MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA KATEDRA BIOCHEMIE
Molekulová podstata chřipkových virů Bakalářská práce
Brno 2006
Markéta Melicharová
Prohlašuji, že jsem tuto práci vypracovala samostatně, jen
s využitím informačních zdrojů uvedených v kapitole Literatura.
Markéta Melicharová 2
Děkuji paní RNDr. Michaele Wimmerové, Ph.D. za vedení
mé bakalářské práce, za odbornou konzultaci a všestrannou pomoci při řešení problémů.
Děkuji svým rodičům za jejich neustálou podporu.
3
Obsah 1. Úvod a cíle práce……………………………………………..6
2. Viry………………………………………………. …………….8 2.1.
Obecné vymezení pojmu…………………………………8
2.3.
Struktura virových částic………………………………...8
2.2.
Klasifikace a dělení virů………………………………….8
3. Chřipka………………………………………………………...10 3.1.
Obecné vymezení chřipkového onemocnění…………....10
3.3.
Klinické příznaky chřipky………………………………10
3.2.
Patogeneze chřipky………………………………………10
4. Orthomyxoviry (viry chřipky)………………………….....11 4.1.
Klasifikace Orthomyxovirů……………………………..11
4.3.
Molekulární struktura virionu………………………….12
4.2.
Společné znaky orthomyxovirů…………………………11
4.3.1. 4.3.2.
Povrchové antigeny virů chřipky………………...15 Vnitřní antigeny virů chřipky……………………16
5. Životní cyklus chřipkových virů………………………….18 5.1.
Vztah viru a hostitelské buňky………………………….18
5.3.
Penetrace viru do buňky………………………………...20
5.2. 5.4. 5.5.
Adsorpce viru na hostitelskou buňku…………………..18
Reprodukce chřipkových virů…………………………..21 Molekulární mechanismus exprese genomu chřipkových
virů………………………………………………………..23
5.5.1 Transkripce…………………………………………...23 5.5.2 Translace……………………………………………...23
4
6. Variabilita chřipkových virů v souvislosti s jejich
epidemickým šířením……………………………………….24 6.1.
Zdroje variability virů chřipky………………………....24
6.3.
Antigenní posun (antigenní drift)………………………25
6.2.
Antigenní zvrat (antigenní shift)………………………..24
7. Závěr…………………………………………………………....27 8. Zkratky………………………………………………………...30
9. Literatura……………………………………………………...31
5
1.
Úvod a cíle práce Viry jsou nebuněčné nukleoproteinové částice. Řadí se mezi tzv. intracelulární
(vnitrobuněčné) parazity a způsobuji rozmanitá onemocnění rostlin, hub a živočichů člověka nevyjímaje.
Mezi virová onemocnění rostlin patří například vřetenovitost bramborových
hlíz, zakrnělost chmele, bledost okurek, mozaiková onemocnění tabáku a další.
Živočišné viry způsobují kulhavku a slintavku hovězího dobytka, vzteklinu lišek,
myxomatózu králíků, mor u drůbeže, opičí a kravské neštovice, koňskou encefalomyelitidu a další. U člověka jsou viry původci dětské obrny, rýmy, chřipky,
spalniček, příušnic, zarděnek, klíšťové encefalitidy, oparu, pásového oparu, planých
neštovic, hepatitidy A, B, C a E, AIDS (= syndrom získané imunodeficience,
způsobené viry HIV) a dalších. Je prokázáno, že některé virové infekce patří k významných rizikových faktorů při vzniku maligního bujení.
Problematika virů je tedy středem zájmu mnoha disciplin. Výzkumy v oblasti
virologie jsou nezbytné pro humánní a veterinární medicinu, imunologii, farmakologii, biotechnologii, zemědělství a ekologii. Přičemž se hojně využívá
schopnosti virů přenášet nerůznější makromolekuly mezi buňkami a možnosti modifikace genomu buňky.
Po úvodním představení virů a jejich základním členěním se v mé bakalářské
práci se zaměřím na
viry chřipky. Viry chřipky jsou zařazeny do oddělení
Orthomyxoviridae, kde rozlišujeme rody Influenza virus A, B a C, přičemž Influenza virus A je nejčastěji se vyskytujícím a nejvíce infekčním rodem. Infekce chřipkovými
viry vyvolá u člověka chřipku, což je akutní infekční onemocnění dýchacího ústrojí. Viry chřipky patří mezi tzv. obalené živočišné RNA viry.
Poté popíši jednotlivé fáze životního cyklu chřipkových virů. Pro viry, jakožto
intracelulární parazity je životně nezbytný hostitel. Přirozenými hostiteli jsou kromě
člověka vepř, kůň, domácí a divoce žijící ptactvo, někteří mořští savci (lachtani,
velryby). Aby se viry mohly reprodukovat, musí nejprve infikovat hostitelskou buňku a poté se díky jejímu translačnímu systému mohou množit. Prvním nezbytným
krokem a předpokladem infekce buňky virem je adsorpce (= přilnutí) viru na 6
hostitelskou buňku. Úspěšná adsorpce je závislá na povrchových proteinech virové
částice a na receptorech hostitelské buňky. Druhým krokem je penetrace
(= proniknutí) viru do buňky. Penetrace se u chřipkových virů děje endocytózou za účasti mnoha proteinů. Třetím krokem je exprese virového genomu, ke kterému dochází v jádře hostitelské buňky (transkripce, translace). Klíčovým enzymem je virová RNA-dependentní-RNA-polymeráza. Během vlastní reprodukce viru dochází
k syntéze virových bílkovin, k replikaci virového genomu, k tvorbě nových virionů, jejich dozrávání nebo-li maturaci a uvolňování z buňky, tj. eluci.
Na závěr se zmíním o ohromné variabilitě chřipkových virů, která je
způsobena především jejich segmentovaným genomem.
