TUGAS BIOLOGI MOLEKULER Dosen Pengampu : Dr. Siswa Setyahadi, Msc, PhD
Disusun oleh : EKO MUGIYANTO SSI., APT NIM 5414220021 Angkatan XXIII
KONSENTRASI OBAT BAHAN ALAM PROGRAM MAGISTER ILMU KEFARMASIAN FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PANCASILA JAKARTA 2014 1
RNA : Struktur, Fungsi dan Sintesis RNA (ribonucleic acid) Unit fisik terkecil dari organisme hidup adalah sel. Komposisi material sel pada semua organisme adalah sama yaitu: DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), protein, lemak dan fosfolipid, yang merupakan komponen dasar semua jenis sel. Ada dua tipe sel yaitu: sel prokariotik dan sel eukariotik. Prokariota (jasad prokariotik/ primitif), yaitu jasad yang perkembangan selnya belum sempurna. Eukariota (jasad eukariotik), yaitu jasad yang perkembangan selnya telah sempurna. Sebagian besar gen pada akhirnya diekspresikan menjadi protein. Proses yang menjalankan hal ini disebut ekspresi gen. Dalam proses ini, urutan deoksinukleotida dalam DNA (yang menggambarkan gen tersebut) pertama-tama ditranskripsi menjadi urutan ribonukleotida dalam RNA (mRNA). Kemudian urutan ini ditranslasi menjadi urutan asam amino untuk membentuk suatu polipeptida dengan panjang tertentu. Urutan asam amino ini menentukan cara molekul tersebut melipat untuk menghasilkan protein biologis aktif. Rna berbeda dengan DNA baik dalam hal struktur maupun fungsinya. Rna mempunyai dua perbedaan struktur utama : masing-masing cincin ribose mengandung sebuah 2-hydoksil dan Rna menggunakan Urasil di tempat Timin. Molekul Rna mempunya pasangan basa, tetapi umumnya
tidak
akan
dapat
membentuk
RNA-RNA
dobel
helix.
RNA
dapat
bertindak sebagai materi genetik (meskipun peran ini, setidaknya untuk organisme saat ini, tampaknya masih terbatas pada virus).
DNA membawa informasi genetik dan bagian DNA yang membawa ciri khas yang diturunkan disebut gen. Konsep dasar menurunnya sifat secara molekuler adalah merupakan aliran informasi dari DNA ke RNA ke urutan asam amino. Konsep dasar ini disebut sebagai dogma genetik. Pada dogma genetik juga tercermin cara mempertahankan ciri khas supaya tetap sama melalui proses replikasi. Dogma genetik ini bersifat universal yang berlaku baik bagi prokariot maupun eukariot. Transkripsi adalah proses untuk menciptakan sebuah komplementer RNA copy dari urutan DNA. Proses transkripsi menghasilkan mRNA, rRNA dan tRNA. Transkripsi merupakan tahapan penting dalam sintesis protein atau ekspresi gen. Proses transkripsi terjadi pada nukleus (prokaryotik: nukleoid) di mana DNA diterjemahkan menjadi kode-kode dalam bentuk basa nitrogen membentuk rantai RNA yang bersifat single strain. Namun, pada rantai RNA yang terbentuk basa Timin digantikan dengan basa Urasil. Pada 2
prokaryotik, rantai RNA langsung ditranslasikan sebelum transkripsi selesai. Sedangkan pada eukaryotik, rantai di bawa menuju sitoplasma (ribosom) untuk ditranslasi menjadi produk gen. Tidak seperti DNA, RNA dapat membentuk struktur tiga dimensi yang kompleks. Akibatnya, RNA juga dapat menampilkan aktivitas katalitik. Kombinasi kemampuan untuk menyimpan informasi genetik dengan kemampuan untuk mengkatalisis reaksi telah menghasilkan usulan untuk asal usul kehidupan: "Dunia RNA". Sebagian besar fungsi RNA berkaitan dengan sintesis protein
