Metoda otisků a nátěrů, počítání mikroobjektů, imersní metoda A. ZADÁNÍ 1.
2. 3. 4. 5.
Proveďte studium pokožky listů několika rostlin (jednoděložné, dvouděložné) metodou otisků. Zjistěte počet průduchů na jednotkovou plochu listu, velikost a otevřenost průduchů. Zakreslete obraz pokožky a průduchů. Zhotovte a studujte nativní příčný řez listem traviny (obiloviny). Nakreslete obraz řezu a identifikujte jednotlivé druhy pletiv a funkčních útvarů. Seznamte se důkladně s Bürkerovou počítací komůrkou a s postupem při počítání mikroobjektů. Zjistěte obsah červených a bílých krvinek v kapilární krvi. Studujte daný preparát (např. červené krvinky) imersní metodou pro maximální reálné zvětšení mikroskopu. Prostudujte metodiku krevního nátěru. Připravte preparát krevního nátěru a proveďte jeho vyhodnocení.
Poznámka. Po dohodě s vyučujícím budou podle rozsahu hodin praktika realizovány jen některé body zadání. B. SEZNAM POMŮCEK 1.
2.
3.
Přístrojové vybavení: Mikroskop s křížovým posuvem preparátu (Amplival nebo Amplival pol. U.). Bürkerova komůrka (výrobce ZPA Košíře, Praha) typ 10905 s příslušným krycím sklíčkem. Chemikálie: Hayemův (na červené krvinky). Složení: sublimát (HgCl2) 0,5 g, síran sodný (Na2SO4) 5 g, chlorid sodný (NaCl) 1 g , doplněno destilovanou vodou na 200 ml. Místo Hayemova roztoku lze použít fyziologický roztok. Pozor: HgCl2 je jedovatý. Türkův (na bílé krvinky). Složení: ledová kyselina octová 3 ml, 1 % roztok genciánové violeti 3 ml, doplnit destilovanou vodou na 300 ml. Roztok působí tak, že jádra leukocytů se zbarví slabě fialově a červené krvinky jsou kyselinou octovou hemolyzovány a jsou téměř neviditelné (jen zbytky membrán - ghosts). Balónek Spectronics. Ostatní potřeby: Bürkerova pipeta 25 l na krev (katal. č. 3406); odměrné pipety: Hayemova: 4975 l (katal. č. 3408), Türkova: 475 l (katal. č. 3407). Mísící baňky se zátkami: větší pro erythrocyty, menší pro leukocyty. Hadičky a náústky, tampóny, filtrační papír, lancety DIU 3,5, líh lékařský (denaturovaný s 1 % benzínu nebo benzenu).
C. TEORIE 1. Metoda otisků, studium pokožky listů, průduchy Otisky povrchu listů slouží k analýze tvaru a velikosti pokožkových buněk, velikosti, struktury, otevřenosti a plošné hustoty průduchů. Metoda není vhodná pro listy s oděním (trichomy) a s průduchy ponořenými pod úroveň povrchu. Na povrch listu se nanese kapka bezbarvého laku na nehty nebo lepidla kanagom. Používá se také roztok kolodia v chloroformu apod. Kapka se rozetře štětečkem nebo prstem jedním směrem na ploše asi 1 cm2. Po odpaření rozpouštědla (zhruba desítky sekund) se
75
začne objevovat bělostný nádech vrstvy. Přelepíme natřené místo kouskem předem upravené průhledné lepící pásky a postupně ji přitlačíme. Poté pásku i s otiskem opatrně stáhneme a přilepíme ji na označené podložní sklíčko. Takto připravené otisky jsou stálé a lze je prohlížet v mikroskopu i po delší době. Průhledná páska Izolepa může mít vlastní strukturu lepící vrstvy. Proto ji upravíme tak, že její kousky ponoříme do xylenu nebo benzenu, přilepíme za okraj na hranu stolu a necháme volně uschnout. Stékající rozpouštědlo vyrovná povrch pásky a odstraní případné vzduchové bubliny. Nejdůležitější na pokožce čepele listu (epidermis) jsou průduchy. Podílejí se rozhodující měrou na regulaci výměny plynů (CO2 a O2 při fotosyntéze, fotorespiraci a respiraci, H2O při transpiraci). Průduch je složen ze dvou svěracích buněk (guard cells) a případně dvou až čtyřech podpůrných buněk. Výrazný je rozdíl v tvaru a rozložení průduchů jednoděložných a dvouděložných rostlin (viz obr. 1). svěrací buňky p odpůrné buňky
