Masarykova univerzita Lékařská fakulta
STANOVENÍ CELERU JAKO ALERGENU V POTRAVINÁCH METODOU REAL-TIME PCR
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí bakalářské práce:
Autor:
Mgr. Bronislav Šimek
Nela Bednářová
Brno, duben 2014
Jméno a příjmení autora: Nela Bednářová Název bakalářské práce: Stanovení celeru jako alergenu v potravinách metodou Real-time PCR Pracoviště: Laboratoř molekulární biologie, Státní veterinární ústav Jihlava Rok obhajoby bakalářské práce: 2014 Souhrn: Tato práce se zabývá potravinovými alergiemi u lidí a stanovení jednoho z nejagresivnějších potravinových alergenů, celeru, ve stravě. Potravinová alergie je fenoménem 20. a 21. století a určitě patří k horkým tématům alergologických praxí. V práci je popsána metoda stanovení celeru v potravinách metodou Real-time PCR na Státním veterinárním ústavě v Jihlavě.
Klíčová slova: celer, alergie, potravinové alergie, alergeny, PCR, Real-time PCR
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Bronislava Šimka a v seznamu literatury uvedla všechny pouţité literární a odborné zdroje.
V Brně dne .....................................
............………………………. (vlastnoruční podpis autora)
Chtěla bych poděkovat vedoucímu svojí bakalářské práce Mgr. Bronislavu Šimkovi za velkou trpělivost, ochotu, cenné rady a připomínky. Také všem kolegům z laboratoře molekulární biologie SVÚ Jihlava. Dále celé svojí rodině za podporu a velkou trpělivost při mém studiu.
Seznam použitých zkratek a symbolů: CAST
cellular allergen stimulation test
CCD
cross-reactive carbohydrate ceterminants
CCFL
Výbor Codex Alimentarius pro označování
dNTP
deoxynukleotidy
ECP
eozinofilní kationický protein
EFSA
Evropský úřad pro bezpečnost potravin
ELISA
enzymatická imunoassay
FIA
fluoro-imuno-analýza
IgA
imunoglobulin A
IgD
imunoglobulin D
IgE
imunoglobulin E
JECFA
Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
KVS
Krajská veterinární správa
LIA
lumino-imuno-analýza
OAS
orální alergický syndrom
PCR
polymerázová řetězová reakce
RASFF
Rapid Alert System for Food and Feed
RAST
Radioalergosorbent test
RCF
Relative centrifugation force
RIA
radio-imuno-analýza
SVS
Státní veterinární správa
SVÚ
Státní veterinární ústav
SZPI
Státní zemědělská a potravinářská inspekce
Obsah 1 Úvod ......................................................................................................................................8 2 Cíle práce.............................................................................................................................8 3 Teoretická část ..................................................................................................................9 3.1 Alergie ..............................................................................................................................9 3.1.1 Vývoj alergie během ţivota .......................................................................................9 3.1.2 Rozdělení imunopatologických reakcí.....................................................................11 3.1.3 Druhy základních alergických onemocnění .............................................................13 3.1.4 Diagnostika alergických onemocnění ......................................................................15 3.1.5 Léčba alergických onemocnění ...............................................................................18 3.2 Potravinové alergie .......................................................................................................19 3.2.1 Definice potravinové alergie ....................................................................................19 3.2.2 Prevalence potravinové alergie ................................................................................20 3.2.3 Příznaky potravinové alergie ...................................................................................21 3.2.4 Zkříţená alergie (cross reactivity, cross allergy) .....................................................22 3.2.5 Codex Alimentarius .................................................................................................23 3.2.6 Evropská unie, Česká republika - legislativa ...........................................................24 3.2.7 Výjimky z označení alergenních sloţení .................................................................25 3.2.8 RASFF - Rapid Alert System for Food and Feed ....................................................26 3.2.9 Miřík celer (Apium graveolens) ..............................................................................27
4 Praktická část ..................................................................................................................30 4.1 Příjem, typy a zpracování vyšetřovaného materiálu .................................................30 4.2 Typy izolací DNA z vyšetřovaného materiálu ............................................................30 4.2.1 Izolační kit SureFood® - PREP Plant X ..................................................................31 4.2.2 Izolační kit DNeasy® mericon™ Food Kit .............................................................33 4.3 Princip PCR...................................................................................................................34 4.3.1 Detekce chloroplastového genu metodou PCR .......................................................36
4.4 Provedení Real-time PCR ............................................................................................37 4.4.1 Pouţitelnost metody .................................................................................................37 4.4.2 Princip Real-time PCR.............................................................................................37 4.4.3 Praktické provedení Real-time PCR ........................................................................39 4.4.4 Grafický výstup a vyhodnocení Real-time PCR ......................................................42 4.4.5 Specifita Real-time PCR ..........................................................................................43 4.4.6 Detekční limit Real-time PCR .................................................................................44 4.4.7 Přehled vyšetřovaných vzorků na SVÚ Jihlava .......................................................45
5 Diskuze ...............................................................................................................................47 6 Závěr ...................................................................................................................................48 7 Literatura a použité zdroje .........................................................................................49
1 Úvod Alergie patří k velmi aktuálním tématům naší doby. Ať uţ se jedná o alergie potravinové, alergie na léky, na roztoče, na plísně, či jiné. Ţijeme v 21. století, kdy asi kaţdý čtvrtý člověk trpí alergickým onemocněním. Potravinová alergie patří k závaţným onemocněním, nevyhýbá se malým dětem ani dospělým. Pokud je vyšetřením u alergologa a vyšetřením laboratorním potvrzena alergie a pokud se podaří určit potravinový alergen, můţe pacient eliminovat pro něj nevhodné potraviny a svým ţivotním stylem pomoci ke své léčbě. Kontrola potravin ze strany Státních veterinárních ústavů a Krajských veterinárních správ je pro alergiky velmi důleţitá z pohledu dodrţování značení potravin. Díky informacím o alergenech, které jsou uvedeny na obalech potravin, mohou konzumovat vhodné a pro ně neškodné potraviny.
2 Cíle práce Cílem této práce je popis metody Real-time PCR, která se na SVÚ Jihlava pouţívá ke stanovení přítomnosti celeru v potravinách. K tomuto stanovení je nutné v první řadě izolovat DNA z potravin v dostatečné kvalitě a koncentraci. Izolace DNA z potravin je často obtíţná a problémová. Pro získání kvalitní DNA se nám nabízí moţnost pouţití různých izolačních postupů nebo nových komerčních kitů. Cílem práce je také prezentovat stručný přehled vyšetřovaných vzorků na SVÚ Jihlava od roku 2009, tj. od kdy se tento alergen v naší laboratoři stanovuje, do současnosti. Chtěla bych poukázat na alergie a zvláště na potravinové alergie, které v 21. století patří mezi velmi aktuální témata. Také bych chtěla poukázat na důleţitost institucí, které se v době skoro neomezené nabídky potravin a zdánlivého nadbytku a blahobytu snaţí kontrolovat kvalitu potravin a dodrţování příslušných nařízení. Spotřebitel, který koupí potravinový výrobek, musí mít jistotu, ţe je v něm obsaţeno to, co je na obalu výrobku deklarováno. Výrobce, distributor a prodejce potravin nesmí poškozovat zákazníka z pohledu falšování a označování potravin.
8
3 Teoretická část 3.1 Alergie Alergie, slovo, se kterým se setkáváme všichni. Je to obecně známý pojem, se kterým je seznámena široká veřejnost nejen prostřednictvím médií. Alergické choroby jsou jednou z nejčastějších poruch imunity v této době, jednou z nejčastějších poruch imunity u lidí v ekonomicky vyspělých státech. Jsou způsobeny abnormální reaktivitou imunitního systému na antigeny (alergeny) zevního prostředí (Bartůňková aj., 2011). Termín alergia (allos ergos) - jiná reakce - pochází z roku 1906 od vídeňského pediatra Clemense von Pirqueta (Bystroň, 1997). V roce 2006 to tedy bylo teprve 100 let, kdy bylo vysloveno slovo alergie (Fuchs, 2007).
3.1.1 Vývoj alergie během života Aby došlo k rozvoji alergie v organismu, tak musí být splněny základní předpoklady, které působí ve vzájemné součinnosti (Špičák a Panzner, 2004): genetické predispozice senzibilizace vůči alergenům působení doplňujících nespecifických vlivů Genetická predispozice Dědičnost alergických onemocnění je multifaktoriální, polygenní. V klinickém fenotypu se uplatňuje vliv několika genů nebo jejich skupin s negenetickými faktory, jako je například vliv prostředí, ve kterém člověk ţije. Předpokládá se, ţe u alergických stavů existuje více typů různé genetické heterogenity. Různé skupiny genů lze spojit s různou expresí igE, intenzitou zánětu nebo klinickou manifestací. Nelze tedy přesně stanovit typ dědičnosti, ale pro některé geny se udává přenos autozomálně recesivní. V souvislosti s alergií se mluví o oblastech na chromozomu č. 5, 6, 7, 11, 12, 13, 14, 16, 17 a 19 (Špičák a Panzner, 2004). Rodinný výskyt je vysoký a většina epidemiologických studií potvrzuje pozitivní rodinnou anamnézu přibliţně u 50 % případů (Bartůňková a Vernerová, 2002).
9
Senzibilizace vůči alergenům Ve fázi senzibilizace probíhá indukce imunitní reakce mechanismem, kdy buňky prezentující antigen rozpoznají alergen, a indukce specifické T buněčné reakce. Nejčastěji k senzibilizaci dochází na sliznicích. Fáze senzibilizace probíhá inaparentně, klinické projevy vzniknou aţ při opakovaném setkání s alergenem. Časná fáze alergické reakce se rozvíjí hned po opakovaném styku s alergenem. Je zprostředkována uvolněním mediátorů alergické reakce hlavně ze ţírných buněk, na nichţ jsou navázány imunoglobuliny E. Nejčastěji se uplatňuje histamin a heparin. Tyto látky mají vazodilatační účinky, způsobují spasmus hladkých svalů průdušek, podporují sekreci hlenu a stimulují nervová zakončení v kůţi a tím způsobují svědění (Hořejší a Bartůňková, 2009). Pozdní fáze alergické reakce se projeví 8 aţ 12 hodin po akutní fázi. V průběhu pozdní fáze se tvoří sekundární mediátory, hlavně produkty metabolismu kyseliny arachidonové, například tromboxany, prostaglandiny a leukotrieny. Mají protizánětlivý a chemotaktický účinek. Přilákané buňky produkují cytotoxicky účinné mediátory, které jsou zodpovědné za perzistující nebo i trvalé změny postiţených tkání (Hořejší a Bartůňková, 2009). O primární senzibilizaci mluvíme tehdy, kdyţ alergeny působí na dítě v děloze a v prvních dnech a týdnech po porodu. V prvním roce ţivota dítěte, mezi 6. a 12. měsícem, se alergické onemocnění začíná většinou objevovat a mezi 1. a 4. rokem ţivota vzniká klinický obraz alergie. A často přetrvá aţ do dospělosti. Při senzibilizaci hrají hlavní úlohu alergeny a to alergeny potravinové, zvířecí, pylové a roztočové (Špičák a Panzner, 2004). Alergeny jsou většinou bílkovinné povahy s molekulovou hmotností 5 - 100 kD. Mnoho alergenů je jiţ přesně definováno, je známá struktura jejich antigenních součástí a jejich fyzikálně-chemické vlastnosti (Bystroň, 1997).
Působení doplňujících nespecifických vlivů Mezi tyto vlivy řadíme znečištěné ovzduší, nezdravý ţivotní styl, nevhodnou stravu, nevhodné bydlení, málo pohybu, časté prodělání respiračních infekcí (Špičák a Panzner, 2004). Zatím byl prokázán vztah k nárůstu alergie u lidí, kteří kouří aktivně i pasivně cigarety, u změn bydlení lidí, znečištění ovzduší oxidem siřičitým, oxidem dusičným a přítomností dieselových částic (Bartůňková a Vernerová, 2002).
10
Význam infekčních podnětů je základem tzv. hygienické hypotézy, která vysvětluje nárůst alergií v ekonomicky vyspělých zemích na základě preferenční diferenciace Th2 lymfocytů jako následek malé stimulace zánětlivých reakcí v důsledku malého a nedostatečného infekčního tlaku (Hořejší a Bartůňková, 2009). Existuje také vliv emociálního stresu na imunitní systém, například při hojení ran, při aktivitě buněk imunitního systému, při protiinfekční obraně a jiných. Tento efekt je zřejmě způsoben vlivem uvolněných kortikosteroidů (Hořejší a Bartůňková, 2009).
