Mátrix effektus a 25(OH)D-vitamint és a parathormont mérő módszerekben valamint
a 2013-as QuliCont eredményekből levonható tanulságok Toldy Erzsébet, Kányási Mária, Walentin Szilvia QuliCont Fórum 2015. január 30. Budapest, Lurdy Konferencia-és Rendezvényközpont Könyves Kálmán Krt. 12-14.
Fehérjekötésen alapuló módszerek speciális hibalehetőségei I. Analittel összefüggő a standardként használt molekula nem azonos a páciensével- oka az analit in nate heterogenitása
II. A biológiai minta mátrixával összefüggő • Interferencia • Keresztreakció • Mátrix effektus
Interferencia: A mért eredményben torzítást okozó olyan szubsztancia jelenléte, amely zavaró interferenciát okoz. Jelenléte izolálható. – Keveréses vizsgálat. Eltérő módszerek között is ellentmondásos leletet okozhat.
Complementek, fibrinogén, EDTA, bilirubin, haemolisis,
Keresztreakció: a biológiai testnedvekben előforduló keresztreagáló metabolit, gyógyszer, vagy antitest (Rf, HAMA, HAHA, endogén antitestek) A potenciálisan keresztreagáló ágensek nincsenek jelen a standardokban és kontroll mintákban , de jelen lehetnek a beteg szérumában.
MÁTRIX EFFEKTUS: Főként a fehérjekötésen alapuló (immunoassay, protein binding assay) analitikai módszereknél tapasztalható az eredményekben olyan torzítás, amely az analit mátrix összetétel különbözőségből adódik. pl. szérum-plazma; aktív szénnel kezelt szérum-natív szérum, vagy vizelet-szérum, ascites-szérum, liquor-szérum között.
A gyakorlatban a mátrix effektus jelenséget a kalibrátor görbéhez használt szérum-mátrix és a biológiai minta-mátrix között fennálló különbség okozza.
„Ambient assay” - R. Ekins Az eredmény függ a biológiai minta-mátrixtól Az analit és az antitest közötti kötést befolyásolja a reakciótérben lévő környezet:
= analit (pl. hormon)
• pH-ja, • ion erőssége, • protein jelenléte, szintje. fehérjefrakciók mennyisége és aránya • a hidrofób molekulák
- döntő fontosságú a Ag-Ab komplexek kialakulásához
Globulin
Albumin
Lehetőségek a mátrix effektus csökkentésére a biológiai minta mennyiségének csökkentése, a reagens mennyiség javára, amelyben növeljük a protein és ionkoncentrációt valamint a puffer kapacitást. – Ugyanakkor a biológiai mintamennyiség csökkentésével rontjuk a módszer szenzitivitását is. - Klinikai használatra a standardok készítésénél egészséges fehérje és ionkoncentrációkra beállított humán szérum matrixot használjuk. Ettől eltérő a súlyos betegek szérum mátrixa. - Kérdés, hogy a reakciótérben a reagensek milyen fokban képesek ezt az eltérést kompenzálni?
MUNKACSOPORTUNK MÁTRIX EFFEKTUS IRÁNYÚ VIZSGÁLATA: Több irodalmi adattal rendelkezünk már arra nézve, hogy a D vitamin ellátottság javításával egyes betegségek iránti fogékonyság, valamint a már fennálló betegségek relapszusának elkerülése is jobban biztosítható. Ezért, a klinikai gyakorlatban egyre gyakrabban felmerül az igény a 25OHD szintek pontos mérésére olyan biológiai mintákban is, ahol a normálistól eltérő fehérjefrakciókkal (pl. alacsony albumin, alacsony v. magas D vitamin bindig protein (DBP), stb…) is számolnunk kell. Ezért végeztünk in vitro és in vivo vizsgálatokat a hazánkban a klinikai kémiai gyakorlatban leggyakrabban alkalmazott két 25OHD vitamint mérő módszerrel.
Albuminfüggés vizsgálata: in vitro ANYAG ÉS MÓDSZER: Összesen 6 db alacsony albuminszintű szérum poolhoz 5 lépésben adtunk 20%-os human albumint tartalmazó oldatot annyi mennyiségben, hogy lépcsőzetesen növeltük a minta albuminszintjét addig, hogy annak értéke a normális albuminszintet elérje, illetve meghaladja.
