Masarykova univerzita Lékařská fakulta
EPIDEMIOLOGIE KANDIDÉMIÍ VE FN BRNO, LABORATORNÍ IDENTIFIKACE KVASINEK
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí bakalářské práce:
Autor:
Mgr. Iva KOCMANOVÁ
Františka JURČOVÁ
Brno, duben 2015
Jméno a příjmení autora: Františka Jurčová Název bakalářské práce: Epidemiologie kandidémií ve FN Brno, laboratorní identifikace kvasinek
Pracoviště: Oddělení klinické mikrobiologie FN Brno Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Iva Kocmanová Rok obhajoby bakalářské práce: 2015
Souhrn: Kandidémie patří mezi závažné infekce krevního řečiště způsobované rodem Candida, u kterých je důležitá včasná laboratorní diagnostika a identifikace původce. Cílem této práce bylo osvojení technik používaných k identifikaci kvasinek a jejich porovnání, zhodnocení případů kandidémií ve FN Brno a porovnání se světovými daty. Práce je rozdělena na část teoretickou, která se zabývá vlastnostmi rodu Candida, onemocněním, která způsobuje a laboratorní diagnostikou kvasinek. Praktická část obsahuje provedenou laboratorní diagnostiku kvasinek a zpracovaná data z FN Brno.
Klíčová slova: kandidémie, kvasinky, Candida, identifikace, MALDI-TOF
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Ivy Kocmanové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne
……………………………. Františka Jurčová
Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí své bakalářské práce Mgr. Ivě Kocmanové za její odborné rady, cenné připomínky, ochotu a čas, který mi věnovala.
Obsah Seznam použitých zkratek ..........................................................................................................8 1 Úvod.........................................................................................................................................9 I TEORETICKÁ ČÁST ............................................................................................................10 2 Charakteristika kvasinek ........................................................................................................10 3 Rod Candida ..........................................................................................................................11 3.1 Taxonomické zařazení ....................................................................................................11 3.2 Morfologie ......................................................................................................................11 3.3 Epidemiologie .................................................................................................................11 3.4 Faktory virulence ............................................................................................................12 3.4.1 Adherence a tvorba biofilmu ...................................................................................12 3.4.2 Hydrolytické enzymy ...............................................................................................13 3.4.3 Přepínání fenotypu ...................................................................................................13 3.5 Charakteristika jednotlivých druhů .................................................................................13 3.5.1 Candida albicans ......................................................................................................13 3.5.2 Candida glabrata ......................................................................................................13 3.5.3 Candida parapsilosis ................................................................................................14 3.5.4 Candida tropicalis ....................................................................................................14 3.5.5 Candida krusei .........................................................................................................14 4 Onemocnění způsobená rodem Candida ...............................................................................15 4.1 Povrchové kandidózy ......................................................................................................15 4.2 Systémové kandidózy .....................................................................................................15 4.2.1 Kandidémie ..............................................................................................................16 4.3 Imunita ............................................................................................................................17 4.4 Léčba ...............................................................................................................................18 5 Diagnostika kvasinek .............................................................................................................19 5.1 Odběr a zpracování materiálu .........................................................................................19 5.1.1 Materiál u povrchových infekcí ...............................................................................19
5.1.2 Materiál slizničních infekcí a systémových mykóz .................................................19 5.2 Mikroskopie ....................................................................................................................20 5.3 Kultivace .........................................................................................................................21 5.4 Identifikace kvasinek ......................................................................................................21 5.4.1 Kultivace na chromagaru .........................................................................................21 5.4.2 Aglutinace ................................................................................................................22 5.4.3 Kultivace na mediích chudých na živiny .................................................................22 5.4.4 Auxanogramy...........................................................................................................23 5.4.5 MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie .................................................................24 5.4.6 Molekulární metody .................................................................................................25 5.5 Stanovení citlivosti k antimykotikům .............................................................................27 5.6 Sérologické metody ........................................................................................................28 II PRAKTICKÁ ČÁST .............................................................................................................29 6 Cíle a hypotézy práce .............................................................................................................29 7 Laboratorní diagnostika kvasinek ..........................................................................................30 7.1 Materiál a metody ...........................................................................................................30 7.1.1 Mikroorganismy.......................................................................................................30 7.1.2 Pomůcky a přístroje .................................................................................................30 7.1.3 Kultivační půdy........................................................................................................30 7.1.4 Naočkování kmenů ..................................................................................................31 7.1.5 Kultivace při 37°C ...................................................................................................31 7.1.6 Kultivace na Chromagaru Candi..............................................................................31 7.1.7 Kultivace na rýžovém agaru ....................................................................................32 7.1.8 Auxanogram.............................................................................................................32 7.1.9 API test ....................................................................................................................32 7.1.10 Aglutinace ..............................................................................................................33 7.1.11 Gramovo barvení vybraných kmenů......................................................................33 7.1.12 MALDI TOF ..........................................................................................................33
7.2 Výsledky .........................................................................................................................34 7.3 Diskuze ...........................................................................................................................41 8 Epidemiologie kandidémií ve Fakultní nemocnici Brno .......................................................43 8.1 Kritéria výběru dat ..........................................................................................................43 8.2 Počet případů ..................................................................................................................43 8.3 Zhodnocení rodů a druhů ................................................................................................44 8.4 Zhodnocení podle pohlaví ..............................................................................................48 8.5 Věk pacienta ...................................................................................................................50 8.6 Oddělení ..........................................................................................................................53 8.7 Zhodnocení podle diagnóz ..............................................................................................57 8.8 Případy s více druhy z jednoho vzorku...........................................................................62 8.9 Opakovaně pozitivní hemokultury..................................................................................63 8.10 Diskuze .........................................................................................................................64 Závěr .........................................................................................................................................66 Použitá literatura .......................................................................................................................67
Seznam použitých zkratek ARO
Anesteziologicko-resuscitační oddělení
BG
1,3-β-D-glukan
C.
Candida
C. inconsp.
Candida inconspicua
CNS
centrální nervová soustava
Cr.
Cryptococcus
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
EORTC/MSG
European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group
G
glukóza
GI
gastrointestinální
Chl.
chlamydokonidie
CHR
chromagar
L
laktóza
M
maltóza
MIC
minimální inhibiční koncentrace
My.
mycelium
např.
například
PA
peptonový agar
PATH
Prospective Antifungal Therapy
S
sacharóza
SABA
Sabouraudův agar s antibiotiky
SAP
sekretované asparagové proteinázy
T
trehalóza
TFA
trifluoroctová kyselina
Tr.
Trichosporon
1 Úvod Kvasinky rodu Candida patří mezi významné původce mykotických onemocnění. Přirozeně se vyskytují u zdravých lidí jako komenzálové v gastrointestinálním traktu, pochvě, v dutině ústní a na kůži, při oslabení imunitního systému však způsobují povrchové i systémové mykózy. Velice závažnou formou systémové mykózy je kandidémie, při které kvasinky pronikají do krevního řečiště, mohou způsobovat septický stav a následné úmrtí pacienta. V těchto případech je důležitá včasná diagnostika a vhodná léčba antimykotiky. Pro diagnostiku je důležitá jak preanalytická, tak analytická část. Cílem je spolehlivě identifikovat původce a určit jeho citlivost k antimykotikům v co nejkratším čase a současně efektivně využít finanční prostředky. U systémových kandidóz, obzvláště kandidémií, je kladen důraz na zkracování času potřebného k identifikaci kvasinek. Nejčastěji izolovanou kvasinkou je C. albicans, ovšem narůstá výskyt i non-albicans druhů. Celkový počet případů přímo souvisí s narůstajícím počtem imunokompromitovaných pacientů (např. pacienti po transplantacích, léčení imunosupresivy, HIV pozitivní,…) a s narůstajícím počtem invazivních operačních postupů, ale také s profylaktickým podáváním antimykotik u některých skupin pacientů (akutní leukemie, transplantace krvetvorné tkáně apod.)