dan juga RNA merupakan bahan genetik dan memainkan peran utama dalam ekspresi genetik. Jenis utama RNA: RNA ribosom (rRNA) Molekul RNA ribosom terdiri dari 65 sampai 70% dari massa ribosom (yang bertanggung jawab untuk sintesis protein). Ribosom merupakan organel yang sangat besar; ribosom prokariotik memiliki berat molekul sekitar 2,5 juta, sedangkan eukariotik ribosom memiliki berat molekul sekitar 4 juta. Sebagai catatan penelitian asli pada ribosom digunakan relatif teknik mentah yang tidak dapat mengukur ukuran dalam hal berat molekul. Sebaliknya ukuran partikel ribosom dan komponen mereka diukur dengan tingkat mereka sedimentasi (gerakan didorong oleh percepatan gravitasi atau percepatan sentrifugal). Sedimentasi merupakan fungsi dari ukuran, bentuk, dan kepadatan, dengan objek yang lebih besar cenderung sedimen lebih cepat daripada yang lebih kecil. Ukuran objek yang diukur dalam satuan Svedberg. Ribosom prokariotik 70 partikel S, dengan masing-masing terdiri dari besar (50 S) dan kecil (30 S) subunit. Ribosom eukariotik 80 S partikel, terdiri dari besar (60 S) dan kecil (40 S) subunit. Unit Svedberg adalah tidak aditif untuk partikel ukuran; hal ini disebabkan efek dari bentuk pada sedimentasi. Ribosom eukariotik 40S berisi 1 rRNA (18 S rRNA = 1.900 basis) dan sekitar 35 protein yang berbeda. ribosom 60S berisi 3 rRNA (5 S = 120 basis, 5,8 S = 160 basa, dan 28 S = 4700 basis), dan sekitar 50 protein. rRNA 5 S memiliki sendiri gen; yang lainnya disintesis sebagai transkrip tunggal yang kemudian dibelah untuk melepaskan molekul RNA matang yang menjadi bagian dari ribosom. Sampai relatif baru-baru ini, diasumsikan bahwa RNA ribosom melakukan fungsi sebagian besar struktural. Namun, data yang lebih baru sangat menunjukkan bahwa rRNA bertindak sebagai enzim, protein yang bertindak sebagai perancah struktural. Data ini mencakup
3
hasil dari resolusi tinggi baru-baru ini (2,4 Å) difraksi sinar-X struktur subunit besar dan resolusi rendah (5 Å) struktur lengkap ribosom dari bakteri Haloarcula marismortui.
Transfer RNA (tRNA) tRNA adalah tempat molekul ~ 75 yang mengusung asam amino. tRNA diperkirakan memiliki struktur tersier umum (struktur berdasarkan analisis difraksi sinar-X ditampilkan di bawah). Analisis urutan tRNA menunjukkan struktur sekunder daun semanggi yang dibentuk oleh daerah basis pairing antara bagian untai RNA, dengan daun semanggi ini melipat ke dalam struktur tiga dimensi.
Messenger RNA (mRNA) Molekul mRNA mengandung urutan coding untuk protein. Molekul-molekul mRNA dapat bervariasi dalam ukuran, dengan transkrip eukariotik termasuk terbesar asam ribonukleat yang dikenal. Hal ini paling jelas sebelum splicing intron, karena banyak transkrip melebihi 100 kb panjangnya.