Mindegyik mintából (N=36) meghatároztuk mindkét módszerrel a 25OHD szinteket
25(OH)D vitamint mérő két teljesen automatizált módszer I. Antitest kötésen alapuló: IMMUNO-ASSAY CLIA (DiaSorin) 25(OH)D a szérumban DBP 25(OH)D Albumin
II. Fehérje kötésen alapuló : ECL-PBA (Roche)
A két módszerrel mért 25OHD szintek az albuminmanipulációt követően Mérhető 25OHD szintek
25OHD szintek változása%
25OHD vitamin szintek az alacsony és a közel normális albuminszintű minták esetében PBA
IMMUNO-ASSAY
KW-H(1;36) = 7,85; p = 0,005
KW-H(1;36) = 1,1725; p = 0,279 36
70
N.S.
34
50
32
**
25(OH)D nmol/l
25(OH)D nmol/l
60
40 30
30 28 26 24 22 20
20
18
10
<30
>30 g/l Albumin szintek
16 Median 25%-75% Min-Max
<30
>30 g/l Albumin szintek
Median 25%-75% Min-Max
KORRELÁCIÓK AZ ALBUMINSZINTEK ÉS A MÉRT 25OHD VITAMIN SZINTEK KÖZÖTT Protein Binding-Assay Immuno-Assay N.S.
***
***
%-os változás a 25OHD szintekben
***
In vitro albuminmanipuláció eredményekből levonható következtetések
IN VIVO: klinikai tapasztalat elemzése A Belgyógyászati betegek diagnózis szerinti megoszlása
N=64 . Nephrosis+Malnutritio
Chronical renal faileure
Cirrhosis
Kontrollként állítottunk 48 nemben és életkorban illesztett, aktív életvitelű személyt Elemzett paraméterek: albumin, DBP, PTHi, 25OHD vitamin szintek.
A kontroll és a beteg csoportban mért albumin és DBP szintek közötti különbség Albumin g/l: KW-H(1;112) = 80,6; p = 0.0000 50
D-vitamin binding protein mg/l: KW-H(1;111) = 27,5 ; p = 0,000 360
48 340
46 D-vitamin binding protein mg/l
44
Albumin g/l
42 40 38 36 34
***
32 30
320
300
***
280
260
240
28 26 Beteg
Aktív-Kontroll
Mean Mean±SE Mean±1,96*SE
220 Beteg
Aktív-Kontroll
Mean Mean±SE Mean±1,96*SE
25OHD szintek a két módszerrel mérve: a módszerek között szignifikáns különbséget csak az alacsony albuminszintű betegekben találtunk
Korrelációk az albumin és a 25OHD szintek között
Beteg
Kontroll
r = 0,40; p = 0,001
Nincs korreláció
2,0
***
2,1
Log25(OH)D nmol/l PBA
Log25(OH)D nmol/l PBA
1,8
2,2
1,6
1,4
1,2
1,0
N.S.
2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3
0,8 16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
36
Albumin g/l
38
1,2 40
40
42
44
r = 0,40; p = 0,001
1,7
52
54
56
58
0,95 Conf.Int.
Nincs korreláció
***
1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 16
50
2,1
Log25(OH)D nmol/l Immunoassay
Log25(OH)D nmol/l Immunoassay
1,8
48
Albumin g/l
2,0 1,9
46
0,95 Conf.Int.
18
20
22
24
26
28
30
Albumin g/l
32
34
36
38
40
0,95 Conf.Int.
2,0
N.S.
1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 40
42
44
46
48
50
Albumin g/l
52
54
56
58
0,95 Conf.Int.
A DBP és albumin között csak a betegek esetében áll fenn szignifikáns pozitív korreláció
Beteg
Kontroll
A két 25OHD módszer albumin függése A betegminták csoportosításában In vitro kísérletnek ellentmond az IA esetében
IA N.S. PBA P=0,057
Albumin
Korreláció a 25OHD és a DBP között Beteg Kontroll r = 0,30; p = 0,020;
Nincs korreláció
2,0
N.S.
*
Log25(OH)D nmol/l PBA
Log25(OH)D nmol/l PBA
1,8
2,2
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8 50
100
150
200
250
300
350
DBP mg/l
400
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2 100
450
150
200
0,95 Conf.Int.
r = 0,44; p = 0,0004
1,7
400
450
0,95 Conf.Int.
Nincs Korreláció
***
1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 50
350
2,1
Log25(OH)D nmol/l Immunoassay
Log25(OH)D nmol/l Immuno assay
1,8
300
DBP mg/l
2,0 1,9
250
100
150
200
250
DBP mg/l
300
350
400
450
0,95 Conf.Int.
