Masarykova univerzita Lékařská fakulta
IMUNOHISTOCHEMICKÝ PROFIL VYBRANÝCH NÁDORŮ SLINIVKY BŘIŠNÍ
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí diplomové práce:
Autor:
MUDr. Jan Mazanec
Lucie ČEČETKOVÁ
Brno, 2014
Jméno a příjmení autora:
Lucie Čečetková
Název bakalářské práce:
Imunohistochemický profil vybraných nádorů slinivky břišní
Pracoviště:
FN Brno – Ústav patologie
Vedoucí bakalářské práce:
MUDr. Jan Mazanec
Rok obhajoby bakalářské práce:
2014
Souhrn: Cílem této bakalářské práce je shrnutí poznatků týkajících se onemocnění pankreatu se zaměřením na nádorová onemocnění vč. jejich hlavního zástupce- duktální adenokarcinom a hodnocení významu imunohistochemických metod při diferenciální diagnostice těchto onemocnění. Obecná část se zabývá teoretickými informacemi o různých chorobách pankreatu vč. přehledné charakteristiky jednotlivých typů nádorů. Speciální část popisuje princip imunohistochemických metod a jednotlivé vyšetřované tkáňové antigeny. V experimentální části této práce je vyhodnoceno 20 bioptických vzorků ze dvou histogeneticky odlišných typů nádorů pankreatu na míru pozitivity či negativitu vybraných tkáňových markerů resp. antigenů rozdělených do dvou skupin na základě podobného imunofenotypu. Výsledky potvrdily silnou pozitivitu stanovovaných markerů u jednotlivých vzorků. Klíčová slova: nádory pankreatu, imunohistochemie, cytokeratiny, antionkogeny, neuroendokrinní markery
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením MUDr. Jana Mazance a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.
V Brně dne .................................
..................................... Podpis autora
Poděkování: Ráda bych poděkovala panu MUDr. Janu Mazancovi za jeho vedení a rady při vzniku této bakalářské práce.
Obsah Úvod ...................................................................................................................................... - 9 1
Obecná část ................................................................................................................. - 10 1.1
Slinivka břišní (pankreas) ..................................................................................... - 10 -
1.2
Onemocnění exokrinního pankreatu ..................................................................... - 13 -
1.2.1 Malformace pankreatu ........................................................................................ - 13 1.2.2 Cystická fibróza (mukoviscidóza) ...................................................................... - 13 1.2.3 Regresivní změny ............................................................................................... - 14 1.2.4 Záněty pankreatu................................................................................................. - 14 1.2.5 Nádory exokrinního pankreatu ........................................................................... - 18 Duktální adenokarcinom .............................................................................................. - 19 Acinární adenokarcinom .............................................................................................. - 21 Serózní cystadenom ..................................................................................................... - 21 Mucinózní cystická neoplázie ...................................................................................... - 22 Intraduktální papilární mucinózní neoplázie ............................................................... - 23 Solidně pseudopapilární tumor .................................................................................... - 24 Pankreatoblastom ......................................................................................................... - 25 Onemocnění endokrinního pankreatu ................................................................... - 26 -
1.3
1.3.1 Diabetes mellitus................................................................................................. - 26 1.3.2 Neuroendokrinní tumory (NET) ......................................................................... - 28 1.3.3 Neuroendokrinní karcinom (NEC) ..................................................................... - 29 2
Speciální část ............................................................................................................. - 31 2.1 Imunohistochemie ...................................................................................................... - 31 2.1.1 Imunohistochemické metody .............................................................................. - 31 2.1.2 Typy protilátek pro imunohistochemické metody .............................................. - 34 2.2 Aplikace imunohistochemických metod v bioptické diagnostice.............................. - 34 -
3
Experimentální část ................................................................................................... - 36 -
3.1 Přehled získaných dat ................................................................................................ - 36 3.1.1 Hodnocení markerů u duktálního adenokarcinomu ............................................ - 37 3.1.2 Hodnocení markerů u NET a NEC ..................................................................... - 39 3.2. Názorné vyhodnocení preparátů dvou vybraných případů ....................................... - 40 3.2.1 Případ první: duktální adenokarcinom hlavy pankreatu, grade 2 ....................... - 40 3.2.2 Případ druhý: neuroendokrinní tumor těla pankreatu, grade 2 ........................... - 44 4
Závěr ........................................................................................................................... - 48 -
5
LITERATURA ........................................................................................................... - 50 -
Seznam obrázků Obrázek 1 Stavba a umístění pankreatu ............................................................................... - 10 Obrázek 2 Schéma stavby pankreatu vlevo, histologický snímek vpravo ( HE, 100x) ....... - 11 Obrázek 3 Chronická pankreatitida, 50x ............................................................................. - 16 Obrázek 4 Časový vývoj hrubé incidence a mortality zhoubných novotvarů pankreatu .... - 18 Obrázek 5 Duktální adenokarcinom grade 1 nahoře, grade 2 dole, 200x ............................ - 20 Obrázek 6 Serózní cystadenom, 150x.................................................................................. - 22 Obrázek 7 MCN, 200x ......................................................................................................... - 23 Obrázek 8 IMPN, 200x ........................................................................................................ - 24 Obrázek 9 Solidně pseudopapilární tumor, 150x................................................................. - 25 Obrázek 10 NET grade 1, 200x ........................................................................................... - 29 Obrázek 11 NEC grade 3, 150x ........................................................................................... - 30 Obrázek 12 Přímá metoda (a), nepřímá metoda dvojstupňová (b) ...................................... - 32 Obrázek 13 Nepřímá trojstupňová metoda, a) peroxidáza, b) alkalická fosfatáza .............. - 33 Obrázek 14 ABC metoda ..................................................................................................... - 33 Obrázek 15 Duktální adenokarcinom, HE, 200x ................................................................. - 40 Obrázek 16 Duktální adenokarcinom, CK 7, 200x .............................................................. - 40 Obrázek 17 Duktální adenokarcinom, CK 8, 200x .............................................................. - 41 -
Obrázek 18 Duktální adenokarcinom, CK 18, 200x ............................................................ - 41 Obrázek 19 Duktální adenokarcinom, CK 19, 200x ............................................................ - 42 Obrázek 20 Duktální adenokarcinom, CK 20, 200x ............................................................ - 42 Obrázek 21 Duktální adenokarcinom, Ki- 67, 200x ............................................................ - 43 Obrázek 22 Duktální adenokarcinom, p53, 200x ................................................................ - 43 Obrázek 23 NET, HE, 200x ................................................................................................. - 44 Obrázek 24 NET, AE1/3, 200x ............................................................................................ - 44 Obrázek 25 NET, NSE, 200x............................................................................................... - 45 Obrázek 26 NET, chromatogranin, 200x ............................................................................. - 45 Obrázek 27 NET, synaptofyzin, 200x ................................................................................. - 46 Obrázek 28 NET, p53, 200x ................................................................................................ - 46 Obrázek 29 NET, CD 56, 200x............................................................................................ - 47 Obrázek 30 NET, Ki- 67, 200x ............................................................................................ - 47 -
Seznam tabulek Tabulka 1 Stupně diferenciace NET a hodnoty jejich mitotického indexu a proliferační aktivity Ki-67 ....................................................................................................................... - 29 Tabulka 2 Výsledky vyšetřovaných markerů duktálního adenokarcinomu pankreatu a dalších imunofenotypicky podobných adenokarcinomů žlučových cest ......................................... - 38 Tabulka 3 Výsledky vyšetřovaných markerů u NET a NEC pankreatu .............................. - 39 -
Seznam použitých zkratek
AE 1/3
směs cytokeratinů
Ag-Ab
komplex antigen-protilátka
CA 19- 9
karbohydrát 19- 9
CAE
karcinoembryonální antigen
CK 7
cytokeratin 7
HDL
high density lipoprotein
HE
hematoxylin- eozin
HPF
high power field
ICA
islet cell antibody
ICAA
insulin antipody
IDDM
insulin- dependent diabetes mellitus
IPMN
intraduktální papilární mucinózní neoplázie
MCN
mucinózní cystická neoplázie
MEN 1
mnohočetná endokrinní neoplazie typu 1
MK
mastná kyselina
NET
neuroendokrinní tumor
NEC
neuroendokrinní karcinom
NIDDM
non- insulin- dependent diabetes mellitus
NSE
neuron specifická enoláza
TAG
triacylglycerol
Úvod Obsahem této bakalářské práce je přehledné zpracování tématiky onemocnění postihující pankreas neboli slinivku břišní se zaměřením na nádorová onemocnění, zejména na nejčastěji se vyskytující duktální adenokarcinom. Dále se práce zaměřuje i na ostatní typy nádorů pankreatu a jejich diferenciální diagnostiku v případech nejasné diagnózy pomocí aplikace imunohistochemických metod. Obecná část práce se zabývá stavbou a funkcí pankreatu a jejími onemocněními rozdělenými v závislosti na původu postižení endokrinní nebo exokrinní složky. Podrobně jsou zde probrány jednotlivé typy tumorů a jejich imunohistochemické profily. Speciální část se zaměřuje na princip imunohistochemických metod a jejich konkrétní aplikaci v bioptické diagnostice tumorů pankreatu. V poslední experimentální části je vyhodnocena pozitivita vyšetřovaných markerů v závislosti na typu nádorového onemocnění a jako příklad jsou zde uvedeny fotografie hodnocených tkáňových imunohistochemických markerů dvou případů histogeneticky odlišných tumorů. Cílem této práce je porovnání výsledků imunohistochemických vyšetření jednotlivých vyšetřovaných případů na Ústavu patologie Fakultní nemocnice Brno a zhodnocení jejich přínosu v diagnostice nádorů slinivky břišní.