4
Basis RNA Dasar yang digunakan untuk RNA yang melekat pada ribosa. Namun, banyak yang secara signifikan dimodifikasi dari khas empat basa biasanya dianggap sebagai bagian dari RNA. ini adalah terutama berlaku untuk tRNA. Basis yang dimodifikasi meliputi pseudouracil dan versi alkohol dari sitosin dan adenin. Perbedaan antara RNA dan DNA adalah transkripsi yang mirip dengan replikasi DNA, hususnya dalam penggunaan substrat trifosfat nukleosida dan template diarahkan pertumbuhan rantai asam nukleat dalam 5 '→ 3' arah. Dua perbedaan utama adalah sebagai berikut: (1) Dengan pengecualian tahu sedikit, hanya satu untai DNA template yang ditranskripsi, dan (2) hanya sebagian kecil dari potensi genetik seluruh organisme diwujudkan dalam satu sel. (Mathews van Holde, hal:956) Ekspresi informasi genetik normalnya melibatkan produksi molekul RNA yang ditranskripsi dari templat DNA. Rantai DNA dan RNA mungkin kelihatan sama, perbedaan hanya terletak pada posisi 2’ pentosa dan penggantian Tymin menjadi Urasil. RNA merupakan satu-satunya makromulekul yang berfungsi untuk menyimpan, mentransmisikan informasi genetik, dan sebagai katalis. Penemuan katalis RNA atau ribozim telah merubah defenisi dari enzim. Proses sintesis molekul RNA menggunakan DNA sebagai templat disebut transkripsi. Molekul RNA yang disintesis mempunyai urutan basa yang kompelemen dengan salah satu rantai DNA. Proses transkripsi menghasilkan tiga jenis molekul RNA, yaitu : mRNA, tRNA dan rRNA. Messenger RNA (mRNA) merupakan blue print yang mengkode urutan asam amino dari satu atau lebih polipeptida yang terdapat dalam satu gen atau sekumpulan gen. Transfer RNA (tRNA) berfungsi membaca informasi yang dikode oleh mRNA dan mentransfer asam amino tertentu ke rantai polipeptida yang sedang tumbuh selama proses sintesis protein. Molekul ribosomal RNA (rRNA) merupakan komponen ribosom, yang berfungsi sebagai cetakan tempat sintesis protein terjadi. Selama proses replikasi keseluruhan kromosom di-copy, namun transkripsi bersifat lebih selektif. Hanya gen tertentu atau sekumpulan gen tertentu yang ditranskripsi pada suatu waktu tertentu, dan beberapa bagian DNA genom tidak pernah ditranskripsi. Sel membatasi ekspresi informasi genetik untuk membentuk produk gen yang dibutuhkan pada waktu tertentu. Terdapat urutan regulator spesifik yaitu promotor pada awal gen dan terminator pada akhir gen, yang 5
menandakan bagian DNA mana yang akan digunakan sebagai templat. Promotor merupakan urutan pada awal gen yang dikenali oleh RNA polimerase untuk memulai transkripsi, dan terminator merupakan urutan yang memberikan sinyal penghentian transkripsi. Rantai DNA yang berfungsi sebagai cetakan untuk sintesis RNA disebut rantai templat. Rantai DNA yang komplemen dengan tempat disebut rantai non-templat atau rantai pengkode. Rantai pengkode atau coding strand identik dengan rantai RNA yang ditranskripsi, kecuali basa T diganti dengan basa U. (Shabarni Gaffar.hal:31-33) Secara ringkas berikut ini hal yang membedakan antara DNA dan RNA
Tabel . Perbedaan DNA dan RNA
-
Letak
- Bentuk - Gula - Basanya
- Fungsi
DNA (Deoxyribo Nukleat Acid) Dalam inti sel, mitokondria, kloroplas, senriol. Polinukleotida ganda yang terpilin panjang Deoxyribosa Golongan purin : adenine dan guanine Golongan pirimidin : cytosine dan timin
RNA (Ribo Nukleat Acid) Dalam inti sel, sitoplasma dan ribosom.
mengontrol sifat yang menurun sintesis protein
-
Kadarnya
Polinukleotida tunggal dan pendekl Ribosa Golongan purin : adenine dan guanine Golongan pirimidin : cytosine dan urasil sintesis protein
sintesis RNA
Tidak dipengaruhi sintesis protein. Letak basa nitrogen dari kedua pita ADN saling berhadapan dengan pasangan yang tetap yaitu Adenin selalu berpasangan dengan Timin, Cytosin dengan Guanin. Kedua pita itu diikatkan oleh ikatan hidrogen.