b) jednoděložná
a) dvouděložná
Obr. 1. Schéma stavby a rozložení průduchů Pro činnost průduchů jsou důležité tenkostěnné a tlustostěnné oblasti buněčných stěn. Např. průduchy travin (jednoděložné) mají na koncích svěracích buněk v místě vzájemného dotyku tenkostěnné oddělení. Zvýšení turgoru vede ke zvýšení objemu tenkostěnných oddělení a k otevření průduchů. U travin jsou průduchy v řadách a na obou stranách čepele listu. U bifaciálních listů s palisádovým parenchymem jsou průduchy obvykle jen na spodní straně listu. V praktiku vyhodnoťte tvar a strukturu průduchů, velikost buněk a otevření průduchů (šířku štěrbiny) a plošnou hustotu průduchů (počet průduchů na 1 mm2 ). 2. Nativní příčný řez listem Studium vnitřní struktury listu lze provést na jednoduchém nativním řezu. Vybranou část listové čepele (nejlépe 5 x 5 mm2) vystřihneme či vyřízneme a vsuneme do naříznutého bločku (asi 1 cm z mrkve nebo suché dužiny bezu). Řez provádíme ostrou žiletkou. Oproti postupu při přípravě trvalých řezů jde o metodu velmi rychlou. Je však náročná na zručnost a jen některý z řezů mívá dobrou kvalitu. Řez, někdy i s podpůrným materiálem, umístíme do
76
kapky destilované vody (nebo fyziologického roztoku) na podložním sklíčku a přikryjeme krycím sklíčkem. Pozorujeme jej při vhodném zvětšení a v procházejícím světle. Jako příklad zvolíme příčný řez čepelí listu ječmene, kolmý k vodivým pletivům. Obr. 2 znázorňuje základní morfologické prvky, které lze identifikovat, případně zakreslit. Jsou to především: 1) svrchní a spodní epidermis (bez chloroplastů); 2) průduch (s chloroplasty) a dýchací dutina; 3) mezofyl (houbovitý parenchym) s chloroplasty; 4) hypodermální sklerenchym (mrtvé buňky, bez chloroplastů) v oblasti cévních svazků; 5) ohýbací buňky; 6) průřez svazkem cévním kde lze identifikovat pochvu, xylém a floém.
prùduch dýchací dutina hypodermální sklerenchym
ohýbací buòky
svrchní epidermis
pochva svazku cévního houbovitý parenchym
xylém
(mezofyl) floém
Obr. 2. Schéma řezu čepelí listu ječmene 3. Práce s Bürkerovou komůrkou a) Příprava roztoků Do větší mísící baňky napipetujeme 4975 l Hayemova roztoku odměrnou pipetou. Na pipetu je nasazena dostatečně dlouhá hadička a skleněný náústek tak, aby nasávaný roztok nemohl vniknout do úst. Je možné pipetovat pomocí balónku (Spectronic corp.). Naplnění pipety po značku ústy vyžaduje určitou praxi. Regulovat nasávání lze např. přehnutím hadičky u konce pipety. Do menší baňky obdobně napipetujeme Türkovou pipetou 475 l Türkova roztoku. Poznámka. Práce s balónkem Spectronic corp. Balónek má tři ventily otevírané bočním stisknutím příslušných tlaček (viz obr. 3). V centru ventilu je kovová kulička. Stlačením pryže se kolem kuličky vytvoří mezera, kterou vzduch proniká. Ventil A spojuje balónek se vzduchem v okolí, ventil S jej připojuje k pipetě (pro nasávání nebo tlakové vypouštění pipety) a ventil E umožňuje samovolné vypouštění pipety.