9
I TEORETICKÁ ČÁST
2 Charakteristika kvasinek Kvasinky jsou skupina hub, které jsou většinou jednobuněčné a množí se nepohlavně pučením. Jsou to kulaté či oválné buňky, velké přibližně 3-15 µm, některé rody mohou tvořit i pseudohyfy (vláknité útvary), což jsou podlouhlé buňky, které zůstaly po pučení spojené a neoddělily se. Souboru těchto buněk se říká pseudomycelium. Některé druhy kvasinek mohou vytvářet i tzv. pravé mycelium (vlákno vzniklé příčným dělením protáhlých buněk). (Votava 2010) Kvasinky mohou kvasit cukry za vzniku ethanolu a oxidu uhličitého. Většinou žijí saprofyticky,
ale
mohou
být
původci
imunokompromitovaných pacientů. (Votava 2010)
10
onemocnění
člověka,
především
u
3 Rod Candida 3.1 Taxonomické zařazení Říše: Fungi Kmen: Ascomycota Podkmen: Ascomycotina Třída: Ascomycetes Řád: Saccharomycetales Čeleď: Saccharomycetaceae Rod: Candida (DoctorFungus 2007)
3.2 Morfologie Kandidy patří mezi dimorfní houby, tvoří kvasinkovitou formy (blastospory) i vláknitou formu (hyfy/pseudohyfy). Kvasinkovitá forma bývá většinou saprofytická, vláknitá patogenní. (Jedličková 2006) Velikost kvasinkové formy se pohybuje kolem 3-5 µm, mají kulatý či oválný tvar a množí se pučením. Protáhlé blastospory, které tvoří větvené řetízky, nazýváme pseudohyfy. Kandidy mohou vytvářet také pravé hyfy skládající se z více buněk, které dohromady utvářejí septa. (Bednář 1996) V klinickém materiálu nejvíce zastoupený druh, Candida albicans, může také tvořit rezistentní buňky (chlamydokonidie) – jedná se o větší, kulaté útvary se silnou stěnou, bývají umístěny na koncích hyf a po jejich stranách. Dále se vyznačuje schopností germinace neboli tvorbou zárodečných klíčků (germ tubes), které mají vzhled jemných vláken vyrůstající z blastokonidií. (Bednář 1996)
3.3 Epidemiologie U zdravých lidí kandidy obvykle mohou kolonizovat celý gastrointestinální (GI) trakt od dutiny ústní až po konečník, jako komenzálové se mohou vyskytovat také ve vagině, močové trubici, na kůži nebo pod nehty. (Murray 2013) Kolonizace na těchto místech se může stát zdrojem infekce, pokud dojde k přemnožení kvasinek a jejich invazi. Příčinou může být
11
oslabení imunitního systému či narušení normální mikroflóry. Většinou jsou tedy kandidózy endogenního původu. (Votava 2010) Exogenně se může kandidóza přenášet mezi lidmi navzájem (nosokomiální kandidózy, vyvolané vysoce virulentními kmeny), kontaminovanými předměty (např. venózní katetry), infuzními roztoky apod. (Bednář 1996) Onemocnění způsobené rodem Candida může být primární (u zdravých lidí, infikováni vysoce virulentními kmeny) nebo sekundární (pacienti s oslabenou imunitou a hospitalizovaní se závažným základním onemocněním). (Bednář 1996; Sardi et al. 2013) Mezi faktory, které přispívají k rostoucímu počtu případů mykotických onemocnění, patří intravenózní katetry, parenterální výživa, invazivní operace, nadměrné užívání širokospektrálních antibiotik, cytotoxická chemoterapie a transplantace. (Sardi et al. 2013) Kandidy mohou způsobovat řadu onemocnění od povrchové kandidózy po život ohrožující systémové kandidózy. Povrchové kandidózy postihují kůži, nehty, sliznici v dutině ústní a v pochvě. Systémová kandidóza může být lokalizovaná nebo diseminovaná a spojená se sepsí. (Greenwood et al. 1999) Nejčastějším původcem kandidózy je C. albicans, patogenní pro člověka jsou i C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. dubliniensis, C. rugosa a další. (Murray 2013)
3.4 Faktory virulence Virulence se liší u různých druhů rodu Candida. Mezi faktory virulence patří schopnost adherence, tvorba biofilmu, produkce hydrolytických enzymů, germinace a tvorba hyf. 3.4.1 Adherence a tvorba biofilmu Základním faktorem virulence je schopnost adherence na povrch hostitelských buněk, díky které jsou kvasinky schopny buňky kolonizovat. Mohou adherovat na epiteliální buňky, endoteliální buňky, fibrin nebo umělé materiály (kanyly, protézy). (Bednář 1996) Kandidy mohou také vytvářet biofilm (specifické organizované komunity buněk řízené signálními molekulami, nejedná se o náhodné nahromadění buněk po buněčném dělení). Biofilm zvyšuje rezistenci vůči antimykotikům. (Sardi et al. 2013) Tuto schopnost mají kromě C. albicans i C. parapsilosis, C. tropicalis a C. glabrata. (Silva et al. 2009) Adheziny se specificky vážou na aminokyseliny a cukry na povrchu buněk nebo pomáhají adherenci na nebiologické povrchy. (Verstrepen a Klis 2006) 12
„Adhezinem C. albicans je mananprotein, který na povrchu buněk tvoří fibrilární vrstvu. Chrání také buňky před fagocytózou a tím dále zvyšuje jejich virulenci. Kmeny bez této struktury jsou nevirulentní.“ (Bednář 1996) 3.4.2 Hydrolytické enzymy Extracelulární hydrolytické enzymy hrají významnou roli v adherenci, průniku do tkáně, invazi a destrukci hostitelské tkáně. Nejvýznamnější hydrolytické enzymy produkované kvasinkami jsou proteázy a fosfolipázy.(Sardi et al. 2013) SAP (sekretované asparagové proteinázy) mají vliv na adherenci, zničení tkání a změnu v imunitní odpovědi. C. albicans má 10 izoenzymů, dále byly popsány u C. tropicalis, C. parapsilosis a C. guilliermondii. SAP jsou kódovány SAP1-10 geny. (Sardi et al. 2013) U fosfolipáz bylo objeveno 7 kódujících genů, ale pravděpodobně pouze PLB1 má roli ve virulenci u živočichů. (Sardi et al. 2013) 3.4.3 Přepínání fenotypu Přepínání fenotypu („phenotypic switching“) přispívá ke schopnosti přizpůsobit se aktuálním podmínkám, pomáhá také snadnějšímu průniku do tkání a invazi, vláknité formy totiž pronikají lépe do tkání než kvasinkovité formy. Tuto schopnost má především C. albicans a C. dubliniensis. (Bednář 1996; Sardi et al. 2013)
3.5 Charakteristika jednotlivých druhů 3.5.1 Candida albicans Candida albicans je nejčastěji izolovaná kvasinka z klinického materiálu. Žije jako saprofyt, ale může být i oportunním patogenem, způsobuje infekce kůže, dutiny ústní (moučnivka, soor), vaginální kandidózy, u oslabených jedinců způsobuje invazivní infekce s vysokou mortalitou. (Votava 2010) Morfologická charakteristika v kapitole 3.2. 3.5.2 Candida glabrata Candida glabrata je druhá nejčastěji izolovaná kvasinka rodu Candida, není schopna tvořit pseudohyfy, zárodečné klíčky a pravé hyfy, ale může vytvářet biofilm, její buňky jsou navíc výrazně menší (1-4µm), než u ostatních kvasinek. Relativně snadno si vytvoří rezistenci 13
vůči flukonazolu a dalším azolům. (Murray 2013; Sardi et al. 2013; Silva et al. 2012) Na rozdíl od C. albicans, pro kterou má z hlediska virulence klíčovou roli tvorba hyf a sekrece proteináz, u C. glabrata nemají žádný význam. (Kaur et al. 2005) C. glabrata se vyskytuje spíše při močových infekcích, systémovou mykózu způsobuje méně často, nicméně její četnost při invazivních infekcích záleží také na skladbě pacientů a existuje vztah mezi incidencí sepsí způsobených C. glabrata a dlouhodobě používanou profylaxí flukonazolem. (Greenwood et al. 1999; Pfaller a Diekema 2010)
Častěji se
vyskytuje u dospělých než u dětí a novorozenců. (Silva et al. 2012) 3.5.3 Candida parapsilosis Candida parapsilosis dorůstá velikosti 2,5-4µm, nevytváří hyfy, pouze pseudohyfy, může vytvářet biofilm.(Silva et al. 2012) Je méně virulentní než C. albicans a C. tropicalis, ale je významným nozokomiálním patogenem, ačkoliv byla dříve spojována spíše s endokarditidou u drogově závislých pacientů. (Weems 1992) C. parapsilosis má vysokou afinitu k parenterální výživě, často kolonizuje ruce zdravotnických pracovníků a vytváří biofilm na povrchu protéz a venozních katetrech, často ohrožuje nedonošené novorozence. (Trofa et al. 2008) 3.5.4 Candida tropicalis Candida tropicalis patří mezi tři nejčastěji izolované non-albicans druhy z hemokultur a moči, je velká 4-8µm, vytváří hyfy a pseudohyfy, netvoří zárodečné klíčky. Nejčastěji je spojována s pacienty s neutropenií a malignitami, často se vyskytuje u pacientů s dlouhodobou katetrizací a léčených dlouhodobě antibiotiky. (Silva et al. 2012) 3.5.5 Candida krusei Buňky C. krusei jsou na rozdíl od ostatních kandid protáhlého oválného tvaru připomínající dlouhozrnnou rýži. (Samaranayake a Samaranayake 1994) C. krusei je přirozeně rezistentní vůči flukonazolu, proto se často vyskytuje u pacientů flukonazolem profylakticky léčených, dále často u neutropenických pacientů, pacientů po transplantaci kmenových buněk a u hematoonkologických pacientů. (Pfaller et al. 2014)
14
4 Onemocnění způsobená rodem Candida 4.1 Povrchové kandidózy Kandidové infekce dutiny ústní se vyskytují především u pacientů s poruchou systémové či lokální imunity, konkrétně u HIV pozitivních pacientů, novorozenců, podvyživených pacientů, diabetiků nebo dlouhodobě léčených antibiotiky. Této infekci se také říká moučnivka (soor), na sliznici úst a jazyka se tvoří bílé povlaky, takže vypadají jako posypané moukou. Infekce se může rozšířit i na jícen, obzvláště u imunokompromitovaných pacientů. (Anaissie et al. 2009; Votava 2010) Kandidóza střeva bývá nejčastější v tenkém střevě, může vést k hematogenní infekci a přechodu do systémové mykózy, obstrukci střeva a může dojít i k perforaci. (Anaissie et al. 2009) Kandidová infekce kůže je poměrně častá u novorozenců, může se jednat i o vrozenou kandidózu. Nebezpečím kožních lézí je riziko vzniku diseminované formy, mohou však být také projevem a diagnostickou hodnotou kandidemie u neutropenických pacientů. (Anaissie et al. 2009; Zazula et al. 2005) Kandidová infekce nehtů postihuje nehtovou ploténku rukou i nohou, dochází ke ztluštění nehtového lůžka, změně barvy na žlutohnědou, zduření nehtových valů. (Korandová 2014) Vulvovaginální kandidóza je častým onemocněním žen, projevuje se především svěděním a výtokem z pochvy, ten může být bílý až tvarohovité konzistence nebo vodnatý, vagina je bolestivá, podrážděná. Pacienti mohou být i asymptomatičtí (jedná se o kolonizaci). (Sobel et al. 1998; Sobel 2007)
