MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ

MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Př írodově decká fakulta

Disertač ní práce

MODULACE FUNKČ NÍ AKTIVITY FAGOCYTŮ LÁTKAMI S PROZÁNĚ TLIVÝMI, PROTIZÁNĚ TLIVÝMI A ANTIOXIDAČ NÍMI ÚČ INKY

Mgr. Lucie GALLOVÁ Brno 2006

Bibliografická identifikace

Jméno a příjmení autora:

Mgr. Lucie Gallová

Název disertační práce: Modulace funkční aktivity fagocytů látkami s prozánětlivými, protizánětlivými a antioxidačními účinky Název disertační práce anglicky: The modulation of the functional activity of phagocytes by substances with pro-inflammatory, anti-inflammatory and anti-oxidant effects Studijní doktorský program: BIOLOGIE Studijní obor: IMUNOLOGIE Školitel: Doc. RNDr. Antonín Lojek, Csc. Rok obhajoby: 2006 Klíčová slova v češtině:

fagocyty, cytokiny, reaktivní kyslíkové a dusíkové metabolity, zánět, oxidativní stres, antioxidanty

Klíčová slova v angličtině: phagocytes, cytokines, reactive oxygen and nitrogen species, inflammation, oxidative stress, antioxidants

© Mgr. Lucie Gallová, Masarykova univerzita v Brně, 2006

PODĚKOVÁNÍ

Ráda bych poděkovala svému školiteli Doc. RNDr. Antonínu Lojkovi, CSc. za odborné vedení, předání cenných zkušeností a všestrannou podporu. Dále děkuji Mgr. Lukáši Kubalovi, Ph.D. za poskytnuté rady a možnost podílet se zajímavých projektů. Dále můj dík patří všem spolupracovníkům Laboratoře patofyziologie volných radikálů: Mgr. Martině Pavelkové, Ph.D., MVDr. Ivě Papežíkové, Ph.D., Lence Vystrčilové, Blance Panakové, RNDr. Haně Čížové, Ph.D. a RNDr. Milanu Čížovi, Ph.D. a studentům za ochotnou pomoc při praktickém řešení problémů a za vytváření přátelské atmosféry. A v neposlední řadě mé velké díky patří rodičům, prarodičům, sestře Petře, Šárce a její rodině a všem blízkým přátelům za lásku, podporu a trpělivost.

OBSAH SOUHRN

6

ABSTRACT

13

1. ÚVOD

19

1. 1. IMUNITNÍ SYSTÉM

19

1. 2. Role PROFESIONÁLNÍCH FAGOCYTŮ

19

1. 3. OXIDATIVNÍ VZPLANUTÍ

22

1. 3. 1. Reaktivní kyslíkové metabolity

22

1. 3. 2. Reaktivní dusíkové metabolity 1. 4. OXIDATIVNÍ STRES

24 26

1. 5. CYTOKINY 1. 6. ZÁNĚT 1. 6. 1. Zánětlivá odpověď

30 32 32

1. 6. 2. Role cytokinů v patologii onemocnění spojených s akut. a chron. zánětem

33

1. 6. 3. Systémová zánětlivá odpověď

34

1. 7. PŘEHLED TESTOVANÝCH CYTOKINŮ

36

1. 8. ANTIOXIDANTY

40

1. 8. 1. Rostlinné polyfenoly a jejich antioxidační účinky

42

1. 8. 2. Carvedilol a jeho antioxidační účinky

43

2. CÍLE A Č LENĚ NÍ PRÁCE

46

3. PŘ EHLED POUŽ ITÝCH METOD

48

4. VÝSLEDKY A DISKUSE

49

4. 1. IL-10 does not affect oxidative burst and expression of selected surfaced antigen on human blood phagocyte in vitro

49

4. 2. Dealcoholated red and white wines reduce the oxidative stress associated to inflammation in rats

60

4. 3. The infleunce of carvedilol on the production of reactive oxygen and nitrogen species by phagocytes

84

5. ZÁVĚ R

89

6. SEZNAM POUŽ ITÉ LITERATURY

92

7. Ž IVOTOPIS

103

8. SEZNAM PUBLIKACÍ A KONFERENCÍ

104

9. PŘ ÍLOHA

106

10. SEZNAM POUŽ ITÝCH ZKRATEK

122

SOUHRN Fyziologickou odpovědí organismu na stav ohrožení je místní prozánětlivá a systémová protizánětlivá reakce. Při narušení integrity, ať už jde o infekci či trauma, začne organismus mobilizovat nejprve složky přirozené imunity, kde ústřední úlohu vykonávají profesionální fagocyty. Zánětlivá reakce je spjata s tvorbou multifunkčních prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů a se změnami v metabolické aktivitě profesionálních fagocytů související se zvýšenou produkcí reaktivních kyslíkových (RKM) a dusíkových metabolitů (RDM). Na koncentraci a vzájemném poměru těchto regulačních a cytotoxických produktů aktivovaných fagocytů je závislý průběh a výsledek zánětlivé odpovědi. Koordinovaná zánětlivá reakce soustřeďuje potenciál obranných procesů do postiženého místa, čímž se snižuje riziko poškození ostatních tkání. Nicméně přechod prozánětlivých cytokinů, cytotoxických reaktivních metabolitů a často také patogenních mikroorganismů, z původně místního zánětlivého ložiska do celkové cirkulace je příčinou systémové zánětlivé odpovědi organismu (SIRS). SIRS je komplexní obrannou reakcí vytvářející podmínky pro přežití organismu při závažných infekčních chorobách, polytraumatech a po náročných chirurgických zákrocích. V organismu jsou vždy přítomné protizánětlivé a antioxidační systémy, které kontrolují průběh zánětlivé reakce a brání poškozování vlastních struktur. Nicméně v akutních stádiích, kdy invaze prozánětlivých a/nebo cytotoxických metabolitů převýší jejich kapacitní možnosti, nejsou schopny stávající situaci zvrátit a nastává nespecifická destrukce vlastních buněk a tkání. Zvýšená produkce volných RKM a RDM vede k narušení prooxidační/antioxidační rovnováhy ve prospěch oxidačních procesů – tento stav je označován jako oxidativní stres. Oxidativní stres má důležitý vliv na celkový výsledek zánětlivé odpovědi. V poslední letech řada studií uvádí, že právě oxidativní stres hraje kritickou úlohu v patologii mnoha onemocnění. Mezi nejznámější choroby na jejichž iniciaci či rozvoji se podílí reaktivní metabolity (RM) patří ateroskleróza, kardiovaskulární a nádorová onemocnění, cukrovka, revmatoidní artritida, neurodegenerativní onemocnění, septický šok, plicní onemocnění či urychlené stárnutí a jiné. Nicméně kritická role fagocytů v zánětlivých procesech souvisí nejen se schopností produkovat cytotoxické RM, ale také regulační hormony - cytokiny. Cytokiny zastávají výhradní místo v iniciaci a kontrole zánětlivé reakce a to především regulačními mechanismy modulující aktivitu profesionálních fagocytů na různých úrovních. Dokonce existuje vzájemný vztah mezi hladinou cytokinů a výsledkem zánětlivé reakce. Lze tedy shrnout, že vhodná regulace metabolické aktivity profesionálních fagocytů by mohla být jedním z klíčových mechanismů, které by mohly vést k zamezení vzniku či rozvoji

6

SOUHRN

oxidativního poškozování tkání a mohly být využity v prevenci a léčbě zánětlivých onemocnění spojených s oxidativním stresem. Předkládaná disertační práce je proto zaměřena na otázku modulace fyziologických a patofyziologických funkcí fagocytů vybranými prozánětlivými, protizánětlivými nebo antioxidačními substancemi v zánětlivých procesech. První část disertační práce se zabývá otázkou regulace aktivity krevních fagocytů vybranými prozánětlivými a protizánětlivými rekombinantními cytokiny in vitro. Rekombinantní cytokiny představují užitečné nástroje pro studium buněčné biologie imunitních a zánětlivých pochodů a jejich dostupnost otevírá řadu možností klinického použití při orgánových transplantacích, nádorových onemocnění a onemocnění spojených s poruchami imunity. Výběr cytokinů a jejich koncentrací byl odvozen z výsledků klinické studie. V naší práci jsme se zaměřili na objasnění mechanismu protizánětlivého účinku interleukinu-10 (IL-10) a jeho možné využití v imunomodulační terapii. Dále nás zajímala úloha prozánětlivých cytokinů: IL6, IL-8, tumor nekrotizující faktor alfa (TNFα) a jejich kombinované působení s IL-10. Protizánětlivé účinky IL-10 byly podrobněji sledovány na změně metabolické aktivity lidských fagocytů plné krve v přítomnosti/nepřítomnosti IL-6, IL-8, TNFα. V našich experimentálních podmínkách byly prokázány silné prozánětlivé vlastnosti TNFα již v časných inkubačních intervalech v případě spontánní chemiluminiscence (CL). Naopak po 2h inkubaci plné krve s TNFα nedošlo v žádné z testovaných koncentrací k významnému ovlivnění spontánní CL odpovědi. Tyto výsledky jsou v souladu s tvrzením, že TNFα patří mezi cytokiny akutní fáze zánětu, který je zodpovědný za iniciaci zánětlivé reakce, a proto se jeho účinky projevují velmi rychle. Ostatní testované cytokiny (IL-6, IL-8, IL-10) neovlivňovaly produkci RKM nestimulovaných neutrofilů. Naopak významné navýšení tvorby RKM bylo pozorováno po inkubaci IL-6, IL-8 nebo TNFα s fagocyty aktivovanými částicemi opsonizovaného zymozanu (OZP) nebo phorbol 12-myristát 13-acetátem (PMA). Stimulační účinky IL-6 a IL-8 na CL odpověď aktivovaných fagocytů se na rozdíl od TNFα projevily výrazněji až po delší inkubační době (2h). Získané výsledky podporují fakt, že „priming“ fagocytů antigenním či jiným stimulem (INFγ, TNFα) má za následek mohutnější zánětlivou odpověď. Naopak, za fyziologických podmínek vyvolají tyto regulační molekuly pouze malou nebo žádnou odpověď fagocytů. 15-ti minutová inkubace krve s IL-10 v koncentračním rozmezí 400-1600 pg/mL nevyvolala statisticky významné změny CL aktivity neutrofilů aktivovaných OZP nebo PMA oproti kontrole. Předpokládané inhibiční vlastnosti IL-10 se neprojevily ani po 2 hodinách inkubace. Naopak, překvapivě byl pozorován statisticky významný nárůst produkce RKM při 2h inkubaci OZP-aktivovaných neutrofilů s IL-10 v koncentraci 1200 a 1600 pg/mL. Pro potvrzení výsledků CL metody a získání komplexnějších 7

SOUHRN

informací byla použita metoda průtokové cytometrie. Tato metoda potvrdila, že TNFα je silný stimulátor intracelulární produkce RKM nestimulovanými i aktivovanými neutrofily a monocyty. IL-6 významně zvyšoval spontánní a OZP-aktivovanou CL odpověď neutrofilů a PMA-aktivovanou CL monocytů. Naopak, IL-10 nezpůsoboval změny ve spontánní ani aktivované produkci RKM neutrofilů a monocytů. Dalším mechanismem, kde mohou cytokiny významně modulovat aktivitu profesionálních fagocytů a jejich zapojení do zánětlivého procesu, je exprese povrchových antigenů zodpovědných za adhezi a migraci fagocytů do zánětlivého ložiska. Exprese povrchových molekul CD11b, CD15, CD62L, CD31 byla měřena na neutrofilech a monocytech metodou průtokové cytometrie. Cytokiny TNFα a IL-6 zvyšovaly expresi CD11b a CD15 a potlačovaly CD62L u obou buněčných typů. IL-8 významně zvyšoval expresi CD11b na neutrofilech a CD15 na neutrofilech a monocytech a neovlivňoval expresi CD62L. Protizánětlivý IL-10 nemodifikoval expresi žádného ze sledovaných povrchových antigenů. Exprese CD31 nebyla ovlivněna žádným z testovaných cytokinů. Avšak buňky jsou jen zřídka vystaveny působení pouze jednoho cytokinu a mnohem pravděpodobněji odpovídají na více synergicky a/nebo antagonisticky působících cytokinů a dalších bioaktivních molekul. Pro získání realističtějšího obrazu o komplexním působení cytokinů byly v našich experimentech analyzovány kombinované účinky cytokinů. Byla testována simultánní inkubace IL-10 s jednotlivými prozánětlivými cytokiny. IL-10 při simultánní inkubaci neměl žádný efekt na stimulační účinky prozánětlivých cytokinů na produkci RKM a expresi povrchových antigenů. Ani 60-ti minutová preinkubace krve s IL-10 neprokázala dostatečnou kapacitu inhibovat či alespoň snížit produkci RKM a expresi povrchových receptorů stimulovanou prozánětlivými cytokiny ve srovnání s analogickými vzorky, které nebyly preinkubovány s IL-10. Výsledky této studie objasňují mechanismus protizánětlivého působení IL-10 na úrovni produkce RKM a exprese adhezivních molekul v časných stádiích. Získané výsledky svědčí o tom, že IL-10 nepřímo kontroluje aktivitu krevních fagocytů. Dále nám tato studie přináší lepší informace o úloze IL-6, IL-8 a TNFα v regulaci aktivity fagocytů v zánětlivých procesech. V oblasti léčby řady zánětlivých onemocnění začala být v posledních letech věnována velká pozornost účinkům rostlinných polyfenolů a jejich možnému terapeutickému využití. Tyto látky jsou obsaženy v zelenině, ovoci, čaji a v hojné míře ve víně a jako takové jsou součástí běžného jídelníčku. Skladba jídelníčku s vyšším obsahem tuků, sacharidů a vůbec životní styl ve středomořských zemí je do jisté míry blízký životnímu stylu v České republice. Nicméně i přes tuto podobnost je v těchto zemích mnohem nižší výskyt kardiovaskulárních onemocnění. Tento jev je obecně označován jako „francouzský paradox“ a je pravděpodobné, že 8

SOUHRN

významnou roli sehrává právě konzumace vína, která je v těchto středomořských zemích vyšší. Většina prospěšných účinků umírněné konzumace vína je přisuzována vlastnostem polyfenolů, kam patří: taniny, 3-hydroxystilbeny, fenolové kyseliny a flavonoidní látky, zejména pak quercetin, catechin a epicatechin. Řada studií uvádí, že polyfenolické látky prokazují antioxidační a protizánětlivé aktivity, které udržují organismus ve zdraví a je možné je využít v prevenci kardiovaskulárních a nádorových onemocnění. Nicméně existují jen omezené informace o mechanismu těchto prospěšných účinků, distribuci v organismu, metabolismu a exkreci těchto látek. Druhá část disertační práce byla proto věnována studiu účinků polyfenolických látek a jejich úloze v modulaci oxidativního stresu spojeného se zánětem. Hlavní cílem této části bylo sledovat možné prospěšné antioxidační a protizánětlivé účinky umírněné konzumace vína související s vyšším obsahem polyfenolických složek v červeném a bílém víně. Abychom vyloučili možné ovlivnění výsledků etanolem, bylo v experimentech použito dealkoholizované červené (dealcoholated red wine - DRW) a bílé (dealcoholated white wine - DWW) víno. Po dobu 15 dnů byla potkanům podávána jedna z následujících diet; (a) dieta obohacená o 35% (v.v-1) (DRW), (b) dieta obohacená o 35% (v.v-1) (DWW) a (c) kontrolní dieta. V naši studii bylo využito snadno hodnotitelného zánětlivého modelu „granuloma pouch“ indukovaného carrageenanem, ve kterém je zánětlivý proces spojený s oxidativním stresem. Vzhledem k tomu, že antioxidační mechanismy se uplatňují různými cestami bylo k objasnění podstaty mechanismu účinků využito více rozdílných metod poskytující komplexnější informace o cestě působení testovaného antioxidantu. Granulomatózní tkáň a exudát bohatý na polymorfonukleární leukocyty (PMNL) byly využity pro analýzu zánětlivého procesu. Byla měřena hmotnost zánětlivé tkáně granulomu; objem, osmolarita, obsah proteinů a koncentrace prostaglandinu E2 v exudátu, dále počet PMNL v exudátu, aktivita a exprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého (iNOS) a produkce superoxidu a oxidu dusnatého těmito buňkami ex vivo. Dále byly v plazmě a exudátu analyzovány parametry oxidativního stresu: celková antioxidační kapacita (total antioxidant status - TAS), lipidová peroxidace (thiobarbituric acid reactive substances - TBARS), koncentrace dusitanů a poměr citrulinu/argininu. Nejprve byly testovány vlastnosti dealkoholizovaného vína a jejich antioxidační aktivita v chemických systémech. Chromatografickou metodou bylo potvrzeno, že proces dealkoholizace nezpůsobil žádné změny v celkovém obsahu polyfenolických látek, kterých bylo nalezeno významně více v DRW než DWW (8.64 mM vs. 1.82 mM). Dále bylo prokázáno, že již samotné dealkoholizované víno je silným vychytávačem volných radikálů generovaných chemickými systémy (superoxid, peroxylový radikál, oxid dusnatý). Vychytávací schopnost DRW byla 9

SOUHRN

shledána významně vyšší než DWW; v případě oxidu dusnatého dokonce až 12-krát vyšší. Následkem zvýšeného obsahu fenolů u skupin potkanů, kterým byla podávána dieta obohacená o dealkoholizované víno byly některé parametry oxidativního stresu v plazmě i zánětlivém exudátu redukovány. Tyto prospěšné účinky neměly však příčinu v působení kyseliny askorbové, ale byla způsobena antioxidačními vlastnostmi plazmy a exudátu. Tento fakt svědčí o tom, že polyfenoly nebo jejich metabolity si zachovávají dostatečnou aktivitu in vivo. Objemy exudátu, osmolarita a koncentrace proteinů v exudátu byly shledány u všech tří dietetických skupin potkanů obdobné. Celkový obsah proteinů byl daný objemem zánětlivého exudátu. Infiltrace a akumulace leukocytů v postiženém místě je základním mechanismem zánětlivé reakce a je pozoruhodné, že počet PMNL v zánětlivém exudátu byl významně redukován: o 36% u DRW skupiny, o 44% u DWW skupiny. Infiltrace leukocytů je ovlivňována různými faktory zahrnující superoxid a oxid dusnatý. PMNL získané z exudátu u DRW-, DWW-skupin potkanů vykazovaly významnou redukci tvorby superoxidu (50%) a masivní nárůst produkce oxidu dusnatého (200%) při jejich aktivaci PMA ex vivo. Nadbytek produkce superoxidu v kontrolní skupině potkanů pravděpodobně indukoval oxidativní stres, zatímco nadbytek produkce oxidu dusnatého u DRW- a DWW-skupiny má pravděpodobně protizánětlivý účinek, což může vysvětlovat tendenci snižování objemu exudátu a významnou redukci počtu PMNL. Navíc někteří autoři uvádí, že superoxid podporuje infiltraci leukocytů a oxid dusnatý naopak zabraňuje migraci PMNL do postiženého místa in vitro i in vivo. Je tedy pravděpodobné, že jak snížená produkce superoxidu tak zvýšená tvorba oxidu dusnatého aktivovanými PMNL hraje důležitou úlohu v regulaci počtu buněk v zánětlivém místě. Zvýšená koncentrace oxidu dusnatého byla potvrzena výsledky o zvýšeném poměru Lcitrulinu/L-argininu. Masivní nárůst tvorby oxidu dusnatého je indukován iNOS jejíž exprese a aktivita byla významně zvýšena u DRW-, DWW-skupin oproti kontrole. Dále byl v naší studii pozorován výrazný nárůst hladiny prostaglandinu E2 v exudátu, což pravděpodobně souvisí se zvýšenou expresí a aktivitou cyclooxygenázy 2 (COX2) jako následek vysoké koncentrace oxidu dusnatého. Salvemini et al. dospěl také k podobným závěrů. Je známo, že oxid dusnatý přímo reaguje s alkoxylovými a peroxylovými radikály, čímž zamezuje propagaci řetězové reakce lipidové peroxidace. Také v naší studii byly hodnoty TBARS v plazmě i exudátu DRW-, DWW-skupin

potkanů

shledány

statisticky

významně

redukovány.

Koncentrace

dusitanů+dusičnanů v plazmě a exudátu byla natolik vysoká, že přesahovala vychytávací kapacitu obsažených polyfenolů. Nepoměr naměřených parametrů oxidativního stresu v plazmě a exudátu naznačuje, že zánětlivé buňky byly aktivovány zánětlivými mediátory přítomnými in situ. Je pravděpodobné, že polyfenoly jsou inkorporovány do zánětlivých 10

SOUHRN

buněk, čímž mohou modulovat expresi a aktivitu enzymů důležitých při oxidativním stresu a zánětlivých procesech, které byly v práci také měřeny. Výsledky získané z této studie poskytují informace o tom, že nealkoholové složky vína nejenom, že zlepšují antioxidační status v místě zánětu, ale také omezují infiltraci buněk do zánětlivého ložiska pravděpodobně cestou zvýšené produkce oxidu dusnatého. Tyto mechanismy by mohly být jedním z hlavních vysvětlení k pochopení preventivních účinků polyfenolických látek v zánětu. Třetí část předkládané disertační práce je zaměřena na studium vztahu carvedilolu a metabolické aktivity krevních fagocytů, objasnění antioxidačních aktivit carvedilolu a jeho možné využití v léčbě a prevenci některých onemocnění spojených s oxidativním stresem. Kardiovaskulární onemocnění jsou řazena k nejčastějším příčinám morbidity a jsou největším zdrojem hospitalizace pacientů vyžadující dlouhodobou léčbu. V České republice zapříčiňují kardiovaskulární choroby více než 50% úmrtí. Léčba těchto onemocnění je však nezřídka kdy spojena s podáváním více léků z různých farmakologických skupin, čímž narůstá riziko vedlejších účinků a negativní interakce podávaných farmak. Tento problém by mohl být částečně vyřešen zavedením carvedilolu do léčebného procesu. Carvedilol je jedinečné kardiovaskulární léčivo s multifaktoriálním terapeutickým potenciálem. Hlavním účinkem carvedilolu je blokace membránových (β1 , β2, α1) adrenergních receptorů. Nicméně z farmakologického hlediska je carvedilol vybaven řadou dalších účinků tj. vazodilatační, antihypertenzní, antiaterogenní, antihypertrofní nebo antiischemické. Všechny tyto účinky jsou více či méně spjaty se silnou antioxidační kapacitou carvedilolu. Díky těmto schopnostem je cavedilol vhodný pro léčbu srdečních onemocnění, hypertenze, anginy pectoris dále slouží jako přídatné kardioprotektivum, zejména během ischemie/reperfuze. Ischemicko-reperfuzní poškození tkáně je složitý proces, ve kterém klíčovou úlohu sehrávají krevní fagocyty. Oxidativní stres odvozený od fagocytů a indukovaný RKM a RDM je významným induktorem zánětu a je zahrnut v patologii řady onemocnění zejména kardiovaskulárního systému. Aktivované neutrofily mohou agregovat a ucpávat mikrocévní oblasti. Také samotná adherence aktivovaných neutrofilů na cévní endotel může způsobit porušení cévní stěny toxickým působením RKM. Nicméně mechanismus antioxidačního působení carvedilolu na krevní fagocyty a jeho vliv na tvorbu RKM a RDM nejsou doposud zcela objasněny. Hlavním cílem této části bylo sledovat schopnost aktivovaných profesionálních fagocytů produkovat RKM a RDM po ovlivnění carvedilolem in vitro. V naší studii byla antioxidační aktivita carvedilolu (100µM – 0.1µM) testována na různých buněčných modelech. Krevní fagocyty laboratorního potkana byly použity jako model pro sledování produkce RKM a buněčná linie myších makrofágů (RAW 246.7) pro studium exprese iNOS a produkce oxidu dusnatého . V naší studii 11

SOUHRN

carvedilol

snižoval

v

koncentrační

závislosti

produkci

RKM

detekovanou

jako

chemiluminiscenční aktivitu nestimulovaných, ale také aktivovaných krevních fagocytů. Koncentrace carvedilolu nižší než 1µM neměly žádný efekt na metabolickou aktivitu krevních fagocytů. Kvalita inhibičního efektu carvedilolu je závislá na typu použitého aktivátoru: OZP, PMA, vápníkový ionofor A23187 (Ca-I), N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-phenylalanin (fMLP). K podobným výsledkům dospěli Dandona et al., Asbrink et al., kteří v experimentech se zvířaty pozorovali významný pokles produkce superoxidu. Naše výsledky dále ukázaly, že kromě přímé schopnosti vychytávat volné radikály196 se na antioxidačním účinku carvedilolu podílí též schopnost carvedilolu modulovat aktivaci NADPH oxidázy. Další důležitou skupinou RM, která ochotně reaguje s RKM za tvorby vysoce reaktivních produktů např. peroxynitritu, jsou RDM. Proto pokud chceme získat celkový obrázek antioxidační účinnosti carvedilolu je vhodné monitorovat též jeho vliv na tvorbu RDM. V předkládané studii byla sledována koncentrace dusitanů a exprese iNOS, jako nepřímých ukazatelů tvorby oxidu dusnatého. Koncentrace dusitanů byla po 24-hodinové inkubaci makrofágů s carvedilolem (100µM) zcela redukována oproti kontrolnímu vzorku (0.83 ± 0.47µM NO2-/ 2*106 buněk vs. kontrola: 54 ± 1.0µM NO2-/ 2*106 buněk). Carvedilol v koncentaci 10µM měl slabý inhibiční efekt na produkci dusitanů (49.82 ± 1.06µM NO2-/ 2*106 buněk). Tyto výsledky byly ve shodě s výsledky získanými Western-blot analýzou, kde totální inhibice exprese iNOS byla pozorována jen v případě 24h inkubace makrofágů s 100µM carvedilolem. Získaná data blíže charakterizují mechanismus antioxidačního účinku carvedilolu na produkci RKM krevními fagocyty.