Dipengaruhi sintesis protein. Macam RNA : RNA duta RNA ribosom RNA transfer
6
Prinsip Dasar Transkripsi Fungsi dasar kedua yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi genetik adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan dan diferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu. Fungsi ini dilaksanakan melalui ekspresi gen, yang tahap pertamanya adalah proses transkripsi, yaitu perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (templat)nya. Transkripsi mempunyai ciri-ciri kimiawi yang serupa dengan sintesis/replikasi DNA, yaitu;
Adanya sumber basa nitrogen berupa nukleosida trifosfat. Bedanya dengan sumber basa untuk sintesis DNA hanyalah pada molekul gula pentosanya yang tidak berupa deoksiribosa tetapi ribosa dan tidak adanya basa timin tetapi digantikan oleh urasil. Jadi, keempat nukleosida trifosfat yang diperlukan adalah adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sitidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP).
Adanya untai molekul DNA sebagai cetakan. Dalam hal ini hanya salah satu di antara kedua untai DNA yang akan berfungsi sebagai cetakan bagi sintesis molekul RNA. Untai DNA ini mempunyai urutan basa yang komplementer dengan urutan basa RNA hasil transkripsinya, dan disebut sebagai pita antisens. Sementara itu, untai DNA pasangannya, yang mempunyai urutan basa sama dengan urutan basa RNA, disebut sebagai pita sens. Meskipun demikian, sebenarnya transkripsi pada umumnya tidak terjadi pada urutan basa di sepanjang salah satu untai DNA. Jadi, bisa saja urutan basa yang ditranskripsi terdapat berselang-seling di antara kedua untai DNA.
Sintesis berlangsung dengan arah 5’→ 3’ seperti halnya arah sintesis DNA.
Gugus 3’- OH pada suatu nukleotida bereaksi dengan gugus 5’- trifosfat pada nukleotida berikutnya menghasilkan ikatan fosofodiester dengan membebaskan dua atom pirofosfat anorganik (PPi). Reaksi ini jelas sama dengan reaksi polimerisasi DNA. Hanya saja enzim yang bekerja bukannya DNA polimerase, melainkan RNA polimerase. Perbedaan yang sangat nyata di antara kedua enzim ini terletak pada kemampuan enzim RNA polimerase untuk melakukan inisiasi sintesis RNA tanpa adanya molekul primer.
7
5’
5’-PO4
3’
3’
5’
3’-OH Arah sintesis RNA Skema dasar transkripsi Pada umumnya, gen yang mengkode protein pada prokaryot berupa gen dengan kopi tunggal (single copy), sedangkan gen yang mengkode tRNA dan rRNA berupa gen dengan jumlah kopi banyak (multiple copies). Gen-gen pada prokaryot yang bertanggung jawab dalam jalur biokimia tertentupada umumnya diorganisasikan dalam struktur operon. Suatu operon adalah organisasi beberapa gen stuktural yang ekspresinya dikendalikan oleh suatu promoter yang sama. Sebagai contoh adalah operon lac, yaitu operon yang mengendalikan kemampuan metabolisme laktosa pada bakteri Escherichia coli. Dalam operon lac terdapat tiga macam gen struktural yang mengkode protein yang berbeda, yaitu gen Z (mengkode β-galaktosidase), gen γ (mengkode permease) dan gen A(mengkode trans-asetilase). Masing –masing gen struktural tersebut mempunyai kodon inisiasi (awal) dan kodon terminasi, tetapi ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama. Pada waktu ditranskripsi, operon lac akan menghasilkan satu mRNA yang membawa kode-kode genetik untuk tiga macam polipeptida yang berbeda (oleh karena itu disebut mRNA polisistronik). Masing-masing polipeptida akan ditranslasi secara independen dari satu untaian mRNA yang sama. Β-galaktosidase
I
Gen represor
p
o
Operator
z
Trans-asetilase
y
a
Permease
Promoter 8
Organisasi operon lac pada Escherichia coli
(Triwibowo Yuwono: 135-136)
Proses Transkripsi Secara garis besar transkripsi berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengenalan promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Masing-masing tahap akan dijelaskan secara singkat sebagai berikut. Pengenalan promoter Agar molekul DNA dapat digunakan sebagai cetakan dalam sintesis RNA, kedua untainya harus dipisahkan satu sama lain di tempat-tempat terjadinya penambahan basa pada RNA. Selanjutnya, begitu penambahan basa selesai dilakukan, kedua untai DNA segera menyatu kembali. Pemisahan kedua untai DNA pertama kali terjadi di suatu tempat tertentu, yang merupakan tempat pengikatan enzim RNA polimerase di sisi 5’ (upstream) dari urutan basa penyandi (gen) yang akan ditranskripsi. Tempat ini dinamakan promoter.