4.2 Systémové kandidózy Pro systémové kandidózy je charakteristická invazivní infekce s postižením orgánů, jsou zde zařazeny orgánová a diseminovaná kandidóza. (Zazula et al. 2005) Orgánová kandidóza často zasahuje močový trakt, plíce, srdce, centrální nervovou soustavu (CNS), oko, kosti a klouby, játra a slezinu. (Zazula et al. 2005; Anaissie et al. 2009) Kandidóza plic je většinou sekundární (vzniká hematogenní cestou), primárně vzniká přímým vdechnutím, ale spíše výjimečně. Při izolaci rodu Candida z moči se může jednat o kontaminaci (např. u žen s vulvovaginální kandidózou), kolonizaci (často u pacientů s obvyklými systémovými rizikovými faktory – diabetes, imunokompromitovaní, atd.; nebo 15
s lokálními rizikovými faktory – např. zavedení katetru) nebo o infekci močového měchýře či ledvin. Sekundární kandidóza ledvin může být projevem sepse způsobené kandidémií. U infekcí srdce může Candida způsobovat endokarditidu, myokarditidu i perikarditidu. Infekce CNS jsou poměrně vzácné, vznikají sekundárně u pacientů s kandidémií, častěji u novorozenců než u dospělých. Oční infekce může být spojena s úrazem oka nebo je sekundární u kandidémie, stejně tak je většina infekcí kostí a kloubů sekundární u kandidémie. (Anaissie et al. 2009) 4.2.1 Kandidémie Při kandidémii jsou kvasinky přítomné v krvi, nemusí vždy docházet k postižení orgánů, ale je časté. Může probíhat jako akutní či chronická forma. Akutní forma probíhá podobně jako sepse. U dětí dochází ke vzniku meningitidy častěji než u dospělých, může dojít také k postižení dalších orgánů (viz výše). (Anaissie et al. 2009) Klinické projevy jsou nespecifické, významným příznakem je přetrvávající horečka, případně septický stav nereagující na léčbu širokospektrálními antibiotiky. Může dojít k diseminaci do jakéhokoliv orgánu, nejčastěji dochází k postižení jater, sleziny a ledvin. (Ráčil et al. 2007) Chronická forma je méně častá, většinou se vyskytuje u pacientů s akutní leukémií léčených cytotoxickou chemoterapií. Klinicky se projevuje přetrvávající horečkou nereagující na antibiotika, často negativní hemokulturou, bolestmi břicha (zejména v pravém horním kvadrantu), nevolností, zvracením, zvýšenými jaterními testy a přítomností abscesů v játrech, případně slezině, plicích a ledvinách. (Anaissie et al. 2009) EORTC/MSG (European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group) stanovila podmínky potvrzení invazivní kvasinkové infekce. (De Pauw et al. 2008) O potvrzenou kandidémii se jedná, pokud je splněna jedna podmínka: a) histopatologicky, cytopatologicky nebo přímou mikroskopií vzorku získaného biopsií z normálně sterilního místa (jiné než sliznice) prokáže buňky kvasinek (obzvláště pseudohyfy nebo pravé hyfy u Candid) b) je kultivačně prokázána Candida spp. ze vzorku sterilně odebraného (včetně drénu zavedeného ˂ 24 hodin) z normálně sterilního místa s klinickými nebo radiologickými známkami odpovídající infekčnímu procesu c) Pozitivní hemokultura na kvasinky (Candida species)
16
O pravděpodobnou kandidémii se jedná, pokud jsou splněny současně hostitelské podmínky, klinická kritéria i mykologická kritéria. Pokud jsou splněny pouze hostitelské faktory a klinická kritéria, je kandidémie možná. 1. Hostitelské faktory (např. nedávná neutropenie, příjemce transplantace kmenových buněk, dlouhodobá léčba kortikosteroidy, léčba imunosupresivy potlačující Tlymfocyty nebo zděděné těžké imunodeficience) 2. Klinická kritéria (např. kvasinkové onemocnění dolních cest dýchacích, sinonasální infekce, infekce CNS, diseminovaná kandidóza – nejméně 1 z následujících nálezů po epizodě kandidémie v předchozích 2 týdnech – malé terčovité abscesy v játrech nebo slezině nebo progresivní retinální exsudáty na očním pozadí) 3. Mykologická kritéria (např. β-D-glukan detekovaný v séru) Kategorie jisté infekce může být použita pro jakéhokoliv pacienta (tj. bez ohledu na imunokompetenci), zatímco kategorie pravděpodobné a možné infekce jsou navrženy pouze pro imunokompromitované pacienty. Některé skupiny pacientů jsou ke vzniku kandidémie náchylnější než jiní. Mezi rizikové faktory patří: kolonizace, parenterální výživa, neutropenie, dlouhodobá léčba imunosupresivy, intravaskulární katetry, popáleniny, nedonošení novorozenci, břišní operace, transplantace kmenových buněk nebo orgánu, parenterální užívání drog, chronická granulomatózní choroba, nedostatek myeloperoxidázy u neutrofilů, dlouhodobá léčba antibiotiky, nedávná operace mozku, AIDS, selhání ledvin nebo hemodialýza, diabetes mellitus. (Anaissie et al. 2009)
4.3 Imunita V obraně organismu proti kvasinkám se uplatňuje jak imunita vrozená, tak získaná. První linií obrany je mechanická bariéra zabraňující průniku kvasinek do organismu, tu tvoří kůže a slizniční membrány, dále se na ní podílí přirozená bakteriální mikroflóra a řasinkový epitel dýchacích cest. Důležitost těchto mechanismů se projeví především při jejich narušení úrazem, popáleninami, zavedením katetru, narušením přirozené mikroflóry podáváním širokospektrálních antibiotik. (Anaissie et al. 2009) Dalším důležitým mechanismem, který se uplatňuje po proniknutí kvasinek do organismu, je fagocytóza, při které dojde k pohlcení buňky kvasinky a nitrobuněčnému zničení uvnitř fagocytující buňky. S nimi úzce spolupracují i T-lymfocyty. (Votava 2010) 17
4.4 Léčba Léčba kvasinkových infekcí se provádí léčivy působícími na kvasinky a plísně, antimykotiky. Lze je rozdělit do několika skupin na azoly, polyeny, echinokandiny a ostatní. Azoly působí na tvorbu ergosterolu – nezbytnou součást buněčné stěny hub, čímž dojde oslabení buněčné membrány. Mezi azoly řadíme dvě skupiny látek – imidazoly a triazoly. Imidazoly se používají většinou k lokální léčbě, řadíme k nim např. ketokonazol, klotrimazol a mikonazol. Triazoly se používají k léčbě povrchových i systémových onemocnění. Flukonazol patří mezi hojně používané antimykotikum, které však nelze použít u původců C. glabrata a C. krusei. Používá se především u pacientů bez neutropenie, lze ho použít i k léčbě kandidémie. Profylaktické podávání flukonazolu má významný vliv na snížení výskytu invazivních mykotických onemocnění u některých skupin pacientů. Do první generace triazolů patří kromě flukonazolu také itrakonazol. Do druhé generace řadíme vorikonazol a posakonazol. U vorikonazolu byla prokázána účinnost při léčbě kandidémie. (Diatková et al. 2012) Polyeny působí také na buněčnou membránu kvasinek, vážou se na ergosterol v membráně a poškozují její integritu. Amfotericin B deoxycholát byl hojně používaným antimykotikem vhodným i pro léčbu kandidémií, avšak použití je limitováno kvůli vysoké toxicitě – především nefrotoxicitě a ztrátě iontů (kalium a magnézium). Méně toxické jsou lipidové přípravky amfotericinu B: lipozomální amfotericin B, amfotericin B lipidový komplex a amfotericin B koloidní disperze. (Diatková et al. 2012) Echinokandiny působí přímo na tvorbu buněčné stěny s následkem lýzy buňky. Mezi echinokandiny patří kaspofungin, mikafungin a anidulafungin. Všechny jsou v intravenózní podobě, mají dobrý průnik do tkání kromě mozkomíšního moku. Jsou doporučovány, pokud se jedná o infekci C. glabrata nebo C. krusei. (Diatková et al. 2012) Mezi ostatní antimykotika patří flucytosin, který se však používá k léčbě kryptokokových infekcí, nikoliv kandidóz. (Ráčil et al. 2008)
18
5 Diagnostika kvasinek Diagnostika kvasinek je postavena na stejných základech jako diagnostika bakterií: mikroskopické pozorování odebraného materiálu, následná kultivace a identifikace. Z hlediska léčby infekce je také důležité stanovení citlivosti k antimykotikům.
5.1 Odběr a zpracování materiálu Pro laboratorní diagnostiku kvasinek je důležitý správně provedený odběr a zpracování vyšetřovaného materiálu. Odebíraný materiál závisí na druhu infekce, při povrchových infekcích se nejčastěji odebírají šupiny kůže, vlasy a nehty, u slizničních infekcí jsou nejčastější stěry, u systémových krev, vzorky tkání, moč, likvor, tekutina z bronchoalveolární laváže, sputum, exsudáty, hnis, punktáty. Důležité je také zajistit odběr vzorku před podáním antimykotik. (Votava 2010) 5.1.1 Materiál u povrchových infekcí Kožní šupiny jsou odebírány skalpelem, pokud možno z okraje infikované oblasti, protože z těchto míst je nejvyšší pravděpodobnost záchytu a úspěšné kultivace. Před odběrem je místo dekontaminováno 70% alkoholem, odběr se provádí do sterilní zkumavky. Vlasy a chlupy se odebírají sterilní pinzetou, nejlépe přímo z ložiska. Je důležité, aby vzorek obsahoval i vlasovou cibulku. U nehtů se seškrabují šupinky napadených nehtů ze spodní strany nehtu. Stěry sterilním tamponem se používají u mokvavých lézí. Vzorky se transportují do laboratoře ve zkumavkách neupravované, zalévání bujonem se nedoporučuje.
(Votava
2010) 5.1.2 Materiál slizničních infekcí a systémových mykóz Stěry se používají u slizničních mykóz a ran, u popállenin lze použít i otiskovou metodu (přiložení sterilního navlhčeného filtračního papíru nejpve na popálenou plochu a posléze na kultivační půdu - Sabouraudův agar). Vzorky tkání při systémových nebo invazivních mykózách je třeba co nejdříve zpracovat, odběr musí probíhat asepticky. (Votava 2010) Krev je odebírána do sterilních lahviček s bujónem, které jsou součástí automatizovaných systémů (BactAlert, Bactec).