Dále

z naší

studie

vyplývá,

že

carvedilol

může

ovlivňovat

celkovou

chemiluminiscenční aktivitu fagocytů cestou inhibice iNOS a tvorby RDM.

12

ABSTRACT The localized and systemic inflammatory reactions are considered physiological responses to injury. For instance, the early physiological response to infections includes activation of the innate immunity with professional phagocytes playing crucial role in this process.1 Inflammatory reaction is associated with production of pro-inflammatory and antiinflammatory cytokines

2

and with changes in metabolic activities of professional phagocytes

producing reactive oxygen (ROS) and reactive nitrogen species (RNS).3 The severity and outcome of the inflammatory reaction is dependent on the ratio and balance of these cytotoxic products. The goal of this process is to localize the inflammatory reaction and prevent unnecessary tissue damage. However, the release of inflammatory cytokines and pathogenic microorganisms into the circulation induce the systemic inflammatory response (SIRS).4 The SIRS then provides a complex defense mechanism against severe infections, injuries and facilitate recovery after complicated surgeries. The presence of anti-inflammatory and anti-oxidative systems influences the course of inflammatory reaction and prevents tissue injury. However, the invasion of pro-inflammatory and/or cytotoxic metabolites in acute stages of infection might overwhelm the capacity of the above defense systems and unspecific destruction of cells and tissues might occur. 5 The increased production of ROS and RNS disturbs the pro-inflammatory and anti-inflammatory balance resulting in an oxidative stress. The oxidative stress influences the outcome of the inflammatory reaction.6,7 and play crucial role in pathology of many diseases.8,9 For instance, cardiovascular, neurodegenerative, pulmonary and cancer diseases, such as atherosclerosis, diabetes, rheumatoid arthritis, septic shock and premature aging are examples of disorders that include oxidative stress in their etiology.10-13 The critical role of phagocytes during inflammation includes producing cytotoxic reactive metabolites and regulatory hormones called cytokines. Cytokines play a crucial role in controlling inflammatory reaction via various mechanisms modulating activity of professional phagocytes on various levels. There is a relationship between levels of cytokines and the outcome of the inflammatory reaction. In summary, influencing the metabolic activity of professional phagocytes might be considered as a promising mechanism that might be utilized for prevention and treatment of oxidative tissue injury associated with oxidative stress. Thus the objective of this dissertation project was to investigate the modulation of physiological and pathophysiological roles of professional phagocytes using selected pro- inflammatory, anti- inflammatory and anti-oxidative molecules in inflammatory processes. The regulation of activity of blood phagocytes with selected recombinant pro- inflammatory and anti-inflammatory cytokines in vitro was investigated. Recombinant cytokines provide useful tools for studying cell biology of immune and 13

ABSTRACT

inflammatory processes. In addition, their availability enables clinical application in organ transplantations, treatment of neoplasm and immune disorders. The selection of cytokines in our investigations was based on published clinical studies.14,15 We investigated the antiinflammatory mechanism of interleukin-10 (IL-10) and evaluated its potential for immunomodulative therapies. Furthermore, we studied the role of pro-inflammatory cytokines: IL-6, IL-8, tumor necrosis factor alpha (TNFα) and their relationship with IL-10. The antiinflammatory effects of IL-10 were evaluated using human phagocytes in the whole blood in presence and/or absence of IL-6, IL-8 and/or TNFα. In our experiments, TNFα induced a strong inflammatory response at early time points detected as spontaneous CL. On the other hand, two-hour incubation of the whole blood with TNFα did not produce any significant increase of CL. This is in accord with previously published reports indicating TNFα as cytokine of the acute phase of inflammation initiating inflammatory reaction. Other tested cytokines (IL-6, IL-8, IL-10) did not influence the production of ROS with unstimulated neutrophils. On the other hand, IL-6, IL-8 or TNFα increased formation of ROS in phagocytes activated by opsonized zymosan (OZP) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). In contrast to TNFα, the stimulatory effects of IL-6 and IL-8 detected as increased CL were apparent after longer 2-hr incubation. Our data are supported by the fact that priming of phagocytes using antigenic or other stimuli (INFγ, TNFα) results in the increased inflammatory response. Under physiological conditions, these stimulies cause only small if any increase of production of reactive metabolites by phagocytes. The incubation of blood with IL-10 at concentrations 400-1600 pg/ml for 15 minutes did not increase CL activity of neutrophils activated by OZP or PMA. In addition, anticipated inhibitory properties of IL10 were not observed even after 2-hr incubation. Interestingly, a significant increase of ROS was observed after 2-hr incubation of OZP- activated neutrophils with IL-10 at concentrations 1200 and 1600 pg/ml. These results were confirmed using flow cytometric method. This method also confirmed that TNFα is a strong stimulator of intracellular production of ROS in unstimulated and activated neutrophils and monocytes. IL-6 increased spontaneous and OZP-activated CL response in neutrophils and PMA-activated monocytes. On the other hand, IL-10 did not display any significant influence on spontaneous and activated production of ROS in neutrophils and monocytes. Cytokines also modulates activities of professional phagocytes in inflammation via the expression of adhesive molecules that regulate adhesion and migration of phagocytes to the center of the inflammation. Thus we measured the expression of surface antigens CD11b, CD15, CD62L and CD31 in neutrophils and monocytes using flow cytometry. The treatment of both cell types with TNFα and IL-6 increased the expression of CD11b and 14

ABSTRACT

CD15 and decreased CD62L. Although, IL-8 significantly increased the expression of CD11b and CD15 the levels of CD62 were not changed. The treatment of neutrophils or monocytes with anti-inflammatory IL-10 did not influence the expression of any of the tested antigens. Furthermore the expression of CD31 remained unchanged after treatment with TNFα, IL-8, IL6 or IL-10. Since the cells in vivo are rarely exposed to only a single cytokine, the investigation of mixtures of synergistic and/or antagonistic cytokines and other biomolecules is important. Thus we studied the relationship of IL-10 with other pro-inflammatory cytokines. In our experimental conditions, simultaneous incubation of IL-10 with individual pro-inflammatory cytokines did not influence their stimulatory effects on the production of ROS and the expression of surface antigens. In addition, even the 60-min pre-incubation blood with IL-10 (1200 pg/mL) did not affect the stimulatory effects of pro-inflammatory cytokines (1200 pg/mL) on ROS production and the expression of surface antigens. Our results contribute to understanding of the antiinflammatory mechanisms of IL-10 via influencing phagocytes in acute stages. The obtained results suggest that IL-10 does not directly control blood phagocyte activation. These results also provide better information about the contribution of IL-6, IL-8 and TNFα to the regulation of blood phagocyte-mediated inflammatory processes. Recently, plant polyphenols have been studied for their potential to treat inflammatory diseases. Polyphenols found in vegetables, fruits, tea and at high levels also in wines are part of a common diet. Although the diet with higher content of fat, carbohydrates and life style in the Czech Republic is quite similar to Mediterranean diet and life style, the incidence of cardiovascular diseases is much higher. This observation is called the „French paradox“ and is attributed to higher consumption of red wine in Mediterranean countries. The beneficial health effects of wine it credited to polyphenols such as tanins, 3-hydroxystilbens, phenolic acid and flavonoids namely quercetin, catechin and epicatechin. A variety of studies document antioxidantive and anti-inflammatory effects of polyphenols that are thought to be beneficial for prevention of cardiovascular diseases and cancer.18,19 Nevertheless, there is only limited understanding of mechanism of action of polyphenols, their distribution, metabolism and excretion. Therefore, the objective of the second part of this dissertation was to evaluate the beneficial anti-oxidative and anti-inflammatory effects associated with higher content of plyphenols in red and white wine. To eliminate the effect of ethanol, we have used dealcoholated red (DRW) and white wine (DWW), respectively. Groups of rats were fed with (a) diet supplemented with 35% (v/v) DRW, (b) diet supplemented with 35% (v/v) DRW and (c) control diet for 15 days. In the present work, we have used the carrageenan-induced granuloma 15

ABSTRACT

in rats as a model in which inflammation and oxidative stress are associated and easily evaluated.20 Because of variety of anti-oxidative mechanisms, we have used multiple methods to evaluate the action of DRW and DWW. The granuloma tissue and exudate rich in polymorphonuclear leukocytes (PMNL) were collected. We weighed granulomas, and measured volume, osmolarity and protein content in the exudates. Furthermore we analyzed the concentration of prostaglandin E2 and PMNL counts in exudates. The activity and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and the production of superoxide and nitric oxide by PMNL were detected ex vivo. The plasma and exudates were also analyzed for parameters of oxidative stress such as the total antioxidant status (TAS), lipid peroxidation (thiobarbituric acid reactive substance – TBARS), and measuring the concentration of nitrites and ratios citrulin/arginine. First, the anti-oxidative activity of dealcoholated wines were tested in chemical systems. We have confirmed using chromatography that the content of polyphenols in DRW (8.64mM) and DWW (1.82mM) was not affected during the evaporation of alcohol. Furthermore, the DRW and DWW scavenged free radicals generated using chemical systems (superoxide, peroxyl radical, nitric oxide). The scavenging activity of DRW was significantly higher than DWW (e.g.12-fold for nitric oxide). In rats, the parameters of oxidative stress were also significantly reduced in both plasma and exudate. Since these effects were caused by anti-oxidative action of plasma and exudates and not via ascorbic acid, the polyphenols and their metabolites are active in vivo. Similar volume of exudate and osmolarity and protein concentration in exudate were observed in the three groups of rats and the total protein content in the exudate was a reflect of their volume. However, the numer of cells in the inflammatory exudate was reduced by 36% and 44% in rats fed DRW- and DWW-diets, respectively. The infiltration of PMNL is affected by many factors including nitric oxide and superoxide. In our study, isolated PMNL from exudates in DRW and DWW treated animals showed a significant decrease of superoxide formation (50%) and increased production of nitric oxide (200%) ex vivo. The overproduction of superoxide in control group most likely induced oxidative stress. On the other hand, the increased production of nitric oxide in DRW and DWW treated animals had anti-inflammatory effect and could explain the trend in small reduction of exudates and reduction of PMNL counts. This is also supported by results published in the literature. 21,22 Thus it is probable plausible that the decreased production of superoxide and increased production of nitric oxide by activated PMNL play an important role in regulation of number of inflammatory cells in the exudates. In addition, the increased ratio citrulin/arginine (parameter of oxidative stress) in DRW and DWW treated animals also supports the increased concentration of nitric oxide. The 16

ABSTRACT

increased production of nitric oxide corresponds to increased expression and activity of iNOS in treated animals. The significant increase of prostaglandin E2 in the exudates of treated animals is likely associated with increased expression and activity of cyclooxygenase 2 (COX2) as consequence of high concentration of nitric oxide. These observations are in according with published data.23 It is known that nitric oxide reacts with alkyl and peroxyl radicals prohibiting the propagation of lipid peroxidation.24 In our study, the TBARS values in plasma and exudates were statistically reduced in DRW and DWW treated animals. The concentration of nitrits and nitrates in plasma and exudates exceeded the scavenging capacity of polyphenols. The difference between parameters of oxidative stress in plasma and exudate suggests that inflammatory mediators present in situ activate inflammatory cells. It is also possible that polyphenols are incorporated into inflammatory cells and modulate the expression of enzymes involved in the oxidative stress and the inflammation. Our studies suggest that non-alcoholic components of wine improve anti-oxidative status during the inflammation and limit infiltration of cells into center of inflammation likely via increased production of nitric oxide. These mechanisms might provide the explanation of preventative effects of polyphenols in inflammation. The objective of the third part of the dissertation was to investigate influence of carvedilol on the metabolic activities of phagocytes and contribute to elucidation of anti-oxidative activities of carvedilol including its potential for treatment or prevention of cardiovascular diseases associated with oxidative stress. Cardiovascular diseases are most prevalent cause of morbidity and long-term hospitalization. In the Czech Republic, the cardiovascular diseases are recognized as causing 50% of all mortalities. The therapy of cardiovascular diseases consists of complex pharmaco-therapeutic modalities increasing risk of side effects and drug-drug interactions. The introduction of carvedilol into therapy could potentially reduce these problem.25 Carvedilol possess multifactorial therapeutic potential.26-28 The main mechanism of action of carvedilol is attributed to blocking adrenergic receptors β1, β2, α1.29,30 Carvedilol has vasodilatatory, antihypertensive, antiatherogenic, antihypertrophic and antiischemic effects. All these effects are more or less associated with its strong anti-oxidative capacity. Therefore, carvedilol is suitable for treatment of cardiovascular disorders such as hypertension and agina pectoris,31 and as cardioprotectant during ischemia and/or reperfusion.25 Ischemic-reperfusion tissue injury is a complex process where phagocytes play a crucial role. Phagocyte-derived oxidative stress associated with the production of ROS and RNS participates in pathology of various diseases including cardiovascular disorders. Aggregated activated neutrophils might occlude capillaries. In addition, the adhesion of activated neutrophils to vascular endothelium 17

ABSTRACT

might cause vascular damage via ROS.32 Nevertheless, the mechanism of anti-oxidative effects of carvedilol on blood phagocytes and its influence on ROS and RNS production are not fully understood. Thus the main research objective was to investigate the influence of carvedilol (100µM – 0.1µM) on the ability of activated professional phagocytes to produce ROS and RNS in various cell models in vitro. The production of ROS was measured in rat blood phagocytes and RNS was detected in mouse macrophage cell line (RAW 246.7) as the expression of iNOS and the production of nitric oxide. Carvedilol exhibited a dose dependent decrease of ROS production detected as chemiluminescent activity of unstimulated and activated blood phagocytes at concentrations greater than 1µM. The type of activator used in our studies influenced the quality of the response: OZP, PMA, calcium ionophore A23187 (Ca-I), Nformyl-L-metionyl-L-leucyl-phenylalanine (fMLP). Similar findings were published in case of superoxide.33,34 Our results show that besides the direct radical scavenging activity, carvedilol also exerts its anti-oxidative effects via influencing the activation of NADPH oxidase. Other RM that readily react with ROS forming highly toxic and reactive metabolites i.e. peroxynitrite are RNS. Therefore, our evaluation of anti-oxidative properties of carvedilol also included monitoring the formation of RNS via the expression of iNOS as an indirect measure of nitric oxide production. The incubation of macrophages with 100µM carvedilol for 24 hrs significantly reduced concentration of nitric oxide (0.83 ± 0.47µM NO2-/ 2*106 cells vs. control 54 ± 1.0µM NO2-/ 2*106 cells). There was only a slight reduction at 10µM carvedilol (49.82 ± 1.06µM NO2-/ 2*106 cells). This is in line with the total inhibition of iNOS protein levels after 24 hr incubation with 100µM carvedilol detected using the Western blotting analysis. Our study described the mechanism of the anti-oxidative effect of carvedilol on the production of ROS by blood phagocytes. Moreover, our results suggested that carvedilol can affect the total chemiluminescence activity of phagocytes by the modulation of the formation of RNS via inhibition of iNOS protein expression.

18

1. ÚVOD 1. 1. IMUNITNÍ SYSTÉM Imunitní systém patří k základním homeostatickým mechanismům organismu. Imunitní systém rozpoznává vlastní tkáně organismu a udržuje toleranci vůči nim, ale také má schopnost rozpoznávat a průběžně odstraňovat staré, poškozené nebo jinak pozměněné (mutované) buňky. Další jeho důležitou funkcí je rozpoznávat cizorodé částice a chránit organismus proti patogenním mikroorganismům a jejich toxickým produktům. Mechanismy imunitního systému lze rozdělit na přirozenou a specifickou imunitu. Jako první se do obranných reakcí organismu zapojují mechanismy přirozené imunity. Vnitřní imunitní systém je v těle přítomen konstitutivně v bazální hladině. Je schopný odpovídat velmi rychle na antigenní stimul, čímž je zodpovědný za kontrolu časných fází infekce a je zásadní pro celkový výsledek zánětlivé reakce. Ústřední úlohu obranných mechanismů přirozené imunity plní aktivované profesionální fagocyty. Jejich mikrobicidní vlastnosti jsou založeny především na produkci reaktivních kyslíkových a dusíkových metabolitů a cytokinů, které kontrolují průběh zánětlivé odpovědi a napomáhají reparaci poškozené tkáně. Evolučně mladší, antigenně specifický imunitní systém reaguje na cizorodou strukturu prostřednictvím vysoce specifických molekul: 1) protilátek produkovaných aktivovanými Blymfocyty 2) specifických receptorů T-lymfocytů. Oba imunitní systémy spolu úzce kooperují a jejich funkční aktivity jsou založeny na interakcích buněčných složek. Komunikace přirozené a specifické imunity je založena buď na přímém kontaktu buněk imunitního systému a/nebo na stimulaci buněk pomocí rozpustných mediátorů. Interakce mezi profesionálními fagocyty a T-, B-lymfocyty vedou k sekreci cytokinů iniciující aktivaci řady buněčných funkcí, které hrají důležitou úlohu v nespecifické zánětlivé a specifické imunitní odpovědi. 1. 2. Role PROFESIONÁLNÍCH FAGOCYTŮ Profesionální fagocyty jsou základními efektorovými buňkami přirozené imunity a ústředními buňkami v zánětlivé odpovědi. Tvoří přední linii obranných mechanismů proti invadujícím mikrobiálním patogenům, cizorodým částicím nebo vlastním pozměněným buňkám. Základní vlastností profesionálních fagocytů je schopnost rozpoznávat, fagocytovat a svými cytotoxickými produkty inaktivovat cizorodou částici, často „zviditelněnou“ složkami komplementu. S fagocytózou úzce souvisí proces oxidativního vzplanutí v jehož rámci profesionální fagocyty tvoří cytotoxické, vysoce reaktivní metabolity odvozené od kyslíku a dusíku. Proces fagocytózy a oxidativního vzplanutí tvoří nejdůležitější obranný systém v rámci vnitřní imunity za účelem udržování homeostázy vnitřního prostředí organismu a zamezení 19

1. ÚVOD

iniciace a propagace onemocnění. Oba tyto procesy jsou zodpovědné nejen za intracelulární usmrcení fagocytovaných mikroorganismů, ale mohou také iniciovat extracelulární poškození buněk vlastní tkáně. Funkci profesionálních fagocytů v organismu plní dva typy buněk: polymorfonukleární leukocyty (PMNL, zejména neutrofily) a mononukleární leukocyty (krevní monocyty a jejich tkáňové formy - makrofágy). Oba typy fagocytujících buněk jsou přes určité rozdíly v receptorové a enzymatické výbavě velmi podobné. Základním rozdílem je, že neutrofily neexprimují hlavní histokompatibilní komplex II. třídy (MHC II) a neplní tedy funkci antigenprezentujících buněk (APC) na rozdíl od makrofágů. Neutrofily mají význam v antiinfekční obraně zejména proti extracelulárním bakteriím, zatímco makrofágy fagocytují zejména vlastní apoptické buňky a významně se podílí na obraně proti některým intracelulárním parazitům. Krevní monocyty jsou předurčeny, aby se z nich staly dlouze žijící tkáňové makrofágy, zatímco krevní neutrofily jsou krátce žijící konečná stadia (6-8h). 

Neutrofily jsou hlavními buňkami akutní fáze zánětu - odpovídají velmi rychle na chemotaktický podnět a jsou prvními buňkami, které vstupují do zánětlivého místa. Neutrofily mohou být kromě antigenů aktivovány také cytokiny odvozenými od makrofágů, endoteliálních buněk nebo T lymfocytů.



Monocyty/makrofágy hrají důležitou úlohu nejen v přirozené, ale také ve specifické imunitě, kde působí jako antigen-prezentující buňky a aktivátory lymfocytů. Makrofágy jsou především známy jako ústřední „scavenger“ buňky, jejichž úkolem je odstranit intracelulární bakterie, prvoky, mnohobuněčné parazity a nádorové buňky v těle hostitele a eliminovat další zdroje antigenů. Na svém povrchu exprimují MHC I a II, kterými předkládají zpracovaný antigen T lymfocytům a aktivují specifický imunitní systém. Populace makrofágů se vyskytuje téměř ve všech tkáních: krevní monocyty, peritoneální, mikrogliální a mléčné makrofágy, Kuppferovy buňky v játrech (největší rezervoár makrofágů v těle s obrovskou potencí produkovat cytokiny), makrofágy v kostní dřeni, lymfatických orgánech a ve střevě. Proces diferenciace krevních monocytů na funkční tkáňové makrofágy je indukován řadou impulsů: bakteriální produkty – lipopolysacharid (LPS), cytokiny a molekuly v mezibuněčné hmotě. Při aktivaci makrofágů dochází ke zvýšení genové transkripce a exprese různých genových produktů, kterými aktivované makrofágy získají speciální vlastnosti např. zvýšení exprese cytochromálních enzymů, které vede k mohutnější tvorbě RKM; nebo zvýšení exprese MHC a některých povrchových receptorů. Mikrobicidní funkce aktivovaných fagocytů jsou založeny především na produkci cytotoxických molekul, především reaktivních metabolitů kyslíku 20

1. ÚVOD

a dusíku, které slouží k smrcení fagocytovaných mikroorganismů. Kromě těchto přímých mikrobicidních funkcí mají profesionální fagocyty také důležitou úlohu regulační a reparační. V zánětlivých procesech produkují aktivované makrofágy růstové faktory pro fibroblasty a cévní endotel, které nahrazují poškozenou tkáň; proteázy (kolagenáza, elastáza); angiogenesis factor - stimulují migraci a proliferaci fibroblastů a endoteliálních buněk; metabolity kyseliny arachidonové (prostaglandiny, prostacykliny, leukotrieny, tromboxany) a složky komplementu. Velice důležitými produkty aktivovaných makrofágů v zánětlivé odpovědi jsou regulační molekuly – cytokiny. Fakt, že neutrofily produkují mnohem menší množství cytokinů, ve srovnání s makroofágy, je kompenzován podstatně vyšším zastoupením neutrofilů v zánětlivých ložiscích. Cytokiny odvozené od fagocytů zprostředkovávají systémovou zánětlivou odpověď (IL-6, tumor necrosis factor alpha (TNFα), amplifikují zánětlivou reakci (IL-8) a regulují diferenciaci T lymfocytů (IL-12). Cytokiny stimulují další buňky zánětu a jsou zodpovědné za řadu systémových zánětlivých reakcí jako je např. horečka. Prostřednictvím těchto signálních molekul sehrávají profesionální fagocyty významnou roli v regulaci hematopoezy, imunitní, zánětlivé odpovědi a mnoha homeostatických procesech. Reaktivní metabolity (RM) RM jsou definovány jako nestabilní, vysoce reaktivní molekuly radikálové (jedním nebo více nepárovými elektrony ve vnějším orbitalu) nebo neradikálové povahy. RM vznikají v menším množství v organismu i za fyziologických podmínek jako vedlejší produkty některých enzymatických a autooxidačních reakcí. V dýchacím řetězci mitochondrií je utilizováno až 90% přijatého kyslíku. Za fyziologických podmínek je přibližně 1–3% tohoto spotřebovaného kyslíku nedokonale redukováno na superoxidový radikál a další RKM. Dalšími zdroji RKM jsou autooxidace cytochromu P450 v transportním elektronovém řetězci endoplazmatického retikula, autooxidace monoaminů (dopamin, epinefrin, norepinefrin), flavinů a hemoglobinu v přítomnosti přechodných kovů nebo oxidace redukčních ekvivalentů (NADH-redukovaná forma

nikotinamid

adenindinukleotidu,

NADPH-redukovaná

forma

nikotinamid

adenindinukleotid fosfátu, FAD-flavin adenindinukleotid) v dýchacím řetězci mitochondrií. V případě nedostatku L-argininu nebo tetrahydrobiopterinu (BT4) v buňce se na tvorbě superoxidu mohou také podílet konstitutivní isoformy NOS. Reaktivní metabolity mohou tedy vznikat i ve zdravém organismu, nicméně k mohutnému nárůstu jejich produkce dochází zejména především v obranných pochodech vnitřní imunity proti infekcím, v zánětlivých procesech, v případě tkáňového poškození, otravách, různých onemocněních a jako následek 21

1. ÚVOD

chirurgických zákroků. Nicméně nejvýznamnějším zdrojem RKM a RDM jsou aktivované profesionální fagocyty v procesu oxidativního vzplanutí. 1. 3. OXIDATIVNÍ VZPLANUTÍ Za fyziologických podmínek jsou fagocyty v klidovém stavu a energii získávají anaerobní glykolýzou, jejich aerobní metabolismus je velmi nízký. Po antigenní stimulaci fagocytů, dochází k významným metabolickým změnám – zvýší se spotřeba kyslíku, metabolismus glukosy a tvoří se velké množství RM radikálové i neradikálové povahy. Ústředním enzymem oxidativního vzplanutí profesionálních fagocytů je membránová NADPH oxidáza, která katalyzuje jedno-elektronovou redukci molekulárního kyslíku na superoxidový anionový radikál. Antigenní stimulace vede k fosforylaci cytoplazmatických podjednotek NADPH oxidázy, jejich vazbě na membránovou složku a tvorbě aktivního enzymu. Antigenních stimulů existuje celá řada: bakterie, houby, viry, prvoci. Mezi nejefektivnější iniciační stimuly oxidativního vzplanutí, které jsou často přítomné v zánětlivém místě, patří opsonizované mikroorganismy, složky komplementu (C5a), leukotrien B4 (LTB4) a N-formylované oligopeptidy bakteriálního původu, které jsou aktivně sekretovány nebo jsou uvolňovány lyzí mikroorganismů a v neposlední řadě cytokiny: IFNγ, TNFα, IL-1, IL-8, IL-6 aj.. 1. 3. 1. Reaktivní kyslíkové metabolity Superoxidový aniontový radikál (·O2-) vzniká různými cestami jednoelektronové redukce molekulárního kyslíku za fyziologických a také patologických stavů. Poločas rozpadu superoxidu je velmi krátký (několik sekund) a nesetká-li se s jinou molekulou, dochází ke spontánní nebo enzymaticky urychlené dismutaci superoxiddismutázou (SOD) na peroxid vodíku a molekulární kyslík Díky svému zápornému náboji neprostupuje superoxid biologickými membránami a jeho účinky se uplatňují převážně intracelulárně a v místě jeho vzniku. I přesto, že patří ke slabším oxidantům, je schopen přímého oxidativního poškození. Patofyziologický význam superoxidu spočívá na schopnosti redukovat ionty přechodných kovů vázaných na proteiny a podporovat jejich vstup do Fentonovy reakce. Nicméně podstatná část vyprodukovaného superoxidu slouží spíše jako substrát pro vznik dalších reaktivních forem kyslíku a dusíku radikálové/neradikálové povahy. Dalším poměrně málo reaktivním metabolitem je peroxid vodíku (H2O2), který na rozdíl od superoxidu, snadno prostupuje membránami a může tak působit i na vzdálenějších místech. Reakce peroxidu vodíku s biomolekulami je pomalá, ale v přítomnosti volných iontů přechodných kovů (Fe2+, Cu+) v tzv. Fentonově reakci se pohotově redukuje na vysoce reaktivní hydroxylový radikál. Může sám působit jako oxidant, ale větší část slouží jako 22

1. ÚVOD

substrát pro myeloperoxidázu (MPO), která v přítomnosti halogenidových kofaktorů tvoří kyselinu chlornou (HOCl), kyselinu bromnou (HOBr), kyselinu jodnou (HOI). Kyselina chlorná je vysoce účinná mikrobicidní látka, která může reagovat se superoxidem za vzniku hydroxylového radikálu. Hydroxylový radikál (OH.) je velmi nestabilní a vysoce reaktivní radikál schopen reagovat a poškozovat téměř každou molekulu, s kterou se setká. Krátká životnost a vysoká reaktivita však omezují jeho schopnost migrovat do okolí a působit poškození mimo místo vzniku. Na vzniku hydroxylového radikálu se podílí také kyselé pH ve fagozomech, které podporuje uvolnění iontů přechodných kovů a jejich vstup do Fentonovy reakce. Nadprodukce hydroxylového radikálu v organismu může způsobit rozsáhlé poškození mnoha biologicky významných molekul: DNA, aminokyselin (AMK), fosfolipidů, cukrů a organických kyselin. Důležitou úlohu sehrává hydroxylový radikál v iniciaci lipidové peroxidace, kde reaguje s mastnými kyselinami fosfolipidů, čímž narušuje integritu buněčné membrány. V procesu lipidové peroxidace dále vzniká peroxylový radikál (ROO.) (viz. 1. 4. Oxidativní stres).