77
PIPETY
:
HAYEM OVA 4975 l
.. TURKOVA 475
.. BURKEROVA
l
25
l
BALÓNEK (SPECTRONICS) BANIČKY
VELKÁ
M ALÁ A
HADIČKA
S
E NÁÚSTEK
Obr. 3. Pomůcky k počítání krvinek b) Odběr krve 1. Provedeme odběr krve z prstu. K tomu je zapotřebí mít sterilizovanou podkožní nebo injekční jehlu nebo lancetu. Dříve používaná Frankova jehla se už nesmí používat (lze ji špatně čistit a tudíž i špatně sterilizovat). Bříško prstu očistíme lihem a éterem. Vpich v kolmém směru provádíme do uvolněného prstu (není tak bolestivé). Z uvolněné krve odebíráme až druhou kapku a to sterilní pipetou 25l opět opatřenou hadičkou a náústkem. Ústí pipety se ponoří pod povrch kapky aniž bychom se dotkly pokožky (sterilní důvody) a nasajeme (nesmí se tvořit bublinky) po značku 25 l. Pokud nasajeme krev nad značku, odsajeme přebytek doteky filtračního papíru nebo tampónu. Správná sterilizace pipet, jehel a lancet se provádí ve sterilizátorech (parou o vyšší teplotě a tlaku). Starší způsob sterilizace vyvařením není dostatečný. Je vhodné použít jehly a lancety na jedno použití. Nesterilizovanou jehlou se mohou krví přenášet nebezpečné nemoci (hepatitida B sérová žloutenka, virus HIV). 2. Krev z pipety vyfoukneme ke dnu větší baničky s Hayemovým roztokem a nasátím horních vrstev roztoku několikrát pipetu propláchneme. Baňka se uzátkuje (stačí gumová zátka) a důkladně několik minut protřepáváme. Krev je takto zředěná 200 x. 3. Z další kapky odebereme následujících 25 l krve a smícháme obdobným způsobem s Türkovým roztokem v malé baničce. Opět zazátkujeme a důkladně promícháme. Krev je zředěna 20 x. Při odběru krve není vhodné příliš prst mačkat, mohlo by dojít k naředění krve
78
lymfou. Na ranku pak přiložíme tampónek nebo čtvereček (3x3 cm) z dřevité vaty. Naředěná krev může v baničce zůstat i 24 hodin. c) Naplnění počítací komůrky Bürkerova počítací komůrka má dvě počítací sítě. Udělejme dohodu, že horní část bude sloužit pro počítání erythrocytů a dolní pro leukocyty. K naplnění komůrek je možné opět použít pipety 25 l nebo speciálně upravené pipety ze skleněné trubičky, vytažené v kapiláru. Bürkerova komůrka, důkladně vyčistěná a suchá, je připravena s přitlačeným krycím sklíčkem. Toto sklíčko je speciální, tlustší, přesně rovinné se zabroušenými rohy. Mezi sklíčkem a sítí je při správné poloze mezera přesně 0,1 mm. Hrot pipety přiložíme k okraji sklíčka a 1-3 kapky suspenze necháme vtéci kapilárními silami pod sklíčko tak, aby byla zaplněna celá oblast sítě. Vnější přebytek suspenze (např. na krycím sklíčku) odsajeme čtverečkem z dřevité vaty, tampónem nebo filtračním papírem. Přebytečnou suspenzi uvnitř zachytí drážky komůrky. Obdobně napustíme dolní oblast suspenzí v Türkově roztoku. d) Počítání krvinek 1) Používáme zvětšení mikroskopu 100 - 300 x. Volíme takové osvětlení komůrky, aby jak síť, tak krvinky kontrastně vystupovaly. Rozdělení mřížové sítě komůrky je uvedeno na obr. 4. 2 1 síť = 3 x 3 mm P 3
a
P 1
P 2
a = 1/5 mm
b = 1/20 mm
1 mm P = 1/25 mm 1
b
2
P = 1/100 mm 2 P = 1/400 mm 3
2
2
1 mm
Obr. 4. Část mřížové sítě Bürkerovy komůrky 2) Bürkerovo pravidlo. Krvinky, které se dotýkají čar se počítají takto: - zvolíme dvě sousední strany obdélníku (čtverce) např. horní a pravou. Spočteme všechny krvinky, které na těchto stranách leží, nebo se jich dotýkají zevnitř i zevně. - krvinky, které se dotýkají nebo leží na dolní a levé straně se nepočítají; - krvinka, která leží na pravé a současně na dolní čáře a ta, která leží na horní a současně levé čáře se nepočítá.
