Masarykova univerzita. Lékařská fakulta STANOVENÍ VÁPNÍKU V MOČI METODOU ATOMOVÉ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE. Bakalářská práce. v oboru zdravotní laborant

Masarykova univerzita Lékařská fakulta

STANOVENÍ VÁPNÍKU V MOČI METODOU ATOMOVÉ ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE

Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant

Vedoucí bakalářské práce:

Autor:

prof. MUDr. Vladimír Soška, CSc.

Michaela Šorfová

Brno, duben 2014

Jméno a příjmení autora: Michaela Šorfová Název bakalářské práce: Stanovení vápníku v moči metodou atomové absorpční spektrometrie

Pracoviště: Oddělení klinické biochemie FN U Svaté Anny Vedoucí bakalářské práce: prof. MUDr. Vladimír Soška, CSc. Rok obhajoby bakalářské práce: 2014

Souhrn: Cílem mé bakalářské práce bylo porovnání 2 metod pro stanovení vápníku v moči (fotometrická metoda s NM-BAPTA a atomová absorpční spektrometrie) a ověření vlivu 2 modifikátorů matrice [Sr(NO3)2 a LaCl3. 7 H2O] na výsledky vyšetření. Vyšetřila jsem celkem 104 vzorků moči, pro statistické vyhodnocení výsledků jsem použila Grubbsův test, krabicové grafy odlehlých hodnot, Passing-Bablokovu regersi, Bland-Altmanův rozdílový graf a konkordanční korelační koeficient. Zjistila jsem, že fotometrická metoda a atomová absorpční spektrometrie mají srovnatelné výsledky měření a že modifikátor LaCl3. 7 H2O dává dle validačních parametrů lepší výsledky vyšetření.

Klíčová slova: vápník, atomová absorpční spektrometrie, fotometrická metoda, porovnání metod

Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením prof. MUDr. Vladimíra Sošky, CSc., a konzultantky RNDr. Pavly Hložkové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.

V Brně dne .......................

..................................................

Poděkování Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucímu své bakalářské práce prof.MUDr.Vladimíru Soškovi, CSc. za odborné vedení, věcné rady, připomínky a ochotu. Dále bych chtěla poděkovat RNDr.Pavle Hložkové za odbornou pomoc, vstřícnost a čas při zpracování praktické části mé bakalářské práce.

Použité symboly a zkratky

AAS

Atomová absorpční spektrometrie

ATP

Adenosintrifosfát

Ca2+

Vápenatý kationt

CO2

Oxid uhličitý

ECT

Extracelulární tekutina

EDTA

Kyselina ethylendiamintetraoctová

FNUSA

Fakultní nemocnice U Svaté Anny v Brně

GIT

Gastrointestinální trakt

H+

Vodíkový kationt

HCl

Kyselina chlorovodíková

ICT

Intracelulární tekutina

IP3

Inositol trifosfát

ISE

Iontově selektivní elektroda

Mg2+

Hořčíkový kationt

Na+

Sodný kationt

NM-BAPTA

5-nitro-5‘-methyl- [1,2-bis(o-aminofenoxy)ethanN,N,N‘,N‘-tetraoctová kyselina]

PTH

Parathormon

OBSAH 1 2

ÚVOD .............................................................................................................................................9 CÍLE A HYPOTÉZA PRÁCE ........................................................................................................9

A. Teoretická část 3

VÁPNÍK ........................................................................................................................................10

3.1

Význam vápníku v těle...............................................................................................10

3.2

Hlavní funkce vápníku v organismu ..........................................................................10

3.2.1

Stavba a funkce kosti ..........................................................................................10

3.2.2

Uvolnění neurotransmiteru .................................................................................11

3.2.3

Kontrakce svalu ..................................................................................................11

3.2.4

Krevní srážlivost .................................................................................................12

3.3

Vápník v krvi..............................................................................................................12

3.4

Homeostáza vápníku ..................................................................................................13

3.4.1

Hormonální regulace...........................................................................................14

3.4.1.1

Parathormon ................................................................................................14

3.4.1.2

Vitamin D ....................................................................................................14

3.4.1.3

Kalcitonin ....................................................................................................15

3.4.2

Eliminace ledvinami ...........................................................................................15

3.4.3

Resorpce gastrointestinálním traktem .................................................................15

3.5

Intracelulární vápník ..................................................................................................16

3.6

Hyperkalcémie ...........................................................................................................16

3.6.1

Příčiny hyperkalcémie ........................................................................................16

3.6.2

Příznaky hyperkalcémie ......................................................................................17

3.7

Hypokalcémie ............................................................................................................17

3.7.1

Příčiny hypokalcémie .........................................................................................17

3.7.2

Příznaky hypokalcémie .......................................................................................18

3.8

Vápník v moči ............................................................................................................18

3.8.1

Hyperkalciurie ....................................................................................................18

3.8.2

Hypokalciurie......................................................................................................19

3.8.3

Sběr moči pro stanovení kalciurie ......................................................................19

3.9

Urolitiáza ....................................................................................................................20

3.9.1

Hyperoxalurická kalciová litiáza ........................................................................21

3.9.2

Hyperkalciurická kalciová litiáza .......................................................................22

3.9.3 4

Hyperurikosurická kalciová litiáza .....................................................................22

METODY STANOVENÍ VÁPNÍKU ...........................................................................................23

4.1

Preanalytická fáze ......................................................................................................23

4.2

Spektrofotometrické stanovení...................................................................................23

4.2.1

O-kresolftalein komplexon .................................................................................24

4.2.2

Arzenazo III ........................................................................................................24

4.2.3

5-nitro-5‘-methyl- [1,2-bis(o-aminofenoxy)ethan-N,N,N‘,N‘-tetraoctová

kyselina] (NM-BAPTA) ...................................................................................................24 4.3

Atomová absorpční spektrometrie .............................................................................25

4.3.1

Princip metody ....................................................................................................25

4.3.2

Interference .........................................................................................................26

4.3.3

Součásti přístroje.................................................................................................27

4.4

Iontově selektivní elektrody .......................................................................................27

4.5

Historické metody stanovení ......................................................................................28

4.5.1

Plamenová emisní spektrometrie ........................................................................28

4.5.2

Komplexometrické titrace...................................................................................28

B. Praktická část 5

6

POUŽITÁ PŘÍSTROJOVÁ TECHNIKA .....................................................................................29

5.1

Atomový absorpční spektrometr ContrAA® 700 ......................................................29

5.2

Modular Analytics Evo Modul P ...............................................................................30

MATERIÁL ..................................................................................................................................31

6.1

Vzorky ........................................................................................................................31

6.2

Reagencie pro AAS ....................................................................................................31

6.2.1

Diluční roztoky ...................................................................................................32

6.2.2

Standardní roztoky ..............................................................................................32

6.3

7

8

Reagencie pro fotometrické stanovení .......................................................................33

6.3.1

Pracovní roztoky .................................................................................................33

6.3.2

Kalibrační materiál .............................................................................................33

STANOVENÍ KONCENTRACE VÁPNÍKU METODOU AAS .................................................34

7.1

Preanalytická fáze ......................................................................................................34

7.2

Software ASpect CS ...................................................................................................34

7.3

Podmínky měření .......................................................................................................34

7.4

Postup měření .............................................................................................................35

VALIDACE METODY ................................................................................................................36

8.1

Opakovatelnost a pravdivost metody .........................................................................36

8.2

Mezilehlá preciznost ..................................................................................................38

8.3

Odhad nejistot výsledků měření .................................................................................39

8.4

Linearita a citlivost metody........................................................................................40

8.5

Výtěžnost....................................................................................................................45

8.6

Statistické porovnání metod .......................................................................................47

8.6.1

Grubbsův test ......................................................................................................47

8.6.2

Krabicové grafy odlehlých hodnot .....................................................................48

8.6.3

Regrese dle Passing-Bablok................................................................................50

8.6.4

Bland – Altmanův rozdílový graf .......................................................................52

8.6.5

Konkordanční korelační koeficient .....................................................................55

9

ZÁVĚR..........................................................................................................................................56

10

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...........................................................................................57

11

PŘÍLOHY......................................................................................................................................60

1 ÚVOD Vápník je jedním z nejdůležitějších minerálů v lidském organismu, jeho funkce jsou nepostradatelné. Primárně je stavební složkou kostí a zubů, má ale i vliv na svalovou kontrakci, krevní srážení a sekreci hormonů. Homeostáza vápníku je udržována mimo jiné i jeho vylučováním do moči. Zvýšené vylučování vápníku močí může vést k urolitiáze, je to poměrně častě onemocnění a může mít závažné následky. Hlavním problematikou této bakalářské práce je stanovení vápníku v moči metodou atomové absorpční spektrometrie a srovnání vlivu použití 2 různých modifikátorů matrice na výsledky stanovení kontrolních materiálů a vzorků od pacientů.

2 CÍLE A HYPOTÉZA PRÁCE Cílem bakalářské práce bylo: Porovnání metod stanovení vápníku atomovou absorpční spektrometrií a fotometrií s NMBAPTA. Vybrat vhodný diluent (ředící roztok) s modifikátorem pro rutinní stanovení vápníku v moči metodou AAS.

Hypotézy bakalářské práce: Předpokládá se, že není podstatný rozdíl mezi stanovením metodou AAS a fotometrickým stanovením. Vliv použitých modifikátorů matrice (LaCl3. 7H2O a Sr(NO3)2) bude srovnatelný.

-9-

A. Teoretická část 3 VÁPNÍK 3.1 Význam vápníku v těle Vápník je jedním z nejdůležitějších minerálů v lidském těle. U dospělého člověka tvoří asi 2 % tělesné váhy. Největší část vápníku je vázána v kosti (asi 99 %). Zde ve formě hydroxyapatitu slouží k mechanické pevnosti kosti. Zbylé procento vápníku je obsaženo v extracelulární tekutině a měkkých tkáních. Minerální látky si organismus nedokáže sám vytvořit, musíme je tedy přijímat potravou. Největším zdrojem vápníku je mléko a mléčné výrobky [28]. Denní příjem je kolem 1 g. Zvýšený příjem je potřeba v období růstu, těhotenství a laktace [6]. Důsledkem nedostatečného přívodu může být osteoporóza, v dětství rachitida. Při nadbytečném přívodu může dojít k zácpě nebo zvracení [23].

3.2 Hlavní funkce vápníku v organismu Vápník je jednak minerální složkou kostí a zubů, dále se podílí na svalové kontrakci, uvolňování neurotransmiterů, sekreci a působení hormonů, účastní se enzymových reakcí a procesu koagulace [34].

3.2.1 Stavba a funkce kosti Kostra tvoří oporu těla, probíhá zde neustálá remodelace jako odpověď na mechanické změny jako je tělesný růst nebo poškození kosti. V kostní dřeni probíhá postnatální krvetvorba. Kost je také zdrojem iontů vápníku a fosforu pro buňky i extracelulární prostor [19]. Kost je složena ze složky organické (osteiod) a anorganické. Organickou složku tvoří kolagen a amorfní hmota (proteoglykany). Složka anorganická je tvořena kostními minerály, většina minerálů (85 %) je ve formě krystalů hydroxyapatitu Ca10(PO4)6(OH)2, dále 10 % tvoří CaCO3 a 1 % Mg3(PO4)2 [1].

- 10 -

Po celý život probíhá v kostní tkáni remodelace, ve stáří už ale pomaleji. Jedná se o odbourávání a následné vytváření kosti. Kost se tak adaptuje na různé změny jako mechanické poškození a zátěž, kdy je stará kostní tkáň odbourána a nahrazena novou. Remodelace je výsledkem činnosti kostních buněk. Osteoklasty mají za úkol odbourání kosti, jejich aktivitou dojde ke snížení pH, což vede k rozpuštění krystalů hydroxyapatitu a pomocí enzymů štěpí i organickou část kosti. Novotvorba kosti je zajištěna osteoblasty. Vytvářejí organickou složku kosti a do ní ukládají anorganickou část, vychytáváním minerálů z krve. Osteoblasty potom dozrávají v osteocyty, které jsou zapouzdřené v mineralizované kosti. Osteocyty pak slouží jako ukazatelé zatížení kosti a mohou signalizovat potřebnou přestavbu [28, 4].