Obr.č . 1. Tvorba reaktivních kyslíkových a dusíkových radikálů a dalších reaktivních metabolitů produkovaných savčí buňkou (Fang, 2002).

23

1. ÚVOD

1. 3. 2. Reaktivní dusíkové metabolity Dalším důležitým mikrobicidním prostředkem fagocytů je tvorba oxidu dusnatého. Na základě regulačních vlastností a lokalizaci byly identifikovány tři isoformy NO syntáz (EC 1.14.13.39). Tyto isoformy NOS katalyzují tvorbu NO stejnou biochemickou cestou, která sestává z dvou po sobě následovaných monooxygenázových reakcí; L-arginin je oxidován na meziprodukt N ω

-OH-L-arginin, který je dále oxidován na molekulu NO·a L-citrulin.

Obr.č .2. Metabolická cesta L-argininu v biologické tkáni (Giraldez and Zweier, 1998).

Neuronální NOS (nNOS; NOS I) je přítomna v cytoplazmě neuronů a buněk plicního epitelu. Endotelová NOS (eNOS; NOS III) je přítomna v endoteliálních buňkách, některých neuronech a srdečních myocytech. Obě tyto isoformy jsou konstitutivně exprimovány ve zdravém organismu a jsou stálým zdrojem malého množství fyziologicky účinného NO zajišťujícího neurotransmisi, cevní homeostázu a tkáňovou perfuzi. Souhrnně jsou tyto isofromy označovány jako konstitutivní NOS (cNOS). Nicméně, nejdůležitějším zdrojem NO v zánětlivých procesech je inducibilní NOS. Proto se dále v této práci budeme zabývat pouze úlohou NO syntetizovaným iNOS exprimovanou v profesionálních fagocytech. Inducibilní NOS (iNOS; NOS II) je 140-kDa protein lokalizovaný v cytosolu nebo vázaný na membrány fagocytů, který není zdrojem NO za fyziologických podmínek. Až teprve antigenní stimulace makrofágů/neutrofilů mikroorganismy, mikrobiálními produkty a nebo cytokiny vede ke zvýšení exprese iNOS, která produkuje velké množství NO. K aktivaci iNOS dochází především pod vlivem cytokinů odvozených od TH1 lymfocytů (INFγ a TNFα). Propojení vnitřní a specifické imunity úzce souvisí s činností iNOS. NO syntázy jsou schopné tvořit NO jen pokud se nachází ve formě homodimeru. Každá podjednotka NOS váže, kromě svých 24

1. ÚVOD

substrátů (L-argininu, NADPH, O2) a druhého monomeru, přinejmenším dalších 5 molekul: hem, BH4, calmodulin, flaviny a FAD. NOS tedy vyžaduje nejméně 17 vazebných reakcí pro sestavení funkčně aktivního homodimeru schopného katalyzovat tvorbu NO. Všechny isoformy NOS se nápadně odlišují rychlostí a délkou produkce NO. eNOS a nNOS produkují NO pouze několik minut jako následek chemického (neurotransmiter-glutamát) nebo mechanického (pulzační tlak v cévní stěně) stimulu. Naopak, iNOS může produkovat NO velmi dlouho (5 dní), pokud má k dispozici potřebné substráty. Vysvětlení této rozdílnosti spočívá ve schopnosti iNOS vázat calmodulin dostatečně pevně bez přítomnosti intracelulárního Ca2+ na rozdíl od cNOS, které váží calmodulin za přítomnosti Ca2+, což iniciuje přenos elektronů z flavinů na hem. iNOS je snadno detekovatelná v monocytech/makrofázích pacientů s infekčním nebo zánětlivým onemocněním. Farmakologické inhibice exprese iNOS, glukokortikoidy, inhibitory tyrosinových kináz proteinových fosfatáz a nebo serinových proteáz na úrovni transkripčních a posttranskripčních kroků, mají za důsledek snížení antimikrobiální aktivity mikrofágů. Oxid dusnatý (NO·) je velmi nestabilní plyn radikálové povahy, který snadno prostupuje buněčnými membránami, nicméně vzhledem ke svému velmi krátkému poločasu rozpadu působí pouze místně. Jako silný multifunkční reaktivní metabolit se NO podílí na různých buněčných procesech jako je cévní rovnováha, neurotransmise, antimikrobiální a antivirová obrana. Fyziologická hladina NO je esenciální pro regulaci cévní relaxace a proliferace buněk hladké svaloviny cév, adhezi leukocytů, agregaci trombocytů, angiogenezi, cévní tonus a hemodynamiku. NO se podílí na regulaci funkční aktivity, růstu a smrti řady imunitních a zánětlivých buněk, takových jako makrofágy, T-lymfocyty, žírné buňky, neutrofily. NO reguluje vlastnosti APC cestou modulace fagocytární aktivity, síly oxidativního vzplanutí nebo exprese MHC II. NO je jednou z hlavních efektorových molekul imunitního systému v obraně proti patogenům a nádorovým buňkám. Hladina NO reguluje extracelulární sekreci RKM aktivovanými fagocyty a tím se podílí na regulaci akutní fáze zánětu. Rodenas et al. uvádí, že NO má schopnost inhibovat tvorbu superoxidu cestou inaktivace NADPH oxidázy. Je také dobře známo, že oxid dusnatý inhibuje adhezi krevních destiček k cévnímu endotelu a může přímo reagovat s lipidovými alkoxylovými a peroxylovými radikály, čímž může ukončovat řetězovou reakci lipidové peroxidace. Příspěvek NO v indukci apoptózy v makrofázích byl dobře prozkoumán. Na konci zánětlivé odpovědi jsou buňky účastnící se zánětlivého procesu odstraněny apoptózou, což zabraňuje přechovávání infekce v intracelulárních patogenech a

25

1. ÚVOD

snižuje riziko zánětlivého stresu. Vysoká hladina NO indukuje sekreci mitochondriálních mediátorů, které iniciují kaspázy vedoucí k programované buněčné smrti. I přesto, že tvorba NO pravděpodobně chrání hostitele proti možné infekci, byly pozorovány také supresivní účinky NO na proliferaci lymfocytů a poškozování buněk. I zde byla tedy prokázána protektivní/destruktivní dualita, která se může projevit v každé důležité složce imunitního systému. Zhoršená dostupnost NO vede k endoteliální dysfunkci charakterizované vazokonstrikcí, zvýšenou agregací trombocytů a zvýšenou adhezivitou neutrofilů na povrch endotelu. Poškozená NOS syntetizuje méně oxidu dusnatého a naopak začíná produkovat superoxid. Výsledkem těchto změn je další snížení hladiny NO a zvýšení produkce superoxidu a prohlubování endoteliální dysfunkce. Na druhé straně, nadprodukce NO v průběhu infekce či zánětlivé reakce může být taktéž zdrojem závažného poškození buněk a tkání (zejména cévního endotelu) a může vést až ke smrti. Vazodilatační účinky NO napomáhají prokrvení zánětlivého ložiska a tím i přísunu živin, imunokompetentních buněk a protilátek a odstraňování toxických produktů zánětu. Nicméně, nadprodukce NO může vést k hypotenzi a nebo oběhovému selhání – tento mechanismus je součástí patogeneze septického šoku. Bylo prokázáno, že NO je zahrnut v cévním kolapsu, což je častá příčina úmrtnosti. Interakce NO s RKM vedou k tvorbě mnohem silnějších metabolitů a svými synergickými účinky navodí mocnější účinek, což může způsobit až vyčerpání dostupných antioxidantů v buňce. Oxid dusnatý je jedinou molekulou, která je in vivo schopna soutěžit o superoxid se superoxiddismutázou, čímž se snižuje dostupnost NO a potlačují se jeho protizánětlivé účinky. Reakcí superoxidu s NO vzniká peroxynitrit (ONOO-) silný oxidant, schopný přímo nebo nepřímo poškozovat řadu významných biomolekul. Vznikající peroxynitrit může kromě poškození důležitých biomolekul také snižovat aktivitu SOD a NOS. Uplatňuje se v patogenezi mnoha onemocnění včetně ischemicko-reperfuzního poškození. Tvorba peroxynitritu v endoteliálních buňkách vede ke snížení koncentrace oxidu dusnatého a omezování jeho fyziologických vlastností. Baktericidní vlastnosti peroxynitritu byly prokázány. Navíc, peroxynitrit je účinnějším induktorem apotózy než NO. 1. 4. OXIDATIVNÍ STRES Význam reaktivních metabolitů v biologii zánětlivé reakce má “dvě tváře“. Na jedné straně slouží RM jako významné signální a regulační molekuly a svými cytotoxickými účinky jsou zodpovědné

za

inaktivaci,

destrukci

a

intracelulární

usmrcení

fagocytovaných

mikroorganismů. Nicméně pokud jsou RM produkovány v nadměrném množství nebo při narušení některé ze složek imunitního systému, stávají se tyto metabolity vysoce toxickými 26

1. ÚVOD

vůči vlastním strukturám a sehrávají důležitou roli v patogenezi celé řady chronických onemocnění. Již v roce 1887 se Metchnikoff jako první zmiňuje, že během intracelulárního zabíjení fagocytované bakterie může docházet k uvolňování reaktivních produktů do extracelulárního prostředí, kde negativně přispívají k rozvoji zánětlivé reakce a vzniku různých onemocnění. Od dob objevení katalytické funkce SOD (1969) a mechanismů působení NOS (1988) se začala věnovat větší pozornost procesu oxidativního vzplanutí. V poslední době je pozornost soustředěna na roli RMK/RMD v zánětu. Řada studií poukazuje na to, že právě tyto reaktivní produkty odvozené od fagocytů jsou příčinou oxidativního poškození tkání a iniciují řadu onemocnění. Oxidoredukční rovnováha v buňkách je udržována účinnými antioxidačními mechanismy, kterými je vybaven každý aerobní organismus. U zdravého organismu mají tyto antioxidační mechanismy dostatečnou kapacitu udržovat tvorbu RM pod kontrolou a omezovat tak jejich nepříznivé účinky. Pokud však poměr mezi prooxidační a antioxidační složkou organismu převáží ve prospěch tvorby RM nastává oxidativní stres. Buňky většinou tolerují mírný oxidativní stres, který vede k adaptační reakci (syntéza proteinů teplotního šoku, zvýšení syntézy antioxidačních enzymů). Silný oxidativní stres vede k rozsáhlému poškození, ke ztrátě homeostázy a ke smrti buněk apoptózou nebo nekrózou. Oxidativní stres je tedy definován jako porucha rovnováhy mezi produkcí reaktivních kyslíkových a dusíkových metabolitů a antioxidační kapacitou organismu. Negativní účinky reaktivních metabolitů mohou postihovat všechny typy biomolekul a způsobí jejich strukturální a funkční změny. Oxidativní stres vede k poškození membránových proteinů – receptorů, enzymů nebo iontových kanálů. Rozsáhlé oxidativní poškození vede ke ztrátě integrity membrán, ztrátě iontových gradientů a ke smrti buňky. Následky těchto oxidačních reakcí jsou pro funkci buněk velmi závažné. Například funkční změny v enzymové aktivitě, narušení iontových pump způsobí hromadění Ca2+ v cytosolu, modifikace AMK iniciuje vznik nových antigenních determinantů. Následkem oxidativního stresu dále dochází ke štěpení řetězců DNA (respektive RNA). Fragmentace je iniciována především hydroxylovým radikálem, produkty lipidové peroxidace nebo nepřímo aktivací Ca-dependentních endonukleáz, případně inaktivací reparačních mechanismů.

27

1. ÚVOD

Tab.č .1. Poškození biologicky důležitých makromolekul (Štípek a kol., 2000).

Polynenasycené mastné kyseliny (PUFAs) a fosfolipidy, součásti každé buněčné membrány, jsou citlivé k oxidativnímu poškození. Tyto lipidy se často stávají cílem pro hydroxylový radikál, který iniciuje lipidovou peroxidaci (viz. obr.č.3). Lipidová peroxidace je řetězová reakce, která je iniciována hydroxylovým radikálem, který má schopnost vytrhnout vodík z metylenové skupiny řetězce mastné kyseliny. Mastná kyselina nebo lipid se tak stává uhlíkovým radikálem (L·), který snadno reaguje s molekulárním kyslíkem za vzniku peroxylového radikálu (LOO·). Peroxylový radikál je velice nestabilní a snaží se stabilizovat odejmutím elektronu jiné molekule mastné kyseliny sousedního lipidu, a celá reakce se dále propaguje. Z peroxylového radikálu se stává hydroperoxid, který reaguje s ionty přechodných kovů za vzniku alkoxylového radikálu (LO·), které napadají další mastné kyseliny. Řetězová reakce je ukončena ve chvíli, kdy se uhlíkový radikál mastné kyseliny setká s jinou látkou radikálové povahy a vytvoří spolu neradikálové produkty. Další možností ukončení lipidové peroxidace je reakce s antioxidantem za vzniku stabilní sloučeniny. Antioxidant se tak stává volným radikálem, který má však příliš nízkou reaktivitu na to, aby atakoval další mastnou kyselinu. Membrány s peroxidovanými lipidy ztrácejí přirozenou fluiditu a schopnost rychlé výměny lipidů i proteinů v rámci jedné fosfolipidové vrstvy. Ztrácejí také bariérovou funkci a přes poškozené membrány mohou nekontrolovatelně prostupovat ionty nebo molekuly, které za fyziologických podmínek samovolně neprocházejí.

28

1. ÚVOD

Obr. č . 3. Schéma lipidové proxidace (Štípek a kolektiv, 2000).

Nespecifická destrukce vlastních buněk a tkání reaktivními metabolity iniciuje tkáňové poškození a propagaci zánětlivé reakce a hraje ústřední roli v patologii řady onemocnění. Mezi nejzávažnější choroby spojované s negativním působením RM patří ateroskleróza, cukrovka, revmatoidní

artritida,

cystická

fibróza,

kardiovaskulární

a

nádorové

onemocnění,

neurodegenerativní onemocnění, sepse, plicní onemocnění či urychlené stárnutí. Metabolická aktivita profesionálních fagocytů spojená s tvorbou cytotoxických RM je pod přísnou kontrolou cytokinové sítě. Cytokiny spolu s RM jsou ústředními organizátory imunitní a zánětlivé odpovědi a hlavními složkami obranných, regulačních a reparačních mechanismů v udržování homeostázy organismu. 29

1. ÚVOD

1. 5. CYTOKINY Cytokiny jsou rozmanitou skupinou buněčných regulátorů, které jsou sekretovány různými typy buněk nebo jsou součástí buněčné membrány. Jde o široké spektrum rozpustných proteinů s nízkou molekulovou hmotností (menší než 30-kDa), které bývají často glykosylovány. Většina mikroorganismů (bakterie, viry, houby, paraziti) je schopna indukovat tvorbu cytokinů z mononukleárních fagocytů. Již pikogramová množství LPS jsou dostačující pro iniciaci syntézy cytokinů. Naopak existuje mnoho fyziologických složek, které mají schopnost redukovat tvorbu cytokinů – proteiny teplotního šoku (HSP - heat shock proteins), glukokortikoidy. Cytokiny jsou „slova“ v jazyce buněčné komunikace, která znamenají různé věci v závislosti na tom, kterými slovy jsou obklopovány. Cytokiny pracují v síti. Obecná charakteristika cytokinů I přesto, že jsou cytokiny diverzní skupinou proteinů, existuje celá řada obecných charakteristik, které jsou společné pro tyto molekuly: 1. Cytokiny jsou produkovány během efektorové fáze vrozené a specifické imunity a slouží ke zprostředkování a regulaci imunitní a zánětlivé odpovědi. 2. Cytokiny jsou produkovány různými typy buněk imunitního systému a mají rozdílné biologické účinky po navázání na jiný buněčný typ – pleiotropismus. 3. Cytokiny nejsou tvořeny do zásoby a jejich přechodná syntéza je iniciována transkripcí nového genu po předchozí buněčné aktivaci. Sekrece cytokinů je krátkodobá a je omezená vlastní povahou cytokinů, což je způsobeno rychlou transkripční fází a krátkou životností mRNA genu pro syntézu nového cytokinu. 4. Cytokiny často ovlivňují syntézu dalšího cytokinu, což vede ke kaskádovité reakci, kde druhý nebo až třetí cytokin může zprostředkovat biologický efekt. Schopnost jednoho cytokinu zvyšovat nebo potlačovat produkci dalších cytokinů může poskytovat pozitivní nebo negativní regulační mechanismy v imunitní a zánětlivé odpovědi. 5. Synergické nebo antagonistické působení ovlivňuje působení dalších cytokinů. 6. Většina cytokinů působí místně - autokrinní nebo parakrinní účinky. Nicméně některé cytokiny (IL-4 a TNFα) jsou produkovány v dostatečné množství, aby cirkulovaly krevním oběhem a působily endokrinně. Tyto účinky jsou iniciovány silně afinitní vazbou ke specifickým receptorům cílové buňky. Tyto membránové receptory pro cytokiny mají vlastní kinázovou aktivitu.

30

1. ÚVOD

7. Cytokiny jsou účinné v nepatrném množství, obecně působí již pikogramových koncentracích. 8. Jedním ze zajímavých aspektů monocytů/makrofágů je rychlost de novo syntézy mRNA a účinku vytvořeného proteinu. Maximum syntézy se objevuje již během několika hodin. Základní funkce cytokinů Cytokinům se připisují dvě základní funkce: jednak se uplatňují jako výkonné složky zánětlivé a imunitní odpovědi a přímo se podílejí odstraňování cizorodých struktur a nebo se uplatňují jako regulační faktory, které upravují průběh zánětlivé odpovědi podle aktuálních potřeb organismu. Cytokiny iniciují kaskádu událostí, které jsou esenciální pro vnitřní imunitu a zajišťují spojení mezi specifickou a přirozenou imunitou. Mechanismy, kterými cytokiny kontrolují zánětlivou odpověď, jsou založeny na funkčních změnách profesionálních fagocytů na různých úrovních: adherence fagocytů na cévní stěnu, migrace a chemotaktická odpověď, proces fagocytózy cizorodé částice, regulace aktivity oxidativního vzplanutí a tvorby baktericidních RM. Cytokiny plní nenahraditelnou úlohu v buněčné komunikaci, která je kritickým aspektem imunitní a zánětlivé odpovědi. Některé cytokiny působí jako chemotaktické agens. Cytokiny jsou zahrnuty v místní regulaci buněčného růstu a diferenciace mnoha buněčných typů, čímž značnou měrou se přispívají do zánětlivých procesů. Současný trend ve studiu biologie cytokinů vede ke sledování role těchto mediátorů v řadě infekčních, nádorových a autoimunitních onemocnění. Různé modely onemocnění jsou stále častěji využívány pro ilustraci nezbytnosti cytokinů v modulaci zánětlivé odpovědi hostitele při různých chorobách. Nicméně, studium cytokinů a jejich zapojení v různých zánětlivých a imunitních

odpovědích

je

velmi

komplikované

vzhledem

k

jejich

pleiotropním,

synergickým/antagonistickým účinkům. Přestože byla provedena celá řada studií o působení jednotlivých cytokinů in vitro, je mnohem složitější porozumět síťovému působení cytokinů in vivo. Aktivované fagocyty produkují více než jeden cytokin v odpovědi na příslušný stimul, a proto je velmi obtížné hodnotit přímý účinek jednotlivých cytokinů. Komplexnost interakcí vede k mnohonásobné kontrole, která limituje délku a rozsah buněčné odpovědi. Také načasování sekrece jednotlivých cytokinů a posloupnost jejich působení během zánětlivé reakce nejsou doposud zcela objasněny. K zodpovězení těchto otázek jsou sestavovány různé experimentální modely, které využívají rekombinantních cytokinů, antagonistů cytokinů, transgenních zvířat exprimujících geny pro cytokin a nebo zvířat, kterým tento specifický gen chybí. 1. 6. ZÁNĚ T 31

1. ÚVOD

Zánět je souhrn fyziologických reakcí při narušení integrity organismu, které vedou k ochraně před infikováním poškozeného místa, k lokalizaci poškození a ke zhojení. Induktorem zánětlivé reakce mohou být patogenní mikroorganismy a nebo látky sekretované poškozenými buňkami následkem chemického/ fyzikálního poranění. Je známo, že také oxidativní stres mění řadu imunitních funkcí a je závažným iniciátorem zánětlivé odpovědi. Při narušení integrity začne organismus mobilizovat zánětlivou odpověď. Reakce zánětlivé odpovědi probíhají podle shodného scénáře bez ohledu, zda byla integrita organismu narušena infekcí či traumatem nebo např. reperfuzí ischemické tkáně. Fyziologickou odpovědí organismu na stav ohrožení je místní prozánětlivá a systémová protizánětlivá reakce. Takto koordinovaná odpověď soustřeďuje potenciál obranných procesů do postiženého místa, čímž se redukuje možnost poškození ostatních tkání v důsledku obranných zánětlivých reakcí. Příčinou systémové zánětlivé odpovědi je průnik prozánětlivých cytokinů, často i patogenních mikroorganismů, z původně místního zánětlivého ložiska do systémové cirkulace. Protizánětlivá odpověď je vždy přítomna, ale v akutním stádiu, pokud invaze prozánětlivých působků převyšuje její kapacitní možnosti, není schopna stávající situaci zvrátit. Akutní zánět je zpravidla fyziologickou obrannou reakcí a obvykle odezní bez následků a poraněná tkáň se kompletně zhojí, zatímco chronický zánět je již patologický. Některé práce prokazují korelaci mezi chronickým zánětem a vznikem nádorového onemocnění. 1. 6. 1. Záně tlivá odpověď V důsledku tkáňového poškození dochází k uvolňování vazoaktivních látek (histaminu, kininů), které ovlivňují průměr cév. Tyto faktory způsobují zvýšení permeability cév, vazodilataci kapilár a vazokonstrikci cév vedoucích krev směrem od poškození, čímž narůstá příliv imunokompetentních buněk do zánětlivého ložiska. Zvýšením kapilární propustnosti se tvoří erytém, dochází ke zvýšení teploty a otoku tkáně. Do cirkulace je uvolňována řada zánětlivých mediátorů - TNFα, IFNγ, IL-1, PAF, LTB4, a také složky komplementu (C3a, C5a), které iniciují zánětlivou odpověď. Vlivem těchto zánětlivých mediátorů a produkce RKM/RDM se zvyšuje exprese adhezivních molekul na povrchu fagocytů a cévních endoteliálních buňek. Interakce fagocytů s cévním endotelem, migrace a charakter endoteliální vrstvy cév sehrávají důležitou úlohu v obranných mechanismech hostitele, zánětlivé odpovědi a udržování homeostázy organismu. Proto porozumění mechanismům a nebo regulacím těchto interakcí může mít značnou důležitost pro pochopení řady klinických onemocnění. Interakce leukocyt-endoteliální buňka je přísně regulovaný proces a sestává ze 3 kroků. Počáteční „rolling“ fáze má za úkol zpomalit pohyb leukocytů v krevním řečišti a usnadnit jejich 32

