MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav biochemie
,,Mechanismy degradace látek narušujících hormonální rovnováhu organismů“
Bakalářská práce
Brno, květen 2010
Nikol Blokešová 1.
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci Mechanismy degradace látek narušujících hormonální rovnováhu organismů vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Barbory Jedličkové. Prohlašuji, ţe citace pouţitých pramenů je úplná a ţe jsem v práci neporušila autorská práva (ve smyslu zákona č. 121/2000 Sb. O právu autorském a o právech souvisejících s právem autorským). V Brně dne 14. 5. 2010
……...…………………… Nikol Blokešová
2.
Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala především Mgr. Barboře Jedličkové za odbornou pomoc při tvorbě této práce a čas, který mi věnovala. Poděkování jí patří také za poskytnutí odborných informací, všestrannou pomoc a věcné připomínky. 3.
Obsah 1. Teoretická část ....................................................................................................................6 1.1 Úvod............................................................................................................................. 6 1.2 Známé EDCs ................................................................................................................ 7 1.3 Výskyt a stanovování EDCs ........................................................................................ 8 1.4 Ekologická rizika ......................................................................................................... 9 1.5 Základní informace o steroidních estrogenech .......................................................... 10 1.6 Chemická struktura a biosyntéza přirozených estrogenů .......................................... 11 1.7 Fyzikálně- chemické vlastnosti steroidních estrogenů .............................................. 13 1.8 Osud a mechanismy degradace steroidních hormonů................................................ 13 1.8.1 Čistírny odpadních vod ....................................................................................... 16 1.8.2 Účinnost odstraňování estrogenů na ČOV.......................................................... 18 1.8.3 Enviromentální faktory a provozní podmínky ČOV .......................................... 19 1.8.4 Biodegradace ...................................................................................................... 20 1.8.5 Sorpce ................................................................................................................. 21 1.8.6 Fotodegradace ..................................................................................................... 23 1.9 Cíl práce ..................................................................................................................... 24 2. Materiál a metody .............................................................................................................25 2.1 Chemikálie a spotřební materiál ................................................................................ 25 2.2 Přístroje ...................................................................................................................... 25 2.3 Pouţitý organismus a princip metody ........................................................................ 25 2.4 Metody ....................................................................................................................... 26 2.4.1 Příprava vzorků ................................................................................................... 26 2.4.2 Příprava médií ..................................................................................................... 28 2.4.3 Příprava agarových ploten .................................................................................. 28 2.4.4 Zahájení kultivace z glycerolové zmrzlé kultury ................................................ 29 2.4.5 Nárůst kultur v roztoku média ............................................................................ 29 2.4.6 Testování vzorků................................................................................................. 30 3. Výsledky a diskuze ...........................................................................................................31 4. Závěr .................................................................................................................................36 5. Souhrn ...............................................................................................................................37 6. Summary ...........................................................................................................................38 7. Seznam pouţité literatury .................................................................................................39
4.
Seznam použitých zkratek: AC
aktivní uhlí
AOB
bakterie oxidující amoniak
BPA
bisfenol A
ČOV
čistírna odpadních vod
E1
estron
E2
17ß-estradiol
E3
estriol
ED
narušení hormonální rovnováhy organismů (Endocrine Disruption)
EDCs
látky narušující hormonální rovnováhu organismů (Endocrine Disruptors)
EE2
17α-ethinylestradiol
ER
estrogenní receptor
HRT
hydraulický retenční čas
Kd
distribuční koeficient voda-aktivovaný kal
Kow
rozdělovací koeficient oktanol-voda
OD
optická hustota
RLU
relativní jednotka luminescence
SRT
retenční čas kalu
5.
1. Teoretická část 1.1 Úvod Díky rozvoji průmyslu a celkovému populačnímu růstu stále narůstá mnoţství chemických látek uvolňovaných do ţivotního prostředí, které mohou mít dopad na jeho kvalitu. Řada z těchto látek má schopnost narušovat endokrinní systém organismů a tím negativně ovlivnit jejich celkovou homeostázu, rozmnoţování nebo chování a řadí se proto mezi různorodou skupinu tzv. endokrinních disruptorů (EDCs). Existence těchto látek v ţivotním prostředí je známa jiţ přibliţně 100 let, přesto se tyto látky staly předmětem studia převáţně v posledních 20 letech a to díky narůstajícím počtům pozorovaných případů narušení endokrinního systému (endokrinní disrupce ED) u různých organismů.
Nejvíce známých případů ED je spjato s vodním prostředím. Na různých místech po celém světě byl zjištěn výskyt hermafroditních jedinců v populacích ryb ţijících v blízkosti čistíren odpadních vod (ČOV). Laboratorní experimenty a terénní studie prokázaly pravděpodobnou souvislost ED nejen s feminizací samců ryb, ale také s poklesem spermií, abnormálním zvětšením prostaty, zmenšenými penisy aligátorů na Floridě, a v neposlední řadě s imposexem měkkýšů a maskulinizací racků. (Sumpter a Johnson 2005)
EDCs účinkují různými mechanismy a narušují funkci různých hormonů. Závaţné jsou především účinky na pohlavní hormony (důleţitá role ve vývoji organismů a jejich pohlavních orgánů, řízení reprodukce). Známými EDCs působícími negativně na reprodukci sladkovodních ţivočichů jsou především steroidní estrogeny působící např. feminizaci samců ryb. Pro zvýšení účinnosti jejich odstranění z vodního prostředí je nutné znát jejich osud v ŢP, proto jsem se v BP zaměřila především na osud těchto látek .
6.
1.2 Známé EDCs Látky narušující hormonální systém organismů jsou definovány jako exogenní látky, které narušují syntézu, sekreci, transport, vazbu nebo odstranění přirozených hormonů v těle, které jsou odpovědné za udrţování homeostázy, reprodukci, rozvoj a chování. Takovými ,,rušiteli― jsou pesticidy (např. DDT, Lindan), některé PCB, ftaláty, BPA, benzotriazoly, zpomalovače hoření, přirozené (Estron, 17β-estradiol) a syntetické hormony (17α-ethinylestradiol), farmaka (diklofenak, diazepam, analgetika) a zboţí denní potřeby (Kuster a kol. 2004, La Farré a kol. 2008). Přehled vybraných EDCs, jejich pouţití a strukturní vzorce jsou uvedeny v tabulce 1.
7.
Tab. 1: Chemická struktura a pouţití vybraných EDCs
EDCs
Strukturní vzorec
Pouţití
DDT
- insekticid
Lindan
- chlorovaný organický pesticid
např.např
PCB
- aditiva v barvách, lacích, hydraulických zařízeních či teplonosných médiích - byly náplní transformátorů a kondenzátorů
Ftaláty
- změkčovadla plastů, v kosmetice, jako insekticidy či adheziva - pouţívají se také v barvách
Bisfenol A
- výroba PET lahví, kojeneckých lahví, plastových příborů - ve stomatologii,stavebnictví, elektronice, medicíně
1.3 Výskyt a stanovování EDCs EDCs byly nalezeny ve stojících odpadních vodách a povrchových vodách, sedimentech, podzemních vodách, a dokonce i v pitné vodě. Zdroji EDCs jsou domácnosti, nemocnice, průmysl a déšť, který sbírá znečišťující látky ze vzduchu a povrchů před vstupem do kanalizace. (Press-Kristensen a kol. 2006, Urase a Kikuta 2005)
S příchodem a dostupností nejnovějších analytických metod byla prokázána přítomnost velkého počtu farmak a zboţí denní spotřeby (Personal Care Products). 8.
Výzkum financovaný UK agenturou pro ţivotní prostředí zjistil v anglických řekách nízké koncentrace steroidních hormonů. Studii byly podrobeny přírodní ovariální steroidy 17βestradiol (E2), estron (E3) a syntetický steroid 17α-ethinylestradiol (EE2). Přírodní estrogeny byly přítomny ve všech analyzovaných vzorcích odpadních vod v rozmezí 1,4 aţ 76 ng/1. Ethinylestradiol byl zjištěn u 3 ze 7 analyzovaných odpadních vod na poměrně nízké hladině (0,2 - 7 ng/l). Tyto komponenty byly jedinými významnými estrogenními chemickými látkami měřenými v testovaných odpadních vodách, ale výsledky nevylučují další slabě estrogenní polutanty. (Alcock a kol. 2009)
Analytické metody pro detekci organických kontaminantů se neustále zdokonalují a to především díky instrumentaci MS, která usnadňuje citlivé, selektivní a spolehlivé určení.