Epidemie chřipky, které
mohou přejít až v pandemie, jsou obvykle spojeny s tzv. antigenním zvratem (= antigenní shift). Nejzávažnější zaznamenanou chřipkovou pandemií v lidské
populaci byla tzv. Španělská chřipka, která v letech 1918/1919 způsobila smrt 20 milionů lidí. Dalším, zato méně závažným zdrojem variability je antigenní posun (antigenní drift).
Velkým pokrokem pro vědu a výzkum, zabývající se chřipkovými viry bude
objasnění a vysvětlení molekulárního mechanismu adsorpce (identifikace receptorů, jejich struktura, vazebné schopnosti), vstupu viru do buňky skrze buněčné membrány
a dalšího působení virové částice v infikované buňce. Tato bakalářská práce má na
základní úrovni shrnout dosavadní poznatky o molekulárních mechanismech životního cyklu chřipkových virů.
7
2. Viry (1, 2, 3)
2.1. Obecné vymezení pojmu
Viry jsou nukleoproteinové (NP) částice o rozměrech 25 – 400 nm, vyznačující se
schopností infikovat hostitelskou buňku a v ní se reprodukovat v závislosti na jejím translačním systému.
S živými organismy viry spojuje pouze jediná vlastnost, a to že mají genetický
kód pro vlastní replikaci. Genetická informace virů je zapsána vždy jen v jediném typu
nukleové kyseliny. Podle toho dělíme viry na DNA a RNA viry. V genomu viru nejsou
geny pro rRNA a tRNA ani strukturní geny kódující ribozomové proteiny, z čehož vyplývá, že syntéza virových proteinů je zcela závislá na translačním systému hostitelské
buňky. (Viry se nemnoží, ale jsou pomnožovány hostitelskou buňkou). Patří mezi obligátní intracelulární parazity.
2.2. Klasifikace a dělení virů
Oddělení Viry (Vira) spadají do Říše: Nebuněční (Subcellulata), taxonomicky jsou
utříděny do čeledí, rodů a jednotlivých druhů rodu. Příslušníci jednotlivých čeledí mají
stejný typ nukleové kyseliny, stejné uspořádání virionu a stejnou strategii replikace. Názvy čeledi jsou charakterizovány příponou viridae. Rody zahrnují příslušníky čeledi
více či méně antigenně příbuzné. Názvy rodů jsou charakterizovány příponou virus. Jednotlivé druhy virů příslušející do stejného rodu se liší svými biologickými vlastnostmi.
Podle typu hostitelské buňky dělíme viry na viry bakterií (tzv. bakteriofágy) a
eukaryotické viry. Podle typu hostitele můžeme rozlišovat viry živočišné a rostlinné. Podle typu nukleové kyseliny dělíme viry na RNA a DNA viry. Podle toho, zda mají či nemají kolem kapsidu lipoproteinový obal, rozlišujeme viry obalené, resp. neobalené.
2.3. Struktura virových částic
Virová částice, která je schopna infikovat hostitelskou buňku, se nazývá virion.
Nejdůležitější složkou virionu je nukleová kyselina (DNA nebo RNA), která obsahuje 8
genetické informace nezbytné pro realizaci reprodukce viru. Nukleová kyselina má funkci genoforu (= nosiče genů), u převážné většiny představuje celý genom viru. Genom může
být buď cirkulární nebo lineární. U DNA virů je zpravidla tvořen dvěma komplementárními vlákny, u RNA virů jediným (+ nebo -) vláknem. V obou případech
však existují výjimky (viz. Tabulka1). RNA s pozitivní polaritou (+RNA) má povahu
informační RNA (iRNA) a může být přímo překládána na ribozomech hostitele do příslušných polypeptidů. RNA s negativní polaritou (-RNA) je přepisována do informační
podoby virovou RNA-polymerázou, která je součástí virionu. U některých virů není genom souvislý, ale je tvořen separátními segmenty.
Kolem nukleové kyseliny virového genomu se tvoří proteinový obal, zvaný
kapsid. Tento (deoxy)ribonukleoproteinový komplex se označuje též jako nukleokapsid. Virové kapsidy se vyznačují symetrickým uspořádáním. Nejobvyklejším typem symetrie
je symetrie helikoidální nebo kubická. U řady virů reprezentuje nukleokapsid kompletní virion, takový virion označujeme jako neobalený (nahý). Tzv. obalené viry mají kromě
kapsidu ještě další lipoproteinový obal, který je tvořen lipidovou dvojvrstvou hostitelského původu, kterou se kapsid obalí při postupu skrze membrány hostitelské buňky.
Tabulka 1: Názvy hlavních skupin virů podle typu jejich genomu (1) Typ virového genomu
Označení skupiny virů s příslušným genomem
dsDNA lineární nebo kružnicová
dsDNA-viry
dsRNA
dsRNA-viry
ssDNA lineární nebo kružnicová Pozitivní ssRNA
Negativní ssRNA
ssDNA-viry
+ssRNA-viry -ssRNA-viry
RNA určená ke zpětné transkripci v hostitelské buňce do DNA, Rna-viry s reverzní jejíž kopie po replikaci slouží jako matrice pro syntézu virového transkriptázou RNA-genomu
DNA určená k transkripci v hostitelské buňce do RNA jako DNA-viry s reverzní matrice pro zpětnou transkripci do DNA opět s funkcí virového transkriptázou genomu
9
3. Chřipka (2) 3.1. Obecné vymezení chřipkového onemocnění
Chřipka je akutní infekční onemocnění dýchacího ústrojí způsobené chřipkovými
viry. Viry chřipky se přenášejí kapénkovou infekcí (vzdušnou cestou). Nakažlivost, zejména virem chřipky A (viz kap. 4.1.), je vysoká.
3.2. Patogeneze
Místem primárního pomnožení virů je sliznice dýchacích cest. Virová
neuraminidáza snižuje viskozitu ochranného hlenu a umožňuje virionům přístup
k receptorům vnímaných buněk. Množení viru vede k rozvoji zánětlivého infiltrátu, edému a destrukci sliznice. Typická pro chřipku je tracheobronchitida (zánět průdušnic a průdušek). Nejčastější komplikace chřipky jsou způsobeny sekundární bakteriální invazí
rozrušených sliznic. Přidružená infekce je nejčastěji vyvolávána patogenními stafylokoky. Výjimečně, při rozsáhlém postižení pneumocytů (primární chřipková pneumonie), může
porucha oxido-redukčních funkcí způsobit náhlou smrt postižené osoby. Při neletálním průběhu onemocnění se stav nemocného postupně v průběhu 5 -16 dnů zlepšuje.