79
Pravidlo lze snadno zdůvodnit představou o sousedních čtvercích a požadavkem, aby se žádná krvinka nepočítala dvakrát. Obr. 5. Bürkerovo pravidlo. Počítají se vyšrafované krvinky 3) Zvolíme si vhodný postup při počítání ve čtvercích (obdélnících) a to buď po řadách, sloupcích nebo diagonálně. Možný je meandrovitý postup. Mírným přeostřením můžeme vždy překontrolovat, zda jsme neopomněli krvinku přilepenou na sklíčku nebo na dně. 4) Obecný výraz pro počet krvinek v 1 mm3 je P = p z / (S t n) kde P - počet krvinek v 1 mm3, p - zjištěný počet krvinek, n - počet počítaných ploch, S - velikost 2 jedné plochy (mm ), t - hloubka kyvety (mm), z - zředění krve. 5) Doporučené počítání červených krvinek: spočteme krvinky ve 20 obdélnících (1/100 mm2), P = p.10 000. 6) Doporučené počítání bílých krvinek: v 50 velkých čtvercích (1/25 mm2). P = p.100. e) Chyby měření Ze statistického hlediska je pro daný proces měření vhodná Poissonova statistika. P(p) = e-u up /p! kde u je střední hodnota počtu částic a P(p) pravděpodobnost napočítání p částic. Absolutní chyba jednoho měření (statistický rozptyl) je p a relativní 1/ p = p /p (100 %). Snadno usoudíte, že postačí-li vám přesnost 10 % , napočítejte 100 krvinek. Požadujete-li ovšem např. 5 % přesnost, je třeba spočítat 400 krvinek atd. Určete přesnost vašich výsledků. f) Čištění komůrky a pipet Komůrku, krycí sklíčko a pipety čistíme ihned po použití vodou, lihem a éterem, případně postačí vodou se saponátem. Zaschne-li krev v pipetách, ponoříme je na několik hodin do louhu nebo čpavku. Protahujeme je pouze koňskou žíní. g) Lékařská data Normální stav: Erythrocyty muži: 5 milionů v mm3 ženy: 4.5 mil. v mm3 Leukocyty muži i ženy: 4000 - 10 000 v mm3. Nemoc: Leukocyty: nad 10 000 - leukóza; nad 30 000 - leukémie. 4. Melanžérová metoda (mísící pipety) Tato metoda se dnes již prakticky nepoužívá, je méně přesná než baničková metoda.
80
Pomůcky: melanžér na červené krvinky (značky 0,5; 1; 101; červené tělísko), melanžér na bílé krvinky (značky 0,5; 1; 1,1; bílé tělísko), hadičky a skleněné náústky, keramické mističky nebo Petriho misky. Postup: Krev odsáváme přímo do melanžéru po značku 0,5 (nebo 1). Připravíme do mističek Hayemův a Türkův roztok. Doplníme pak krev v melanžéru na červené krvinky Hayemovým roztokem po značku 101 - ředěno 200 x (nebo 100 x) a Türkovým roztokem v melanžéru na bílé krvinky po značku 11 - ředěno 20 x (nebo 10 x). Hrot pipety ucpeme ukazováčkem pravé ruky, sejmeme hadičku a konec pipety přidržíme palcem pravé ruky. Kývavým pohybem pipety mícháme krev (pomocí tělíska) asi po dobu 3 minut. Z melanžéru pak vypustíme suspenzi pod krycí sklíčko Bürkerovy komůrky. Další postup je stejný jako v baničkové metodě. 5. Automatické metody vyšetřování v hematologii Většina hematologických vyšetřovacích postupů je náročná na čas, znalosti a zkušenosti pracovníků. Byly vyvinuty některé automatické metody, nahrazující činnost laboranta. První přístroje na počítání krvinek se zakládaly na zákalové (turbidimetrické metodě). Fotometricky se měřil stupeň zákalu suspenze zředěných erythrocytů. Tato metoda se ukázala jako nespolehlivá, protože stupeň zákalu nezávisel jenom na počtu, ale i na velikosti a stupni nasycení erythrocytů hemoglobinem. Dalším stupněm ve vývoji byly elektronické počítače, které pracovaly na principu průchodu erythrocytů v suspenzi tmavým polem. Procházející erythrocyty byly osvětleny světelným paprskem. Záblesky při průchodu jednotlivých krvinek byly elektronicky zaznamenány, zesíleny a počítány. Přístroj se osvědčil jen při počítání krve od zdravých lidí. V současné době se ve větších hematologických laboratořích používají přístroje, pracující na principu změny elektrického odporu elektrolytu při průchodu krvinky malým otvorem. Vychází se při tom ze skutečnosti, že krvinky je prakticky izolující částice. Schéma zařízení je na obr. 6. Suspenze krvinek je protlačována přes vhodnou trysku z vnější nádoby do vnitřní, ve které je jen fyziologický