Přesto je stále nedostatek informací o produktech transformace v
čistírnách odpadních vod a ţivotního prostředí.
Další moţností stanovování hladin EDCs ve vzorcích z ţivotního prostředí jsou biologické metody, především in vitro testy. Jedná se o buňky, keré jsou citlivé na přítomnost EDCs a jsou geneticky modifikovány tak, ţe při styku buněk s EDCs je spuštěn tzv. reporterový gen, který umoţní měřit mnoţství EDCs ve vzorcích. Výhodou těchto testů je kromě niţší ceny v porovnání s chemickou analýzou také fakt, ţe buňky reagují na komplexní směsi látek a ne pouze na vybrané polutanty. Dá se tak sledovat celkový potenciál směsí stimulovat např. estrogenní receptor. Bliţšší informace o jednom z in vitro testů naleznete v praktické části této práce.
1.4 Ekologická rizika Při hodnocení ekologických rizik jsou obvykle pouţívána toxikologická data pocházející ze studií jednotlivých látek. Organismy jsou ale ve vodním prostředí jen zřídka vystaveny působení jediného např. estrogenního polutantu. Místo toho jsou obvykle vystaveny současně mnoha estrogenním sloučeninám (tj. směsi estrogenních chemických látek) různé potence. Současné znalosti o této důleţité otázce jsou poměrně chudé, zejména pro směsi obsahující nízké koncentrace těchto látek.
Přestoţe neexistují ucelené informace o dopadu EDCs na lidské zdraví a ţivotní prostředí, autoři všech článků citovaných v bakalářské práci se shodují, ţe jejich 9.
přítomnost v ţivotním prostředí je důvodem k obavám. Takové sloučeniny se velmi liší ve své chemické struktuře a charakteru. Jednotlivé EDCs se navíc liší svým potenciálem narušovat endokrinní systém organismů. Např. 17α-ethinylestradiol účinkuje jiţ v koncentracích v řádech jednotek ng/l, zatímco bisphenol A účinkuje v řádech nejméně 1000 krát vyšších. (Urase a Kikuta 2005, Hashimoto a Murakami 2007)
Moţnost expozice vodních volně ţijících ţivočichů především steroidními estrogeny je vysoká z důvodu intenzivního uţívání těchto látek ve farmaceutickém i jiném průmyslu a stabilitě estrogenů vůči degradaci, která je dána především velmi nízkými koncentracemi, ve kterých jsou tyto látky stále účinné (řádově ng/l). Tyto estrogeny jsou vylučovány převáţně močí (lidskou i zvířecí) do odpadních vod a zásadní roli v jejich odstranění z ţivotního prostředí proto hrají zaprvé ČOV a za druhé podobné procesy probíhající samovolně v nečištěných vodách. V další části bakalářské práce se proto zabývám jak steroidními estrogeny, tak popisem procesů, které vedou k jejich odstranění z vodního prostředí.
1.5 Základní informace o steroidních estrogenech Vývoj a údrţba reprodukčních tkání v těle je z velké části řízena steroidními hormony. Vedle regulace reprodukční soustavy se také podílejí na řízení růstu, hustoty kostí a metabolismu. E2 je hlavní intracelulární lidský estrogen a je podstatně aktivnější neţ jeho metabolity, E1 a estriol (E3) (Obr. 1). EE2 je hlavní estrogenní součástí mnoha perorálních antikoncepcí a také součástí menopauzální léčby. EE2 je silný induktor vaječného proteinu vitellogeninu u samců ryb a představuje tak značné riziko pro endrokrinní systémy vodních druhů. (Kwak a kol. 2001)
10.
Obr. 1: Steroidní estrogeny- strukturní vzorce
1.6 Chemická struktura a biosyntéza přirozených estrogenů Steroidní hormony jsou skupinou biologicky aktivních sloučenin, které jsou syntetizovány z cholesterolu a mají ve své struktuře cyklopentano-perhydrofenantrenovou strukturu.
Obr. 2: Strukturní vzorec cholesterolu Sumární vzorec cholesterolu je C27H46O a molekulová hmotnost je 386.654 g/mol.
Syntéza steroidních hormonů je řízena činností několika vysoce selektivních enzymů, řadou steroidních dehydrogenáz a reduktáz. De novo syntéza všech steroidních hormonů začíná přeměnou cholesterolu na pregnenolon (štěpení bočního řetězce cholesterolu). Pregnenolon pak můţe být převeden na 17α-hydroxypregnenolon pomocí 11.
CYP 17A1 nebo za účasti 3β-hydroxysteroid dehydrogenázy (3β-HSD) na progesteron. Pregnenolon a progesteron tvoří prekursory pro všechny ostatní steroidní hormony. (Albergotti a kol. 2009)
Přirozené estrogeny (především estradiol) jsou u ţen syntetizovány v Graafových folikulech ovárií, u muţů v malé míře v testes. Aldosteron a testosteron se šíří do sousedních granulózních buněk, kde je testosteron převeden na estradiol. (Obr. 3) (Mindnich a kol. 2004)
Obr. 3: Biosyntéza přirozených estrogenů. Prekurzorem je cholesterol s cyklopentano perhydrofenantrenovou strukturou (Olson a kol. 2007)
12.
1.7 Fyzikálně- chemické vlastnosti steroidních estrogenů Přírodní estrogenní steroidy E1, E2 a E3 mají rozpustnost přibliţně 13 mg/l, zatímco rozpustnost syntetického steroidu EE2 je mnohem niţší (4,8 mg/l). Všechny tyto -10
steroidy mají velmi nízký tlak páry v rozmezí 2.3 x 10
– 6.7 x 10-15 mm Hg, coţ
naznačuje nízkou volatilitu těchto sloučenin. Hodnoty rozdělovacího koeficientu oktanolvoda (Kow) jsou 2,81 pro E3, 3,43 a 3,94 pro E1 a E2, syntetické steroidy mají hodnoty log Kow vyšší (4,15 pro EE2). Z fyzikálně-chemických vlastností těchto steroidů (Tab. 2) je patrné, ţe estrogeny jsou hydrofobní organické sloučeniny a očekává se, ţe významným faktorem při sniţování jejich koncentrace z vodné fáze bude sorpce v půdě nebo na sedimenty. (Ying a kol. 2002)
Tab. 2: Fyzikálně-chemické vlastnosti steroidních estrogenů Chemický název
Molekulová Rozpustnost hmotnost ve vodě (mg/l)
log Kow1
Tlak páry (mm Hg)
Estron
270, 4
13
3.43
2,3 x 10-10
17 ß-Estradiol
272,4
13
3.94
2,3 x 10-10
Estriol
288,4
13
2.81
6,7 x 10-10
17 α-Ethinylestradiol
296,4
4,8
4.15
7,5 x 10-15
1
Rozdělovací koeficient oktanol- voda
1.8 Osud a mechanismy degradace steroidních hormonů Je třeba říci, ţe vliv estrogenních látek na vodní organismy a potenciální hrozba kontaminace zásob pitné vody nejsou určeny pouze dobou ţivota a biologickou aktivitou steroidních hormonů, ale také perzistencí a biologickou aktivitou produktů jejich degradace. Pouhá zmizení původní látky nelze brát za synonymum kompletní degradace. Pouze sledování metabolitů nebo konečných produktů degradace můţe poskytnout informace o stupni biotransformace. Za účelem zjištění skutečné biologické rozloţitelnosti jsou nezbytné podrobné degradační studie. 13.
Mnohé studie zabývající se eliminací EDCs se věnují tématu pitné vody. Přírodní estrogeny a syntetický estrogen (EE2) jsou vylučovány do odpadních vod člověkem a savci, zejména prostřednictvím jejich moči. Estrogeny podstupují v těle různé transformace (především v játrech). Často před konečnou konjugací s kyselinou glukuronovou nebo sírovou dochází k jejich oxidaci, hydroxylaci, deoxygenaci a denaturaci. E2 je rychle oxidován na E1, který můţe být dále transformován na E3, hlavní produkt vylučování. V moči a výkalech mohou být přítomny i další polární metabolity, jako jsou 16-hydroxyestron, 16-ketoestron nebo 16-epiestriol. E2 je z těla odstraněn především jako konjugát. (Ying a kol. 2002)
Tyto glukuronované a sulfátované konjugáty mají velmi nízký estrogenní potenciál, ale mohou být během transportu (ve splaškových vodách) a zpracování na čistírnách odpadních vod hydrolyzovány zpět na volné aktivní hormony (Pedrouzo a kol. 2009). Molekulární struktura steroidních konjugátů je uvedena na Obr. 4.