1. ÚVOD

bezprostřední adherenci na cévní povrch pomocí adhezivních molekul tzv. selektinů. Pselektiny a E-selektiny jsou exprimovány na povrchu endoteliálních buněk a L-selektiny na povrchu leukocytů. CD62L (L-selektin) je zahrnut také v extravasaci neutrofilů a lymfocytů do místa zánětlivé reakce. Druhým krokem je pevná vazba neutrofilů na endotelovou vrstvu pomocí vysokoafinitních receptorů - intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) nebo leukocyte function associated antigen-1 (LFA-1; CD11a/CD18). β2-integriny jsou komplexem glykoproteinů uspořádaných z β-řetězce (CD18) a 3 rozdílných α- řetězců (CD11a, CD11b, CD11c). CD11b/CD18 funguje jako komplement receptor 3 (CR3). Tato pevná vazba vyžaduje změnu konformace extracelulárních domén β-integrinů způsobené interakcí selektinů, CD31 nebo vystavením neutrofilů molekule chemoatraktantu (IL-8, platelet-activating factor (PAF), fMLP, C5a, LTB4). Poslední fází migrace je extravasace fagocytů mezi epiteliálními buňkami a dosažení zánětlivého ložiska, což je zajišťováno gradientem molekuly chemoatraktantu. Zatímco monocyty a lymfocyty prostupují přes klidový cévní endotel spontánně, neutrofily vyžadují aktivaci endotelu a/nebo chemoatraktant. Také aktivovaný cévní endotel produkuje chemotaktické působky - IL-6, PAF, LTB4 a IL-8, které modulují integritu cév, koagulaci a vytváří chemotaktický gradient pro vstup nové vlny PMNL do zánětlivého ložiska a podporují zrání imunokompetentních buněk. Chemotaktické a adhezivní pochody lákají další imunokompetentní buňky do postiženého místa a umocňují zánětlivou odpověď, ale i možné tkáňové poškození. Ve zřetelně ohraničeném prostoru jsou fagocytované mikroorganismy intracelulárně usmrcovány po vystavení vysokým koncentracím cytotoxických produktů oxidativního vzplanutí fagocytů. Cytotoxická aktivita uvedených obranných mechanismů však není antigenně specifická. Nedokonale řízená zánětlivá odpověď se mimo prostor vymezený membránami fagozomu lehce vymyká kontrole a způsobuje poškození vlastních tkáňových struktur. 1. 6. 2. Role cytokinů v patologii onemocně ní spojené s akutním a chronickým záně tem Cytokiny jsou nezbytné jako iniciační stimul účinné zánětlivé odpovědi a jsou zodpovědné za koordinaci obranných mechanismů vnitřní imunity. Nicméně jejich nadprodukce a neadekvátní účinky mohou vést k vážným poškozením hostitelského organismu. Zvýšená hladina cytokinů byla prokázána v různých orgánech během infekčních, ale také neinfekčních zánětlivých onemocnění. Masivní navýšení koncentrací cytokinů v plazmě je pozorováno během některých patologických stavů jako je ateroskleróza, revmatoidní artritida, chronické zánětlivé artritidy, cukrovka se svými komplikacemi, poškození pojivové tkáně (sklerodermie), zánětlivé onemocnění střev a kůže. Příkladem negativních účinků cytokinů je septický šok. Zde je 33

1. ÚVOD

kritickým mediátorem masivně uvolňovaný zánětlivý cytokin - TNFα, který společně s cévním kolapsem a nízkým tlakem vyúsťuje ve stav, který může končit i smrtí. Také během adherence a migrace fagocytů dochází k intenzivnější sekreci cytokinů, které za určitých podmínek mohou působit cytotoxicky a modifikovat cévní endotel. Cytokiny jsou zahrnuty v mnoha procesech spojených s poruchami autoimunity a patogenezí chronických zánětlivých onemocnění. 1. 6. 3. Systémová záně tlivá odpověď Systémová zánětlivá odpověď (SIRS - systemic inflammatory response) vytváří podmínky pro přežití organismu při závažných infekčních chorobách, polytraumatech a po náročných operačních zákrocích. Orgánové transplantace a srdeční operace s použitím mimotělního oběhu jsou úzce spjaty s ischemicko-reperfuzními procesy. Reperfuze celkově ischemického myokardu indukuje typickou zánětlivou odpověď, která však není způsobena vstupem cizorodé částice, ale tkáňovou anoxií a následnou reoxygenací tkáně. Reperfundovaný myokard je považován za kvantitativně nejvýznamnější zdroj prozánětlivých cytokinů indukujících SIRS. Jednou ze zásadních komplikací při těchto složitých chirurgických zákrocích je oxidativní stres, který také hraje kritickou úlohu v iniciaci a propagaci systémové zánětlivé odpovědi. SIRS je komplexní obranná reakce organismu, která je spjata s tvorbou multifunkčních prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů

a se změnami v metabolické

aktivitě profesionálních fagocytů produkujících RKM a RDM. Tyto regulační a cytotoxické molekuly uvolňované během zánětlivé odpovědi jsou zapojeny do procesů adheze fagocytů k cévnímu povrchu, migrace zánětlivých buněk do poškozeného ložiska, regulace metabolické aktivity fagocytů a tvorby enzymů. Řada prací prokázala zvýšenou hladinu cytokinů IL-6, IL8, IL-10 a TNFα vyplavovaných během časných repefuzních fází při srdečních operacích a po orgánových transplantacích, kde korelují se stupněm tkáňového poškození a jsou v úzké spojitosti se závažnosti zákroku. Prozánětlivé účinky IL-6, IL-8 a TNFα modulují funkce endoteliálních buněk a fagocytů a iniciují akumulaci neutrofilů v zánětlivém ložisku, což může indukovat oxidativní poškození tkáně. Klíčovou roli v tomto poškozování sehrávají především prozánětlivé účinky TNFα. Časné navýšení hladin cytokinů může indukovat neutrofily a makrofágy k další produkci cytokinů, a tím prohloubovat tkáňové poškození, dysfunkci transplantovaného štěpu nebo dokonce jeho rejekci. Nadměrná prozánětlivá aktivita cytokinů ohrožuje organismus svými toxickými účinky. Existuje korelace mezi zvýšenou hladinou

IL-6,

IL-8,

TNFα

a

funkčními

poruchami

transplantovaného

štěpu,

virovou/bakteriální infekcí nebo časným odvržením štěpu. Fugger et al. též uvádí, že spuštění 34

1. ÚVOD

rejekce při transplantacích jater je spojeno se zvýšenou koncentrací TNFα v plazmě a vysokou hladinou IL-6, následováné virovou/bakteriální infekcí. Také Boros et al. nalezl vyšší hladiny IL-6, IL-8 a TNFα u pacientů se špatnou počáteční funkcí transplantátu. Naopak rychlý pokles a nízké hladiny cytokinů byly pozorovány u pacientů s dobrým počátečním stavem transplantovaného štěpu. Nicméně přesná dynamika produkce cytokinů není doposud zcela známá. Zdárný průběh SIRS je podmíněn vyváženou aktivací prozánětlivé a protizánětlivé složky imunitního systému. Při nevyváženém poměru prozánětlivých a protizánětlivých složek existuje riziko přechodu SIRS v závažnější a prognosticky nepřiznivé formy syndromu multiorgánové dysfunkce a syndromu multiorgánového selhání. Důležitou součástí zánětlivé odpovědi je také tvorba protizánětlivých cytokinů, které přirozenou cestou omezují nežádoucí rozsah zánětlivých a imunitních reakcí. Nepřiměřené aktivaci a šíření zánětlivé odpovědi brání, za normálních okolností, protizánětlivé a imunosupresivní působky endogenního regulačního mechanismu. Za nejvýznamnější protizánětlivý cytokin je považován IL-10. IL-10 produkován během orgánových transplantací, kde snižuje metabolickou aktivitu fagocytů a způsobuje inhibici sekrece prozánětlivých cytokinů (IL-6, IL-8 a TNFα). Terapeutický potenciál IL-10 a jeho analogů spočívá v ochraně organismu před nepřiměřenou zánětlivou odpovědí, rozvojem SIRSu a v ochraně ischemických orgánů před reperfuzním poškozováním. Protizánětlivé účinky IL-10 mají velký vliv na celkovou zánětlivou odpověď. Čím méně příznivý je kardiovaskulární profil nemocného, tím vyšší je produkce IL-10 v průběhu operace. Některé práce předkládají informace o tom, že IL-10 redukuje allogenní odpověď a brání rejekci štěpu u pacientů s transplantací jater. Nicméně nepřiměřený rozvoj protizánětlivých reakcí včetně nadměrné tvorby IL-10 ohrožuje nemocné nekontrolovaným šířením patogenních mikroorganismů a vyšší úmrtností při infekčních onemocněních. Podmínkou příznivé prognózy zánětlivé odpovědi je vyvážený poměr obou jejích složek - prozánětlivé i protizánětlivé. Nové možnosti skýtají farmakologické postupy, které do určité míry napodobují účinky protizánětlivého IL-10. Cytokinová imunoterapie/ imunomodulace Detekce hladiny prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů při různých onemocněních může poskytnout řadu užitečných diagnostických informací. Terapeutické využití farmakologických dávek cytokinů již bylo testováno u širokého množství infekčních chorob a onemocnění spojených s poruchami imunity. Zdá se, že např. monitorování hladin cytokinů v periferní krvi během složitých chirurgických zákroků a v pooperačních stádiích poskytuje užitečné 35

1. ÚVOD

informace o klinickém stavu pacienta, rekonvalescenci a možných rizicích. Využití účinků cytokinů a nebo naopak jejich potlačení je jednou z možných cest modifikace zánětlivé odpovědi v mnoha patofyziologických procesech. Zájem využívat rekombinantní cytokiny v imunoterapii roste s přibývajícími informacemi o jejich regulačním vztahu s aktivitou fagocytů v zánětlivé odpovědi. Některé cytokiny mají přímé a často synergické účinky, které podporují mikrobicidní vlastnosti imunokompetentních buněk a další sekreci cytokinů. Výsledek zánětlivé odpovědi, tj. rozpoznání a inaktivace patogenních mikroorganismů/ vlastních poškozených buněk, obnovení morfologické a funkční celistvosti tkání či orgánů, je podmíněna včasným zahájením, průběžnou kontrolou a včasným ukončením všech reakcí zánětlivé odpovědi. Všechny tyto mezistupně zánětlivé odpovědi jsou přísně kontrolovány aktivovanými profesionálními fagocyty a jejich produkty – RKM, RDM a cytokiny. Příspěvek aktivovaných fagocytů, cytokinů, RM a jejich vzájemných interakcí je zřejmý v patogenezi mnoha zánětlivých onemocnění. A řada těchto onemocnění je iniciována oxidativním stresem. Z toho vyplývá, že možnost regulace fyziologických a patofyziologických funkcí fagocytů by mohla být klíčová ve zlepšení průběhu zánětlivé reakce či dokonce zamezení vzniku mnoha zánětlivých onemocnění. Část disertační práce je proto zaměřena na sledování regulačních účinků vybraných prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů na produkci RKM a modulaci exprese adhezivních molekul na povrchu leukocytů in vitro.

1. 7. PŘ EHLED TESTOVANÝCH CYTOKINŮ 

TNFα je silný prozánětlivý cytokin, jehož důležitá role spočívá v iniciaci zánětlivé odpovědi a indukci akutní fáze zánětu. Jeho účinky se uplatňující především v rámci přirozené imunity, nicméně je též významným pojítkem specifické imunitní odpovědi a akutního zánětu.

Nízké koncentrace TNFα (10-9M) působí místně jako autokrinní nebo parakrinní regulátor funkcí monocytů/makrofágů, PMNL a endoteliálních buněk. Je-li iniciační stimul dostatečně silný, může TNFα vstupovat do krevního řečiště a působit také endokrinně. Největšími buněčnými zdroji TNFα jsou mononukleární leukocyty, ale také antigenem stimulované Tlymfocyty, fibroblasty, neutrofily a žírné buňky. Afinita TNFα ke svým receptorům je neobvykle nízká, avšak TNFα je syntetizován ve velkém množství a může tedy snadno saturovat své receptory. TNF-receptory (TNF-αRI a TNF-αRII) jsou přítomny na povrchu 36

1. ÚVOD

téměř všech buněčných typů. Aktivované buňky mohou odlučovat obě formy TNF-receptorů, a ty mohou kompetitivně inhibovat biologické funkce TNFα. Signální transdukce vyvolaná působením TNFα na cílovou buňku je velmi rychlá - řádově minuty. Příčinou je rychlé přemístění komlexu NF-κB z cytoplazmatického prostoru do buněčného jádra, kde se váže na DNA-promotor mnoha genů pro cytokiny. TNFα je významným aktivátorem baktericidních účinků profesionální fagocytů; zvyšuje expresi adhezivních molekul na povrchu endoteliálních buněk - ICAM-1, VCAM-1, Eselektinů, P-selektinů a na PMNL CD11b/CD18, zvyšuje expresi CD35, CD18, MHC II, což umož uje rychlou adhezi fagocytň ů k endoteliálním buňkám a akumulaci imunokompetentních buněk v zánětlivém ložisku..Zdá se, že zvýšené uvolňování RKM indukované působením TNF α, hraje významnou roli v „rolling“ fázi leukocytů. Tato funkce je považována za fyziologicky nejdůležitější místní efekt TNFα. Dále se prozánětlivé účinky TNFα projevují ve stimulaci tvorby IL-6, IL-1, IL-8, INFγ a proteinů akutní fáze odvozené od mononukleárních fagocytů a cévního endotelu, čímž je zánětlivá odpověď dále propagována. TNFα působí jako endogenní pyrogen. TNFα má podíl na inhibici dělení kmenových buněk kostní dřeně. Dlouhodobé podávání TNFα vede k lymfopénii a imunodeficienci. TNFα také potlačuje syntézu lipoprotein lipáz nutných k uvolňování potřebných mastných kyselin z cirkulujících lipoproteinů. TNFα hraje tedy klíčovou úlohu v hostitelské obraně proti patogenním mikroorganismům. Nicméně, nadměrná produkce TNFα se negativně projeví v patogenezi mnoha onemocnění. Zvýšená tvorba RKM indukovaná TNFα představuje oxidativní stres nejen pro cílové buňky, ale také pro buňky vlastní tkáně. TNFα je důležitou regulační složkou v obraně organismu proti gram-negativní infekci. Bakteriální sepse vyvolává masivní sekreci TNFα (až 10-7M). Tyto extrémně vysoké koncentrace TNFα indukují tkáňové poškození, snížení srdeční stažitelnosti a perfuzi tkání a mohou působit až letálně. TNFα působí buď přímo na srdeční svalovinu a nebo snižuje krevní tlak působením přes NOS uvolňováním vazodilatačního NO a prostacyklínů z cévního endotelu. Prozánětlivé účinky TNFα jsou synergicky podporovány spolupůsobením INFγ, čímž jsou zajištěny prospěšné TNFα účinky za nižších hladin než letálních TNFα. TNFα sekretovaný LPS-aktivovanými makrofágy je zodpovědný za produkci IL-10, zatímco IL-10 redukuje produkci IL-1, IL-6, IL-8, TNFα a G-CSF. V zánětlivých situacích je aktivita IL-10 zrcadlovým projevem působení TNFα a převaha jednoho nebo druhého cytokinu určuje výsledek zánětlivé reakce.

37

1. ÚVOD



IL-10 (18 kD) je produkován především Th2 subpopulací CD4+ lymfocytů, aktivovanými B lymfocyty a makrofágy. IL-10 limituje příspěvek makrofágů do zánětlivého procesu potlačením tvorby prozánětlivých cytokinů TNFα, IL-1, IL-8, IL-12. Pod vlivem IL-10 se mění fenotypový profil neutrofilů, lymfocytů, monocytů i makrofágů. Síťovým efektem IL-10 je potlačovat zánětlivou odpověď zprostředkovanou T-lymfocyty, čímž zasahuje i do antigenně specifické imunity a celkové obranyschopnosti organismu.

IL-10 udržuje aktivitu cNOS, aktivita iNOS je účinky IL-10 naopak potlačována. cNOS je zdrojem pikomolárních množství NO s protizánětlivými a cytoprotektivními účinky, které omezují vazbu aktivovaných neutrofilů s endoteliálními buňkami. Naopak iNOS produkuje prozánětlivé, cytotoxicky působící nanomolární koncentrace NO, které adhezivní děje významně zesilují. IL-10 má schopnost omezovat celkové příznaky zánětlivé reakce, jako je septický šok, intravaskulární srážení krve, nadměrná kapilární permeabilita a nahromadění fagocytů v tkáni. Nadměrná tvorba IL-10 při infekčním onemocnění zvyšuje mortalitu postižených jedinců, kteří následkem toho nejsou schopni kontrolovat průnik a šíření patogenních mikroorganismů. Naopak nedostatečná nebo chybějící tvorba IL-10 sice vede k rychlejšímu a účinnějšímu odstraňování infekčních agens, avšak takto postiženým jedincům hrozí úmrtí z nekontrolovaného rozvoje imunitní reakce. Aplikace exogenního IL-10 má příznivý účinek na nebakteriální zánět, kterým je např. SIRS při polytraumatech a náročných operačních výkonech a/nebo ischemicko-reperfuzním poškození orgánů. Proti repefuznímu poškození působí IL-10 tak, že omezuje infiltraci aktivovaných neutrofilů do zánětlivého ložiska a snižuje aktivitu MPO, která je důležitá pro rozvoj nekrózy. Zdrojem IL-10 v reperfundovaném myokardu jsou lymfocyty, které se do ischemického ložiska dostaly po chemotaktickém gradientu IL-8. Nejvyšších hodnot produkce IL-10 se dosahuje po 24h po zahájení reperfuze a určitou produkci IL-10 lze detekovat dalších 120h. Nejvyšší nárůst IL-10 se kryje s dobou poklesu tvorby IL-6 a v této době také IL-10 ukončuje své cytotoxické účinky a zahajuje reparační účinky. Neutrofily přestávají odpovídat na aktivační podněty prozánětlivých cytokinů a přecházejí do apoptózy, čímž se vyřazují ze zánětlivé reakce. Hojení nekrotické tkáně je výsledkem aktivity makrofágů, které vytváří působky nezbytné pro regenerační procesy. Dále dochází k deaktivaci makrofágů, které spočívá v ukončení tvorby prozánětlivých působků, zejména RM a TNFα a sekreci růstových faktorů: transforming growth factor beta (TGFβ), inhibitorů metaloproteáz, které zamezují odbourávání mezibuněčné hmoty a zvyšují její syntézu. In vivo se na tvorbě IL-10 významně podílí stresová odpověď nadledvin s vyplavováním glukokortikoidů a endogenních katecholaminů a/nebo terapeutické podání farmakologických dávek katecholaminů. Tímto mechanismem IL38

1. ÚVOD

10 snižuje tvorbu TNFα, na rozdíl od experimentální endotoxémie, kdy LPS nejprve indukuje tvorbu TNFα a ten následně vyvolá tvorbu IL-10. 

IL-6 (26kD) je sekretován jako následek bakteriální gram-negativní infekce nebo častěji jako odpověď na působení TNFα nebo IL-1. Hlavními buněčnými zdroji jsou mononukleární fagocyty, cévní endoteliální buňky, aktivované T-lymfocyty a fibroblasty. Prozánětlivé účinky IL-6 se výrazně projevují v počátečních fázích stresové reakce, kdy IL-6 iniciuje tvorbu proteinů akutní fáze: C-reaktivního proteinu, fibrinogenu, složek komplementu a ceruloplazminu. Tyto produkty vedou ke zvýšení vstupu profesionálních fagocytů do zánětlivého ložiska. Dále napomáhají odstranění patogenů, vlastních nekrotických buněk a nefunkčních proteinů, čímž brání nepřiměřené aktivaci imunitního systému a sebepoškozování organismu. Složky akutní fáze hrají důležitou úlohu v reparaci poškozených tkání. Nicméně jsou známy i protizánětlivé účinky IL-6, které se projeví až v pozdějších fázích zánětlivé odpovědi, kde IL-6 snižuje tvorbu TNFα, IL-1β a INFγ, zvyšuje tvorbu solubilních receptorů TNFα a vede k tvorbě protizánětlivých a imunosupresivních glukokortikoidů. Rozdílná dynamika produkce IL-6 a IL-10 je ukazatelem závažnosti celkové zánětlivé odpovědi. U onemocnění s fatálním průběhem nedochází k poklesu koncentrace IL-6. Nepříznivý průběh SIRS je charakterizován vzestupem poměru koncentrací IL-6/IL-10. IL-6 nezpůsobuje trombózu ani tkáňové poškození, které lze pozorovat v odpovědi na LPS nebo TNFα. IL-6 se zdá být vhodným ukazatelem zánětu.



IL-8 (8-kD) patří do skupiny tzv. chemokinů, které plní funkci chemoatraktantu pro cirkulující neutrolily a monocyty a iniciují tak migraci a hromadění fagocytů v postiženém místě. IL-8 zvyšuje expresi CD11b, CD11c a tok Ca2+ a stimuluje tvorbu dalších prozánětlivých cytokinů IL-1, IL-6 a TNFα. IL-8 je produkována LPS-, TNFα aktivovanými mononukleárními fagocyty, lymfocyty, neutrofily, endoteliálními buňkami, fibroblasty nebo epiteliálními buňkami. IL-8 sehrává důležitou roli v zánětlivých procesech a je zahrnut patogenezi některých onemocnění. IL-8 aktivuje proces fagocytózy a oxidativního vzplanutí a zvyšuje tvorbu RKM a indukuje degranulaci neutrofilů. IL-8 je sekretován aktivovanými makrofágy ve dvou fázích: během prvních 8h je tato produkce přímým následkem působení LPS a v následujících 16h působením IL-1 a TNFα. IL-8 výrazně ovlivňuje funkční aktivitu neutrofilů jako mediátory akutní fáze zánětu. Zvýšená

39

1. ÚVOD

hladina IL-8 byla pozorována při I/R, septickém šoku, ateroskleróze, systémové zánětlivé odpovědi, operacích srdce, orgánových transplantacích a dalších onemocněních. 1. 8. ANTIOXIDANTY Každá molekula živého organismu je potenciálním cílem oxidativního poškození. Z těchto důvodů je každý aerobní organismus vybaven účinnými antioxidačními mechanismy, které pohotově eliminují malá množství reaktivních metabolitů radikálové/neradikálové povahy. Antioxidanty jsou substance, které již v nízkých koncentracích, ve srovnání s oxidovatelným substrátem, významně snižují nebo zcela inhibují oxidaci substrátu. Antioxidanty jsou tedy látky chránící biologický systém před škodlivým působením oxidačních procesů. Ve zdravém organismu mají tyto antioxidační mechanismy dostatečnou kapacitu udržovat tvorbu RKM/RDM pod kontrolou a zamezovat projevům jejich nepříznivých účinků. Pokud však hladina reaktivních metabolitů převáží nad kapacitou antioxidačních mechanismů, redoxní rovnováha se posune ve prospěch oxidačních procesů a nastává oxidativní stres. Déletrvající působení RM, dokonce i v nízkých koncentracích, vede k narušení důležitých biomolekul, tkáňovému poškození a patogenezi řady onemocnění. Mezi onemocnění na jejichž iniciaci a zejména propagaci se podílí RM např. ateroskleróza, infarkt myokardu, některá nádorová onemocnění, revmatická artritida, autoimunitní onemocnění a další. Mechanismy, kterými antioxidanty chrání před toxickým působením RM a udržují homeostázu: •

vychytávání již vytvořených RM, při kterém se tvoří stabilnější a méně toxické sloučeniny

•

inhibice syntézy RKM a RDM regulací aktivity enzymů (NOS, NADPH oxidázy)

•

vyvázání kovových iontů nezbytných ke konverzi slabých oxidantů na vysoce toxické

•

podíl na reparačních procesech a odstranění a náhradě poškozených buněk

Mezi základní intracelulární antioxidanty patří superoxiddismutáza (SOD), kataláza a peroxidázy. Cytochrom c a SOD katalyzují dismutaci superoxidového radikálu na kyslík a peroxid vodíku, který je konvertován katalázou na vodu. Kataláza také přeměňuje lipidové hydroperoxidy na alkoholy za pomoci glutathionu (GSH). Glutathion je antioxidant, který vychytává peroxid vodíku a peroxylový radikál vzniklý při lipidové peroxidaci. Oxid dusnatý reaguje s glutathionem a vytváří nitrosothiol nebo rychle reaguje s hemem za vzniku methemoglobinu. GSH může vychytávat také peroxynitrit a tvořit oxidovanou formu GS-SG, která je zpátky konvertována na GSH pomocí NADPH-dependentní glutathion reduktázy. Účinky těchto enzymů se navzájem doplňují a jsou podporovány neenzymatickými antioxidačními složkami. Mezi významné extracelulární antioxidanty bezesporu patří kyselina 40

1. ÚVOD

moč ová, manitol, ubichinon, bilirubin, arginin, citrulin, tetrahydrobiopterin, glycin, histidin.