Inisiasi Setelah mengalami pengikatan oleh promoter, RNA polimerase akan terikat pada suatu tempat di dekat promoter, yang dinamakan tempat awal polimerisasi atau tapak inisiasi (initiation site). Tempat ini sering dinyatakan sebagai posisi +1 untuk gen yang akan ditranskripsi. Nukleosida trifosfat pertama akan diletakkan di tapak inisiasi dan sintesis RNA pun segera dimulai. Elongasi Pengikatan enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya pada untai DNA cetakan membentuk kompleks transkripsi. Selama sintesis RNA berlangsung kompleks transkripsi akan bergeser di sepanjang molekul DNA cetakan sehingga nukleotida demi nukleotida akan ditambahkan kepada untai RNA yang sedang diperpanjang pada ujung 3’ nya. Jadi, elongasi atau polimerisasi RNA berlangsung dari arah 5’ ke 3’, sementara RNA polimerasenya sendiri bergerak dari arah 3’ ke 5’ di sepanjang untai DNA cetakan. Terminasi Berakhirnya polimerisasi RNA ditandai oleh disosiasi kompleks transkripsi atau terlepasnya enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya dari untai DNA cetakan. Begitu pula halnya dengan molekul RNA hasil sintesis. Hal ini terjadi ketika RNA polimerase mencapai urutan basa tertentu yang disebut dengan terminator. Terminasi transkripsi dapat 9
terjadi oleh dua macam sebab, yaitu terminasi yang hanya bergantung kepada urutan basa cetakan (disebut terminasi diri) dan terminasi yang memerlukan kehadiran suatu protein khusus (protein rho). Di antara keduanya terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri terjadi pada urutan basa palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan palindrom adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan. Oleh karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa tertentu, maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung terminasi berbentuk batang dan kala (loop). Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi sebelumnya. Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan pemanjangan 50 hingga 60 nukleotida, promoter dapat mengikat RNA polimerase yang lain. Pada gen-gen yang ditranskripsi dengan cepat reinisiasi transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga gen tersebut akan terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat penyelesaian yang berbeda-beda.
Transkripsi pada prokariot Transkripsi gen oleh RNA polimerase E. coli berlangsung dalam tiga tahap: inisiasi, elongasi dan terminasi. Selama inisiasi, RNA polimerase mengakui situs tertentu pada DNA, hulu dari gen yang akan ditranskripsi, disebut situs promotor dan kemudian unwinds DNA secara lokal. Selama perpanjangan polimerase RNA menggunakan antisense untai DNA sebagai template dan mensintesis molekul RNA komplementer menggunakan trifosfat ribonucleoside 5 'sebagai prekursor. RNA dihasilkan memiliki urutan yang sama seperti untai non-template, yang disebut rasa strand (strand atau coding) kecuali bahwa RNA mengandung U bukan T. Pada lokasi yang berbeda pada kromosom bakteri, kadang-kadang satu untai digunakan sebagai template, kadang-kadang yang lain, tergantung pada strand adalah untai coding untuk gen yang bersangkutan. Untai yang tepat untuk digunakan sebagai template diidentifikasi untuk polimerase RNA dengan kehadiran situs promotor. Akhirnya, polimerase RNA bertemu sinyal terminasi transkripsi dan berhenti, melepaskan transkrip RNA dan memisahkan dari DNA. (B.D.Hames & N.M.Hooper, Hal: 170) Telah dikatakan di atas bahwa transkripsi merupakan proses sintesis RNA yang dikatalisis oleh enzim RNA polimerase. Berikut ini akan diuraikan sekilas enzim RNA 50