3.2.2 Uvolnění neurotransmiteru Neurotransmiter šíří vzruch mezi neurony a také přes nervosvalovou ploténku ke svalům. K šíření nervového vzruchu dochází v synapsích, jedná se o spojení mezi dvěma neurony, které je tvořeno presynaptickou částí jednoho neuronu, synaptickou štěrbinou a postsynaptickou částí druhého neuronu. V presynaptické části se nacházejí váčky s neurotransmitery, které jsou produkty enzymů [17]. Buněčné membrány nervových buněk mají iontové kanály propustné pro vápník. Prostřednictvím akčního potenciálu, který je přiveden nervy, se kanály otevřou a vpustí vápník do buňky. Zvýšení koncentrace vápníku v cytosolu vyvolá uvolnění neurotransmiteru [28].

3.2.3 Kontrakce svalu Vápník je intracelulárně vázán v sarkoplazmatickém retikulu. Při podráždění svalu se dostává signál do buňky ve formě akčního potenciálu a dojde k vylití Ca2+ z buňky do sarkoplazmy specifickými membránovými kanály. Vápníkové ionty se naváží na troponin, tím se odkryjí aktivní místa aktinu a může dojít k reakci aktinu s myosinem, čili ke svalové kontrakci. Tuto reakci ukončí přečerpání vápníku ATP-ázou zpět do buňky. To se projeví relaxací svalu [35].

- 11 -

3.2.4 Krevní srážlivost Hemostáza je proces, který vede k zástavě krvácení. Při poškození cévy dochází k vazokonstrikci, aktivaci a přilnutí trombocytů k endotelu v místě poranění. Vzniká tak primární zátka. Dále nastupuje proces hemokoagulace, kdy dochází k přeměně fibrinogenu na fibrin a vzniká pevná definitivní zátka. V primární hemostáze má vápník podíl na agregaci trombocytů. Ca2+ spolu s kolagenem poraněné cévy stimuluje v trombocytech enzym fosfolipázu A2, který katalyzuje uvolnění arachidonátu, z něhož vzniká tromboxan A2 a ten stimuluje agregaci trombocytů [17]. Vápník se účastní i procesu hemokoagulace. Srážení může být aktivováno dvěma cestami, vnitřní a vnější. V obou případech dochází ke kaskádovitým reakcím, kdy jsou aktivovány další a další faktory. To vede k výsledné přeměně protrombinu na trombin, který přeměňuje rozpustný protein fibrinogen na nerozpustný fibrin [24]. Ca2+ se účastní na aktivaci srážecích faktorů při kaskádovitých reakcích. Ve vnitřní cestě, zahájené aktivací faktoru XII, je vápník potřeba pro aktivaci faktoru X, IX a VIII. Vnější cesta začíná aktivací tkáňového faktoru, který aktivuje faktor VII a ten za přítomnosti Ca2+ aktivuje faktor X [17]. Vyvázáním vápenatých iontů, pomocí citrátu nebo EDTA, získáme nesrážlivou krev [21].

3.3 Vápník v krvi Vápník je přítomen v krvi ve 3 formách: a) vázaný na bílkoviny (46 %) – především na albumin, z menší části na globuliny. Tato část není filtrovatelná. b) ve formě komplexních sloučenin (6 %) – jako citrát, fosfát c) ionizovaný (48 %) - Ca2+, jako jediný je fyziologicky aktivní [4]. Vápník ionizovaný i komplexně vázaný proniká semipermeabilními membránami. Vázaný vápník složí jako rezerva Ca2+ iontů při poklesu kalcémie. Při poklesu hladiny albuminu v séru klesá i koncentrace celkového vápníku, ale hladina ionizovaného vápníku se nemění. Naopak při vyšších koncentracích bílkovin stoupá i koncentrace celkového vápníku, opět beze změny ionizovaného Ca2+ [6]. Vazba Ca2+ na bílkoviny závisí na pH krve. Při alkalóze hladina ionizovaného Ca2+ klesá a při acidóze stoupá. Je to důsledkem kompetice mezi Ca2+ a H+ o vazebné místo na albuminu. Při poklesu hladiny albuminu o 1 g/l stoupá koncentrace Ca2+ o 0,015-0,020 - 12 -

mmol/l. Ca2+ tvoří s anorganickým fosforem fosforečnan vápenatý, při zvýšení hladiny fosforu se tedy snižuje hladina ionizovaného vápníku. Procento ionizovaného vápníku se může díky těmto mechanismům měnit, i když hladina celkového vápníku zůstává stejná [23]. Referenční rozmezí: celkový vápník 2,25 – 2,75 mmol/l ionizovaný vápník 1,12 – 1,32 mmol/l [23]

3.4 Homeostáza vápníku V organismu člověka je přibližně 1000 g vápníku. Nejvíce je vázán v kostech a zubech a zbylé procento se nachází hlavně v ECT, malé množství je i v ICT. Z kostí se vápník uvolňuje podle potřeby pro udržení hladiny kalcémie [6]. Fyziologicky aktivní je jen ionizovaný vápník. Jeho koncentrace v plazmě je udržována v úzkém rozmezí 1,1 – 1,3 mmol/l. Pokud jeho koncentrace klesne pod toto rozmezí, zvyšuje se nervosvalová dráždivost a dochází tak k tetanii, křečím nebo srdeční arytmii. Naopak zvýšením koncentrace, dochází k zácpě, zvracení, může dojít i k snížení koncentrační schopnosti ledvin, následkem je polydypsie a polyurie. Homeostáza vápníku je udržována zpětnou resorpcí vápníku ledvinami, remodelací kostní tkáně a vstřebáváním vápníku gastrointestinálním traktem (viz Obrázek č.1) [28]. Obrázek č.1: Udržování homeostázy vápníku [6]

- 13 -

3.4.1 Hormonální regulace Homeostáza vápníku je řízena hormony PTH, kalcitoninem a vitaminem D. Malý vliv na homeostázu mají také kortizol, thyreoidální hormony a aldosteron [23].

3.4.1.1

Parathormon

Parathormon je polypeptidický hormon, který se tvoří v příštítných tělískách. Sekrece PTH je řízena plazmatickou koncentrací ionizovaného vápníku [23]. Při snížení koncentrace vápníku se zvyšuje sekrece PTH a při zvýšení koncentrace je sekrece PTH tlumena. Cílovými orgány působení PTH jsou kost a ledviny, napřímo působí i na střevo. PTH podporuje odbourávání kostní tkáně a následné vyplavení vápníku i fosforu do krve. V ledvinných tubulech PTH zvyšuje zpětnou resorpci vápníku, čili snižuje jeho vylučování a zároveň zvyšuje vylučování fosforu. Dále stimuluje v ledvinách přeměnu kalcidiolu na aktivní kalcitriol, který zvyšuje vstřebávání vápníku ve střevě [4].

3.4.1.2

Vitamin D

Vyskytuje se ve 2 formách, jako vitamin D2 a D3. Tyto dvě formy mají rozdílnou strukturu postranního řetězce, D2 má oproti D3 navíc dvojnou vazbu mezi atomy C12 a C13 a methylovou skupinu. Fyziologický efekt mají ale podobný. Převažuje vznik aktivního vitaminu D z formy D3 [9]. Primárně se vitamin D3 tvoří v kůži, kde vlivem UV záření vzniká z 7 dehydrocholesterolu [23]. Dalším zdrojem je potrava. Vitamin D přijímáme jako prohormon ve formě rostlinného ergokalciferolu (D2) a živočišného cholekalciferolu (D3) [4]. V játrech je vitamin D2 nebo D3 hydroxylován na kalcidiol (25-hydroxyderivát) a dále se hydroxyluje ještě v ledvinách na aktivní kalcitriol (1,25-dihydroxyderivát) [17]. Tato druhá hydroxylace je stimulována hypokalcémií, přesněji PTH. Kalcitriol jako hormon podporuje v tenkém střevě vznik proteinu, který přenáší Ca2+ přes membránu enterocytů a tím zvyšuje jeho vstřebávání. Kalcitriol tedy zvyšuje koncentraci vápníku v krvi.

- 14 -

3.4.1.3

Kalcitonin

Kalcitonin je polypeptidický hormon, který je produkován parafolikulárními buňkami štítné žlázy. Sekrece je závislá na koncentraci vápníku v krvi, při zvýšení kalcémie se zvyšuje i sekrece kalcitoninu a naopak při snížení koncentrace je sekrece utlumena. Kalcitonin snižuje aktivitu osteoklastů, čili snižuje odbourávání kosti a vyplavení vápníku do krve. Kalcitonin tedy působí jako antagonista PTH. Kalcitonin se využívá pro léčbu osteoporózy, protože podporuje mineralizaci kosti [17].

3.4.2 Eliminace ledvinami V glomerulu může být filtrován pouze vápník ionizovaný a vázaný v komplexech nikoli vápník vázaný na proteiny. Většina (98%) takto přefiltrovaného vápníku se zpětně vstřebává v proximálním tubulu, do definitivní moči se dostává 2,5 – 5 mmol/den. Největší část vápníku je resorbována v proximálním tubulu. Resorpce zde probíhá transportem jak pasivním (paracelulárním), tak i aktivním (transcelulárním ) přes specifické kanály na apikální membráně a Ca2+ pumpou anebo antiportem 3 Na2+/Ca2+ na membráně bazolaterální [32]. Dále dochází k resorpci paracelulárním transportem ve vzestupné části Henleovy kličky a v distálním tubulu transcelulárním transportem, v těchto částech je vstřebávání stimulováno hormony PTH a v distálním tubulu i kalcitriolem [34].

3.4.3 Resorpce gastrointestinálním traktem Z potravou přijatého vápníku je ve střevě vstřebáno 20 – 30 %, zbytek kalcia je vyloučeno stolicí. Denně takto vyloučíme asi 800 mg Ca2+. Resorpce probíhá převážně v tenkém střevě. Transport Ca2+ se děje proti koncentračnímu spádu, proto je třeba pomoci ATP-ázy. V tlustém střevě pak probíhá transport pasivně, paracelulárně. Resorpce je ovlivňována jak hormony, tak i nehormonálně. Kalcitriol podporuje vstřebávání Ca2+ a PTH působí nepřímo stimulací tvorby kalcitriolu. Dále závisí na:  věku – u dětí je resorpce až 75 %, s přibývajicím věkem sliznice atrofuje  stravě – negativní vliv mají vláknina, lipidy, oxaláty a naopak pozitivní pro vstřebávání Ca2+ je příjem sacharidů - 15 -

 peristaltice střev – zvýšená peristaltika snižuje vstřebávání [34, 32]

3.5 Intracelulární vápník Ve srovnání s extracelulárním prostorem je zde mnohem nižší koncentrace, zatímco v ECT je to kolem 2,5 mmol/l, v ICT je to o 3 až 4 řády méně. Množství intracelulárního vápníku závisí na typu buňky. Nejmenší koncentrace jsou v erytrocytech, které nemají organely. Ve svalových buňkách nebo trombocytech je koncentrace naopak vyšší, protože zde je vápník plně využíván. Vápník je v buňce vázán v endoplazmatickém retikulu, mitochondriích i jádře. Díky rozdílným koncentracím vzniká mezi ECT a ICT elektrochemický gradient, který je udržován pasivní výměnou Ca2+ za Na+ a aktivním transportem přes vápníkové kanály [28]. Za normálních okolností jsou kanály velmi málo propustné. K uvolnění Ca2+ z ICT dochází při depolarizaci membrány nebo prostřednictvím IP3. Ionty Ca2+ jsou transportovány zpět do buňky pomocí ATP-ázového systému, který přepumpuje 2 Ca2+ při spotřebě 1 ATP [17, 24]. Vápník se v buňce váže na bílkovinu kalmodulin, tento komplex aktivuje enzymy (proteinkinázy) a vyvolá tak děje jako svalovou kontrakci, uvolnění neurotransmiterů, buněčné dělení nebo aktivuje další enzymy. Tyto pochody jsou krátkodobé a fyziologické. Pokud by došlo k dlouhodobému nárůstu koncentrace Ca2+ uvnitř buňky (při ischemii), může dojít až k její smrti [23, 17].

3.6 Hyperkalcémie Tento stav je definován zvýšením hladiny celkového vápníku v krvi nad referenční rozmezí (nad 2,75 mmol/l).