Nejvážnější důsledky může mít chřipka u osob imunologicky oslabených (malých dětí, chronicky nemocných, osob starších sedmdesáti let a těhotných žen).
3.3. Klinické příznaky
Po jednom až třech dnech inkubační doby dochází k vzestupu tělesné teploty,
provázené bolestmi hlavy, svalstva, končetin, zad a očí. Vysoká horečka, rýma, zduřená nosní sliznice a suchý kašel jsou nejčastější symptomy. Nekomplikované onemocnění trvá 3 – 7 dní. Kašel a pocity slabosti trvají 1 – 2 týdny.
Přidruží-li se sekundární bakteriální infekce, onemocnění trvá déle a je
doprovázeno hnisavou rýmou a mukopurulentní expektorací. U dětí do pěti let může být onemocnění
komplikované
bronchopneumonií.
bronchopneumonie.
U
zánětem
dospělých
je
středního
nejčastější
ucha,
bronchitidou
komplikací
nebo
bronchitida
a
Výše uvedené klinické příznaky provázejí infekce viru chřipky typu A i B. Virus
chřipky C vyvolává lehké infekce horních cest dýchacích převážně u dětí.
10
4. Ortomyxoviry 4.1. Klasifikace Ortomyxovirů (1)
Viry způsobující chřipku spadají do oddělení Orthomyxoviridae (Ortomyxoviry),
kde rozlišujeme dva rody. Rod Influenza virus A, B – sem patří virus influenzy A (virus
chřipky A), který způsobuje chřipku u člověka a onemocnění dýchacích cest koní, ptáků a prasat. Influenza virus B (virus chřipky B) způsobuje chřipku jen u člověka. Rod influenza virus C, kam patří virus influenzy C (virus chřipky C), způsobuje chřipku u člověka, většinou u dětí.
Obr. 1: Influenza virus A (4)
4.2. Společné znaky Ortomyxovirů (1, 3) Ortomyxoviry
jsou živočišné RNA
viry.
Jejich
genom tvoří
lineární
jednořetězcová negativní segmentovaná RNA (-ssRNA viry). Jejich viriony jsou obalené, kulovitého tvaru o průměrné velikosti 120 nm.
11
Za negativní genomovou RNA (-RNA) viru se považuje taková genomová RNA,
která se přepisuje do RNA s funkcí mRNA a replikuje do RNA s funkcí antigenomu, obě
RNA mají vzhledem k negativní genomové RNA opačnou orientaci fosfodiesterových
vazeb. Jako antigenom se pak označuje pozitivní RNA, která slouží jako matrice pro replikaci do negativní RNA s funkcí genomu, přičemž pozitivních RNA při této replikaci se využívá ve funkci mRNA.
4.3. Molekulární struktura virionu (1, 5) Ortomyxoviry
mají
nukleokapsid
obalený
lipoproteinovou
dvojvrstvou
hostitelského původu, kterou se obalí při prostupu skrze membrány hostitelské buňky.
Viry chřipky mají tři základních typy membránových proteinů, a to hemaglutinin (HA), neuraminidázu (NA) a M-proteiny (M2). (Rod Influenza C virus má pouze jeden
jednoduchý membránový protein typu hemaglutininu – HEF (Hemagglutinin-esterasefusion protein).
Na vnitřní straně lipoproteinové dvojvrstvy jsou molekuly matricového typu
(M-proteiny, M1), které vážou obal k nukleokapsidu. Na vnější straně obalu ční výběžky tvořené biologicky aktivními glykoproteiny, jejichž součástí jsou také hemaglutininy
(HA, HEF), neuraminidáza (NA) a případně další transmembránové proteiny (BM2, CM2).
V nukleokapsidu se nachází segmentovaný genom viru tvořený negativní RNA,
který je obklopen membránovým obalem. U virů chřipky A a B je genom rozdělen do 8
segmentů, viry chřipky C mají genom rozdělen do 7 segmentů. Každý segment většinou kóduje jeden protein (viz. Tabulka 2). Na každý segment se vážou molekuly
nukleokapsidového proteinu (NP-proteinu). Na 3´-konec segmentů se váže RNA-
dependentní-RNA-polymeráza, která sestává z proteinů PB1, PB2 a PA případně z P1, P2 a P3. V nukleokapsidu se dále nacházejí v malém množství nestrukturální proteiny (NS1, NS2).
12
Tabulka 2: Proteiny kódované segmenty v genomu chřipky A, B a C (1) Segment
Virus chřipky A
Virus chřipky B
Virus chřipky C
2
PB1
PB2
P2
1
PB2
3
PA
PB1 PA
P1
P3
4
HA
HA
HEF
6
NA
NA, NB
CM2
5
NP
7
M1, M2
8
NS1, NS2
NP
M1, BM2
NS1, NS2
NP
NS1, NS2 -
Nejběžněji se vyskytujícím a také nejinfekčnějším virem chřipky je Influenza
virus A. Struktura jeho virionu patří mezi nejlépe prostudované. Proteiny virionu Influenza viru A a jejich funkce je pro úplnost shrnuta v Tabulce č. 3.
Tabulka 3: Proteiny kódované segmenty genomu viry chřipky A a jejich funkce (6)
Číslo segmentu a
kódovaný protein
1. PB2 3. PA
(proteiny
Funkce
2. PB1 Komplex tří proteinů (PB2, PB1, PA) zajišťuje virovou replikaci a transkripci. Replikují virovou RNA v komplexu s NP. PB2
virové vykazuje při replikaci specifitu vůči hostiteli.
RNA-dependentníRNA-polymerázy 4.