3.1.2 Rozdělení imunopatologických reakcí Za normálních okolností imunitní systém pracuje tak, ţe likviduje škodliviny v našem organismu. Někdy ovšem dojde k neúčinné nebo nadměrné imunitní reakci a ta vede k poškození orgánů a tkání. Tyto poškozující imunitní reakce (imunopatologické) jsou někdy také nazývány reakce přecitlivělosti (Bartůňková aj., 2011). Imunopatologické reakce jsou rozděleny do čtyř základních typů podle Gella a Coombse (Špičák a Panzner, 2004). V rozvoji alergické reakce se uplatňují všechny tyto čtyři typy imunopatologických reakcí (viz. tab. č. 1 a obr. č. 1). O alergii v uţším smyslu se hovoří, pokud se onemocnění rozvíjí na podkladě přecitlivělosti I. typu, tzn. ţe je zprostředkováno protilátkou IgE.(Hořejší a Bartůňková, 2009).
Tab. č. 1 Imunopatologické reakce a paralely s fyziologickými reakcemi (podle Bartůňková a Vernerová, 2002) Typ reakce Imunitní mechanismus
Fyziologická reakce
Patologická reakce
Příklad onemocnění
I.
Vazba IgE na žírné buňky a jejich aktivace antigenem (alergenem)
Vypuzení střevních parazitů
II. a)
Vazba protilátek a aktivace komplementu
Opsonizace, popř. lýza mikroorganismů
Lokálně: místní alergický zánět Systémově: anafylaktická reakce, šok Opsonizace a destrukce vlastních buněk
II. b)
Vazba protilátek
Neutralizace toxinů
Neutralizace sérových proteinů
Alergická rýma, kontaktní dermatitida, astma, anafylaktický šok Autoimunitní hematolytická anémie, trombocytopenie, neutropenie Hemofilie s protilátkami proti faktoru VIII,
Blokování adheze virů
Blokování nebo stimulace buněčných receptorů Usazování imunokomplexů v tkáních Destrukce vlastních tkání neúměrná infekci: autoimunitní choroby Destrukce vlastních neinfikovaných buněk nebo buněk infikovaných relativně neškodnými viry
III.
Tvorba imunokomplexů
IV. a)
Aktivace TH1 a makrofágů
IV. b)
Aktivace cytotoxických lymfocytů TCD8+
Eliminace antigenů, stimulace akutního zánětu Obrana proti intracelulárním bakteriím (tbc, syfilis, lepra) Destrukce buněk infikovaných viry
11
Myastenia gravis, tyreotoxikóza Některé vaskulitidy, glomerulonefritidy, sérová nemoc Rozpadová tbc, sarkoidóza, roztroušená skleróza Kontaktní dermatitida, autoimunitní hepatitidy, virové exantémy
Obr. č. 1 Čtyři typy imunopatologických reakcí (podle Čáp a Průcha, 2006)
12
Imunopatologická reakce I. typu, atopická reakce - časná přecitlivělost Patří sem většina alergických onemocnění, která jsou blízká svojí patogenezí tomuto typu imunopatologické reakce, tj. časná reakce závislá na IgE. Mezi primární faktory řadíme faktory buněčné. Jako příklady buněk, které jsou zapojené do mechanismu rozvoje alergické zánětlivé odpovědi, můţeme zařadit ţírné buňky, eozinofily, bazofily, dále buňky epitelové, endotelové, fibroblasty, neurony a jiné. Komunikace mezi buňkami probíhá pomocí cytokinů, neuropeptidů a enzymů. U atopických, tzn. geneticky predisponovaných, pacientů dochází k patologickým reakcím, které nastanou kontaktem se specifickým antigenem, nazývaným alergen. Při počátečním kontaktu, tzv. senzibilizaci, dojde ke stimulaci diferenciace řady buněk a jejich hromadění v místě, kde proběhla expozice alergenu (Špičák a Panzner, 2004). Tvoří se příslušné protilátky IgE a váţí se na ţírné buňky nebo bazofily. Při dalším kontaktu s alergenem můţe dojít k přemostění molekul IgE na povrchu těchto buněk a okamţitému uvolnění jejich mediátorů jako je heparin a histamin. Následuje tvorba metabolitů kyseliny arachidonové, např. tromboxany a prostaglandiny (Bartůňková a Vernerová, 2002). Je to tzv. časná fáze, která vznikla během několika minut po expozici alergenu. U respiračních alergií se tato fáze projeví kýcháním, svěděním v nose, nosní obstrukcí, hypersekrecí hlenu v průduškách. Během několika hodin vzniká pozdní fáze, která je důsledkem buněčných změn, kdy došlo k další migraci protizánětlivých buněk do tkáně a k jejich aktivaci uvolněnými mediátory a cytokiny. Dochází také k rozvoji eozinofilního zánětu se vznikem strukturálních změn (Špičák a Panzner, 2004).
3.1.3 Druhy základních alergických onemocnění V tab. č. 2 jsou uvedeny základní druhy alergických onemocnění, které se vyskytují u lidí s alergií nejčastěji.
13
Tab. č. 2 Druhy základních alergických onemocnění (upraveno podle Bartůňková aj., 2011) Onemocnění Charakteristika polinóza
celoroční rýma
astma bronchiale alergie na hmyzí jed
potravinová alergie
léková alergie
atopický ekzém
kontaktní ekzém
nejčastější druh alergie, projevuje se rýmou, kýcháním a zánětem spojivek, kašlem, případně dušností, únavou, subfebriliemi chronická rýma nebo obstrukce nosu s kýcháním
Příčinný alergen nebo podnět pylová zrna převážně tzv. anemofilních (větrosplašných) rostlin
roztoči, plísně, domácí zvířata, bakterie, léky, potraviny záchvatovitá dušnost spojená pylová zrna, roztoči, se zánětem dýchacích cest plísně, zvířecí srst, fyzická zátěž, chlad reakce může být místní (otok), žihadlo vosy, včely, ložisková (rýma, dušnost nebo čmeláka, sršně, migréna) nebo generalizovaná kousnutí mravencem, (celotělová kopřivka, píchnutí komárem, anafylaktická reakce) blechou, muničkou může se projevovat různě potraviny živočišného jako ekzém, kopřivka, rýma, i rostlinného původu, astma bronchiale, migréna, nejčastěji kravské porucha soustředění nebo i mléko, vaječný bílek, jako anafylaktická reakce ryby, mořské plody, ořechy, ovoce kopřivka a exantémy, edémy, antibiotika s anafylaktická reakce po požití β-laktamovou skupinou, sulfonamidy, nebo aplikaci léků anestetika, antikonvulziva, antirevmatika ekzém projevující se na potravinové alergeny, různých částech těla psychické vlivy, inhalační alergeny
otisková forma ekzému
kovy, některé chemikálie nebo rostlinné jedy
14
Poznámky typická reakce I. typu zprostředkovaná protilátkami IgE
nejde vždy jen o alergii
alergické i nealergické příčiny reakce může být alergická, anafylaktoidní (podobná anafylaktické) i toxická alergická reakceI.-IV. typu (dle Coombse a Grella), toxické reakce, anafylaktoidní reakce
diagnostika není spolehlivá jen 20% reakcí na léky je skutečně alergických
multifaktoriální onemocnění, může věkem přejít v alergickou rýmu či astma bronchiale, kombinace I. a IV. typu imunopatologické reakce IV. typ imunopatologické reakce, diagnostické jsou kožní náplasťové testy odečítané po 2-3 dnech, laboratorní vyšetření nepřispívá k diagnostice
3.1.4 Diagnostika alergických onemocnění Aby bylo onemocnění správně označeno a zařazeno mezi alergické choroby, musí být nejprve provedeno kvalitní základní vyšetření praktickým lékařem. Úkolem je ujasnit si povahu nemoci a vyloučit ostatní choroby nealergického původu. Vlastní alergologické vyšetření se skládá z anamnézy, fyzikálního klinického vyšetření, koţní testace, laboratorních vyšetření, a pokud je potřeba, tak i z testů provokačních, expozičních nebo epikutánních (Špičák a Panzner, 2004). Hlavním diagnostickým problémem je však stanovení příčinného alergenu. To by mělo být základem určení správné diagnózy onemocnění a provedení potřebných léčebných postupů (Bartůňková aj., 2011).
In vivo Kožní testy Jsou prováděny určitým podezřelým alergenem a slouţí ke stanovení přítomnosti ţírných buněk senzibilizovaných vůči určitému alergenu v kůţi. Pokud testovaný alergen najde korespondující specifické receptory protilátky IgE navázané na ţírné buňky, přemostí dvě sousední molekuly, čímţ aktivuje ţírnou buňku a dojde k tzv. degranulaci zúčastněných buněk. Uvolněný histamin má vazoaktivní účinky a vede k vytvoření otoku, začervenání, pupenu a svědění. Reakci hodnotíme po 5-20 minutách (časná reakce) nebo ještě druhý den (pozdní reakce) (Bartůňková aj., 2011). Koţní test nemá ţádnou výpovědní hodnotu u těch onemocnění, kde není předpokládán atopický podklad (alergie zprostředkovaná IgE). Koţní test není indikován tehdy, kdyţ charakter alergenu nedává předpoklad výskytu IgE-protilátek proti této látce. To je například u některých potravin a léků (Špičák a Panzner, 2004). Prick test Je to základní a nejuţívanější koţní test. Provádí se na volární straně předloktí nebo na zádech. Standardní provedení prick testů je zaručeno pouţitím speciálních lancet s dlouhým ostrým hrotem. Je tím zaručena aplikace alergenu vhodným způsobem. Alergen je nanesen na kůţi očištěnou alkoholem formou kapky a lancetou je provedena imprese středem kápnutého alergenu. Dojde k narušení povrchové vrstvy kůţe a průniku alergenu do místa reakce. Musí se také provádět negativní kontrola pomocí ředícího roztoku a pozitivní kontrola pomocí histaminu nebo kodein fosfátu (Bartůňková aj., 2011). Jednotlivá místa aplikace testovaného alergenu můţeme označit po straně například fixem, aby byl usnadněn 15
odečet výsledků (Špičák a Panzner, 2004). Pozitivní puchýřek nabývá velikosti 2-3 mm v průměru (Bartůňková aj., 2011). Intradermální test Kůţi dezinfikujeme 1 % Jodisolem, stříkačkou intradermálně aplikujeme 0,02-0,05 ml alergenu tak, aby vznikl pupen o velikosti asi 3 mm. Mezi jednotlivými testy dodrţujeme vzdálenost nejméně 5 cm, aby nedošlo k překrytí jednotlivých reakcí (Špičák a Panzner, 2004). Opět je nutné provést pozitivní a negativní kontrolu. Pozitivní pupen by měl mít velikost o průměru minimálně 5 mm (Bartůňková aj., 2011). Eliminační testy Zde se sleduje ústup alergických příznaků pacienta po odstranění vyvolávajících agens. Tento princip se pouţívá hlavně při hledání podezřelého potravinového alergenu. Po vysazení podezřelého potravinového alergenu vymizí klinické příznaky alergie (Litzman aj., 2007). Eliminace vyvolávajících alergenů je však obtíţná a ne vţdy se setká s pochopením rodiny pacienta. Je však nezbytná jako základní předpoklad úspěšné léčby (Bartůňková a Vernerová, 2002). Expoziční testy V tomto případě se jedná o snahu vyvolat alergickou reakci přímo v klinicky postiţeném orgánu pacienta. U nemocných s alergickou rýmou se pouţívá intranazální aplikace alergenu. Test lze také pouţít při vyšetření potravinové nebo lékové alergie (Litzman aj., 2007). Epikutánní (plátenkový) test Tento test se pouţívá při vyšetření IV. typu přecitlivělosti. Setkáváme se s ním nejčastěji v dermatologii. Alergenem jsou nízkomolekulární látky, které pronikají epidermis a vyvolávají vznik alergen-specifických T-lymfocytů. Klinickým projevem je alergická kontaktní dermatitida. Při epikutánním (plátenkovém) testu je podezřelý antigen vnesen do masťového základu a aplikován na malou oblast kůţe pacienta. Poté je toto místo překryto celofánem a náplastí na 24-48 hodin. Poté se náplast odstraní, místo omyje a reakce je odečítána za dalších 24 hodin. Pozitivní reakce se projeví vznikem lokalizovaného erytému (Litzman aj., 2007).