-9-
1
Obecná část
1.1
Slinivka břišní (pankreas)
Pankreas je složená tuboalveolární žláza, patřící mezi orgány trávicí soustavy. Skládá se z exokrinní a endokrinní žlázové tkáně, je kryta vazivovým pouzdrem, z něhož vybíhají septa, kterými prochází cévy, nervy a interlobulární vývody, a která rozdělují žlázu na laloky a lalůčky (Horký, a další, 2011). Dosahuje délky 12 – 16 cm a váží 60 – 90 g. Skládá se z hlavy, která tvoří 50% pankreatického parenchymu a těla a ocasu, které tvoří zbylých 50%. Hlava pankreatu (caput pancreatis) je spojena s konkávní stranou dvanáctníku, do kterého ústí oba vývody pankreatu, tj. velký a malý (Obr. 1). Velký vývod (ductus pancreaticus major) se před vyústěním do duodena spojuje se žlučovodem (ductus choledochus) a společně ústí na papilla duodeni major (Vateri). Ductus pancreaticus accessorius, pokud je vytvořen, vystupuje na papilla duodeni minor (Sadler, 2011).
Obrázek 1 Stavba a umístění pankreatu
- 10 -
Přibližně 84% z objemu orgánu tvoří exokrinní část pankreatu, Langerhansovy ostrůvky s endokrinní funkcí tvoří 2%, zbytek je zastoupen vývody a cévami. (Nečas, a další, 2003) Produktem vnější sekrece pankreatu je pankreatická šťáva, která obsahuje enzymy štěpící základní živiny (bílkoviny, lipidy, cukry), vnitřní sekrecí jsou tvořeny hormony, jež jsou odváděny do krve.
Exokrinní pankreas Exokrinní část pankreatu se skládá ze sekrečních oddílů a vývodních cest. Sekreční oddíly jsou uspořádány v aciny. Ty jsou tvořeny jednak serózními buňkami, které ve své cytoplazmě obsahují zymogenní granula obsahující proenzymy pankreatické šťávy a centroacinózními buňkami, které tvoří intercelulární kanálky, na něž navazují vsunuté vývody. Tyto se spojují do intralobulárních a dále interlobulárních vývodů, které ústí do hlavních vývodů pankreatu
- ductus pancreaticus major (Wirsungi) a ductus pancreaticus
accessorius (Santorini) (Horký, a další, 2011).
Obrázek 2 Schéma stavby pankreatu vlevo, histologický snímek vpravo ( HE, 100x)
Takto je každý den vytvořeno 1000- 1500 ml pankreatické šťávy, která obsahuje vodu, ionty Na+, Cl−, K+, HCO3− a enzymy. Díky bikarbonátovému aniontu je pH pankreatu vysoké (až 8,3) a neutralizuje kyselý chymus, který doputuje ze žaludku do duodena. Mezi enzymy patří ty, které jsou produkovány v aktivní formě - lipáza, amyláza, ribonukleáza, deoxyribonukleáza a dále inaktivní proenzymy - trypsinogen, chymotrypsinogen, prokarboxypeptidáza, proelastáza, fosfolipáza A2, které se aktivují v duodenu. Proces začíná - 11 -
přeměnou trypsinogenu na trypsin účinkem enteropeptidázy, vzniklý trypsin aktivuje ostatní proenzymy. Tvorba šťávy je řízena humorálně dvěma hormony produkovanými sliznicí duodena - cholecystokininem (stimuluje sekreci enzymů) a sekretinem (způsobí produkci alkalických šťáv). Dále je sekrece řízena nervovými vlivy z nervus vagus acetylcholinem, který má stejné účinky jako cholecystokinin. Proti samonatrávení působí antitrypsin (Nečas, a další, 2003).
Endokrinní pankreas Endokrinní část žlázy tvoří Langerhansovy ostrůvky (insulae pancreaticae), které se v počtu od 0,75 do 1 milionu nacházejí zpravidla uprostřed lalůčků pankreatu. Na barvených preparátech je lze díky svému světlému zbarvení snadno odlišit od exokrinních acinů. Každý ostrůvek je obalen tenkým vazivovým pouzdrem a mezi epitelovými buňkami obsahuje četné krevní sinusoidy. Rozlišujeme 4 základní druhy epitelových buněk. A-buňky (α) tvoří glukagon, který působí jako antagonista inzulinu, stimuluje štěpení glykogenu v játrech a tuku v tukové tkáni, čímž udržuje stálou hodnotu glykémie. B-buňky (β) tvoří převahu nad ostatními epitelovými buňkami (60-70 %) a produkují inzulin, který snižuje hladinu cukru v krvi tím, že usnadňuje difúzi glukózy do svalu a tukové tkáně, kde dochází k jejímu zabudování do glykogenu. D-buňky (δ) produkují somatostatin, který inhibuje sekreci α a β buněk. Posledním typem jsou PP-buňky, které jsou svým produktem pankreatickým polypeptidem odpovědné za útlum sekrece žaludeční HCl (Horký, a další, 2011).
Onemocnění pankreatu Onemocnění pankreatu lze rozdělit na tato onemocnění: Exokrinní část pankreatu:
Malformace pankreatu
Cystická fibróza
Regresivní změny
Záněty pankreatu
Nádory pankreatu
- 12 -
Endokrinní část pankreatu:
1.2
Diabetes mellitus
Nádory Langerhansových ostrůvků
Onemocnění exokrinního pankreatu
1.2.1 Malformace pankreatu Malformace jsou vrozené vývojové vady způsobující vrozené morfologické a funkční odchylky od normálního stavu. Akcesorní (aberantní) pankreas je heterotopie (výskyt tkáně na jiném než obvyklém místě) tkáně pankreatu v duodenu, žaludku, jejunu. Příkladem je Saltykovův karcinoid, u kterého dochází vlivem poruchy embryonálního vývoje k přemístění pankreatické tkáně pod sliznici tenkého střeva. Pancreas annulare je vzácný výskyt pankreatické tkáně kolem duodena, čímž způsobuje jeho stenózu, která se může projevit zábranou posunu potravy do dalších částí tenkého střeva. Pancreas divisium je způsoben poruchou splynutí ventrálního a dorzálního základu, nedochází k napojení vývodu v těle a ocasu na ductus pancreaticus maior (Wirsungi), který ústí na Vaterské papile, ale místo toho je napojen na ductus pancreaticus accessorius (Santorini), jehož papila je úzká a může zde docházet k zadržování pankreatické šťávy, což představuje predispozici pro recidivující pankreatitidu. Cystóza pankreatu je způsobena poruchami ve vývoji pankreatických vývodů. Cysta je dutý útvar s vlastní výstelkou vyskytující se solitárně nebo ve velkém počtu, dle členitosti dutiny se dělí na unilokulární a multilokulární (Rejthar, a další, 2002).
1.2.2 Cystická fibróza (mukoviscidóza) Je to dědičné autozomálně recesivní onemocnění charakteristické vysoce vazkým sekretem všech exokrinních žláz způsobeným poruchou transportu chloridových iontů. Konkrétně v pankreatických vývodech tento sekret způsobuje obstrukci vedoucí k dilataci acinů, které se následně mění v cysty. Postupně dochází k atrofii exokrinní tkáně pankreatu - 13 -
spojené s fibrózou intersticia, čímž zaniká tvorba enzymů a následuje stav těžké malabsorpce tuků a v nich rozpustných vitamínů.
1.2.3 Regresivní změny Mezi regresivní změny patří různé atrofie, např. lipomatosní atrofie, kde je mezi zanikající tkání pankreatu zmnožena tuková tkáň. Duktogenní atrofie je charakteristická snížením množství exokrinní složky a proliferací intersticiálního vaziva a je způsobena obstrukcí pankreatických vývodů kamenem či nádorem (Povýšil, a další, 2001).
1.2.4 Záněty pankreatu Zánětlivé změny jsou reakcí na poškození acinózních buněk aktivovanými enzymy, v jejichž důsledku dochází až k vymizení exokrinní, popř. i endokrinní funkce.