Obr.č . 4. Odstraňování kyslíkových a dusíkových radikálů a ostatních reaktivních metabolitů v savčí buňce (Fang, 2002).

Kromě těchto endogenních antioxidantů hrají důležitou úlohu také antioxidanty přijímané v potravě. Fyziologická úloha některých z nich je dobře známá; např vitamín E (α-tokoferol) je díky lipofilní povaze součástí buněčné membrány a chrání před oxidativním poškozením PUFAs fosfolipidové membrány. Vitamín C má schopnost vychytávat anorganické i organické radikály a spolupracovat s vitamínem E na ochraně lipidových struktur buněčných membrán. Většina savců je schopna vitamín C syntetizovat, kromě člověka, vyšších primátů a morčete, kteří ho musí přijímat v potravě. Vitamín A inhibuje transkripci genu pro iNOS v buňkách hladké svaloviny cév, endoteliálních buňkách a srdečních myocytech. Karotenoidy potlačují expresi iNOS a tvorbu NO v aktivovaných makrofázích, vitamín K2 a niacin v buňkách mozku a hladké svaloviny cév. Snížením tvorby NO hrají vitamíny důležitou roli v obraně 41

1. ÚVOD

buněk před cytotoxickým působením RM. Vitamíny mají přímou vychytávací schopnost vůči RKM a zvyšují aktivitu antioxidačních enzymů. 1. 8. 1. ROSTLINNÉ POLYFENOLY a jejich antioxidač ní úč inky V posledních letech začala být věnována velká pozornost účinkům rostlinných polyfenolů a jejich možnému terapeutickému využití v léčbě zánětlivých onemocnění spojených s oxidativním stresem. Tyto látky jsou přijímány v potravě zejména zelenině, ovoci a čaji a jsou tedy součástí každodenního jídelníčku. Mezi významné rostlinné polyfenoly patří flavonoidy, které jsou v hojné míře zastoupeny v červeném a bílém víně. Skladba jídelníčku s vyšším obsahem tuků, sacharidů a vůbec životní styl ve středomořských zemích je blízký zvyklostem v České republice. Nicméně i přes tuto podobnost je v zemích středozemí mnohem nižší výskyt kardiovaskulárních onemocnění než v ČR. Tento jev se obecně označuje jako „francouzský paradox“ a je pravděpodobné, že významnou úlohu zde sehrává právě konzumace vína, která je ve Středomořských zemí vyšší. Většina prospěšných účinků umírněné konzumace vína je přisuzována přítomnosti polyfenolických látek. Polyfenoly obsažené ve víně dělíme na látky flavonoidní povahy, kam patří zejména catechin, epicatechin, quercetin a látky neflavonoidní - taniny, 3-hydroxystilbeny, fenolové kyseliny. Předpokládá se, že terapeutický efekt mnoha tradičních přírodních léčiv je zprostředkovaný právě působením přítomných flavonoidů. Vědecké studie uvádí, že rostlinné polyfenoly vykazují antioxidační, protizánětlivé či protinádorové aktivity, které udržují organismus ve zdraví a je možné je využívat v prevenci kardiovaskulárních a nádorových onemocněních. Nicméně existují jen omezené informace o mechanismu účinků, distribuci v organismu, metabolismu a exkreci polyfenolických látek. Některé in vitro studie uvádí, že antioxidační účinek polyfenolů souvisí s blokací tvorby hypervalentních kovových forem, se schopností přímého vychytávání volných radikálů, se zvyšováním účinnosti vitamínů a snížením jejich degradace. Je pravděpodobné, že i jiné mechanismy jako např. modulace oxidačních enzymů nebo obnovení α-tokoferolu z αtokoferoxylového radikálu mohou přispívat k antioxidačním aktivitám polyfenolů in vivo. Flavonoidy zlepšují vstřebávání minerálních látek a vitamínů, potlačují zánětlivou reakci a prokazují ochranný potenciál proti karcinogenezi. Silný antioxidační účinek polyfenolů souvisí také s inhibicí oxidace LDL, čímž zabraňují kornatění cév a vzniku trombóz. Kromě antioxidačních vlastností prokazují polyfenoly také výrazné protizánětlivé aktivity, které spočívá v inhibici fosfolipázy A2, lipooxygenáz a cyklooxygenáz. Nicméně, i když existuje řada důkazů o těchto aktivitách in vitro studiích, nelze je zcela extrapolovat do in vivo situacích vzhledem k jejich biodostupnosti.

42

1. ÚVOD

Podrobně již byly prostudovány například účinky polyfenolů obsažených v čaji. Prospěšnost těchto polyfenolů spočívá ve zvyšování odolnosti erytrocytů vůči oxidativnímu stresu in vitro a in vivo studiích. Dále mají schopnost účinně vychytávat superoxidový a hydroxylový radikál a inhibovat oxidativní modifikaci LDL. Podávání těchto polyfenolů jako součást diety přináší též redukci celkové koncentrace cholesterolu a malondialdehydu (MDA, indikátor lipidové peroxidace) a zvýšení HDL v séru člověka. Dále jejich přínos spočívá v inhibici růstu a indukci apoptózy některých druhů nádorových linií in vitro. Z řady studií tedy vyplývá, že prospěšnost konzumace potravy s vyšším obsahem polyfenolických látek souvisí zejména s jejich antioxidační, v některých případech také protizánětlivými či protinádorovými aktivitami udržující organismus ve zdraví. Nicméně, i přes intenzivní studium polyfenolů v poslední době zůstávají některé jejich vlastnosti, mechanismy účinků a vhodné využití v léčbě a prevenci kardiovaskulárních a nádorových onemocnění stále neobjasněné. 1. 8. 2. CARVEDILOL a jeho antioxidač ní úč inky Kardiovaskulární a cerebrovaskulární onemocnění jsou řazena k nejčastějším příčinám morbidity a mortality. V České republice zapříčiňují kardiovaskulární choroby více než 50% úmrtí a jsou největším zdrojem hospitalizace pacientů vyžadující dlouhodobou léčbu. Tento fakt představuje závažný společenský, zdravotnický a ekonomický problém, jehož řešení je stále aktuální. Prevence a včasná diagnostika hraje rozhodující roli v úspěšnosti léčby. Léčba těchto onemocnění je však nezřídka kdy spojena s podáním více léků z různých farmakologických skupin, čímž narůstá riziko vedlejších účinků a negativní interakce podávaných farmak. Tento problém by mohl být částečně vyřešen zavedením carvedilolu jako součásti léčebného procesu. Carvedilol

1-[carbazolyl-(4)-oxy]-3-[(2-methoxyphenoxyethyl)amino]-2-propanol]

je

jedinečné kardiovaskulární léčivo s multifaktoriálním terapeutickým potenciálem. Z farmakologického hlediska je carvedilol léčivem se širokým rozpětím účinků, kterých se využívá při léčbě hypertenze, anginy pectoris a jiných onemocnění srdce.

43

1. ÚVOD

Obr.č .5. Strukturní vzorec carvedilolu (Cheng et al. 2001).

Hlavní účinek carvedilolu je založen na kombinaci neselektivní blokace β-adrenoreceptorů se selektivní blokací α1-adrenoreceptorů. Adrenergní receptory patří mezi neurohumorální receptory, které se nachází v buněčné membráně hladkých svalů vnitřních orgánů, buňkách kardivaskulárního a centrálního nervového systému. Tyto receptory reagují s řadou exogenních i endogenních látek, ale jejich hlavními agonisty jsou adrenalin a noradrenalin. Základní klasifikace adrenergních receptorů podle účinků je na α- a β-receptory. α-receptory se dále rozdělují podle lokalizace receptoru na α1- převážně jen postsynaptické a α2- součastně postsynaptické i presynaptické. β-receptory se na základě citlivosti k některým lékům dělí na β1- nacházející se v srdeční a střevní hladké svalovině, a β2- v plicích a cévní svalovině. β -blokátory se dále dělí podle afinity na selektivní a neselektivní. Z farmakologického hlediska se β-blokátory využívají především ke snížení srdeční frekvence a krevního tlaku. První generace blokátorů (propranol, timolol) vykazuje stejnou afinitu k β1- a β2-receptorům. Druhá generace (metoprolol) vykazuje vyšší afinitu k β1-receptorům a jsou tudíž kardioselektivní. Nicméně nedostatečná selektivita obou těchto skupin blokátorů nedovoluje jejich podání u pacientů s bronchiálním astmatem nebo cukrovkou. Nicméně byla vyvinuta třetí generace léčiv, do které patří carvedilol, který je klasifikován jako neselektivní β-blokátor se selektivní α1-blokací. Dalšími cíli působení carvedilolu jsou vedle membránových adrenoreceptorů také iontové kanály (K+, Ca2+) a reaktivní metabolity. Vazodilatační účinek carvedilolu je založen na blokaci vápníkových kanálů v membráně hladké svaloviny cév. Antihypertenzní účinek je výsledkem komplexního působení carvedilolu na různých místech: blokace β1>β2 adrenoreceptorů, inhibice periferních α1-adrenoreceptorů, blokace Ca

2+

kanálů aj.. Antiaterogenní a

antihypertrofní účinek je dán preventivním účinkem carvedilolu na přestavbu myokardu při vývoji myopatie. Snížením oxidace LDL chrání carvedilol endoteliální buňky před toxickým 44

1. ÚVOD

vlivem a tím brání aterogenezi. Antiarytmický účinek byl pozorován na různých zvířecích modelech ischemie-repefuze, kde carvedilol zabraňoval tachykardii a redukoval rozsah ischemického ložiska. Antiischemické působení carvedilolu při infarktu myokardu bylo ověřeno v klinických studiích a probíhá několika různými cestami, které jsou úzce spjaty s antioxidační a protizánětlivou aktivitou carvedilolu. Antioxidační a protizánětlivé aktivity carvedilolu Carvedilol, na rozdíl od ostatních β-blokátorů, se jeví jako potencionální antioxidant. Antioxidační aktivita carvedilolu a některých jeho metabolitů byla prokázána na velkém množství buněčných a nebuněčných systémů. Antioxidační účinek carvedilolu je 15x vyšší než účinek vitamínu E a tato vlastnost je přisuzována přítomnosti karbazolové skupiny v molekule carvedilolu. I přesto, že informací dokazující antioxidační kapacitu carvedilolu je celá řada, mechanismus působení carvedilolu na tvorbu RM fagocyty není stále plně objasněn. Některé studie uvádí, že mechanismus antioxidačního působení carvedilolu je založen na přímém vychytávání již vytvořených volných RM, na odčerpávání Fe3+ iontů a nebo na inhibici uvolňování superoxidu z neutrofilů. Dále bylo demonstrováno, že carvedilol má schopnost blokovat adhezi neutrofilů na cévní stěnu a tím zamezovat naakumulování zánětlivých buněk v zánětlivém místě. Také hodnoty TBARS v plazmě byly shledány o více než polovinu nižší u zvířat, kterým byl carvedilol podáván. Carvedilol má schopnost redukovat peroxidaci lipidů v buňkách myokardu a chránit endoteliální, nervové buňky a buňky hladké svaloviny cév před toxickým působením RKM. Ochranný vliv carvedilolu proti vzniku mozkových příhod s následnou ochrannou mozkových cév u spontánně hypertenzních potkanů se též připisuje antioxidačním účinkům. Carvedilol je vhodným přídatným kardioprotektivem, zejména během ischemie/reperfuze. Přepokládá se, že existuje několik různých a doplňujících mechanismů, které přispívají k ochranným účinkům carvedilolu při ischemii myokardu: silná β-adrenergní blokáda, která snižuje srdeční zátěž a spotřebu kyslíku myokardem; k ochrannému účinku přispívá αadrenergní blokáda, která navozuje vazodilataci a zvýšení antiischemického účinku; a k omezení tkáňového poškození může carvedilol přispívat přímou inhibicí migrace krevních fagocytů z cirkulace do ischemického myokardu; a v neposlední řadě také antioxidační vlastnosti carvedilolu přispívají ke kardioprotekci při ischemicko-reperfuzních situacích. Ischemicko-reperfuzní poškození tkání je složitý proces, při kterém sehrávají klíčovou úlohu krevní fagocyty. Aktivované neutrofily mohou agregovat a ucpávat mikrocévní oblasti. Také samotná adherence aktivovaných neutrofilů na cévní endotel může být příčinou narušení cévní 45

1. ÚVOD

stěny toxickým působením RKM a jejich dalšími zánětlivými produkty. Nicméně doposud existuje jen velmi málo studií o vztahu carvedilolu k metabolické aktivitě krevních fagocytů spojené s tvorbou cytotoxických reaktivních metabolitů. Proto je část předkládané disertační práce věnována studiu vlivu carvedilolu na schopnost různých typů profesionálních fagocytů produkovat reaktivní kyslíkové a dusíkové metabolity.

46

2. CÍLE A Č LENĚ NÍ PRÁCE Předkládaná disertační práce je zaměřena na problematiku modulace fyziologických a patofyziologických funkcí fagocytů vybranými prozánětlivými, protizánětlivými a nebo antioxidačními substancemi v zánětlivých procesech. Pro objasnění regulačních vlastností testovaných látek a ověření získaných výsledků bylo v našich pokusech použito více různých metodik a experimentálních modelů. 

Cílem první části disertační práce je přispět k objasnění regulační úlohy vybraných prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů na aktivitu profesionálních fagocytů in vitro. Podrobněji jsme se v této kapitole zaměřili na objasnění mechanismu působení významného protizánětlivého cytokinu IL-10 a jeho kombinovaného působení s prozánětlivými cytokiny - IL-6, IL-8 a TNFα na metabolickou aktivitu krevních fagocytů v zánětu. Regulační účinky cytokinů byly testovány na produkci reaktivních kyslíkových metabolitů nestimulovanými nebo aktivovanými lidskými fagocyty a na expresi povrchových molekul zodpovědných za adhezi a migraci fagocytů do zánětlivého ložiska (CD11b, CD15, CD62L, CD31). Dále byl sledován vliv inkubační doby a rozdílně působících aktivátorů (OZP, PMA) v přítomnosti cytokinů na produkci RKM analyzovanou různými metodami (chemiluminiscence, DHR-123 průtoková cytometrie). Byl také analyzován vliv simultánní inkubace a 60-minutové preinkubace krve s IL-10 a s jednotlivými cytokiny IL-6, IL-8 a TNFα.



V druhé části disertační práce je diskutována otázka prospěšnosti umírněné konzumace vína související s vyšším obsahem rostlinných polyfenolů. Hlavním cílem této kapitoly bylo zkoumat možnosti modulace oxidativního stresu spojeného se zánětem působením polyfenolických látek obsažených ve víně. Za účelem ověření antioxidačních a protizánětlivých vlastností složek dealkoholizovaného vína byl použit „granulom“ jako zánětlivý model spojený s procesem oxidativního stresu. Vliv diety obohacené o rostlinné polyfenoly byl ověřován na parametrech oxidativního stresu - celková antioxidační kapacita, lipidová peroxidace, koncentrace dusitanů a poměr citrulin/arginin. Základní zdroj informací o účincích polyfenolů na zánětlivé parametry poskytla granulomatózní tkáň a exudát bohatý na PMNL, u kterých byla ex vivo měřena schopnost produkovat superoxid a oxid dusnatý.

47

2. CÍLE A Č LENĚ NÍ PRÁCE



Třetí část disertační práce byla zaměřena na získání nových informací o účincích carvedilolu na aktivitu fagocytů. Hlavním cílem bylo ověřit účinky carvedilolu na oxidativní vzplanutí krevních fagocytů a objasnění molekulárního mechanismu jeho antioxidační aktivity. Antioxidační vlastnosti carvedilolu byly sledovány na změně produkce reaktivních kyslíkových a dusíkových metabolitů in vitro. Krevní fagocyty laboratorního potkana byly použity jako model sledování RKM produkce a buněčná linie myších makrofágů (RAW 246,7) byla použita ke studiu exprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého a produkce oxidu dusnatého.

48

3. PŘ EHLED POUŽ ITÝCH METOD V této kapitole je uveden stručný přehled metod použitých ke stanovení změn funkční aktivity fagocytů v zánětlivých procesech a oxidativním stresu. Podrobněji jsou jednotlivé metody popsány v kapitole „Material and methods“ přiložených článků v kapitolách 4.1, 4.2 a 4.3.



detekce produkce RKM – chemiluminiscence a průtoková cytometrie



detekce povrchových antigenů - průtoková cytometrie



stanovení produkce superoxidu - redukce cytochromu c



detekce produkce RDM - Griessova metoda



detekce exprese iNOS – Western-blot analýza



stanovení aktivity iNOS – konverze značeného [3H] L-argininu → [3H] L-citrulin



detekce exprese COX2 – Western-blot analýza



detekce aktivity COX2 – stanovení koncentrace PGE2



stanovení lipidové peroxidace – TBARS



stanovení antioxidační kapacity vína, plazmy, exudátu: TAS kit, NBT test, elektrochemická detekce oxidu dusnatého, redukce R-phycoerythrinu



stanovení obsahu fenolů v dealkoholizovaném víně – chromatografie



indukce zánětu spojeného s oxidativním stresem tzv. „granuloma pouch“



dealkoholizace vína

49

4. VÝSLEDKY A DISKUSE

4. 1.

IL-10 does not affect oxidative burst and expression of selected surfaced antigen on human blood phagocyte in vitro

Gallova L. 1,2, Kubala L. 1, Ciz M. 1, Lojek A.1 Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic Department od Comparative Animal Physiology and General Zoology, Faculty of Science, Masaryk University, Brno, Czech Republic 1

2

Physiological Research Vol. 53: 199-208, 2004

viz. přiložený soubor „Gallova – IL-10“

50

. VÝSLEDKY A DISKUSE

4. 2.

Dealcoholated red and white wines reduce the oxidative stress associated to inflammation in rats

D. López1, M. Pavelková2, L. Gallová2, A. Lojek2, R. Loaiza3, & M.T. Mitjavila1 Department of Physiology, Faculty of Biology, University of Barcelona, Spain; 2 Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic 3 Faculty of Sciences, University of Costa Rica, San José, Costa Rica

1

British Journal of Pharmacology (v recenzním řízení)

60

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Dealcoholated red and white wines reduce the oxidative stress associated to inflammation in rats 1

D. López, 2M. Pavelkova, 2L. Gallova, 2A. Lojek, 3R. Loaiza, & 1M.T. Mitjavila

1

Department of Physiology, Faculty of Biology, University of Barcelona, Spain;

2

Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Brno, Czech Republic

and 3Faculty of Sciences, University of Costa Rica, San José, Costa Rica. Running title: Reduction of oxidative stress in rats by wines. Correspondence to: Dr. M. Teresa Mitjavila, Departament de Fisiologia, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Avgda. Diagonal 645. E-08028, Barcelona, Spain. Telephone number (34) 93 402 15 30. Fax number: (34) 93 411 03 58. E-mail: [email protected]. Summary: 1. In vitro experiments have reported that polyphenols have antioxidant activity. This study was designed to test the hypothesis that modulation of the inflammatory oxidative stress may partly explain the beneficial effects of wines in some conditions. 2. Rats were fed for 15 d a control diet or a diet supplemented with dealcoholated red wine (DRW) or dealcoholated white wine (DWW) and finally a granuloma was induced by subcutaneous administration of carrageenan. 3. DRW showed a higher antioxidant activity than DWW. Both wines reduced the number of cells recruited into the granuloma pouch. 4. The total phenol content increased and some oxidative stress parameters decreased in plasma and inflammatory exudate from rats fed the DRW- and DWW-rich diets. Moreover, the concentration of nitrites plus nitrates was increased in exudate, related to the increase in the citrulline/arginine ratio. 5. Polymorphonuclear cells (PMN) from the inflammatory exudate of rats fed dealcoholated wines showed a decrease in superoxide anion (O2.-) production and an increase in nitric oxide (NO) production ex vivo. The change in NO production was a consequence of an increase in the expression and activity of the inducible nitric oxide synthase (iNOS). Also, an increase in prostaglandin E2 (PGE2) in exudate by DRW was observed, possibly related to the upregulation of the cyclooxygenase (COX)-2 protein expression by NO. 61

. VÝSLEDKY A DISKUSE

6. Our results suggest that the non-alcoholic component of wines, by increasing NO production, control the vascular tone and tissue perfusion and by reducing the oxidative stress associated to inflammation prevent the initiation and development of atherosclerosis. Keywords: Free radicals; nitric oxide synthase; polymorphonuclear leukocytes; flavonoids Abbreviations:

AAPH,

2,2',-azobis-(2-amidinopropane)

dihydrochloride;

COX,

cyclooxygenase; DRW, dealcoholated red wine; DWW, dealcoholated white wine; IC50, 50%inhibitory concentration; iNOS, inducible nitric oxide synthase; L-NIO, N-imino-ethyl-Lornithine; NO, nitric oxide; O2.-, superoxide anion; PGE2, prostaglandin E2; PMN, polymorphonuclear leukocytes; SOD, superoxide dismutase; TAS, total antioxidant status; TBARS, thiobarbituric acid reactive substances. Introduction Most of the beneficial effects of moderate red wine consumption are related to its polyphenolic compounds including tannins, flavonoids, trihydroxystilbenes and phenolic acids. They had been addressed to the prevention of cardiovascular disease (de Whalley et al., 1990; Frankel et al., 1993; Hayek et al., 1997; Benito et al., 2002) and may also contribute to other potential biological activities. Flavonoids are consumed daily in the average Western diet but only limited information is available on their absorption, distribution, metabolism, and excretion. Most of the flavonoids are poorly absorbed from the gut and are subject to degradation by intestinal micro-organisms. Thus, the bioavailability of these compounds can be limited because they may not reach a concentration to be biologically effective (Scalbert & Williamson, 2000; Benito et al., 2004). However, a variety of in vitro experiments have reported that polyphenols posses antioxidant activity (Rice-Evans et al., 1996; Lotito & Fraga, 1998) either by blocking the generation of hypervalent metal forms (Kuo et al., 1998), by scavenging free radicals (Robak & Gryglewski, 1998; Paquay et al., 2000) or by breaking lipid peroxidation chain reactions (Cook & Samman, 1996). Moreover, they have an antiinflammatory activity independent of their antioxidant property, through inhibition of phospholipase A2 (Lindahl & Tagesson, 1997), cyclooxygenase (COX) (Morikawa et al., 2003) and lipoxygenase (Laughton et al., 1991). The evidence of all these activities in vitro cannot be extrapolated to an in vivo situation for the kinetic reasons exposed. The inflammatory response is characterized by the attraction of large amounts of leukocytes (neutrophils, monocytes-macrophages and mast cells) to the inflamed area. These inflammatory 62

. VÝSLEDKY A DISKUSE

cells are triggered by the mediators of inflammation and generate nitric oxide (NO), superoxide anion (O2.-) and other potentially cytotoxic species. The inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene expression is up-regulated in the presence of cytokines and thus, NO production is sustained at a high level (Moncada et al., 1991). O2.- in the presence of transition metals will generate hydroxyl radical or by reacting with NO will generate peroxynitrite. Hydroxyl radical and peroxynitrite are powerful oxidants and are capable of injuring the invading pathogens and eliminating the altered cells and tissues. However, indiscriminate destruction of cells and tissues plays a significant role in the pathology of many inflammatory conditions, including atherosclerosis, sepsis, arthritis and diabetes. Thus, selective inhibition of O2.- and peroxynitrite or an increase in NO production are key targets for the attenuation of inflammatory diseases. In the present work, we have used the carrageenan-induced granuloma in rats as a model in which inflammation and oxidative stress are associated and easily evaluated. This enabled us to study the hypothesis that interactions in parameters involved to these two processes may explain some aspects of the beneficial effects of wines in inflammatory-like situations such as in the atherosclerosis development. Methods Phenolic content and antioxidant activity of dealcoholated wines Total phenols in dealcoholated wines were measured following the Folin-Ciocalteau colorimetric method, using gallic acid as standard (Singleton & Rossi, 1965). The antioxidant potential of dealcoholated wines was determined by five methods. The reducing power and the total antioxidant status (TAS) reflect the antioxidant capacity involving oxidants that are not necessarily pro-oxidants. The O2.-, peroxyl radical and NO scavenging activities evaluate the antioxidant capacity involving oxidants that are pro-oxidants. The reducing power was determined in 150 µl according to the method of Oyaizu (1986) using quercetin as standard. TAS was assayed in 5 µl using the TAS kit (Randox Laboratories, Crumlin, UK). The O2.- scavenging activity was quantified in serial dilution of wines by the hypoxanthine/xanthine oxidase system via the rate of reduction of nitroblue tetrazolium to a dark-blue formazan measured at 540 nm every minute for a 20 min period (Ukeda et al., 1997). The maximal velocity was computed to determine the concentration to induce 50% inhibition (IC50) of the O2.- generated by the system. The peroxyl radical scavenging capacity of wines was tested using R-phycoerythrin as a redox-sensitive fluorescent indicator and 2,2',-azobis-(2amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) as a chemical peroxyl radical generator (Glazer, 1990) in wines diluted to 1:25 (v v-1). The decline of R-phycoerythrin fluorescence was 63