3.6.1 Příčiny hyperkalcémie 

Primární hyperparatyreóza - jedná se o nejčastější příčinu vzniku hyperkalcémie. Při hyperparatyreóze je zvýšena sekrece PTH vlivem adenomu nebo hyperplazie příštítných tělísek, PTH zvyšuje osteoresorpci a díky tomu je Ca uvolňováno do krve.



Snížené vylučování ledvinami – hypokalciurie. Může být způsobeno vlivem PTH při hyperparatyreóze nebo vlivem thiazidových diuretik. U familiární benigní hypokalciurické hyperkalcémii je přítomna mutace v genu pro kalcium-vázající receptor, příštítná tělíska - 16 -

proto nedostatečně reagují na hladiny kalcémie, považují normální hladiny za nízké a sekrece PTH je utlumena až při vyšších hladinách kalcémie. 

Zvýšené vstřebávání v GIT – je způsobeno předávkováním vitaminem D



Imobilizace – při znehybnění převažuje odbourávání kosti nad novotvorbou

3.6.2 Příznaky hyperkalcémie Mírná hyperkalcémie (do 3 mmol/l) nemusí mít žádné klinické příznaky, může se zjistit náhodně z krve, při testování hladiny vápníku. Pokud je ovšem vzrůst rychlý jsou patrny příznaky i při mírné hyperkalcémii. Těžká hyperkalcémie (nad 3,5 mmol/l) je už životu nebezpečná, hrozí zástava srdce anebo selhání ledvin. Mezi příznaky patří snížená nervosvalová dráždivost spojená se svalovou slabostí a poškozením srdečního rytmu, deprese, neschopnost soustředění. Vzhledem k tomu, že je porušená koncentrační schopnost ledvin, nacházíme polyurii a následně polydipsii a dehydrataci. Hrozí i nefrolitiáza a selhání ledvin. K příznakům v GIT patří nechutenství, zvracení, vředy a kvůli precipitaci solí i pankreatitida [23, 32, 3].

3.7 Hypokalcémie Hypokalcémie je stav, kdy dochází ke snížení hladiny vápníku v plazmě pod referenční rozmezí (pod 2,25 mmol/l). Může se jednat o pokles celkové nebo jen ionizované frakce.

3.7.1 Příčiny hypokalcémie 

Snížený příjem potravou – při nedostatku mléka a mléčných výrobků (vegani).



Snížená resorpce střevem – při poškození střevní sliznice (Crohnova choroba) nebo nedostatku vitaminu D (málo vystavění slunci, při jaterním nebo ledvinném selhání nedojde k přeměně v aktivní formu).



Hypoparatyreodismus – vlivem autoimunitního poškození nebo operativního odnětí příštítných tělísek dochází k nedostatečné sekreci PTH.



Hyperfosfatémie – vzniká tak kalciumfosfát, který se ukládá do tkání.



Zvýšené vylučování močí – při poruchách ledvin.

- 17 -



Hypoalbuminémie – snižuje se frakce vázaná na albumin, čili i hladina celkového vápníku. Při poklesu albuminu o 1 g/l se sníží koncentrace v krvi o 0,02 mmol/l. Ionizovaná frakce se ale nemění.

3.7.2 Příznaky hypokalcémie Vápník v plazmě je nutný pro správnou funkci svalů a nervů, při nízkých koncentracích nacházíme poruchy hlavně v těchto soustavách. Při mírné hypokalcémii nejsou patrny příznaky, ale přetrvává-li dlouho, pozorujeme poruchy nervové soustavy (demence, psychózy). Důsledkem hypokalcémie je tetanický syndrom, charakterizovaný zvýšením nervosvalové dráždivosti. Mezi projevy tetanického syndromu patří tetanické křeče, parestezie. Nebezpečné jsou srdeční arytmie a postižení dýchacích svalů, protože hrozí smrt udušením [23, 32, 2].

3.8 Vápník v moči Denně člověk močí vyloučí až 300 mg vápníku. Množství vyloučeného vápníku závisí zejména na jeho příjmu potravou a vstřebání ve střevě, na kalcémii v krvi, na kostní resorpci a správné funkci ledvin. Referenční rozmezí: muži 2,4 – 7,5 mmol/24 hod ženy 2,4 – 6,2 mmol/24 hod

3.8.1 Hyperkalciurie Je stav, kdy je zvýšeno vylučování vápníku močí. Referenční meze pro tento stav jsou různé, protože závisí na mnoha faktorech. Největší vliv má příjem vápníku potravou. Při nízkém příjmu vápníku je to 3,7 mmol/den, ale při příjmu nad 800 mg/den jsou referenční meze 6,2 – 7,5 mmol/den. Dále kalciurie závisí na věku (ve stáří je vyšší) a pohlaví (muži mají vyšší koncentrace než ženy). Hyperkalciurie jsou primární, u kterých neznáme příčinu a sekundární, kde známe původ tohoto stavu. Mezi příčiny hyperkalciurie patří:  hyperkalcémie – je zvýšena filtrační nálož - 18 -

 předávkování vitaminem D – nejčastější příčina, vitamin D zvyšuje kalcémii  hyperparathyreóza – způsobeno adenomem nebo hyperplázií příštítných tělísek  sarkoidóza – multisystémové onemocnění, je zvýšená citlivost na vitamin D [13] Pro hodnocení hyperkalciurie je používán poměr Ca/kreatinin (Nordinův index). Jako mezní hodnota je dáno 0,6 mmol/mmol. Pro hyperkalciurii svědčí hodnota nad 0,6 mmol/mmol. Tento index lze využít i pokud si nejsme jisti, zda byla moč správně sbírána (viz kapitola 1.8.3) [9]. Výpočtem frakční exkrece vápníku zjistíme, jaké množství vápníku přefiltrovaného v glomerulech se nakonec vyloučí definitivní močí [33]. Definitivně určíme hyperkalciurii, pokud je kreatinový index větší než 0,6 mmol/mmol, frakční exkrece kalcia nad 5 % a kalciurie přesahuje referenční meze pro dané pohlaví a věk [9].

3.8.2 Hypokalciurie Hypokalciurie je charakterizována snížením vylučování vápníku močí. Pro tento stav však nejsou dány referenční meze. Mezi příčiny hypokalciurie patří  hypokalcemie – vlivem snížené filtrační nálože vápníku se i do moče dostává menší množství  hypoparathyreóza – např. při odnětí příštítných tělísek (strumektomie), vede k hypokalcemii  malabsorpce vápníku ve střevě – snížené vstřebávání vede k hypokalcémii  deficit vitaminu D [13]

3.8.3 Sběr moči pro stanovení kalciurie Moč se sbírá po dobu 24 hodin. Je nutné pacienta podrobně instruovat, aby nedošlo k chybám ve sběru. Je nutné sběr zahájit s prázdným močovým měchýřem. Pacient se tedy vymočí, zaznamená čas a další porce jde již do sběrné nádoby. Zaznamenává se počáteční a konečný čas sběru a celková diuréza [9]. Moč je odebírána do sběrných nádob vypláchnutých kyselinou. K moči je přidávána HCl, která rozpouští precipitované vápenaté soli [30]. - 19 -

Je dobré stanovovat kreatinin, pro orientační kontrolu správného sběru. Musíme však dbát na to, že množství kreatininu vylučovaného močí závisí na množství svalové hmoty. Vyšetření ztrát vápníku v moči sbírané po 24 hodin se používá pro hodnocení metabolismu vápníku, je užitečná pro stanovení a sledování léčby pacientů s osteoporózou nebo ledvinovými kameny [25].

3.9 Urolitiáza Jedná se o onemocnění, kdy se v močových cestách tvoří konkrementy (kameny). Látky, z kterých se konkrementy skládají, jsou málo rozpustné a mohou tvořit krystaly. Konkrementy mohou vznikat v ledvinné pánvičce (nefrolitiáza), v močovodech (uterolitiáza) i v močovém měchýři (cystolitiáza). Jde o časté onemocnění (prevalence 5 %), neléčená může mít vážné zdravotní následky jako hydronefróza nebo insuficience ledvin. Nemoc často recidivuje [4].

Rizikové faktory 1. Nedostatečný pitný režim – může způsobit přesycení moči krystalotvornými látkami. 2. Infekce močových cest – patří mezi časté příčiny onemocnění. Význam zde mají bakterie tvořící enzym ureázu, která štěpí močovinu za vzniku amoniaku. NH3 alkalizuje moč [23]. To je příčinou vzniku struvitových konkrementů [27]. 3. Zvýšené koncentrace krystalotvorných látek v moči – ke zvýšeným koncentracím těchto látek v moči může dojít vlivem poruch metabolismu litogenní látky anebo nadměrným přísunem potravin, které tyto látky obsahují. Tabulka č.1: Rizikové hodnoty krystalotvorných látek pro vznik urolitiázy [19] Krystalotvorná látka

Denní ztráty močí

Vápník

> 6,25 mmol/den

Oxaláty

> 4,16 mmol/den

Kyselina močová

> 0,46 mmol/den

Fosfáty

> 35,5 mmol/den

4. Vrozené anomálie močových cest – tyto vady často způsobují uroinfekce. 5. Nedostatek inhibitorů krystalizace a agregace – látky bránící vzniku konkrementů (inhibitory krystalizace - kyselina citrónová, magnesium; inhibitory agregace – glykosaminoglykany). - 20 -

6. Další příčiny: genetické poruchy (cystinurie), užívání některých léků (vitamin D, antacida, diuretika),genetická dispozice. Při vyšetření urolitiázy je důležité zjistit příčinu vzniku a typ konkrementů, abychom mohli zvolit vhodnou léčbu a předešli recidivě. Odebírá se anamnéza, jak rodinná, tak osobní. Při recidivujících infekcích močových cest je nutné urologické vyšetření. Dále je potřeba zjistit, z jakých látek se konkrement skládá a zda se nejedná o poruchu metabolismu. Složení konkrementů je závislé na pH moči. Při kyselém pH je nejčastější výskyt oxalátu vápenatého a při alkalickém pH najdeme fosforečnany vápenaté. Zřídka je ale konkrement tvořen pouze jednou látkou, většinou se konkrement skládá ze směsi dvou a více látek. Při hyperkalciurii dochází nejčastěji k tvorbě kalciumoxalátových konkrementů [23].

3.9.1 Hyperoxalurická kalciová litiáza Zvýšeným vylučováním oxalátu (šťavelan) nad 0,4 mmol/l může dojít ke vzniku urolitiázy. Asi 60 % oxalátu vzniká endogenně, je totiž konečným metabolickým produktem přeměny aminokyselin serinu a glycinu. 30 % je tvořeno přeměnou kyseliny askorbové a 10 % je exogenního původu, tj. přijímáno potravou. Konkrementy tohoto typu se vyskytují ve formě monohydrátů (COO)2Ca.H2O (whewellit) nebo dihydrátů (COO)2Ca. 2 H2O (wheddelit). K příčinám zvýšeného vylučování oxalátů močí patří:  malý příjem kalcia – Ca2+ ve střevě váže kyselinu šťavelovou a ta tak nemůže být absorbována.  malabsorpční syndrom - Pokud v tenkém střevě nedochází k absorpci žlučových a mastných kyselin, zvyšuje se propustnost pro oxaláty kvůli nedostatku vápníku. Nevstřebané kyseliny totiž reagují s Ca2+ a tak vznikají nerozpustná mýdla, která způsobují průjmy.  zvýšený příjem oxalátů  primární hyperoxalurie - je způsobena dědičnými poruchami metabolismu oxalátů. Jedná se o poruchy enzymů, jejichž následkem je hyperoxalurie, selhávání ledvin a ukládání kalciumfosfátů v různých orgánech.