Obr. 4: Molekulární struktura estrogenních konjugátů (Liu a kol. 2009)
Kontaminující látky nebo jejich metabolity se mohou v důsledku nedokonalého odstranění na čistírnách odpadních vod dostat do podzemních vod (v důsledku vyluhování) nebo povrchových vod v okolí, coţ můţe vést ke kontaminaci zásob pitné vody (Pedrouzo a kol. 2009). Naměřené koncentrace steroidních estrogenů v odpadních vodách a přilehlých řekách se značně liší. V povrchových vodách se vyskytují obvykle v nízkých
14.
koncentracích (v řádech ng/l).
Steroidní estrogeny však mohou mít i přes nízkou
koncentraci nepříznivé vlivy na endokrinní systém vodních ţivočichů.
Tabata a kol. (2001) provedli rozsáhlý výzkum estrogenních steroidů ve 109 japonských řekách. E2 byl přítomen ve 222 z 256 vzorků (letní období) s průměrnou koncentrací 2,1 ng/l a ve 189 ze 261 vzorků získaných v podzimním období. Průměrná koncentrace činila 1,8 ng/l. E1 byl zjištěn u 7 z 11 nizozemských řek a sladkovodní vzorky obsahovaly koncentraci 0,3 ng/l, zatímco E2 a EE2 byly detekovány pouze ve 4 a 3 z 11 vzorků, přičemţ se většina koncentrací pohybovala pod limitem 1 ng/l.
Distribuce estrogenních steroidů v ţivotním prostředí (schéma viz Obr. 5) jsou určovány jejich fyzikálně-chemickými vlastnostmi a specifickými podmínkami ţivotního prostředí. Neiontové sloučeniny s nízkým log Kow upřednostňují vstup do vodné fáze, kde mohou být rozptýleny, ředí se, aktivují a někdy fotooxidují. Lipofilní kontaminanty s vyšším log Kow budou přitahovány částicemi obohacenými lipidy, dále přepravovány ve vodním prostředí a uloţeny v sedimentech.
Obr. 5: Disribuce steroidních estrogenů v ŢP
15.
Přestoţe čistírny odpadních vod nejsou předmětem BP, autorka se domnívá, ţe pro úplnost práce by bylo vhodné uvést alespoň základní informace o procesech, které na nich probíhají. Popis jednotlivých stupňů čištění jsem převzala z literární rešerše Mgr. Barbory Jedličkové.
1.8.1 Čistírny odpadních vod Existuje mnoho typů čistíren odpadních vod, které mohou zahrnovat mechanické, biologické a chemické (terciální) čištění. Nejčastěji se vyskytujícím typem je v ČR mechanicko-biologická čistírna odpadních vod. (Obr. 6)
Mechanické (primární čištění) Odpadní vody přiváděné na ČOV ze stokové sítě obsahující v podstatě pevné látky, organickou hmotu a ţiviny. Fáze primárního čištění slouţí k odstranění nejhrubších nerozpuštěných látek (například dlaţební kostky, písek, kameny, kusy cihel atd). Součástí zaţízení bývají česle, které odstraní hrubé plovoucí nečistoty (Roda a kol. 2000). Na malých čistírnách odpadních vod se jako alternativa česlí pouţívají buď síta nebo desintegrátory. Cílem lapáku písku, často v kombinaci s lapákem tuků, je oddělení minerálních suspenzí (písek) od organických nerozpuštěných látek. Separace je pak zaloţena na rozdílných hustotách anorganických a organických látek. Odpadní voda pokračuje do usazovacích nádrţí, kde se usazuje tzv. primární kal, který je dál zpracováván v tzv. kalovém hospodářství.
Biologické (sekundární) čištění Biologické čištění probíhá v biologickém reaktoru. Zde dochází k degradaci naprosté většiny organických látek prostřednictvím mikroorganismů. Aktivovaný kal je v biologickém reaktoru kultivován buď jako suspenze (tzv. aktivační systémy) nebo na pevném nosiči (tzv. biofilmové reaktory). Biologické čištění probíhá za aerobních nebo anaerobních podmínek.
Principem biologického aerobního stupně je vyuţití aerobních bakterií, které procesem mineralizace (proces aerobní respirace) odbourávají uhlíkaté organické látky za 16.
vzniku CO2 a vody. V této oblasti probíhá vedle oxidace organických látek i nitrifikace (přeměna amonného iontu na dusičnany). Takto zpracovaná voda putuje do dosazovacích nádrţí, kde je aktivovaný kal spojen do větších celků a spontánně usazován. Aktivovaný kal je následně vyuţit v anaerobním stupni (přebytečný aktivovaný kal), nebo se z části vrací zpět do aktivačních nádrţí.
Anaerobní stupeň se vyskytuje především u větších ČOV. Přebytečný aktivovaný kal slouţí jako zdroj ţivin pro anaerobní bakterie, které produkují různé plyny. Některé biologické nádrţe mají anoxické prostředí s cílem podpořit denitrifikaci, coţ můţe hrát významnou roli v odstranění stopových kontaminantů jako jsou steroidní estrogeny.
Terciární čištění Terciární čištění slouţí k dočištění odpadních vod, především k odstranění fosforu, nerozpuštěných látek a k hygienizaci vody. Zahrnuje procesy jako je chlorování, ultrafialová (UV) fotolýza, ozonizace, adsorpce na aktivní uhlí a membránové filtrace.
0br. 6: Blokové schéma čistírny odpadních vod s kalovým hospodářstvím 17.
1.8.2 Účinnost odstraňování estrogenů na ČOV Jen nízká účinnost odstranění steroidních estrogenů byla zaznamenána na ČOV, které vyuţívají pouze primární čištění.
Významnou roli v odstranění estrogenů na ČOV hrají biodegradační procesy v sekundárním čištění odpadních vod. Hashimoto a Murakami (2007) zkoumali odstranění E1, E2 a EE2 ze vzorků odebraných ze 4 čistíren odpadních vod v Japonsku. Všechny ČOV byly určeny především ke zpracování odpadních vod z domácností. Konečná koncentrace E2 a E1 ve vodné fázi a fázi kalu oproti původní koncentraci výrazně poklesla.
Halifax Harbour, největší námořní přístav nacházející se v Kanadě je místem, kde je kaţdodenně zpracováno 180 milionů odpadní vody z domácností a průmyslu. V posledních deseti letech obec investovala miliony dolarů na výstavbu čistíren odpadních vod. Pro budoucí srovnání byly před dokončením výstavby čistíren odpadních vod započaty studie zaměřené na schopnost místních mikrobiálních společenstev biologicky rozloţit EDCs. Halifax Harbour představuje jedinečné místo ke studiu EDCs. Vzorky jsou reprezentativní a to díky zvýšené koncentraci EDCs vypouštěných z průmyslu a domácností.
Zkoumané látky představovaly BPA, syntetické změkčovadlo běţně pouţívané v polykarbonátech, přírodní látku E2 a farmaceutický produkt EE2. Ve všech studiích byl ze tří sloučenin nejrychleji degradován E2. BPA a EE2 byly vůči biodegradaci odolnější. Vyšší míra rozkladu přirozeného hormonu ve srovnání se dvěma syntetickými sloučeninami je pravděpodobně způsobena odlišnou chemickou strukturou. (Robinson a Hellou 2009)
Protoţe biodegradace zahrnuje enzymatické reakce specifické pro chemické struktury, biologická rozloţitelnost steroidních estrogenů s různými strukturami se bude tedy lišit a "maří tak úsilí dodrţovat obecné trendy". Antropogenní sloučeniny mají často substituenty a strukturální vlastnosti, které se liší od přírodních produktů a mikroorganismy nemusí mít vyvinuty enzymy, které jsou schopny tyto chemické struktury odstranit (Robinson a Hellou 2009). Weber a kol. (2005) naznačují, ţe perzistence EE2 je způsobena ethinyl skupinou v 17- pozici syntetického estrogenu, která blokuje potenciální vznik 18.
ketonu a sféricky komplikuje přístup k hydroxylové skupině. Vzhledem k perzistenci některých steroidů, zvláště EE2 vůči mikrobiální transformaci je nutné identifikovat mikroorganismy, které jsou schopny tyto struktury odstranit nebo by vedly ke ztrátě estrogenní aktivity.