(HA)
Hemaglutinin Hemaglutinin zajišťuje vazbu viru na receptory kyseliny sialové (SA). Navozuje vstup viru do buňky endocytózou a způsobuje fůzi
virového obalu a endosomální membrány. Díky specifické sekvenci
a struktuře HA řídí specifické navázání k SA. Aby HA navodil fůzi, musí být nejprve proteolyticky rozštěpen. Významným úkolem HA je „neutralizovat“ imunitní odpověď, změny struktury HA mají za následek vyhnutí se imunitní odpovědi.
13
5.
(NP)
Nukleoprotein Zastává roli v řízení replikace virové RNA v komplexu s PB2, PB1 a PA
6. Neuraminidáza Enzym, který štěpí terminální sialové kyseliny z glykoproteinů (NA)
buněčného povrchu a také z glykokonjugátů virového původu. Specifita NA k jednotlivým typům vazeb kyseliny sialové a aktivita neuraminidázy muže být variabilní a závisí na mutacích ve
vazebném místě a délce spojovací části, která ji drží na membráně. Odštěpení kyseliny sialové z hemaglutininu zabraňuje agregacím
virionů. NA je cílem imunitní odezvy, existuje několik antigenních variant.
7.
M-proteiny M1: Řídí transport virových ribonukleoproteinových komplexů do
(M1, M2)
jádra
a
z jádra.
Napomáhá
„zrání“
ribonukleoproteinového
komplexu (RNP) v plasmatické membráně během výstavby virionů.
M2: Funguje jako iontový kanál skrz který vstupují H+ do virionu, navodí tak M/NP disociaci, což umožní ribonukleoproteinovému
komplexu (RNP) dostat se do jádra. Moduluje pH Golgiho aparátu a umožňuje molekulám HA, které jsou na kyselé prostředí citlivé, 8.
prostoupit buněčným povrchem neporušeně.
Nestrukturální NS1: Váže a odděluje RNA, brání aktivaci proteinkinázy A a
proteiny
(NS1/NS2)
zabraňuje buněčné apoptóze.
NS2: Je zapojený v jaderném exportu virových RNP
14
Obr. 2: Struktura virionu chřipky A (1)
4.3.1. Povrchové antigeny viru chřipky (1, 7)
Jak již bylo zmíněno výše, povrchovými antigeny virů chřipky jsou hemaglutinin
(HA) a neuraminidáza (NA). Kombinace subtypu hemaglutininu se subtypem
neuraminidázy charakterizují příslušný kmen viru (např. H3N1) a podmiňuje rozlišování antigenních subtypů a variant.
Hemaglutinin viru chřipky je trimer. Každý monomer se skládá ze dvou
polypeptidových řetězců spojených disulfidovými můstky. Hemaglutinin se vytváří v endoplazmatickém retikulu infikovaných buněk z polypeptidového prekurzoru HA0 tvořeného přibližně z 560 aminokyselin. V retikulu je protein glykosylován, trimerizuje se
a skládá do správné konformace. Správně složený protein je poté transportován do Golgiho aparátu a plazmatické membrány a je zabudován do virové částice. V Golgiho
aparátu se HA0 proteolyticky štěpí na HA1 a HA2 podjednotky. Hotový protein obsahuje dvě domény: globulární tvořenou HA1, která obsahuje vazebné místo pro sacharid, a doménu tvořenou převážně z HA2. označovaných jako H1-H15.
Existuje celkem patnáct subtypů hemaglutiniu
15
Obr. 3: Struktura virového hemaglutininu (8) Neuraminidáza
je
aktivní
jako
tetramer.
Z receptorů
odštěpuje
N-acetylneuraminovou (sialovou) kyselinu, což vede k inaktivaci receptoru a zabrání se
tak vazbě virionu na receptory v membráně. Existuje celkem devět subtypů neuraminidázy označovaných jako N1-N9.
4.3.2 Vnitřní antigeny virů chřipky (10)
Mezi vnitřní antigeny virů chřipky patří nukleoprotein (NP) a matricový protein
M1 (M-protein). Na identitě hlavních vnitřních proteinových antigenů je založeno členění rodů na Influenzavirus A, B a C.
Matricový protein M1 řídí transport virových ribonukleoproteinových komplexů do
jádra a z jádra. Nukleoprotein (NP) zastává roli v řízení replikace virové RNA.
16
Obr. 4: Výskyt jednotlivých subtypů H a N (9)
17
5. Životní cyklus chřipkových virů
5.1. Vztah viru a hostitelské buňky (2)
Vztah viru a hostitelské buňky je velmi specifický. Infekčnost
jednotlivých druhů je často omezena na úzký okruh nebo dokonce na jediný druh hostitele. Schopnost viru infikovat určitou buňku a množit se v ní je podmíněna její
vnímavostí a permisivitou k danému druhu viru. Vnímavost buňky k virové infekci je
určována přítomností vhodných receptorů na buněčném povrchu, umožňujících adsorpci a penetraci virionu do cytoplazmy. K množení viru v hostitelské buňce však dojde pouze tehdy, je-li buňka metabolicky vybavena k realizaci úplného replikačního cyklu. Taková
buňka je označována jako k dané virové infekci permisivní. Reprodukce viru spojená s tvorbou nových virových částic zahrnuje několik stádií popsaných níže.
5.2. Adsorpce viru na hostitelskou buňku (1, 2, 10, 11, 12)
Prvním důležitým krokem interakce viru s hostitelskou buňkou je adsorpce virionu
na povrch hostitelské buňky. Připojení viru na hostitelskou buňku je řízeno jednak povrchovými proteiny virové částice (viral attachment proteins – VAPs) a dále receptory na povrchu buňky. Mezi tzv. VAPs patří hemaglutinin.
Adsorpce je zprostředkována vazbou hemaglutininu na N-acetylneuraminovou
(sialovou) kyselinu (SA), která je obsažena v glykoproteinech specifických receptorů hostitelské buňky. Bylo zjištěno, že převažujícími receptory pro influenzavirus A a B
jsou sialylglykoproteiny a gangliosidy obsahující monosialo-laktozoamin typu I a II. SAα2,3(6)D-Galβ1,3(4)D-GlcNAcβ1
Kyselina sialová (SA) je tedy nezbytnou složkou vnějších buněčných receptorů.
