Metoda dalam Biologi Molekuler
Erlia Narulita, PhD
Tahap isolasi gen Isolasi DNA total
Isolasi DNA total
Isolasi RNA total
Memotong DNA
Perbanyakan dg metoda PCR
Reverse Transcriptase (RT) PCR
Potongan DNAà ligasi (kloning) ke dalam vektor (misal: plasmid/bacteriophage)
Fragmen hasil PCR à klon ke dalam plasmid
Transfer vektor ke dalam sel inang (transformasi) Seleksi sel inang yang mempunyai vektor+ insert
Identifikasi gen tertentu dg “Southern blotting”
1. Seleksi dengan antibiotik 2. Seleksi putih-biru 3. Analisis dengan enzim restriksi Sekuensing urutan DNA
2005-Biologi ITB
1. Isolasi DNA/RNA 2. PCR 3. Elektroforesis 4. Memotong & Menyambung DNA 5. Vektor, kloning ke dalam plasmid 6. Transformasi & seleksi 7. Southern/Northern blotting 8. Sekuensing urutan DNA
Istilah klon Greek: Klon = twig (ranting) à stek Kultur jaringan merupakan teknik kloning tumbuhan/hewan 1973 : Stanley Cohen dkk berhasil memperbanyak satu potong DNA dalam sel bakteri DNA dapat bereplikasi sama seperti aslinya dalam sel bakteri untuk kemudian dapat diisolasi dan digunakan sesuai kebutuhan
1. Isolasi genomik DNA/RNA Jaringan hewan/bakteri /tumbuhan
Jaringan hewan/bakteri / tumbuhan Penghancuran membran dalam bufer ekstraksi+detergen
Penghancuran membran dalam bufer ekstraksi+detergen Ekstraksi fenol-kloroform Ekstraksi fenol-kloroform
Tambahkan oligo dT RNA & oligo dT ditransfer ke kolom
Pencucian pelet DNA dengan etanol 75% Elusi RNA dgn bufer elusi
Ekstraksi fenol-kloroform dan pencucian pelet mRNA dgn etanol 75%
As. Nukleat terutama RNA dr organisma dapat dgn mudah terdegradasi selama isolasi à perlu mencegah degradasi oleh nuklease selama isolasi u/ RNA , misalnya dengan penambahan: Bufer mgdng protease u/ menghlgkan nuklease Inhibitor RNAse PVP u/ DNA digunakan 2-mercaptoetanol, SDS, DTT Menghilangkan RNA dr DNA hasil isolasi dgn RNAse atau centrifugasi pada gradien CsCl
Isolasi RNA spesifik dg metoda afinitas Populasi RNA dapat difraksionasi menjadi spesifik RNA misal : isolasi mRNA dengan adanya ujung poly A Penambahan nukleotida analog sbg marker spesifik sblm ekstraksi: RNA disintesis in vitro dengan penambahan nukleotida analog (memiliki grup sulfidril dan biotin yg berikatan ke mercuri dan streptavidin pd kolom matrik/butiran magnet) utk membedakannya dg RNA lain
mRNA dengan kolom kromatografi
2. PCR
Biologi Molekuler 2005-Biologi ITB
3. Elektroforesis A. Horisontal
Pemisahan DNA Pemisahan DNA untuk isolasi dan analisis dgn metoda elektroforesis DNA fragmen yang linier dipisahkan berdasarkan ukuran lewat gel agar agarorosa atau poliakrilamida Agarosa adalah polisakarida dari rumput laut dg konsentrasi 0.5% to 2% (mass/volume i.e. 0.5 to 2.0 g agarose/100 ml of aqueous buffer) biasa dipakai utk memisahkan DNA berbagai ukuran Pemisahan DNA dilakukan dari kutub positif à kutub negatif dengan voltage tertentu karena DNA bermuatan negatif DNA yg telah dielektroforesis dapat diwarnai dg metoda kimia ethidium bromide yang berikatan pada DNA (DNA chelator) Sinar UV yang berflouresence dpt digunakan utk deteksi DNA