Shi a kol. (2004) prokázal souvislost mezi bakterií oxidující amoniak (AOB) a biologickou rozloţitelností přírodních a syntetických estrogenů, včetně EE2. Přidáním allylthiourea (inhibitor oxidace amoniaku) se utlumil růst AOB a výrazně se sníţila účinnost aktivovaného kalu redukovat estrogeny. EE2-OH jako metabolit pak poskytl důkaz o zapojení amoniak monooxygenasy do transformace EE2. Úloha enzymu byla prokázána in vitro, kdy byl degradován EE2 v přítomnosti kultury obsahující amoniak monooxygenasu.
Studie prováděná Haiyan a kol. (2007) navrhuje cestu rozkladu EE2 prostřednictvím Sphingobacterium sp., pomocí kterého se syntetický estrogen přímo oxiduje na E1 s následným štěpením B-kruhu a A-kruhu na nenasycené kyseliny, které jsou dále mineralizovány na CO2 a vodu.
1.8.3 Enviromentální faktory a provozní podmínky ČOV Denní zatíţení ČOV estrogenními steroidy do značné míry závisí na zdroji odpadní vody. Odpadní vody z obytných, průmyslových a lékařských zdrojů mohou mít naprosto odlišné skladby. Mnoţství vyloučených steroidů závisí na pohlaví, rase, hormonálním stavu, fázi menstruace, uţívání antikoncepce a těhotenství.
Účinnost odstraňování steroidních estrogenů na ČOV je ovlivněna mnoha faktory a provozními podmínkami ČOV. Degradace steroidních hormonů je komplexní proces řízený koncentrací substrátu, dostupností ţivin, existencí stabilních mikrobiálních komunit a faktory jako je přítomnost kyslíku, organického uhlíku, teplota atd., které mohou ovlivnit růst i sloţení bakteriálního společenství. Je důleţité studovat vztah mezi těmito faktory a účinností odstranění EDCs (Yoshimoto a kol. 2004).
Czajka a Londry (2006) zkoumali závislost biodegradace E2 a EE2 na přítomnosti kyslíku. Za aerobních podmínek byly pozorovány rychlejší degradace všech 19.
estrogenů, včetně EE2. Ying a kol. (2008) také uvádějí, ţe za aerobních podmínek výrazně klesla koncentrace E2 i EE2. Za anoxických podmínek byl degradován pouze E2 (ztráta E2 byla doprovázena hromaděním E1). Mikroorganismy degradují cílové sloučeniny rychleji v nepřítomnosti snadno biologicky rozloţitelných substrátů jako je glukóza a pepton. Moţným vysvětlením je vyuţití cílových látek jako zdroje energie v nepřítomnosti výše uvedených substrátů.
Je všeobecně známo, ţe celkový rozklad sloučenin je ovlivněn řadou abiotických faktorů a ţe existuje vztah mezi odstraněním estrogenních EDCs a hydraulickým retenčním časem (HRT) a také retenčním časem kalu (SRT). Vysoký SRT umoţňuje obohacení o pomalu rostoucí bakterie a vytvoření pestřejší mikrobiální populace ve srovnání s nízkými hodnotami SRT. Zvýšení HRT zvyšuje dobu kontaktu mezi rozpuštěnými estrogeny a pevnými látkami a zvyšuje tím čas určený pro adsorpci a biodegradaci.
Častým vysvětlením variability ve stejném systému je provozní teplota. Sníţení teploty na ČOV můţe sníţit účinnost čištění, protoţe rychlost metabolismu mikroorganismů se zpomaluje (vyšší koncentrace EDCs v zimě neţ v létě). Ve studii prováděné Layton a kol. (2000) autoři uvádí, ţe změny teploty během procesu významně ovlivnily mineralizaci E2, ale neměly ţádný vliv na rychlost metabolismu EE2.
1.8.4 Biodegradace Procesy, které se účastní degradace steroidních estrogenů v sedimentech, podzemních vodách, odpadních nebo splaškových vodách a čistírnách odpadních vod mohou zahrnovat působení bakterií a mikrobů, a v některých případech i houby a řasy (Cajthmal a kol. 2009)
20.
Působení mikroorganismů ve splaškových vodách Biotickými procesy jsou běţně produkovány látky se zvýšenou polaritou, jejichţ různé fyzikálně-chemické vlastnosti mají za následek odlišné chování v ţivotním prostředí. Vzhledem k přítomnosti mikroorganismů v odpadní vodě mohou být neaktivní konjugáty estrogenních steroidů vyloučených močí štěpeny na aktivní hormony a uvolňovat se tak do ţivotního prostředí.
Ve vodním prostředí je E2 rychle biologicky rozloţen na E1, který je degradován na E3. Syntetický EE2 je vůči degradaci odolnější (aby mohl být účinný jako perorální antikoncepce).
Biodegradace na ČOV Osud steroidních hormonů v procesu čištění odpadních vod je rozhodující faktor kontroly jejich koncentrace ve vodním prostředí. Odstranění steroidních estrogenů z odpadních vod lze řešit konvenčními postupy (např. chemické oxidace a adsorpce na aktivní uhlí), ale tyto procesy mohou mít řadu nevýhod, jako jsou vysoké náklady, časově náročné postupy a vznik toxických derivátů.
Komunální ČOV jsou konstruovány pro efektivní odstranění organických ţivin v koncentracích řádově mg/l. V důsledku toho nejsou konvenční biologické metody určeny k odstranění mikropolutantů tj. látek vyskytujících se v koncentracích v řádech ng-μg/1, jako jsou léky a steroidní estrogeny, proto jsou dosavadní ČOV na nepostačující úrovni. Vědci z celého světa hledají nejefektivnější způsoby odstranění kontaminujících látek s ohledem na finanční zátěţ jednotlivých metod. Cílem je nalézt mechanismus, který by efektivním způsobem odstranil toxické mateřské látky i jejich případné neţádoucí metabolity a zároveň by byl ekonomicky dostupný.
1.8.5 Sorpce Sorpce hydrofobních organických sloučenin v půdách a sedimentech můţe být ovlivněna adsorpcí na uhlíkové materiály. Zvýšení sorpce na částice v kalu v ČOV bude
21.
mít za následek sníţení koncentrace těchto sloučenin ve vypouštěných vodách, a tím se sníţí rizika pro ţivotní prostředí.
Vzhledem k hydrofobnosti steroidních estrogenů se předpokládá, ţe výrazným faktorem při sniţování koncentrace ve vodné fázi bude sorpce na suspendované látky nebo na sedimenty. Obecně platí, ţe čím více jsou chemické látky hydrofobní, tím větší mnoţství se kumuluje v pevné fázi (Press-Kristensen a kol. 2007).
Dle studií Holthaus a kol. (2002) a Lai a kol. (2000) se ukázalo, ţe čas potřebný k dosaţení rovnováhy sorpce steroidů E3, E1 a E2 se
pohyboval mezi 1 dnem (v
sedimentech při ústí řek) a 48 hod v půdě a sorpční kapacita korelovala s velikostí minerálních částic a organické hmoty v půdě a sedimentech. EE2, který má relativně hydrofobní povahu, měl vysokou tendenci adsorpce. Poměrně rozporuplné výsledky lze vysvětlit rozdílnými fyzikálně-chemickými vlastnosti různých EDCs. Kromě toho můţe přítomnost jiné hydrofobní chemikálie v různých prostředích soupeřit s estrogeny o vazebná místa v sorbentu.
Sorpce estrogenů byly zkoumány za různých podmínek (změny pH, teploty, koncentrace přírodní organické hmoty) za účelem objasnění moţných mechanismů degradace. Výsledky ukázaly, ţe pryskyřice odstraní při vysokých hodnotách pH (>10,4) asi 70% estrogenů, které byly převáţně negativně nabité. Pod pH 10,4 (estrogeny byly neutrální) pouze přibliţně 40% estrogenů upřednostnilo sorpci. Tato skutečnost můţe hrát klíčovou roli v hromadění mikropolutantů na polymerní materiály při úpravě vody a představovat tak důleţitý mechanismus degradace (Lai a kol. 2000)
Slanost je další důleţitý parametr, který by mohl mít vliv na osud organických látek. Rozdělovací koeficient sediment-voda (Kd) pro E1 se zvyšuje s rostoucí salinitou (Bowman a kol. 2002). Přítomnost solí v ústí řek také inhibuje mikrobiální společenství, jehoţ schopnost degradovat organické látky se se zvyšující salinitou sniţuje.
22.