10
polimerase pada prokariot, khususnya pada bakteri E.coli, promoter σ70, serta proses transkripsi pada organisme tersebut. RNA polimerase E. coli Enzim RNA polimerase pada E. coli sekurang-kurangnya terdiri atas lima subunit, yaitu alfa (α), beta (β), beta prima (β’), omega (ɷ, dan sigma (σ). Pada bentuk lengkapnya, atau disebut sebagai holoenzim, terdapat dua subunit α dan satu subunit untuk masing-masing subunit lainnya sehingga sering dituliskan dengan α2ββ’ɷσ. Holoenzim RNA polimerase diperlukan untuk inisiasi transkripsi. Namun, untuk elongasi transkripsi tidak diperlukan faktor σ sehingga subunit ini dilepaskan dari kompleks transkripsi begitu inisiasi selesai. Sisanya, yakni α2ββ’ɷ, merupakan enzim inti (core enzyme) yang akan melanjutkan proses transkripsi. Kebanyakan urutan DNA yang ditranskrifsikan memunculkan mRNA, yang segera ditranslasikan menjadi protein. Namun, jenis RNA yang paling berlimpah adalah ribosomal RNA (rRNA) dan transfer RNA (tRNA), yang tidak mengode protein melainkan berfungsi dalam proses translasi. Reaksi kimia keseluruhan yang dikatalis oleh RNA polimerase adalah nNTP
Mg2+
(NMP)n + nPPi
Reaksi ini menggunakan empat ribonukleosida trifosfat (ATP, GTP, UTP, dan CTP) untuk menyusun suatu rantai RNA, urutannya ditentukan oleh untai templat DNA. Penambahan nukleotida berlangsung berurutan, ikatan fosfodieter terbentuk melalui mekanisme yang sama seperti dijelaskan untuk DNA polimerase.
11
(Yohanis Ngili.hal:479) Tahapan transkripsi pada prokariot Di bawah ini akan dijelaskan sekilas tentang pembukaan heliks, yang terjadi antara tahap pengikatan promoter dan insiasi transkripsi. Pengikatan promoter Pada awalnya, RNA polimerase inti (α2ββ’ɷ) mempunyai afinitas nonspesifik terhadap DNA. Keadaan ini dikenal sebagai pengikatan longgar, dan sifatnya cukup stabil. Namun, begitu faktor σ bergabung dengan enzim inti tersebut hingga terbentuk holoenzim, terjadilah pengurangan afinitas nonspesifik terhadap DNA hingga 20.000 kali. Sejalan dengan hal itu, faktor σjuga meningkatkan pengikatan holoenzim pada tempat pengikatan promoter yang tepat hingga 100 kali. Dengan demikian, akan terjadi peningkatan spesifisitas holoenzim yang tajam dalam mengenali promoter. Pada genom E. coli holoenzim dapat mencari dan mengikat promoter dengan sangat cepat. Bahkan, karena begitu cepatnya, maka proses ini tidak mungkin terjadi melalui pengikatan dan pelepasan holoenzim dari DNA secara berulang-ulang. Kemungkinan yang masuk akal hanyalah melalui pergeseran holoenzim di sepanjang molekul DNA hingga mencapai urutan promoter. Pada promoter, holoenzim mengenali urutan -35 dan - 10. Kompleks awal antara holoenzim dan promoter dikenal sebagai kompleks tertutup (closed complex). Pembukaan heliks 12
Agar pita antisens dapat diakses untuk perpasangan basa antara DNA dan RNA yang disintesis, untai ganda (heliks) DNA harus dibuka terlebih dahulu oleh enzim RNA polimerase. Pada kebanyakan gen pembukaan heliks oleh RNA polimerase akan dimudahkan oleh struktur superkoiling negatif DNA sehingga transkripsi dapat ditingkatkan. Namun, tidak semua promoter dapat diaktivasi oleh superkoiling negatif sehingga terisyaratkan bahwa perbedaan topologi DNA dapat mempengaruhi transkripsi. Hal ini mungkin karena adanya perbedaan hubungan sterik pada urutan -35 dan -10 di dalam heliks. Sebagai contoh, promoter