B. Vertikal
4. Memotong DNA Endonuklease ditemukan pertama kali 1960, Stewart Linn dan Aber Werner pada E. coli. Berasal dari bakteri yang resisten terhadap bacteriophage Endonuclease : memotong di bagian dalam DNA
Sayangnya penemuan Linn & Arber tidak memenuhi harapan: endonuklease yang ditemukan tidak spesifik memotong DNA pada sekuense tertentu. Gunting molekuler pertama ditemukan adalah Hind diisolasi dari Haemophilus influenzae strain Rd. Hind endonuklease dapat terdiri dari 3 macam masing masing memiliki spesifikasi pengenalan terhadap sekuens tertentu
Macam-macam endonuklease HindII (Py =TC; Pu=AG) HindIII
GTPy PuAC
MboI (frekuensi tinggi) SmaI dan XmaI (Isoschizomers)
GATC
A AGCTT
CCC GGG
5. Menyambung DNA Ligase Berasal dari Bacteriophage (T4) Membentuk 2 ikatan kovalen antara ujung 3’ OH satu nukleotida dengan ujung 5’ fosfat dari nukleotida lain ATP diperlukan u/ reaksi
6. Vector Ciri-ciri: • DNA • Dapat bereplikasi sendiri • Dapat disisipi DNA asing • Ada marker: • mendeteksi adanya vektor • mendeteksi adanya DNA asing Macam-macam vektor • Plasmid • Virus • Kombinasi plasmid dan virus
Macam-macam marker gen resistensi antibiotik • gen lacZ (βgalaktosidase) • gen untuk sintesis asam amino •
Vector λ phage Charon phage λ phage dapat melakukan klon DNA ukuran 12 Kb s/d 20 Kb (20.000 pb), bandingkan dengan plasmid hanya 0.5-5 Kb. Cosmid DNA insert dimasukkan pada Cos site dari λ phage DNA Dapat mengklon DNA dengan ukuran 40- 50 kb
Northern & Southern Blotting
21
Pendahuluan Pengertian
Blot/Blo'ng
Berdasarkan Tipenya, terdiri atas :
1 Southern Blo'ng (DNA)
Teknik memindahkan atau mentransfer DNA, RNA, protein ke lembaran tipis atau matriks membran. Teknik ini berupa lanjutan dari penggunaan elektroforesis gel.
2
3 Northern Blo'ng (RNA)
Western Blo'ng (Protein) 22
Southern Blotting (DNA) Southern Blo'ng (DNA)
Penger&an dan Sejarah
Tahapan dan Mekanisme Kerja
Komponen-Komponen
23
Keuntungan teknik blot : a) Akses yang lebih besar kepada molekul yang telah terikat ke permukaan lembaran dibandingkan kepada molekul yang masih berada di dalam gel atau matriks. b) Lebih sedikit reagen yang dibutuhkan. c) Waktu untuk melakukan staining dna destaining, inkubasi, mencuci, dll dapat lebih singkat. d) Pola yang terbentuk dapat dikeringkan dan disimpan berbulan-bulan sebelum dianalisis. e) Dapat dibuat banyak replika pola tersebut untuk memungkinkan banyak metode analisis yang dipakai
24
Pengertian dan Sejarah Southern Blotting (DNA) Southern Blo'ng (DNA) Pengertian
Sejarah
Metode ini ditemukan oleh seorang ahli biologi dari Inggris yang bernama Edward M. Southern, yang mengembangkan prosedur ini pada tahun 1975 di Universitas Edinburgh
Sebuah metode yang sering digunakan dalam bidang Biologi Molekular untuk menguji keberadaan dari suatu sekuen DNA dalam suatu sampel DNA.