V přírodě se vyskytuje více než čtyřicet derivátů SA. Dva majoritní druhy kyseliny
sialové, které podmiňují molekulární mechanismus rozpoznávání receptoru chřipkovými
viry, jsou 5-N-acetylneuraminová kyselina (Neu5Ac) a 5-N-glykolylneuraminová kyselina (Neu5Gc). Tyto dva druhy se liší funkční skupinou na uhlíku C5. Na uhlíku C5
je navázána N-acetylová skupina, pak jde o Neu5Ac. Neu5Gc je derivátem Neu5Ac, vzniká enzymatickou hydroxylací N-acetylové skupiny CMP- Neu5Ac.
18
Sialové kyseliny se typicky vyskytují na terminálních koncích N-glykanů,
O-glykanů a glykosfingolipidů. Je tu potenciální možnost dodatečné
substituce
hydroxylových skupin (-OH) na uhlíku v pozici 4, 7, 8 a 9 (O-acetyl, O-methyl, O-sulfát a fosfátové skupiny). Existují různé možnosti α- vazeb s C2 - různé kmeny virů chřipky
specificky rozeznávají buď rezidua kyseliny sialové navázané na povrch buňky vazbou α(2,6)- anebo α(2,3)-. To vše se podílí na jejich široké strukturální rozmanitosti.
Cílovými hostitelskými buňkami influenzavirů A jsou u lidí, prasat a koní buňky
průdušnicového epitelu, u ptáků jsou to buňky střevní sliznice. Hemaglutininy (HA) influenzavirů A rozpoznávají kyselinu sialovou (SA) navázanou na povrch hostitelských
buněk vazbou (2,3) nebo (2,6). Hemaglutininy lidských influenzavirů jsou výhradně (2,6) specifické, hemaglutininy prasečích influenza virů jsou (2,6) i (2,3) specifické, přičemž
lehce převažuje (2,6) specifita. Hemaglutininy koňských i ptačích influenzavirů jsou též (2,6) i (2,3) specifické, přičemž specifita (2,3) silně převažuje.
Analýzou nukleotidové sekvence bylo zjištěno, že potenciální substituce
aminokyselin hemaglutininů v určitých pozicích mají zásadní vliv na jejich vazebnou specifitu k SA. Příklad pro Neu5Ac: Subtyp hemaglutininu H3, který obsahuje v pozici
226 leucin je α(2,6) specifický, zatímco přítomnost glutaminu v této pozici odpovídá α(2,3) specifitě. Dojde-li tedy k substituci leucinu glutaminem, změní se vazebná
specifika k Neu5Ac z Neu5Ac(2,3)Gal na Neu5Ac(2,6)Gal. Příklad pro Neu5Gc: Glykokonjugáty obsahující Neu5Gc se typicky vyskytují u mnohých druhů zvířat, ale v normálních lidských tkáních ještě nebyly detekovány. Bylo zjištěno, že zásadní vliv na
schopnost viru rozpoznat vazebné místo v Neu5Gc mají aminokyseliny v pozicích 143, 155 a 158.
19
Obr. 5: Vazebné místo receptoru hemaglutinu H3 v komplexu s kyselinou sialovou s vyznačenými aminokyselinami v pozicích 143, 155 a 158 (12)
5.3. Penetrace viru do buňky (1, 2, 5, 7)
Viry vyvinuly mnoho strategií, jak proniknout do hostitelských buněk. Způsob
vstupu viru do buňky je primárně určen jejich strukturou. Rozlišujeme viry obalené a viry
neobalené. Viry chřipky patří mezi viry obalené, jejich dvouvrstevný lipoproteinový obal je hostitelského původu, kapsid se jím obalí právě při prostupu skrze membrány hostitelské buňky.
Segmentovaný genom, složený z osmi (resp. sedmi) jednořetězcových negativních
RNA, je sbalen do virového ribonukleoproteinového komplexu (vRNP). Ve vRNP se nachází nukleoproteiny (NP) a RNA-polymerázy (složené z proteinů PA, PB1 a PB2).
Po navázání chřipkových virů na receptory obsahující SA jsou virové partikule
sevřeny cytoplazmatickou membránou a aktivně endocytovány buňkou. Vstupují do
buňky jako tzv. časné endozomy (pH = 6). Následně jsou virové partikule dopraveny do 20
tzv. pozdních endozomů (pH = 5). Nízké pH v endozomu vede ke konformační změně
podjednotky HA2 hemaglutininu. HA2 v této aktivní formě zprostředkovává fůzi
membránového obalu viru s endozomální membránou, což způsobí uvolnění vRNP do cytosolu. Okyselení přes protonovou pumpu M2-proteinu navodí disociaci N/MP, což umožní transport vRNP přes póry jaderné membrány do jádra. V jádře poté dochází k expresi virového genomu.
Obr. 6: Endocytóza virové částice (5)
5.4. Reprodukce viru (1, 3)
Během vlastní reprodukce viru dochází k syntéze virových bílkovin, k replikaci
virového genomu, k tvorbě nových virionů, jejich dozrávání nebo-li maturaci a
uvolňování z buňky, tj. eluci. Časový úsek od adsorpce až po zahájení syntézy nových virionů se nazývá eklipse. Doba mezi počátkem interakce viru s buňkou a uvolněním prvních virových částic je označována jako latentní stadium.
21
Při transkripci negativního řetězce (-ss RNA) se syntetizuje (+ss RNA), jež
vystupuje z části jako mRNA a z části je přepisována do (-ss RNA) začleněné do nově vznikajících virových částic. -ss RNA
+ss RNA mRNA
-ssRNA proteiny
Virion
U ortomyxovirů se tedy uskutečňuje první transkripce, která probíhá na
segmentech negativní genomové RNA ještě před její replikací v hostitelské buňce a druhá transkripce probíhající na segmentech negativní genomové RNA vzniklých jejich replikací v hostitelské buňce.