2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 100
N.S. 150
200
250
300
DBP mg/l
350
400
450
0,95 Conf.Int.
A két módszerrel mért 25OHD szintek az alacsony és a normál DBP szintű mintákban A 25OHD IA módszer DBP függése erősebb, mint a PBA esetében
IA PBA
Klinikai adatokból levonható következtetések, összevetve az In vitro albuminmanipuláció eredményekkel
A 2013-as QuliCont eredményekből levonható tanulságok QuliCont: Gyógyszerek, hormonok- 196-os és Cametabolismus 301-es 4 ill. 6 körvizsgálat/év 25(OH)D vitamin és PTHi adatok.
25(OH)D-vitamin
Beküldött kontroll eredmények száma 2010-2013
A 25(OH)D vitamint mérő módszerek megoszlása
Melyik tartományt ellenőrizték a QuliCont kontroll szérumok 2013-ban
Nem ellenőriztük: Elégtelen
1.) Toxikus tartományt ( >250 nmol/l)
Hiány
2.)Súlyos hiányt (<20-25nmol/l)
Súlyos hiány
Miként is mérünk összességében 25OHD Szinteket a módszertől függetlenül: K1 szérum
‼
Miként is mérünk összességében? módszertől függetlenül: K2 szérum?
‼
Eltérés a célértékektől százalékban
Laboratóriumonként leadott 25OHD eredmények 4 azonos kontroll szérum esetében Szaggatott vonal: Célértékek átlaga
Laboratóriumonként leadott eredmények eltérése a módszer specifikus célértéktől
Cél
Célértéktől való eltérések az 5 módszer esetében
PTH intact H2N
COOH
Parathormon (PTH) mérés Mit mérnek a PTH-intact módszerek? 3. Generáció BIO-intact (1-84) 2011-
2. Generáció
4. generáció!!! 2014-től
PTH molekulaformák a keringésben
A 40 laboratórium által alkalmazott 7 PTHi módszer megoszlása
Beküldött PTH kontroll eredmények száma 2010-2013
Melyik PTHi tartományt ellenőrizték a QuliCont kontroll szérumok 2013-ban Alacsonyabb N=6
Magasabb N=6
Miként is mérjük a PTHi szinteket az alacsony és a magas mérési tartományban: Alulmérünk picit?
Referencia tartományok: ECLIA (Roche): 1,6-6,9 pmol/l CLMA (DiaSorin): 1,2-6,48 pmol/l Vesepotló terápiában: 5,3-31,8 pmol/l
átváltási faktor: 1 pg/ml=0,106 pmol/l
PTHi kontrollok %-os eltérése a célértéktől a két mérési tartományban
Cél
Kontroll eredmények eltérése a célértékektől 6 módszerrel mérve
Laboratóriumonként leadott PTH eredmények 3 kontroll szérum esetében-I.
Laboratóriumonként leadott PTH eredmények 3 kontroll szérum esetében-II.
Laboratóriumonként leadott PTH eredmények eltérése a módszer specifikus célértéktől
Köszönöm a megtisztelő figyelmet! ÉS
Köszönet munkatársaimnak ésTDK hallgatóimnak!
Köszönet a klinikus kollégáknak
Regression Summary for Dependent Variable: t-25(OH)D-IA nmol/l (Csak betege-BelosztalyModszer-osszemereshez) R= ,45624200 R2= ,20815676 Adjusted R2= ,18219469 F(2,61)=8,0177
p<,00081 Std.Error of estimate: 15,908
b*
Std.Err. - of b*
Intercept
b
Std.Err. - of b
t(61)
p-value
-5,46458
10,97342
-0,497983
0,620286
Albumin g/l
0,123779
0,129317
0,37988
0,39687
0,957178
0,342256
D-vitamin binding protein mg/l
0,384466
0,129317
0,09596
0,03228
2,973058
0,004217
Regression Summary for Dependent Variable: t-25(OH)D-PBA nmol/l (Csak betege-Belosztaly-Modszerosszemereshez) R= ,29824732 R2= ,08895146 Adjusted R2= ,05908102 F(2,61)=2,9779
p<,05835
Std.Error of estimate: 15,741 b*
Std.Err. - of b*
Intercept
b
Std.Err. - of b
t(61)
p-value
-1,63906
10,85820
-0,150951
0,880512
Albumin g/l
0,157101
0,138709
0,44478
0,39271
1,132595
0,261817
D-vitamin binding protein mg/l
0,189871
0,138709
0,04372
0,03194
1,368839
0,176069