Edward M. Southern
Southern Blo'ng (DNA) 25
Komponen-Komponen utama pada Southern Blotting (DNA) Membran Nitroselulosa
DNA probe
Membran Nitroselulosa digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen DNA dari gel agarosa
Ø Merupakan sutau fragmen dna yang berfungsi sebagai pelacak target gen Ø Harus bersifat spesifik dan komplemen terhadap DNA target
26
Lanjutan... Larutan Buffer
DNA
Enzim Retriksi
Larutan buffer berfungsi untuk membawa DNA dari gel dan mengimobilisasi DNA pada membran (Larutan akan bergerak dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah)
Merupakan materi atau molekul yang akan diidentifikasi pada tekhnik Southern Blotting
Berfungsi untuk memotong DNA menjadi suatu fragmen tertentu 27
Tahap- tahap Southern Blotting (DNA) 1
Isolasi DNA dan Pemotongan DNA
2
3
Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis
Transfer DNA ke Membran (Blot)
5
4 Hibridisasi DNA
Deteksi DNA
28
Tahap 1 1
Isolasi DNA dan Pemotongan DNA
Tahap untuk memperoleh DNA yang akan dideteksi. Pemotongan DNA yang ingin diperoleh dilakukan dengan menggunakan enzim retriksi (endonuklease retriksi) yang bersifat spesifik terhadap DNA 29
Tahap 2 2
Fragmentasi DNA dengan Elektroforesis gel
Ø Merupakan tahap dimana Fragmen-fragmen dari DNA akan terpisah berdasarkan ukuran berat molekulnya. Ø B e r d a s a r k a n p r i n s i p elektroforesis, Fragmen DNA yang ukuran berat molekulnya lebih kecil akan lebih cepat bergerak dari kutub negatif kekutub positif dibandingkan dengan fragmen DNA dengan berat molekul lebih besar. 30
Denaturasi DNA
Ø Proses denaturasi DNA dilakukan dengan merendam gel dalam larutan denaturan (NaOH ) Ø NaOH bersifat basa sehingga dapat menyebabkan rusaknya ikatan hidrogen antar untai DNA Ø Ikatan hidrogen antar untai DNA yang putus menyebabkan struktur DNA yang semula double heliks menjadi DNA single strand
31
Tahap 3 Transfer DNA ke Membran nitroselulosa
DNA yang telah diperoleh kemudian ditransfer ke membran nitroseluloasa, tahap inilah yang disebut dengan blotting.
Tahap ini dapat dilakukan dengan 2 pilihan metode, yaitu:
Berdasarkan prinsip Kapilaritas
Berdasarkan prinsip elektroforesis 32
Gel agarosa dijiplak pada membran nitroselulosa
Ø Merupakan salah satu metode tahapan transfer DNA ke membran nitroselulosa yang berdasarkan pada prinsip Kapilaritas Ø Kapilaritas adalah peristiwa naiknya zat cair pada pembuluh, celah atau pori-pori kecil
33
Tahap 4 4 Hibridisasi DNA
Ø Hibridisasi DNA adalah proses pembentukan molekul double helix dari single strand DNA probe dan single strand DNA target Ø Tahap ini terjadi ketika membran nitroselulosa direndam dalam larutan yang berisi probe DNA Ss* (diberi radioisotop) 34
Tahap 5 5
Deteksi DNA
Ø Merupakan tahap lanjutan dari proses hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak/probe Ø Probe biasanya merupakan DNA yang dimurnikan dan bisa ditandai dengan aktifitas spesifik radionukletida. Ø Pada tahap deteksi DNA digunakan Autoradiogram untuk melihat lokasi sinyal DNA
35
Southern Blotting (DNA) Northern Blo'ng (RNA)
Penger&an dan Sejarah
Tahapan dan Mekanisme Kerja
Komponen-Komponen
36
Pengertian dan Sejarah Northern Blotting (RNA) Northern Blo'ng (RNA)
Pengertian
Sejarah
Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali oleh Alwin pada tahun 1977
Ø Secara umum teknik ini mirip dengan Southern Blot, akan tetapi sampel yang digunakan, yaitu RNA. Ø Prinsip northern blot adalah memisahkan RNA berdasarkan ukuran dan terdeteksi pada membran menggunakan probe hibridisasi dengan urutan basa komplementer untuk semua, atau sebagian, dari urutan mRNA target
Komponen-Komponen utama Membran
Formaldehid
Probe
Ø Membran digunakan sebagai tempat hasil jiplakan fragmen RNA dari gel agarosa formaldehid Ø Membran yang digunakan pada Northern blooting adalah nilon
Nilon
Ø Probe atau RNA probe adalah fragmen yang digunakan untuk hibridisasi asam nukleat Ø Probe dilengkapi semua, atau sebagian, urutan basa komplementer dari urutan mRNA target.