19
5.2 Mikroskopie Přímá mikroskopie může pomoci rychle rozhodnout, zda se jedná o kvasinky, pokud jsou pozorovány typické útvary (chlamydokonidie, arthrokonidie), můžeme orientačně zařadit i do rodu C. albicans nebo Trichosporon. Pozorovat můžeme preparát nativní nebo barvený. Jako základ se používá Gramovo barvení prováděné i v mikrobiologických vyšetřeních. (Anaissie et al. 2009) Nativní preparát se připraví tak, že se na podložní sklo kápne kapka biologického vzorku, pevný vzorek se rozmělní a homogenizuje v kapce fyziologického roztoku na podložním skle. Preparát se překryje krycím sklíčkem a pozoruje v mikroskopu. (Juránková 2011) Gramovo barvení se používá k barvení buněčné stěny, v bakteriologii se používá k rozlišení grampozitivních (modré) a gramnegativních (červené) bakterií. Kvasinky na sebe vážou Gramovo barvivo, barví se modře až modrofialově. (Juránková 2011) Preparát se připravuje podobně jako nativní, nepřekrývá se však krycím sklem, ale nechá se zaschnout. Po zaschnutí je sklíčko fixováno plamenem (3x protažení). Postup Gramova bavení po zafixování zaschlého nátěru na podložním skle: Gram I
20 sekund
Oplach vodou Lugolův roztok
20 sekund
Oplach vodou Odbarvení alkoholem
10 sekund
Oplach vodou Safranin
60 sekund
Oplach vodou a osušení Preparát pozorujeme s použitím imerzního oleje a objektivu (10x100). Louhový preparát se běžně používá při pozorování kožních šupin, nehtů nebo vlasů, k lepšímu pozorování mykotických elementů se využívá KOH k projasnění tkáně. Materiál se vloží do kapky 10-40% KOH na podložním skle a překryje se krycím sklíčkem, po 30-60 minutách se přebytečný KOH odsaje a jemně se zatlačí na krycí sklíčko (kvůli roztlačení materiálu do tenčí vrstvy). (Votava 2010) Výhodné je také využití barviv, která se vážou na chitin v buněčných stěnách hub a kvasinek, např. MykoInk, chlorazolová čerň, nebo fluorescenční barviva Calcofluor, Rylux BSU nebo Blancophor. Nespecifické barvivo, které lze také k obarvení použít je Lugolův roztok. Postup při fluorescenční mikroskopii: připraví se roztok smícháním 0,1% roztoku fluorescenčního barviva a 20% roztoku KOH v poměru 1:1, do něho se vloží vzorek. Po 20
15 minutách se preparát prohlíží přes krycí sklo ve fluorescenčním mikroskopu. (Votava 2010; Juránková 2011)
5.3 Kultivace Kultivace je důležitá pro určení rodu a druhu kvasinek, základní kultivační půdou je Sabouraudův agar, který bývá obohacený o antibiotika k potlačení růstu bakterií a o cukr (glukóza, dextróza, maltóza). Přesné složení podle výrobce Conda na 1l média: 40g dextrózy, 10g peptonové směsi, 15g agaru a 0,5g chloamfenikolu. (Laboratorios Conda, S.A.) Protože kvasinky rostou pomaleji než bakterie, kultivuje se alespoň 4-5 dní v termostatu při 28-30°C. Hemokultury jsou kultivovány ve speciálních automatizovaných kultivačních systémech. Kultivují se při 35°C přímo v odběrových lahvičkách (speciální mykologické nebo aerobní lahvičky). Přístroj pravidelně lahvičky kontroluje, jsou protřepávány, pozitivita vzorků je určována na základě detekce vznikajícího oxidu uhličitého v lahvičce. (Horvath et al. 2004) Pokud je hemokultura pozitivní, určuje se původce. Nejprve se mikroskopicky zhodnotí nátěr na sklíčko, následně lze využít dražší metody pro přímou identifikaci z hemokultury nebo se očkuje na Sabouraudův agar a kultivuje.
5.4 Identifikace kvasinek Kvasinky jsou saprofyté člověka, přesná identifikace kvasinek je důležitá zejména v případech, kdy se jedná o závažnou infekci, čili pozitivní kultivační výsledek je z jinak sterilního materiálu (krev, likvor, bioptický materiál apod.). Na základě identifikace a stanovení citlivosti k antimykotikům se poté rozhoduje o léčbě. Po kultivaci na Sabouraudově agaru se hodnotí barva, velikost a povrch kolonií, pro většinu kvasinek je typický hladký povrch kolonií, zatímco vláknité houby mají povrch drsný – spíše vatovitý. (Votava 2010) 5.4.1 Kultivace na chromagaru Jedná se o selektivní a diferenciální půdu, která se používá k rychlé identifikaci a diferenciaci druhů Candida z klinických vzorků. (Sivakumar et al. 2009) Podle studie má dokonce lepší schopnost inhibovat růst bakterií než Sabouraudův agar. Díky chromagaru lze 21
poměrně spolehlivě odlišit C. albicans od ostatních kvasinek, i některé další kvasinky se specificky barví. (Silva et al. 2004) Principem rozdílného barevného růstu je reakce enzymů mikroorganismů s chromogenním substrátem. (Sivakumar et al. 2009) C. albicans roste na půdě v odstínech modré až zelené, C. krusei v typicky růžových koloniích. C. tropicalis roste typicky v modrých koloniích, ale může růst i v zelených, poté je špatně odlišitelná od C. albicans. (Sivakumar et al. 2009; Hospenthal et al. 2002) Chromagar vyrábí několik výrobců, jednotlivé půdy se liší zbarvením různých druhů kvasinek i cenou. 5.4.2 Aglutinace Aglutinace se využívá například k rozlišení C. albicans a C. dubliniensis, protože na chromagaru je nelze spolehlivě odlišit. Na latexových částicích jsou navázány monoklonální protilátky, které se specificky vážou na antigen na povrchu C. dubliniensis. Výsledkem reakce je okem pozorovatelná aglutinace. Na stejném principu je i aglutinace pro rychlé zařazení do druhu C. krusei. (ElitechGroup) Test bývá prováděn pomocí komerčně dodávaných setů, dle návodu výrobce. Zpravidla se jedná o tento postup: na destičku se nakape reagencie, do které se zamíchá kolonie vyšetřovaného kmene, pozoruje se přítomnost/nepřítomnost aglutinace.
Obrázek 1: Princip latexové aglutinace 5.4.3 Kultivace na mediích chudých na živiny Pro kultivaci se využívá rýžový agar, bramborový agar nebo kukuřičný agar. Jsou to media chudá na živiny, na kterých se sleduje schopnost kvasinek tvořit pseudomycelium, mycelium a chlamydospory. (Votava 2010; Juránková 2011) Produkci chlamydospor u C. albicans při kultivaci na kukuřičném agaru lze zvýšit přidáním Tween 80 do kultivačního media, u rýžového agaru Tween 80 produkci nezvyšuje. Dle studie je nejlepším mediem pro
22
pozorování tvorby chlamydospor rýžový agar a kukuřičný agar obohacený o Tween 80. (Rosenthal a Furnari 1959)
Obrázek 2: Tvorba chlamydospor C. albicans na rýžovém agaru (Mallátová a Mencl 2010) Mycelium i chlamydokonidie na půdách chudých na živiny tvoří C. albicans a C. dubliniensis. Pouze mycelium tvoří C. parapsilosis, C. krusei a Trichosporon asahii. C. tropicalis tvoří mycelium, chlamydokonidie mohou, ale nemusí být pozorovány. C. glabrata a Cryptococcus neoformans mycelium ani chlamydokonidie nevytváří. (Joshi 1975) 5.4.4 Auxanogramy Auxanogram patří mezi identifikační metody založené na biochemické aktivitě kvasinek, v případě auxanogramu se prokazuje schopnost kvasinky asimilovat různé zdroje uhlíku. (Votava 2010) V 5,5 ml fyziologického roztoku se suspendují kolonie kvasinek na zákal McFarland 2, na peptonový agar se část objemu nalije, rozlije po celé ploše a zbytek se odsaje Pasteurovou pipetou. Miska se nechá uschnout, poté se na misku položí disky s cukry (nejčastěji se jedná o glukózu, sacharózu, laktózu, maltózu a trehalózu). Misky se kultivují 24 hodin v termostatu při 30°C ± 1°C. Vizuálně se hodnotí růst v přítomnosti cukru (+) a bez růstu (-). V současné době se využívají komerční sety pro přesnější identifikaci, například ID32C od firmy bioMérieux běžně používaný v Evropě nebo API 20C používaný spíše ve Spojených státech amerických, oba dva sety mají srovnatelné výsledky. V obou případech jsou kolonie kvasinek suspendovány v roztoku na určitý zákal, poté jsou nakapány do stripu a kultivovány s kultivačním mediem obsahujícím konkrétní sacharid. Po uplynutí stanovené doby kultivace 23
se vizuálně hodnotí pozitivita nebo negativita jamek na základě zákalu jamky. Výsledky jsou převedeny na kód, který je následně vyhodnocen podle vzoru nebo pomocí přístroje. (Ramani et al. 1998) Tabulka 1: Očekávané výsledky auxanogramu vybraných druhů G S
L M
T
C. albicans
+
+
-
+
+/-
C. glabrata
+
-
-
-
+
C. krusei
+
-
-
-
-
C. tropicalis
+
+
-
+
+
C. kefyr
+
+
+
-
-
C. parapsilosis
+
+
-
+
+
S. cerevisiae
+
+/- -
+/- -
C. dubliniensis
+
+
-
+
+/-
Tr. asahii
+
+
+
+
+
Cr. neoformans +
-
+
+
+/-
Kromě auxanogramu existují také zymogramy, při kterých se zjišťuje schopnost kvasinek fermentovat cukry (např. glukózu, sacharózu, laktózu a maltózu). 5.4.5 MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization – time of flight) patří mezi velmi moderní metody určené pro rychlou a spolehlivou identifikaci kvasinek. (Lima-Neto et al. 2014)
MALDI-TOF
MS
(s
hmotnostním
spektrometrem)
využívá
k identifikaci
mikroorganismů druhově specifické šablony hmotnosti peptidů a proteinů, díky kterým lze identifikovat široké spektrum bakterií a kvasinek. (Murray 2013) Existuje několik způsobů přípravy vzorku pro analýzu od přímého nanášení vzorku a zakápnutí kyselinou mravenčí, přes extrakci pomocí ethanolu a kyseliny mravenčí, u sporulujících organismů se používá extrakce pomocí TFA (trifluoroctová kyselina). „Laser hmotového spektrometru MALDI-TOF ozáří nanosekundovým pulsem směs vzorku a matrice, přičemž matrice absorbuje energii pulsu a její rozklad ionizuje molekuly vzorku, především ve vysokých koncentracích přítomné ribosomální proteiny. Pozitivně nabité ionty jsou pak na krátkou vzdálenost urychleny silným elektrickým polem a vstupují do vakua v trubici detektoru, kde se pohybují rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji. Doby letu iontů se velmi přesně měří a výpočetně se konvertují na poměr molekulové hmotnosti a náboje.“ (Státní veterinární ústav Jihlava) 24