- 21 -

3.9.2 Hyperkalciurická kalciová litiáza Zvýšené vylučování vápníku močí zvyšuje nasycení kalciumoxalátu (při kyselém pH) a kalciumfosfátu (při alkalickém pH). Podle příčin vzniku dělíme hyperkalciurii na primární a sekundární. Primární hyperkalciurie – má 2 formy:  Absorpční formu způsobuje zvýšená absorpce vápníku v tenkém střevě.  Renální forma je dána poruchou vstřebávání vápníku v ledvinách. Formu hyperkalciurie zjistíme pomocí zátěžového testu, kdy necháme pacienta 3 dny na dietě s nízkým obsahem kalcia (zákaz mléčných výrobků a mléka). Poté odebereme vzorek moči nalačno, následně podáme destilovanou vodu a moč se sbírá 2 hodiny. Nakonec dáme pacientovi zátěž kalciem a moč odebíráme následující 4 hodiny. Při absorpční formě je moč nalačno i po vypití destilované vody v normě, ale po zátěži zaznamenáme zvýšení. U renální formy pozorujeme již nalačno zvýšené hodnoty a po zátěži nám ještě mírně stoupnou. Sekundární hypekalciurie je způsobena poruchami v metabolismu vápníku. 

hyperparatyreóza – při zvýšené činnosti příštítných tělísek je produkována nadmíra PTH, který zvyšuje odbourávání kostní tkáně a stimuluje tvorbu vitaminu D, který zvyšuje absorpci Ca ve střevě a vzniká hyperkalciurie.



imobilizace – nedostatkem pohybu dochází ke zvýšenému odbourávání vápníku z kostí a následné hyperkalciurii. Vleže je zhoršeno vylučování moči, což také přispívá urolitiáze.



hladovění

3.9.3 Hyperurikosurická kalciová litiáza Konkrementy tvořené kyselinou močovou se také vyskytují u kalciumoxalátové litiázy. Soli kyseliny močové totiž kompetitivní inhibicí váží inhibitory litiázy a povrch kyseliny močové se může stát jádrem, kolem kterého se začne tvořit konkrement. Kyselina močová je konečným produktem metabolismu purinů. Její zvýšené vylučování močí může být následkem zvýšené filtrace (při hladovění, onemocnění dnou, zvýšený příjem purinů potravou) nebo inhibice zpětné resorpce (účinek diuretik) [27, 23].

- 22 -

4 METODY STANOVENÍ VÁPNÍKU 4.1 Preanalytická fáze Stanovení vápníku v moči sbírané po 24 hodin je problematické, závisí zde na mnoha faktorech. Během dne hladiny vápníku v moči kolísají, a proto je doporučeno sbírat moč během 24 hodin, závisí totiž na příjmu vápníku potravou. Dále je důležité, aby byla moč správně sbírána, pro kontrolu se stanovuje poměr Ca/kreatinin (Nordinův index). Vápníkové ionty mohou precipitovat, proto je potřeba moč okyselit, aby se precipitované soli před stanovením rozpustily a došlo k vyvázání vápníku. Po okyselení je moč stabilní 24 hod při 4 – 8°C [9].

4.2 Spektrofotometrické stanovení Principem spektrofotometrie je absorpce světla různých vlnových délek. Ze zdroje je vysíláno záření, jehož část je pohlcena vzorkem a záření, které vzorkem prošlo je zpracováno detektorem. Spektrofotometrií stanovíme koncentraci analytu ve vzorku, která je přímo úměrná absorpci. Platí zde Lambertův-Beerův zákon: A = ε.l.c A – absorbance l – tloušťka kyvety v cm c – látková koncentrace Absorpce samotného prvku je slabá, proto je využíváno barevných reakcí s chromogeny, které nám reakci zbarví. Barevný produkt je pak stanoven fotometricky při vlnových délkách oblasti viditelného světla [16]. Spektrofotometrické metody jsou snadno automatizovatelné, proto je tento princip využíván v biochemických analyzátorech [5].

- 23 -

4.2.1 O-kresolftalein komplexon Ca2+ reagují s o-kresolftalein komplexonem v alkalickém prostředí za vzniku ftaleinového purpuru s maximem absorbance při 600 nm. Může zde docházet k interferenci Mg2+, proto jsou tyto ionty maskovány 8-hydroxychinolinem. [4]

4.2.2 Arzenazo III V kyselém prostředí navozeném imidazolovým pufrem tvoří arzenazo III komplexy lépe s Ca2+ než-li s Mg2+.Reakcí vzniká stabilní modrá sloučenina, kterou měříme fotometricky při 650 nm. Interference zde může působit citrát (antikouagulační činidlo) nebo bílkovinné matrice způsobující zákal, pro potlačení se používají detergenty. [9]

4.2.3 5-nitro-5‘-methyl- [1,2-bis(o-aminofenoxy)ethan-N,N,N‘,N‘tetraoctová kyselina] (NM-BAPTA) Nová metoda patentovaná firmou Roche. Metoda má dvě fáze. V první fázi Ca2+ reagují s NM-BAPTA v alkalickém prostředí, vzniká komplex (jedna molekula NM-BAPTA váže právě jednu molekulu vápníku) a mění se reagenční zbarvení, které je měřeno fotometricky. V druhé fázi reaguje komplex vápník-NM-BAPTA s EDTA. EDTA na sebe díky větší vazebné afinitě naváže Ca2+ z komplexu a tím uvolní NM-BAPTA. V druhé fázi tedy vzniká komplex vápník-EDTA a volné molekuly NM-BAPTA, to se měří fotometricky. Změna absorbance je přímo úměrná koncentraci vápníku. Tato metoda má oproti předcházejícím fotometrickým metodám delší stabilitu kalibrace a je více odolná vůči interferencím hořčíku [20].

- 24 -

Obrázek č.2: Schéma fotometrického stanovení s NM-BAPTA [20]

4.3 Atomová absorpční spektrometrie AAS je referenční metodou pro stanovení celkového vápníku v moči i krvi.

4.3.1 Princip metody Principem AAS je absorpce záření o určité vlnové délce volnými atomy v základním stavu [12]. Základním stavem se rozumí stav s nejnižší energií [15]. Pokud atom absorbuje záření o určité vlnové délce, přechází atom ze základního do excitovaného stavu. Záření je charakterizováno jako tok fotonů, energie fotonu je rovna energetickému rozdílu mezi nižší (základní stav) a vyšší (excitovaný stav) energetickou hladinou atomu. Platí tu Planckův vztah: ∆E = E2 – E1 = h.ν E2 – energie atomu v excitovaném stavu E1 – energie atomu v základním stavu h – Planckova konstanta (6,626 . 10-34 J.s) ν – frekvence absorbovaného záření

- 25 -

Atom v základním stavu tedy přijme energii od absorbovaného fotonu a tím se dostává na vyšší energetickou hladinu. Tento energetický přechod se nazývá rezonanční a odpovídá mu příslušná čára spektra, tzv. rezonanční čára [12]. Atomy absorbují záření v úzkém intervalu vlnových délek. V tomto rozmezí musí zdroj záření emitovat čárové spektrum, proto se využívá vlnová délka toho prvku, který je stanovován. Vlivem absorpce atomy dochází k zeslabení intenzity záření (viz Obrázek č.2), které je zaznamenáno na detektoru. Pro vyhodnocení výsledků je nutná kalibrační křivka, kterou sestrojíme na základě hodnot absorbancí standardních roztoků [11]. Obrázek č.3: Schéma plamenové atomové absorpční spektrometrie [14]

4.3.2 Interference Jevy, které mají rušivý vliv na hodnotu absorbance měřeného analytu. Rozlišuje se spektrální a nespektrální interference. Spektrální interference - Jsou způsobeny rušivou absorpcí v spektrálním intervalu analytu. Ta může být způsobena překryvem spektrálních čar (toto riziko je malé), rozptylem záření (na nevypařených částečkách aerosolu, projevuje se u krátkých vlnových délek) nebo absorpcí molekulami (kromě atomů jsou přítomny i nedisociované molekuly). Nespektrální interference – Patří sem jevy jako rušivý transport vzorku do plamene (změny rychlosti nasávání a účinnosti zamlžování) a rušivý vliv vypařování kondenzované fáze (vznikem odlišně těkavých sloučenin) [11]. V moči může být vysoký obsah fosforečnanů, které způsobují interference. Fosforečnany tvoří tepelně stabilní sloučeniny s vápníkem a nedochází tak k úplně atomizaci. Pro jejich - 26 -

uvolnění z vazby se používají modifikátory matrice, které umožní uvolnění vápníku z vazby na fosforečnany [14]. Jako modifikátory se používají lanthan nebo stroncium [9].

4.3.3 Součásti přístroje  Zdroj světelného záření vymezující přesnou vlnovou délku. Nejčastěji se používá výbojka s dutou katodou, která obsahuje příměs stanovovaného prvku a vyzařuje čárové spektrum.  Atomizér – prostředí, kde dochází k převedení stanovovaného prvku ze vzorku do základního atomového stavu. Při stanovení vápníku dochází k atomizaci v plameni acetylén – vzduch.  Monochromátor – zařízení pro rozložení polychromatického světla na záření o jednotlivých vlnových délkách. Nejčastěji je to difrakční reflexní mřížka. Vápník se měří při vlnové délce 422,7 nm.  Detektor záření – převádí světelné záření na elektrický signál, který je pak elektronicky vyhodnocen.

Vzorek je nasáván díky vzduchovému podtlaku kapilárou do zamlžovací komory (nebulizér), kde vzniká aerosol, který je smíchán s oxidovadlem (vzduch) a topným plynem (acetylén). Poté je směs přiváděna do plamene. Průtok oxidovadla a topného plynu je regulován, pro každý prvek existuje optimální složení a teplota plamene, která se mění s výškou plamene. Tato výška se zjišťuje experimentálně. V plameni dochází k odpaření rozpouštědla, atomizaci a absorpci světelného záření. Monochromátor za plamenem izoluje spektrální interval s vlnovou délkou rezonanční čáry, regulací šířky spektrálního intervalu vstupní štěrbina monochromátoru propustí absorbované záření a ne záření balastní (neabsorbující). Za výstupní štěrbinou monochromátoru je detektor, většinou fotonásobič s fotosenzitivní katodou, který převádí záření na měřitelný elektrický proud pomocí systému dynod [12].

4.4 Iontově selektivní elektrody Metodou ISE lze měřit pouze ionizovaný vápník v krvi. Principem je měření rozdílu potenciálu mezi referenční a měrnou elektrodou [4]. - 27 -

Uvnitř elektrody je roztok s rozpuštěnými látkami, které jsou schopné vázat nebo vyměnit ionty z krve. Pro měření Ca2+ v krvi je využívána membrána z PVC oddělující substance uvnitř elektrody a stanovovaný biologický materiál. Ionizovaný vápník je závislý na pH, proto je nutný odběr krve i stanovení za nepřístupu vzduchu, protože jinak by došlo k uvolnění CO2 a změně pH. V moči se ionizovaný vápník nestanovuje, protože zde dochází k velkým výkyvům iontové síly a může zde být i nízké pH, při kterém elektroda už nefunguje [9].

4.5 Historické metody stanovení 4.5.1 Plamenová emisní spektrometrie Tato metoda využívá záření emitované valenčními elektrony při přechodu z excitovaného stavu do základního. Energie pro excitaci je zde dána teplotou plamene. Excitované atomy jsou nestabilní a mají tedy tendenci se vrátit do základního stavu, přitom je uvolněno světlo o vlnové délce typické pro daný prvek [5]. Stanovení vápníku probíhá v plameni acetylen-vzduch při 622 nm. Pro vyvázání z tepelně stabilních fosfátů se přidává EDTA, která utvoří s Ca2+ snadno spalitelný chelát a tím se vápník uvolní. Měření je méně přesné než u AAS. Objevují se různé interference (ovlivnění dvou prvků s blízkými emisními čarami, absorpce emitovaných elektronů v chladnějších okrajových částech plamene) [9] a je excitováno pouze malé procento atomů [5].

4.5.2 Komplexometrické titrace Principem je reakce vápenatého kationtu s aniontem aminopolykarboxylové kyseliny za vzniku chelátového komplexu. Pro stanovení vápníku se používaly titrace komplexonem EDTA na metalochromní indikátory (např. murexid), které byly detekovány fotometricky [5, 9].

- 28 -

B. Praktická část 5 POUŽITÁ PŘÍSTROJOVÁ TECHNIKA Pro stanovení vápníku v moči metodou AAS byl použit atomový absorpční spektrometr ContrAA ® 700 s kontinuálním zdrojem od společnosti Analytik Jena ve FN u svaté Anny v Brně. Stanovení metodou AAS bylo porovnáváno s fotometrickým stanovením na analyzátoru MODULAR ANALYTICS EVO MODUL P firmy Roche.

