Bab III
Metodologi Penelitian
Metode, bahan dan alat yang digunakan dalam penelitian ini akan dipaparkan pada bab ini.
III.1 Rancangan Penelitian Secara garis besar tahapan penelitian dijelaskan pada diagram dibawah ini.
Isolat MDR TB rpoB termutasi, katG315 tidak termutasi - Amplifikasi gen katG menggunakan metode PCR - Elektroforesis gel agarosa - Sequencing - Analisis in silico Fragmen gen katG terjadi mutasi selain S315T ?
Ya, Terjadi perubahan asam amino atau tidak? terjadi perubahan struktur protein KatG?
Tidak
Mutasi di luar area penelitian
Gambar III.1 Diagram alur penelitian. Terlihat pada diagram di atas tahapan penelitian meliputi: amplifikasi DNA menggunakan metode PCR, elektroforesis gel agarosa, sequencing, dan analisis in silico.
III.2 Peralatan dan Bahan Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan dan bahan yang lazim digunakan dalam penelitian biokimia dan rekayasa genetika.
III.2.1. Peralatan Peralatan gelas yang digunakan meliputi gelas kimia, gelas ukur, labu takar, labu erlenmeyer, cawan petri, dan botol reagen. Peralatan non gelas yang digunakan meliputi mikropipet Eppendorf dengan tip pipet mikro ukuran 2,5 µL, 10 µL, 100 µL dan 1000 µL. Tabung mikro (Eppendorf, Jerman) ukuran 500 µL dan 1500 µL. Selain itu digunakan juga alat-alat lain seperti gunting, alumunium foil, dan parafilm. Alat pengukur massa digunakan neraca analitis digital Explorer (Ohaus, AS). Sterilisasi alat menggunakan Autoclave Electric Pressure Steam Sterilized model No.25 (All American, AS). Penyimpanan bahan-bahan PCR menggunakan deep freezer Caravell dengan suhu tetap yaitu -20oC. Proses PCR menggunakan alat PCR merek Gene Amp PCR system 2700 (Applied Biosystems, AS). Analisis hasil PCR
dengan
cara
elektroforesis
gel
agarosa
menggunakan
perangkat
elektroforesis Mini Dubcell GT BASe DNA Biorad (Biorad, AS) dan untuk visualisasi hasil elektroforesis digunakan lampu UV dengan panjang gelombang 312 nm. Gel elektroforesis difoto dengan kamera digital Canon Power Shoot A400.
III.2.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi sampel penelitian, yaitu isolat L5 MDR-TB yang telah diisolasi pada penelitian sebelumnya, M. tuberculosis H37Rv (ATCC25618). Bahan untuk membuat master mix yaitu komponen-komponen stok pereaksi PCR dengan merk MDBio. Inc. meliputi 5 µL-1 enzim Taq DNA Polimerase, dNTP 10 mM, primer KF (katG forward) dan
primer KR (katG reverse) masing-masing 30 pmol µL-1, buffer Taq DNA polymerase 10x, MgCl2 25 mM dan ddH2O steril. Analisis hasil PCR menggunakan gel agarosa 1,5% (b/v), 0,5 µg mL-1 EtBr, buffer elektroforesis (running buffer) TAE 1x (40 mM tris asetat dan 1 mM EDTA pH 8,0 (Merck), dan loading buffer (sukrosa 50%, Merck), 0,1 M EDTA dan 0,1% bromfenol biru pH 8,0 (Pharmacia). Sebagai penanda (marker) dalam gel elektroforesis digunakan plasmid pUC19/HinfI 60 ng µL-1. Penanda ini akan menghasilkan lima pita dalam gel elektroforesis yang masing-masing berukuran 1419 pb, 517 pb, 397 pb, 214 pb, dan 75 pb.
III.3 Metode Penelitian Metode yang dipakai dalam penelitian ini meliputi pemilihan sampel, amplifikasi DNA, elektroforesis gel agarosa, penentuan urutan nukleotida, dan analisis in silico.
III.3.1 Pemilihan Sampel Isolat yang digunakan berasal dari kelompok penelitian M.Tuberculosis KK Biokimia ITB yang didapatkan dari spesimen klinis berupa dahak atau cairan paru-paru penderita TB pada laboratorim BPLK, Departemen Kesehatan dan Rumah Sakit Rontisulu, Bandung. Berdasarkan data karakteristik isolat yang didapatkan dari hasil PCR Multiplek pada penelitian sebelumnya, 42 isolat MDR TB yang telah diisolasi dapat dikelompokkan menjadi empat kelompok, yaitu: isolat yang mengalami mutasi G944C baik pada gen katG yang mengode enzim KatG dan mengalami mutasi pada posisi 1578-1580 dan 1593-1595 atau salah satunya pada gen rpoB pengode RNA polimerase sub unit β, isolat yang termutasi pada gen katG G944C tetapi tidak termutasi pada gen rpoB, isolat yang termutasi pada gen rpoB tetapi tidak termutasi pada gen katG dan isolat yang tidak termutasi baik pada gen katG atau gen rpoB.