untuk subunit enzim DNA girase justru dihambat oleh superkoiling negatif. Seperti kita ketahui, DNA girase adalah enzim yang bertanggung jawab untuk superkoiling negatif pada genom E. coli sehingga superkoiling negatif ini dapat bertindak sebagai umpan balik yang menghambat ekspresi DNA girase. Pembukaan awal heliks DNA akan menyebabkan pembentukan kompleks terbuka (open complex) dengan RNA polimerase. Proses ini dikenal sebagai pengikatan ketat. Inisiasi Berbeda dengan sintesis DNA, sintesis RNA dapat berlangsung tanpa adanya molekul primer. Oleh karena hampir semua tapak inisiasi transkripsi berupa basa G atau A, maka nukleosida trifosfat pertama yang digunakan untuk sintesis RNA adalah GTP atau ATP. Mula-mula RNA polimerase akan menggabungkan dua nukleotida pertama dan membentuk ikatan fosfodiester di antara kedua nukleotida tersebut. Selanjutnya, sembilan basa pertama ditambahkan tanpa disertai pergeseran RNA polimerase di sepanjang molekul DNA. Pada akhir penambahan masing-masing basa ini akan terdapat peluang yang nyata terjadinya aborsi untai RNA yang baru terbentuk itu. Proses inisiasi abortif mempengaruhi laju transkripsi secara keseluruhan karena proses tersebut memegang peranan utama dalam menentukan waktu yang dibutuhkan oleh RNA polimerase untuk meninggalkan promoter dan memungkinkan RNA polimerase lainnya menginisiasi putaran transkripsi berikutnya. Waktu minimum untuk pengosongan promoter ini adalah 1 hingga 2 detik, suatu waktu yang relatif lama bila dibandingkan dengan waktu untuk tahap-tahap transkripsi lainnya. Elongasi Jika inisiasi berhasil, RNA polimerase melepaskan faktor σ, dan bersama-sama dengan DNA dan RNA nasen (RNA yang baru disintesis), akan membentuk kompleks terner atau kompleks yang terdiri atas tiga komponen. Dengan adanya kompleks terner ini RNA polimerase 13
dapat berjalan di sepanjang molekul DNA. Artinya, promoter akan ditinggalkannya untuk kemudian ditempati oleh holoenzim RNA polimerase berikutnya sehingga terjadi reinisiasi transkripsi. Bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks, atau disebut dengan gelembung transkripsi (transcription bubble), akan terlihat bergeser di sepanjang molekul DNA sejalan dengan gerakan RNA polimerase. Panjang bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks tersebut relatif konstan, yakni sekitar 17 pb, sedangkan ujung 5’ molekul RNA yang disintesis akan membentuk heliks hibrid dengan pita antisens DNA sepanjang lebih kurang 12 pb. Ukuran ini ternyata tidak mencapai satu putaran heliks. RNA polimerase E. coli bergerak dengan kecepatan rata-rata 40 nukleotida per detik. Akan tetapi, angka ini dapat bervariasi sesuai dengan urutan lokal DNA (urutan DNA yang telah dicapai oleh RNA polimerase). Tetap dipertahankannya bagian DNA yang mengalami pembukaan heliks menunjukkan bahwa RNA polimerase membuka heliks DNA di depan gelembung transkripsi dan menutup heliks DNA di belakangnya. Dengan demikian, heliks hibrid RNA-DNA harus berputar setiap kali terjadi penambahan nukleotida pada RNA nasen. Terminasi RNA polimerase tetap terikat pada DNA dan melangsungkan transkripsi hingga mencapai urutan terminator (sinyal stop), yang pada umumnya berupa struktur seperti tusuk konde (hairpin). Struktur yang terdiri atas batang dan kala (loop) ini terjadi karena RNA hasil transkripsi mengalami komplementasi diri. Biasanya, bagian batang sangat kaya dengan GC sehingga sangat stabil (GC mempunyai ikatan rangkap tiga). Di