Výsledné spektrum je porovnáno s databází spekter a analyzovaný vzorek je identifikován. V případě neúspěchu nebo nejednoznačné identifikace lze analýzu zopakovat nebo přistoupit k molekulárním metodám. 5.4.6 Molekulární metody Molekulární metody se dají považovat za vrchol současné diagnostiky v mykologii, využívá se při nich DNA kvasinek. Tyto metody jsou velice přesné, ale také dražší než nemolekulární metody. U těchto metod je obzvláště důležité vyhnout se kontaminaci vzorku, proto se manipulace s nimi prování ve sterilních boxech. PNA FISH (Peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization) je rychlá metoda k identifikaci bakterií a kvasinek, lze ji využít i na přímou identifikaci z pozitivních hemokultur bez nutnosti kultivovat na SA a získat čisté kolonie. (Harris a Hata 2013) Metoda se provádí pomocí setů dodávaných výrobcem, na sklíčku se smíchá kapka fixačního roztoku a kapka pozitivní hemokultury, po uschnutí se sklíčko fixuje (plamenem nebo methanolem), přidá se PNA sonda a překryje se krycím sklíčkem. Hybridizuje se v termostatu, poté se sklíčko ponoří do předehřátého promývacího roztoku, odstraní se krycí sklíčko a inkubuje se. Po inkubaci se sklíčka nechají uschnout, přidá se kapka montážního media, překryje se krycím sklíčkem. Hodnotí se fluorescenčním mikroskopem při zvětšení objektivu 60x nebo 100x. (AdvanDx)
Obrázek 3: Výsledek PNA FISH, C. albicans (vlevo), C. glabrata (uprostřed) a C. tropicalis (vpravo) (AdvanDx) Real-time PCR lze použít přímo pro vzorky odebrané krve do zkumavky s citrátem nebo EDTA. Prvním krokem je izolace DNA, která se provádí pomocí dodávaných kitů, principem je lýza lidských krevních buněk dříve než se rozpadnou buňky se stanovovanou DNA. Vyizolovaná DNA se smíchá se směsí primerů, sond a Master Mixem, provede se amplifikace DNA v cykleru podle programu: počáteční denaturace při 95°C 10 minut, následuje 50 cyklů denaturace po 10s při 95°C, annealing 10s při 58°C a elongace 20s při 72°C, závěrem analýza 25
křivky tání. Záznam amplifikace se provádí pomocí fluorescence sond navázaných na nově vznikající DNA. (Susanne Gebert et al. 2008; Wellinghausen et al. 2009) DNA microarray je založeno na principu párování komplementárních bází nukleotidů DNA, nejprve se provede izolace DNA, následuje multiplex PCR (umožňuje současnou amplifikaci více řetězců DNA), označení molekul DNA fluorescenční značkou, aplikace na čip a hybridizace, omytí a skenování čipu. (Ferrari et al. 2013; Spiess et al. 2007)
Obrázek 4: Výsledky microarray DNA (Spiess et al. 2007) DNA sekvenováním lze navázat na metody PCR, pomocí sekvenování lze určit přesné pořadí nukleotidů v nareplikovaném úseku DNA. Tuto metodu lze využít k přesnému rozlišení některých druhů, např. k odlišení C. dubliniensis od C. albicans. (Kiraz et al. 2014)
26
5.5 Stanovení citlivosti k antimykotikům Stanovení citlivosti k antimykotikům je důležitý krok z hlediska zvolení vhodné léčby, u kvasinek se používají kvalitativní metody (diskový difuzní test) a kvantitativní metody (E-test, diluční test). Pomocí diskového difuzního testu lze kvalitativně určit, zda je testovaný kmen k antimykotiku citlivý či rezistentní. Na povrch Mueller-Hintonova agaru s přídavkem glukózy a metylenové modři se nalije 05,ml připraveného inokula (denzita 0,5 McFarland pro kandidy, 1McFarland pro Cr. neoformans), přebytek se odsaje pipetou. Otevřená miska se nechá zaschnout, poté jsou aplikovány disky napuštěné testovanými antimykotiky. Kultivuje se 24-48 hodin při 35-37°C, hodnotí se velikost zóny kolem disku až do 80% inhibice růstu kvasinek. (BioVendor) Diskový difuzní test je ovšem standardizován pouze pro flukonazol a vorikonazol a některé kvasinkové druhy. V ostatních případech jsou výsledky testu nestandardizované. Pomocí E-testu lze stanovit minimální inhibiční koncentraci (MIC) antimykotika. Na kultivační půdu RPMI se nalije suspenze kolonií kvasinek ve fyziologickém roztoku (denzita 0,5 McFarland pro kandidy, 1 McFarland pro Cr. neoformans), přebytek se odsaje Pasteurovou pipetou a nechá zaschnout. Proužek napuštěný gradientem antimykotika se pokládá od konce s nejnižší koncentrací, mezi proužkem a agarem nesmí vzniknout vzduchové bubliny. Kultivuje se při 35-37°C, 24-48 hodin pro kandidy, 48-72 hodin pro kryptokoky. MIC lze stanovit i za pomocí mikrodilučního testu (Sensititre YeastOne®, TREK Diagnostic Systems, UK) a to i pomocí přímého testování citlivosti z pozitivních hemokultur. (Avolio et al. 2009) Stanovení se provádí na deskách potažených antimykotiky v příslušném ředění, dle pokynů výrobce se do jamek na desce aplikují vzorky, kultivuje se nejméně 24 hodin při 35°C. Výsledky jsou vizuálně hodnoceny, u pozitivních jamek dochází ke změně zbarvení z modré na červenou. (MCS DIAGNOSTICS 2012) V obou případech se hodnotí nejnižší koncentrace, při které je růst inhibován. O citlivost či rezistenci k testovanému antimykotiku se rozhoduje podle stanovených break-pointů.
27
5.6 Sérologické metody Pokud je třeba rychlý průkaz mykózy, lze využít i sérologické metody, které detekují mykotické antigeny nebo protilátky tvořené proti nim. Reakce jsou založené na principu vazby antigen-protilátka, často uspořádání ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Velkou nevýhodou nepřímého průkazu (detekce tvořených protilátek) je riziko falešné pozitivity u zdravých jedinců, která vzniká přirozenou reakcí na kvasinky saprofytické a vyskytující se v prostředí, a falešné negativity u imunosuprimovaných pacientů, u kterých nemusí být dostatečná protilátková odpověď. (Votava 2010) Příkladem časného průkazu invazivní kvasinkové infekce může být detekce mannanového antigenu (povrchový antigen rodu Candida) v kombinaci s detekcí protilátek proti němu (antimannan). V lidském séru nebo plazmě je lze stanovit např. pomocí imunoenzymatické sendvičové reakce. Zředěné vzorky séra/plazmy se nanesou do jamek mikrotitrační destičky, na které je navázán antigen (pokud stanovujeme protilátky) nebo protilátka (pokud stanovujeme antigen). Po inkubaci při 37±1°C se destička promyje, přidá se konjugát (protilátky značené peroxidázou), po další inkubaci se znovu promyje. Pokud byl ve vzorku přítomný antigen/protilátka, dojde ke vzniku sendvičového komplexu, přidáním chromogenu (obsahuje substrát pro peroxidázu) se komplex vizualizuje a vzniklé zbarvení se měří na spektrofotometru. (Bio-Rad) Panfungální antigen 1,3-β-D-glukan (BG) je součástí vnější buněčné stěny saprofytických a patogenních hub, je uvolňován do krve pacientů s invazivní mykotickou infekcí. (Kędzierska et al. 2007) Detekce se může provádět kalorimetrickou metodou pomocí lyzátu z ostrorepa. BG aktivuje faktor G, který aktivuje koagulační enzym odštěpující pNA z chromogenního peptidového substrátu a vytváří chromofor absorbující pří 405 nm. (Obayashi et al. 1995; Associates of Cape Cod Inconporated 2007)
28
II PRAKTICKÁ ČÁST
6 Cíle a hypotézy práce Cíle praktické části bakalářské práce shrnuté v bodech: -
osvojení technik laboratorní diagnostiky kvasinek
-
porovnání výsledků získaných pomocí MALDI-TOF a postupem bez použití MALDITOF
-
zhodnocení získaných dat o hemokulturách kultivačně pozitivních na kvasinky a porovnání se světovými daty
MALDI-TOF je moderní metoda využívaná po celém světě, lze předpokládat, že identifikace kmenů s využitím této metody bude mít vyšší úspěšnost oproti postupu identifikace bez použití této metody. V České republice je úroveň zdravotnictví srovnatelná s ostatními vyspělými státy, proto lze očekávat, že získaná data o hemokulturách kultivačně pozitivních na kvasinky budou s nimi porovnatelná.
29
7 Laboratorní diagnostika kvasinek 7.1 Materiál a metody 7.1.1 Mikroorganismy K vypracování praktické části bakalářské práce bylo použito 15 kmenů kvasinek vyizolovaných od pacientů FN Brno z různých klinických materiálů. 7.1.2 Pomůcky a přístroje -
mikrobiologické kličky
-
kahan
-
zapalovač
-
sterilní špičky k automatické pipetě (Associates of Cape Cod)
-
stojan na zkumavky
-
nastavitelná automatická pipeta (Brand, LabSystem)
-
termostat 35-37°C (BT 120)
-
komorový termostat 29-31°C
-
skleněné zkumavky se sterilním fyziologickým roztokem
-
prázdné sterilní skleněné zkumavky
-
sterilní Pasteurovy pipety
-
diagnostický set API 32C (BioMérieux)
-
Biotyper (Bruker)
-
McFarlandova stupnice (BioMérieux)
-
bambusová párátka
-
mravenčí kyselina (Bruker)
-
matrice pro MALDI TOF (α-kyano-4-hydroxy-skořicová kyselina) (Bruker)
-
set ELITex Bicolor dubliniensis (ELITech Microbio)
7.1.3 Kultivační půdy -
Sabouraudův agar obohacený o antibiotika (zkratka SABA; Conda)
-
Rýžový agar (Conda)
-
Chromagar Candi (Trios)
-
Peptonový agar na auxanogramy (zkratka PA; Conda) 30
7.1.4 Naočkování kmenů Misky se Sabouraudovým agarem s antibiotiky (dále SABA) byly popsány označením kmenu a datem. Z Petriho misek s vybranými kmeny bylo provedeno rozočkování na SABA vytemperovaný na pokojovou teplotu: vyžíhanou kličkou bylo nabráno několik kolonií a hustě natřeno asi do 1/3 misky se SABA, vyměněnou vyžíhanou kličkou hádkem rozočkováno, znovu vyměněnou kličku rozočkováno, dalším hádkem vyplněn volný prostor Petriho misky (viz Obrázek 5).
Obrázek 5: Schéma očkování Misky byly kultivovány dnem vzhůru v komorovém termostatu při 30°C ± 1°C 48 hodin. Po uplynutí doby byla zhodnocena barva a vzhled kolonií. 7.1.5 Kultivace při 37°C Petriho misky se SABA byly rozděleny fixou na 6 částí, popsány datem a označením kmenů. Vykultivované kmeny byly naočkovány jednoduchým hádkem do příslušných částí. Misky byly kultivovány 48 hodin při 37°C ± 1°C. 7.1.6 Kultivace na Chromagaru Candi Petriho misky s Chromagarem Candi byly rozděleny fixou na 3 části, popsány datem a označením kmenů. Kmeny byly naočkovány nejdříve hustým nátěrem, který byl následně rozočkován hádkem vyžíhanou kličkou. Misky byly kultivovány 48 hodin při 30°C ± 1°C.