V první fázi exprese genomu dochází k tzv. první nebo-li primární transkripci a
translaci virových genů kódujících nestrukturální virové proteiny (regulační polypeptidy a
enzymy, které se nestanou součástí nově tvořených virionů). Během primární transkripce
jsou syntetizovány mRNA komplementární s genomovou RNA jednotlivých segmentů. Následná translace vede k tvorbě polypeptidů, představujících složky polymerázy a vnitřní bílkoviny nukleoproteinu. Současně s primární transkripcí dochází k replikaci genomové RNA za vzniku komplementárního +ss RNA řetězce, který slouží jako matrice pro syntézu dceřiných virových -ss RNA.
Z jádra jsou jednotlivé RNA přenášeny do cytoplazmy, kde dochází k sekundární
transkripci nově vytvořených (dceřiných) genomových RNA za tvorby mRNA kódujících
syntézu strukturních bílkovin. Syntéza těchto bílkovin probíhá na polyribozomech, z nichž jsou vytvořené polypeptidické řetězce přenášeny přes drsné a hladké endoplasmatické retikulum do buněčné membrány na místo tvorby virionů. Obalové bílkoviny jsou přitom zároveň glykozylovány.
Stavba nukleokapsidů je uskutečňována na plasmatických membránách za účasti
nukleonu a membránové bílkoviny. V průběhu maturace se nukleokapsidy spojují s virově modifikovanými složkami buněčné membrány, tj. lipoproteiny a glykoproteiny a zralé viriony se v podobě pupenů oddělují od hostitelské buňky.
22
5.5. Molekulární mechanismus exprese genomu chřipkových virů (1)
Virová RNA-dependentní-RNA-polymeráza je navázána na 3‘-konec jednotlivých
segmentů genomu. Syntézu mRNA může začít až poté, co je 5‘–konec této mRNA modifikován čepičkou (cap) m7G. (jde o strukturu obsahující mj. methylovaný guanin a
ribózu). RNA-dependentní polymeráza využívá čepičku z mRNA hostitelských buněk. Tento mechanismus „kradení čepičky“ má mimo jiné ten význam, že se jím přeruší transkripce a translace hostitelské buňky a přepne se na výrobu chřipkových virionů.
5.5.1. Transkripce
Polymerázový komplex (PB1, PB2, PA) se specificky naváže na 5‘-konec
genomové RNA, tím se aktivuje k vazbě na čepičku buněčné mRNA. Dochází ke změně
konformace genomové RNA do vlásenkové struktury, čímž se aktivuje endonukleáza polymerázového komplexu. Endonukleáza štěpí čepičku buněčné mRNA a dojde k vytvoření aktivního transkripčního komplexu.
Prodlužování virové mRNA se zúčastňují
RNA-dependentní-RNA-polymerázy.
Transkripce
proteiny PB1, PB2 a PA
se
ukončí
polyadenylací.
Polyadenylace začne probíhat, jakmile se transkripcí dosáhne oligo U-sekvence na 5‘-
konci genomové RNA. Vlastní polyadenylace probíhá tak, že se U-sekvence přepisuje do
A-sekvence. Malé transkripty se upravují částečně sestřihem, kterého se jako kofaktor zúčastňuje NS1-protein.
5.5.2. Translace
Následnou translací mRNA viru se vytváří polypeptidy představující složky
polymerázy a vnitřní bílkoviny nukleoproteinu. Translace proteinů membránového obalu
viru (HA-protein, případně NA a M2) probíhá na membráně endoplasmatického retikula. Po odstranění signálního peptidu z proteinů HA a M2 se prostřednictvím Golgiho
systému tyto proteiny dopravují k buněčnému povrchu. Přitom vytvářejí trimery a tetramery a glykosylují se.
23
6. Variabilita chřipkových virů v souvislosti s jejich epidemickým šířením
6.1. Zdroje variability virů chřipky (1)
Virus chřipky je charakteristický svým segmentovaným genomem, který
způsobuje značnou variabilitu virů chřipky. Segmentovaný genom totiž umožňuje
přeskupování genomových segmentů. K přeskupování dochází, infikují-li současně stejnou hostitelskou buňku různé kmeny téhož druhu. Přeskupením mezi dvěma
segmentovanými osmicemi genomů se může vytvořit 28 tj. 256 nových kombinací.
Vznikají tak nové kmeny chřipky s novým antigenním typem, který není lidská populace schopna imunologicky rozeznat.
Rozhodujícím činitelem pro vznik epidemie chřipky v lidské populaci je změna
antigenních vlastností viru. Ke změnám v antigenních vlastnostech dochází dvěma způsoby, a to buď antigenním zvratem (antigenní shift) nebo antigenním posunem (antigenní drift).
6.2. Antigenní zvrat (antigenní shift) (1, 9)
Antigenním zvratem se rozumí náhlá a zásadní změna v antigenní vlastnostech
viru, která je výsledkem přeskupení mezi segmentovanými genomy virů stejného druhu lišících se v antigenních vlastnostech.
Dojde-li k antigennímu zvratu, hrozí nová možnost vzniku pandemie chřipky. Po
antigenním zvratu virus chřipky disponuje buď novým subtypem samotného hemaglutininu nebo novým subtypem hemaglutininu i neuraminidázy. Nový virus je
antigenně odlišný od dříve se vyskytujících chřipkových virů v lidské populaci, proto nemohl vzniknout jejich mutací.
Přirození hostitelé virů chřipky A (člověk, vepř, kůň domácí i divoce žijící ptáci a
někteří mořští savci) mají podobné vnitřní antigeny NP a M1, liší se však navzájem povahou povrchových glykoproteinů. Až dosud bylo identifikováno patnáct různých typů
hemaglutininů, které se označují pořadovými čísly H1 – H15 a devět různých typů 24
neuraminidázy, N1 – N9. Antigenní typ, který je pro příslušný kmen charakteristický, se vytvoří kombinací subtypu hemaglutininu se subtypem neuraminidázy.