5.1 Atomový absorpční spektrometr ContrAA® 700 Analyzátor Analytik Jena pracuje s technologií vysoko-rozlišovací AAS s kontinuálním zdrojem (High – Resolution Continuum Source AAS). Spektrometr se skládá ze zdroje záření, atomizéru, monochromátoru a detektoru záření. Zdroj záření – xenonová výbojka s krátkým obloukem, díky této geometrii má vysokou hustotu záření a kontinuální emisi přes celý spektrální rozsah (190 – 900 nm), je určena pro všechny prvky. Atomizér – hořák-nebulizér, hořák 50 mmm s jednou štěrbinou Typ plamene - byla použita kombinace acetylen-vzduch Monochromátor – pro vysokospektrální rozlišení je použita kombinace optického hranolu a difrakční Echelle mřížky Detektor – UV citlivý polovodičový detektor (čárový detektor CCD) Korekce pozadí se provádí vytvořením polynomu přes zvolené referenční body. Výběr referenčních bodů se provádí standardně automaticky pomocí softwaru. Referenční body se dynamicky vyselektují pro každé spektrum s použitím speciálního algoritmu a na základě kritérií zajišťujících přiblížení ke skutečné základní linii na měřícím pixelu tak přesně, jak je to možné. Drift výbojky a všechny širokopásmové efekty se okamžitě eliminují ze spektra automatickou a souběžnou korekcí pozadí s přiřazením korekčního pixelu. Tímto způsobem se realizuje simultánní dvoupaprskový systém s pouze jednou optickou dráhou, což má za následek zřetelně vyšší stabilitu měření ve srovnání s klasickou LS AAS [22].

- 29 -

Obrázek č.4: Atomový absorpční spektrometr ContrAA® 700

5.2 Modular Analytics Evo Modul P Modul P800 je biochemický analyzátor určený pro fotometrická a turbidimetrická měření. Je součástí modulárního analytického systému Modular Analytics Evo a dokáže zpracovat až 800 fotometrických testů za hodinu. Přístroj se skládá z těchto součástí: Zdroj záření – je použita wolframová halogenová lampa Reakční prostor – vybaven 160 plastovými kyvetami Reagenční prostor - 88 reagenčních nádobek je umístěno v chlazeném prostoru Monochromátor – konkávní difrakční mřížka Detektor – diodové pole se 12 diodami Rozsah měření vápníku v moči na tomto analyzátoru je 0,2 – 7,5 mmol/l. Pro vyšší koncentrace se vzorky ředí v poměru 1: 1,5 automaticky funkcí rerun, výsledky se poté automaticky vynásobí 1,5. Metoda byla standardizována podle referenčního materiálu SRM 956 c level 2 [30].

- 30 -

Obrázek č.5: Modul P800

6 MATERIÁL 6.1 Vzorky Pro měření byly použity čerstvé vzorky moče z rutinního provozu biochemické laboratoře FNUSA uchovávané při 2-4oC. Pro stanovení vápníku se používá moč sbíraná po 24 hodin do plastových nádob. Je zde přesně zaznamenána doba počátku a konce sběru a objem nasbírané moče, tyto údaje jsou potřebné pro výpočet odpadu vápníku. .

6.2 Reagencie pro AAS Pro odstranění interferencí způsobených fosforečnany a oxaláty přítomnými ve vzorcích močí je nutné použití modifikátorů. K tomuto účelu se v literatuře doporučuje využití iontů La3+ nebo Sr2+. Modifikátory jsou součástí roztoků používaných pro ředění vzorků a přípravu pracovních standardních roztoků. V této práci byl srovnáván vliv obou typů modifikátorů na stanovení vápníku v moči pomocí AAS.

- 31 -

6.2.1 Diluční roztoky Diluční roztoky byly připraveny v laboratoři z pevných substancí - Dusičnan strontnatý bezvodý Suprapur, obj. č. 1.07871.0050 Merck a Chlorid lanthanitý heptahydrát p.a., obj.č. 1.12219.0100 Merck. Prvním diluentem byl 1,0% (w/v) heptahydrát chloridu lanthanitého (LaCl3. 7 H2O) v 0,1molární HCl. Tento diluent byl inspirován pracemi J. B. Willise [36] a B. Kleina [10]. Druhým diluentem byl 1,0% Sr(NO3)2 v 0,1molární HCl. Ten byl vybrán podle prácí J. B. Willise [36] a P. Thomson [29].

6.2.2 Standardní roztoky Ke kalibraci byl použit certifikovaný referenční materiál výrobce Analytika s.r.o., ze kterého byly připraveny 4 standardní roztoky o koncentracích 1,56; 3,90; 6,25; 15,63 g/l. Certifikovaný referenční materiál byl ředěn dilučním roztokem na výše uvedené koncentrace. Byly připraveny 4 pracovní standardní roztoky s LaCl3. 7 H2O a 4 pracovní standardní roztoky s Sr(NO3)2. Certifikovaný referenční materiál – vodný kalibrační roztok vápníku: Výchozí primární látka: 10,0 g/l CaCO3, čistota 99,995% Matrice:

HNO3, 2% (v/v) HNO3 podvarově destilovaná H2O deionizovaná vodivost ≤ 0,5 µS/cm

Číslo šarže: 0018 Datum expirace: 04/2014

- 32 -

6.3 Reagencie pro fotometrické stanovení 6.3.1 Pracovní roztoky Souprava Calcium Gen.2 firmy Roche MOD PD R1, objednací číslo: 506 1431 R2, objednací číslo: 506 1458 Reagencie jsou přímo připraveny k použití.

6.3.2 Kalibrační materiál Používá se kalibrátor pro automatické systémy (C.f.a.s.) s objednacím číslem: 10759350. Je to lyofilizovaný materiál na základě lidského séra se stabilizátory.

- 33 -

7 STANOVENÍ KONCENTRACE VÁPNÍKU METODOU AAS 7.1 Preanalytická fáze Moč byla diluenty ředěna v poměru 1: 50 [10]. Do zkumavky bylo napipetováno 4,9 ml diluentu a poté přidáváno 100 µl moče. Zkumavky byly promíchány na třepačce, aby došlo k homogenizaci roztoku.

7.2 Software ASpect CS ContrAA 700 je ovládán pomocí softwaru ASpect CS. Software slouží mimo jiné pro výběr techniky měření a nastavení jednotlivých parametrů metody použité k měření. Pro měření vápníku byla zvolena atomizace systémem hořák/nebulizér. Při definování parametrů metody je potřeba provést optimalizaci plamene pro co nejcitlivější stanovení, nastavují se tyto parametry:  Výběr čáry prvku, pro kterou bude plamen optimalizován. Vybírá se mezi vlnovými délkami hlavních a vedlejších absorpčních čar, které pro daný prvek doporučuje software. K nastavení dojde pohybem monochromátoru.  Nastavení průtoku paliva (v l/hod)  Nastavení výšky hořáku podle optické osy dráhy světla xenonové výbojky

7.3 Podmínky měření Pro měření byla vybrána hlavní čára o vlnové délce 422,6728 nm (viz Obrázek č.4), nebyly zde patrny žádné interference. Jako nejvhodnější se doporučuje stanovení v plameni acetylen oxid dusný pro jeho vyšší teplotu. Z literárních zdrojů je zřejmé [10,29,36], že ke stanovení lze využít také plamene acetylen - vzduch. Kvůli finanční náročnosti plamene acetylen-oxid dusný, byla vybrána další možná varianta acetylen - vzduch.

- 34 -

Pro stanovení s diluentem LaCl3. 7 H2O vybral software jako optimální průtok plynu 70 l/hod a výšku hořáku 6 mm. Pro stanovení s diluentem Sr(NO3)2 vybral software jako optimální průtok plynu 60 l/hod a výšku hořáku 6 mm. Obrázek č.4: Záznam spektra

7.4 Postup měření Pomocí softwaru byla zvolena příslušná metoda, zapálen plamen, který se nechal asi 10 minut hořet pro stabilizaci teploty. Mezitím byl vytvořen pracovní list s definovaným pořadím vzorků, každá z metod byla před měřením vzorků moče nejprve kalibrována. Pořadí vzorků v pracovním listu bylo následující: 1. Čistá demineralizovaná voda – pro měření referenčního spektra ke korekci pozadí 2. Blank – diluční roztok s přídavkem LaCl3. 7 H2O nebo Sr(NO3)2 3. Standardy – 4 roztoky o stoupající koncentraci 4. Kontrolní materiál 5. Vzorky močí

- 35 -

8 VALIDACE METODY Validace je objektivní potvrzení, že měřící postup je schopen plnit požadavky na něj kladené [7]. V rámci této bakalářské práce byly validovány jen některé parametry opakovatelnost, mezilehlá preciznost a vychýlení (bias), linearita a srovnání s jinou metodou na 104 vzorcích moče z rutinního provozu laboratoře. Ke statistickému vyhodnocení byl použit program MedCalc.

8.1 Opakovatelnost a pravdivost metody Opakovatelnost kvantifikuje náhodnou chybu měření. Měření se provádí v 1 sérii, jedním pracovníkem za stejných podmínek. Pravdivost metody slouží k odhadu systematické chyby [7]. Byly změřeny 2 kontrolní materiály z cyklu EHK Analyty moče 10x pro každý typ diluentu. Vzorek pro každé z deseti měření byl ředěn individuálně. Materiál: SEKK AM2/12 B Komerční materiál – kapalné vzorky směsí nativních močí dárců.

- 36 -

Tabulka č.2: Výsledky měření opakovatelnosti SEKK AM2/12 B SEKK AM2/12 B Číslo měření

Sr(NO3)2

LaCl3.7 H2O

(mmol/)

(mmol/)

1

3,00

2,68

2

3,22

2,71

3

2,82

2,56

4

2,83

2,49

5

2,82

2,52

6

3,08

2,48

7

2,91

2,64

8

3,18

2,64

9

2,73

2,46

10

4,86

2,69

Průměr (mmol/l)

2,954

2,588

SD

0,174

0,096

VK (%)

5,89

3,70

Cílová hodnota (mmol/l)

2,44

2,44

Bias (%)

21,1

6,1

Hodnota zvýrazněná červeně byla z hodnocení vyřazena. Jedná se o chybu, která mohla být způsobena špatným ředěním, nebo mohlo jít o náhodnou chybu při měření. Ze srovnání je patrné, že metoda s diluentem LaCl3.7 H2O má hodnoty směrodatné odchylky i variačního koeficientu (opakovatelnost) nižší než metoda s diluentem Sr(NO3)2.

K výpočtu bias byly pro kontrolní materiály použity cílové hodnoty EHK pro AAS. Pravdivost metody (bias) s diluentem LaCl3.7 H2O dosahuje 6,1 % a je výrazně lepší než u metody s diluentem Sr(NO3)2 , kde dosahuje 21,1 %.

- 37 -

8.2 Mezilehlá preciznost Stejně jako opakovatelnost určuje výskyt náhodných chyb. Měřily se 2 kontrolní materiály z cyklu EHK Analyty moče o různých koncentracích 1x denně pro každý typ diluentu (celkem 4 vzorky), v průběhu 15 dní. Materiál: SEKK AM2/13 A a SEKK AM2/13 B Komerční materiál – lyofilizované vzorky směsí nativních močí dárců

Tabulka č.3: Výsledky měření mezilehlé preciznosti AM 2/13 A

AM 2/13 A

AM 2/13 B

AM 2/13 B

Diluent

Diluent

Diluent

Diluent

Sr(NO3)2

LaCl3.7 H2O

Sr(NO3)2

LaCl3.7 H2O

(mmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

1

6,43

4,92

1,89

1,65

2

6,26

4,74

1,86

1,53

3

6,99

4,80

2,05

1,50

4

6,15

4,63

1,89

1,43

5

6,57

4,57

1,91

1,54

6

6,88

5,07

2,08

1,68

7

6,82

4,50

2,14

1,59

8

6,68

5,06

1,99

1,56

9

6,63

5,14

2,08

1,78

10

5,92

5,07

2,09

1,59

11

6,50

5,12

2,03

1,65

12

6,14

5,36

2,10

1,53

13

5,69

5,22

1,98

1,63

14

6,85

5,36

1,81

1,56

15

5,14

5,07

1,78

1,78

Průměr (mmol/l)

6,38

4,98

1,98

1,60

SD

0,51

0,27

0,12

0,10

VK (%)

7,93

5,46

5,83

6,05

Den měření

- 38 -

Variační koeficienty mezilehlé preciznosti vzorků s oběma použitými diluenty jsou vzájemně srovnatelné, avšak v porovnání s rutinní fotometrickou metodou dosahují vyšších hodnot. U fotometrické metody byly variační koeficienty 4,38 % na hladině 1,86 mmol/l a 2,86 % na hladině 2,67 mmol/l.