16
Laboratorní diagnostika Stanovení koncentrace IgE Hladina
imunoglobulinu E
v séru
pacienta
je
ve
srovnání
s hladinami
ostatních
imunoglobulinových tříd zanedbatelná (Bartůňková a Vernerová, 2002). Celková koncentrace IgE v séru pacienta úzce koreluje s přítomností alergie u pacienta. Specifita u tohoto ukazatele je téměř 90 % a senzitivita 30-40 %. U dospělých je hranice fyziologických hodnot IgE 50150 IU/ml, u dětí je závislá na věku. Normální celková koncentrace IgE nevylučuje přítomnost alergie, zvýšenou hladinu IgE můţeme nalézt u celé řady jiných onemocnění, například parazitární onemocnění, nosní polypóza a jiné. I při normální hladině celkového IgE můţeme nalézt zvýšené hladiny specifických IgE (Bartůňková aj., 2011). Hladina celkového IgE se obvykle vyšetřuje nefelometricky nebo ELISA technikami. O hladině imunoglobulinů nás velmi zhruba informuje procentuální zastoupení gama-frakce při elektroforéze sérových bílkovin (Litzman aj., 2007). Stanovení koncentrace specifických IgE Specifický IgE je IgE namířený proti konkrétnímu alergenu. Vyšetřuje se velmi citlivými metodami zaloţenými na značených imunochemických reakcích jako je například ELISA, LIA, RIA a FIA. Toto vyšetření je indikováno tehdy, kdyţ u pacienta nelze provádět koţní testy (Litzman aj., 2007). Senzitivita vyšetření specifického IgE v séru pacienta je 70-80 %, ale kolísá pro jednotlivé alergeny. Lepší výsledky dosahujeme u pylových alergenů a horší například u potravinových alergenů (Bartůňková aj., 2011). Starší test pro vyšetření specifických IgE se nazývá RAST (radioallegrosorbent test) (Bartůňková aj., 2011). Koncentrace specifických IgE se vyjadřuje v jednotkách IU/ml nebo také pomocí skóre (či třídy) 0-6. Třída 0 značí nedetekovatelné specifické protilátky IgE, třídy 1-6 stoupající hodnoty specifického IgE (Bartůňková aj., 2011). Testy detekující uvolnění mediátorů po expozici alergenu in vitro Test uvolnění histaminu je zaloţený na kvantifikaci histaminu uvolněného z bazofilů po inkubaci s alergenem in vitro. Kvantifikace se provádí ELISA nebo RIA technikou. Dalším příkladem je tzv. CAST test, kdy je měřena hladina sulfido-leukotrienů po stimulaci leukocytů IL-3 a alergenem in vitro. Tyto testy jsou však v současné době pouţívány především pro výzkumné účely. Jejich nevýhodou je vysoká cena a vysoké nároky na vybavení laboratoře (Špičák a Panzner, 2004).
17
Aktivace bazofilů po expozici alergenu Tento postup je vyuţíván spíše pro výzkumné účely. Po expozici alergenu dochází k aktivaci bazofilů s navázanými molekulami alergen-specifického IgE na povrchu buňky. Dojde ke změnám exprese některých povrchových struktur buněk. Sleduje se změna exprese antigenu CD63 pomocí průtokové cytometrie (Špičák a Panzner, 2004). Stanovení mediátorů alergické reakce v tělesných tekutinách Pouţívají se techniky zaloţené na principu sandwichové enzymoimunoeseje, jako je ELISA, chemiluminiscence a jiné. Stanovuje se například hladina mastocytové tryptázy v séru a eozinofilní kationický protein (ECP) (Špičák a Panzner, 2004). 3.1.5 Léčba alergických onemocnění Léčba alergického onemocnění by měla být komplexní a měla by zahrnovat několik kroků (Bystroň, 1997).
Odstranění alergenu Pokud víme, který alergen je původcem alergických obtíţí, tak je většinou snadné tento alergen eliminovat a způsobit ústup projevů alergie. Týká se to některých sloţek potravy, alergií na domácí zvířata, lékových alergií. U alergií na vdechované látky, jako jsou pyly, roztoči a jiné, je tato eliminace obtíţnější. Doporučují se taková opatření, která sniţují kontakt pacienta s alergenem (Špičák a Panzner, 2004).
Farmakoterapie Mezi základní skupiny léků, které se pouţívají pro terapii alergóz, patří antihistaminika, antileukotrieny, anticholinergika, kortikosteroidy, kromony, sympatomimetika a metylxantiny (Špičák a Panzner, 2004).
Léčba podpůrná Mezi podpůrnou léčbu patří dostatek spánku, otuţování, zdravá výţiva a sportování. Tedy zdravý ţivotní styl, kdy nám při správném dodrţování nehrozí ţádné vedlejší účinky (Špičák a Panzner, 2004). Mezi důleţité pomocné léčebné postupy patří lázeňská léčba a rehabilitace, speleoterapie a pobyty v přímořských oblastech (Bystroň, 1997). 18
3.2 Potravinové alergie Ze všech typů alergií se chci blíţe věnovat potravinovým alergiím způsobeným celerem. Celer patří k velmi agresivním potravinovým alergenům a potvrzení jeho přítomnosti nebo nepřítomnosti v potravinách je velmi důleţitou informací pro osoby trpící potravinovou alergií na celer.
3.2.1 Definice potravinové alergie Motto: Titus Lucretius Carus (55 let př. n. l.): Co je pro jednoho člověka potravou, pro jiného můţe být prudkým jedem (Bystroň, 1997). Jiţ před více neţ 2000 lety podal Hippokrates první doklad o neţádoucí reakci na potraviny a to na mléko (Bystroň, 1997). Kdyţ se někomu ve starověku udělalo špatně, zvracel, měl křeče v břiše, otekl v obličeji, vysela se mu kopřivka a dusil se, lidé sváděli všechny tyto příznaky na otravu jedem. Bylo to období travičství. Určitě uţ tehdy mnoho reakcí na pití a jídlo bylo vyvoláno potravinovou alergií. Ovšem slovo alergie nebylo v této době známé (Fuchs, 2007). Potravinová alergie je stav, který musí mít imunologický základ a nejčastěji vzniká na podkladě imunopatologické reakce I. a IV., popřípadě III. typu. Pro nás nejsrozumitelnější je alergie I. typu. Tato alergie je zprostředkovaná protilátkami IgE - pravá atopie. K potravinovým alergiím řadíme také stav zprostředkovaný jinými typy imunoglobulinů, např. IgG, IgA. Dále stav zprostředkovaný imunokomplexy, např. alergie III. typu, nečastěji s IgG. Dále sem řadíme stav zprostředkovaný imunokompetentními lymfocyty T (alergie IV. typu). Nejedná se o celkový výčet imunologických příčin potravinových alergií, probíhají další intenzivní studie těchto příčin (Špičák a Panzner, 2004). Víme, ţe téměř všechny potravinové alergeny jsou proteiny. A jakékoliv jídlo, které obsahuje proteiny, můţe u některých jedinců vyvolat potravinovou alergii. Existují však některé potraviny, které mohou potravinovou alergii vyvolat častěji neţ jiné (Kvasničková, 1998). Význam jednotlivých potravinových alergenů je dán také různými stravovacími návyky národů. V přímořských státech jsou to hlavně alergeny mořských ryb a plodů moře, v USA hlavně arašídy, v Japonsku sója a podobně. V České republice je to hlavně kravské mléko, vaječný bílek, ořechy, obiloviny, ovoce, zelenina a ryby. Také jsou to pro nás exotické potraviny a to kiwi, ananas a mořské plody (Hamplová, 2009).
19
Pokud chceme mluvit o potravinových alergiích, musíme také rozlišovat tři pojmy. A to potravinovou alergii, potravinovou intoleranci a pseudoalergii (přecitlivělost na potraviny). Podstatou potravinové alergie je imunologická přecitlivělost a podstatou potravinové intolerance je nedostatek či chybění nějaké látky, která se podílí na zpracování potravy (Fuchs, 2007). Potravinová intolerance není způsobená imunitní reakcí, ale je způsobená metabolickou poruchou. Jedná se o absenci nebo nedostatek určitých látek, například enzymů, které se podílejí na zpracování potraviny. Příkladem je laktázová intolerance, která je způsobená nedostatkem laktázy, coţ je enzym štěpící mléčný cukr (Pavelková a Burešová, 2012). Pseudoalergie (přecitlivělost na potraviny) je neţádoucí reakcí na potravinu, která je způsobena přecitlivělostí organismu na některou ze sloţek potraviny. Mohou se objevovat příznaky podobného typu jako u potravinové alergie. Pseudoalergie je často způsobena potravinou, která obsahuje více histaminu. Je to např. sýr, červená vína, zkaţené ryby a jiné (Pavelková a Burešová, 2012).
3.2.2 Prevalence potravinové alergie Pokud nebudeme zohledňovat věk, tak prevalence potravinové alergie je 2-3,2 %.V dřívější době, kdy hlavním kritériem byly subjektivně zaměřené průzkumy, se výskyt potravinových alergií uváděl 10-15 %, někdy dokonce aţ 25 %. K těmto omylům přispívala hlediska psychosomatická, kdy lidé vlivem médií a zkreslených informací zaujali negativní postoje k některým vybraným potravinám, tzv. potravinová averze. Dále se jednalo o přímý toxický účinek potravin, jako jsou například endotoxiny a exotoxiny (Špičák a Panzner, 2004). Dalším důleţitým faktorem, který ovlivňuje výskyt potravinové alergie, je věk pacienta (Špičák a Panzner, 2004).
Prevalence - mladší děti do 3 let Výskyt potravinové alergie u dětí se udává v rozmezí 4-8 %. U dětí ve věku do 3 let vede alergie na bílkovinu kravského mléka (Špičák a Panzner, 2004). Alergie na kravské mléko je alergií na celoevropsky nejrozšířenější potravinu vůbec (Fuchs, 2007). Následuje alergie na vaječné bílkoviny, na moučné bílkoviny včetně gliadinu, sóji, ořechů, ryb, ovoce a zeleniny. (Špičák, Panzner, 2004).
20
Důleţitým faktorem vzestupu potravinových alergií u dětí je brzké zařazování příkrmů do stravy kojence, kdy je trávící systém nezralý a snadno dochází k senzibilizaci na různé antigeny, které se nachází v přijímané stravě (Dučaiová a Litvínová, 2011). Potravinová alergie u malých dětí má tendenci k tzv. vyhasínání, jak klinicky, tak i ve vyšetřovacích metodách. Důvody k tomuto vyhasínání nejsou známé, pohybují se pouze v oblasti hypotézy. Moţná souvisí s vyzráváním enzymového systému gastrointestinálního traktu. Aktivita enzymů malých dětí dosahuje schopností dospělých osob aţ kolem 3. roku věku. Do té doby je předpokládána nedokonalá hydrolýza bílkovin. Asi 70-85 % dětí svoji potravinovou alergii na bílkoviny syrovátky, vajíčka a jiné základní potraviny ztrácí. Pokud má však dítě přecitlivělost na alergeny odpovídající věku dospělého, pak tato přecitlivělost vyhasíná vzácně (Špičák a Panzner, 2004).
Prevalence – starší děti a dospělé osoby U dospělých nacházíme na prvním místě alergií různé druhy ořechů, na ryby, měkkýše, korýše, sóju, mouku, sýry, mák, aditiva, ovoce a zeleninu (Špičák a Panzner, 2004).
3.2.3 Příznaky potravinové alergie Mezi základní gastrointestinální projevy řadíme odmítání stravy, nechutenství, zvracení, nauzeu, akutní a chronický průjem, břišní koliky, pálení ţáhy, pocity plnosti, orální alergický syndrom (Špičák a Panzner, 2004).
Orální alergický syndrom Označovaný OAS, někdy také nazývaný orální alimentární syndrom. S tímto syndromem se setkáváme jak u dospělých, tak i u dětí. Tento syndrom nalezneme u pacientů s přecitlivělostí na pylové alergeny, olši, lísku, břízu, trávy, obilí, pelyněk a ambrozii. Pacient po snězení potraviny rostlinného původu, například ovoce, zeleniny nebo obilných produktů, ucítí pálení jazyka, rtů, začne kýchat, nastane porucha polykání, otoky v obličeji. Ve vzácnějším případě aţ anafylaktický šok. Při OAS jde tedy o zkříţenou reakci, která je daná podobným či totoţným alergenem v potravině i v pylovém zrnku. Potravinový alergen je tedy produktem rostliny, která je nějak botanicky spřízněna s rostlinou, na kterou je pacient inhalačně v době květu alergický (Špičák a Panzner, 2004). 21
Koţní projevy potravinové alergie mohou být svědění, exantémy, atopická dermatitida, dermatitis herpetiformis, urtikárie aţ angioedémy, vzácněji purpury (Špičák a Panzner, 2004). Mezi respirační projevy potravinové alergie řadíme svědění či kýchání, nosní obstrukci, kašel, astmatickou dušnost, laryngální dušnost, laryngální edém, izolované oční projevy (Špičák a Panzner, 2004).