roztok. Nasávání přesného objemu suspenze krvinek do vnitřní nádoby se děje pohybem rtuťového sloupce mezi ryskami start a stop. Ve vnější a vnitřní nádobě jsou elektrody, připojené na vysoké napětí. Při průchodu buněk tryskou vznikají napěťové impulsy, jejichž amplituda je úměrná objemu procházející částice (pokud je její průměr menší než průměr trysky). Při počítání leukocytů se nejdříve v suspenzi provede hemolýza erythrocytů roztokem, doporučeným výrobcem přístroje. Diskriminátorem malých pulsů se dají vyloučit pulsy od trombocytů. U nás se používají např. přístroje Coulter Counter.
81
VAKUUM
STOP
Hg START
Obr. 6 Automatické počítání krvinek 6. Imersní metoda. Pozorování červených krvinek Při imersní metodě je mezi objektivem a preparátem, nebo i preparátem a kondenzorem, čirá imersní kapalina s indexem lomu větším než 1. Používá se voda, glycerol, 1-bromnaftalen, nejčastěji však některý olej (parafínový, cedrový, nebo kanadský balzám). Zvýší se tím rozlišovací schopnost mikroskopu. Obvykle se používá imersní objektiv pro největší hodnoty zvětšení (100 x). Imersní objektiv má zvláštní označení (např. HI 100) a nelze ho použít pro mikroskopování bez imersní kapaliny. Před pozorováním preparátu imersní metodou kápneme na preparát kapku imersního oleje a při bočním pozorování přibližujeme preparát k objektivu. Okamžik doteku kapky a čočky objektivu poznáme ze změny světelných podmínek v kapce (rozjasnění). Poté již můžeme jemným posuvem stolku doostřit mikroskop. Základní tvar lidské červené krvinky je uveden na obr. 7 5 . Buňky mají tvar anuloidu (bikonkávního disku), osově symetrického (symetrie Dh) s osou kolmou k rovině disku. Buňka je vysoce deformovatelná. Při průchodů cévami nabývá nejrůznějších tvarů (např. tvaru kulky), v stacionárním izotonickém roztoku se její tvar vrací na bikonkávní. Buňka má vysoký poměr plochy povrchu ku objemu, vystihující její funkci při výměně a přenosu plynů. Pružnost buněčné membrány zajišťuje spektrinová síť umístěná pod buněčnou membránou. Anomální srpkovitý tvar je příznakem nemoci srpkovité anémie.
82
m
Obr. 7. Schematizovaný tvar červené krvinky 7. Krevní nátěry Vyšetřování krevních nátěrů patří k základním metodám v hematologii. Rozlišením krevních buněk a jejich procentuálního zastoupení lze usoudit na povahu onemocnění. Nátěry se zhotovují z krve kapilární (vlásečnicové), žilní, z kostní dřeně, ze sleziny, případně z mízních uzlin. Důkladný klinický rozbor krevních onemocnění vyžaduje vyšetření jak krve žilní, tak z krve kostní dřeně. Pro naše účely se omezíme na zhotovení nátěrů z kapilární krve. Zhotovení krevních nátěrů Krevní nátěry se většinou zhotovují na podložních sklíčkách, složitější jsou nátěry na krycích sklíčkách. Ke zhotovení nátěrů na podložním sklíčku se používají chemicky čistá a dokonale odmaštěná broušená podložní sklíčka. Nová sklíčka stačí umýt mýdlovou vodou nebo namočit do 10 % draselného louhu. Po důkladném opláchnutí se pak sklíčka odmastí ponořením do 96 % alkoholu a osuší se na vzduchu. Dříve použitá sklíčka se chemicky čistí ponořením na 24 hodin do chromsírové směsi nebo detergenčního prostředku. Sklíček se dotýkáme jen na zabroušených hranách a uchováváme je v uzavřených krabicích. Po vpichu do očištěného bříška prstu kápneme kapku kapilární krve na podložní sklíčko přibližně v jedné pětině délky po pravé straně. Palcem a ukazováčkem levé ruky přitlačíme sklíčko s krví pevně k podložce ( ke stolu). Do pravé ruky mezi palec a ukazovák uchopíme druhé podložní sklíčko. Položíme ho před kapku krve tak, aby obě sklíčka svírala úhel 30 - 40o. Krátkým tahem zleva doprava se spojí hrana sklíčka s kapkou krve, která se rozprostře po celé délce hrany. Plynulým jemným tahem zprava doleva zhotovíme nátěr. Nátěr musí být rovnoměrný, homogenní, přiměřeně tenký a přecházet do ztracena. Hotový nátěr se nechá uschnout na vzduchu nejméně půl hodiny a po zaschnutí vznikne trvalý preparát, který se musí barvit. Schéma postupu je na obr. 8.