8.3 Odhad nejistot výsledků měření Nejistota měření je interval hodnot, ve kterém se s určitou pravděpodobností nachází výsledek. V tomto intervalu je výsledek považován za přesný a pravdivý [26]. Výpočet odhadu nejistot měření byl proveden pomocí kalkulátoru na stránkách České společnosti klinické biochemie (www.cskb.cz). Tabulka č.4: Výpočet odhadu nejistot měření pro diluent Sr(NO3)2 Vstupní hodnoty Mezilehlá preciznost (VK)

5,83 %

Nejistota hodnot certifikovaných materiálů

0,1 %

Systematická odchylka (bias)

21,1 %

Počet měření

9

Průměrná hodnota

2,95 mmol/l

Směrodatná odchylka (SD)

0,17

Výsledek výpočtu Relativní kombinovaná nejistota

- 39 -

21,98 %

Tabulka č.5: Výpočet odhadu nejistot měření pro diluent LaCl3. 7 H2O

Vstupní hodnoty Mezilehlá preciznost (VK)

6,1 %

Nejistota hodnot certifikovaných materiálů

0,1 %

Systematická odchylka (bias)

6,1 %

Počet měření

10

Průměrná hodnota

2,59 mmol/l

Směrodatná odchylka (SD)

0,10

Výsledek výpočtu Relativní kombinovaná nejistota

8,67 %

Relativní kombinovaná nejistota pro metodu s diluentem LaCl3. 7 H2O je 8,67 % a vyhovuje podmínkám EHK SEKK, kde se uvádí pro stanovení vápníku v moči Dmax (přijatelný rozdíl v procentech) ± 18 %. Pro metodu s diluentem Sr(NO3)2 je relativní kombinovaná nejistota 21,98 % a podmínka Dmax není splněna.

8.4 Linearita a citlivost metody Linearita metody popisuje míru lineární závislosti mezi signálem měření a koncentrací. Při ověřování linearity se nejprve zjišťuje, zda mezi proměnnými existuje korelace, mírou intenzity korelace je korelační koeficient, a následně se hledá matematické vyjádření této závislosti [31]. K nalezení závislosti lze použít regresní analýzu, která hledá hodnoty konstant popisující tuto závislost. K výpočtu odhadu koeficientů se používá metoda nejmenších čtverců. Formálně se testuje, zda hodnota úseku a směrnice je rovna nule. Vhodnost regresního modelu pak udává koeficient determinace.

- 40 -

Pro ověření linearity bylo připraveno pro každý z diluentů 5 vzorků. První vzorek L o koncentraci 0,00 mmol/l Ca, druhý vzorek H o koncentraci 15,63 mmol/l Ca. Další tři vzorky byly připraveny vzájemným smícháním vzorků L a H v poměrech, které jsou uvedeny v tabulkách č.6 a 7. Takto připravené vzorky byly analyzovány v duplikátu.

Tabulka č.6: Ověření linearity pro diluent s Sr(NO3)2 Teoretická Vzorek

koncentrace (mmol/l)

Průměrná naměřená koncentrace (mmol/l)

Naměřená

Naměřená

koncentrace

koncentrace

1 (mmol/l)

2 (mmol/l)

L

0,00

0,03

0,02

0,03

3L + 1H

3,91

4,60

4,24

4,966

2L + 2H

7,82

8,50

8,21

8,782

1L + 3H

11,72

13,04

14,27

11,8

H

15,63

16,62

15,68

17,56

Tabulka č.7: Ověření linearity pro diluent s LaCl3 . 7 H2O Teoretická Vzorek

koncentrace (mmol/l)

Průměrná naměřená koncentrace (mmol/l)

Naměřená

Naměřená

koncentrace

koncentrace

1 (mmol/l)

2 (mmol/l)

L

0,00

-0,04

-0,04

-0,04

3L + 1H

3,91

4,18

4,03

4,33

2L + 2H

7,82

7,81

7,91

7,71

1L + 3H

11,72

11,67

11,72

11,62

H

15,63

15,37

15,38

15,36

- 41 -

Graf č.1: Ověření linearity kalibrační závislosti Ca v moči pro diluent s Sr(NO3)2 Ověření linearity kalibrační závislosti Ca v moči diluent Sr(NO3)2 20

15

10

5

0

-5 0

5

10

Teoretická koncentrace

15

20

mmol/l

Graf č.2: Ověření linearity kalibrační závislosti Ca v moči pro diluent LaCl3. 7 H2O Ověření linearity kalibrační závislosti metody Ca v moči diluent LaCl3 . 7H2O 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 0

5

10 Teoretická koncentrace

15

20

mmol/l

Červenými přerušovanými čarami v grafu č.1 a 2 je označen 95% interval spolehlivosti regresní závislosti.

- 42 -

K vyhodnocení závislosti byla po grafickém znázornění použita korelační a regresní analýza. V případě sledovaných proměnných (teoretická koncentrace, průměrná naměřená koncentrace) se předpokládá přímkový model. Vhodnost použití zvoleného regresního modelu bylo ověřeno pomocí analýzy rozptylu (F-test) v regresi.

Tabulka č.8: Vyhodnocení lineární regrese pro metodu s Sr(NO3)2

Parametr

Počet vzorků

5

Korelační koeficient

0,9993

Koeficient determinace R2

0,9985

Směrodatná odchylka reziduí

0,2938

Rovnice regresní přímky

y = 0,2319 + 1, 0653 x

Koeficient

Směrodatná

95% interval

odchylka koef.

spolehlivosti

t

P

Úsek A

0,2319

0,2276

-0,4924 – 0,9562

1,0189

0,3833

Směrnice B

1,0653

0,02378

0,9896 – 1,1409

44,8009

< 0,0001

Součet čtverců

Průměrný čtverec

F-poměr

P

2007,1222

< 0,001

Analýza rozptylu Zdroj

Stupně

proměnlivosti

volnosti

Regresní

1

173,2212

173,2212

3

0,2589

0,08630

model Rezidua

- 43 -

Tabulka č.9: Vyhodnocení lineární regrese pro metodu s LaCl3. 7 H2O Počet vzorků

5

Korelační koeficient r

0,9997

Koeficient determinace R2

0,9994

Směrodatná odchylka reziduí

0,1687

Rovnice regresní přímky Parametr

Koeficient

y = 0,1340 + 0,9806 x Směrodatná

95% interval

odchylka koef.

spolehlivosti

t

P

Úsek A

0,1340

0,1307

-0,2818 – 0,5499

1,0256

0,3805

Směrnice B

0,9806

0,01365

0,9371 – 1,0240

71,8296

< 0,0001

Zdroj

Stupně

Součet čtverců

Průměrný čtverec

F-poměr

P

proměnlivosti

volnosti

Regresní

1

146,7665

146,7665

5159,4848

< 0,001

3

0,08534

0,02845

Analýza rozptylu

model Rezidua

Koeficient determinace udává, jaké procento rozptylu dosahuje hodnot od 0 do 1. Pokud regresní přímka prochází všemi body je koeficient determinace roven 1. Koeficienty A a B jsou testovány na rovnost nule. Jestliže hodnota P < 0,05, pak je koeficient od nuly odlišný. Analýza rozptylu (F-test) pro hodnotu P < 0,05 zamítá hypotézu, že mezi proměnnými není lineární vztah. Koeficient determinace, v případě metody s diluentem Sr(NO3)2 0,9985 a s diluentem LaCl3. 7 H2O 0,9994, a výsledek F-testu pro oba diluenty vypovídá o existenci lineární závislosti mezi teoretickými a skutečně naměřenými koncentracemi v rozsahu koncentrací 0,00 - 15,63 mol/l vápníku.

- 44 -

Citlivost plamenové AAS je nepřímo vyjádřena charakteristickou koncentrací [14]. Charakteristická koncentrace je koncentrace, která vyvolá signál rovný1 % absorpce záření a poskytne absorbanci 0,0044 na čistých roztocích [12]. Pro metodu s diluentem LaCl3. 7 H2O bylo dosaženo hodnoty charakteristické koncentrace 0,038 mg/l, pro metodu s diluentem Sr(NO3)2 je hodnota charakteristické koncentrace 0,127 mg/l. Hodnota charakteristické koncentrace získaná z experimentálních stanovení firmy Analytik Jena, která je uvedena jako součást softwaru Aspect CS, je 0,054 mg/l. Z uvedeného je zřejmé, že metoda s La3+ je citlivější a její charakteristická koncentrace je srovnatelná s firemním údajem.

8.5 Výtěžnost Udává schopnost metody detekovat veškerý analyt ve vzorku. Zjišťuje jak je metoda účinná [23]. Jedná se o další možný postup jak posoudit pravdivost metody. K experimentu byly použity 4 vzorky pacientů a z nich byly připraveny dílčí vzorky s přídavkem, všechny vzorky byly měřeny v duplikátu. Vzorek A1-A4: Vzorek pacienta (9 dílů) + přídavek (1 díl) Vzorek B1-B4: Vzorek pacienta (9 dílů) + přídavek (1 díl) Přídavek – pracovní kalibrační standardy v diluentech Sr(NO3)2 a LaCl3 .7 H2O u vzorků A1A4 – fyziologický roztok u vzorků B1- B4 Výtěžnost byla vypočítána vydělením průměrných rozdílů (D) duplikátů vzorků A a B koncentrací přídavků (K). Pro vyjádření v procentech byl výsledek násoben 100.

- 45 -

Tabulka č.10: Výtěžnost metody s diluentem Sr(NO3)2

Číslo

Přídavek

vzorku

(mmol/l)

Naměřená

Naměřená

Teoretický

koncentrace

koncentrace

přídavek

1 (mmol/l)

2 (mmol/l)

(K) mmol/l

A1

7,82

1,34

1,49

B1

fyz. roztok

0,57

0,53

A2

11,72

1,64

2,05

B2

fyz. roztok

0,71

0,61

A3

6,25

1,238

1,102

B3

fyz. roztok

0,5664

0,5695

A4

15,63

2,49

2,304

B4

fyz. roztok

0,7402

0,596

Rozdíl průměrů A a B (D)

Recovery (Výtěžek) %

mmol/l 0,87

111,5

1,17

1,19

101,7

0,625

0,602

96,3

1,563

1,7289

110,6

Tabulka č.11: Výtěžnost metody s diluentem LaCl3 . 7 H2O

Číslo

Přídavek

vzorku

(mmol/l)

Rozdíl

Naměřená

Naměřená

Teoretický

koncentrace

koncentrace

přídavek

1 (mmol/l)

2 (mmol/l)

(K) mmol/l 0,78

0,9

115,3

1,17

1,31

111,9

0,625

0,709

113,4

1,563

1,705

109,1

A1

7,82

1,32

1,26

B1

fyz. roztok

0,38

0,39

A2

11,72

1,72

1,66

B2

fyz. roztok

0,37

0,39

A3

6,25

1,174

1,136

B3

fyz. roztok

0,4639

0,4272

A4

15,63

3,833

3,881

B4

fyz. roztok

2,011

2,293

průměrů A a B (D)

Recovery (Výtěžek)

mmol/l

%

V případě stanovení s diluentem Sr(NO3)2 se výtěžnost pohybovala v rozmězí 96,3 – 111,5 %., s diluentem LaCl3. 7 H2O v rozmezí 109,1 – 115,3 %. Výtěžnost je v případě obou diluentů možno považovat za srovnatelnou. - 46 -

8.6 Statistické porovnání metod Stanovení metodou AAS při použití 2 typů modifikátorů bylo porovnáno se stanovením fotometrickým, které je běžně využíváno v laboratorní praxi FNUSA. Výsledky byly zpracovány pomocí Grubbsova oboustranného testu na odlehlost výsledků, PassingBablokovou neparametrickou regresí a byl zkonstruován Bland Altmanův rozdílový graf.