. VÝSLEDKY A DISKUSE

measured at 37ºC for 30 min (excitation wavelength 530 nm, emission wavelength 585 nm). NO scavenging was determined according to the method of Vriesman et al. (1997) with some modifications. Briefly, NO was chemically generated through dilution of 50 µl of 50 mM NaNO2 (giving 250 nM of NO) in 10 ml of 0.1 M H2SO4 and 0.1 M KI, pH 1.0. After 2 min, dealcoholated red wine (DRW) and dealcoholated white wine (DWW) were added to a final concentration of 1:100 to 1:1000. Haemoglobin was used as standard. During measurement the test vial was kept under N2 current. The NO concentration was monitored with an Iso-NO meter (World Precision Instruments, Saratosa, FL, U.S.A.). The natural logarithm of the NO concentration was plotted versus time. The (pseudo) first-order reaction constant for scavenging was calculated. Animals and diets Male Sprague Dawley rats weighing about 125 g were purchased from Harlan Interfauna Ibérica (Barcelona, Spain). They were housed in temperature-controlled rooms (21-23°C), with 40-60% humidity, and exposed to a 12-h light:dark cycle. Rats were divided into three groups and fed one of the following semi-purified diets for 15 d: (1) a control diet, (2) a 35% (v w-1) DRW diet, and (3) a 35% (v w-1) DWW diet (Table 1). Diets were manufactured and stored at –20°C under vacuum until use to prevent oxidation and loss of antioxidants. Fresh food was provided once a day. Animals had free access to food and water. The experimental protocols were reviewed and approved by the Ethical Committee of the University of Barcelona, in accordance with the European Community guidelines. Dealcoholated wines were prepared from common commercial wines from Spain. Alcohol was removed in a rotary evaporator at a maximum temperature of 30°C. Vacuum was applied progressively up to –70 bars to avoid mechanical stress. Evaporated ethanol was replaced by acidulated distilled water and the pH was adjusted to the original wine pH. Gas chromatography was used to determine traces of ethanol in the dealcoholated wines. Ascorbic acid content in dealcoholated wines was measured fluorimetrically (Hubmann et al., 1969). Induction of inflammation and inflammatory parameters A granuloma was induced by subcutaneous administration of 6 ml of air, followed 24 h later by 4 ml carrageenan 2% (w v-1) in sterile saline into the dorsum of rats as previously described (Muntané et al., 1991). Rats were anaesthetized with isofluorane 24 h after the carrageenan injection. Blood, extracted by heart puncture, and the exudate of the inflammatory pouch were harvested after an overnight fast with heparin- or EDTA-treated syringes. The pouch was rinsed 64

. VÝSLEDKY A DISKUSE

with 3 ml of saline and kept separately. Blood and exudate were centrifuged at 800 x g and the supernatant from the exudate obtained in the presence of EDTA was filtered through Millipore 10kD filters (Bedford, MA, U.S.A.). Aliquots of plasma and exudate were flushed with N2 and stored at -80ºC. Such storage does not significantly alter the antioxidant activity. The osmolarity and the protein concentration in exudate were evaluated by a microosmometer (Advanced Instruments, Needham Heights, MA, U.S.A.) and by the Biuret method, respectively. For prostaglandin E2 (PGE2) measurement, the supernatant from the exudate was processed through C18 solid phase Sep-Pack cartridges (Waters, Milford, MA, U.S.A.), previously activated with methanol and acidified water (pH 4.0). Eluates from 5 ml of methanol were evaporated under N2 and the resulting dried residues were resuspended for the PGE2 immunoassay analysis (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, U.S.A.). Cells were counted after hypoosmotic lysis of contaminating erythrocytes, resuspended in phosphatebuffered saline pH 7.4 without Ca2+ or Mg2+, and washed twice in the same buffer. Viability of inflammatory cells was above 90% as assessed by the Trypan blue exclusion test and 80-90% were PMN. Cells were used for measurement of O 2.- and NO production. The granuloma was extracted and weighed. Parameters related to oxidative stress in plasma and exudate from rats fed dealcoholated winerich diets The antioxidant potential of plasma and exudate were determined by the five methods previously described. Malondialdehyde was assayed as a marker of oxidative stress. Malondialdehyde equivalents were measured in 200 µl of samples by the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) method using tetraethoxypropane as standard (Yagi, 1984). TBARS were extracted with butanol (v v-1). The tubes were centrifuged at 450 x g for 10 min and the absorbance of the upper phase was measured at 540 nm. Nitrites plus nitrates were measured as indicators of NO production (Marletta et al., 1988) in 100 µl of EDTA-harvested plasma or EDTA-harvested exudate by using nitrate reductase (Cayman Chemical) and followed by the Griess reagent. The absorbance was measured at 540 nm. Sodium nitrite was used as standard. The relationship between free L-citrulline vs. free L-arginine was also measured in 500 µl exudate. The aminoacid analysis was conducted by an ion-exchange chromatography (Alpha Plus Two, Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden) coupled to an autoanalyzer. The 300 mm length and 3 mm width column was filled of Dionex DC 6A (Dionex Corporation, 65

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Sunnyvale, CA, U.S.A.). Lithium citrate buffer was used as recommended by the manufacturer (Hilger Analytical, Westwood Monget Kent, UK). The fluorescent derivatives produced by ortophtaldialdehyde were detected in a fluorimeter (excitation wavelength 395 nm, emission wavelength 475 nm). Norleucine was used as internal standard. O2.- and NO production by PMN from the inflammatory exudate PMN (1 x 106 cells per tube) were incubated for 1 h in phosphate buffered-saline, pH 7.4 with 2 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2, and 100 ng ml-1 phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma, St Louis, MO, U.S.A.). Generation of O2.- was assayed by measuring superoxide dismutase (SOD)-inhibitable reduction of 0.15 mM cytochrome c (horse heart type VI, Sigma) in the presence of 0.6 mM N-iminoethyl-L-ornithine (L-NIO) (Cookson Chemicals LTD, Southampton, UK) (Ródenas et al., 1998). Nitrites plus nitrates were measured as indicators of NO generation by PMN and assays were performed in the presence of 0.6 mM L-arginine and 60 U ml-1 SOD. Also, 0.6 mM L-NIO was used in some tubes to substract the L-NIO inhibitable NO production (Ródenas et al., 1995). 60

µl of incubation medium were treated with 10 µl nitrate reductase (Cayman Chemical) followed by the Griess reagent. To evaluate iNOS protein expression, 107 PMN were incubated in 500 µl of a lysis buffer containing 50 mM Tris.HCl (pH 7.4), 500 µM EDTA, 500 µM EGTA, 7 mM glutathione, 10% glycerol (v v-1), 20 mM CHAPS, 100 mM dithiothreitol, 1 µg ml-1 pepstatin, 1 µg ml-1 aprotinin, 1 µg ml-1 leupeptin and 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride for 30 min at 4ºC. Samples were sonicated and boiled at 90ºC for 3 min. Protein concentration in samples was evaluated by the Bradford technique. Homogenate samples (20 µg protein per lane) were submitted to gel electrophoresis and blotted onto a nitrocellulose membrane. Purified murine iNOS was also loaded (1 µg) as a positive control and a prestained protein standard was used to check transfer efficiency. Membranes were then exposed to a 1:1000 of rabbit anti-human iNOS polyclonal antibody (Cayman Chemical) and 1:1000 rabbit anti-chicken γ -tubulin as a housekeeping for 1 h. Antibody detection was carried out by using Immun-Star Anti-Rabbit Detection Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, U.S.A.). For semiquantitative analysis, Western blot images were exported as Tiff-files, and for quantification, rectangles were set to identify specific bands; intensities were calculated as the integrated intensity of all pixels inside the rectangles and expressed by relative densitometric units with regard to the murine iNOS.

66

. VÝSLEDKY A DISKUSE

iNOS activity in PMN from rats fed the different diets was measured by quantifying the amount of [3H]-L-citrulline that is formed from [3H]-L-arginine using a Cayman Chemical kit. [3H]-L-citrulline content was measured by liquid scintillation counting in a Packard Top-Count counter (Packard Instrument Company, Meriden, CT, U.S.A.). To selectively measure iNOS, a Ca2+-free buffer was used and EGTA was present in a final concentration of 1 mM. Nonenzymatic conversion was determined by using heat-inactivated cell suspension containing 10 7 cells (2 min a 100°C). In some experiments, 1 mM N G-nitro-L-arginine methyl ester HCl, an inhibitor of NOS, was added to the incubation medium for 30 min. COX-2 assays in PMN from the inflammatory exudate To evaluate COX-2 protein expression 107 PMN were incubated in 500 µl of a 50 mM Tris·HCl buffer (pH 7.4) containing 500 µM EDTA, 500 µM EGTA, 7 mM glutathion, 10% glycerol (v v-1), 20 mM CHAPS, 100 mM dithiothreitol, 1 µg ml-1 pepstatin, 1 µg ml-1 aprotinin and 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride for 30 min at 4ºC. Samples were treated as for iNOS expression. Purified murine iNOS was also loaded (2 µg) as a positive control and a prestained protein standard was used to check electrophoresis and transfer efficiency. Membranes were then exposed to 1:2000 of rabbit anti-murine COX-2 polyclonal antibody and 1:1000 of rabbit antichicken γ -tubulin polyclonal antibody for 1 h and processed as for iNOS. COX-2 activity in PMN was measured by quantifying the amount of PGE2 that is formed from arachidonic acid by using a kit from Cayman Chemical. Cells (107) cells were incubated in 500 µl buffer (pH 7.4.) containing 0.14 M NaCl, 1.59 mM NaH2PO4·2H2O, 8.8 mM Na2HPO4·2H2O, 2 mM EDTA, 100 mM dithiothreitol, 1 µg ml-1 leupeptin, 1 µg ml-1 aprotinin and 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride for 30 min at 4ºC. Samples were sonicated and boiled at 95ºC for 3 min. After centrifugation at 14,000 x g for 10 min, protein concentration was evaluated in homogenates. Homogenate samples (10 µl) were incubated in 1 ml of 0.1 M TrisHCl pH 8.0, 5 mM EDTA and 2 mM phenol, in the presence of heme group and arachidonic acid. A COX-inhibitor, indomethacin (10 mM), was added for sample control. After 2 min of incubation at 37ºC, the reaction was stopped with 50 µl HCl. Statistics Results are expressed as the mean ± s.e.mean for 3-11 separate experiments, performed in duplicate. Statistical significance was estimated by the Student’s t-test for unpaired observations.

67

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Results Dealcoholated wines and diets The gas chromatography analysis showed that after dealcoholization wines can be considered a non-alcoholic drink (alcohol degree < 3 g l-1). The dealcoholization process did not alter the content of total polyphenols, which was higher in DRW than in DWW (8.64 mM and 1.82 mM of gallic acid equivalents, respectively, P < 0.001) (Table 2). The free radical scavenging activity was smaller in DWW with regard to DRW (Table 2) and the most important differences were observed in the reducing power and in the IC50 of O2.- and NO scavenging activities. Although both wines were scavengers of NO, the DRW had 12 times higher activity than DWW (2.72 vs. 0.23 mM equivalents of Hb, P < 0.001). In spite of all these differences, the TAS values were similar in the two dealcoholated wines (Table 2). The content of ascorbic acid was in the order of 5-8 µM and can be considered with no relevant activity. The radical reducing activities were not altered by treatment of the samples with ascorbate oxidase. Inflammatory parameters in exudate Feeding rats with a wine-rich diet for 15 d had no effect on the body weight (Table 3). No significant differences were observed in the weight of granuloma between dietary groups (Table 3). Similar volumes of exudate and osmolarity and protein concentration in exudate were observed in the three groups of rats (Table 3) and the total protein content in the exudate was a reflect of their volume. However, the number of cells in the inflammatory exudate was reduced by 36% and 44% in rats fed DRW- and DWW-rich diets, respectively (P < 0.05) (Table 3) and the PGE2 concentration was increased by 24% (P < 0.05) and 12% in rats fed DRW- and DWW-rich diets, respectively. Oxidative stress in plasma and exudate The total phenol concentration was increased about 20% in plasma and exudate of DRW-fed rats (P < 0.05) and in a lesser extent in plasma and exudate of DWW-fed rats. The reducing power, TAS, O2.- and peroxyl radical scavenging activities were between 1.5- and 4-fold higher in plasma than in exudate (Table 4). However, the administration through the diet of DRW had only a significant effect on the O2.- scavenging activity (47% reduction, P < 0.01) in plasma, and on reducing power (45% reduction, P < 0.05), and O2.- (29% reduction, P < 0.05) and peroxyl radical (23% reduction, P < 0.001) scavenging activities in exudate. Feeding rats with DWW-rich diets had only effect on the peroxyl radical scavenging activity in plasma (23% 68

. VÝSLEDKY A DISKUSE

increase, P < 0.05). The plasma and exudate from rats fed the control diet or the DRW- or DWW-rich diets did not show NO scavenging activity at 1:100 dilution. At higher concentrations the conversion of the nitrites of samples to NO impaired any measurement of the scavenging activity. The dietary administration of dealcoholated wines reduced significantly the TBARS in plasma (P < 0.05 and P < 0.001 for DRW and DWW, respectively) and exudate (P < 0.05 and P < 0.01 for DRW and DWW, respectively) (Table 4), being values in exudate about 4-fold higher than in plasma (6.1 µM in plasma of control rats). The NO concentration, expressed as nitrites plus nitrates, were about 6- to 7- fold higher in exudate than in plasma, and significantly greater in dealcoholated wine-treated rats (Table 4). However, only DWW-fed rats showed a statistically significant increased in plasma (51%, P < 0.05). The nitrite plus nitrate values in exudate, indicative of NO production by the inflammatory cells present in the exudate, are supported by the ratio of free citrulline vs. free arginine in this compartment (Figure 1), that was increased by 37% and 61% (P < 0.05) in DRW- and DWW-treated rats, respectively, with regard to rats fed the control diet. Free radical production and iNOS and COX-2 expression by PMN leukocytes O2.- production by PMN leukocytes isolated from an inflammatory exudate was reduced about 45% in DRW and DWW treated rats (P < 0.001) (Figure 2a) and NO generation increased about 200% (P < 0.001) and 150% (P < 0.001) in DRW- and DWW-fed rats, respectively (Figure 2b). iNOS protein expression was increased by 40% (P < 0.01) and 25% (P < 0.05) in DRW-and DWW-fed rats, respectively (Figure 3 a and b). However, iNOS activity was more enhanced by dietary wines (67% and 79% for DRW and DWW respectively, P < 0.01) than its expression (Figure 3c). COX-2 expression was only significantly increased (36%, P < 0.01) by the DRW-rich diet (Figure 4a) and COX-2 activity was significantly increased at a similar extent (30%, P < 0.05) in this group of rats (Figure 4b). Discussion The present study shows that dietary administration of DRW and DWW to rats modulates some parameters of the inflammatory response in the carrageenan induced granuloma-pouch model and also the oxidative stress associated with the activation of inflammatory cells.

69

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Inflammatory mediators are involved in the increase in capillary permeability and leukocyte recruitment and thus, inflammation is associated with a dramatic rise in the number of PMN leukocytes and monocytes in the affected tissue. The trend to reduce the protein content of exudate in dealcoholated wine treated rats, associated with no changes in osmolarity, can be due to an impairment of capillary permeability and can explain the tendency to an homeostatic reduction of the exudate volume. Johnston et al. (1999) observed that transvascular albumin leakage induced by neutrophil-independent (histamine) and neutrophil-dependent (CINC/gro) inflammatory mediators were abolished by exogenous NO. On the other hand, the recruitment of leukocytes from the blood stream to the venular endothelial surface and to the tissue interstitium constitutes a fundamental mechanism for the inflammatory response and it is noteworthy that the absolute number of PMN in the exudate was decreased after the diets. The question is whether this is a primary effect of dealcoholated wines on PMN function or is secondary to the presence of local chemotactic or chemokinetic molecules. In this sense, the recruitment of leukocytes is influenced by a variety of factors, including O2.- and NO. O2.increases the sequestration of leukocytes (Shigematsu et al., 2003) whereas NO produced by eNOS or by leucokyte-derived iNOS prevents leukocyte recruitment both in vitro and in vivo (Hickey, 2001). Moreover, leukocyte recruitment occurs subsequent to NOS inhibition (Suematsu et al., 1994). Few studies have addressed the role of iNOS in regulating leukocyte extravasation in models of acute inflammation (Binion et al., 1998; Hickey, 2001). In the present paper we show an inverse relationship between NO generation and leukocyte recruitment in rats fed dealcoholated wines. It is likely that both the decrease on O2.- production and the increase in NO generation by PMN can be involved in the reduction of the number of cells present in the exudate, among other factors. The upregulation of COX-2 associated with an increase in PGE2 is a clue event in inflammation. Flavonoids can inhibit 5-lipoxygenase and COX activities in rat peritoneal leukocytes that are related to their antioxidant activity and iron-reducing ability (Laughton et al., 1991) and act as phospholipase A2 inhibitors (Lindahl & Tagesson, 1997). However, the increase in COX-2 expression and activity in PMN and the PGE2 level observed in the exudate of dealcoholated wines-treated rats are likely to be related to the increased generation of NO also observed by Salvemini et al. (1995). Wines contain a large number of polyphenols that may act as co-antioxidants. It has been shown in this paper that the dealcoholated wines tested are efficient free radical scavengers. This activity is not related to their ascorbic acid content as the level observed is irrelevant 70

. VÝSLEDKY A DISKUSE

compared to its plasma concentration and is related to the antioxidant/scavenging activity of plasma and exudate. This fact indicates that although data on the bioavailability and body distribution of polyphenols are scarce, the polyphenols from wine or their metabolites maintain an important activity in vivo. The concentration of nitrites in plasma and exudate is too high and overwhelms the capacity of flavonoids or their metabolites present in these samples. This should be the reason to explain the absence of NO scavenging activity. Moreover, catechin and teaflavins (Paquay et al., 2000) or quercetin and resveratrol (Chan et al., 2000) have been shown to be effective in vitro inhibitors of iNOS in LPS activated macrophages. Flavonoids may act at key points that regulate free radical production, through the involved enzymes. The increase in NO production by PMN from rats fed dealcoholated wines observed in the present study is supported by the citrulline/arginine ratio in the exudate and by the concentration of nitrites plus nitrates. These substances are essentially generated by the inflammatory cells. Moreover, NOS expression and activity in PMN from exudate were also increased. Activated inflammatory cells also contain NADPH-oxidase. NADPH-oxidase and iNOS mediate the massive production of O2.- and NO, respectively, which are ingredients for the formation of highly pro-oxidant radical species such as hydroxyl radical and peroxynitrite (Radi et al., 1991). In this sense, the increase in NO production has led to the hypothesis that iNOS has detrimental effects in inflamed tissues and promotes the inflammatory process (Ialenti et al., 1992). However, we have previously demonstrated that NO inhibits O2.production by PMN leukocytes from an inflammatory exudate (Ródenas et al., 1998) by inactivating the NADPH oxidase. Thus, the reduction in O2.- generation by PMN can be related to their increased NO generation. It is likely that O2.- scavenging activity of wines, supported by the reduction of the IC50 in the hypoxanthine/xanthine oxidase system by the exudate from dealcoholated wine-treated rats, may have also a role in vivo. The reduction in O2.- production and the increase in NO by PMN from dealcoholated wines fed rats can mean that the generation of the hydroxyl radical or the peroxynitrite will be reduced in the exudate. The ability of wines to protect against the toxicity of O2.- and peroxynitrite seems to be of great interest. The present study is the first to show that both DRW and DWW are able to offer protection in vivo against the oxidative stress in an inflammatory exudate. The reduction in oxidative stress is sustained by a small concentration of molecules derived from the activated inflammatory cells in situ such as TBARS and by a high concentration of nitrites plus nitrates in the exudate of dealcoholated wines-fed rats. However, the TAS in plasma and exudate is similar in the three dietary groups. It is accepted that no single measurement of antioxidant status is sufficient to adequately assess oxidative stress in biological systems and a battery of 71

. VÝSLEDKY A DISKUSE

measurements are recommended as we have evaluated in this paper, both in vitro and in vivo. The lack of equilibrium between plasma and exudate regarding oxidative parameters indicates that inflammatory cells are activated in situ. It is likely that polyphenols were also incorporated into inflammatory cells and were able to modulate the expression of enzymes related to oxidative stress and inflammation as it is observed in this paper. Over the past decade, we have come to appreciate a prominent role for inflammation (Libby et al., 2002) and oxidative stress (Li & Shah, 2004) in atherosclerosis and its complications. It is also well known that NO inhibits the adhesion of platelets to the endothelial surface (Radomski et al., 1987) and that NO can directly react with lipid alkoxyl and peroxyl radicals and thus, terminate the lipid radical chain reaction (Rubbo et al., 2000). These facts together with the present results indicate that the non alcoholic components of red wine and white wines through increasing NO production can control the vascular tone and tissue perfusion and by reducing the oxidative stress associated with inflammation can prevent the initiation and development of atherosclerosis. Acknowledgments This work was supported by the Spanish Ministry of Science and Technology Grant VIN00041 and Generalitat de Catalunya Grant 2001SGR00134. We thank the University of Barcelona for providing support to D. López. References BENITO, S., BUXADERAS, S. & MITJAVILA, M.T. (2004). Flavonoid metabolites and susceptibility of rat lipoproteins to oxidation. Am. J. Physiol., 287, H2819-H2834. BENITO, S., LOPEZ, D., SÁIZ, M.P., BUXADERAS, S., SÁNCHEZ, J., PUIGPARELLADA, P. & MITJAVILA, M.T. (2002). A flavonoid-rich diet increases nitric oxide production in rat aorta. Br. J. Pharmacol., 135, 910-916. BINION, D.G., FU, S., RAMANUJAM, K.S., CHAI, Y.C., DWEIK, R.A., DRAZBA, J.A., WADE, J.G., ZIATS, N.P., ERZURUM, S.C. & WILSON, K.T. (1998). iNOS expression in human intestinal microvascular endothelial cells inhibits leukocyte adhesion. Am. J. Physiol., 275, G592–603. CHAN, M.M., MATTIACCI, J.A., HWANG, H.S., SHAH, A. & FONG, D. (2000). Synergy between ethanol and grape polyphenols, quercetin, and resveratrol, in the inhibition of the inducible nitric oxide synthase pathway. Biochem. Pharmacol., 60, 1539-1548.

72

. VÝSLEDKY A DISKUSE

COOK, N.C. & SAMMAN, S. (1996). Flavonoids - Chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary source. J. Nutr. Biochem., 7, 66-76. FRANKEL, E.N., KANNER, J., GERMAN J.B., PARKS, E. & KINSELLA, J.E. (1993). Inhibition of oxidation of human low density lipoproteins by phenolic substances in red wine. Lancet, 341, 454-457. GLAZER, A.N. (1990). Phycoerythrin fluorescence-based assay for reactive oxygen species. Methods Enzymol., 186, 161-168. HAYEK, T., FUHRMAN, B., VAYA, J., ROSENBLAT, M., BELINKY, P., COLEMAN, R., ELIS, A. & AVIRAM, M. (1997). Reduced progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice following consumption of red wine, or its polyphenols quercetin or catechin, is associated with reduced susceptibility of LDL to oxidation and aggregation. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17, 2744-2752. HICKEY, M.J. (2001). Role of inducible nitric oxide synthase in the regulation of leucocyte recruitment. Clin. Sci., 100, 1-12. HUBMANN, B., MONNIER, D. & ROTH, M. (1969). Une méthode de dosage rapide et precise de l'acide ascorbique: application a la mesure des taux plasmatiques. Clin. Chim. Acta, 25, 161-166. IALENTI, A., IANARO, A., MONCADA, S. & DI ROSA, M. (1992). Modulation of acute inflammation by endogenous nitric oxide. Eur. J. Pharmacol., 211, 177-182. JOHNSTON, B., GABOURY, J.P., SUEMATSU, M. & KUBES, P. (1999).

Nitric oxide

inhibits microvascular protein leakage induced by leukocyte adhesion-independent and adhesion-dependent inflammatory mediators. Microcirculation, 6, 153-162. KUO, S.M., LEAVITT, P.S. & LIN, C.P. (1998). Dietary flavonoids interact with trace metals and affect metallothionein level in human intestinal cells. Biol. Trace Elem. Res., 62, 135153. LAUGHTON, M.J., EVANS, P.J., MORONEY, M.A., HOULT, J.R.S. & HALLIWELL, B. (1991). Inhibition of mammalian 5-lipoxygenase and cyclo-oxygenase by flavonoids and phenolic dietary additives. Relationship to antioxidant activity and to iron ion-reducing ability. Biochem. Pharmacol., 42, 1673-1681. LI, J.M. & SHAH, A.M. (2004). Endothelial cell superoxide generation: regulation and relevance for cardiovascular pathophysiology. Am. J. Physiol., 287, R1014-R1030. LIBBY, P., RIDKER, P.M. & MASERI, A. (2002). Inflammation and atherosclerosis. Circulation, 105, 1135-1143.