Tahap- tahap Northern Blotting 2
1
Isolasi RNA 3
Transfer ke membran dan imobilisasi
5
Elektroforesis 4
Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe
6
Pencucian
Deteksi
1
Isolasi RNA
Penghancuran dinding sel Ø Lisis dilakukan menggunakan detergen Ø Pengotor akibat lisis sel dipisahkan dengan cara sentrifugasi Ø Kemudian molekul nukleotida (DNA dan RNA) dipisahkan dari protein menggunakan fenol
Isolasi RNA dapat dilakukan dengan beberapa tahap berikut, yaitu : Penghilangan protein dan DNA
Enzim DNAase digunakan untuk menghancurkan DNA sehingga RNA diisolasi secara utuh
Pemurnian RNA
Purifikasi RNA dapat dilakukan dengan mencampur larutan tersebut dengan PCl yang berfungsi memekatkan, memisahkan RNA dari larutan, dan mengendapkan.
2
Elektroforesis
Merupakan tahap dimana RNA dielektroforesis menggunakan gel agarosa formaldehida
Formaldehida
Gel dapat diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr) dan dilihat di bawah sinar UV untuk mengamati kualitas dan kuantitas RNA sebelum blotting.
3
Transfer ke membran dan imobilisasi
q Tahap dimana RNA yang sebelumnya telah berhasil diisolasi kemudian ditransfer ke membran nilon q Membran nilon dengan muatan positif paling efektif untuk digunakan dalam northern blot karena asam nukleat bermuatan negatif sehingga memiliki afinitas tinggi.
Setelah RNA ditransfer ke membran, maka membran harus segera disiapkan untuk crosslink RNA dengan sinar UV Tujuan crosslink RNA adalah untuk membuat RNA terikat kuat di membran
q Transfer buffer yang digunakan mengandung formamida karena menurunkan suhu dari interaksi probe-RNA yang dapat menyebabkan degradasi RNA.
Nilon
Formamida
4
Prehibridisasi dan hibridisasi dengan probe
q Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe ini melengkapi semua atau sebagian, dari urutan mRNA target q Probe harus diberi label baik dengan isotop radioaktif (32P) atau dengan chemiluminescence di mana alkali fosfatase atau horseradish peroxidase (HRP) memecah chemiluminescent substrat menghasilkan emisi terdeteksi cahaya
Tujuan dilakukannya prehibridisasi sebelum hibridisasi adalah memblok bagian nonspecific untuk mencegah probe yang single strand dari mengikat sembarang bagian pada membran.
5
Pencucian
q Tujuan dari pencucian membran adalah untuk memastikan bahwa probe telah terikat secara khusus dan untuk mencegah sinyal balik yang timbul q Hal ini juga dilakukan untuk menghilangkan unhibridisasi probe, dengan larutan buffer misalnya dengan Sodium Citrate
6
Deteksi
Tahapan deteksi dalam Northern Blot dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu :
RadioakMvi tas
Probe ditandai dengan 32P (atau 33p)
Non-radioakMf
Deteksi dilakukan dengan pewarnaan, misalnya dengan teknik chemiluminescence
Jika probe radiolabeled selesai digunakan, blot disimpan dalam bungkus pastik agar tidak kering kemudian membran di autoradiografi dengan X-ray
Perbedaan Tekhnik Southern dan Northern Blotting Southern Blo'ng
Northern Blo'ng
Deteksi molekul
DNA (ds)
mRNA (ss)
Membran
Nitroselulosa
Nilon
Elektroforesis gel
Gel agarosa
Gel agarosa formaldehid
Perawatan gel
Pemurnian, denaturasi dan netralisasi
-
Metode bloFng
Transfer melalui kapiler
Transfer melalui kapiler
Probes
DNA (radioak&f dan nonradioak&f)
cDNA, cRNA (radioak&f dan nonradioak&f)
Sistem deteksi
Autoradiography, Chemiluminescent Colorimetric
Autoradiography Chemiluminescent Colorimetric
Summary Southern DNA on membrane. Digest DNA. Convert dsDNA to ssDNA. Probe with DNA or RNA.
Northern RNA on membrane. No need to digest DNA. Denature “folded” RNA with formaldehyde. Probe with DNA or RNA.
47