Anafylaxe Anafylaxe je soubor velmi závaţných aţ ţivot ohroţujících náhle vzniklých příznaků ve více systémech a to v koţním, respiračním, kardiovaskulárním, gastrointestinálním. Tyto příznaky jsou způsobeny účinkem biologicky aktivních mediátorů uvolněných z tkáňových mastocytů a z bazofilních leukocytů, obvykle senzibilizovaných po předchozím kontaktu s alergenem. Mezi nejznámější a nejčastější alergeny, které způsobují anafylaxi, patří léky, potraviny a jed hmyzu. Z potravin jsou to ořechy, mléko, celer, vejce, ryby a měkkýši. Z léků to jsou hlavně antibiotika a z hmyzu včela a vosa (Špičák a Panzner, 2004). V České republice je kaţdoročně hospitalizováno pro závaţné alergické reakce kolem 2000 lidí a je zaznamenáno kolem 5 úmrtí na anafylaktický šok. Riziko vzniku anafylaxe stoupá s délkou a frekvencí expozice alergizující látce (Krčmová a Petrů, 2007). Celer je jeden z nečastějších vyvolavatelů anafylaktické reakce vůbec (Čáp a Průcha, 2006).
3.2.4 Zkřížená alergie (cross reactivity, cross allergy) Rozhodující pro existenci zkříţené alergie je shodnost nebo pouze podobnost (homologie) bílkovin. Homologie alergenů mezi jednotlivými druhy shodných tříd je z botanického i zoologického hlediska pochopitelná. Odhad hovoří o tom, ţe shoda aminokyselinových sekvencí kolem 50 % je uţ významná pro existenci zkříţené alergie, optimum je mezi 70 aţ 80 %, kdy je zaručena přítomnost většího mnoţství totoţných epitopů. Při velmi blízké podobnosti nad 80 % nehovoříme o homologii, ale o panalergenech (Špičák a Panzner, 2004). Klasickým příkladem zkříţených alergenů jsou rostlinné potraviny a pyly, roztoči a korýši, vaječné bílkoviny a peří (Fuchs, 2007). Některé případy homologních alergenů jsou tak rozšířené, ţe si vyslouţily svá označení. Jako příklad můţeme uvést syndrom bříza-ovoce-zelenina-ořechy nebo syndrom celer-mrkevpelyněk-bříza-koření (Špičák a Panzner, 2004). 22
Víme, ţe osoby s alergií na pyly stromů jako je olše, habr, dub, líska a bříza, často trpí intolerancí k zelenině, ořechům a ovoci. Lidé s alergií na pyl trav a plevelů jsou často citliví na mrkev, celer, brambory a různá koření (Kvasničková, 1998). Zkříţená alergie nemusí pro pacienta automaticky znamenat obtíţe. Předpokládá se jen určité riziko, moţnost vzniku obtíţí na podkladě příbuznosti a podobnosti (Fuchs, 2007). Tab. č. 3 uvádí příklady zkříţené reaktivity některých rostlinných alergenů.
Tab. č. 3 Příklady zkříţené reaktivity rostlinných potravin (upraveno podle Fuchs, 2007) Potravina (rostlinný alergen) jablko
Klinický význam
meloun
nízký až střední
mrkev
vysoký
celer
vysoký
rajské jablko
nízký
vysoký
Velmi častá zkřížená reakce bříza
Méně častá zkřížená reakce třešeň, broskev, celer
celer, latex, ambrózie celer, pelyněk, bříza
banán, mrkev, srha aj. trávy petržel - i nať, koření
mrkev, petržel, koření - mix bříza, bojínek, žito - pyl
paprika - červená i jiná arašídy, jablko, latex, pelyněk
Předpokládaná zkřížená reakce hruška, brambory, rajské jablko, trávy, pelyněk, ambrózie jitrocel, okurka, cuketa okurka, mango, hlávkový salát, meloun-různé druhy okurka, mango, meloun-různé druhy brambory, celer
3.2.5 Codex Alimentarius Codex Alimentarius je mezinárodní a mezivládní instituce, která se podílí na tvorbě norem pro zdravotní nezávadnost potravin a norem pro ochranu spotřebitelů a pro usnadnění světového obchodu s potravinami. V roce 1993 Výbor Codex Alimentarius pro označování (CCFL)
vypracoval
pracovní
dokumentaci
na
uznávání
potencionálních
alergenů
v potravinách. Proběhla spolupráce Norska, Finska, Švédska, Islandu a technického konzultačního střediska FAO pro potravinové alergie v Římě. Byl vypracován seznam sloţek a potravin, které se musí na obale potravin vţdy deklarovat: obiloviny obsahující gluten- ţito, pšenice, ječmen, oves, špalda a jejich hybridi korýši a výrobky z korýšů vejce a výrobky z nich 23
ryby a výrobky z ryb sója, burské oříšky a výrobky z nich mléko a mléčné výrobky včetně laktózy ořechy a výrobky z ořechů oxid siřičitý o koncentraci rovna nebo více 10 mg/kg (Pavelková, Burešová, 2012)
Tento seznam byl Komisí Codex Alimentarius přijatý v červnu 1999 jako konečný text. Přidávání nebo ubírání látek provádí Výbor Codex Alimentarius pro označování (CCFL) díky informacím obdrţeným od JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) (Pavelková a Burešová, 2012).
3.2.6 Evropská unie, Česká republika - legislativa V EU je označování alergenů v potravinách řešeno směrnicí 2000/13/ES a změnovou směrnicí 2003/89/ES, 2006/142/ES a 2007/68. Směrnice 2005/26/ES a 2005/63/ES stanovují seznam sloţek potravin nebo látek prozatímně vyřazených z přílohy IIIa směrnice 2000/13/ES. S výjimkou Japonska a Švýcarska nejsou nikde kromě lepku a oxidu siřičitého stanoveny hodnoty prahových alergenů (Suková, 2011). V příloze č. 1 vyhlášky č. 113/2005 Sb. o způsobu označování potravin a tabákových výrobků, která je harmonizována se směrnicí č. 2000/13/ES o sbliţování právních předpisů členských států týkajících se označování potravin, jejich obchodní úpravy a související reklamy, najdeme seznam alergenních sloţek, které je nezbytné na obale potraviny značit. Do tohoto seznamu patří: obiloviny osahující lepek (tj.pšenice, ţito, ječmen, oves, pšenice špalda, kamut nebo jejich hybridní odrůdy) a výrobky z těchto obilovin, vyjímku tvoří glukosový sirup a dextrosa z pšenice, maltodextriny na bázi pšenice, glukosový sirup vyrobený z ječného škrobu a obiloviny, které se pouţívají k výrobě destilátů nebo lihu zemědělského původu korýši a výrobky z nich vejce a jejich výrobky ryby a výrobky z nich kromě rybí ţelatiny pouţívané jako nosič u vitaminových a karotenoidních přípravků nebo pouţívané jako čeřidlo při výrobě vína a piva jádra podzemnice olejné (arašídy) a výrobky z nich celer a výrobky z něj 24
hořčice a výrobky z ní sezamová semena a výrobky z nich siřičitany a oxid siřičitý v koncentracích vyšších neţ 10 mg/l nebo 10 mg/kg mléko a výrobky z něj, včetně laktózy s výjimkou syrovátky, která se pouţívá k výrobě destilátů nebo lihu zemědělského původu pro lihoviny a jiné alkoholické nápoje a lacitolu suché skořápkové plody, tj. mandle, lískové ořechy, vlašské ořechy, kešu ořechy, pekanové ořechy, para ořechy, pistácie, makadamie a queensland a výrobky z nich kromě suchých skořápkových plodů, které se pouţívají k výrobě destilátů nebo lihu zemědělského původu pro lihoviny a jiné alkoholické nápoje sójové boby a výrobky z nich kromě zcela rafinovaného sójového oleje a tuku, přírodní směsi tokoferolů, přírodního D-alfa tokoferolu, přírodního D-alfa tokoferolacetátu, přírodního D-alfa tokoferolu sukcinitu získaného ze sójových bobů, rostlinného oleje, který je získaný z fytosterolů a esterů fytosterolů ze sójových bobů, rostlinný stanol ester vyrobený ze sterolů z rostlinného oleje ze sójových bobů. Vyhláškou č.101/2007 Sb. se mění vyhláška č. 113/2005 Sb. (směrnice 2006/142/ES), v příloze č. 1 zůstává 12 alergenních sloţek a přidávají se další alergenní sloţky (Pavelková a Burešová, 2012): měkkýši a výrobky z nich vlčí bob (lupina) a výrobky z něj
Detekce potravinových alergenů molekulárně biologickými metodami je dána Českou technickou normou ČSN EN 15634-1 z února 2011. Tato norma je českou verzí evropské normy EN 15634-1:2009 (Úřad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, 2011).
3.2.7 Výjimky z označení alergenních složení nebalené potraviny potraviny, které jsou zabaleny v obalech s plochou menší neţ 10 cm², skleněné, které nemají etiketu
25
Spotřebitelé, kteří nakupují nebalené potraviny, jsou tedy znevýhodněni ve výběru, protoţe nemají moţnost získat informace o přítomnosti alergenních sloţek. Změnu však přinese nařízení č. 1169/2011, kdy budou mít provozovatelé potravinářských podniků povinnost poskytovat informace o alergenních sloţkách přítomných v nebalených potravinách. Další změnou bude povinnost odlišit alergenní sloţky od ostatních sloţek například jiným typem písma, jinou barvou písma nebo pozadím písma (Pavelková a Burešová, 2012).
Preventivní označování Jedná se vlastně o dobrovolnou informaci, kterou provozovatel poskytne v rámci odpovědného přístupu. Cílem je upozornit spotřebitele na riziko nezáměrné kontaminace potraviny alergenní sloţkou a umoţnit tak osobám s alergií informovaný výběr potravin a předcházení neţádoucím reakcím na některou ze sloţek potravin. Příčinou této nezáměrné kontaminace je pouţití surovin kontaminovaných alergenní sloţkou nebo kříţovou kontaminací při výrobě. Preventivní označení se pouţívá pouze tehdy, kdy alergenní sloţka nebyla vědomě pouţita při výrobě určité potraviny a tato potravina ji přesto malé mnoţství obsahuje. I přesto, kdy byla realizována všechna preventivní opatření při výrobě, aby se zabránilo kontaminaci (Pavelková a Burešová, 2012). Deklarace preventivního označení však ţádného provozovatele potravinářského podniku nezbavuje odpovědnosti za bezpečnost potraviny ve vztahu obsahu alergenní sloţky. Provozovatelé potravinářských podniků by tedy preventivní značení měli pouţívat pouze při splnění některých podmínek (Pavelková a Burešová, 2012): preventivní označení musí být odůvodněné provozovatel musí přijmout taková opatření, aby zamezil kontaminace alergenní sloţkou
3.2.8 RASFF - Rapid Alert System for Food and Feed Je to systém rychlého varování pro potraviny a krmiva, slouţí k oznamování přímého nebo nepřímého rizika pro lidské zdraví pocházejícího z potraviny nebo krmiva. Umoţňuje rychlé a účinní sdílení informací o nebezpečných potravinách nebo krmivech mezi členy systému: Evropskou komisí, členy EU a EFTA (Island, Norsko a Lichtenštejnsko) a Evropským úřadem pro bezpečnost potravin (EFSA). RASFF byl zřízen na základě článku 50 Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č.178/2002, ve všech členských státech a v Evropské komisi byla zřízena kontaktní místa, mezi nimiţ probíhá výměna 26
informací. Pokud má nějaký člen informace o závaţném zdravotním riziku u potravin či krmiv, musí prostřednictvím RASFF okamţitě informovat Evropskou komisi. Ta vyhodnotí hlášení a předává je dál všem členům RASFF pomocí různých typů oznámení. Členové provedou patřičné kroky dle typu oznámení a poté informují Komisi o přijatých opatřeních. Fungování RASFF v České republice je upraveno Nařízením vlády č. 98/2005 Sb. a kontaktním místem je Státní zemědělská a potravinářská inspekce (Informační centrum bezpečnosti potravin, internetový portál). Příkladem
fungující
spolupráce
je
hlášení
z 31. 8. 2012,
kdy
internetové
stánky
bezpecnostpotravin.cz ve spolupráci s RASFF a SVS ČR vydaly Tiskovou zprávu SVS ČR o nálezu nedeklarovaného celeru v konzervě guláše. (SVS ČR, 2012, tisková zpráva). Obr. č. 2 ukazuje oficiální logo RASFF.