Kompletním rezervoárem virů chřipky je vodní ptactvo. Ve vodním ptactvu se
nacházejí všechny antigenní subtypy H a N viru influenzy A, a to ve všech kombinacích.
Pravděpodobně se virus přenáší nepřímo z vodního ptactva na prasata, teprve až v praseti dochází k přeskupování genomových segmentů mezi viry vodního ptactva a lidskými. Lidský virus se může v praseti zkřížit s ptačím za vzniku nového antigenního typu. (viz. Obr. 7)
Obr. 7: Cirkulace antigenů H a N mezi živočišnými druhy (9)
6.3. Antigenní posun (1, 2)
I v období mezi vznikem nových pandemických subtypů dochází plynule
k menším antigenním změnám převládajících subtypů virů chřipky. Tyto změny se
označují jako antigenní posun. Antigenním posunem se rozumí postupné hromadění
drobných mutací obvykle charakteru nukleotidových substitucí ve virovém genomu, které 25
vedou jen k nepatrně pozměněným antigenním vlastnostem viru, takže jsou imunitním
systémem hostitele jen slabě rozpoznávány. Antigenní posun umožňuje reinfekci osob, které již nákazu daným subtypem prodělaly.
Téměř každá nová pandemie chřipky byla vyvolána virem influenzy A vzniklým
přeskupením jeho genomových segmentů. V Tabulce č. 4 jsou uvedeny pandemie chřipky, které se vyskytly v lidské populaci od roku 1918.
Tabulka 4: Chřipkové pandemie v lidské populaci (1) Označení
Španělská chřipka
Asijská
chřipka Hong Kong
Ruská
chřipka
Antigenní typ
H1N1
Vznik
Antigenní posun
Pandemie v roce 1918/1919 způsobila smrt 20 milionů lidí. Virus byl přenesen do
H2N2
H3N2
H1N1
Poznámka
Evropy
Kansasu
americkými
vojáky
z
Antigenní zvrat, kmen V roce 1957 nahrazuje kmen H2N2 H1N1 získal nové alely kmen H1N1 z ptačího rezervoáru
Antigenní zvrat, nové Nastupuje alely
opět
získány pandemií
v roce
1968
rozsáhlou
z ptačího rezervoáru
Pravděpodobný únik z Nastupuje v roce 1977, od té doby laboratoře
působí v lidské populaci kmeny H3N2 i H1N1
26
7. Závěr
Viry jsou nebuněčné nukleoproteinové částice o velikostech desítek až stovek nm,
schopné rozmnožování pouze v hostitelských buňkách. Viry mají genetický kód pro vlastní replikaci, avšak chybí jim translační aparát, proto jsou zcela závislé na translačním
systému hostitelských buněk. Virová částice, která je schopna infikovat hostitelskou buňku, se nazývá virion. Viry patří mezi intracelulární parazity a způsobují různorodá onemocnění rostlin a živočichů.
Genom virů je tvořen vždy jedním typem nukleové kyseliny, buď DNA nebo
RNA (mohou být dvouřetězcové nebo jednořetězcové, lineární či cirkulární), podle toho rozlišujeme DNA-viry a RNA-viry. Podle typu hostitele dělíme viry na živočišné a
rostlinné. Dále rozlišujeme viry obalené či neobalené, podle toho, zda mají kolem svého kapsidu lipoproteinový obal.
Má bakalářská práce byla zaměřena na viry chřipky. Viry chřipky spadají do
oddělení Orthomyxoviridae (Otromyxoviry), kde rozlišujeme dva rody, rod Influenza virus A, B a rod Influenza virus C. Influenza viry způsobují chřipku, což je akutní infekční onemocnění dýchacího ústrojí. Viry chřipky se přenášejí kapénkovou infekcí.
Ortomyxoviry patří mezi tzv. obalené živočišné RNA-viry. Jejich genom tvoří
lineární jednořetězcová negativní segmentovaná RNA (-ssRNA viry). Jednotlivé segmenty RNA tvoří spolu s nukleoproteiny (NP) a RNA-polymerázou (PB1, PB2, PA resp. P1, P2, P3) tzv. virový ribonukleoproteinový komplex (vRNP). vRNP je uložen
v nukleokapsidu ještě s nestrukturálními proteiny (NS1, NS2). Nukleokapsid je obalen
dvojvrstevnou lipidovou membránou hostitelského původu. Mezi tři základní typy membránových proteinů patří hemaglutininy (HA, HEF), neuraminidáza (NA) a M2
protein (M-protein). Na vnitřní straně této dvojvrstvy jsou molekuly matricového typu (M-proteiny, M1), které vážou obal k nukleokapsidu. Na vnější straně obalu ční výběžky tvořené biologicky aktivními glykoproteiny.
Z hlediska schopnosti viru infikovat hostitelskou buňku je determinujícím
činitelem struktura povrchových antigenů viru a struktura receptoru hostitelské buňky. Povrchovými antigeny virů chřipky jsou hemaglutinin a neuraminidáza. Kombinace
subtypu hemaglutininu (H1 – H15) se subtypem neuraminidázy (N1 – N9) podmiňují 27
rozlišování antigenních variant. Mezi vnitřní antigeny patří nukleoprotein (NP) a matricový protein M1. Na identitě vnitřních antigenů je založeno členění rodů na Influenza virus A, B či C.
Prvním a nezbytným krokem infekce buňky virem je adsorpce (přilnutí) viru na
hostitelskou buňku. Adsorpce chřipkových virů je zprostředkována specifickou vazbou hemaglutininu na kyselinu sialovou (SA), která je obsažena v glykoproteinech
specifických receptorů hostitelské buňky. Dvěma majoritními druhy SA jsou 5-Nacetylneuraminová kyselina (Neu5Ac) a 5-N-glykolylneuraminová kyselina (Neu5Gc).
Hemaglutininy rozpoznávají SA navázanou na povrch hostitelských buněk vazbou α(2,3) nebo α(2,6).