31
7.1.7 Kultivace na rýžovém agaru Petriho misky s rýžovým agarem byly rozděleny fixou na 4 části, popsány datem a označením kmenů. Kmeny byly naočkovány jednoduchým hádkem, misky byly kultivovány při 30°C ± 1°C 48 hodin. 7.1.8 Auxanogram Ve zkumavkách s fyziologickým roztokem byly suspendovány kolonie kvasinek na zákal McFarland 2. Na vytemperovaný peptonový agar bylo napipetováno Pasteurovou pipetou přibližně 2ml připravené suspenze, rozlito po celé ploše misky, přebytek byl odsán. Misky uschly dnem dolů, na suchou misku poté byly naneseny disky s glukózou (G), sacharózou (S), laktózou (L), maltózou (M) a trehalózou (T) dle schématu (viz Obrázek 6). Misky byly kultivovány při 30°C ± 1°C 48 hodin.
Obrázek 6: Rozmístění disků
7.1.9 API test Tři skleněné zkumavky s víčkem byly naplněny 2ml sterilní vody, do které byly suspendovány kolonie kvasinek třech vybraných kmenů na zákal McFarland 2. 250µl této suspenze bylo napipetováno do lahvičky s API C mediem dodávaným výrobcem soupravy. Po promíchání bylo napipetováno 135µl do každé jamky destičky diagnostické soupravy (celkem 32 jamek). Souprava byla kultivována 48 hodin při 30°C ± 1°C.
32
7.1.10 Aglutinace Pomocí setu ELITex Bicolor dubliniensis byla provedena aglutinace pro rozlišení C. albicans a C. dubliniensis. Do kruhu na diagnostické kartičce bylo napipetováno 20µl homogenizované reagencie TEST LATEX. Kličkou bylo nabráno několik kolonií kmene, který byl rozmíchán v kapce reagencie a rozetřen po celé ploše kruhu. 7.1.11 Gramovo barvení vybraných kmenů Pro Gramovo barvení bylo vybráno 5 kmenů. Na dvě podložní sklíčka bylo kápnuto 5 kapek fyziologického roztoku. Do každé kapky bylo kličkou rozmícháno několik kolonií daného kmene. Po zaschnutí a zafixování v plameni byly skla barveny krystalovou violetí po dobu 20 sekund, Lugolovým roztokem po dobu 20 sekund, alkoholem po dobu 10 sekund a safraninem po dobu 60 sekund. Mezi jednotlivými kroky byla sklíčka oplachována vodou. Osušená sklíčka byla pozorována v mikroskopu s použitím imerzního oleje. 7.1.12 MALDI TOF Pomocí bambusového párátka byly naneseny testované kmeny do pozic dle schématu. Každá pozice byla překryta 1 µl kyseliny mravenčí, po zaschnutí byl nanesen 1 µl matrice (kyselina skořicová). Vzorky byly změřeny na hmotnostním spektrometru Biotyper (Bruker).
Obrázek 7: Destička připravená pro analýzu
33
7.2 Výsledky Po kultivaci na SABA byla hodnocena barva a vzhled vyrostlých kolonií. Výsledky byly zaznamenány do tabulky (Tabulka 3). Na miskách kultivovaných při 37°C ± 1°C narostly kolonie u všech testovaných kmenů. Na chromagaru Candi narostly kmeny v barvách typických pro určité druhy. (viz Obrázek 8-10) Po
kultivaci
na
rýžovém
agaru
byla
mikroskopicky
vyhodnocena
tvorba
mycelií/pseudomycelií a chlamydokonidií. U auxanogramu se hodnotila schopnost kvasinek růst v přítomnosti daného cukru (asimilace). Výsledky byly zaznamenány do tabulky a podle vzoru bylo provedeno zařazení k určitému druhu. Aglutinace kmene KP 690 byla pozitivní, jedná se tedy o C. dubliniensis. Pozitivita/negativita jamek v API 32C byla odečtena okometricky, výsledky byly zaznamenány do tabulky (Tabulka 2) a vyhodnoceny pomocí počítačového programu mini API (BioMérieux).
Obrázek 8: Chromagar Candi, KP 746 (vlevo nahoře), KP 760 hladké (vpravo nahoře) a KP 760 drsné (dole)
34
Obrázek 9: Chromagar Candi, KP 752 (vlevo nahoře), KP 747 (vpravo nahoře), KP 763 velké (dole)
Obrázek 10: Chromagar Candi, KP 690 (vlevo nahoře), KP 704 (vpravo nahoře), KP 728 (dole)
35
Tabulka 2: Výsledky API 32C testu KP 763 malé GAL ACT
SAC NAG LAT
ARA CEL
RAF
MAL TRE
2KG
MDG MAN LAC INO
0
+
-
+
+
-
+
+
+
-
SOR +
+
-
XYL RIB
GLY
RHA PLE
ERY MEL GRT
+
+
-
-
-
+
-
-
-
-
+
-
-
MLZ GNT LVT
GLU
SBE
GLN ESC
+
+
+
+
+
+
+
Výsledek: Candida parapsilosis KP 746 GAL ACT
SAC NAG LAT
ARA CEL
RAF
MAL TRE
2KG
MDG MAN LAC INO
0
+
+
+
+
-
+
+
+
-
SOR +
+
+
XYL RIB
GLY
RHA PLE
ERY MEL GRT
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
MLZ GNT LVT
GLU
SBE
GLN ESC
-
+
-
+
+
-
+
36
Výsledek: Trichosporon asahii KP 704 GAL ACT
SAC NAG LAT
ARA CEL
RAF
MAL TRE
2KG
MDG MAN LAC INO
0
+
-
+
-
+
+
+
+
-
SOR +
+
-
XYL RIB
GLY
RHA PLE
ERY MEL GRT
+
-
+
-
+
Výsledek: Cryptococcus neoformans
+
-
-
+
+
+
-
+
MLZ GNT LVT
GLU
SBE
GLN ESC
+
+
-
-
+
-
+
Nátěry na sklíčko nabarvené dle Grama byly prohlédnuty pod mikroskopem (10 x 100, imerze). Z hlediska Gramova barvení lze kvasinky považovat za Gram-pozitivní. Buňky kmene KP 746 měly kulatý až vejčitý tvar, byly nalezeny arthrokonidie (obdélníčkové buňky), buňky kmene KP 760 drsné byly protáhlé až tyčinkovité, bylo pozorováno apikální pučení, tvar buněk kmene KP 752 byl vejčitý. Buňky kmene KP 690 a IN 907 byly různě velké a kulaté.
Obrázek 11: Tr. asahii (zvětšení 10x100)
Obrázek 12: C. krusei (zvětšení 10x100)
37
Obrázek 13: C. glabrata (zvětšení 10x100)
Obrázek 14: Cr. neoformans (zvětšení 10x100)
Obrázek 15: C. dubliniensis (zvětšení 10x100)
38
Odběr vzorku
Mikroskopie barvení dle Grama*
Kultivace na SABA
Postup s použitím MALDI-TOF
Postup bez použití MALDITOF
MALDI-TOF + chromagar
Chromagar
C. albicans
C. non-albicans
C. albicans
C. non-albicans
Auxanogram + Rýžový agar
Rýžový agar
Dourčeno
Nedourčeno
Dourčeno
API
Obrázek 16: Algoritmus laboratorního vyšetření kvasinek * U materiálů, které lze mikroskopovat
39
Nedourčeno
API
Tabulka 3: Celkové hodnocení bez MALDI Rýžový agar
Označení
Barva
Povrch Auxanogram
kmene
kolonií
kolonií G S L M T Mycelium Chlamydokonidie Hodnocení Zařazení
Chromagar Candi
API
Závěr
C. KP 690
Bílá
hladké
+
+ -
+
-
+
+
Tmavě
dubliniensis
modrá
/ C. albicans
C. dubliniensis
(aglutinace +) Cr.
Cr.
neoformans
neoformans
40
KP 704
Bílá
hladké
+
+ -
+
-
-
-
Růžová
neurčeno
KP 728
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
+
+
Modrá
C. albicans
KP 746
Bílá
drsné
+
+ +
+
+
+
-
Modrá
Tr. asahii
KP 747
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
+
+
Modrá
C. albicans
C. albicans
KP 752
Bílá
hladké
+
-
-
-
+
-
-
Růžová
C. glabrata
C. glabrata
KP 760 hladké
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
-
-
Modrá
neurčeno
neurčeno
KP 760 drsné
Bílá
drsné
+
-
-
-
-
+
-
Růžová
C. krusei
C. krusei
KP 763 velké
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
+
+
Modrá
C. albicans
C. albicans
KP 763 malé
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
-
-
Bílá
neurčeno
KP 765 velké
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
-
-
Bílá
neurčeno
neurčeno
KP 765 malé
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
+
-
Bílá
neurčeno
neurčeno
KP 831 žluté
Nažloutlá hladké
+
-
-
-
-
-
-
Bílá
neurčeno
neurčeno
KP 831 bílé
Bílá
hladké
+
+ -
+
+
-
-
Modrá
neurčeno
neurčeno
IN 907
Bílá
hladké
+
+ -
+
-
-
-
Bílá
neurčeno
neurčeno
C. albicans Tr. asahii
C. parapsilosis
Tr. asahii
C. parapsilosis
Tabulka 4: Výsledky MALDI-TOF a porovnání s metodami bez použití MALDI-TOF Označení kmene MALDI-TOF
Závěr
KP 690
C. dubliniensis
C. dubliniensis
KP 704
Cr. neoformans Cr. neoformans
KP 728
C. albicans
C. albicans
KP 746
Tr. asahii
Tr. asahii
KP 747
C. albicans
C. albicans
KP 752
C. glabrata
C. glabrata
KP 760 hladké
C. albicans
neurčeno
KP 760 drsné
C. krusei
C. krusei
KP 763 velké
C. albicans
C. albicans
KP 763 malé
C. parapsilosis
C. parapsilosis
KP 765 velké
C. albicans
neurčeno
KP 765 malé
C. parapsilosis
neurčeno
KP 831 žluté
C. inconspicua
neurčeno
KP 831 bílé
C. albicans
neurčeno
IN 907
Cr. neoformans neurčeno
7.3 Diskuze Byla provedena jak tradiční laboratorní diagnostika kvasinek pomocí auxanogramu, chromagaru a rýžového agaru, tak moderní pomocí MALDI-TOF. Bez použití MALDI-TOF nebylo možné zařadit některé kmeny do druhu, zatímco pomocí MALDI-TOF byly jednoznačně identifikovány. MALDI-TOF identifikovala 100% kmenů, zatímco auxanogram, rýžový agar a chromagar v kombinaci s API (u vybraných izolátů) zařadili pouze 9 z 15 kmenů (60%). Časová náročnost tradičních metod byla také významnější než u MALDI-TOF (v případě C. non-albicans trvá dourčení 48 hodin při použití MALDI-TOF oproti 96-144 hodinám při použití klasických metod). V případě, že byly kmeny určeny pomocí tradičního postupu, výsledky se shodovaly s výsledky metody MALDI-TOF. Metoda API také jednoznačně identifikovala, o jaký druh kvasinky se jedná, výsledky MALDI-TOF a API se 100% shodovaly. Správně by měly být dourčeny všechny druhy kvasinek pomocí API, ale z důvodu omezených financí a diagnostického materiálu bylo vyšetření API provedeno pouze u třech kmenů. I v klinické praxi nesmí být vyšetření prodražována, obzvláště pokud se jedná o pouhou kolonizaci kvasinkami. 41
I když biochemické testy ukazovaly na konkrétní druh, nebyly u některých vzorků pozorovány mycelia a chlamydokonidie, výsledek proto nemohl být uzavřen bez použití MALDI-TOF. Dále také u některých vzorků nebylo pozorováno typické zbarvení kolonií na chromagaru. Soubor obsahuje pouze 15 kmenů, takže z něho nelze posuzovat zastoupení jednotlivých druhů v klinických izolátech ve FN Brno, ale cílem této části bakalářské práce bylo seznámení se s metodami laboratorní diagnostiky kvasinek a jejich porovnání, proto soubor obsahuje širokou škálu druhů, včetně druhů méně často identifikovaných. Metoda MALDI-TOF je vysoce přesná, ale nelze se spoléhat pouze na výsledky této analýzy, proto se v praxi současně s MALDI-TOF provádí očkování na chromagar a v případě C. non-albicans i na rýžový agar. Pokud dojde k neshodě, provádí se API test (viz schéma). Pokud ani poté nelze vydat jednoznačný výsledek, je nutné (samozřejmě u závažných izolátů – původců invazivních infekcí) využít metod molekulární biologie (sekvenace).