Akutní pankreatitida Akutní intersticiální nehnisavá pankreatitida je onemocnění provázející bakteriální mycoplasmata, legionelly, leptospiry, salmonelly) a virové infekce (příušnice, coxackieviry, CMV, VZV, HIV, HSV). Typický je výskyt pankreatitis serosa, tedy edematózní tkáně s přítomností zánětlivé celulizace. Akutní intersticiální hnisavá pankreatitida vzniká krevní cestou - pyogenně nebo přestupem hnisavého zánětu ze střeva, typický je vznik abscesů v pankreatické tkáni. Akutní hemoragická pankreatitida (nekróza) je způsobena autodigescí parenchymu žlázy i okolních struktur působením předčasně aktivovaných enzymů pankreatické šťávy uvnitř žlázy a následným akutním zánětovým procesem (Povýšil, a další, 2001). K aktivaci enzymů dochází správně až v duodenu působením enteropeptidázy, někdy však mohou být proenzymy aktivovány již uvnitř acinů či v luminu vývodných cest navzdory trypsin inhibující bílkovině. Přesný mechanismus aktivace trypsinogenu není dosud znám. Nejvíce se na vzniku akutní pankreatitidy podílí obstrukce vývodných žlučových cest a abúzus alkoholu. Zaklínění kamene ve vaterské papile způsobuje reflux žluči do pankreatu, která poškozuje epitel vývodu. Při uzávěru duodena může dojít k refluxu již aktivovaných enzymů zpět do pankreatu. Alkohol zvyšuje permeabilitu pankreatických vývodů a umožňuje tak difúzi enzymů z acinů do periduktálního intersticia, kde dochází k poškození okolích buněk (Silgernagl, a další, 2001). Akutní pankreatitida může také vzniknout po - 14 -
chirurgickém zákroku v dutině břišní či po velkém traumatu břicha, z metabolických příčin (hyperlipidémie typ V., hyperkalcémie), na základě genetických mutací (PRSS1, SPINK1, CFTR). Proces patogeneze začíná aktivací trypsinu, který dále aktivuje ostatní proenzymy (fosfolipázu A2, elastázu, chymotrypsin, lipázu), koagulační faktory a tkáňové hormony (kalikrein), které svům proteolytickým působením poškozují buněčné membrány. Elastáza svým štěpením elastinu v krevních cévách způsobuje krvácení, odtud název hemoragická pankreatitida. Fosfolipáza A2 je odpovědná za vznik koagulačních nekróz pankreatu, neboť štěpením fosfolipidů vznikají lyzosloučeniny poškozující buněčné membrány. Aktivace lipázy způsobuje vznik tukových nekróz. (Nečas, a další, 2003) Pacienty jdou většinou dospělí mezi 3. a 6. dekádou, žlučové kameny jsou častější u žen mezi 50 a 60 lety věku, u mužů je častější příčinou alkoholismus. Symptomaticky se projevuje bolestí nadbřišku, zvracením, šokovým stavem. Laboratorní testy prokazují zvýšenou amylázu a lipázu, hypokalcémii. Mortalita akutní pankreatitidy je asi 10%. Makroskopickým nálezem u mírné formy je edém a zvětšení pankreatu, okrsky tukové nekrózy. U těžké pankreatitidy splývají oblasti tukové a parenchymové nekrózy, pankreas je prokrvácený. Mikroskopickým nálezem je u mírné pankreatitidy intersticiální akutní zánět s neutrofilními granulocyty, disperzní tukové intra a peripankreatické nekrózy. U těžké pankreatitidy jsou tukové a parenchymové nekrózy, tukové nekrózy mohou být i ve vzdálených oblastech, např. v omentu, peritoneu a kostní dřeňi (Lamps, 2011).
Chronická pankreatitida Chronická pankreatitida je zánětlivé onemocnění charakteristické poškozením a následným zánikem acinózních buněk, fibrózními změnami a nedostatečností exokrinní i endokrinní sekrece. K nejčastější formě patří chronická kalcifikující pankreatitida způsobená chronickým abúzem alkoholu. Zde dochází ke snížení sekrece HCO3− a vody, čímž roste koncentrace bílkovin, které se usazují v luminu vývodů a tvoří bílkovinné kapénky, do kterých se ukládají soli vápníku. Tyto vápenaté usazeniny způsobují léze epitelu a aktivaci enzymů vedoucí k natrávení tkáně. Méně často se vyskytuje chronicko- obstrukční pankreatitida, kde dochází k uzavření hlavního vývodu nejčastěji tumorem, stenózou papily nebo strikturou jizvy a následně vzniká stenóza vývodu. Následkem zánětu bývá kromě insuficience pankreatu i pankreatický ascites, malabsorpce se ztrátou hmotnosti, diabetes - 15 -
mellitus, trombóza vena portae a vena lienalis, městnavý ikterus a pseudocysty (Silgernagl, a další, 2001). Mezi symptomy patří bolest v nadbřišku, steatorea, diabetes mellitus, ztráta váhy, nausea, zvracení, rekurentní ataky akutní pankreatitidy. Laboratorní testy vykazují yvýšený CA 199. Chronická pankreatitida představuje zvýšené riziko rozvoje karcinomu pankreatu. Makroskopickým nálezem je tuhá indurovaná fibrotická tkáň, s místy cysticky dilatovanými dukty s kalcifikovaným sekretem a pseudocysty s krví a nekrotickým debritem. Mikroskopicky se vyskytuje nepravidelná atrofie a obliterace acinů a duktů s retencí původní lobulární architektoniky, fibrotické změny (jizvení), alterace (poškození) duktů - epitel duktů může být atrofický, reaktivně změněný, hyperplastický, metaplastický (metaplázie dlaždicová, mucinózní, pylorická). Viz obr. 3. Langerhansovy ostrůvky zanikají až při pokročilé fázi (Lamps, 2011).
Obrázek 3 Chronická pankreatitida, 50x
Autoimunitní pankreatitida Autoimunitní pankreatitida je fibroproduktivní a zánětlivé onemocnění původu autoimunitního. Projevy jsou bolest nadbřišku, ikterus, úbytek váhy. Po léčbě steroidy je poměrně příznivá prognóza tohoto onemocnění. Makroskopicky bývá zvětšený pankreas (zejména hlava) a stenózy pankreatického duktu a choledochu. Mikroskopickým nálezem je hustý plazmocelulární infiltrát v okolí duktů. (Lamps, 2011) - 16 -
Nádory pankreatu Nádor je geneticky podmíněný patologický útvar typický klonálním růstem, který se vymkl kontrole organismu. Nádory se dělí podle vztahu k okolní tkáni na benigní, intermediární a maligní. Benigní (nezhoubné) nádory rostou pomalu a expanzivně, takže svým růstem stlačují okolní tkáně bez jejich podstatnějšího porušení. Mají homologní stavbu, a proto se nádorový parenchym podobá tkáni, ve které vznikl. Obvykle tvoří z vlastního nádorového stomatu nebo z tlakem atrofované okolní tkáně pouzdro, díky kterému lze tyto nádory většinou snadno chirurgicky odstranit. Benigní nádory netvoří metastázy. Intermediární nádory tvoří přechod mezi benigními a maligními nádory. Tyto nádory mohou metastazovat, ale mívají lepší prognózu než zhoubné nádory. Maligní (zhoubné) nádory rostou rychle a agresivně vůči okolní tkáni. Nižším stupněm agresivního růstu je růst infiltrativní, kdy dochází k propagaci nádoru tkáňovými štěrbinami a vyšším stupněm je invazivní růst, způsobený destrukcí okolní tkáně vlivem enzymů a proteáz štěpících kolagen na povrchu nádorových buněk (Rejthar, a další, 2002). Tyto nádory jsou neohraničené, recidivují a tvoří metastázy, což znesnadňuje jejich vyoperování. U nádorů je určován typing (určení tkáně, ze které nádor pochází) a dále grading a staging. Grading neboli stupeň diferenciace či zralosti nám udává stupeň odlišnosti nádoru od původní tkáně. Značí se písmenem G a dělí se na tyto stupně:
Gx - nelze určit stupeň diferenciace
G1 - dobře diferencovaný nádor
G2 - středně diferencovaný nádor
G3 - málo diferencovaný nádor
G4 - nediferencovaný nádor
Staging udává rozsah nádorového onemocnění po těle, používá se tzv. TNM klasifikace. Písmeno T (tumor) značí rozsah nádoru v daném orgánu, M (metastasis) přítomnost vzdálených metastáz, N (node) hodnotí přítomnost metastáz v oblasti regionálních uzlin. - 17 -
Nádory pankreatu rozlišujeme na nádory vycházející z endokrinní a exokrinní tkáně. Pojem karcinom pankreatu označuje výhradně tumory vycházející z tkáně exokrinní. Mezi nejvíce zastoupený nádor exokrinního pankreatu patří duktální adenokarcinom, dalšími méně běžnými typy jsou acinární adenokarcinom, serózní cystadenom, mucinózní cystická neoplázie, intraduktální papilární mucinózní neoplázie, solidně pseudopapilární tumor a pankreatoblastom. Endokrinní pankreas je místem vzniku vzácně se vyskytujícího neuroendokrinního tumoru a neuroendokrinního karcinomu.
1.2.5 Nádory exokrinního pankreatu Malignitu nádorů často posuzujeme dle stupně buněčné atypie. Zhoubné novotvary (ZN) pankreatu se řadí mezi nádory s nejhorší prognózou, jejichž incidence celosvětově jeví pomalý růst. Graf zobrazuje časový vývoj hrubé incidence (počet nově nemocných nahlášených osob na 100 000 osob) a hrubé mortality (počet úmrtí na ZN na 100 000 osob) v České republice od roku 1977 do roku 2010.