73

. VÝSLEDKY A DISKUSE

LINDAHL, M. & TAGESSON, C. (1997). Flavonoids as phospholipase A2 inhibitors: importance of their structure for selective inhibition of group II phospholipase A2. Inflammation, 21, 347–356. LOTITO, S.B. & FRAGA, C.G. (1998). (+)-Catechin prevents human plasma oxidation. Free Radic. Biol. Med., 24, 435-441. MARLETTA, M.A., YOON, P.S., IYENGAR, R., LEAF, C.D. & WISHNOK, J.S. (1988). Macrophage oxidation of L-arginine to nitrite and nitrate: nitric oxide is an intermediate. Biochemistry, 27, 8706-8711. MONCADA, S., PALMER, R.M. & HIGGS, E.A. (1991). Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev., 43, 109–142. MORIKAWA, K., NONAKA, M., NARAHARA, M., TORII, I., KAWAGUCHI, K., YOSHIKAWA, T., KUMAZAWA, Y. & MORIKAWA, S. (2003). Inhibitory effect of quercetin on carrageenan-induced inflammation in rats. Life Sci., 74, 709-721. MUNTANÉ, J., FRITSCH, P., CARBONELL, T., SÁIZ, M.P., PUIG-PARELLADA, P. & MITJAVILA, M.T. (1991). Modulation of exudate inflammation parameters in rat carrageenan-induced granuloma by modification of exudate iron levels. Agents Actions, 32, 167-172. OYAIZU, M. (1986). Studies on products of browning reaction prepared from glucosamine. Jpn. J. Nutr., 44, 307-315. PAQUAY, J.B., HAENEN, G.R., STENDER, G., WISEMAN, S.A., TIJBURG, L.B. & BAST, A. (2000). Protection against nitric oxide toxicity by tea. J. Agric. Food Chem., 48, 57685772. RADI, R., BECKMAN, J.S., BUSH, K.M. & FREEMAN, B.A. (1991). Peroxynitrite-induced membrane lipid peroxidation: the cytotoxic potential of superoxide and nitric oxide. Arch. Biochem. Biophys., 228, 481-487. RADOMSKI, M.W., PALMER, R.M.J. & MONCADA, S. (1987). Endogenous nitric oxide inhibits platelet adhesion to vascular endothelium. Lancet 331, 1057-1058. RICE-EVANS, C.A., MILLER, N.J. & PAGANGA, G. (1996). Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids. Free Radic. Biol. Med., 20, 933-956. ROBAK, J. & GRYGLEWSKI, R.J. (1988). Flavonoids are scavengers of superoxide anions. Biochem. Pharmacol., 37, 837-841. RÓDENAS, J., MITJAVILA, M.T., & CARBONELL, T. (1995). Simultaneous generation of nitric oxide and superoxide by inflammatory cells in rats. Free Radic. Biol. Med., 18, 869875. 74

. VÝSLEDKY A DISKUSE

RÓDENAS, J., MITJAVILA, M.T., & CARBONELL, T. (1998). Nitric oxide inhibits superoxide production by inflammatory polymorphonuclear leukocytes. Am. J Physiol., 274, C827-C830. RUBBO, H., RADI, R., ANSELMI, D., KIRK, M., BARNES, S., BUTLER, J., EISERICH, J.P. & FREEMAN, B.A. (2000). Nitric oxide reaction with lipid peroxyl radicals spares αtocopherol during lipid peroxidation. J. Biol. Chem., 275, 10812-10818. SALVEMINI, D., SETTLE, S.L., MASFERRER, J.L., SEIBERT, K., CURRIE, M.G. & NEEDLEMAN, P. (1995). Regulation of prostaglandin production by nitric oxide; an in vivo analysis. Br. J. Pharmacol., 114, 1171-1178. SCALBERT, A. & WILLIAMSON, G. (2000). Dietary intake and bioavailability of polyphenols. J. Nutr., 130, 2073S–2085S. SHIGEMATSU, S., ISHIDA, S., HARA, M., TAKAHASHI, N., YOSHIMATSU, H., SAKATA, T. & KORTHUIS, R.J. (2003). Resveratrol, a red wine constituent polyphenol, prevents superoxide-dependent inflammatory responses induced by ischemia/reperfusion, platelet-activating factor, or oxidants. Free Radic. Biol. Med., 34, 810-817. SINGLETON, V.L. & ROSSI, J.A. (1965). Colorimetric of total phenols with phosphomolybdic phosphotungstic acid reagents. Am. J. Enol. Viticult., 16, 144-158. SUEMATSU, M., TAMATANI, T., DELANO, F.A., MIYASAKA, M., FORREST, M., SUZUKI, H., SCHMID-SCHONBEIN, G.W. (1994). Microvascular oxidative stress preceding leukocyte activation elicited by in vivo nitric oxide suppresion. Am. J. Physiol., 266, H2410-H2415. UKEDA, H., MAEDA, S., ISHII, T. & SAWAMURA, M. (1997). Spectrophotometric assay for superoxide dismutase based on tetrazolium salt 3’-{1-[(phenylamino)-carbonyl]-3,4tetrazolium}-bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulfonic acid hydrate reduction by xanthinexanthine oxidase. Anal. Biochem., 251, 206-209. VRIESMAN, M.F., HAENEN, G.R., WESTERVELD, G.J., PAQUAY, J.B., VOSS, H.P. & BAST, A. (1997). A method for measurement nitric oxide radical scavenging activity. Scavenging properties of sulfur-containing compounds. Pharm. World Sci., 19, 283-286. DE WHALLEY, C.V., RANKIN, S.M., HOULT, J.R., JESSUP, W. & LEAKE, D.S. (1990). Flavonoids inhibit the oxidative modification of low density lipoproteins by macrophages. Biochem. Pharmacol., 39, 1743-1750. YAGI, K. (1984). Assay for blood plasma or serum. Methods Enzymol., 105, 328-331.

75

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Table 1. Composition of semipurified diets Components (g kg-1 diet) Caseina Potato Starch Saccharose Cellulose DL-methionine Mineral mixb Vitamin mixc Corn oil Wined

Control

DRW

DWW

225 446 223 31 1 14 10 50 0

225 446 223 31 1 14 10 50 350

225 446 223 31 1 14 10 40 350

a

Vitamin-free delipidated. bAIN-93 M-MX (ICN, Costa Mesa, CA). cAIN-93-VX (ICN). d350

ml of DRW or DWW replaced the 350 ml of water added to compact the diet

76

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Table 2. Total phenols and antioxidant activities of dealcoholated wines Total phenol (mM, gallic acid equivalents) Reducing power (mM, quercetin equivalents) TAS (mM) Hipoxanthine/xanthine oxidase (IC50, µl ml-1) AAPH (mM, trolox equivalents) NO scavenging (mM, haemoglobin equivalents)

DRW 8.64 ± 0.06 133.9 ± 1.1 1.5 ± 0.1 17 ± 2 3.1 ± 0.1 2.72 ± 0.06

DWW 1.82 ± 0.05*** 47.6 ± 0.9*** 1.3 ± 0.1 32 ± 2*** 2.2 ± 0.1*** 0.23 ± 0.02***

Values are the mean±s.e.mean of three to six different samples per wine. ***P < 0.001 significantly different compared with DRW, by the Student's unpaired t-test.

77

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Table 3 Body weight, parameters of the exudate and weight of granuloma after 24 h of carrageenan granuloma induction Body weight (g) Weight of granuloma (g) Volume of exudate (ml) Osmolarity of exudate (mOsmol l-1) Protein concentration in exudate (g l-1) Total protein content in exudate (mg) Number of cells in exudate (x 106) PGE2 in exudate (pg ml-1)

Control 213 ± 9 6.0 ± 0.6 5.3 ± 0.7 303 ± 1 1.5 ± 0.1 9.3 ± 1.9 101 ± 16 66 ± 4

DRW 219 ± 11 6.0 ± 1.0 4.5 ± 0.6 300 ± 2 1.4 ± 0.1 5.8 ± 0.7 65 ± 10* 82 ± 4*

DWW 224 ± 10 6.7 ± 0.9 4.0 ± 0.4 302 ± 2 1.5 ± 0.1 5.1 ± 1.0 57 ± 9* 74 ± 5

Values are the mean±s.e.mean of four to eleven rats per group. *P < 0.05 significantly different compared with control, by the Student's unpaired t-test.

78

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Table 4 Oxidative stress in plasma and exudate after 24 h of carrageenan granuloma induction Control Total phenol

Plasma DRW

94.7 ± 5.9 112.3 ± 2.4*

DWW

Control

111.1 ±

7.41 ±

Exudate DRW

DWW

9.05 ± 0.58*

8.00 ±

2.9*

0.35

139 ± 15

154 ± 21

53 ± 6

77 ± 7*

74 ± 9

0.86 ± 0.03 25 ± 2**

0.77 ± 0.04 40 ± 3

0.18 ±0.01 91 ± 6

0.21 ± 0.02 65 ± 3**

0.18 ±0.01 80 ± 4

2.2 ± 0.1

2.7 ± 0.2*

2.7 ± 0.2*

1.5 ± 0.1

equivalents) TBARS

6.1 ± 0.3

5.2 ± 0.2* 4.8 ± 0.2***

24.8 ± 1.3

20.1 ± 1.7*

18.1 ±1.6**

(µM) Nitrites +

41 ± 6

304 ± 7

364 ± 22*

358 ± 21*

(mM, gallic

0.59

acid equivalents) Reducing

112 ± 12

power (µM quercetin equivalents) TAS (mM) 0.77 ±0.06 47 ± 3 Hypoxanthin e/xanthine oxidase (IC50, µl ml-1) AAPH (mM

2.6 ± 0.1***

1.7 ± 0.1

trolox

52 ± 8

62 ± 6*

nitrates (µM) Values are the mean±s.e.mean of three to eleven rats per group. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 significantly different compared with control, by the Student's unpaired t-test.

79

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Figure 1. Citrulline/arginine ratio

Citrulline/arginine ratio

2

* 1

Control Dealcoholated red wine Dealcoholated white wine

0 Figure 1. Ratio between free citrulline and free arginine concentrations in the exudate recovered from the inflammatory pouch of rats fed a control diet or diets supplemented with DRW and DWW for 15 d. Values are the mean±s.e.mean of four rats. *P < 0.05 significantly different compared with control, by the Student's unpaired t-test.

80

. VÝSLEDKY A DISKUSE

[O 2 .-] (nmol (10 6 cells h)-1)

Figure 2. Superoxide and nitric oxide production

a 5 4 3 2

***

***

1

Control

0

b 5

***

***

[NO] (nmol (10 6 cells h)-1)

Dealcoholated red wine Dealcoholated white wine

4 3 2 1 0

Figure 2. O2.- (a) and NO (b) production by PMNL from the inflammatory pouch of rats fed a control diet or diets supplemented with DRW and DWW for 15 d. Values are the mean±s.e.mean of six rats. ***P < 0.001 significantly different compared with control, by the Student's unpaired t-test.

81

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Figure 3. NOS expression and activity

a

a b c d iNOS

[iNOS expression] (relative units)

γ-tub b 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0

**

*

Control Dealcoholated red wine

[iNOS activity] (nmol citrulline (g protein h)-1)

c 50 40

**

Dealcoholated white wine

**

30 20 10 0

Figure 3. iNOS expression. Representative Western blot (a; b) and activity (c) in PMNL from the inflammatory pouch of rats fed a control diet or diets supplemented with DRW and DWW for 15 d. Values are the mean±s.e.mean of four rats. *P < 0.05, **P < 0.01 significantly different compared with control, by the Student's unpaired t-test.

82

. VÝSLEDKY A DISKUSE

Figure 4. COX-2 expression and activity a

a

b c

COX-2 γ-TUB

[COX-2 expression ] (relative units)

b

1.6 1.4 1.2

**

1.0 0.8 0.6 0.4 Control

0.2 0

[COX-2 activity] (pg PGE2 (mg protein min)-1)

c

Dealcoholated red wine Dealcoholated white wine

10 8

*

6 4 2 0

Figure 4. COX-2 expression. Representative Western blot (a; b) and activity (c) in PMN from the inflammatory pouch of rats fed a control diet or diets supplemented with DRW and DWW for 15 d. Values are the mean±s.e.mean of four rats. *P < 0.05, **P < 0.01 significantly different compared with control, by the Student's unpaired t-test.

83

. VÝSLEDKY A DISKUSE

4. 3.

The infleunce of carvedilol on the production of reactive oxygen and nitrogen species by phagocytes

Lucie GALLOVÁ1, Martina PAVELKOVÁ1, Tatiana MAČIČKOVÁ2, Radomír NOSÁL2, Milan ČÍŽ1 & Antonín LOJEK1 1

Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Czech Rep. 2 Institute of Experimental Pharmacology, SAS, Bratislava, Slovakia

Biologia, Bratislava, Vol. 60/Suppl. 17: 125 – 128, 2005

viz. přiložený soubor „Gallova – carvedilol“

84

5. ZÁVĚ R První část disertační práce byla věnována sledování regulačních účinků vybraných rekombinantních cytokinů na aktivitu krevních fagocytů in vitro. Zájem využívat rekombinantní cytokiny v imunoterapii roste s přibývajícími informacemi o schopnostech cytokinů regulovat některé funkce fagocytů. A proto jsme se v první části disertační práce podrobněji zaměřili na objasnění mechanismu protizánětlivého účinku IL-10 na produkci RKM a expresi adhezivních molekul a možné využití IL-10 v imunomodulační terapii. Dále nás zajímala úloha prozánětlivých cytokinů: IL-6, IL-8, TNFα a jejich kombinované působení s IL-10 v plné krvi. K detekci změn metabolické aktivity fagocytů byla použita luminolem zesílená chemiluminiscence, která se jeví být vhodnou metodou pro stanovování produkce reaktivních metabolitů a je využívána i v humánní klinické praxi. Navíc měření oxidativního vzplanutí v plné krvi obchází izolační procedury, které mohou způsobovat aktivaci leukocytů a zkreslovat výsledky měření. V našich experimentálních podmínkách nebyl prokázán žádný inhibiční účinek IL-10 na produkci RKM ani na expresi adhezivních molekul u nestimulovaných nebo aktivovaných fagocytů. Navíc IL-10 neprokázal dostatečnou kapacitu modifikovat změny metabolické aktivity fagocytů a expresi povrchových antigenů, které byly indukované prozánětlivými cytokiny. Tyto výsledky svědčí o tom, že v časovém intervalu do 3hodin se protizánětlivé účinky IL-10 buď nestačí zcela plně rozvinout a nebo se uplatňují jinými regulačními mechanismy než je modulace tvorby RKM či exprese adhezivních molekul fagocytů v periferní krvi. Tyto možnosti je nutné brát v úvahu při využívání protizánětlivých účinků IL10 v léčbě. Naopak pokusy s prozánětlivými cytokiny prokázaly, že aktivita krevních fagocytů je pod přímou kontrolou účinků IL-6, IL-8 a TNF α. Každý z testovaných prozánětlivých cytokinů indukoval zvýšení produkce RKM aktivovanými fagocyty. Silné prozánětlivé vlastnosti prokázal TNFα dokonce v případě spontánní CL odpovědi neutrofilů. Také exprese adhezivních molekul zodpovědná za adhezi, migraci a hromadění fagocytů v zánětlivém ložisku byla významně modifikována prozánětlivými cytokiny. Závěrem lze tedy shrnout, že využití účinků sledovaných cytokinů k modulaci tvorby RKM a exprese povrchových receptorů, které sehrávají důležitou úlohu v procesu oxidativního poškozování, je jednou z možných cest regulace výsledku zánětlivé reakce v mnoha patofyziologických procesech. Druhá část práce byla věnována studiu modulace zánětlivého procesu spojeného s oxidativním stresem. Hlavní cílem bylo sledovat antioxidační a protizánětlivé účinky umírněné konzumace vína související s vyšším obsahem polyfenolických složek v červeném a bílém víně. Naše studie předkládá důkazy o tom, že dealkoholizované víno, podávané jako součást diety, má schopnost modulovat některé parametry zánětlivé odpovědi a také oxidativní stres spojený 89

5. ZÁVĚ R

s aktivací zánětlivých buněk. U skupin potkanů (DRW, DWW), kterým byla podávána dieta obohacená o dealkoholizované víno, došlo ve srovnání s kontrolní skupinou k výraznému snížení lipidové peroxidace a zvýšení schopnosti plazmy a exudátu vychytávat volné radikály. Další parametr, který byl konzumací dealkoholizovaného vína pozitivně ovlivněn byl počet PMNL v zánětlivém exudátu. Infiltrace PMNL doprovázená dramatickým nárůstem počtu buněk v zánětlivém ložisku je základním mechanismem zánětlivé odpovědi a je pozoruhodné, že absolutní počet buněk v zánětlivém exudátu byl významně snížen u skupin potkanů, kterým byla podávána dieta obohacená o DRW a DWW. Je pravděpodobné, že pokles hladiny superoxidu a nárůst tvorby oxidu dusnatého, sledovaný v našich pokusech, hraje důležitou úlohu

v redukci

počtu

zánětlivých

buněk

přítomných

v exudátu.

Klíčovým

místem antioxidačního a protizánětlivého působení flavonoidů by mohla být regulace aktivity iNOS a NADPH oxidázy, které jsou zdroji masivní produkce superoxidu, oxidu dusnatého a dalších vysoce reaktivních produktů např. hydroxylový radikál nebo peroxynitrit. V tomto smyslu by zvýšená hladina oxidu dusnatého měla spíše negativní vliv a propagovala by zánětlivý proces. Nicméně, Rodenas et al. 1998 uvádí, že oxid dusnatý má schopnost inaktivovat NADPH oxidázu.78 Z toho plyne, že pokles tvorby superoxidu by mohl být způsoben zvýšením hladiny oxidu dusnatého. Schopnost vína chránit proti toxicitě superoxidu a peroxynitritu se zdá být zajímavým účinkem vhodným k dalšímu výzkumu. Zvýšená produkce oxidu dusnatého u dietetických skupin potkanů (DRW, DWW) byla potvrzena výsledky získanými z měření poměru citrulin/arginin, koncentrace dusitanů+dusičnanů a také exprese a aktivity iNOS. V této části práce bylo tedy prokázáno, že nealkoholové složky červeného a bílého vína jsou in vivo schopny nabídnout ochranu před oxidativním stresem a zabraňovat iniciaci a propagaci zánětu. Polyfenolické složky vína nejenom, že zlepšují antioxidační status v zánětlivém procesu, ale také omezují infiltraci buněk do zánětlivého místa pravděpodobně cestou zvýšené produkce oxidu dusnatého. Tyto mechanismy by mohly být jedním z hlavních vysvětlení k pochopení prospěšných účinků polyfenolických látek v zánětu. Ve třetí části práce jsme se věnovali studiu mechanismu antioxidační aktivity carvedilolu a sledování vlivu na produkci reaktivních kyslíkových a dusíkových metabolitů v různých buněčných systémech. Naše studie potvrdila antioxidační vliv carvedilolu na metabolickou aktivitou PMNL. V našich experimentálních podmínkách carvedilol snižoval v koncentrační závislosti produkci RKM detekovanou jako chemiluminiscenční aktivitu krevních fagocytů. Nejvyšší koncentrace carvedilolu (100µM) způsobila úplné vymizení CL signálu nestimulovaných fagocytů stejně jako aktivovaných fagocytů (OZP, Ca-I, fMLP, PMA). 90

5. ZÁVĚ R

V řadě studií je mechanismus antioxidačního působení carvedilolu často připisován přímé schopnosti vychytávat volné radikály. Nicméně výsledky z naší studie svědčí o tom, že vedle přímého vychytávání již vytvořených RKM se na antioxidační aktivitě carvedilolu podílí též jeho schopnost modulovat metabolickou cestu aktivace NADPH oxidázy. K tomuto tvrzení přispívá fakt, že carvedilol vzhledem k jeho kationové amfifilní povaze je schopný měnit fluiditu buněčné membrány, vázat se na hydrofóbní část NADPH oxidázy a tím modulovat její aktivitu. Také odlišný efekt carvedilolu (10µM a nižší) na oxidativní vzplanutí PMNL aktivovaných různými typy stimulů ukazuje na to, že carvedilol zasahuje do produkce RKM ovlivněním aktivace NADPH oxidázy. Dále jsme se zabývali otázkou modulace tvorby RDM, která též přispívá k celkové chemiluminiscenční aktivitě fagocytů. Inhibice tvorby oxidu dusnatého byla pozorována pouze v případě nejvyšší koncentrace carvedilolu (100µM). Tento pokles produkce oxidu dusnatého korespondoval s výsledky získanými Western-blot analýzou, kde 100µM carvedilol způsobil totální inhibici exprese iNOS. Závěrem lze tedy shrnout, že carvedilol, vedle schopnosti přímého vychytávání již vytvořených radikálů, disponuje též mechanismy, které zabraňují tvorbě reaktivních metabolitů cestou inhibice metabolické aktivity enzymů klíčových v procesech oxidativního vzplanutí a zánětu tj. NADPH oxidázy a iNOS.

91

6. SEZNAM POUŽ ITÉ LITERATURY

92

6. SEZNAM POUŽ ITÉ LITERATURY

Mgr. Lucie Gallová datum a místo narození: 30.12. 1976, Hradec Králové stav: svobodná

Vzdě lání: 1996.2001

magisterské studium oboru Obecná biologie - fyziologie živočichů Masarykova univerzita v Brně , Přírodovědecká fakulta Katedra srovnávací fyziologie živočichů a obecné zoologie téma diplomové práce: Reaktivní metabolity kyslíku a dusíku produkované fagocyty

od r. 2001

počátek doktorandského studia oboru Imunologie Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta Katedra srovnávací fyziologie živočichů a obecné zoologie téma disertační práce: Modulace funkční aktivity fagocytů látkami s prozánětlivými, protizánětlivými a antioxidačními účinky

Zamě stnání: podzim 2005

Vědecký pracovník na Biofyzikálním ústavu AV ČR v Brně, Laboratoř patofyziologie volných radikálů

Stáž e:

v roce 2002 4-měsíční stáž v rámci programu Socrates-Erasmus Department de Fisiologia Animal, Facultat de Biologia, Universitat de Barcelona. Téma: “Wine and oxidative stress in inflammation”

Oblast zájmu:

reaktivní metabolity kyslíku a dusíku a jejich role v zánětlivých procesech, oxidativní stres, modulace fyziologických a patofyziologických funkcí profesionálních fagocytů různými pro-, protizánětlivými a antioxidačními substancemi, práce s tkáňovými kulturami, chemiluminiscence, Westernblotting, elektrochemická detekce tvorby oxidu dusnatého.

Č lenství:

Česká společnost pro analytickou cytologii (od r. 2003)

Pedagogická č innost: podíl na výuce Cvičení z imunologie a Speciální cvičení z imunologie Jazykové znalosti: angličtina, němčina, ruština

93

7. Ž IVOTOPIS Publikace v odborných č asopisech: Gallová L., Pavelková M., Mačičková T., Nosál R., Číž M., Lojek A. The infleunce of carvedilol on the production of reactive oxygen and nitrogen species by phagocytes. Biologia, Vol. 60/Suppl. 17: 125 – 128, 2005 Pavelková M., Gallová L., Kubala L., Lojek A., Číž M. The influence of wine polyphenols on reactive oxygen and nitrogen species production by rat macrophages RAW 264.7 Journal of Agricultural and Food Chemistry (v recenzním řízení) Gallová L., Kubala L., Číž M., Lojek A. IL-10 does not affect oxidative burst and expression of selected surface antigen on human blood phagocytes in vitro. Physiological Research, Vol. 53, 199-208, 2004 López D., Pavelková M., Gallová L., Lojek A., Loaiza R., Mitjavila MT. Dealcoholated red and white wines reduce on the oxidative stress associated to inflammation in rats British Journal of Pharmacology (v recenzním řízení) Konference: Pečivová J., Mačičková T., Lojek A., Gallová L., Číž M., Nosáľ R. The effects of carvedilol on respiratory burst of phagocytes in vitro. 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference The Protein World (Budapest, July 2 – 7, 2005) - Abstracts. FEBS J. 272 (Suppl. 1), 291-292. Gallová L., Pavelková M., Mačičková T., Nosál R., Číž M., Lojek A. The infleunce of carvedilol on the production of reactive oxygen and nitrogen species by phagocytes; 9. Mezioborová slovensko-česká toxikologická konferenci, Píla-Častá, 2004 Pavelková M., Gallová L., Číž M., Lojek A. The influence of wine polyphenols on reactive oxygen and nitrogen species production by phagocytes; 9. Mezioborová slovensko-česká toxikologická konferenci, Píla-Častá, 2004 Gallová L., Číž M., Lojek A. Electrochemical detection of nitric oxide production 1st European Workshop on the Analysis of Phagocyte Functions, Brno, 2003 Pavelková M., Gallová L., López D., Mitjavila MT. Wine and oxidative stress in inflammation 1st European Workshop on the Analysis of Phagocyte Functions, Brno, 2003

94

8. SEZNAM PUBLIKACÍ A KONFERENCÍ Lojek A., Gallová L., Pavelková M., Hladíková R., Hrbáč J., Číž M. Electrochemical detection of nitric oxide production in cell populations. Analytical cytometry II (Brno, May 11-14, 2003). Book of abstracts (Kozubík A. – ed.), 52 (in Czech). Gallová L., Kubala L., Číž M., Lojek A. IL-10 does not affect activation of human blood phagocytes in vitro Abstracts of the 3rd international workshop on oxidative stress in ischemia-reperfusion injury. Barcelona, May 10 – 11, 2002, 31 López D., Jimenez J., Casos K., Sáiz MP.,Gallová L.,Pavelková M.,Puig-Paralada,Mitjavila MT. Fish Oil Diet and NO Production by Blood Vessels in Intestinal Ischemia-Reperfusion 3rd International Workshop on Oxidative stress in ischemia-Reperfusion Injury, Barcelona, Spain, 2002 Gallová L., Pavelková M., López D., Mitjavila MT. Reducción del estrés oxidativo por la de vino en leucocitos polimorfonucleares activados de rata; VII Reunión del Grupo espanol de radicales libres z III Reunión Iberoamericana; Cáceres, Spain, 2002 Lojek A., Gallová L., Kubala L., Číž M., Čížová H., Kozubík A., Lilius EM. The use of luminometry for the measurement of neutrophil-derived reactive oxygen and nitrogen species in blood 2nd International Workshop on Oxidative Stress in Ischemia/Reperfusion Injury (Sümeg, September 29 – October 1, 2000). Program and Abstracts, 14. Gallová L., Číž M., Lojek A. Vliv NG-nitro-L-arginin methyl esteru (L-NAME) na chemiluminiscenční aktivitu neutrofilů; XVII. Biochemický sjezd, Praha, 2000. Chem. Listy 94 (8), 675 (in Czech)