42
8 Epidemiologie kandidémií ve Fakultní nemocnici Brno 8.1 Kritéria výběru dat Vstupními daty byly informace o pozitivních hemokulturách (kultivačně pozitivní kvasinky) v období od 1.1.2007 do 31.12.2014 ve FN Brno, které obsahovaly tyto informace: datum přijmu vzorku, jméno pacienta (pro účel statistiky pohlaví), datum narození, kód diagnózy, oddělení, rod a druh. Nejprve byla data třízena, kritériem bylo, že o jednu příhodu se jedná, pokud stejný druh byl vykultivován do 7 dní, přičemž prvním dnem je den příjmu vzorku, shodná kultivace po více než 7 dnech je považována za další příhodu a je započítávána do statistiky. Pokud byly z jednoho vzorku určeny dva a více druhů, jsou všechny započítávány do statistiky.
8.2 Počet případů Nejprve byl zhodnocen počet případů v jednotlivých letech. Nejvíce případů bylo v letech 2008 a 2010, naopak nejméně v roce 2012 a 2014. Průměrně vychází 40,6 případů na jeden rok.
Počet případů
Počet případů v jednotlivých letech 60 50 40 30 20 10 0
51
50
46
44
45
35 27
2007
2008
2009
2010
2011
2012
Rok Graf 1: Počet případů pozitivních hemokultur v letech 2007-2014
43
27
2013
2014
8.3 Zhodnocení rodů a druhů V celkovém počtu případů bylo zhodnoceno zastoupení rodů, nejvíce byl zastoupen rod Candida, dále byl detekován rod Trichosporon (pouze 2 případy z celkových 325). Dále byl celkově zhodnocen počet v zastoupení jednotlivých druhů. Nejzastoupenější byla C. albicans (162 případů z 325), dále C. parapsilosis (44 z 325), C. glabrata (41 z 325) a C. tropicalis (34 z 325).
Druh
Zastoupení druhů 1
Trichosporon asahii Candida sake Trichosporon inkin Candida inconsp./norvegensis Candida colliculosa Candida norvegensis Candida kefyr Candida guilliermondii Candida fabianii Candida dubliniensis Candida lipolytica Candida famata Candida utilis Candida lusitaniae Candida krusei Candida tropicalis Candida glabrata Candida parapsilosis Candida albicans
1
1 1 1 2 2 2 2 2 3 4 5 6 11 34 41 44 162
0
20
40
Graf 2: Celkové zastoupení druhů
44
60 80 100 120 140 160 180 Celkový počet případů
C. albicans byla v porovnání s non-albicans početně méně zastoupená téměř ve všech
Počet případů
letech, výjimkou byly roky 2007, 2011 a 2012, kdy C. albicans výrazně převahovala.
60 50 40 30 20 10 0
28 15 20
19
28
25
24 9
23
27
22
19
Candida non-albicans
16
Candida albicans
22
18
11
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Rok Graf 3: Porovnání C. albicans a non-albicans
Následně byl hodnocen vývoj zastoupení druhů v jednotlivých letech.
Zastoupení druhů v jednotlivých letech 60
50
4
9 6
Počet případů
40
8 1
30
7
6
2 5
5
11
3
8 8
4 2
20
23
1 4
8
7
ostatní Candida tropicalis
5 3 3 3
6
20
10
8
10
Candida glabrata
27 19
22
18
22
9
Candida parapsilosis
2 3 2
Candida albicans
11 0 2007
2008
2009
2010 2011 Rok
2012
2013
2014
Graf 4: Zastoupení nejčastějších druhů v jednotlivých letech
45
Candida albicans byla hojně zastoupena ve všech letech, procenta v zastoupení na jednotlivých případech sice kolísala (od 40,7% do 66,7%), i přesto platilo, že C. albicans je nejzastoupenějším druhem.
Počet případů
Candida albicans v jednotlivých letech 60 50 40 30 20 10 0
51
50 44
46
45
35 27
20
23
19
22
27
Celkem v roce
27 18
22
Candida albicans 11
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Rok Graf 5: Počet případů Candida albicans v jednotlivých letech
Candida colliculosa byla detekována v jednom případě v roce 2008. Candida dubliniensis byla zastoupena pouze ve dvou případech v roce 2009, u dvou různých pacientů. Candida fabianii byla také málo zastoupená, pouze ve dvou případech v roce 2014, u dvou různých pacientů. Candida famata nebyla taktéž hojně zastoupena, případy byly pouze v letech 2007-2010, v každém roce byl pouze jeden případ. Candida sake byla detekována pouze v 1 případě v roce 2010. Candida utilis byla zastoupena ve 2 případech v roce 2008, v letech 2009, 2010 a 2013 po jednom případu. Trichosporon asahii byl zastoupen pouze v 1 případě v roce 2011. Candida guilliermondii byla zastoupena pouze ve dvou případech, jeden v roce 2013, druhý v roce 2014. Candida inconsp./norvegensis byla detekována pouze v jednom případě v roce 2008 a v druhém v roce 2013. Trichosporon inkin byl zastoupen pouze v jednom případě v roce 2014. Candida kefyr byla detekována pouze v jednom případě v roce 2013 a v jednom v roce 2014. 46
Candida glabrata byla hojněji zastoupena, procentuálně od 5,9% v roce 2007 do 18,2% v roce 2009.
Candida glabrata v jednotlivých letech Počet případů
60 40
51
50
44
46
45
35 27
20 2
8
6
7
8
27
Celkem v roce 4
3
3
Candida glabrata
0 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Rok Graf 6: Počet případů Candida glabrata v jednotlivých letech
Candida krusei byla detekována ve 3 případech v roce 2008, v 1 případě v roce 2009, v 1 případě v roce 2011, ve 2 případech v roce 2012 a ve 4 případech v roce 2013. Candida lipolytica byla detekována v 1 případě v roce 2013 a ve 2 případech v roce 2014. Candida lusitaniae byla detekována v roce 2009-2012, v každém roce byl 1 případ, v roce 2014 byly případy 2. Candida norvegensis byla detekována po jednom případu v roce 2008 a 2011. Candida parapsilosis byla hojně zastoupena ve všech letech, od 7,4% případů do 22,2% případů.
Počet případů
Candida parapsilosis v jednotlivých letech 60 50 40 30 20 10 0
51
50 44
46
45
35 27
5
5
8
6
5
27
Celkem v roce
10 3
2
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Rok Graf 7: Počet případů Candida parapsilosis v jednotlivých letech 47
Candida parapsilosis
Candida tropicalis byla hojně zastoupena, procentuálně nejvíce v roce 2010 (22%).
Počet případů
Candida tropicalis v jednotlivých letech 60 50 40 30 20 10 0
51
50 44
46
45
35 27 7
8
27
Celkem v roce
11 3
2
0
1
2
Candida tropicalis
2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Rok Graf 8: Počet případů Candida tropicalis v jednotlivých letech
8.4 Zhodnocení podle pohlaví Nejprve bylo zhodnoceno procentuální zastoupení mužů a žen. V souboru se nacházelo 180 mužů (55%) a 145 žen (45%).
Zastoupení mužů a žen
Žena 45% Muž 55%
Graf 9: Procentuální zastoupení mužů a žen v případech
V jednotlivých letech co do počtu případů převažovali muži, pouze v roce 2008 bylo více případů u žen a v roce 2010 byly počty vyrovnány.
48
Zastoupení mužů a žen v letech
Počet případů
60 50 40 30
27
25
20
16
19
14
20 10
11
13 21
24
29
27
25
24
14
Žena Muž
16
0 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 Rok Graf 10: Zastoupení mužů a žen v letech 2007-2014
U některých druhů je patrný výrazně vyšší výskyt u jednoho pohlaví, C. parapsilosis byla častěji detekována u mužů než u žen (31 případů u mužů, pouze 13 u žen), zatímco C. glabrata byla častěji detekována u žen (24 případů, u mužů 17). U obou pohlaví však byla jednoznačně nejzastoupenější C. albicans, což odpovídá faktu, že tento druh má nejvyšší výskyt v souboru.
Druhy v závislosti na pohlaví 12
ostatní 2
Druhy
C. krusei
21
9 17 17
C. tropicalis
Ženy
13
C. parapsilosis C. glabrata
31 17
Muži
24 77
C. albicans 0
20
40 60 Počet případů
Graf 11: Zastoupení druhů v závislosti na pohlaví 49
80
85
100
8.5 Věk pacienta Pro zhodnocení věku pacientů byly vybrány tyto kategorie: do 1 roku, 1-3, 4-18, 19-44, 45-64, 65-84, 85 a více. Nejprve byl zhodnocen počet pacientů v jednotlivých věkových kategoriích.