83
Obr. 8. Postup při tvorbě krevního nátěru Barvení se neprovádí hned po zhotovení nátěru, protože by došlo ke srážení buněčných útvarů vlivem prudkého odnímání vody. Jedním ze způsobů barvení užívaných v naší klinické praxi je Papenheimova metoda panoptického barvení roztokem May-Grünwaldovým (sloučenina eosinu a methylenové modři 1g, methylalkohol 100 cm3, glycerin 50 cm3) a roztokem Giemsy-Romanovského (methylenový azur 0,8 g, methylenový azur-eosin 3 g, glycerin 250 g, methylalkohol 250 g). Při vyšetřování krve nemocných lidí se provádí důkladné barvení nátěrů aby vynikly erythrocyty, leukocyty, trombocyty i vnitřní struktury krevních buněk. U zdravých lidí (např. na transfúzních stanicích) se zjišťuje jen zastoupení jednotlivých typů bílých krvinek, erythrocyty se nevyhodnocují. provádí se proto jednodušší a rychlejší barvení krevních nátěrů. Důkladnější barvení krevních nátěrů: 1) Fixace methanolem, který se nechá působit 5 - 10 minut. 2) Barvení May-Grünwaldovým roztokem. Roztok se musí před použitím filtrovat. Nátěr ponoříme do roztoku a necháme působit 5 - 7 minut. V této fázi stále ještě dochází k fixaci nátěru, barvící účinek je nepatrný, barví se jen červené krvinky. 3) Nátěr opláchneme destilovanou vodou. 4) Barvení roztokem Giemsy-Romanovského. Roztok se nejdříve naředí destilovanou vodou v poměru 1 : 9. Zásadně se leje destilovaná voda do barviva, nikoliv naopak. Roztok necháme působit 30 minut. 5) Opláchneme destilovanou vodou, pak i tekoucí vodou a necháme na vzduchu vyschnout. Urychlené barvení krevních nátěrů: 1) Barvení May-Grünwaldovým roztokem 2 minuty. 2) Opláchnutí destilovanou vodou. 3) Barvení naředěným roztokem Giemsy-Romanovského (1:9) - 10 minut. 4) Opláchnutí destilovanou vodou a tekoucí vodou. Vyšetřování krevních nátěrů Obarvené krevní nátěry jsou trvalé preparáty, které se pozorují v mikroskopu imersní metodou. Vyšetřují se na konci nátěru, kde je vrstva krve nejtenčí a kde jsou krevní buňky od sebe nejvíce vzdáleny. Používá se meandrovitý pohyb podložního sklíčka a vyhodnocují se červené krvinky (erythrocyty), bílé krvinky (leukocyty) a krevní destičky (trombocyty). 84
Erythrocyty: posuzuje se tvar a velikost krvinek, obsah hemoglobinu (zbarvení krvinek) a vnitřní struktura buňky. Tvarové typy červených krvinek se vyjadřují příslušnými názvy: normocyty, makrocyty, mikrocyty, sferocyty, poikilocyty, srpkovité, nitkovité, terčové erythrocytry (obr. 9). Leukocyty: posuzují se podle barevných vlastností jádra a plazmy, podle velikosti a tvaru jádra a plazmy, podle granulí v plazmě. Zjišťuje se procentuální zastoupení jednotlivých typů bílých krvinek v celkovém množství leukocytů. Atestovaný laborant prohlédne pod mikroskopem celkově 100 bílých krvinek, přičemž zaznamenává počet jednotlivých typů na počítadle (např. značky LEUKONOR, Německo), které je vybaveno tlačítky s příslušnými názvy typů leukocytů. Typy leukocytů: segmentové neutrofily, monocyty, neutrofily s tyčkovým jádrem, bazofily, lymfocyty, eosinofily. Trombocyty: Početně se nijak speciálně nevyhodnocují, jejich počet se odhaduje. Počty krvinek u dospělých zdravých lidí: Erythrocyty .......................................................................... 