Adsorbce aktivním uhlím Bylo prokázáno, ţe aktivní uhlí (AC) je účinným prostředkem k odstranění mnoha nově identifikovaných látek. To můţe být způsobeno vysokou sorpční účinnosti cílových sloučenin na AC na základě jejich hydrofobnosti. (Pikaar a kol. 2006)
Mezi mnoha materiály vyniká nízkými výrobními náklady a bohatými zdroji, jakoţ i specifickými vlastnostmi, jako je např. vysoká mechanická a chemická odolnost, jednoduchost degradace pouţitého materiálu a dobré výměnné vlastnosti iontů. AC je nejčastěji pouţito ve formě prášku nebo ve formě granulí.
Snyder a kol. (2003) hodnotili míru odstranění EDCs pomocí AC. Byly studovány účinky některých základních parametrů ţivotního prostředí, včetně pH, slanosti a přítomnosti huminové kyseliny a povrchové adsorpce. Výsledky ukázaly, ţe adsorpční kapacita AC klesala s nárůstem koncentrace estrogenů a přítomností povrchově aktivní látky a huminové kyseliny.
1.8.6 Fotodegradace Koncentrace steroidních estrogenů v odpadních a povrchových vodách můţe být ovlivněna fotolýzou. Fotolytické reakce jsou často sloţité a vedou k více reakčních produktům. Tyto deriváty mohou být více toxické neţ původní látka nebo si ponechat toxické vlastnosti mateřské sloučeniny.
O účinnosti degradace prostřednictvím přirozeného slunečního záření v mělkých sladkých vodách není doposud mnoho informací. E2 vystavený slunečnímu světlu o vlnové délce 290 a 720 nm prokázal jen nízkou míru fotodegradace (přibliţně 26%). Fotodegradace se významně zvýšila (40 - 50%) v přítomnosti 2,0-15,0 mg/l rozpuštěného organického uhlíku z huminových kyselin. Přestoţe nejvyšší míra fotodegradace byla způsobena slunečním světlem, které obsahuje UV-B (290 - 320 nm), degradace byla také zjištěna působením UV-A (320-400 nm) a viditelným světlem (400 - 720 nm). (Leech a kol. 2009)
23.
1.9 Cíl práce Cílem teoretické části této práce je stručně shrnout známé údaje o výskytu a působení EDCs a jejich účincích na organismy a zpracovat literární přehled pojednávající o způsobech degradace vybraných EDCs. Teoretická část práce bude slouţit jako podklad pro hlubší pochopení moţností úprav na čistírnách odpadních vod, které mají vést ke zvýšení degradace těchto kontaminujících látek.
Cílem praktické části je stanovit estrogenní potenciál vzorků vody z laboratorního pokusu, při kterém byla testována schopnost částic nanoţeleza odstraňovat steroidní estrogeny.
24.
2. Materiál a metody 2.1 Chemikálie a spotřební materiál
Sterilní zkumavky s víčky
Automatická pipeta
Plastové Petriho misky o průměru 10cm
Klička (slouţí k přenosu kvasinkových kultur)
Špičky
Míchačka na mikrodestičky
Yeast nitrogen base w/o amino acids (BD DifcoTM)
Yeast synthetic drop-out mix w/o leu, his, ura, trp (Sigma)
Bakto-Agar (BD Difco)
Histidin (Sigma)
Adenin hemisufát (Sigma)
Leucin (Sigma)
Tryptofan (Sigma)
40% roztok glukosy
D-luciferin (Bio Thema)
Citrát trissodný
Kyselina citrónová
HCl nebo NaOH pro úpravu pH
2.2 Přístroje
Třepačka
Spektrometr (Varian cary 50 Bio, UV visible spectrophotomet)
Luminometr s dispensory (Luminoskan Ascent, DLReadyTM)
Flow-box
2.3 Použitý organismus a princip metody Testovacím organismem je rekombinantní kvasinková linie Saccharomyces cerevisiae. Kvasinky nemají vlastní estrogenní receptor (ER), proto je do jejich genomu 25.
vloţen transfekací (umělým přenosem DNA) „reportérový‖ gen, který citlivě odpovídá na aktivaci receptorového mechanismu. ER jsou v inaktivním stavu vázány v komlexech s jiným proteiny (např. chaperony). Po navázání estrogenní molekuly dochází ke konformačním změnám, spouští se aktivace ER a následuje kaskáda dějů, na jejímţ konci dochází k aktivaci tzv. estrogen-responzivních elementů, které spouštějí transkripci příslušných genů. Jako reportérový gen se pouţívá gen enzymu luciferázy. Principem testu je tedy indukce transkripce reporterového genu díky které je syntetizován enzym luciferáza. Luciferáza oxiduje přidaný substrát (D-luciferin) za vzniku luminiscence, která je detekována.
Během měření xenoestrogenity jsou standardně pouţívány testovaci mikrodesky obsahující 96 jamek. Buňky jsou exponovány libovolnými vzorky vţdy ve třech opakováních. Kaţdá deska obsahuje negativní kontrolu (voda), standard (E2 v 9 různých koncentracích) pro sestrojení kalibrační křivky a minimálně tři koncentrace kaţdého vzorku.
2.4 Metody In vitro testy jsou často pouţívány k hodnocení specifických mechanismů účinku čistých látek, ale i enviromentálních směsí a umoţňují ohodnotit celkový účinek směsi látek, aniţ by byly zanedbány interakce mezi látkami, jako antagonismus či synergismus. Jedná se o relativně jednoduchý, rychlý a finančně nenáročný test.
2.4.1 Příprava vzorků Vzorky byly připraveny Mrg. Barborou Jedličkovou, ale samostatně jsem je testovala pomocí in vitro testu.
Do čtyř skleněných lahví o objemu 1 l bylo přidáno 0, 5 l miliQ čisté vody s E2 o přibliţné koncentraci 100 ng/ml a s EE2 také o koncentraci přibliţně 100 ng/ml. Suspenze nanoţeleza byla přidána dle tabulky 3.
26.
Tab. 3: Mnoţství přidané suspenze nanoţeleza Láhev č.
Mnoţství přidané suspenze nanoţeleza/0,5 l vody
1
0,0 ml (0g)
2
4,4 ml (1g)
3
8,8 ml (2g)
4
13,2 ml (3g) Všechny lahve byly uzavřeny těsnícími víčky a zaráz třepány při teplotě 21° C a
při intenzitě 150 rpm (Obr. 7).
Obr. 7: Třepání vody obsahující estrogeny bez/s částicemi nanoţeleza v suspenzi
První vzorek byl odebrán před procesem třepání a byl označen jako „počáteční koncentrace―. Další vzorky byly odebírány z jednotlivých lahví v čase 1 h třepání, po 3 h třepání a po 5 h třepání. Jednotlivé vzorky byly označeny dle schématu v tabulce 4.
Tab. 4: Schéma odebraných vzorků Počáteční koncentrace E2 a EE2 ve vodě
Vzorek bez Fe 1h
Vzorek 1g Fe 1h
Vzorek 2g Fe 1h
Vzorek 3g Fe 1h
Vz. bez Fe 3h Vz. bez Fe 5h
Vz. 1g Fe 3h Vz. 1g Fe 5h
Vz. 2g Fe 3h Vz. 2g Fe 5h
Vz. 3g Fe 3h Vz. 3g Fe 5h
Po odebrání vzorků bylo nutné zbavit vodu s estrogeny zbytků nanočástic ţeleza. Toho bylo docíleno postavením minivialky se vzorky na magnet. Po usazení ţeleza na magnetu byla odebrána horní část roztoku k analýzám. Úbytek koncentrace E2 a EE2 ve 27.
vodě byl měřen pomocí in vitro testu a pomocí vysokorozlišovací kapalinové chromatografie
spojené
s hmotností
spektrofotometrií
(HPLC/MS/MS).
Analýzu
HPLC/MS/MS prováděl doc. Šimek (RECETOX) a jím naměřené výsledky jsou v práci uvedeny pouze pro srovnání s autorkou naměřeními výsledky pomocí in vitro testů.
2.4.2 Příprava médií Synthetic Minimal Medium (SD medium) 1,7 g „yeast nitrogen base w/o amino acids― bylo rozpuštěno spolu s 5 g síranu amonného v 910 ml vody a sterilizováno v autoklávu. Glukóza a nezbytné aminokyseliny byly přidány dle tabulky 5 „Roztoky na doplnění média―.
Synthetic Complex Medium (SD medium) Podobně jako při přípravě minimálního média bylo 1,7 g „yeast nitrogen base w/o amino acids― rozpuštěno spolu s 5 g síranu amonného v 910 ml vody. Dále bylo přidáno 1,4 g/l „yeast synthetic drop-out mix w/o leu, his, ura, trp―a vše bylo sterilizováno v autoklávu. Poté bylo pH upraveno na 5,6 pomocí HCl nebo NaOH.