sebelah downstream (3’) dari struktur tusuk kode sering kali terdapat urutan yang terdiri atas empat U atau lebih. Nampaknya RNA polimerase akan segera berhenti begitu struktur tusuk konde RNA disintesis. Bagian ujung RNA yang mengandung banyak U tersebut mempunyai ikatan yang lemah dengan basa-basa A pada DNA cetakan sehingga molekul RNA hasil sintesis akan dengan mudah terlepas dari kompleks transkripsi. Selanjutnya, pita DNA cetakan yang sudah tidak berikatan atau membentuk hibrid dengan RNA segera menempel kembali pada pita DNA komplemennya. RNA polimerase inti pun akhirnya terlepas dari DNA. Terminasi menggunakan protein rho Telah disinggung di muka bahwa selain karena adanya struktur tusuk konde, terminasi transkripsi dapat juga terjadi dengan bantuan suatu protein khusus yang dinamakan protein rho 14
(ρ). Rho merupakan protein heksamer yang akan menghidrolisis ATP dengan adanya RNA untai tunggal. Protein ini nampak terikat pada urutan sepanjang 72 basa pada RNA, yang diduga lebih disebabkan oleh pengenalan suatu struktur spesifik daripada karena adanya urutan konsensus. Rho bergerak di sepanjang RNA nasen menuju kompleks transkripsi. Pada kompleks transkripsi ini rho memungkinkan RNA polimerase untuk berhenti pada sinyal terminator tertentu. Sinyalsinyal terminator ini, seperti halnya sinyal terminator yang tidak bergantung kepada rho, lebih dikenali oleh RNA daripada oleh DNA cetakannya. Adakalanya terminator tersebut juga berupa struktur tusuk konde tetapi tidak dikuti oleh urutan poli U. Pada E. Coli, terdapat dua mekanisme terminasi yaitu: adanya protein ρ (rho) yang membantu melepaskan RNA atau terminasi tanpa bantuan protein ρ (rho-independen) dimana pada daerah terminator membentuk seperti loop. (Shabarni Gaffar.hal:34) Struktur RNA Molekul RNA mempunyai bentuk yang berbeda dengan DNA. RNA memiliki bentuk pita tunggal dan tidak berpilin. Tiap pita RNA merupakan polinukleotida yang tersusun atas banyak ribonukleotida. Tiap ribonukleotida tersusun atas gula ribosa, basa nitrogen, dan asam fosfat. Basa nitrogen RNA juga dibedakan menjadi basa purin dan basa pirimidin. Basa purinnya sama dengan DNA tersusun atas adenin (A) dan guanin (G), sedangkan basa pirimidinnya berbeda dengan DNA yaitu tersusun atas sitosin (C) dan urasil (U). Tulang punggung RNA tersusun atas deretan ribosa dan fosfat. Ribonukleotida RNA terdapat secara bebas dalam nukleoplasma dalam bentuk nukleosida trifosfat, seperti adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sistidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP). RNA disintesis oleh DNA di dalam inti sel dengan menggunakan DNA sebagai cetakannya. Susunan RNA terdiri atas: a. gugus fosfat b. gula pentosa (gula ribosa), c. basa nitrogen. Basa nitrogen dibedakan menjadi dua jenis. 1) Basa purin yang tersusun dari Adenin (A) dan Guanin (G). 2) Basa pirimidin yang tersusun dari Sitosin (S) dan Urasil (U). 15
Proses transkripsi menghasilkan tiga jenis molekul RNA, yaitu : mRNA, tRNA dan rRNA. Messenger RNA (mRNA) merupakan blue print yang mengkode urutan asam amino dari satu atau lebih polipeptida yang terdapat dalam satu gen atau sekumpulan gen. Transfer RNA (tRNA) berfungsi membaca informasi yang dikode oleh mRNA dan mentransfer asam amino tertentu ke rantai polipeptida yang sedang tumbuh selama proses sintesis protein. Molekul ribosomal RNA (rRNA) merupakan komponen ribosom, yang berfungsi sebagai cetakan tempat sintesis protein terjadi.
16