95

8. SEZNAM PUBLIKACÍ A KONFERENCÍ

The influence of wine polyphenols on reactive oxygen and nitrogen species production by rat macrophages RAW 264.7 Milan CIZ, Martina PAVELKOVA, Lucie GALLOVA, Lukas KUBALA, Antonin LOJEK* Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic (v recenzním ř ízení Journal of Agricultural and Food Chemistry) Corresponding author: Antonin Lojek, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic, phone: +420-541517104, fax: +420541211293, e-mail: [email protected]

ABSTRACT The murine macrophage cell line RAW 264.7 was used for studying the influence of catechin, epicatechin, quercetin and resveratrol in concentrations of 10-5 - 10-4 mol/L on: (a) total free radical production by activated macrophages with 24h preincubation with lipopolysaccharide (LPS) (luminometrically), (b) LPS-induced reactive nitrogen species release (Griess reaction, spectrophotometry), (c) LPS-dependent expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) (Western blotting). All four polyphenols exerted high and dose-dependent antioxidative capacity against the peroxyl radical. All polyphenols decreased the production of reactive oxygen metabolites by RAW 264.7 cells. The long term effects of polyphenols were studied on LPS-induced RAW 264.7 incubated for 24h with polyphenols. Only quercetin incorporated into macrophages quenches their production of reactive metabolites. Quercetin and resveratrol decreased the release of nitric oxide in a dose-dependent manner. In the case of quercetin, the decrease in nitric oxide production corresponded to a decrease in iNOS expression. KEY WORDS Polyphenols; Macrophages; Oxidative stress; Nitric oxide

96

9. PŘ ÍLOHA INTRODUCTION The overproduction of reactive oxygen and nitrogen species (ROS and RNS, respectively) by phagocytes causes oxidative damage to membrane lipids, DNA, proteins and lipoproteins. These reactions have functional consequences, which may be deleterious to the cells and tissues. Thus, the inhibition of ROS and RNS production is a popular target for the attenuation of many inflammatory diseases . Dietary polyphenols with antioxidative effects from fruit and vegetables play an important role in a prevention of the oxidative stress . Another important source of polyphenolic antioxidants is wine, particularly red wine. It has been demonstrated that polyphenols from wine has not only antioxidative but also anti-inflammatory effects . It is furthermore suggested that they prevent free radical mediated lipid peroxidation of low density lipoproteins (LDL), which is associated with cell aging and chronic disesases such as atherosclerosis . It is postulated that the antioxidant and free radical scavenging properties of phenolic compounds, present in red wine, may partly explain the ”French paradox”, i.e. the fact that French people have low incidence of coronary heart disease, despite having a diet high in fat and being heavy smokers . The main polyphenolic compounds in red wine are of two major classes: flavonoids and non-flavonoids, particularly stilbenes. Of the flavonoids, (+)-catechin, (-)-epicatechin and quercetin and of the stilbenes, trans-resveratrol, are the most studied polyphenols. The aim of this study was to study the antioxidant properties of four wine polyphenols (catechin - CAT, epicatechin - EPI, quercetin - QUE, resveratrol - RES), their immediate and long term effects on the production of reactive oxygen and nitrogen species by RAW 264.7 macrophages, and their influence on the expression of inducible nitric oxide synthase. MATERIALS AND METHODS Materials Murine RAW 264.7 macrophage cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, USA). Cells were maintained in a Dulbecco`s Eagle medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) supplemented with a 10% fetal bovine serum, gentamycin (0.045 mg/L), glucosa (3.5 g/L) and NaHCO3 (1.5 g/L). The stock solution of lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli serotype 0111:B4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) was made up at 1 g/L in Hanks' balanced salt solution without phenol red (HBSS, pH 7.4). The final concentration of LPS in a reaction mixture was 10 -4 g/L. Polyphenols (CAT, EPI, QUE and RES) were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Stock solutions (2x10-2 mol/L) were always prepared fresh, in 99.8% ethanol. 97

9. PŘ ÍLOHA Then, concentrations of 2x10-4, 5x10-4, 1x10-3, 2x10-3 mol/L were prepared in RPMI 1640 and added to the reaction mixture to obtain final concentrations of 10-5, 2.5x10-5, 5x10-5 and 10-4 mol/L, respectively. ABAP [2,2-azo-bis(2-amidinopropane) hydrochloride] was purchased from Polyscience (Warrington, Pennsylvania, USA) and Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8,-tetramethyl-chroman-2carboxylic acid) from Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). The stock solution of 10-2 mol/L luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione) (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) was prepared in 0.2 mol/L sodium borate buffer, pH 9.0 (1.24 g of H 3BO3 and 7.63 g of Na2B4O7 ⋅ 10H2O in 1 litre of redistilled water). All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate) was dissolved in dimethyl sulphoxide to obtain 3x10-3 mol/L stock solution with. Total radical-trapping antioxidant parameter (TRAP) The luminol-enhanced chemiluminescence (CL) assay for TRAP was measured using a Luminometer 1251 (BioOrbit, Turku, Finland). The method is based on the measurement of peroxyl radicals produced at a constant rate by a thermal decomposition of ABAP. The TRAP value is determined from the time period during which the CL signal is diminished by antioxidants . Trolox, a water-soluble analogue of α-tocopherol, was used as a reference inhibitor for the calculation of the TRAP value. The reaction mixture contained 475µl of sodium phosphate buffered saline (PBS 10-1 mol/L, pH 7.4), 50 µl of 10-2 mol/L luminol in 10-1 mol/L borate buffer (pH 10.0), and 20 µl of examined compound. The cuvettes were incubated at 37°C in the temperature-controlled carousel of the luminometer for ten minutes. Then, 50 µl of 4x10-1 mol/L ABAP (prepared in 10-1 mol/L PBS) was added. TRAP value for the sample was obtained from the equation: TRAP = n [Trolox]τsample /ƒ τTrolox Where n is the stoichiometric factor of Trolox (2.0), τ is the time period of diminished chemiluminescence, and ƒ is the dilution factor of the sample.

98

9. PŘ ÍLOHA Experimental design 1) Immediate effect of polyphenols When the immediate effect of polyphenols was studied, 2 x 10 5 of RAW 264.7 cells in 100µl of DMEM were allowed to adhere for 1h to the edge of each of the 96-well plate and then all chemicals were added immediately before CL was measured. 2) Long-term effect of polyphenols (Fig. 1) When the long-term effect was studied, 96-well cultivation plates (2 x 105 cells per well) and 6well cultivation plates (2x106 cells per well) were used for CL measurement and Western-blot analysis (and Griess reaction), respectively. Adhered cells (1h) were pre-incubated with one of the polyphenols at an indicated concentration for 1h prior to the 24h of incubation with LPS (10-4 g/L). Adherence as well as incubation steps proceeded at 37°C with 5%CO2. After 24h the 96-wells were gently washed with HBSS and CL was measured (as described below). The supernatants of the 6-well plates were removed and used for the determination of nitrites by Griess reaction as described below. Cells were used for a Western-blot analysis as described below. Chemiluminescence assay The luminol-enhanced CL of RAW 264.7 macrophages was measured using microtitre plate Luminometer LM-01T (Immunotech, Prague, Czech Republic) as described previously . The principle of the method is based on a luminol interaction with the phagocyte-derived ROS, which results in large measurable amounts of light. Each well (in 96-well culture plates) contained 2*105 RAW 264.7 cells, luminol (at a final concentration of 10 -3 mol/L) and PMA (at a final concentration of 8x10-7 mol/L), which was selected on the basis of previous results and one of the polyphenols at a final concentrations of 0, 10-5, 2.5x10-5, 5x10-5 and 10-4 mol/L. The total reaction volume of 250 µl was adjusted with HBSS. The assays were run in duplicates. Light emission expressed as relative light units (RLU) was recorded continuously at 37°C for 60 minutes. Intensity of CL reaction is expressed as the integral of the obtained kinetic curves which correspond to the total amount of light produced during the time of measurements. Determination of nitric oxide The production of nitric oxide (NO) was estimated indirectly as the accumulation of nitrites (NO2-), the metabolic end product of NO metabolism, in the medium using the Griess reagent as described previously . Sodium nitrite was used as a standard. 150 µl of culture supernatant was added to 150 µl of Griess reagent (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), then incubated 99

9. PŘ ÍLOHA for 15 min in a dark at room temperature and absorbance was measured at 532 nm on a SLT Rainbow spectrophotometer (Tecan, Crailsheim, Germany). Detection of inducible nitric oxide synthase (iNOS) by Western blot Cells were washed with cold PBS, scraped and then lysed in the lysis buffer (1% sodium dodecyl sulphate - SDS, 10-1 mol/L Tris pH 7.4, 10% glycerol, 10-3 mol/L sodium orthovanadate, 10-3 mol/L phenylmethanesulfonyl fluoride). Protein concentrations were measured with the DC protein assay (Bio-Rad, Hercules, California, USA) using bovine serum albumin as a standard. Equal amounts of proteins (20 µg) were applied on an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. Proteins were electrically transferred from the gel to a nitrocelulose membrane and immunoblotted with rabbit antiserum against the murine iNOS (Transduction Lab, Lexington, Kentucky, USA). Horseradish peroxidase-conjugated with anti-rabbit IgG antibody was used as a secondary antibody. The blots were vizualized using ECL+ kit (Amersham, Arlington Heights, Illinois, USA) and exposed to CP-B X-ray films (Agfa, Brno, Czech Republic). Viability Viability was set using ATP kit SL (BioThema AB, Hanince, Sweden) on microtitre plate Luminometer LM-01T (Immunotech, Prague, Czech Republic). Statistical analysis All experiments were done in duplicates and repeated six times. All data are reported as means ± standard error of the mean (SEM). The data were analyzed using the non-parametric Wilcoxon test or one-way analysis of variance (ANOVA) using Statistica for windows 5.0 (Statsoft, USA). A P value of less than 0.01 was considered significant. RESULTS 1) Immediate effect of polyphenols Fig. 2 demonstrates the total antioxidant capacity of four polyphenols studied (CAT, EPI, QUE and RES), which was measured as the ability to scavenge chemicaly generated peroxyl radical. All of them showed a significant antioxidant capacity, which increased in a dose-dependent manner. Flavonoids (CAT, EPI, QUE) were observed to show an approximately four-fold higher antioxidant capacity than hydroxystilben RES.

100

9. PŘ ÍLOHA The ability of polyphenols to reduce the oxidative stress caused by biologically generated radicals was studied using murine macrophages RAW 264.7. All polyphenols dose-dependently inhibited the chemiluminescence produced by the PMA-stimulated RAW 264.7 (Fig.3). The effect of RES was the highest among all compounds tested, because even the lowest concentration inhibited markedly CL. Thus, RES seems to be a more potent inhibitor of oxidative burst then flavonoids.) 2) Long-term effect of polyphenols LPS (10-4 g/L) increased the ROS production by 190% (51.2 x 10 4 vs. 17.6 x 104 RLU in an untreated control), as measured by PMA-activated CL. CAT, EPI and RES did not have any inhibitory effect on ROS production (data not shown). Conversely, QUE significantly decreased the ROS production of LPS-stimulated RAW 264.7 in a dose-dependent manner (Fig 4A). LPS evoked a 30-fold induction of nitrite production as opposed to the untreated control (34.4x10-6 vs. 1.1x10-6 mol/L NO2-/2*106 cells, respectively). This induction was inhibited by QUE (2.5x10-5-10-4 mol/L) treatment in a dose-dependent manner (Fig. 4B). RES at concentrations of 5x10-5 and 10-4 mol/L cut the NO production by 7 and 26 %, respectively. However, no significant inhibition by CAT and EPI was found (data not shown). The cytotoxicity of polyphenols in RAW 264.7 cells was examined by luminometrical detection of ATP concentration. None of the polyphenols affected the viability of RAW 264.7 cells (data not shown). In view of the involvement of iNOS in the inflammatory process, we monitored iNOS protein expression by Western blot in RAW 264.7 exposed to polyphenols. As shown in Fig. 5, expression of the iNOS protein was not detectable in unstimulated cells, but markedly increased 24 h after LPS (10-4 g/L) treatment. Treatment with QUE showed a concentration-dependent inhibition of iNOS protein expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. CAT, EPI and RES did not influence iNOS expression in LPS-activated RAW 264.7 cells (data not shown). DISCUSSION In our paper, four wine polyphenols (CAT, EPI, QUE and RES) were studied from the viewpoint of their antioxidant capacity, their ability to scavenge biologically produced ROS and their influence on nitric oxide production and iNOS expression. In agreement with other authors we observed a significant antioxidant capacity against peroxyl radical of all studied polyphenols. Some authors have even found that QUE and CAT showed a greater efficacy to scavenge peroxyl radical on a mole for mole basis than the antioxidant 101

9. PŘ ÍLOHA nutrients vitamin C, vitamin E, and beta-carotene . In our study, flavonoids (CAT, EPI, QUE) showed an approximately four-fold higher ability to scavenge peroxyl radical than hydroxystilben RES. The antioxidant potential of polyphenols depends on the number and arrangement of the hydroxyl groups and the extent of structure conjugation . They can donate hydrogen atom from their hydroxyl groups and stabilize the phenoxy radical formed by delocalisation of the unpaired electron within the aromatic structure. It is well-known that aromatic compounds containing hydroxyl groups, especially those having an O-dihydroxy group on ring B, appear to be important scavengers as reported for flavonoids . RES, a nonflavonoid, is also known to have a strong antiradical activity, which is due to the presence of a conjugated double bond, which makes the electrons more delocalized . The higher TRAP of flavonoids found in our experiments may be caused by the fact that flavonoids contain multiple hydroxyl groups (5 OH groups) in comparison to RES (3 OH groups), which are able to donate hydrogen atoms to peroxyl radicals and so have a greater potential to act as a scavenger of peroxyl radicals. This is also supported by the findings of López et al. , who reported QUE to have higher antioxidant capacity against peroxyl radical than RES. On the other hand, Yilmaz and Toledo found the RES to be a more potent scavenger of chemically generated peroxide radical than CAT and EPI. Since cellular systems generate a variety of radicals including superoxide, hydroxyl and peroxyl radicals and peroxinitrite, other experiments were performed to demonstrate the ability of flavonoids and RES to scavenge biologically generated radicals. All test compounds dose-dependently scavenged the free radicals that were produced by the PMA-stimulated RAW 264.7. RES, interestingly, seems to be a more potent scavenger even though its TRAP was the lowest. The efficiency of individual polyphenols to scavenge peroxyl radical and inhibit oxidative burst in macrophages was not always the same because of a different specificity of a polyphenol to scavenge peroxyl radical particularly and other free radicals involved in the process of an oxidative burst of macrophages. The TRAP test provides information only of the reactivity of phenolic compounds with only one radical in a buffered solution. On the other hand, in the PMA-stimulated macrophage CL assay, a combination of many ROS is present. Moreover, the mechanisms of actions of flavonoids may differ from that of stilbenes. In addition to their antioxidative properties, some polyphenols act as metal chelating agents and inhibit the superoxide-derived Fenton reaction, which is an important source of the most reactive hydroxyl radicals. Various authors consider chelation of metal ions as the main mechanism of polyphenolic action , while others consider ROS scavenging to dominate in the antioxidant effects . Belguendouz et al. investigated that RES protects LDL 102

9. PŘ ÍLOHA against peroxidative degradation mainly by chelating copper whereas flavonoids are better scavengers of free radicals. The ability to inhibit the Fenton reaction could explain the effectiveness of RES against biologically generated radicals in contrast to the system, were radicals are chemically produced in a copper-free buffered solution. All phenomena previously described are responsible for a short-term response mediated by wine polyphenols. Recent studies have pointed out that polyphenolic compounds from several sources may also have long-term effects, as they are able to modulate gene expression in different transformed cell lines and in macrophages . We used a bacterial LPS for the induction of inflammation processes in RAW 264.7. LPS, as an outer membrane component of bacteria, triggers the generation of reactive oxygen intermediates as well as the secretion of a variety of inflammatory mediators, such as nitric oxide. In our experiment, a 190% increase in ROS production was observed when RAW 264.7 cells were incubated with LPS (24h) in comparison with an untreated control. The incubation of cells with QUE diminished their LPS-activated production of ROS in a concentration dependent manner (Fig 4A). We found that QUE, in a concentration of 10-4 mol/L, reduced the ROS release even to the level of non-LPS-treated cells. Conversely, CAT, EPI and RES did not decrease the amount of ROS produced by activated macrophages. This indicates that QUE is the most effective modulator of oxidative stress in the long term. The large amount of NO produced in response to bacterial lipopolysaccharide plays an important role in endotoxemia and inflammatory conditions . Therefore, drugs that inhibit NO production by inhibiting iNOS expression or its enzyme activity, resulting in decreased NO generation, may be beneficial in treating diseases caused by an overproduction of NO . To investigate the effect of polyphenols on NO production, we measured the accumulation of nitrite, the stable metabolite of NO, in culture media. We found a huge NO release by LPSstimulated cells as opposed to untreated control. The results are in full agreement with the data of others . When LPS-activated cells were incubated with QUE or RES, significant and dose-dependent decrease of the NO production was observed after 24h. It seems likely that QUE and RES inhibit NO production by several mechanisms. Suppression of NO release may be attributed to direct NO scavenging activity, which was previously confirmed by their ability to scavenge an exogenous NO donor sodium nitropruside (SNP) in vitro . Another possible mechanism is a modulation of iNOS protein expression. To investigate, whether QUE and RES are able to decrease iNOS protein expression, Western blot analysis of RAW 264.7 exposed to LPS and one of these polyphenols was monitored. As shown in Fig. 5, expression of the iNOS protein 103

9. PŘ ÍLOHA was not detectable in unstimulated cells, but markedly increased 24 h after LPS treatment. Treatment with QUE showed a concentration-dependent inhibition of iNOS protein expression in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The regulation of iNOS expression is complex, but appears to occur primarily at the level of transcription. Activation of mitogen activated protein kinases (MAPKs) and the redox-sensitive transcription factors, nuclear factor-κB (NF-κB) and activator protein 1 (AP-1) are key events in the signal transduction pathways mediating iNOS induction in macrophages exposed to LPS . Wadsworth and Koop has found that QUE inhibited p38 MAPK activity, which causes inhibition of iNOS mRNA expression which results in decreasing in iNOS protein level and NO release in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. It is not clear whether QUE acts more by inhibiting iNOS expression or by direct scavenging of NO. Chan speculates that QUE and RES may act more by scavenging of NO radicals than by inhibition of iNOS gene expression. The rationale for this deduction is that these compounds were not very effective in reducing iNOS mRNA while they readily scavenged NO produced by SNP. In our study, inhibition of iNOS protein expression was in parallel with the comparable inhibition of NO production, thus agreeing with the results obtained by Chen , Chan and Wadsworth and Koop . Therefore we propose that the suppression of NO by QUE was mainly mediated by inhibition of iNOS protein expression. As stated earlier, NO plays an important role in the pathogenesis of various inflammatory diseases. Therefore, the inhibitory effect of QUE on iNOS gene expression suggests that this is one of the mechanisms responsible for the anti-inflammatory action of QUE. Although RES at higher concentrations decreased NO production, it did not influence iNOS expression in LPS-activated RAW 264.7 cells. Our results accord with the results of Cho , who found that a higher concentration of RES than needed for the inhibition of NO production was required for the iNOS expression and NF-κB translocation. It suggests that these may not be the primary targets for RES required for the inhibition of NO production. It may be speculated that RES may act more by scavenging of NO radicals and suppressing the generation of RNS than by the inhibition of iNOS gene expression . In conclusion, this study provides the evidence for in vitro effects of wine polyphenols (CAT, EPI, QUE and RES). All of them have a pronounced free radical scavenging ability. It was found that only quercetin incorporated into macrophages quenches their production of reactive metabolites. Moreover, quercetin and resveratrol decreased the release of nitric oxide in a dosedependent manner without cytotoxic effect. In the case of quercetin, the decrease in nitric oxide production corresponded to a decrease in iNOS expression. We proposed that QUE is a potential inhibitor of LPS-induced NO production by inhibiting iNOS expression. 104

9. PŘ ÍLOHA Abbreviations Used ABAP - 2,2-azo-bis(2-amidinopropane) hydrochloride, ANOVA - analysis of variance, CAT – catechin, CL – chemiluminescence, DMEM - Dulbecco`s Eagle medium, EPI – epicatechin, HBSS - Hanks' balanced salt solution without phenol red, iNOS - inducible nitric oxide synthese, LDL - low density lipoproteins, LPS – lipopolysaccharide, NO - nitric oxide, PBS phosphate buffered saline, PMA - phorbol 12-myristate 13-acetate, QUE – quercetin, RES – resveratrol, RLU - relative light units, RNS - reactive nitrogen species, ROS - reactive oxygen species, SDS - sodium dodecyl sulphate, SEM - standard error of the mean, TRAP - Total radical-trapping antioxidant parameter Acknowledgements This study was executed within a research plan AVOZ50040507 and was supported by grant No. B6004204 of the Grant Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic. LITERATURE CITED

105

9. PŘ ÍLOHA Fig. 1: Experimental design of experiments when long-term effect of polyphenols was studied.

Fig. 2: Total antioxidant capacity of polyphenols. TRAP is expressed as µmol of the peroxyl radical trapped per 1 L of polyphenolic solution. The changes of the parameter were found to be significant at the level of p = 0.01 using ANOVA test. Statistically significant contrasts among the values are marked by different capital letters.

106

9. PŘ ÍLOHA

Fig. 3: Activity of polyphenols to scavenge reactive metabolites produced by RAW 264.7 cells (measured by chemiluminescence). The changes of the parameter were found to be significant at the level of p = 0.01 using Wilcoxon test. Statistically significant contrasts among the values are marked by different capital letters.

Fig. 4: The effect of polyphenols on CL activity and nitrite production by RAW 264.7 cells. Cells were pre-treated with the indicated concentrations of QUE for 1 h before being incubated with LPS (10-4 g/L) for 24 h. Control cells were incubated with vehicle alone. The changes of the parameter were found to be significant at the level of p = 0.01 using Wilcoxon test. Statistically significant contrasts among the values are marked by different capital letters. (A) Inhibition of reactive metabolite production by QUE in LPS-stimulated RAW 264.7 macrophages. Before measurement, supernatant was removed and cells were washed twice with PBS. Phorbol-myristate acetate was used to activate the oxidative burst of RAW 264.7 measured by chemiluminescence. (B) Inhibition of nitrite production by QUE in LPSstimulated RAW 264.7 cells. The cultured supernatants were subsequently isolated and analyzed for nitrite production. 107

9. PŘ ÍLOHA

Fig. 5: Inhibition of iNOS protein expression by QUE. Cultures were set up as described in the legend to Fig. 4. Equal loading of proteins was verified by β-actin immunoblotting. One of three representative experiments is shown.

108

9. PŘ ÍLOHA

AMK - aminokyselina BT4 - tetrahydrobiopterin C3a, C3b – složky komplementu Ca-I – vápníkový ionofor A23187 CD – cluster of differentiation, povrchové molekuly leukocytů CL – chemiluminescence, chemiluminiscence DWW – dealcoholated white wine, dealkoholizované bílé víno DRW - dealcoholated red wine, dealkoholizované červené víno G-CSF – granulocyte colony stimulating factor, kolonie stimulující faktor granulocytů FAD – flavin adenindinukleotid fMLP – N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-phenylalanine GSH – glutathion GS-SG – glutathionový disulfid ICAM-1 – intercellular adhesion molecule, intercelulární adhezivní molekula IFNγ – interferon gamma IL – interleukin LDL, HDL – low-/high-density lipoprotein, nízko-/vysoko-denzitní lipoprotein LFA-1 - leukocyte function associated antigen 1, leukocytární integrin LPS – lipopolysacharid LTB4 – leukotrien B4 MDA - malondialdehyd MHC I., II. – major histocompatibility complex, hlavní histokompatibilní komplexglykoproteiny I.,II. třídy MPO - myeloperoxidáza NADH – redukovaná forma nikotinamid adenindinukleotidu NADPH - redukovaná forma nikotinamid adenindinukleotid fosfátu NBT – nitroblue tetrazolium, nitrotetrazoliová modř NO - nitric oxide, oxid dusnatý NOS – nitric oxide synthase, syntáza oxidu dusnatého iNOS – inducible nitric oxide synthase, inducibilní syntáza oxidu dusnatého OZP - opsonizované zymozanové částice PAF – platelet-activating factor, faktor aktivující destičky PMA – phorbol 12-myristate 13-acetate PMNL – polymorphonuclear leukocytes, polymorfonukleární leukocyty 109

10. SEZNAM POUŽ ITÝCH ZKRATEK PUFAs – polyunsaturated fatty acid, polynenasycené mastné kyseliny RS, RM – reactive species, reaktivní metabolity ROS, RKM – reactive oxygen species, reaktivní kyslíkové metabolity RNS, RDM – reactive nitrogen species, reaktivní dusíkové metabolity SIRS – systemic inflammatory response, systémová zánětlivá odpověď SOD – superoxid dismutáza TAS - total antioxidant kapacity, celková antioxidační kapacita TRAP - total peroxyl radical-trapping antioxidative parameter TBARS – thiobarbituric acid reactive substance, sloučeniny reagující s kyselinou thiobarbiturovou (indikátor lipidové peroxidace) TGFβ – transforming growth factor beta, transformující růstový faktor beta TNFα - tumor necrosis factor alpha, tumor nekrotizující faktor alfa VCAM – vascular cell adhesion molecule, cévní adhezivní molekula X/XO – xanthin/xanthinoxidáza

110