2.4.3 Příprava agarových ploten Ke 20 g/l bakteriálního agaru bylo přidáno 30ml sterilního komplexního média bez glukosy a aminokyselin. Následovala sterilizace v autoklávu. Po autoklávování byly sterilně ( v laminárním boxu) přidány roztoky glukosy (50 ml/l) a aminokyselin (histidin 10 ml/l, adenin 10 ml/l, leucin 10 ml/l ) dle tabulky 5 „Roztoky na doplnění média―.
28.
Tab. 5: Roztoky na doplnění média Přídavky do média 50ml/l
10ml/l 10ml/l 10ml/l 10ml/l
Koncentrace roztoků
Kmen
glukóza
Zdroj uhlíku 40 % (hmotnostní %- 40g/100ml konečného objemu)
histidin
2g/l
ER, luc
adenin
5g/l
ER, luc
leucin
10g/l
ER, luc
tryptofan
2g/l
luc
ER, luc
Agar byl nalit na sterilní plotny (cca 10 ml na 1 misku) a ponechán ztvrdnout ve sterilním prostředí laminárního boxu.
2.4.4 Zahájení kultivace z glycerolové zmrzlé kultury Agarové plotny pro kmeny kvasinek, které jsem kultivovala, byly označeny jménem kvasinek, datem a osobními monogramy. Za sterilních podmínek byla odejmuta malá část buněk z povrchu zamrzlé kultury sterilní špičkou. Tzv. kříţovým roztěrem byla kultura přenesena na agarovou plotnu. Zbývající zmrzlá kultura byla vrácena ihned zpět do mrazáku (-70 oC). Agarové plotny byly uchovávány dnem vzhůru ve 30 oC dva aţ tři dny ve tmě do velikosti jedné kolonie kvasinek 1mm.
2.4.5 Nárůst kultur v roztoku média Po celou dobu práce jsem udrţovala vše sterilní (v laminárním boxu). Po odměření 3 ml SD-minimálního média do sterilní zkumavky byla sterilní tyčkou vybrána samostatná kvasinková kolonie na agarové plotně a přenesa do tekutého média v baňce nebo zkumavce s víčkem. Vičko nebylo utěsněno úplně. Buňky rozsuspendované pomocí sterilní tyčky se nechaly inkubovat ve 30 oC s mírným třepáním ve tmě po dobu cca 24 h.
29.
2.4.6 Testování vzorků Naočkovaná kvasinková pre-kultura v minimálním médiu s glukosou a aminokyselinami přes noc v tmavém prostředí za třepání ve 30
o
C narostla. Na
spektrofotometru byla změřena OD600nm (optická hustota) z dvacetkrát naředěné kultury (50 μl kvas. kultury + 950 μl dest.vody). Měření OD u kvasinek jsou lineární jen do hodnoty OD600nm = 0,3. Vyšší OD600nm odezvy nejsou lineární, v tom případě je potřeba roztok pro měření více rozředit. Z naměřených hodnot OD bylo vypočítáno rozředění v příslušném médiu pro celou desku. Rozředění musí být takové, aby konečná hodnota OD600nm kultury byla okolo 0,7. Vhodně zředěná kultura byla dána zpátky na třepačku do inkubátoru při teplotě 30oC do tmy na 2 hodiny k dosaţení OD600nm 0,4. Poté bylo 100µl kvasinkové kultury napipetováno pomocí opakovací pipety do kaţdé jamky bílé destičky (96x). Byl přidán 1µl vzorku zředěného v destilované vodě. Negativni kontrolu představoval 1 µl vody/jamka. Pozitivni kontrola byla reprezentována E2 v 9 různých koncentracích (v rozsahu 15; 45; 137; 412; 1235; 3704; 1111; 3333 a 10 000 pM) pro sestrojení kalibrační křivky. Destička byla přikryta víčkem a třepána 20 s na třepačce. Inkubace při 30oC ve tmě probíhala po dobu 2,5 hodiny. Po inkubaci pomocí dispenzorů v luminometru byl přidáno 96µl 1mM roztoku luciferinu (viz luciferázový zásobní roztok). Luminiscence byla ihned změřena– vzorek je stálý pouze okolo 5 minut.
Příprava luciferinového zásobního roztoku Smícháním 35 ml 0,2M kyseliny citrónové s 65 ml citronanu trissodného (0,2M) byl připraven pufr citrátu sodného (0,2 M, pH 5). Do konečné koncentrace 2 mM byl přidán D-luciferin, míchaný pomocí magnetické míchačky dokud se nerozpustil. Luciferin je citlivý na světlo - musí být chráněný před světlem během přípravy. Roztok byl rozdělen po 5 ml (2x koncentrované) a uchováván při -20 oC.
Před měřenim pomocí luminometru bylo smícháno 5 ml 2x konc. roztoku luciferinu s 5 ml destilované vody k získání 1x koncentrovaného roztoku (1mM) luciferinu.
30.
3. Výsledky a diskuze Pro experiment byla pouţita linie transgenních kvasinek označovaných jako BMAEREluc/Erα a testovací mikrodesky s 96 jamkami. Kaţdá deska obsahovala rozpouštědlovou kontrolu branou jako pozadí, kalibrační řadu standardní látky (E2 v 9 různých koncentracích) a pět různých koncentrací kaţdého vzorku. Jednotlivé koncentrace vzorků nebo kontrol byly měřeny ve třech opakováních. Na kaţdé desce bylo navíc testováno 5 koncentrací vzorku označeného jako „Počáteční koncentrace―, který byl brán jako 100% estrogenní aktivity. Míra luminiscence byla luminometrem naměřena v relativních luminiscenčních jednotkách (RLU). Ze získaných dat byly vytvořeny průměrné hodnoty pro jednotlivé triplikáty. Byl vytvořen spojnicový graf, vypočteny směrodatné odchylky a odstraněny výrazně odlišné hodnoty (Graf 1).
1 0,8
RLU
0,6 0,4
ER alfa
E2 v H2O
Poč.konc.
1g 5h
koncentrace v jamce [pM]
2g 5h
3* 1*
90*
30* 10*
90* 30* 10* 3* 1*
3*
H2O 1*
90* 30* 10*
3* 1*
30* 10*
90*
270*
100000
11111,11 33333,33
15,24 45,72
0 H2O
137,17 411,52 1234,57 3703,70
0,2
3g 5h
ER alfa
zředění vzorků
Graf 1: Příklad spojnicového grafu jedné ze změřených desek
Vzhledem k tomu, ţe dispenzor luminometru dávkoval luciferin nerovnoměrně, velký počet naměřených hodnot musel být vyloučen a dále bylo počítáno pouze „s jamkami―, do kterých byl luciferin dávkován správně. I přes nestejnoměrné dávkování luciferinu byly kalibrační řady na jednotlivých deskách velmi podobné standardním kalibračním řadám naměřených v jiných měřeních a proto jsem se rozhodla desky vyhodnotit. 31.
Od všech hodnot byla odečtena průměrná hodnota luminiscence, kterou dosahovalo samotné rozpouštědlo (voda). Hodnoty RLU byly přepočítány na procenta maximální odpovědi. Jako 0 % odpovědi byla stanovena RLU rozpouštědlové kontroly,
% maximální odpovědi
jako 100% koncentrace E2, která dosáhla nejvyšší indukce luminiscence (Graf 2).
100,00
50,00
AR alfa 2
E2 v H2O
Poč.konc.
koncentrace v jamce [pM]
0g 1h
1*
3*
10*
30*
90*
1*
3*
10*
30*
90*
1*
3*
10*
30*
90*
270*
100000
33333,33
3703,70
11111,11
411,52
1234,57
45,72
137,17
15,24
H2O
0,00
0g 3h
ředění vzorků
Graf 2: Příklad spojnicového grafu jedné ze změřených desek s převedením RLU na % maximální odpovědi
Míra estrogenního potenciálu zkoumaných vzorků byla stanovena porovnáním EC 50 vypočteným z křivky dávka-odpověď E2 a EC 50 vypočítaných z křivek dávka-odpověď různého ředění vzorků. Pro výpočet EC 50
E2 byly zlogaritmovány
hodnoty koncentrace a vytvořen bodový graf procent maximální odpovědi (osa y) a log koncentrace E2 (osa x). Z lineární části křivky dávka-odpověď byly v programu „MS Excel― stanoveny rovnice regrese a hodnoty spolehlivosti R2. Pomocí rovnice regrese byla vypočtena hodnota logaritmu koncentrace a následným odlogaritmováním byla získána hodnota EC 50 (Graf 3).