Obrázek 4 Časový vývoj hrubé incidence a mortality zhoubných novotvarů pankreatu v ČR
Ze zhoubných nádorů jsou nejvíce zastoupeny solidní adenokarcinomy, daleko méně cystické tumory. Karcinomy exokrinního pankreatu postihují v naprosté většině vývody - 18 -
pankreatu, buňky acinů v pouhém 1 % případů (Povýšil, a další, 2001). Přibližně 60 % pankreatických nádorů vzniká v hlavě pankreatu, 15 % v těle, 5 % v ocasu, ve 20 % procentech postihují difúzně celý orgán (Robbins, 2003). Na přítomnost karcinomu hlavy pankreatu může upozornit vnik obstrukčního ikteru, způsobený uzavřením intrapankreatické části žlučovodu nádorem. Nádory těla a ocasu se projevují mnohem později, a proto mají velmi špatnou prognózu. V době jejich diagnózy již bývají značně infiltrovány v okolní tkáni, často jsou přítomny metastázy v regionálních lymfatických uzlinách, játrech, plicích a kostech (Mačák, a další, 2004). Příznakem karcinomu mohou být tromboflebitidy v oblasti dolních končetin vznikající uvolňováním tkáňového tromboplastinu z nádoru do cévního řečiště (Nečas, a další, 2003). U každého typu tumoru je uveden imunohistochemický profil, tj. přítomnost obvykle positivních markerů.
Duktální adenokarcinom Duktální adenokarcinom je maligní epiteliální tumor vycházející z buněk pankreatických vývodů. Jak již bylo naznačeno výše, tvoří 85 - 90 % všech nádorů pankreatu. Mezi rizikové faktory patří kouření, chronická pankreatitida, abúzus alkoholu, vysoký příjem tuků, nitrátů a masa v potravě, chemikálie (rozpouštědla, DDT), méně často vzniká jako součást některých genetických syndromů. Vznik duktálního karcinomu podmiňují preneoplastické prekurzory, které způsobují vznik pankreatických intraepiteliálních neoplázií (PanIN), kde dochází ke změně normálního duktálního epitelu v epitel dysplastický. Vyskytuje se nejčastěji během sedmé a osmé dekády věku, častěji u mužů v poměru 1,3:1. Díky nespecifickým symptomům, jako je bolest v epigastriu a zádech, úbytek na váze a obstrukční ikterus, dochází k pozdní diagnóze. Patří k nádorům s velmi špatnou prognózou, pětileté přežití je pod hranicí 5 %. Resekce je možná pouze v 10 - 20 % případů (Lamps, 2011). Makroskopickým nálezem je solitární nebo multifokální tuhé bělavě šedé ložisko, které bývá špatně ohraničené. Pro mikroskopický nález je typická glandulární architektonika, cytonukleární atypie, produkce hlenu nádorovými buňkami, dezmoplastické stroma, lišící se v závislosti na grade 1 - 3. Viz obr. 4. Častá je perineurální invaze, proto jsou nádory tohoto typu velice bolestivé, vaskulární invaze je méně obvyklá. Mezi nejčastější varianty - 19 -
duktálního adenokarcinomu patří varianta pěnitá, světlobuněčná, koloidní, prstenčitá, adenoskvamózní, medulární a anaplastická (Lamps, 2011). Imunohistochemický profil: positivní cytokeratiny (dále jen CK) 7, 8, 18, 19, CEA, CA 19- 9, CA 125, claudin- 4, fascin, mesothelin, overexprese p53 (50 - 75 %).
Obrázek 5 Duktální adenokarcinom grade 1 nahoře, grade 2 dole, 200x
Totožný imunohistologický profil s duktálním adenokarcinomem vykazuje svou lokací blízký adenokarcinom choledochu a amplulární adenokarcinom (adenokarcinom Vaterské papily), jež patří mezi nádory extrahepatálních žlučovodů. Nádory žlučových cest patří mezi vzácné nádory postihující věkovou skupinu 50-70 let. Častým projevem obou - 20 -
těchto nádorů je vznik obstrukčního ikteru. Dalšími projevy mohou být cholangitida v důsledku městnání žluči a u ampulárního adenokarcinomu akutní pankreatitida. Přímou invazí se mohou šířit do žlučových cest nádory pankreatu.
Acinární adenokarcinom Acinární adenokarcinom je vzácný vysoce agresivní maligní epiteliální tumor. Je typický svou acinární diferenciací se zymogenními granuly. Tvoří 1 % všech nádorů pankreatu. Vyskytuje se v páte až sedmé dekádě, častěji u mužů. Kromě nespecifických symptomů se zde vyskytuje paraneoplastický syndrom z nadprodukce lipázy, dochází tedy k četným tukovým nekrózám. Zde je prognóza také nepříznivá, 5-ti leté přežití činí 6 %. Terapie spočívá v provedení chirurgického zákroku a chemoterapie. Makroskopicky jde o solidní ohraničené ložisko s invazí do pouzdra o velikosti v průměru 10 cm ( rozsah 2-30 cm). Mikroskopicky je přítomna solidní, acinární, glandulární nebo trabekulární architektonika, produkce hlenu, uniformní jádra s prominentními centrálními jadérky, cytoplazma obsahuje četná eozinofilní granula. Dalším nálezem bývá vaskulární invaze. (Lamps, 2011) Imunohistochemický profil: trypsin, chymotrypsin, lipáza, CK 8, 18, chromogranin, synaptofyzin, méně často pozitivní amyláza, CK 7, 20.
Serózní cystadenom Serózní cystadenomy jsou benigní cystické tumory žlázového epitelu vyrůstající z centroacinózních či interkalárních buněk. Tvoří asi čtvrtinu všech cystických nádorů pankreatu. Jsou charakteristické malými cystami, které obsahují jasnou, slámově zbarvenou serózní tekutinu. Výstelka těchto cyst je tvořena kubickými buňkami bohatými na glykogen. Viz obr. 6. Nádory se typicky vyskytují v sedmé dekádě života a jsou provázené nespecifickými symptomy, jako je bolest v epigastriu, poměr ženy: muži je 3:1. Tyto nádory bývají dobře ohraničené a jejich chirurgická resekce je řešením u naprosté většiny pacientů. Variantami jsou: mikrocystická, oligocystická, solidní varianta (Lamps, 2011). Imunohistochemický profil: pozitivní pancytokeratin, α- inhibin, calponin.
- 21 -
Obrázek 6 Serózní cystadenom, 150x
Mucinózní cystická neoplázie Mucinózní cystické novotvary (dále jen MCN) vycházejí z hlen produkujících epiteliálních buněk a jsou asociované se stromatem ovariálního typu, který se v pankreatu vyskytne chybou při embryonální migraci. Proto téměř vždy vznikají u žen a to v poměru 20: 1. Vyskytují se kolem 40. až 50. roku života, obvykle v těle nebo ocasu slinivky (90 %), mohou být bezbolestné nebo se vyskytují symptomy z komprese okolních orgánů. Prognóza je příznivá u pacientů s benigní MCN a MCN bez invaze (Lamps, 2011). Makroskopicky jsou pozorovatelné multilokulární cystické silnostěnné léze vyplněné hustým hlenem, cysty jsou lemovány vysokým cylindrickým hlen produkujícím epitelem. Viz obr. 7. Tyto nádory mohou být benigní, hraniční nebo maligní. Benigní mucinózní cystadenomy nemají významnou cytologickou či architektonickou atypii, zatímco hraniční MCN ji vykazují, ale nejsou invazivní do okolního vaziva, narozdíl od maligních mucinózních cystadenokarcinomů, které invazivní jsou (Robbins, 2003). Dle stupně buněčné atypie rozlišujeme:
LG dysplasia- mírná dysplázie
MG dysplasia- střední dysplázie
HG dysplasia- těžká dysplázie
invazivní mucinózní cystadenokarcinom - 22 -
Imunohistochemický profil: stroma ovariálního typu: calretinin, inhibin, ER/PR, CD 10, nádorový parenchym (epitel) vykazuje podobný imunofenotyp jako duktální karcinom (CK 7, 8, 18, 19).