Obr. č. 2 Logo RASFF (Informační centrum bezpečnosti potravin, internetový portál)
3.2.9 Miřík celer (Apium graveolens) Vědecká klasifikace Říše:
rostliny
Podříše:
cévnaté rostliny
Oddělení:
krytosemenné
Třída:
vyšší dvouděloţné
Řád:
miříkotvaré
Čeleď:
miříkovité
Rod:
miřík
Druh:
miřík celer
27
Variety (odrůdy) Existují tři odrůdy celeru (Wikipedie, miřík celer, 2014, internetový portál): Celer řapíkatý (Apium graveolans var. dulce) - obr. č. 3 Celer bulvový (Apium graveolans var. rapaceum) - obr. č. 4 Celer listový (Apium graveolans var.secalinum) - obr. č. 5
Obr. č. 3 Celer řapíkatý
Obr. č. 4 Celer bulvový
Obr. č. 5 Celer listový
Latinský název celeru vlastně znamená celer vonný. Je to velmi aromatická rostlina. Lidé znají celer uţ velmi dlouho, staří Egypťané celer nepouţívali k jídlu, ale jeho listy nosili při pohřebních obřadech. Celer byl znamením smutku a smrti. Tuto rostlinu také doprovází pověst přírodního afrodisiaka. Název této aromatické rostliny pochází z německého slova Zeller, u nás se začal pouţívat aţ v druhé polovině 19. století. Do té doby se mu říkalo Opich (Muchka, 2009). Celerová nať a duţina bulvy obsahuje mnohé cenné látky, jsou to vitamíny C, B1, B2, z minerálních látek vápník, sodík, draslík, hořčík, fosfor, dále silice, puriny, glycidy a bílkoviny. V naší kuchyni je pouţívaný velmi hojně, často v kombinaci s další kořenovou zeleninou jako je mrkev a petrţel. Pouţívá se jak ve studené, tak i v teplé kuchyni. Pouţívá se při vaření polévek, omáček, pečení masa, přidává se do různých studených zeleninových salátů. Celer můţeme zařadit také mezi koření, je to díky aromatickýma nahořklým semenům.
28
Tato semena se pouţívají k výrobě tzv. celerové soli. Tato celerová sůl se pouţívá jako koření rybích a zeleninových pokrmů (Wikipedie, miřík celer, 2014, internetový portál). Rostlina je tvořena kořenem (bulvou) a stonky (řapíky). U alergických osob se vyskytuje častěji alergie na bulvu neţ na řapíky. Alergizující potenciál sušeného celeru je srovnatelný se schopností syrového celeru vyvolat alergickou reakci. Celer obsahuje minimálně tři skupiny alergizujících bílkovin (Kvasničková, 2011): Api g1 - je homologický s Bet v1, který je hlavním alergenem pylu břízy Api g4 (profilin) - je homologický se sekundárním alergenem pylu břízy a pelyňku CCD (Cross-reactive Carbohydrate Determinants) - patří mezi ně hlavně Api g5 (proteoglykan).
Tým vědců v Německu se zaměřil na hledání dalších potenciálních alergenů v celeru a za pouţití molekulárních metod identifikovali molekulu označenou jako Api g 2. Je to nespecifický protein v celeru, který přenáší lipidy (nsLTP). IgE protilátky specifické vůči Api g 2 kříţově reagují s nsLTP, které lze najít v broskvích a pelyňku (Kvasničková, 2011). Celer patří na celém světě k nejagresivnějším alergenům. Není to způsobeno tím, ţe by na světě byl relativně vyšší počet lidí alergických na celer, ale tím, ţe reakce na syrový celer má tendenci přecházet do celkových příznaků, včetně moţnosti nebezpečí anafylaktického šoku (Fuchs, 2007). Vzhledem ke schopnosti zkříţeně reagovat, je přecitlivělost na celer často spojená s alergií na pyl břízy a pelyňku (Kvasničková, 2011). Víme, ţe stabilita alergenů se sniţuje se zvyšující se teplotou. Máme málo informací o mnoţství celeru, které nevyvolá neţádoucí reakci. Uvádí se ale, ţe lokální symptomy se můţou vyskytnout při dávce 0,2-2,7 g celeru, symptomy celého organismu při dávce 7,531 g celeru. Celer ve formě koření můţe vyvolat neţádoucí reakci při mnoţství 0,16-5,85 g celeru. Mnoţství celeru schopné vyvolat alergickou reakci je podobné u syrového celeru a tepelně opracovaného celeru. Osoby, které reagují na syrový celer, reagují i na celer tepelně opracovaný (Kvasničková, 2011). Výzkumný ústav potravinářský v Praze zkoumal moţnost úplné odstranění nebo sníţení alergizujícího
potenciálu
celeru
pomocí
oxidace
za
vyuţití
přirozeného
obsahu
polyfenoloxidázy v celerové šťávě. Výsledky tohoto zkoumání a testování však byly rozdílné a proto nebylo moţné vypracovaný postup povaţovat za bezpečný (Kvasničková, 2011). 29
4 Praktická část 4.1 Příjem, typy a zpracování vyšetřovaného materiálu Na SVÚ Jihlava jsou přijímány vzorky, které byly doručeny poštou, svoznými linkami, nebo byly doručeny osobně. Potraviny, které podléhají rychlé zkáze, je nutné zpracovat hned, nebo je uloţit při patřičné teplotě dle charakteru vzorku. Teplota uchování vzorku záleţí na typu potraviny, můţe to být pokojová teplota, chladničková teplota 4°C, nebo je potravina zamraţena při -18°C. Teplota, při které jsou vzorky uchovávány, je důleţitá k tomu, aby laboratoř dosahovala standardních výsledků. Vzorky jsou vyšetřovány na ţádost soukromých potravinářských firem jako komerční zakázka nebo na ţádost inspektorátů Státní veterinární správy nebo Státní zemědělské a potravinářské inspekce. Vzorek je řádně označen, zapsán do laboratorního systému a poté zpracován v Laboratoři molekulární biologie.
4.2 Typy izolací DNA z vyšetřovaného materiálu Izolace DNA je proces, při kterém získáme DNA ze zkoumaného vzorku pomocí kombinací chemických a fyzikálních metod. DNA byla poprvé izolována roku 1869 Friedrichem Miescherem, v současné době je izolace DNA rutinní technikou molekulární biologie (Wikipedie, izolace DNA, internetový portál). Technologické postupy, které se pouţívají při výrobě potravin (tepelná úprava, chemické ošetření a jiné) do značné míry ovlivňují kvalitu hledané nukleové kyseliny (dochází k degradaci DNA), coţ můţe mít za důsledek sníţení citlivosti pouţité metody pro detekci. Citlivost metody je také ovlivněna druhem vyšetřovaného materiálu, který můţe obsahovat látky (barviva, konzervanty a jiné), které inhibují PCR reakci. Tyto inhibiční faktory nemusí být zcela odstraněny v průběhu extrakce nukleové kyseliny a mohou způsobit falešně negativní test. Procentuální zastoupení hledané sloţky v potravině, v tomto případě celeru, a homogenita kontrolovaného potravinářského produktu jsou také velmi významnými faktory. Kvalita izolované DNA často rozhoduje o úspěšnosti navazujících postupů (Šmarda aj., 2005). Abychom předešli případným kontaminacím mezi vzorky, které by mohly být způsobeny pracovníky, je nutné pouţít prostředků, které eliminují tento problém. Jsou to rukavice na jedno pouţití, špičky s filtrem, pipety na roztoky, pipety na vzorky, práce v laminárních boxech a udrţování čistoty pracovních ploch a centrifug ošetřením dekontaminačními 30
prostředky. V laboratoři SVÚ Jihlava slouţí k dekontaminaci pracovních ploch a nástrojů roztok sava ředěný 1:5 a komerční roztok DNA Exitus. Ke kontrole správnosti práce laboratorního pracovníka slouţí zařazení negativní kontroly od izolace vzorku aţ po jeho amplifikaci. Jako negativní kontrolu pouţíváme PCR H2O.
4.2.1 Izolační kit SureFood® - PREP Plant X
Charakteristika izolačního kitu Tento izolační kit od firmy R-Biopharm (obr. č. 6) je určen pro extrakci DNA z potravinových
výrobků
obsahující
rostlinné
sloţky,
potravinářských aditiv a také výrobků s vyšším obsahem tuků.
Obr. č. 6 Izolační kit SureFood® - PREP Plant X (R-Biopharm)
31
výrobků
s vyšším
obsahem
Provedení izolace Z vyšetřované potraviny odebereme reprezentativní mnoţství vzorku, a to 200 g. Pokud má vyšetřovaný vzorek více kusů, například balení tavených sýrů, musíme odebrat vzorek z kaţdého sýru, který je obsaţený v krabičce. Mechanicky homogenizujeme vzorky 3 minuty v přístroji Retsch-Grindomix. Z takto odebraného a homogenizovaného vzorku odebereme 150 mg do předem označené 2 ml zkumavky od firmy Eppendorf. Ke vzorku přidáme 580 μl lyzačního pufru a 20 μl enzymu katalyzujícího štěpení bílkovin, tzv. proteinázy K. Tyto roztoky naruší buněčné stěny, membrány a jiné buněčné struktury a DNA z buněčných jader uvolní do roztoku. Vzorek inkubujeme 30 minut při 65ºC na přístroji Thermomixer Comfort od firmy Eppendorf. Při této teplotě je usnadněna lýza vzorků. Zároveň dáme předehřát potřebné mnoţství elučního pufru X a elučního pufru E. Po inkubaci vzorek centrifugujeme 2 minuty při 14000 rcf. Vytvoří se sediment a supernatant, ve kterém se nachází DNA. Po centrifugaci odpipetujeme 400 μl supernatantu a přeneseme jej na filtrační kolonku v čisté sběrné zkumavce. Vzorek centrifugujeme 2 minuty při 14000 rcf. Filtrační kolonku vyhodíme a k filtrátu napipetujeme 200 μl vázacího pufru. Filtrát společně s vázacím pufrem přeneseme na filtrační kolonku v nové sběrné zkumavce. Centrifugujeme 2 minuty při 14000 rcf. Filtrační kolonku přeneseme do nové sběrné zkumavky a přidáme 550 μl předpromývacího pufru a vzorek centrifugujeme 1 minutu při 14000 rcf. Filtrační kolonku přeneseme do nové sběrné zkumavky a přidáme 550 μl promývacího pufru a vzorek centrifugujeme 1 minutu při 14000 rcf. Filtrační kolonku umístíme do nové zkumavky firmy Eppendorf, přidáme 200 μl předehřátého elučního pufru X, inkubujeme 3 minuty při 65°C a centrifugujeme 2 minuty při 12000 rcf. Vyhodíme filtrační kolonku, přidáme 200 μl lyzačního pufru a 200 μl vázacího pufru. Vše napipetujeme na novou filtrační kolonku a centrifugujeme 2 minuty při 14000 rcf. Filtrační kolonku přeneseme do nové sběrné zkumavky a přidáme 550 μl předpromývacího pufru a vzorek centrifugujeme 1 minutu při 14000 rcf. Filtrační kolonku přeneseme do nové sběrné zkumavky a přidáme 550 μl promývacího pufru a vzorek centrifugujeme 1 minutu při 14000 rcf. Filtrační kolonku umístíme do nové označené zkumavky firmy Eppendorf, přidáme 100 μl předehřátého elučního pufru E, inkubujeme 3 minuty při 65°C a centrifugujeme 2 minuty při 12000 rcf. Eluční pufr působí na DNA, ta se uvolní z filtru do 2 ml zkumavky od firmy Eppendorf.
Vyhodíme filtrační kolonku
a extrakci uchováváme při -80°C (R-Biopharm, 2011, uţivatelská příručka).
32
4.2.2 Izolační kit DNeasy® mericon™ Food Kit
Charakteristika izolačního kitu Tento izolační kit od firmy Qiagen (obr. č. 7) je určen pro extrakci DNA z potravinových výrobků, zejména z potravin ţivočišného původu, také rostlinného původu a zvláště vhodný je k izolaci potravin s vysokým obsahem ţivočišných a rostlinných tuků. Jako příklad izolovaných potravin tímto kitem můţeme uvést různé druhy masných výrobků, např. klobás, salámů, paštik, játrových knedlíčků, dále hotových zamraţených jídel jako je guláš, halušky se zelím a mraţená pizza, dále stěry z různých potravinářských zařízení (výrobní linky, pracovní plochy) a mnohé další.