32.
90,00 y = 35,113x - 28,864 R2 = 0,9918
80,00
% maximální odpovědi
70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
log koncentrace E2
Graf 3: Příklad jednoho z bodových grafů vytvořeného pro výpočet EC 50 E2 a rovnice regrese
Výsledky měření estrogenní aktivity vzorků jsou vyjádřeny pomocí tzv. estrogenního ekvivalentu (EEQ). Hodnota EEQ vzorku vyjadřuje, jaká koncentrace standardu (E2) by způsobila stejný estrogenní účinek, který byl způsoben celkovou směsí látek ve vzorku. Nejdříve bylo vypočítáno v jaké koncentraci (kolikrát ředěný) vzorek způsobuje stejnou odpověď jako 50 % odpověď E2 a po té vyhodnoceno mnoţství estrogenního ekvivalentu na 1 ml vzorku, takţe výsledný estrogenní potenciál vzorku je vyjádřen v jednotkách EEQ ng /ml.
Příklad výpočtu: EC 50 standarního estrogenu E2 byla vypočítána jako 4,8 ng/ml. Stejnou odpověď jako byla EC 50 E2 způsoboval 20,18 krát ředěný vzorek. Výsledný estrogenní potenciál vzorku byl proto 96,7 EEQ ng/ml (4,8 x 20,18).
33.
Změřené hladiny EEQ ve vzorcích vody (odebíraných po 1h, 3h a 5h třepání) jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 6 dále uvádí koncentrace E2 a EE2 změřené pomocí HPLC/MS/MS.
Tab. 6: Změřené hladiny E2, EE2 a EEQ v jednotlivých vzorcích Vzorek kontrola bez Fe 1h 1g 1h 2g 1h 3g 1h kontrola bez Fe 3h 1g 3h 2g 3h 3g 3h kontrola bez Fe 5h 1g 5h 2g 5h 3g 5h
E2 ng/ml (Průměr 2 měření)
SD
EE2 ng/ml (Průměr 2 měření)
SD
EEQ ng/ml (1 měření)
110
1,4
160,5
0,7
Nevyhodnotitelné
95 95 85,5
1,4 0 2,1
118 89,5 59
8,5 2,1 2,8
157,7 86,3 61,0
107
1,4
158,5
0,7
Nevyhodnotitelné
96 82 84,5
2,8 0 0,8
117 79 51
5,7 1,4 1,4
Nevyhodnotitelné 122,6 17,5
109
2,8
159
7,1
Nevyhodnotitelné
95,5 89,5 84
3,5 0,7 1,4
117 80 48
4,2 2,8 0
Nevyhodnotitelné Nevyhodnotitelné Nevyhodnotitelné
Procenta odstranění estrogenů jsou uvedena v tabulce 7 a v grafu 4.
Tab. 7: Srovnání % odstranění estrogenity změřené pomocí HPLC/MS/MS a pomocí in vitro testu Vzorek kontrola Bez Fe 1h 1g1h 2g1h 3g1h kontrola Bez Fe 3h 1g3h 2g3h 3g3h kontrola Bez Fe 5h 1g5h 2g5h 3g5h
% odstranění EEQ (měřeno in vitro)
% odstranění E2
% odstranění EE2
(měřeno HPLC/MS/MS)
(měřeno HPLC/MS/MS)
1
0
Nevyhodnotitelné
14 14 23
26 44 63
2 46 62
4
1
Nevyhodnotitelné
14 26 24
27 51 68
19 88 Nevyhodnotitelné
2
1
Nevyhodnotitelné
14 19 24
27 50 70
Nevyhodnotitelné Nevyhodnotitelné Nevyhodnotitelné
34.
E2 EE2
3g 5h
2g 5h
1g 5h
3g 3h Fe 5h
ko nt ro la
Be z
2g 3h
1g 3h
3g 1h Fe 3h
ko nt ro la
Be z
2g 1h
Fe ko nt ro la
Be z
1g 1h
EEQ
1h
% odstanění estrogenity
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Vzorky
Graf 4: Srovnání % odstranění estrogenity změřené pomocí HPLC/MS/MS (E2 a EE2) a pomocí in vitro testu (EEQ)
Na základě výsledků in vitro testů lze konstatovat, ţe částice nanoţeleza v suspenzích měly ve shodě s výsledky z HPLC/MS/MS výrazný vliv na odstraňování estrogenních látek z vody. Účinnost odstraňování závisela na mnoţství nanočástic ve vodě a na době třepání. Vzhledem k chybnému nástřiku dispenzoru je nutné měření in vitro opakovat.
35.
4. Závěr V rámci bakalářské práce se mi podařilo shrnout základní mechanismy degradace některých látek způsobujících změny hormonální rovnováhy. EDCs jsou látky, které působí ve velmi nízké koncentraci a klíčovým faktorem jejich odstranění z ţivotního prostředí je sledování jejich degradace na čistírnách odpadních vod. Biodegradace je obvykle pouze jedním z několika moţných procesů odstraňování. Je třeba prozkoumat jiné mechanismy k jasnějšímu pochopení procesů odstranění EDCs a vzájemného působení různých mechanismů. Částice nanoţeleza jsou schopny eliminovat mnoţství EDCs ze vzorků vody. Tyto moţnosti budou diskutovány.
Výsledky praktické části bakalářské práce ukázaly, ţe testované částice nanoţeleza jsou schopny odstraňovat steroidní estrogeny E2 a EE2 z vody. Pomocí in vitro testu jsme navíc ověřili, ţe v procesu odstraňování nedošlo ke vzniku metabolitů s vyšším estrogenním potenciálem. Metoda odstraňování EDCs pomocí nanočástic ţeleza však vyţaduje další laboratorní i terénní studie.
36.
5. Souhrn EDCs jsou různorodou skupinou látek, které narušují hormonální rovnováhu organismů. Mezi EDCs patří např. PCBs, ftaláty, bisfenol A, DDT, ale také steroidní estrogeny, které jsou syntetizovány endogenně nebo uměle jako např. EE2 pouţívaný coby součást antikoncepce. Steroidní estrogeny byly nalezeny v odpadních, podzemních i povrchových vodách po celém světě a jsou potencionálním rizikem kontaminace zásob pitné vody. Toto riziko představují především díky své schopnosti účinkovat jiţ v řádech ng/l. Jako hlavní cesty jejich degradace se jeví biotransformace, sorpce a částečně i fotodegradace. Přestoţe byly vyvinuty citlivé analytické metody pro jejich detekci, v současné době existují jen omezené údaje o environmentálním chování a osudu těchto steroidů v různých sloţkách ţivotního prostředí. V různých vyspělých státech jsou v současnosti optimalizovány podmínky provozu stávajících čistíren odpadních vod, které by vedly k větší účinnosti odstraňování EDCs a dále jsou vyvíjeny nové přídatné metody jejich odstraňování. V praktické části bakalářské práce byla pomocí in vitro testu ověřena schopnost nanočástic ţeleza sniţovat hladiny E2 a EE2 ve vodě.
37.
6. Summary EDCs are various groups of substances which affect hormonal balance of organisms. Well known EDCs are e.g. PCBs, phthalates, Bisphenol A, DDT and endogenously synthesized steroid estrogens or. EE2, which is a synthetic estrogen used as a part of birth control. These steroidal estrogens can affect the organisms at extremely low levels (ng/l). Above mentioned compounds were found in waste, underground and surface water over the World and are possible risks of contamination of drinkable water supplies. main mechanisms of their removal from waters are sorption, biodegradation and photodegradation may partly play some role. Currently only limited facts about environmental acts and life of these steroids in variant combination of milieu exist although sensitive analytic methods for their detection have been developed. Therefore expositions and risks related to these chemicals are still not known enough. Waste water treatment plants conditions as well as new advanced technologies are currently optimized or tested for example in US or European countries in order to improve EDCs removal efficiency. In practical part of this theses we demonstrated (by using in vitro test) the ability of one type on iron nanoparticles to remove E2 and EE2 from water.
38.