Obrázek 7 MCN, 200x
Intraduktální papilární mucinózní neoplázie (dále jen IPMN) IPMN je hlen produkující epiteliální tumor s intraduktálním růstem, dle postiženého duktu členěný na „branch“, „main“ a „combined“. Patří mezi nejčastější cystický tumor pankreatu (8-20 %). Průměrný věk pacientů s IPMN se pohybuje okolo 63 let. Symptomy, jako je bolest břicha a zad, úbytek hmotnosti až anorexie a opakované pankreatitidy, jsou způsobeny obstrukcí pankreatického duktu. Narozdíl od mucinózních cystických nádorů se vyskytují častěji u mužů než u žen a postihují převážně hlavu slinivky břišní. Ve většině případů je postižena pouze část pankreatického vývodu, postižení může být také multifokální či v rozsahu celého pankreatu. Dobrou prognózu mají neinvazivní tumory, kde je 5- ti leté přežití větší než 75 %, horší prognóza je u tumorů invazivních, kde je 5-ti leté přežití v rozmezí 34-62 %. Mikroskopickým nálezem je papilární architektonika, vyskytuje se 5 epiteliálních subtypů hlen secernujícího epitelu (Lamps, 2011) (viz obr.8): - 23 -
žaludeční
intestinální (střevní)
pankreatobiliární
onkocytární
tubulopapilární
Dle stupně buněčných atypií rozlišujeme:
LG dysplasia- mírná dysplázie
MG dysplasia- střední dysplázie
HG dysplasia- těžká dysplázie
IPMN s invazivní komponentou- 35 % případů
Obrázek 8 IMPN, 200x
Solidně pseudopapilární tumor Tento tumor je nízce maligní a pochází z neznámé buněčné diferenciace. Tvoří 1-2 % všech exokrinních tumorů pankreatu. Postihuje pacienty 3. a 4. dekády a je častější u žen
- 24 -
v poměru 15:1. Kompletní resekce je úspěšná ve více než 80 % případů. Rekurence a metastázy (játra, uzliny, peritoneum) tvoří 10-15 % případů. Makroskopicky je pozorovatelná solitární léze, která je dobře ohraničená (opouzdřená), bělavě šedého zbarvení, solidně- cystické stavby, částečně nekrotická a prokrvácená, o průměrné velikosti 10 cm ( rozsah 1,5 až 25 cm). Mikroskopický obraz tvoří solidní monomorfní
plochy
polygonálních
buněk,
typické
jsou
pseudopapily,
vzniklé
degenerativními změnami. Viz obr. 9. Dále je typická přítomnost pěnitých makrofágů, krvácení, pigmentace lipofuscinem, melaninem (Lamps, 2011). Imunohistochemický
profil:
β
katenin,
vimentin,
α-1-antitrypsin,
CD
10,
progesteronový receptor (PR), NSE, CD 56, synaptofyzin, cyklin D1, CD 117
Obrázek 9 Solidně pseudopapilární tumor, 150x
Pankreatoblastom Pankreatoblastom je vzácný maligní epiteliální tumor typický pro dětský věk. Pluripotentní buňky přetrvávají v pankreatoblastomu v nezralé podobě a mají schopnost diferenciace do buněčných typů acinárních, skvamózních, endokrinních, duktálních a mezenchymálních. Dvě třetiny tumorů jsou diagnostikovány u dětí, jedna třetina u dospělých pacientů. Většina případů je sporadických, četné případy jsou asociovány - 25 -
s mutací beta-katenin/APC cesty. Mezi symptomy patří abdominální bolest, úbytek váhy a přítomnost palpovatelné léze v epigastriu. Patří mezi agresivní tumory, u jedné třetiny pacientů jsou již v době diagnózy přítomny metastázy v játrech, uzlinách, plicích či peritoneu (Lamps, 2011). Pankreatoblastom se vyskytuje solitárně, je dobře ohraničený, alespoň částečně opouzdřený, lobulární, šedé, béžové či žluté barvy a průměrné velikosti 10 cm. Mikroskopicky je možný výskyt mnoha histologických vzorů, např. acinární, skvamoidní, endokrinní, stromální (vazivo, chrupavka, kost), primitivní komponenta, vzácně duktální tkáň. Imunohistochemický profil: acinární tkáň- pozitivní cytokeraniny 7, 8, 18, 19, AE 1/3 a pankreatické enzymy, endokrinní tkáň- pozitivní chromogranin, synaptofyzin, CD 56, NSE.
1.3 Onemocnění endokrinního pankreatu Mezi onemocnění endokrinní části pankreatu patří diabetes mellitus a neuroendokrinní tumory a karcinomy.
1.3.1 Diabetes mellitus Diabetes mellitus (dále jen DM) je skupina metabolických chorob patřící do patologie endokrinní části pankreatu. Jejich společným znakem je hyperglykémie a po překročení prahu renální absorpce také glykosurie, způsobená úplným nebo relativním nedostatkem hormonu inzulinu. Inzulin je produkován β-buňkami Langerhansových ostrůvků a jeho funkcí je regulace hladiny glukosy v krvi. Snižuje glykémii tím, že zvýší propustnost glukosy směrem do buněk, stimuluje glykolýzu, v játrech podporuje syntézu glykogenu a zároveň blokuje glykogenolýzu a glukoneogenezi, tj. tvorbu glukózy z ostatních živin. Ovlivňuje metabolismus tuků, bílkovin, minerálů a vody. V tukové tkáni podporuje ukládání triacylglycerolů (dále jen TAG) a zároveň brání odbourávání těchto zásob (Nečas, a další, 2003). DM je zastoupen několika typy:
DM 1. typu (IDDM) DM 1. typu se projevuje absolutním nedostatkem inzulinu způsobeným zničením βbuněk Langerhansových ostrůvků na základě autoimunitního onemocnění, vyvolaného např. proděláním virové infekce. Tento typ typ tvoří 10 % onemocnění DM, pacienti jsou - 26 -
odkázáni na podávání inzulinu. Ve tkáni jsou prokazatelné protilátky proti buňkám ostrůvků (ICA) a proti inzulinu (IAA). Při nadbytku glukosy v krvi se její intracelulární nedostatek (hlavně ve svalech a tukové tkáni) projevuje tvorbou energie z jiných zdrojů, nedostatkem inzilinu dochází v adipocytech ke štěpení TAG na mastné kyseliny (dále jen MK) a z těchto MK vzniká β-oxidací acetyl-CoA, z něhož vznikají ketolátky v játrech, jejich nadprodukce vede ke ketoacidóze. Acidóza drážděním dýchacího centra v prodloužené míše způsobuje tzv. Kaussmaulovo dýchání, dech je cítit po acetonu. Následkem glykosurie nastupuje osmotická diuréza a polyurie vedoucí k dehydrataci (Lamps, 2011).
DM 2. typu (NIDDM) DM 2. typu je způsobena relativním nedostatkem inzulinu (jeho sekrece může být snížena, normální dokonce i zvýšená) v kombinaci s rezistencí cílových orgánů k inzulinu. DM 2. typu tvoří 90 % onemocnění, jehož pacienti nejsou závislí na dávkách inzulinu. Na vzniku tohoto typu cukrovky se podílí do značné míry životní styl (obezita, nadměrný příjem cukrů v potravě) a genetické předpoklady. Mezi typické symptomy patří polyurie, polydipsie, únava, rozostřené vidění (Lamps, 2011).
Gestační DM Tento typ DM vzniká na základě inzulinorezistence způsobené hormony (choriový somatomamotropin, progesteron, kortizol) asi u 2- 3 % gravidních žen. (Nečas, a další, 2003)
DM z dalších příčin DM může vznikat následkem pankreatitidy zánikem B-buněk, dále po chirurgickém odstranění pankreatu, působením protilátek proti inzulinu nebo jeho receptorům či inhibicí sekrece
inzulinu
somatostatinem
produkovaným
somatostatinomem.
Metabolický
endokrinní syndrom (Reavenův syndrom) je syndrom pro něhož je typická porušená glukózová tolerance, inzulinorezistence, arteriální hypertenze, hyperlipidémie s nízkými hladinami HDL cholesterolu (Nečas, a další, 2003). Dále se vyskytují mutace inzulinového receptoru způsobující inzulinorezistenci.
- 27 -
1.3.2 Neuroendokrinní tumory (NET) NET patří mezi nádory neuroendokrinního systému pankreatu, vyskytují se většinou sporadicky nebo jako součást některých syndromů (MEN 1, von Hippel-Lindau syndrom, tuberózní skleróza). Věk pacientů se pohybuje nejčastěji v rozmezí 30-60 let. Symptomaticky se projevují abdominální bolestí a ikterem. Prognóza se odvíjí od stupně diferenciace tumoru, čím vyšší grade, tím horší prognóza. Dle schopnosti produkovat biologicky aktivní látky se dělí na funkční tumory, které produkují hormony a nefunkční tumory, kterých je většina. Funkční NET nesou název podle hormonu, který ve velkém množství produkují, např. inzulinom, glukagonom, somatostatinom, VIPom (nádor z D1buněk) (Mačák, a další, 2004). Inzulinom (nádor z β-buněk) díky nadprodukci inzulinu způsobuje hypoglykémii, která se prohlubuje po hladovění nebo fyzickém výkonu, vedoucí k poruchám vědomí a kómatu. Podobné důsledky má předávkování exogenním inzulinem. Glukagonom (nádor z α-buněk) produkuje ve zvýšeném množství glukagon, který zvyšuje glukoneogenezi v játrech, což se projevuje mírnou formou DM. Často se vyskytuje u postmenopauzálních žen. Somatostatinom (nádor z δ-buněk) snižuje díky somatostatinu sekreci inzulinu a glukagonu, mezi projevy patří mírný DM, cholelitiáza, steatorea. VIPomy (nádor D1buněk) tvoří vazoaktivní intestinální polypeptid, který ovlivňuje sekreci iontů a vody, způsobuje hypokalemii, achlorhydrii a masivní průjmy (Nečas, a další, 2003). Makroskopicky jsou NET solidní dobře ohraničené ovoidní léze. Mikroskopický obraz tvoří trabekulární glandulární solidní architektonika, typické jsou monotónní populace kulatých buněk, jaderný chromatin je zrnitý typu “sůl a pepř“. Viz obr. 10. Mezi varianty NET patří: onkocytární, rhabdoidní, vakualizovaná na tuky bohatá varianta (Lamps, 2011). Imunohistochemický profil: pozitivní neuroendokrinní markery − chromogranin, synaptofyzin, CD 56, NSE, CK 8, 18. Dle hodnot mitotického a proliferačního indexu se určuje stupeň diferenciace nádoru (grade) viz tabulka 1. Mitotický index je definován jako počet mitóz na 10 HPF v oblasti s nejvyšší mitotickou aktivitou. Ki-67 je antigen exprimovaný výhradně buňkami v aktivní fázi buněčného cyklu, udává proliferační aktivitu vyjádřenou proliferačním indexem Ki-67, který vyjadřuje procento pozitivních jader ze všech nádorových jader. (Lamps, 2011)
- 28 -
Grading NET
Mitotický index (počet mitóz na 10 HPF)
Proliferační index Ki- 67
NET grade 1
<2
≤2%
NET grade 2
2- 20
3- 20 %
NE karcinom
> 20
> 20 %
Tabulka 1 Stupně diferenciace NET a hodnoty jejich mitotického indexu a proliferační aktivity Ki-67
Obrázek 10 NET grade 1, 200x
1.3.3 Neuroendokrinní karcinom (NEC) Tento vysoce agresivní karcinom je typický svou nadměrnou proliferační aktivitou. Je poměrně vzácný, tvoří 2-3 % ze všech pankreatických endokrinních neoplázií. Projevuje se bolestmi
zad,
žloutenkou,
paraneoplastickým
syndromem
(Cushingův
syndrom,
hyperkalcémie). Špatná prognóza tohoto karcinomu představuje průměrné přežití pacientů v řádech měsíců. Tumory jsou velké, solidní a béžově zbarvené. Mikroskopicky se NEC dělí na dvě varianty, na malobuněčnou a velkobuněčnou (Lamps, 2011).