8.6.1 Grubbsův test Hodnoty, které jsme naměřily metodou AAS (s modifikátory LaCl3. 7 H2O a Sr(NO3)2) a fotometricky (s NM-BAPTA) byly testovány Grubbsovým oboustranným testem na vyhledání odlehlých hodnot. Tabulka č.12: Vyhodnocení Grubbsova testu Vypočtené veličiny

Sr(NO3)2

LaCl3. 7 H2O

NM-BAPTA

Počet vzorků

104

104

104

Nejnižší hodnota (mmol/l)

0,1218

0,1069

0,14

Nejvyšší hodnota (mmol/l)

6,302

6,538

6,05

Aritmetický průměr (mmol/l)

1,3618

1,3376

1,38

Medián (mmol/l)

1,0505

0,9839

1,07

Směrodatná odchylka

1,1212

1,1555

1,09

Koeficient šikmosti

1,4569

1,633

1,4759

Koeficient špičatosti

2,7029

3,3518

2,5303

Grubbsův test vyhodnotil některé hodnoty jako odlehlé, tyto hodnoty nebyly z dalšího zpracování vyloučeny, protože nebyly nalezeny objektivní důvody pro jejich vyřazení. Podle vyhodnocení Grubbsova testu nejde o normální rozložení dat, protože jsou koeficienty šikmosti i špičatosti ve všech případech větší než 0. Výsledky dalšího statistického zpracování bez vyloučení dat i po jejich vyloučení se od sebe nelišily a vedly ke stejnému závěru.

- 47 -

8.6.2 Krabicové grafy odlehlých hodnot Odlehlé hodnoty byly dále znázorněny pomocí krabicového grafu. Graf nám popisuje rozptýlenost dat pomocí pěti hodnot: minima, prvního kvartilu, mediánu (střední hodnota dat), třetího kvartilu a maxima hodnot. V krabici je obsaženo 50 % dat, čára uvnitř krabice je medián, horní hrana je dána prvním a dolní hrana třetím kvartilem. Odlehlá hodnota je definována jako hodnota menší než dolní kvartil mínus 1,5 násobek interkvartilového rozmezí nebo větší než horní kvartil plus 1,5 násobek interkvartilového rozmezí [8]. Graf č.3: Krabicový graf odlehlých hodnot pro stanovení metodou AAS s diluentem Sr(NO3)2

Graf č.4: Krabicový graf odlehlých hodnot pro stanovení metodou AAS s diluentem LaCl3.7 H2O

- 48 -

Graf č.5: Krabicový graf odlehlých hodnot pro stanovení fotometrickou metodou s NM-BAPTA

- 49 -

8.6.3 Regrese dle Passing-Bablok Metody byly srovnány neparametrickou regresí Passing Bablok, která nevyžaduje normální rozdělení dat a není ovlivněna jednou nebo několika málo odlehlými hodnotami na rozdíl od klasické jednoduché lineární regrese [8]. Na osu x se vynesla srovnávací metoda s NM-BAPTA a na osu y byla vynesena v prvním případě metoda s Sr(NO3)2 a v druhém případě metoda s LaCl3. 7 H2O

Graf č.6: Porovnání AAS a diluentem Sr(NO3)2 s fotometrickým stanovením s NM-BAPTA Passing-Bablokovou regresí

Tabulka č.13: Porovnání metody AAS s diluentem Sr(NO3)2 s fotometrickým stanovením s NM-BAPTA Passing-Bablokovou regresí Rovnice regrese

y = -0,0904 + 1,0326 x

Systematické rozdíly Úsek A

-0,0904

95% interval spolehlivosti

-0,1163 až -0,0425

Proporcionální rozdíly Směrnice B

1,0326

95% interval spolehlivosti

1,0052 až 1,0609

- 50 -

Graf č.7: Porovnání AAS a diluentem LaCl3.7 H2O s fotometrickým stanovením s NMBAPTA Passing-Bablokovou regresí

Tabulka č.14: Porovnání metody AAS s diluentem LaCl3.7 H2O s fotometrickým stanovením s NM-BAPTA Passing-Bablokovou regresí Rovnice regrese

y = -0,0965 + 1,0225 x

Systematické rozdíly Úsek A

-0,0965

95% interval spolehlivosti

-0,1457 až -0,0538

Proporcionální rozdíly Směrnice B

1,0225

95% interval spolehlivosti

0,9907 až 1,0594

Úsek A je měřítkem systematických rozdílů mezi srovnávanými metodami a jeho 95% interval spolehlivosti můžeme použít pro testování hypotézy A=0. Hypotéza je potvrzena, jestliže je v intervalu spolehlivosti pro úsek A zahrnuta 0. Směrnice B je měřítkem proporcionálních rozdílů srovnávaných metod, 95% interval může být použit pro testování hypotézy B=1. Hypotéza je tu potvrzena, pokud je v intervalu spolehlivosti zahrnuta 1 [18]. - 51 -

V prvním případě, srovnání fotometrické metody s NM-BAPTA a AAS s diluentem Sr(NO3)2, interval spolehlivosti A neobsahuje 0 a interval spolehlivosti B neobsahuje 1, což poukazuje na přítomnost systematické i proporcionální chyby měření. V druhém případě, srovnání fotometrické metody s NM-BAPTA a AAS s diluentem LaCl3. 7 H2O interval spolehlivosti A neobsahuje 0 a interval spolehlivosti B obsahuje 1, což vylučuje systematickou chybu a zároveň poukazuje na přítomnost proporcionální chyby měření.

8.6.4 Bland – Altmanův rozdílový graf Výsledky měření fotometrické metody a AAS jsme porovnaly pomocí Bland – Altmanova rozdílového grafu. Jde o grafický způsob, jak vyhodnotit 2 metody měření. Rozdíly mezi 2 stanovovanými technikami jsou vyneseny proti jejich průměru. Horizontální čáry ukazují průměrný rozdíl mezi metodami (detekce systematické chyby) a meze shody (průměr ± 1,96 SD rozdílů). Po obou stranách čar je znázorněn jejich 95% interval spolehlivosti.

Graf č.8: Rozdílový graf pro srovnání metody fotometrické s NM-BAPTA a AAS s Sr(NO3)2

- 52 -

Tabulka č.15: Statistické informace dle Bland-Altmana pro porovnání metody fotometrické s NM-BAPTA a metody AAS s diluentem Sr(NO3)2 Počet vzorků

104

Aritmetický průměr (mmol/l)

0,0182 -0,0109 až 0,0473

95% interval spolehlivosti SD

0,1495

Dolní limit

-0,2749

95% interval spolehlivosti

-0,3248 až – 0,2251

Horní limit

0,3113

95% interval spolehlivosti

0,2614 až 0,3611

Rovnice regresní přímky Parametr

Koeficient

y = 0,0570 +(- 0,0283) x Směrodatná

95% interval

odchylka

spolehlivosti

t

P

Úsek A

0,0570

0,0230

0,0113 – 0,1027

2,4730

0,0150

Směrnice B

- 0,0283

0,0131

- 0,0544 – (-

- 2,1587

0,0332

0,0023)

Graf č.9: Rozdílový graf pro srovnání metody fotometrické s NM-BAPTA a AAS s LaCl3. 7 H2O

- 53 -

Tabulka č.16: Statistické informace dle Bland-Altmana pro porovnání metody fotometrické s NM-BAPTA a metody AAS s diluentem LaCl3. 7 H2O Počet vzorků

104

Aritmetický průměr (mmol/l)

0,0424

95% interval spolehlivosti

0,0104 až 0,0744

SD

0,1644

Dolní limit

-0,2799

95% interval spolehlivosti

-0,3347 až – 0,2251

Horní limit

0,3647

95% interval spolehlivosti

0,3099 až 0,4195

Rovnice regresní přímky Parametr

Koeficient

y = 0,1221 +(- 0,0586) x Směrodatná

95% interval

odchylka

spolehlivosti

t

P

Úsek A

0,1221

0,0234

0,0756 – 0,1686

5,2128

< 0,0001

Směrnice B

- 0,0586

0,0133

- 0,0850 – 0,0322

- 4,4014

< 0,0001

V obou porovnáních jsou mezi metodami minimální průměrné rozdíly 0,02 (u metody s diluentem Sr(NO3)2 ) a 0,04 (u metody s diluentem LaCl3. 7H2O ) mmol/l, hodnoty jsou rozloženy rovnoměrně, není u nich patrný žádný trend.

- 54 -

8.6.5 Konkordanční korelační koeficient Pro odhad míry shody mezi dvěma metodami lze využít konkordanční korelační koeficient podle Lina. Stupnice, podle které se popisuje shoda [18]: Míra shody

Hodnota konkordančního korelačního koeficientu

Téměř dokonalá

> 0,99

Významná

0,95 - 0,99

Průměrná

0,90 - 0,95

Špatná

< 0,90

Tabulka č.17: Výsledky vyhodnocení konkordančního korelačního koeficientu pro srovnání fotometrické metody NM-BAPTA s metodou AAS s diluentem Sr(NO3)2 Počet vzorků

104

Konkordanční korelační koeficient

0,9907

95% interval spolehlivosti

0,9865 až 0,9936

Pearsonův korelační koeficient

0,9912

Bias korekční faktor

0,9995

Tabulka č.18: Výsledky vyhodnocení konkordančního korelačního koeficientu pro srovnání fotometrické metody NM-BAPTA s metodou AAS metodu s diluentem LaCl3. 7 H2O Počet vzorků

104

Konkordanční korelační koeficient

0,9886

95% interval spolehlivosti

0,9837 až 0,9920

Pearsonův korelační koeficient

0,9910

Bias korekční faktor

0,9976

Shoda fotometrické metody a metody AAS s diluentem s Sr(NO3)2 je dle hodnoty konkordančního korelačního koeficientu 0,9907 téměř dokonalá, u diluentu s LaCl3. 7 H2O je vyhodnocena jako významná, hodnota konkordančního korelačního koeficientu je 0,9886. - 55 -

9 ZÁVĚR Cílem této bakalářské práce bylo porovnání stanovení vápníku metodou absorpční atomové spektrometrie a fotometrií s NM-BAPTA a výběr vhodnějšího diluentu s modifikátorem pro rutinní stanovení vápníku v moči metodou AAS. Oba tyto cíle byly splněny.

Hypotézy jsem definovala takto: 1. Předpokládá se, že není podstatný rozdíl mezi stanovením metodou AAS a fotometrickým stanovením. 2. Vliv použitých modifikátorů matrice (LaCl3. 7H2O a Sr(NO3)2) bude srovnatelný.

První hypotéza byla potvrzena. Korelace mezi fotometrickou metodou a atomovou absorpční spektrometrií je výrazná. Z výsledků statistických analýz vyplývá, že metoda AAS s modifikátorem Sr(NO3)2 koreluje s fotometrickou metodou více než-li metoda AAS s modifikátorem LaCL3.7 H2O, tyto rozdíly jsou ale zanedbatelné. Druhá hypotéza potvrzena nebyla. Srovnání použitých modifikátorů jsem provedla na základě parametrů validace metody. Vzhledem k získaným výsledkům se jako vhodnější jeví použití diluentu s modifikátorem LaCl3. 7 H2O především z důvodu dosažených lepších hodnot pravdivosti a nejistoty měření. Stanovení vápníku v moči metodou atomové absorpční spektrometrie je specifičtější než stanovení fotometrické, pokud má tedy laboratoř k dispozici atomový absorpční spektrometr, doporučuji stanovení touto metodou, za použití diluentu s modifikátorem LaCl3. 7 H2O.

- 56 -

10 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY [1]

BROULÍK, P. Osteoporóza: osteoporóza, osteomalacie, osteodystrofie. 1. vyd. Praha: MAXDORF-JESSENIUS, 1999, 172 s. ISBN 80-858-0093-4.

[2]

COOPER, M. S., GITTOES N. J. L. Diagnosis and management of hypocalcaemia. BMJ. 2008-06-07, vol. 336, issue 7656, s. 1298-1302. DOI: 10.1136/bmj.39582.589433.BE.

[3]

CROWLEY, R., GITTOES N. How to approach hypercalcaemia. Clinical Medicine Jun2013, Vol. 13 Issue 3, p287-290, 2013.

[4]

DASTYCH, M., BREINEK P. Klinická biochemie: bakalářský obor Zdravotní laborant. Brno: Masarykova univerzita, 2011. ISBN 978-80-87192-18-4.