Pada penelitian ini digunakan isolat yang termutasi gen rpoB pada posisi 15931595 atau mengalami mutasi pada kodon 531 sub unit β RNA polimerase tetapi tidak mengalami mutasi G944C gen katG atau Ser315Thr pada enzim KatG. Adapun isolat yang digunakan adalah isolat L5 yang mengalami Ser531Leu pada sub unit β RNA polimerase dan M. tuberculosis H37Rv sebagai kontrol wild type. Setelah itu dilakukan amplifiksi gen katG kontrol wild type dan isolat tersebut. III.3.2 Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA untuk perbanyakan gen katG dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Primer yang digunakan adalah primer KF dan KR, kedua primer ini mengamplifikasi mulai urutan basa 738 sampai 1172 dan kedua primer ini juga mengamplifikasi daerah sebelum dan sesudah kodon 315. Fragmen DNA yang dihasilkan dari amplifikasi kedua primer berukuran 0,43 kb (Mokrousov et al., 2003; Mokrousov et al., 2002a). Adapun sekuen primer yang digunakan adalah: Tabel III.1 DNA primer yang digunakan dalam penelitian Primer
Urutan nukleotida
KF 5’-GCA GAT GGG GCT GAT CTA CG-3’ KR 5’-AAC GGG TCC GGG ATG GTG-3’ Sumber: Mokrousov et al., 2003; Mokrousov et al., 2002a Tahap persiapan amplifikasi dilakukan dengan membuat master mix dalam tabung eppendorf 1500 µL dengan campuran yang terdiri dari buffer PCR 10x, MgCl2 3 mM, primer KF 30 pmol, primer KR 30 pmol, dNTP 10 mM yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP dan dTTP serta Taq DNA Polymerase 5 u/µL yang ditambahkan terakhir kali. Perbanyakan dilakukan dengan menambahkan 5 µL template DNA sampel kedalam 20 µL campuran master mix dalam satu tabung PCR. Kontrol positif dibuat dengan komposisi reaksi yang sama tetapi template yang digunakan adalah M. tuberculosis H37Rv. Digunakan juga kontrol negatif dengan campuran reaksi yang sama tetapi template diganti dengan ddH2O steril. Proses PCR dilakukan dengan tahapan sebagai berikut, tahap denaturasi awal pada 96oC selama 3 menit, kemudian 30 siklus PCR dengan masing-masing
siklus terdiri dari denaturasi pada 94oC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 50oC selama 40 detik, dan perpanjangan rantai pada 72oC selama 30 detik dan pemantapan pada 72oC selama 3 menit (Noviana, H, 2007). Hasil PCR disimpan pada suhu -20oC.
III.3.3 Analisis hasil PCR Hasil PCR dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1,5% (b/v) dibuat dengan melarutkan 0,6 gr agarosa dalam 40 mL buffer TAE 1x kemudian dipanaskan hingga agarosa larut. Larutan didinginkan hingga kira-kira mencapai suhu 60oC dan ditambahkan 2,0 µL EtBr 10 mg mL-1. Campuran kemudian dituang ke dalam cetakan elektroforesis berukuran 6x10 cm yang sebelumnya telah dipasang sisir pembentuk sumur dan didiamkan hingga membentuk gel padat. Hasil PCR diambil sebanyak 5 µL dan dicampur dengan 2 µL loading buffer kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Sebagai penanda (marker) DNA digunakan pUC19/HinfI 60 ng/µL sebanyak 5 µL dicampur dengan 2 µL loading buffer. Alat elektroforesis dihubungkan dengan sumber arus listrik dan diatur pada tegangan 80 Volt selama 30 menit menggunakan buffer TAE 1x sebagai running buffer. Pita DNA dianalisis dengan melihat gel elektroforesis di atas sinar UV pada panjang gelombang 312 nm dan difoto dengan kamera digital. Untuk mengetahui ukuran fragmen DNA yang dihasilkan maka pita hasil PCR dibandingkan dengan pita penanda (marker). Untuk memperbanyak hasil PCR dilakukan dengan cara melakukan PCR untuk sampel yang sama berulang-ulang. PCR dilakukan hingga sampel berjumlah 600800 ng atau lebih, dengan konsentrasi 15 ng/µL yang merupakan jumlah minimal untuk melakukan 1 kali reaksi sequencing.
III.3.4 Penentuan urutan nukleotida Untuk keperluan urutan nukleotida, sampel hasil PCR dikumpulkan hingga berjumlah antara 600-800 ng. Selain itu, disiapkan juga primer KF dengan
konsentrasi 10 pmol/3 µL dalam tabung mikro lalu dibungkus dengan parafilm. Untuk satu kali reaksi sequencing dibutuhkan 2,5 µL primer dengan konsentrasi 10 pmol/3 µL. Peentuan urutan nukleotida (sequencing) dilakukan oleh Macrogen Inc. dengan menggunakan metode Dideoksi Sanger dan mengikuti prosedur BigDye TM Terminator. Urutan nukleotida dibaca secara otomatis menggunakan alat Automatic Sequencer 3730xl.
III.3.5 Analisis in silico Analisis in silico meliputi analisis hasil sequencing dan pemodelan struktur enzim KatG M. tuberculosis menggunakan program PYMOL. Analisis hasil sequencing dilakukan dengan cara membandingkan urutan nukleotida sampel terhadap urutan nukleotida M. tuberculosis galur murni H37Rv menggunakan program SeqmanTM versi 4.0.0 dan Meg align versi 4.00 dari DNA*STAR untuk mengetahui adanya mutasi pada fragmen hasil amplifikasi. Pemodelan struktur enzim KatG dimulai dengan pengambilan struktur enzim KatG M. tuberculosis yang terdpat di www.pdb.org dengan kode ISJ2, file struktur enzim tersebut berbentuk PDB. Setelah itu file dibuka pada program PYMOL untuk mengetahui residu asam amino yang mengalami mutasi.