- 29 -
Malobuněčná varianta je tvořena malými až středně velkými buňkami s chudou cytoplazmou, hyperchromatickými jádry s hrubým chromatinem. Buňky vykazují difúzní architektoniku a jsou přítomny četné mitózy. Běžná je vaskulární i perineurální invaze a nekrózy (Lamps, 2011). Velkobuněčná varianta je tvořena trabekulární síťovitou architektonikou, buňky jsou velké s hojnou eozinofilní cytoplazmou a vezikulárními jádry s viditelnými jadérky. Stejně jako u malobuněčné varianty se vyskytují nekrózy, mitózy a perineurální i vaskulární invaze (Lamps, 2011). Imunohistochemický
profil:
pozitivní
neuroendokrinní
synaptofyzin, CD 56, NSE), pancytokeratin.
Obrázek 11 NEC grade 3, 150x
- 30 -
markery
(chromogranin,
2 2 Speciální část 2.1 Imunohistochemie Imunohistochemie patří mezi histologické metody prokazující v buňkách a tkáních přítomnost určitých antigenů na základě vazby antigen-protilátka. Na základě afinity antigenní determinanty a vazebné části specifické protilátky dochází k vazbě, která se v dalším kroku zviditelní a tím se hledaný antigen ve tkáni prokáže. Prokazované antigeny mohou být původu endogenního (jaderné, membránové, cytoskeletální) nebo jsou do tkání zavlečeny např. infekcí (viry a bakterie). Imunohistochemické reakce doplňují v rutinním vyšetření přehledná (barvení Hematoxylin-Eosin) a speciální barvení, společně s dalšími imunochemickými metodami jako je Western blotting, ELISA, Souther a Nothern blotting, PCR, hybridizace in situ a dalšími (Dvořák, a další, 2008). Průkaz antigenů in situ představuje nalezení antigenu a jeho vizualizaci přímo v konkrétním místě tkáně. Ke zviditelnění vazby Ag-Ab používáme protilátky s navázaným detekčním systémem, u imunofluorescenčních principů je to fluorochrom, který emituje záření pozorovatelné fluorescenčním mikroskopem, u imunohistochemických principů se používá enzym (např. peroxidáza, alkalická fosfatáza), který je detekován změnou zbarvení substrátu, která je pozorovatelná ve viditelném světle.
2.1.1 Imunohistochemické metody Imunohistochemické a imunofluorescenční metody se dělí na tyto typy:
přímá metoda
nepřímá metoda dvojstupňová
nepřímé trojstupňové metody -metoda peroxidáza-antiperoxidázového komplexu (PAP) -metoda avidin-biotinového komplexu (ABC)
Schéma těchto metod znázorňují obrázky č 12, 13, 14.:
- 31 -
Přímá metoda Při přímé metodě se specifická protilátka značená enzymem či fluorochromem váže přímo na antigen tkáně (Obr. 12a). Nevýhodou zvláště imunofluorescenčních metod je nesnadná konjugace protilátek s některými fluorochromy, které změní vazebné místo protilátky a ta pak ztrácí schopnost rozpoznat antigen (Lukáš, a další, 1997).
Obrázek 12 Přímá metoda (a), nepřímá metoda dvojstupňová (b)
Nepřímá metoda (dvojstupňová) Při nepřímé metodě nejprve dochází k navázání specifické neznačené protilátky na antigen, tato primární protilátka je poté zviditelněna navázáním značené protilátky (Obr. 12b). Výhodou oproti přímé metodě je její větší citlivost, neboť na každou primární protilátku se váže více protilátek značených (Lukáš, a další, 1997). Na podobném principu je založen systém DAKO-Envision, kde je na tkáňový antigen navázána primární protilátka, která se přes sekundární protilátku spojí s polymerem, na němž jsou navázány molekuly enzymu peroxidázy.
Nepřímé trojstupňové metody Tyto metody jsou citlivější než předešlé, slouží k zesílení signálu při malém množství antigenu v tkáni. Nejprve je na antigen specificky navázána primární zvířecí protilátka, na kterou se následně naváže proti imunoglobulinům zvířete specifická neznačená protilátka (specifická také proti protilátce v PAP-komplexu), tvořící spojovací můstek a na něj nanášíme tzv. PAP-komplex (peroxidase-anti-peroxidase), komplex křenové peroxidázy a anti- peroxidázové protilátky (Obr. 13a). Enzym je navázán na vazebné místo protilátky, není tedy ovlivněna jeho enzymová aktivita konjugací.
- 32 -
Obrázek 13 Nepřímá trojstupňová metoda, a) peroxidáza, b) alkalická fosfatáza
V preparátech s vysokou aktivitou endogenní peroxidázy se používá metoda APAAP (alkalická fosfatáza-anti-alkalická fosfatáza), kde je enzym peroxidáza nahrazen alkalickou fosfatázou (Obr. 13b). Velmi rozšířenou a citlivou metodou je ABC metoda (avidin-biotin complex). Na primární specifickou protilátku se naváže sekundárná protilátka konjugovaná s biotinem, na niž se naváže komplex avidin-biotin-peroxidáza/alkalická fosfatáza, čímž dojde k zesílení signálu enzymatické aktivity. Principem této metody je pevná vazba vaječného glykoproteinu vaječného bílku avidinu s vitaminem H (biotinem). Avidin má 4 vazebná místa pro biotin/ komplex biotin-enzym. Obdobou je použití streptavidinu z bakterie Streptomyces avidini, která dává lepší reakci, komplex se nazývá SABC (streptavidin-biotin complex) (Lukáš, a další, 1997).
avidin biotin enzym
Obrázek 14 ABC metoda
- 33 -
Demaskování epitopů Vlivem fixace nativní tkáně dochází k maskování antigenních determinant, které musíme demaskovat, abychom zabránili zkreslení výsledků imunohistochemických vyšetření. V dnešní době se k těmto účelům používá působení proteolytických enzymů (trypsinu, pepsinu) a zahřátí tkáňových řezů v autoklávu, mikrovlné troubě či tlakové nádobě.
2.1.2 Typy protilátek pro imunohistochemické metody
Polyklonální protilátky Polyklonální protilátky se získávají opakovanou imunizací zvířete daným antigenem, který aktivuje mnoho klonů B-lymfocytů. Každý tento klon produkuje protilátku s jednou specificitou, tzn. rozpoznávající jeden epitop, který vyvolal její množení. Polyklonální protilátky tedy mají schopnost rozpoznat více epitopů téhož antigenu.
Monoklonální protilátky Monoklonální protilátky rozpoznávající pouze jeden epitop jsou uměle vyráběné. Proces také začíná imunizací zvířete určitým antigenem, poté se vyjme slezina k získání suspenze B-lymfocytů a probíhá fúze s myelomovými buňkami v PEG (polyethylenglykolu). PEG stimuluje fúzi membrán a poté jader. Dalším krokem je kultivace v selekčním HAT mediu (hypoxantin aminopterin thymidin), které umožní přežití pouze hybridním buňkám, tzv. hybridomům.
2.2 Aplikace imunohistochemických metod v bioptické diagnostice Imunohistochemické metody mají dnes široké využití v onkologické diagnostice, kde ve sporných případech pomáhají klasifikovat nádor, určit typ tkáně, ze které vychází, popř. stupeň diferenciace a proliferační aktivity nádorových buněk.