[5]

DASTYCH, M. Instrumentální technika: obor zdravotní laborant. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2010, 131 s. ISBN 978-80-210-4226-1.

[6] FIALOVÁ, L. a VEJRAŽKA M. Metabolismus vápníku a fosforu: Praktické cvičení z lékařské biochemie. Ústav lékařské biochemie 1.LF UK, 2009/2010. [cit. 12.2.2014] Dostupné z: http://che1.lf1.cuni.cz/html/Kost-teorievseobecni0910%20_3_.pdf [7]

FRIEDECKÝ B. a kolektiv, Doporučení k provádění validace a verifikace analytických metod v klinických laboratořích, ČSKB ČLS JEP, 2010

[8]

HENDL, J. Přehled statistických metod zpracování dat: analýza a metaanalýza dat. 1. vyd. Praha: Portál, 2004. ISBN 80-717-8820-1.

[9]

JABOR, A. Vnitřní prostředí. 1. vyd. Praha: Grada, 2008, xxvi, 530 s. ISBN 978-8024712-215.

[10] KLEIN, B., KAUFMAN, J.H., OKLANDER, M., Automated Atomic Absorption Spectrophotometry: Calcium in Urine and Spinal Fluid. Clinical Chemistry 13, 797 (1967) [11] KOMÁREK, J. Atomová absorpční spektrometrie. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2000. ISBN 80-210-2500-X. [12] KOMÍNKOVÁ, J., MESTEK, O. Atomová absorpční spektrometrie. Návod pro laboratorní cvičení na úlohu č.2 AAS pro rok 2013/2014. [cit.18.3.2014]. Dostupné z: http://www.vscht.cz/anl/lach2/AAS.pdf [13] KOPÁČ, J. Lékařská laboratorní diagnostika. 1. vyd. Turnov: Lékařská laboratoř, 2004. - 57 -

[14] KOPLÍK, R. Metody atomové spektrometrie.(přednáška) Analytické metody ve forenzní analýze. [cit.10.2.2014]. Dostupné z: http://web.vscht.cz/~koplikr/6_FA_atomov%C3%A1_%20spektrometrie.pdf [15] KOTLÍK, B., RŮŽIČKOVÁ, K. Chemie I v kostce: obecná a anorganická chemie, výpočty v oboru chemie. 2. vyd. Havlíčkův Brod: Fragment, 1999, 119 s. V kostce. ISBN 80-7200-319-4. [16] KŘÍŽENECKÁ S. Základy analytické chemie. 2007, skripta Univerzita J. E. Purkyně [17] LEDVINA, M., STOKLASOVÁ A., CERMAN J. Biochemie pro studující medicíny. 2. vyd. Praha: Karolinum, 2009, 269 s. ISBN 978-802-4614-144 [18] Manuál statistického softwaru MedCalc. Belgium [cit.15.4.2014]. Dostupné z: http://www.medcalc.org/manual/ [19] MASOPUST, J. Požadování a hodnocení biochemických vyšetření. Vyd. 1. Praha: Avicenum, 1991, 324 s. Zdravotnické aktuality Ministerstva zdravotnictví ČR, 216. ISBN 80-850-4703-9. [20] ONDRÁČEK, P., PROUZA P. Stanovení vápníku. Labor Aktuell. 03/12, s. 23-25. [21] PENKA, M., TESAŘOVÁ E. Hematologie a transfuzní lékařství. 1. vyd. Praha: Grada, 2011, 421 s., 30, 8, 23 s. obr. příl. ISBN 978-802-4734-590. [22] Provozní příručka AnalytikJena: Atomový absorpční spektrometr ConrAA 700 s kontinuálním zdrojem, říjen 2005 [23] RACEK, J. Klinická biochemie. 2., přeprac. vyd. Praha: Galén, 2006, 329 s. ISBN 80726-2324-9. [24] ROKYTA, R. Fyziologie: pro bakalářská studia v medicíně, přírodovědných a tělovýchovných oborech. 1. vyd. Praha: ISV nakladatelství, 2000, 359 s. ISBN 80-8586645-5. [25] SODI, R., BAILEY L.B., GLAYSHER J. et al. Acidification and urine calcium: is it a preanalytical necessity?. Annals of Clinical Biochemistry. 2009-11-04, vol. 46, issue 6, s. 484-487. DOI: 10.1258/acb.2009.009027. [26] SUCHÁNEK, M. a kol. Doporučení pro určení odhadů nejistot výsledků měření/klinických testů v klinických laboratořích, VŠCHT Praha, SEKK Pardubice a FN Ostrava (2005)

- 58 -

[27] TEPLAN, V. Praktická nefrologie. 2., zcela přeprac. a dopl. vyd. Praha: Grada, 2006, xxviii, 496 s., 12 s. barev. obr. příl. ISBN 80-247-1122-2. [28] THEOBALD, H. E. Dietary calcium and health. Nutrition Bulletin. 2005, vol. 30, issue 3, s. 237-277. DOI: 10.1111/j.1467-3010.2005.00514.x. [29] THIN, C. G., THOMSON P. A. Estimation of calcium and magnesium in serum and urine by atomic absorption spectrophotometry. Journal of Clinical Pathology. 1967-0501, vol. 20, issue 3, s. 280-282. DOI: 10.1136/jcp.20.3.280. [30] Uživatelský manuál Roche/Hitachi MODULAR P, 2012 [31] Validační program pro statistické zpracování analytických dat. [cit.8.4.2014]. Dostupné z: http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/ana/validace.pdf [32] VESELÝ, O. Patofyziologie a klinická fyziologie vnitřního prostředí: 4.Homeostáza iontů vápníku a hořčíku. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci, 2013 [cit. 9.1.2014]. ISBN 978-80-244-3793-4. Dostupné z: http://pfyziollfup.upol.cz/castwiki2/ebooks/21/flipviewerxpress.html [33] Vyšetřovací metody - Laboratorní vyšetření ledvinových funkcí. 27.3.2012 [cit.24.1.2014]. Dostupné z: http://pfyziollfup.upol.cz/castwiki2/?p=1550 [34] WILHELM, Z. Co je dobré vědět o vápníku. Praktické lékárenství, Olomouc: SOLEN,s.r.o., 2007, roč. 3/2007, č. 4, s. 184 - 189. ISSN 1801-2434. [35] WILHELM, Z. Stručný přehled fyziologie člověka pro bakalářské studijní programy. Brno: Masarykova univerzita v Brně, 2003, 116 s. ISBN 80-210-2837-8. [36] WILLIS, J. B. Determination of Calcium and Magnesium in Urine by Atomic Absorption Spectroscopy. Analytical Chemistry. 1961, vol. 33, issue 4, s. 556-559. DOI: 10.1021/ac60172a021.

- 59 -

11 PŘÍLOHY Příloha č.1: Tabulka naměřených koncentrací vápníku v moči AAS s diluentem

AAS s diluentem

Fotometrické stanovení s

LaCl3. 7 H2O

Sr(NO3)2

NM-BAPTA

(mmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

1

0,2083

0,2551

0,2300

2

0,4964

0,5155

0,6500

3

0,3059

0,3289

0,3300

4

0,1344

0,1662

0,2600

5

0,1069

0,1218

0,1400

6

1,1930

1,3060

1,3200

7

0,3922

0,4348

0,5800

8

1,4030

1,4340

1,5000

9

2,6000

2,5550

2,3400

10

2,1050

1,8690

1,9400

11

2,0370

2,0560

2,2400

12

3,5230

3,4090

2,9300

13

6,5380

6,3020

6,0500

14

0,5264

0,5037

0,7100

15

1,0160

1,1790

1,2500

16

0,3776

0,4009

0,5400

17

0,1675

0,1755

0,3700

18

0,7652

0,7647

0,9100

19

1,1500

1,2510

1,1700

20

0,6845

0,7630

0,8600

21

0,8344

0,9131

1,0500

22

2,8160

2,7450

2,8000

23

2,2940

2,0950

2,4500

Pořadové číslo vzorku

- 60 -

AAS s diluentem

AAS s diluentem

Fotometrické stanovení s

LaCl3. 7 H2O

Sr(NO3)2

NM-BAPTA

(mmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

24

1,3950

1,6540

1,5900

25

0,7953

0,9447

0,9600

26

0,1466

0,1509

0,2200

27

0,4600

0,5212

0,6000

28

0,4756

0,5896

0,4700

29

2,7080

3,0610

2,9200

30

2,5670

2,7890

2,8000

31

2,9680

3,3860

3,1800

32

1,1800

1,7970

1,0800

33

1,2320

1,4890

1,4600

34

1,0820

1,2900

1,2800

35

0,4691

0,9031

0,5200

36

1,5300

1,7570

1,7400

37

1,6100

1,8411

1,8200

38

1,0900

1,2810

1,1700

39

0,6010

0,7007

0,7700

40

0,1790

0,2296

0,3600

41

0,9154

1,1140

1,0900

42

1,2000

1,4080

1,3900

43

2,5850

2,9680

2,9000

44

0,9077

1,0880

1,1400

45

0,7199

0,8387

0,8100

46

0,5268

0,6377

0,7500

47

0,3655

0,4367

0,5600

48

0,1699

0,2099

0,3300

49

1,2440

1,3130

1,3100

Pořadové číslo vzorku

- 61 -

AAS s diluentem

AAS s diluentem

Fotometrické stanovení s

LaCl3. 7 H2O

Sr(NO3)2

NM-BAPTA

(mmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

50

1,3650

1,4710

1,6200

51

0,5097

0,5431

0,4800

52

0,4048

0,4429

0,5200

53

3,3380

2,9250

3,0000

54

0,5601

0,5744

0,6700

55

0,6317

0,6001

0,6700

56

0,3604

0,3718

0,5400

57

2,5270

2,4580

2,5000

58

0,8269

0,6270

0,7100

59

0,6278

0,4529

0,6100

60

0,9399

0,8047

1,0100

61

0,6125

0,5650

0,7400

62

1,8500

1,7200

1,7000

63

1,2400

1,0990

0,9300

64

0,9226

0,8917

0,9600

65

1,7290

1,2980

1,4900

66

0,2148

0,1459

0,3400

67

4,0640

3,3320

3,5100

68

1,2110

1,2500

1,3700

69

0,9517

0,8906

0,8700

70

0,3818

0,3791

0,5500

71

3,3120

3,2510

3,2900

72

0,3062

0,2959

0,4300

73

0,2583

0,2039

0,3400

74

2,2000

2,2900

2,1800

75

1,0320

1,0130

1,1100

Pořadové číslo vzorku

- 62 -

AAS s diluentem

AAS s diluentem

Fotometrické stanovení s

LaCl3. 7 H2O

Sr(NO3)2

NM-BAPTA

(mmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

76

1,0170

0,9142

1,0900

77

4,4020

4,0720

4,1500

78

0,3595

0,2921

0,2900

79

0,3738

0,3779

0,3700

80

0,7245

0,6678

0,7000

81

1,6900

1,6600

1,7400

82

4,0890

3,9480

4,1600

83

1,0280

1,1530

1,0600

84

3,0570

3,0460

3,0600

85

0,6802

0,6562

0,6600

86

1,1750

1,1530

1,1600

87

3,1920

3,3500

3,2800

88

2,2650

2,3600

2,3400

89

0,5357

0,6817

0,4700

90

0,6473

0,6369

0,5500

91

1,6700

1,7260

1,7400

92

0,2032

0,2143

0,1900

93

1,2460

1,2290

1,2300

94

3,2420

3,2260

3,3400

95

0,4490

0,4204

0,4000

96

0,4881

0,4352

0,4700

97

1,8740

1,8120

1,8500

98

0,8977

0,8726

0,7800

99

0,8579

0,8110

0,8800

100

1,8240

1,8880

1,7300

101

1,3400

1,6080

1,3000

Pořadové číslo vzorku

- 63 -

AAS s diluentem

AAS s diluentem

Fotometrické stanovení s

LaCl3. 7 H2O

Sr(NO3)2

NM-BAPTA

(mmol/l)

(mmol/l)

(mmol/l)

102

2,5080

2,7120

2,5500

103

0,4138

0,3683

0,3800

104

3,6870

3,5000

3,6200

Pořadové číslo vzorku

- 64 -