Obr. č. 7 Izolační kit DNeasy® mericon™ Food Kit
33
Provedení izolace Z vyšetřované potraviny odebereme reprezentativní mnoţství vzorku, a to 200 g. Mechanicky homogenizujeme vzorky 3 minuty v přístroji Retsch-Grindomix. Z takto odebraného a homogenizovaného vzorku odebereme 2 g do předem připravené a označené zkumavky o obsahu 50 ml. Ke vzorku přidáme 10 ml Food Lysis Buffer (lyzační pufr) a 25 μl enzymu katalyzující štěpení bílkovin, tzv. proteinázy K. Roztoky přidané ke vzorku narušují buněčné stěny, membrány a jiné struktury v buňce a DNA z jader buněk se uvolní do roztoku. Vzorek inkubujeme 30 minut při 60°C na přístroji Thermomixer Comfort od firmy Eppendorf. Při této teplotě je usnadněna lýza vzorků. Vzorek zchladíme na pokojovou teplotu. Vzorek centrifugujeme 5 minut při 2500 rcf . Při centrifugaci vzorku se vytvoří supernatant a sediment. Odebereme 700 μl supernatantu do 2 ml zkumavky od firmy Eppendorf a přidáme 500 μl chloroformu. Nepolární látky se v chloroformu rozpouští, polární zůstanou ve vodě. Zkumavku uzavřeme, silně vortexujeme a centrifugujeme 15 minut při 14000 rcf. Díky centrifugaci se nám lépe rozdělí chloroform a voda. Do nové zkumavky odebereme 250 μl horní (vodní) fáze a přidáme 1 ml pufru PB. Pomocí tohoto pufru vytvoříme podmínky pro zachycení DNA na filtrační kolonku. Obsah zkumavky zvortexujeme a 600 μl obsahu zkumavky přeneseme na filtrační kolonku. Vzorek centrifugujeme 1 minutu při 17900 rcf. Filtrační kolonku přeneseme do čisté zkumavky a přidáme zbytek směsi na kolonku. Opět centrifugujeme 1 minutu při 17900 rcf. Filtrační kolonku přeneseme do čisté zkumavky a přidáme 500 μl Buffer AW2. Buffer AW2 je promývací pufr. Vzorek centrifugujeme 1 minutu při 17900 rcf. Filtrační kolonku opět přeneseme do čisté zkumavky a centrifugujeme 1 minutu při 17900 rcf. Tímto krokem odstraníme zbytky tekutin z filtru. DNA zůstává zachycena na filtrační kolonce. Nachystáme si čistou 1,5 ml zkumavku, kterou popíšeme číslem vzorku, datem a typem izolace. Filtrační kolonku dáme do takto označení zkumavky a přidáme 100 μl Buffer EB. Jedná se o eluční pufr, působí na DNA a ta se uvolní z filtrační kolonky do zkumavky. Centrifugujeme 1 minutu při 17900 rcf .Vyhodíme filtrační kolonku, zkumavku uzavřeme a extrakci uchováváme při -80°C ( Qiagen, 2010, uţivatelská příručka). Ať provedeme izolaci jakoukoliv metodou, je třeba získaný vzorek uloţit v hlubokomrazícím boxu. Zabráníme tím degradaci a zajistíme tak jeho dlouhodobé uchování (Kočárek, 2007).
4.3 Princip PCR Tuto metodu vyvinul roku 1983 Kary Mullis, v roce 1993 za ni dostal Nobelovu cenu (Wikipedie, PCR, internetový portál). 34
Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla dále vyvinuta v Cetus Corporation v Emeryville v Kalifornii. Principem je enzymatická amplifikace DNA in vitro syntézou mnoha kopií vybrané sekvence DNA v cyklické reakci o třech teplotních fázích (Bartůňková aj., 2011). PCR (z anglického ,,Polymerase Chain Reaction“) slouţí k pomnoţení neboli amplifikaci specifických úseků DNA, vyuţívá procesů denaturace, hybridizace a syntézy neboli replikace DNA (Kočárek, 2007). Pokud chceme pro účely vyšetření pomnoţit neboli amplifikovat určitou část genomu, tak potřebujeme dva úseky DNA, které jsou komplementární k jejím koncovým oblastem. Tyto úseky o známé sekvenci nazýváme primery a jsou tvořeny asi 20-25 nukleotidy. Je důleţité, aby cílové sekvence, se kterými primery hybridizují, byly specifické jen pro vyšetřovanou oblast a nevyskytovaly se na jiných místech genomu. Vedle primerů je potřeba ke správnému provedení PCR také DNA-polymeráza a dNTP. Reakce probíhá v přístroji zvaném termocykler. Do termocykleru vkládáme zkumavky, kde je směs vyšetřované DNA, primerů, dNTP a DNA-polymerázy (Kočárek, 2004). PCR se skládá z těchto kroků (Kočárek, 2007): Denaturace vyšetřované DNA pomocí zvýšené teploty, obvykle 92-96°C. Hybridizace neboli tzv. annealing primerů, kdy se primery naváţou na cílovou sekvenci vyšetřované DNA, probíhá při teplotě 45-65°C. Primery vymezují oblast genomu, která bude v dalších cyklech PCR amplifikována. Elongace neboli prodluţování nukleotidových řetězců pomocí DNA-polymerázy při teplotě 70-74°C. Na 3´-OH-konce navázaných primerů nasedá DNA-polymeráza, která k primerům připojuje nové nukleotidy. Prodluţuje tím řetězec ve směru 5´→ 3´. Vytváří se tím základ fragmentu DNA, který potřebujeme získat.
Uvedené kroky představují pouze první cyklus PCR, je potřeba uvedený postup vícekrát opakovat. Teprve ve třetím cyklu se vytvářejí dvouřetězcové fragmenty DNA o délce odpovídající amplifikovanému úseku. Aby se jich vytvořilo dostatečné mnoţství, provádíme 15-40 na sebe navazujících cyklů. Z jednoho úseku molekuly DNA můţeme získat aţ 109 kopií (Kočárek, 2007). Na konci PCR získáme směs, která obsahuje velké mnoţství amplifikovaných fragmentů. Musíme je oddělit od zbytku DNA a to pomocí elektroforézy. Ta je zaloţená na izolaci molekul o rozdílné hmotnosti, popřípadě odlišném elektrickém náboji. Roztok, který obsahuje fragmenty DNA, naneseme do jamek v elektroforetickém gelu. Ten vytvoříme rozpuštěním 35
polysacharidu zvaného agaróza v horké vodě. Tento roztok nalijeme na povrch elektroforetické desky a necháme ochladit. V některých případech můţeme místo agarózy pouţít polyakrylamid (Kočárek, 2004). Elektroforetickou desku umístníme do elektroforetické vany, která je připojena ke zdroji stejnosměrného elektrického proudu. Z jamek na okraji gelu jsou záporně nabité fragmenty DNA přitahovány ke kladné elektrodě, neboť obsahují aniontové skupiny PO43-. Pokud jsou vytvořeny fragmenty DNA o rozdílné délce, dojde na gelu k jejich rozdělení a můţeme je rozlišit. Po skončení elektroforézy zviditelníme fragmenty v gelu tím, ţe přidáme fluorescenční barvivo, které se specificky váţe na DNA a v UV světle jasně září (Kočárek, 2004).
4.3.1 Detekce chloroplastového genu metodou PCR Jedná se o kontrolní reakcí detekující úsek DNA chloroplastu. Pozitivní výsledek této reakce indikuje úspěšnost extrakčního postupu z rostlinného materiálu. Tato reakce se provádí kitem GMOScreen 35S/NOS/FMV (GeneScan), který obsahuje hotový premaster pro detekci DNA chloroplastu a Taq DNA polymerázu. Sloţení reakční směsi udává tab. č. 4. Teplotní profil PCR udává tab. č. 5. Výsledný produkt PCR o velikosti 199 bp je vizualizován a vyhodnocen gelovou elektroforézou. Negativní výsledek značí neúspěšnost extrakčního postupu nebo přítomnost inhibičních substancí v izolátu DNA. Inhibiční vliv lze v některých případech eliminovat opakováním PCR s naředěním izolátu DNA 5x či 10x. Pokud je i přesto nadále vzorek negativní, je příčinou neúspěšné amplifikace nedostatečné mnoţství izolované DNA ve vzorku. V takovém případě je třeba zvolit alternativní izolační postup.
Tab. č. 4 Protokol reakční směsi pro detekci DNA chloroplastu Reagencie
Objem (µl)
Premaster CP/A
Taq DNA polymeráza
19,9 0,1
Extrahovaná DNA
5
36
Tab. č. 5 Teplotní profil PCR pro detekci DNA chloroplastu Krok 1 - Iniciální denaturace 2 - Denaturace 3 - Annealing 4 - Elongace
doba 10 min 25 s 30 s 45 s
6 - Finální elongace
teplota 94 °C 94 °C 62 °C 72 °C zpět na krok č. 2 72 °C
7 - Chlazení
10 °C
nepřetrţitě
5
opakovat 49x 5 min
4.4 Provedení Real-time PCR 4.4.1 Použitelnost metody V současné době jsou při kontrolách kvality a bezpečnosti potravin v oblasti detekce alergenů nejčastěji vyuţívány ELISA testy. Na SVÚ v Jihlavě se takto stanovují tyto alergeny: lískové ořechy, mandle, burské ořechy, celkový mléčný alergen, kasein, sojový alergen, vaječný alergen, gluten, sezam, siřičitany, laktóza a hořčice. Některé jiné druhy alergenů však nelze těmito testy detekovat a jsou pouţívány jiné vyšetřovací metody. Mezi tyto metody řadíme také molekulárně biologickou metodu PCR (polymerázová řetězová reakce), která se vyuţívá k detekci DNA alergenní potravinové sloţky. Metodou ELISA nelze vyšetřit ty potravinové alergeny, které by při reakci antigen+protilátka mohly reagovat nespecificky a způsobit falešně pozitivní nebo negativní výsledek. Není dostupná specifická protilátka, která by reagovala s antigenem námi hledaného alergenu. Proto pro vyšetření alergenu celeru v potravinách pouţíváme metodu Real-time PCR.
4.4.2 Princip Real-time PCR Real-time PCR technologie TaqMan vyuţívá hydrolyzačních prób. Hydrolyzační próba je krátký oligonukleotid, který je komplementární k sekvenci obsaţené v amplifikovaném úseku, nesoucí na sobě navázaný fluorofor na 5´konci a tzv. zhášeč (quencher). V případě detekce celeru se jedná o fluorofor FAM a quencher BHQ1. Pokud neprobíhá amplifikace, nachází se quencher v blízkosti fluoroforu a absorbuje jakékoliv světlo emitované z fluoroforu (obr. č. 8). Ve fázi annealingu při PCR nasednou na cílovou amplifikovanou sekvenci nejen 37
primery, ale i próba (obr. č. 9). Při elongační fázi polymeráza hydrolyzuje próbu díky svojí 5´nukleázové aktivitě, čímţ dojde k prostorovému oddálení fluoroforu a quencheru (obr. č. 10). Dojde k tomu, ţe emise světla z fluoroforu nemůţe být pohlcována quencherem (obr. č. 11). V kaţdém cyklu PCR se tímto způsobem exponenciálně hromadí počet emitujících fluoroforů a tím roste fluorescence (Roche, 2008, uţivatelská příručka).
Obr. č. 8 Hydrolyzační próba nese v těsné blízkosti 2 fluorofory, z nichţ jeden (quencher) potlačuje fluorescenční signál druhého (reportéru). 3´ konec sondy je fosforylován, aby próba nemohla slouţit jako primer.
Obr. č. 9 V annealingové fázi PCR primery i próby nesedají specificky na cílovou sekvenci.
Obr. č. 10 Během prodluţování primeru DNA polymeráza narazí na próbu. Svojí 5´nukleázovou aktivitou hydrolyzuje próbu, odstraní její fragmenty
z cílové
sekvence
a
pokračuje
v polymeraci
amplikonu.
Obr. č. 11 Po hydrolýze próby signální fluorofor (reportér) uţ není potlačován quencherem. Můţe tedy emitovat světlo, jeţ můţe být měřeno a zaznamenáváno přístrojem. Vzrůst fluorescence přímo koreluje s rostoucím mnoţstvím uvolněného signálního fluoroforu a tedy i s rostoucím mnoţstvím produktů PCR.