- 34 -
Cytoskeletální antigeny Hlavním zástupcem cytoskeletálních antigenů jsou cytokeratiny, patřící mezi střední filamenta. Použitím specifických protilátek proti proteinům intermediárních filament se zjistí kombinace exprimovaných cytokeratinů, které jsou specifické pro různé epitely a jejich stupně diferenciace. V jednovrstevném epitelu jsou exprimovány např. CK 8, 18, někdy 7, 19, 20 (Lukáš, a další, 1997).Cytokeratiny se dělí na dva typy:
typ I (kyselé) jsou CK 9-19 (20)
typII (bazické a neutrální) jsou CK 1-8
U nejčastějšího typu karcinomu pankreatu − duktálního adenokarcinomu vykazují pozitivitu cytokeratiny 7, 8, 18, 19. Tato směs protilátek reaguje téměř se všemi druhy epitelových buněk, aniž by vykazovala zkříženou reaktivitu s ostatními intermediárními filamenty. AE1/3 je směs protilátek patřící mezi pancytokeratiny. AE1 reaguje s kyselými CK typu I jako jsou CK 10, 15, 16, 19, zatímco AE3 rozpoznává CK 1-8.
Ukazatelé rychlosti buněčné proliferace Zde se sleduje exprese jaderného antigenu Ki-67 proliferujících buněk ve všech fázích buněčného cyklu kromě fáze G0. V praktické části této práce bude hodnoceno procento pozitivních jader ze všech nádorových jader.
Antionkogeny Hlavním zástupcem antionkogenů je gen p53, který kóduje stejnojmenný jaderný protein p53, jehož hlavní funkcí je kontrola normálního průběhu buněčného cyklu. Vlivem poškození DNA dochází ke zvýšení exprese proteinu p53, který se váže na specifické sekvence DNA a způsobí expresi genů, které mají schopnost zastavit buněčný cyklus v G1 fázi a pokud nedojde k reparaci DNA, navodit apoptózu geneticky poškozené buňky. Pokud je protein p53 nefunkční, nedojde k zastavení buněčného cyklu, buňky se dále dělí a předávají svou poškozenou DNA svým dceřiným buňkám, což vede ke vzniku maligní transformace (Rejthar, a další, 2002).
- 35 -
Neuroendokrinní antigeny Neurálními markery jsou synaptofyzin a chromogranin. Synaptofyzin je membránový protein presynaptických váčků nervových buněk, chromogranin je obsažen v matrix sekrečních granulí neuroendokrinních buněk. NSE (neuron specifická enoláza) je cytoplazmatický enzym, který, jak už název vypovídá, býval považován za specifický marker neuronů. NSE je jedním z izoenzymů glykolytického enzymu enolázy. Dalším takovým izoenzymem je hybridní α-γ enoláza, která je v současné době imunohistochemicky neodlišitelná od NSE. Zatímco γ-enoláza je specifická pouze pro neurony, α-enoláza se vyskytuje v extraneuronálních tkáních (endotelie). Díky své positivitě se využívá jako marker difusního neuroendokrinního systému.
3 Experimentální část 3.1 Přehled získaných dat Praktická část této práce se zabývá odečtením a zhodnocením imunohistochemického profilu vybraných tumorů pankreatu. Pro zhodnocení bylo použito 20 vzorků histologických preparátů od pacientů FN Brno Bohunice sbíraných v období od 27. 9. 2013 do 18. 6. 2014. Věk pacientů se pohyboval od 40 do 81 let. Pacienty tvořilo 11 mužů a 9 žen. Vzorky jsem rozdělila do dvou skupin na základě histogenetického původu tumorů, na tumory vycházející z exokrinní a endokrinní části pankreatu. Duktální adenokarcinom, adenokarcinom choledochu a ampulární adenokarcinom jsou vzhledem k totožnému imunofenotypu nádorových buněk hodnoceny společně a tvoří první skupinu. Zde je hodnocena pozitivita jednotlivých tkáňových markerů, kterými jsou CK 7, 8, 18, 19, 20, antionkogen p53 a ukazatel proliferace Ki-67. Do druhé skupiny jsou zařazeni zástupci neuroendokrinních nádorů (NET a NEC), hodnoceny byly markery AE 1/3, NSE, synaptofyzin, chromatogranin, p53 a Ki67. Hodnota Ki-67 vyjadřuje v procentech počet pozitivních jader ze všech nádorových jader. U markeru p53 se hodnotí pozitivita jader. Silná pozitivita je u pancytokeratinů a neuroendokrinních markerů značena třemi křížky, slabá jedním křížkem.
- 36 -
3.1.1 Hodnocení markerů u duktálního adenokarcinomu Věk pacientů se pohyboval okolo sedmé dekády (s průměrnou hodnotou 64 let) a byli jimi převážně muži (8 z 15 případů). Mezi patnácti hodnocenými vzorky byly 2 případy ampulárního adenokarcinomu (grade 2-3 u obou z nich), 4 případy adenokarcinomu choledochu (grade 2, 2-3) a 9 případů duktálního adenokarcinomu (z toho 7 případů dukt. adenokarcinomu hlavy, jeden těla a ocasu a jeden pouze těla). Je známo, že u duktálního adenokarcinomu vykazují pozitivitu cytokeratiny 7, 8, 18, 19, což se nám potvrdilo. CK 7, 18 a 19 byly pozitivní ve 100 % případů. Pouze CK 8 byl v jednom případu z 15 negativní (93,3 %). CK 20 byl positivní v 9 z 15 případů (60 %). Protein p53 byl positivní v 9 případech (60 %), což se shoduje s 50-75 % uvedenými v literatuře (LAMPS, Diagnostic patology, 2011). Positivita jaderného antigenu Ki-67 se lišila v rozmezí od 10 do 70 % positivních jader.
- 37 -
pa-
typ tumoru
grade
CK 7
cient
CK
CK
CK
CK
8
18
19
20
P53
Ki67 (%)
Ž- 68
Ampulární adenokarcinom
2- 3 ++++
+
++ ++
-
+
30
M- 52
Ampulární adenokarcinom
2- 3 ++++
++
++ +++
+
-
60
M- 72
Adenokarcinom choledochu
2
++++
++
++ +++
-
+
20
M- 66
Duktální adenokarcinom
2
++++
+
++ +++
+
+
70
+
20
hlavy p. Ž- 71
Adenokarcinom chlodedochu
2- 3 ++++
+
+++
+++
M- 61
Duktální adenokarcinom
2- 3 ++++
+
+++
+++
-
+
55
2- 3 ++++
+
+++
+++
-
-
35
2- 3 ++++
+
++ +++
+
+
20
2- 3 ++++
-
+
+++
-
+
50
2
+
++ +++
+
+
25
2- 3 ++++
++
++ +++
-
65
2- 3 ++++
++
++ +++
-
-
20
++
hlavy p. M- 81
Duktální adenokarcinom těla a ocasu p.
M- 66
Duktální adenokarcinom hlavy p.
M- 49
Adenokarcinom chlodedochu
Ž- 61
Duktální adenokarcinom
++++
hlavy p. Ž- 59
Duktální adenokarcinom
++
hlavy p. Ž- 68
Duktální adenokarcinom hlavy p.
M- 47
Adenokarcinom chlodedochu
2- 3 ++++
++
++ +++
+
-
10
Ž- 74
Duktální adenokarcinom těla
2
++++
+++
++ +++
+
-
10
Ž- 67
Duktální adenokarcinom
2- 3 ++++
+++
++ ++
+
15
++
hlavy p. Tabulka 2 Výsledky vyšetřovaných markerů duktálního adenokarcinomu pankreatu a dalších imunofenotypicky podobných adenokarcinomů žlučových cest
- 38 -
3.1.2 Hodnocení markerů u NET a NEC Průměrný věk pacientů s NET a jedním případem NEC činil 50 let, pacienty byly 3 ženy a 2 muži. Neuroendokrinní markery chromogranin a synaptofyzin a směs pancytokeratinů AE1/3 byly pozitivní ve všech případech (100 %), CD 56 byl positivní ve 4 z 5 případů (80 %) a NSE byly positivní ve 3 případech z 5 (60 %). Jaderný protein p53 byl positivní pouze v jednom případě, a to u NEC těla a ocasu grade 3 (positivita 20 %). Ki- 67 byl výrazně positivní jen u NEC grade 3, konkrétně bylo positivních 70 % jader. U NET těla a ocasu p. grade 1 činil proliferační index Ki-67 1 %. Ve zbylých případech a zároveň NET grade 2 byla positivita Ki-67 pod 20 %. Výsledky se nám shodují s tabulkou 1 uvedenou v kapitole o NET.