4,3 - 5,3 .10 /l Leukocyty ............................................................................ 4 - 9 .10 /l Trombocyty .......................................................................... 200-300 .10 /l Segmentové neutrofily ......................................................... 50 - 70 % lymfocyty .............................................................................. 25 - 40 % monocyty .............................................................................. 2 - 6 % neutrofilní tyčinky ................................................................ 3 - 5 % eosinofily .............................................................................. 2 - 4 % bysofily ................................................................................. 0 - 1 %. Krevní nátěry je možné po určitou dobu uchovávat. Imersní olej se odstraní otřením vatou navlhčenou benzínem. Data se obvykle vyrývají přímo do krevního nátěru. Automatické vyhodnocování krevních nátěrů Automatické vyhodnocování se provádí pomocí mikroskopů s automatickým zaostřováním a vyhledáváním buněk a s digitálním počítačem pro klasifikaci a počítání buněk. Mikroskopický obraz se digitálně zpracovává přičemž se registruje velikost a tvar buňky, velikost a hustota jádra, barva cytoplazmy atd. Objektiv se automaticky posunuje nad krevním nátěrem, zaznamenává jednotlivé buňky a jejich charakteristiky. Existují zařízení na automatické zhotovování krevních nátěrů, jejich barvení a vyhodnocování.
85
normocyty
mikrocyty
makrocyty
megalocyty
sferocyty
poikilocyty
eliptocyty
srpkovité .... ...
Jollyho tělíska
.. . .. .
bazofilní tečkování
Cabotovy prstence
Obr. 9. Schéma různých tvarů a změn červených krvinek
86
. .. . ... . . .. . ... ... .. .. ........ .. . ... .
3
3
1
... . ...... . .. . ... ... .. ..... . ..... .. .. ... . .. .. ... .. ...
5
6
4
... . . .... .... .. .. .. . .. ... .. ..... .. ., .. ..... ... ... ... . ... ... ... .. . ... . ..
5
2
2 7
.
... 8
..
... ..
Obr. 10. Buňky krve (zjednodušený nákres), rozeznatelné na nátěru 1 - červené krvinky 2 - krevní destičky 3 - segmentované neutrofily - jádro je segmentováno na 2 až 3 části, které jsou spojeny, plazma je světlá, obsahuje granule 4 - neutrofil s tyčkovým jádrem - jádro není segmentováno, má podkovovitý tvar, plazma je světlá, obsahuje granule 5 - malý a velký lymfocyt - jádro je velké, vyplňuje téměř celou buňku, plazma tvoří jen úzký okraj, neobsahuje granule 6 - monocyt - velká, méně častá buňka, laločnaté jádro 7 - eozinofil - tmavá plazma, s velkým počtem granulí 8 - bazofil - velké množství granulí překrývá i jádro, které je špatně viditelné Buňky 3, 4, 7, a 8 se označují společným názvem GRANULOCYTY.
D. LITERATURA 1 V. Habrová: Biologická technika (skripta), SPN, Praha 1979. 2 Návod k počítací komůrce (ZPA Košíře). 3 J. Cudlín a kol.: Vybrané metody v mikrobiologii. Academia, Praha 1981. 4 B. Slavík a kol.: Metody studia vodního provozu rostlin. Academia, Praha 1965. 5 Y.C. Fung: Biomechanics, Springer-Verlag, New York, 1981. 6 J. Neuwirth a kol.: Patofyziologie krve. Avicenum, Praha 1983. 87
88