38
4.4.3 Praktické provedení Real-time PCR Metodu Real-time PCR, kterou je SVÚ Jihlava vyuţívána, byla převzata z těchto institucí: National Food Administration ve Švédsku a National Veterinary Institute v Norsku. Cílovou sekvencí v testu je gen manitol dehydrogenáza (MTD)/113 bp. Manitol dehydrogenáza je enzym náleţející do skupiny oxidoreduktáz. Katalyzuje biochemickou reakci, kterou lze znázornit vzorcem D-manitol + NAD+ → D-manóza + NADH + H+. Jedná se o první krok katabolické dráhy manitolu v nefotosyntetizujících pletivech celeru. Regulací buněčné koncentrace manitolu se podílí na toleranci celeru k solnému stresu (Stoop aj., 1995). Reakční směs Real-time PCR se skládá z premasteru připraveného z reagencií z komerčně pořízeného kitu LightCycler® FastStart DNA MasterPLUSHybProbe (Roche) (obr. č. 12), dále z primerů a próby. Kit se skládá z roztoku označeného 1a, 1b a 2 (tab. č. 6). Pro přípravu premasteru napipetujeme 10 μl roztoku ze zkumavky 1a do zkumavky 1b. Takto vzniklá směs je 5x koncentrovaná, lze ji skladovat při teplotě -20°C. Primery a próbu (tab. č. 7) skladujeme při teplotě -20°C, próbu nevystavujeme světlu. Mastermix (tab. č. 8) mícháme tak, ţe ve zkumavce smícháme 9 μl H2O - PCR grade, 4 μl premasteru, 1 ul kaţdého z primerů a 1 μl próby. Takto připravenou směs zvortexujeme a napipetujeme do skleněných kapilár a přidáme 4 μl extrahované DNA. Kapiláru uzavřeme a centrifugujeme 2 minuty při 2000 rcf. Kapiláry vloţíme do přístroje LightCycler (obr. č. 13) od firmy Roche a spustíme přednastavený program (tab. č. 9).
Tab. č. 6 Reagencie obsaţené v kitu LightCycler® FastStart DNA MasterPLUSHybProbe (Roche) Roztok
Specifikace 1 zkumavka, 1a - Enzyme skladování -15°C aţ -25°C 3 zkumavky (5x koncentrovaný), 1b - Reaction Mix skladování -15°C aţ -25°C 2 zkumavky, 2 - H2O - PCR grade skladování -15°C aţ -25°C
39
Obsah FastStart Taq DNA polymeráza reakční pufr, MgCl2, dNTP mix voda pro PCR
Obr. č. 12 kit LightCycler® FastStart DNA MasterPLUSHybProbe
Tab. č. 7 Specifikace primerů a próby Název primeru / próby Forward primer Cel-AgMD2637F Reverse primer Cel-AgMD2749R Próba CelAgMD2690Ta#P, modif.BHQ1-FAM
Nukleotidová sekvence (5´-3´) AGCCTGTTTCCCGTACGAGAT CTCATCACACCGTAATCCAAACAT TACACGCTCATCGTGACTCAGCA
Tab. č. 8 Protokol reakční směsi (mastermix) Reagencie
Objem (µl)
H2O - PCR grade Premaster (5x koncentrovaný) Forward primer Reverse primer Próba Extrahovaná DNA
9 4 1 1 1 4
40
Specifikace 20 μM, skladování -15°C aţ -25°C 20 μM, skladování -15°C aţ -25°C 10 μM, skladování -15°C aţ -25°C
Tab. č. 9 Teplotní profily Real-time PCR teplota 1 – Iniciální denaturace 95 °C 2 - Denaturace 95 °C 3 - Annealing 60 °C 4 - Elongace 72 °C zpět na 5 krok č. 2 6 - Chlazení 40 °C
doba 10 min 15 s 15 s 15 s opakovat 44x 10 s
Obr. č. 13 Přístroj na Real-time PCR LightCycler (Roche)
41
4.4.4 Grafický výstup a vyhodnocení Real-time PCR Monitoring a hodnocení výsledků probíhá v softwaru LightCycler Software od firmy Roche. Obr. č. 14 představuje typický výstup Real-time PCR při detekci celeru v softwaru LightCycler Software.
Obr. č. 14 Výstup Real-time PCR v softwaru LightCycler Software (Roche) 1: Amplifikace pod hranicí detekovatelnosti přístrojem 2: Exponenciální fáze amplifikace detekovatelná přístrojem 3. Fáze lineární amplifikace
3
2 1
V levé horní části obr. č. 14
vidíme seznam vzorků, jedná se o vzorek -K PCR H2O
(negativní kontrola, kde do připraveného mastermixu je přidána pouze voda), vzorek ALG33 (směs koření), vzorek ALG34 (směs koření) a vzorek +K celer Q020810 (pozitivní kontrola, jedná se o izolovanou DNA z celeru). V pravé části vidíme záznam průběhu Real-time PCR, kdy na ose vodorovné jsou cykly amplifikace a na ose svislé je hodnota zaznamenané fluorescence. Průběh změn fluorescence je u kaţdého ze vzorků zaznamenám jako křivka 42
rozdílné barvy. V případě pozitivního vzorku lze na křivce Real-time PCR rozlišit následující fáze: 1. fáze amplifikace pod hranicí detekovatelnosti přístrojem (v této fázi probíhá amplifikace, ale intenzita fluorescence nedosahuje úrovně detekovatelné přístrojem) 2. fáze exponenciální amplifikace detekovatelná přístrojem (tato fáze začíná cyklem amplifikace, zvaném crossing point - CP, ve kterém intenzita fluorescence poprvé vzroste nad hranici detekovatelnosti přístrojem, v dalších cyklech lze v této fázi sledovat exponenciální nárůst fluorescence) 3. fáze lineární amplifikace (tato fáze začíná okamţikem, kdy exponenciální nárůst fluorescence přejde v nárůst lineární, nástup této fáze je způsoben postupným vyčerpáváním komponentů PCR) 4. fáze plato (poslední fáze, kdy nedochází k další amplifikaci po celkovém vyčerpání jednoho nebo více komponent PCR, v reakci na obr. č. 14 tato fáze není zaznamenána, protoţe program PCR skončil jiţ ve fázi lineární)
Pro kvalitativní vyhodnocení vzorku je rozhodující exponenciální fáze Real-time PCR. Přítomnost exponenciální fáze (pozitivní kontrola a vzorek ALG34 na obr. č. 14) značí přítomnost cílové sekvence, v tomto případě celeru, ve vzorku, takový vzorek je vyhodnocen jako pozitivní. Absenci exponenciální fáze, kdy hodnota fluorescence zůstává po celý průběh reakce pod úrovní detekovatelnosti přístrojem, lze pozorovat u negativních vzorků (negativní kontrola a vzorek ALG33 na obr. č. 14). Pro interpretaci výsledků je důleţitá také hodnota CP. Tato hodnota se odvíjí od absolutní koncentrace cílové sekvence ve vzorku před začátkem PCR, dále od stupně její degradace a přítomnosti inhibitorů PCR. Při hodnotě CP ≤ 40 je vzorek vyhodnocen jako pozitivní. Niţší koncentrace cílové sekvence ve vzorku, vyšší stupeň její degradace a přítomnost inhibitorů zvyšuje hodnotu CP. Vyšší hodnota CP (> 40) můţe také v některých případech představovat nespecifickou reakci, proto nelze takový vzorek povaţovat za jednoznačně pozitivní a je třeba analýzu zopakovat, případně pouţít jiný extrakční postup pro účinnější odstranění inhibitorů PCR, nebo výsledek konfirmovat pomocí jiného testu.
4.4.5 Specifita Real-time PCR Ověření specifity se na SVÚ Jihlava provedlo pomocí níţe uvedeného panelu rostlin (tab. č. 10). Výsledky ověření specifity na SVÚ Jihlava odpovídaly výsledkům ověření 43
specifity, které proběhly v laboratořích National Food Administration ve Švédsku a National Veterinary Institute v Norsku.
Tab. č. 10 Specifita Real-time PCR druh rostliny celer celer cibule celer mrkev pastiňák paprika petrţel libeček pepř kopr anýz fenykl česnek kmín koriandr kerblík čechřice
vědecké jméno Celer řapíkatý Celer bulvový Cibule kuchyňská Celer naťový Mrkev obecná Pastiňák setý Paprika setá Petrţel zahradní Libeček lékařský Pepř černý Kopr vonný Anýz vonný Fenykl obecný Česnek setý Kmín kořenný Koriandr setý Kerblík třebule Čechřice vonná
latinské jméno Apium graveolens var. dulce Apium graveolens var. rapaceum Allium cepa Apium graveolens var. secalium Daucus carota Pastinaca sativa Capsicum annuum Petrosellinum crispum Levisticum officinale Piper nigrum Anethum graveolens Pimpinella anisum Foeniculum vulgare Allium sativum Carum carvi Coriandrum sativum Anthriscus cerefolium Myrrhis odorata
výsledek PCR + + + -
4.4.6 Detekční limit Real-time PCR Pro ověření citlivosti byly svépomocí vytvořeny standardy z povařené svaloviny (kombinace hovězí a vepřové), do níţ byl zamíchán homogenát celeru o různém výsledném procentuálním zastoupení (tab. č. 11). Na základě zjištěných výsledků uvedených v tab. č. 11 byl detekční limit stanoven na hladině 0,005%. Pomocí této metody je moţno zjistit i niţší koncentrace celeru ve vyšetřovaném vzorku. Detekční limit byl stanoven za optimálních podmínek, kdy nebyla do vzorků přidána ţádná aditiva, která působí inhibice. U běţných vzorků se setkáváme s komplikovanější matricí.
44
Tab. č. 11 Stanovení detekčního limitu Podíl celeru v mase (%) 1 0,2 0,1 0,05 0,01 0,005 0,0025 0,001 neobsahuje celer
Počet opakování 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Počet pozitivních amplifikací 10 10 10 10 10 10 7 5 0
4.4.7 Přehled vyšetřovaných vzorků na SVÚ Jihlava Obr. č. 15 udává grafický přehled vzorků vyšetřovaných na SVÚ Jihlava v letech 2009-2014. V tab. č. 12 jsou uvedeny všechny typy vyšetřovaných materiálů na SVÚ Jihlava a také jejich výsledky. V roce 2014 můţeme pozorovat mírný vzestup vyšetřovaných vzorků na přítomnost celeru.