Po úspěšné adsorpci dochází k penetraci (proniknutí) virové částice do hostitelské
buňky. Viry chřipky pronikají do buňky endocytózou ve formě tzv. endozomů.
Hemaglutinin, po konformační změně způsobené nízkým pH endozomu, zprostředkuje fůzi membránového obalu viru s endozomální membránou. Virový nukleoproteinový
komplex (vRNP) se tak dostane do cytozolu hostitelské buňky, následuje transport vRNP do jádra, kde dochází k expresi virového genomu.
Při transkripci negativního řetězce (-ss RNA) se syntetizuje (+ss RNA), jež
vystupuje z části jako mRNA a z části je přepisována do (-ss RNA) začleněné do nově
vznikajících virových částic. U ortomyxovirů se tedy uskutečňuje první transkripce, která probíhá na segmentech negativní genomové RNA ještě před její replikací v hostitelské buňce a druhá transkripce probíhající na segmentech negativní genomové RNA vzniklých
jejich replikací v hostitelské buňce. Klíčovým enzymem je RNA-dependentní-RNA-
polymeraza. Syntézu mRNA může začít až poté, co je mRNA modifikována čepičkou (cap, m7G). RNA-dependentní polymerázy využívá čepičku výhradně od mRNA
hostitelské buňky, štěpí ji enzymem endonukleázou (endonukleáza je součástí polymerázového komplexu). Následuje translace.
Během vlastní reprodukce viru dochází k syntéze virových bílkovin, k replikaci
virového genomu, k tvorbě nových virionů, jejich dozrávání nebo-li maturaci a uvolňování z buňky ve formě pupenů.
Viry chřipky se vyznačují oproti ostatním virům značnou proměnlivostí. Příčinou
proměnlivosti chřipky je segmentovaný genom a separátní translace jeho částí, což usnadňuje reasortaci segmentů RNA různých kmenů téhož druhu, infikují-li současně stejnou hostitelskou buňku. Vznikají tak nové kmeny chřipky s novým antigenním typem,
který není lidská populace schopna imunologicky rozeznat. Příčinou změny antigenních 28
vlastností je buď antigenní zvrat nebo antigenní posun. Antigenním zvratem se rozumí
náhlá a zásadní změna v antigenní vlastnostech viru, která je výsledkem přeskupení mezi
segmentovanými genomy virů stejného druhu lišících se v antigenních vlastnostech. Antigenní zvrat může způsobit epidemii, výjimečně i pandemii chřipky. Antigenním
posunem se rozumí postupné hromadění drobných mutací, obvykle charakteru nukleotidových substitucí, ve virovém genomu. Antigenní posun umožňuje reinfekci osob, které již nákazu daným subtypem prodělaly.
29
8. Zkratky BM2, CM2…..M-proteiny, transmembránové proteiny virionu Gal…..D-galaktóza (D-galactose) Glc…..D-glukóza (D-glucose)
GlcNAc…..N-acetyl-D-glukozamin (N-acetyl-D-glucosamine) HA …..Hemaglutinin (Haemagglutinin)
HEF…..Hemaglutinin (Haemagglutinin-esterase-fusion protein) M1,M2…..M-proteiny (Matric protein 1, Matric protein 2) NA…..Neuraminidáza (Neuraminidase acid)
NeuNAc…..N-acetylneuraminová kyselina (N-acetylneuraminic acid) NP….. Nukleoprotein (Nucleoprotein)
NS1, NS2….. nestrukturální proteiny (Nonstructural protein 1, nonstructural protein 2) PAK…..Proteinkináza A (protein kinase A) PB1, PB2,
PA…..proteiny RNA-dependentní-RNA-polymerázy (Polymerase basic
protein 1, polymerase basic protein 2) SA…..Kyselina sialová (Sialic acid)
VAPs…. virové povrchové proteiny (viral attachment proteins)
vRNP…..virový ribonukleoproteinový komplex (Viral ribonucleoprotein komplex)
30
9. Literatura
1. S. Rosypal (2002). Úvod do molekulární biologie, díl třetí. Brno
2. M. Bednář, V. Fraňková, J. Schindler, A. Souček, J. Vávra (1999). Lékařská mikrobiologie. Praha:Marvil
3. M. Němec, D. Horáková (1999). Základy mikrobiologie. Brno
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/00.046.0.01.htm
5. M. Lakadamyali, M. j. Rust, X. Zhyny (2004). Endocytosis of influenza viruses. Microbes and Infections. 6: 929-936
6. C. R. Parrish, Y. Kawaoka (2005). The Origins of New Pandemic Viruses: The Acquisition of New Host Ranges by Canine Parvovirus and Influenza A Viruses.
The Annual Review of Mikrobiology. 59: 553-586
7. P. J. Klasse, R. Bron, M. Marsh (1998). Mechanisms of enveloped virus entry into animals cells. Advanced Drug Delivery Reviews. 34: 65 – 91
8. http://chemistry.umeche.maine.edu/CHY431/Proteins11.html
9. K. G. Nicholson, J. M. Wood, M. Zamlon (2003). Influenza. The Lancet, 362:1733-1732
10. Y. Suzuki. (2005). Sialobiology of Influenza Molecular Mechanism of Host Range Variation fo Influenza Viruses. Biological and pharmaceutical bulletin, 28(3): 399408
11. W.I. Weis (1997). Cell-surface carbohydrate recognition by animal and viral lectins. Current Opininon in Structural Biology. 7: 624-630
12. H. Masuda, T. Suzuki, Y. Sugiyama, G. Horrike, K. Murakami, D.
Miyamoto, K. I. P. J. Hádači, T. Ito, H. Kida, M. Kiso, K. Fukunaga, M.
Obuchu, T. Toyoda, A. Ishihama, Y. kawaoka, Y. Suzuki (1999). Substitution of amino acid residue in influenza A virus hemagglutinin affects recognition of
sialyl-oligosacharides containing N-Glycolylneuraminic acid. FEBS Letters, 464: 71-74
31