7. Seznam použité literatury Albergotti, L.C., Hamlin, H. J., McCoy, M.W., Guillette, L. J. (2009). Endocrine Activity of Extraembryonic Membranes Extends beyond Placental Amniotes. Plos One 4(5), 5452
Alcock, R. E., Sweetman, A., Jones, K.C. (1999). Assessment of organic contaminant fate in waste water treatment plants: selected coupounds and physicochemical properties. Chemosphere 38(10), 2247-226
Cajthaml, T., Křesinová, Z. , Svobodová, K., Sigler, K., Řezanka, T. (2009). Microbial transforma-tion of synthetic estrogen 17a-ethinylestradiol. Environmental Pollution 157, 3325–3335
Czajka, P.C., Londry, K. L. (2006). Anaerobic biotransformation of estrogens. Science of the Total Environment 367, 932–941
Eriksson E., Auffarth K., Henze H., Ledin, A. (2002). Characteristics of grey wastewater. Urban Water 4, 85–104. In: Press-Kristensen, K., A. Ledin, J. E. Schmidt, M. Henze (2007) Identifying model pollutants to investigate biodegradation of hazardous XOCs in WWTPs. Science of the Total Environment 373, 122–130
Haiyan R., Shulan J., Ud din Ahmad, N. (2007). Degradation characteristics and metabolic pathway of 17a-ethynylestradiol by Sphingobacterium sp. JCR5. Chemosphere 66(2), 340–346. In: Bram, P., Klaas, W. , Noppe, H., De Brabander, H. , Van de Wiele, T., Verstraete, W., Boon, N. (2008). 17a-ethinylestradiol cometabolism by bacteria degradingestrone, 17b-estradiol and estriol. Springer Science & Business Media, 683–693
Hashimoto, T., Murakami, T. (2009). Removal and degradation characteristics of natural and synthetic estrogens by activated sludge in batch experiments. Water research 43, 573-582
39.
Holthaus, K.I.E., Johnson, A.C., Jurgens, M.D., Williams, R.J., Smith, J.J.L., Carter, J.E. (2002). The potential for estradiol and ethinylestradiol to sorb to suspended and bed sediments in some English rivers. Environmental Toxicology and Chemistry 21, 2526–35
Kuster, M., De Alda, M. J. L., Barcelo, D. (2004). Analysis and distribution of estrogens and progestogens in sewage sludge, soils and sediments. Trends in Analytical Chemistry 23 (10–11), 790-797
Kwak, H.I., Bae, M.O., Lee, M.H., Lee, Y.S., Lee, B.J., Kang, K.S., Chae, C.H., Sung, H.J., Shin, J.S., Kim, J.H., Mar, W.C., Sheen, Y.Y., Cho, M.H. (2001). Effects of nonylphenol, bisphenol A, and their mixture on the viviparous swordtail fish (Xiphophotus helleri). Environmental Toxicology and Chemistry 20: 787–795. In: Cajthaml, T., Křesinová, Z. , Svobodová, K., Sigler, K., Řezanka, T. (2009). Microbial transformation of synthetic estrogen 17a-ethinylestradiol. Environmental Pollution 157, 3325–3335
La Farre, M., Pe´rez, S., Kantiani, L., Barcelo, D. (2008). Fate and toxicity of emerging Pollutants, their metabolites and transformation products in the aquatic environment.Trends in Analytical Chemistry 27 (11), 991- 1005
Lai, K.M, Johnson, K.L, Scrimshaw, M.D, Lester J.N. (2000). Binding of waterborne steroid estrogens to solid phases in river and estuarine systems. Environmental Science & Technology 34, 890– 4
Layton, A.C., Gregory, B.W., Seward, J.R., Schultz, T.W., Sayler, G.S. (2000). Mineralization of steroidal hormones by biosolids in wastewater treatment systems inTennessee USA. Environmental Science & Technology 34, 3925–3931. In: Cajthaml, T., Křesinová, Z. , Svobodová, K., Sigler, K., Řezanka, T. (2009). Microbial transformation of synthetic estrogen 17a-ethinylestradiol. Environmental Pollution 157, 3325–3335
40.
Leech, D.M., Snyder, M.T., Wetzel, R.G. (2009). Natural organic matter and sunlight accelerate the degradation of 17 beta-estradiol in water. Science of the total enviroment 407(6), 2087-2092
Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. (2009). Removal mechanisms for endocrine disrupting compounds (EDCs) in wastewater treatment — physical means, biodegradation, and chemical advanced oxidation. Science of the total enviroment 407, 731-748. A review
Liu, Z., Kanjo, Y., Mizutani, S. (2009). Urinary excretion rates of natural estrogens and androgens from humans, and their occurrence and fate in the environment. Science of the Total Environment 407, 4975–4985. A review
Mindnich R, Moller G, Adamski J. (2004). The role of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenases. Mol. Cell. Endocrinol 218, 7–20. In: Sanderson, J. T. (2006). The Steroid Hormone Biosynthesis Pathway as a Target for Endocrine-Disrupting Chemicals. Toxicological Sciences 94(1), 1-23
Olson, S.H., Orlow, I., Bayuga, S., Sima, C., Bandera, E.V., Pulick, K., Faulkner, S., Tommasi, D., Egan, D., Roy, P., Wilcox, H., Asya, A., Modica, I., Asad, H., Soslow, R., Zauber, A.G. (2007). Variants in hormone biosynthesis genes and risk of endometrial cancer. Cancer Causes Control 19, 955-963
Pedrouzo, M., F. Borrull, E. Pocurull, R. M. Marcé (2009) Estrogens and their conjugates: Determination
in
water
samples
by
solid-phase
extraction
and
liquid
chromatography–tandem mass spectrometry. Talanta 78, 1327–1331
Pikaar, I., Koelmans, A.A, Van Noort, P.C.M. (2006). Sorption of organic compounds to activated carbons. Evaluation of isotherm models. Chemosphere 65, 2343–2351
Press-Kristensen, K., A. Ledin, J. E. Schmidt, M. Henze. (2007). Identifying model pollutants to investigate biodegradation of hazardous XOCs in WWTPs. Science of the Total Environment 373, 122–130
41.
Robinson , B., Hellou, J. (2009). Biodegradation of endocrine disrupting compounds in harbour seawater and sediments. Science of The Total Environment 407 (21), 57135718
Roda, I.R., Poch, M., Bañares-Alcántara, R. (2000). Application of a support system to the design of wastewater treatment plants. Artificial Intelligence in Engineering 14, 45–61
Shi, J., Fujisawa, S., Nakai, S., Hosomi, M. (2004). Biodegradation of natural and synthetic estrogens by nitrifying activated sludge and ammonia-oxidizing bacterium Nitrosomonas europaea. Water Research 38(9), 2323–2330. In: De Gusseme, B., Pycke, B., Hennebel, T., Marcoen, A., Vlaeminck, S. E., Noppe, H., Boon, N., Verstraete, W. (2009). Biological removal of 17a-ethinylestradiol by a nitrifier enrichment culture in a membrane bioreactor. Water research 43, 24932503
Snyder, S. A., Westerhoff, P., Yoon, Y., Sedlak, D. L. (2003). Pharmaceuticals, personal care products, and endocrine disruptors in water: Implications for the water industry. Environmental Engineering Science 20(5), 449-469
Sumpter, J. P., Johnson, A. C. (2005). Lessons from endocrine disruption and their application to other issues concerning trace organics in the aquatic environment. Environmental Science & Technology 39, 4321-4332
Tabata, A., Kashiwa, S., Ohnishi, Y., Ishikawa, H., Miyamoto, N., Itoh, M. (2001). Estrogenic influence of estradiol-17h, p-nonylphenol and bisphenol A on Japanese Medaka (Oryzias iatipes) at detected environmental concentrations. Water Science & Technology 43(2), 109–16. In: Ying, G.-G., Kookana, R. S., Ying, J. R. (2002). Occurrence and fate of hormone steroids in the environment- Review article. Environment International 28, 545– 551
Urase,T., Kikuta, T. (2005). Separate estimation of adsorption and degradation of pharmaceutical substances and estrogens in the activated sludge process. Water Research 39, 1289–1300 42.
Weber, S., Leuschner, P., Kampfer, P., Dott, W., Hollender, J. (2005). Degradation of estradiol and ethinyl estradiol by activated sludge and by a defined mixed culture. Applied Microbiology and Biotechnology 67, 106–112
Ying, G.-G., Kookana, R. S., Ying, J. R. (2002). Occurrence and fate of hormone steroids in the environment- Review article. Environment International 28, 545– 551
Yoshimoto, T., Nagai, F., Fujimoto, J., Watanabe, K., Mizukoshi, H., Makino, T., Kimura, K.
Saino, H., Sawada, H., Omura, H. (2004). Degradation of estrogens by
Rhodococcus zopfii and Rhodococcus equi isolated from activated sludge in wastewater treatment plants. Environmental Microbioogy 70(9), 5283–5289
43.