Obr. č. 15 Přehled vyšetřovaných vzorků na SVÚ Jihlava v letech 2009-2014 40
37
35 29
30
negativní
23
25 20
16 pozitivní
15 10 10
8
55 5
100
10
22
2
10
0
45
nelze izolovat DNA v dostatečném množství a kvalitě pro analýzu
Tab. č. 12 Typy vyšetřovaných vzorků a jejich případná pozitivita
rok prosinec 2009
nelze izolovat DNA v dostatečném množství a kvalitě pro analýzu
negativní houbové koření
pozitivní
tavené sýry, drůbeţí špekáčky, kuřecí šunkový salám, paštiky, játrové knedlíčky, klobásy, různá koření, sušený banán plátky, kuřecí uzená stehna, šunková pěna, strouhanka, sekaná vařená, sekaná zmrazená, kuřecí stehna, grilovací koření
směs koření
šunkový salám, papriková klobása, bramborové chipsy, paštiky, bujóny, halušky se zelím, guláš s knedlíkem, stěry z potravinářských zařízení, nakládaná krůtí prsa, salám Junior, pikantní klobása, chalupářská klobása, plněná krůtí prsa, kořeněná sůl na vepřové maso, krůtí prsa s bílým pepřem
petrţelová nať sušená, směs kukuřice
2012
paštiky, tavené sýry, bramborové chipsy, tvrdé sýry, játrové knedlíčky, korbáčky, debrecínské párky, americké brambory, worcestrová omáčka, dýňová semena, pikantní klobása, chalupářská klobása, papriková klobása, polovina vodního melounu, capuccino
jablečný nápoj
2013
mraţené kuře, šunka, filety z tuňáka, horká čokoláda, nakládané kukuřičky, játrová paštika, šunková klobása, salám Vysočina, farmářská klobása, zeleninový salát, vepřové maso, křupavé musli
mraţený hrášek s jarní stěry z potravinářských zeleninou, oplach dopravníku zařízení, jablečný v potravinářském zařízení, nápoj směsi koření do salámu
tavené sýry, vepřová šunka, party klobása, koření na paprikový lusk, játrové knedlíčky, stěry z potravinářských zařízení, jaternice
játrové knedlíčky,
2010
2011
leden únor 2014
koření na játrové knedlíčky, směs koření a extraktu koření, korex jaternice
46
směsi koření na salám Junior
stěry z potravinářských zařízení
5 Diskuze Chtěla bych se blíţe věnovat izolacím DNA z potravinářských výrobků. Z tabulky námi vyšetřovaných vzorků můţeme vyvodit, ţe existují potravinářské výrobky, u kterých kvůli jejich zpracování nelze izolovat DNA v poţadované kvalitě a koncentraci. Nebylo tedy moţné vzorky vyšetřit a analýza poţadována zadavatelem neproběhla. V současné době na trhu existuje mnoho dostupných kitů, které se dají pouţít k izolaci DNA z různých druhů potravin. Navrhovala bych vyzkoušení jiných extrakčních postupů, případně jiných extrakčních kitů. Při hledání nových extrakčních postupů je také nutné přihlédnout k finančním nákladům spojených s tímto bodem analýzy. K izolaci DNA lze také vyuţít extrakční automaty, jejichţ potenciál je široký. Pouze je nutné připravit (lyzovat) vzorky tak, aby byly vhodné pro tento způsob extrakce. Externí lyzační roztoky musí být kompatibilní s roztoky vyuţívanými v automatické extrakci. Na SVÚ Jihlava jsou pouţívány k izolaci DNA z krve zvířat přístroje MagNA Pure LC a MagNa Pure 96 od firmy Roche. Navrhovala bych otestovat izolaci DNA z různorodých druhů potravin na těchto přístrojích a jejich případné uvedení do praxe. Jako další opatření, které by přispělo ke zvýšení standardizace metody, navrhuji přeměřování koncentrace DNA v izolátu. Do amplifikační reakce by se přidávala standardní koncentrace DNA dosahovalo by se standardních výsledků. Laboratoř SVÚ Jihlava se pravidelně úspěšně účastní mezilaboratorních porovnávacích testů zaměřených na průkaz DNA celeru. Proto pouţívanou metodu Real-time PCR povaţuji za dostatečnou a vhodnou. Díky studii, která proběhla v National Food Administration ve Švédsku a National Veterinary Institute v Norsku, kdy se porovnávaly vyšetřovací metody ELISA a Real-time PCR, víme, ţe Real-time PCR je metodou nejvhodnější ke stanovení přítomnosti celeru v potravinách. Real-time PCR má vyšší citlivost a specifitu neţ ELISA. Od prosince 2009 do konce února 2014 bylo na SVÚ Jihlava vyšetřeno celkem 142 vzorků na přítomnost potravinového alergenu celeru. Ani jedno vyšetření nebylo zasláno Krajskou veterinární správou a Státní zemědělskou a potravinářskou inspekcí. Vzorky pocházely z různých potravinářských firem. Celkem 17 vzorků bylo pozitivních na přítomnost celeru a u všech pozitivních vzorků chyběla deklarace o přítomnosti tohoto alergenu. SVÚ Jihlava nemá ţádnou povinnost hlásit tyto vzorky jakémukoliv dozorčímu orgánu, protoţe se vţdy jednalo o soukromou zakázku. Díky vyššímu zájmu veřejnosti a pod hrozbou kontroly a sankcí vyplývajících z legislativy, se firmy snaţí odstranit zdroje kontaminací celerem a zasílají vzorky na opětovné vyšetření. Proto můţeme v roce 2014 sledovat mírný vzestup zaslaných vzorků. 47
Z mého pohledu se nevěnuje kontrole přítomnosti alergenu celeru v potravinách dostatečná pozornost. Předpokládám, ţe se situace výhledově změní a tento alergen v potravinách bude více vyšetřován.
6 Závěr Ve své bakalářské práci jsem chtěla poukázat na důleţitost a prospěšnost institucí, které kontrolují kvalitu potravin. Obchodní řetězce nám nabízí nepřeberné mnoţství potravin, jejichţ místem původu je nejen Česká republika, ale i ostatní země. Je důleţité, aby se domácí i dováţené potraviny řádně kontrolovaly, aby splňovaly veškerá kritéria kladená na kvalitu vyplývající z legislativy. Na SVÚ Jihlava kontrolujeme nejen alergen celer v potravinách, ale mnoho jiných důleţitých sloţek potravin. Stanovení celeru metodou Real-time PCR je tedy jednou z mnoha metod, která pomáhá kontrolovat kvalitu naší stravy k plné spokojenosti nás všech spotřebitelů. Tato práce se také zabývá potravinovými alergiemi, jejich projevy, diagnostikou a léčbou. Stručně popisuje jednu z aktuálních chorob 20. a 21. století v ekonomicky vyspělých státech.
48
7 Literatura a použité zdroje 1. BARTŮŇKOVÁ Jiřina, Hořejší Václav, ZÁKLADY IMUNOLOGIE, Triton, 2009, ISBN 978-80-7387-280-9 2. BARTŮŇKOVÁ Jiřina, Paulík Milan a kolektiv, VYŠETŘOVACÍ METODY V IMUNOLOGII, 2. přepracované a doplněné vydání, Grada Publishing, a.s., 2011, ISBN 978-80-247-3533-7 3. BARTŮŇKOVÁ Jiřina, Vernerová Eva, IMUNOLOGIE A ALERGOLOGIE, Triton, 2002, ISBN 80-7254-289-3 4. BYSTROŇ Jaromír, ALERGIE-průvodce alergickými nemocemi pro lékaře i pacienty, Mirago Ostrava, 1997, ISBN 80-85922-46-0 5. ČÁP Petr, Průcha Miroslav, ALERGOLOGIE V KOSTCE, Triton, 2006, ISBN 80-7254779-8 6. FUCHS Martin, ALERGIE ČÍHÁ V JÍDLE A PITÍ, 2. rozšířené a přepracované vydání, Adéla, 2007, ISBN 80-902532-2-9 7. FUCHS Martin, POTRAVINOVÉ ALERGIE, Maxdorf, 2013, ISBN 978-80-7345-335-0 8. KOČÁREK Eduard, GENETIKA, Scientia, spol. s r.o., pedagogické nakladatelství, 2004, ISBN 80-7183-326-6 9. KOČÁREK Eduard, MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE V MEDICÍNĚ, NCO NZO Brno, 2007, ISBN 978-80-7013-450-4 10. KVASNIČKOVÁ Alexandra, ALERGIE Z POTRAVIN, ÚZPI, 1998, ISBN 80-8512093-3 11. LITZMAN Jiří, Freiberger Tomáš, Král Vlastimil, Thon Vojtěch, ZÁKLADY VYŠETŘENÍ V KLINICKÉ IMUNOLOGII, MU Brno, 2011, ISBN 978-80-210-4227-8 12. QIAGEN, uţivatelská příručka izolačního kitu DNeasy® mericon™ Food Kit, 2010 13. R-BIOPHARM, uţivatelská příručka izolačního kitu SureFood® – PREP Plant X, 2011 14. ROCHE, uţivatelská příručka LightCycler®480 Real-time PCR Instrument, 2008 15. ŠMARDA Jan, Doškař Jiří, Pantůček Roman, Růţičková Vladislava, Koptíková Jana, METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE, MU Brno, 2005, ISBN 80-210-3841-1 16. ŠPIČÁK Václav, Panzner Petr, ALERGOLOGIE, Galén, 2004, ISBN 80-7262-265-X 17. ÚŘAD
PRO
TECHNICKOU
ZKUŠEBNICTVÍ,
Česká
NORMALIZACI,
technická
norma,
METROLOGII POTRAVINY
A -
STÁTNÍ DETEKCE
POTRAVINOVÝCH ALERGENŮ MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝMI METODAMI, 2011 49
Internetové zdroje 18. DUČAIOVÁ
Jarmila,
Litvínová
Blaţena,
POTRAVINOVÁ
ALERGIE,
2011,
POTRAVINY,
2009,
zdroj: http://zdravi.e15.cz/clanek/sestra/potravinova-alergie-459793 19. HAMPLOVÁ
Ludmila,
ZÁKEŘNÁ
ALERGIE
NA
zdroj: http://www.vitalia.cz/clanky/zakerna-alergie-na-potraviny/ 20. INFORMAČNÍ
CENTRUM
BEZPEČNOSTI
POTRAVIN,
internetový
portál,
zdroj: http://www.bezpecnostpotravin.cz/stranka/system-rychleho-varovani-propotraviny-a-krmiva-(rasff).aspx 21. KRČMOVÁ Irena, Petrů Vít, ANAFYLAKTICKÁ REAKCE A JEJÍ LÉČBA, 2007, zdroj: http://zdravi.e15.cz/clanek/priloha-lekarske-listy/anafylakticka-reakce-a-jeji-lecba296182 22. KVASNIČKOVÁ Alexandra, BYL CHARAKTERIZOVÁN ALERGEN V CELERU, 2011, zdroj: http://www.bezpecnostpotravin.cz/byl-charakterizovan-alergen-vceleru.aspx 23. KVASNIČKOVÁ
Alexandra,
SNIŢOVÁNÍ
ALERGIZUJÍCÍHO
POTENCIÁLU
CELERU, 2011, zdroj: http://www.bezpecnostpotravin.cz/snizovani-alergizujicihopotencialu-celeru.aspx 24. MUCHKA
Bohumír,
OPICH
NEBOLI
CELER,
2009,
zdroj: http://www.ireceptar.cz/zahrada/opich-neboli-celer 25. PAVELKOVÁ
Kateřina,
INTOLERANCE
A
Burešová
Pavla,
PŘECITLIVĚLOST
POTRAVINOVÁ NA
ALERGIE,
POTRAVINY,
2012,
zdroj: http://www.szpi.gov.cz/docDetail.aspx?docid=1000140&nid=11325&hl=pseudoal ergie 26. PAVELKOVÁ
Kateřina,
INTOLERANCE
A
Burešová
Pavla,
PŘECITLIVĚLOST
POTRAVINOVÁ NA
ALERGIE,
POTRAVINY,
2012,
zdroj: http://www.szpi.gov.cz/docDetail.aspx?docid=1000140&docType=ART&nid=113 25&chnum=6 27. PAVELKOVÁ
Kateřina,
INTOLERANCE
A
Burešová
Pavla,
PŘECITLIVĚLOST
POTRAVINOVÁ NA
ALERGIE,
POTRAVINY,
2012,
zdroj: http://www.szpi.gov.cz/docDetail.aspx?nid=11325&docid=1000140&chnum=7 28. STOOP Johan, Willamson John, Conkling Mark, Pharr Mason, PURIFICATION OF NAD-DEPENDENT SUSPENSION
MANNITOL
CULTURES,
DEHYDROGENASE
Plant
Physiology,
zdroj: http://www.plantphysiol.org/content/108/3/1219.full.pdf 50
FROM
1995,
CELERY
108:1219-1225,
29. SUKOVÁ
Irena,
PRAHOVÉ
HODNOTY
ALERGENŮ,
2011,
zdroj: http://www.bezpecnostpotravin.cz/prahove-hodnoty-alergenu.aspx 30. SVS ČR, tisková zpráva, V NĚMECKÉM GULÁŠI BYL NEDEKLAROVANÝ CELER, 2012,
zdroj: http://www.bezpecnostpotravin.cz/v-nemeckem-gulasi-byl-nedeklarovany-
celer.aspx 31. WIKIPEDIE,
internetový
portál,
IZOLACE
DNA,
2014,
CELER,
2014,
zdroj: http://cs.wikipedia.org/wiki/Izolace_DNA 32. WIKIPEDIE,
internetový
portál,
MIŘÍK
zdroj: http://cs.wikipedia.org/wiki/Celer 33. WIKIPEDIE, internetový portál, PCR, 2014, zdroj: http://cs.wikipedia.org/wiki/PCR
Použité obrázky Obr. č. 1: ČÁP Petr, Průcha Miroslav, ALERGOLOGIE V KOSTCE, str. 25, Triton, 2006, ISBN 80-7254-779-8 Obr. č. 2: http://www.bezpecnostpotravin.cz/stranka/system-rychleho-varovani-propotraviny-a-krmiva-(rasff).aspx Obr. č. 3: http://www.jikl.cz/koreni/671-pascal-rapikaty-.html Obr. č. 4: http://www.receptyonline.cz/celer-bulvovy--1275.html Obr. č. 5: http://www.semena-rostliny.cz/blog/180-dietni-a-nenarocny-celer Obr. č. 6: foto autor Obr. č. 7: foto autor Obr. č. 8 - 11: ROCHE, uţivatelská příručka přístrje LightCycler®480 Real-time PCR Instrument, 2008 Obr. č. 12: foto autor Obr. č. 13: ROCHE, uţivatelská příručka LightCycler System, 2008 Obr. č. 14: grafický výstup Real-time PCR, SVÚ Jihlava Obr. č. 15: autor
51