Paci-
Typ tumoru
ent
gra
AE1/3
NSE Synap-
Chromo
tofyzin
-granin
-de
P53
CD56
Ki-67 (%)
Ž- 46
NET těla pankreatu
2
+++
+
+++
+
-
+
7
Ž- 44
NET těla pankreatu
2
+++
++
+++
+++
-
-
4
M- 69
NET těla a ocasu pankreatu
1
++
+
++
++
-
+
1
M- 40
NEC těla a ocasu pankreatu
3
+++
-
+++
++
+
++
70
Ž- 51
NET hlavy pankreatu
2
+
-
+++
+
-
++
5
Tabulka 3 Výsledky vyšetřovaných markerů u NET a NEC pankreatu
- 39 -
3.2. Názorné vyhodnocení preparátů dvou vybraných případů Fotografie byly pořízeny na ÚPa FN Brno.
3.2.1 Případ první: duktální adenokarcinom hlavy pankreatu, grade 2
Obrázek 15 Duktální adenokarcinom, HE, 200x
Obrázek 16 Duktální adenokarcinom, CK 7, 200x
- 40 -
Obrázek 17 Duktální adenokarcinom, CK 8, 200x
Obrázek 18 Duktální adenokarcinom, CK 18, 200x
- 41 -
Obrázek 19 Duktální adenokarcinom, CK 19, 200x
Obrázek 20 Duktální adenokarcinom, CK 20, 200x
- 42 -
Obrázek 21 Duktální adenokarcinom, Ki- 67, 200x
Obrázek 22 Duktální adenokarcinom, p53, 200x
- 43 -
3.2.2 Případ druhý: neuroendokrinní tumor těla pankreatu, grade 2
Obrázek 23 NET, HE, 200x
Obrázek 24 NET, AE1/3, 200x
- 44 -
Obrázek 25 NET, NSE, 200x
Obrázek 26 NET, chromatogranin, 200x
- 45 -
Obrázek 27 NET, synaptofyzin, 200x
Obrázek 28 NET, p53, 200x
- 46 -
Obrázek 29 NET, CD 56, 200x
Obrázek 30 NET, Ki- 67, 200x
- 47 -
4
Závěr Karcinom pankreatu patří díky své poloze v těle a dlouhodobému bezpříznakovému
průběhu k nádorovým onemocněním s nejhorší prognózou, pětileté přežití je pod hranicí 5%. Představuje 2% všech onkologických onemocnění. Neexistuje dosud žádný vhodný specifický laboratorní marker onemocnění, nelze tedy provádět screening, více než 70 % pacientů je v době diagnózy již v pokročilém neresekabilním stádiu. Významnou součástí komplexní diagnostiky onemocnění pankreatu je histologické vyšetření, nejen při rozlišení karcinomu pankreatu a jiných lézí, zejména chronické pankreatitidy, ale i při analýze resekátu pankreatu u radikálně operovaných, pooperační excize či tenkojehlové aspirační biopsie (FNAB) u neresekovaných případů. Aplikace imunohistologických metod pak pomáhá ve sporných případech upřesnit histopatologickou diagnózu i klinickou prognózu. V první části této práce je zpracován přehled onemocnění pankreatu rozlišený na patologie endokrinní a exokrinní složky žlázy. Popis nádorových onemocnění je doplněn o fotografie (pořízené Úpa FN Brno) a imunohistochemické profily jednotlivých tumorů. Druhá část práce popisuje princip imunohistochemických metod, včetně použití protilátek a jejich značek. Dále je zde uvedena základní charakteristika hodnocených cytoskeletálních antigenů (CK 7, 8, 18, 19, 20), antionkogenu p53, neuroendokrinních antigenů (synaptofizin, chromogranin, NSE) a ukazatele rychlosti buněčné proliferace Ki-67. Ve třetí části práce byl proveden odečet dvaceti pacientských vzorků z FN Brno s diagnózami
duktální
adenokarcinom,
ampulární
adenokarcinom,
adenokarcinom
choledochu, neuroendokrinní tumor a neuroendokrinní karcinom. U každého případu byly mikroskopicky odečteny jednotlivé tkáňové antigeny, hodnocené jako pozitivní (+) či negativní (-), popř. uvedeno procento pozitivních jader ze všech nádorových jader (u Ki-67). Z těchto výsledků byly zhotoveny základní statistické údaje, které byly porovnány s imunohistologickými profily popsanými v teoretické části.
- 48 -
U duktálního adenokarcinomu, ampulárního adenokarcinomu a adenokarcinomu choledochu jsme ověřili vysokou pozitivitu CK 7, 8, 18, 19, positivitu CK 20 (60 %) a p53 (60 %), positivita jader na Ki-67 byla odlišná případ od případu v rozmezí 10 až 70 % jader. U NET a NEC jsme potvrdili vysokou pozitivitu směsi pancytokeratinů AE1/3, synaptofizinu a chromograninu (100 %), CD 56 byl positivní v 80 %, NSE v 60 % případů a p53 byl u všech NET negativní, positivní byl u jediného případu NEC. Ki-67 byl výrazně positivní jen u NEC grade 3, konkrétně bylo positivních 70 % jader. U NET těla a ocasu p. grade 1 činil proliferační index Ki-67 1 %. Ve zbylých případech − NET grade 2 byla positivita Ki-67 pod 20 %. Výsledky byly shodné s tabulkou 1 uvedenou v kapitole o NET (čerpáno z Diagnostic patology, Lamps, 2011). Nebyla nalezena žádná srovnatelná studie, se kterou bychom mohli výsledky porovnat. Kvůli nízkému počtu odečítaných vzorků duktálního karcinomu a jemu imunohistochemicky odpovídajících adenokarcinomů (15 vzorků) a díky nízkému výskytu vzácnějších nádorů vycházejících z endokrinní tkáně (5 vzorků) jsou statistické údaje pouze ilustrativní.
- 49 -
5 LITERATURA Dvořáčková, Jana. 2013. Cytologie pankreatu. Praha : Maxdorf, 2013. 978-80-7345-320-6. Dvořák, Karel, a další. 2008. Základy histopatologických vyšetřovacích metod. 2008. Horký, Drahomír a Čech, Svatopluk. 2011. Mikroskopická anatomie . Brno : Masarykova univerzita, 2011. 978-80-210-5550-6. Lamps, Laura Webb. 2011. Diagnostic Pathology: Hepatobiliary and Pancreatic. Canada : Amirsys Publishing, 2011. 978-1-931884-56-3. Lukáš, Zdeněk, a další. 1997. Imunohistochemické metody v biologii a v bioptické diagnostice. Brno : Sborník prací Lékařské fakulty v Brně, 1997. 80-210-0620-X. Mačák, Jirka a Mačáková, Jana. 2004. Patologie. Praha : Grada Publishing, a.s., 2004. 80-247-0785-3. Nečas, Emanuel a kolektiv. 2003. Patologická fyziologie orgánových systémů. Praha : Karolinum, 2003. 978-802-4606-750. Povýšil, Ctibor a kolektiv. 2001. Speciální patologie II. díl. Praha : Univerzita Karlova v Praze-Karolinum, 2001. 80-7184-484-5. Rejthar, Aleš a Vojtěšek, Bořivoj. 2002. Obecná patologie nádorového růstu. Praha : Grada Publishing, 2002. 80-247-0238-X. Robbins. 2003. Robbins basic pathology. Philadelphia : Saunders, 2003. 07-216-9274-5. Sadler, Thomas W. 2011. Langmanova lékařská embryologie. Praha : Grada, 2011. 978802-4726-403. Silgernagl, Stefan a Lang, Florian. 2001. Atlas patofyziologie člověka. Praha : Grada, 2001. 80-716-9968-3.
- 50 -
Elektronické zdroje DUŠEK Ladislav, MUŽÍK Jan, KUBÁSEK Miroslav, KOPTÍKOVÁ Jana, ŽALOUDÍK Jan, VYZULA Rostislav. Epidemiologie zhoubných nádorů v České republice [online]. Masarykova univerzita, [2005], [cit. 2014-07-09]. Dostupný z WWW: http://www.svod.cz. Verze 7.0 [2007], ISSN 1802 – 8861 KOLLÁROVÁ, H., K. AZEEM, H. TOMÁŠKOVÁ, V. PROCHÁZKA, A. MARTÍNEK, O. SHONOVÁ, J. ŠEVČÍKOVÁ, D. HORÁKOVÁ a V. JANOU. Zdravotní stav a karcinom pankreatu. Gastroenterologie a hepatologie [online]. 2013, 67(2), 154- 161 [cit. 2014-0710]. DOI: ISSN 1804-803X. Dostupné z: http://www.csgh.info/dwnld/gh_2013_2_154_161.pdf Islets of Langerhans. In Encyclopædia Britannica. [online]. [cit. 2014-07-10] Dostupné z: http://www.britannica.com/EBchecked/media/101913/The-islets-of-Langerhans-areresponsible-for-the-endocrine-function The components of the pancreas. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 10. [online]. June 2013 [cit. 2014-07-10]. Dostupné z: http://www.nature.com/nrgastro/journal/v10/n6/fig_tab/nrgastro.2013.36_F1.html Slinivka břišní: Langerhansův ostrůvek a exokrinní aciny- detail. CBO - ODDĚLENÍ HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE 3. LÉKAŘSKÉ FAKULTY V PRAZE. Histopatologický atlas [online]. 2007 [cit. 2014-07-10] Dostupné z: http://old.lf3.cuni.cz/histologie/Atlas0/fotka.php?fotka=286
- 51 -