Počet případů dle věkových kategorií 13
33
11
Do 1 roku 19
1-3 4-18
111
19-44
40
45-64 65-84 85 a více 98
Graf 12: Počet případů v jednotlivých věkových kategoriích
Nejvíce pacientů bylo ve věku 65-84 let (111 z 325 případů, 34%), dále ve věku 45-64 let (98 z 325, 30%) a 40 případů byli pacienti ve věku 19-44 let (12%). Z toho lze usuzovat, že u dospělých jsou kvasinkové infekce krevního řečiště častější než u dětí, dospělí tvořili 76,6% souboru, ze zbylých 23,4% celých 10% pacientů tvořily děti do 1 roku. U pacientů ve věku do 1 roku byla nejčastějším původcem C. albicans (61%), druhou nejzastoupenější byla C. parapsilosis (18%).
Zastoupení druhů u pacientů do 1 roku C. albicans
5
C. parapsilosis
2 6
C. tropicalis
20
ostatní
Graf 13: Zastoupení druhů u pacientů ve věku do 1 roku 50
Ve věkové kategorii 1-3 roky jako jediné byla C. albicans méně zastoupena (pouze 18%), najzastoupenější byla C. parapsiolosis (45%).
Zastoupení druhů u pacientů ve věku 1-3 roky 2
C. albicans
4
C. parapsilosis ostatní 5
Graf 14: Zastoupení druhů u pacientů ve věku 1-3 roky
Ve věkové kategorii 4-18 let byla nejzastoupenější C. albicans (58%), dále C. parapsilosis (16%).
Zastoupení druhů u pacientů ve věku 4-18 let 2
C. albicans
1
C. parapsilosis
2
C. tropicalis 11 3
C. glabrata ostatní
Graf 15: Zastoupení druhů u pacientů ve věku 4-18 let
51
Ve věkové kategorii 19-44 let byla opět nejzastoupenější C. albicans (55%) a C. parapsilosis (18%).
Zastoupení druhů u pacientů ve věku 19-44 let 7
C. albicans C. parapsilosis
3 1
22
C. tropicalis C. glabrata ostatní
7
Graf 16: Zastoupení druhů u pacientů ve věku 19-44 let
Ve věkové kategorii 45-64 let byla nejzastoupenější C. albicans (49%), dále C. glabrata (15%), C. tropicalis (12%) a C. parapsilosis (10%).
Zastoupení druhů u pacientů ve věku 45-64 let 13
C. albicans C. parapsilosis
15 48
C. tropicalis C. glabrata
12
ostatní
10
Graf 17: Zastoupení druhů u pacientů ve věku 45-64 let
52
U pacientů ve věku 65-84 let byly nejčastější kvasinky totožné s kategorií 45-64 let, nejčastější byla C. albicans (47%), C. glabrata (17%), C. tropicalis (14%) a C. parapsilosis (12%).
Zastoupení druhů u pacientů ve věku 65-84 let C. albicans
12
C. parapsilosis
19
52
C. tropicalis
15
C. glabrata 13
ostatní
Graf 18: Zastoupení druhů u pacientů ve věku 65-84 let
U pacientů nad 85 let byly zastoupeny pouze 4 druhy, nejvýznamněji C. albicans (54%).
Zastoupení druhů u pacientů ve věku nad 85 let 1
C. albicans 3
C. tropicalis 7
C. glabrata ostatní
2
Graf 19: Zastoupení druhů u pacientů ve věku 85 let a více
8.6 Oddělení Jednotlivé oddělení byly sloučeny do 5 kategorií: ARO (dospělí), Hematoonkologie (dospělí a děti), Děti ostatní, Chirurgie a Interna. Nejvíce případů bylo na interních odděleních (141 případů z 325, 43,4%), nejméně na oddělení ARO u dospělých pacientů (pouze 36 případů z 325, 11,1%).
53
Počet případů na odděleních ARO (dospělí)
36
Hematoonkologie (dospělí a děti)
38
Děti ostatní
53
Chirurgie
57
Interna
141
0
20
40
60
80 100 120 140 160
Graf 20: Počet případů na odděleních ve FN Brno
Na interních odděleních byla nejzastoupenější C. albicans (48,2%), C. parapsilosis a C. tropicalis měly každá 14,9%, C. glabrata 12,8% a v 9,2% případů byly původcem jiné druhy.
Interna C. albicans
13 18
C. parapsilosis 68
C. tropicalis
21
C. glabrata ostatní
21
Graf 21: Zastoupení nejčastějších druhů na interních odděleních
54
Na chirurgických odděleních byla v 68,4% původcem C. albicans, v 17,5% C. glabrata a v 7,0% C. tropicalis. Pouze po 3,5% měla zastoupení C. parapsilosis a ostatní druhy.
Chirurgie 2
C. albicans
10
C. parapsilosis C. tropicalis
4 2
C. glabrata
39
ostatní
Graf 22: Zastoupení nejčastějších druhů na chirurgických odděleních
Na odděleních ARO pro dospělé byla v 50,0% identifikována C. albicans, ve 22,2% C. glabrata, v 11,1% C. tropicalis a po 8,3% C. parapsilosis a ostatní druhy.
ARO 3
C. albicans C. parapsilosis
8
C. tropicalis
18
C. glabrata 4
ostatní
3
Graf 23: Zastoupení nejčastějších druhů na odděleních ARO pro dospělé
Na hematoonkologických odděleních (pro dospělé i děti) byla C. albicans identifikována pouze ve 23,7% případů, na rozdíl od ostatních oddělení zde byla hojně zastoupena C. krusei (18,4%) a ve 28,9% původcem byly ostatní kvasinky. C. parapsilosis byla identifikována pouze ve 13,2%, C. glabrata v 10,5% a C. tropicalis v 5,3%. 55
Hematoonkologie C. albicans 9
11
C. parapsilosis C. tropicalis C. glabrata
5
7
C. krusei
2
ostatní
4
Graf 24: Zastoupení nejčastějších druhů na hematoonkologických odděleních pro děti i dospělé
Na ostatních dětských odděleních byla nejčastěji identifikována C. albicans (52,8%), dále C. parapsilosis (24,5%), pouze v 5,7% C. tropicalis a v 1,9% C. glabrata. Ostatní druhy byly identifikovány v 15,1%.
Děti ostatní
8 1
C. albicans C. parapsilosis
3
C. tropicalis 28
C. glabrata
13
ostatní
Graf 25: Zastoupení nejčastějších druhů na dětských odděleních kromě onkologie
56
8.7 Zhodnocení podle diagnóz Data byly zhodnoceny v závislosti na základní diagnóze pacienta. Přehled písmenných kódů diagnóz (ÚZIS ČR 2013): I.
Některé infekční a parazitární nemoci: A, B
II.
Novotvary: C, D
III.
Nemoci krve, krvetvorných orgánů a některé poruchy týkající se mechanismu imunity: D
IV.
Nemoci endokrinní, výživy a přeměny látek: E
V.
Poruchy duševní a poruchy chování: F
VI.
Nemoci nervové soustavy: G
VII.
Nemoci oka a očních adnex: H
VIII.
Nemoci ucha a bradavkového výběžku: H
IX.
Nemoci oběhové soustavy: I
X.
Nemoci dýchací soustavy: J
XI.
Nemoci trávicí soustavy: K
XII.
Nemoci kůže a podkožního vaziva: L
XIII.
Nemoci svalové a kosterní soustavy a pojivové tkáně: M
XIV. Nemoci močové a pohlavní soustavy: N XV.
Těhotenství, porod a šestinedělí: O
XVI. Některé stavy vzniklé v perinatálním období: P XVII. Vrozené vady, deformace a chromozomální abnormality: Q XVIII. Příznaky, znaky a abnormální klinické a laboratorní nálezy nezařazené jinde: R XIX. Poranění, otravy a některé jiné následky vnějších příčin: S, T XX.
Vnější příčiny nemocnosti a úmrtnosti V, W, X, Y
XXI. Faktory ovlivňující zdravotní stav a kontakt se zdravotnickými službami: Z XXII. Kódy pro speciální účely: U Nejprve byl zhodnocen počet případů v jednotlivých kategoriích v letech 2007-2014, nejvíce jich bylo v kategorii K – nemoci trávicí soustavy (73 z 325; 22%), dále byl vyšší počet případů v kategorii C+D, I a J. Některé kategorie diagnóz se v souboru případů nevyskytovaly vůbec (kategorie F, O, U, V, W, X, Y).
57
Počet případů podle diagnozy 10
5 44 8 7 73
12 15 19 20
51 24 36
K
C+D
J
I
A+B
R
S+T
P
G
N
E
Q
M
L
Z
37
Graf 26: Počet případů v jednotlivých kategoriích dle písmenného kódu diagnózy
Dále bylo hodnoceno zastoupení druhů kvasinek v jednotlivých kategoriích diagnóz. V kategorii A a B převažovala jako původce C. albicans (37% případů), dále také C. parapsilosis (25% případů). Dále byla zastoupena C. glabrata a C. tropicalis (každá ve 4 případech) a C. utilis v 1 případě. Nejčastějším kódem diagnózy bylo A41 – jiná sepse (15 z 23 případů). (ÚZIS ČR 2013) V kategorii C a D bylo dohromady 51 případů, původcem byla v 37% C. albicans, 13% C krusei, ostatní druhy byly zastoupeny méně než 10%. Nejčastější kód diagnózy byl C91 – lymfoidní leukemie (10 případů) a C92 – myeloidní leukemie (7 případů), u obou diagnóz byla zhruba v polovině případů původcem C. krusei (5 případů u C91, 3 u C92). (ÚZIS ČR 2013)
58
Zastoupení druhů kategorie C a D 4% 8%
8% 37% 4% 2%
13%
4%
2% 2%
2% 2% 2% 2%
8%
C. albicans C. norvegensis C. fabianii Tr. asahii C. glabrata C. guilliermondii C. inconsp./norvegensis Tr. inkin C. kefyr C. krusei C. lipolytica C. lusitaniae C. parapsilosis C. tropicalis C. utilis
Graf 27: Zastoupení druhů v kategorii C a D
Kategorie E měla pouze 8 případů, z toho u 4 byla původcem C. albicans, u 2 C. glabrata. C. parapsilosis a C. tropicalis byly původcem každá pouze v jednom případě. V kategorii G byla v 6 z 12 případů identifikována C. albicans, ostatní druhy každý pouze v jednom případě (C. glabrata, C. lipolytica, C. lusitaniae, C. parapsilosis, C. utilis a C. tropicalis). V kategorii I byla na 1. místě C. albicans, 2. byla C. glabrata a 3. C. tropicalis. Nejvíce bylo diagnóz s kódem I26 – plicní embolie (7) a I50 – selhání srdce (7), u obou byla nejčastějším původcem C. albicans (u I26 dokonce v 6 ze 7 případů). (ÚZIS ČR 2013)
59
11%
Zastoupení druhů kategorie I C. albicans
8%
C. dubliniensis C. glabrata
3% 47% 8%
C. krusei C. lusitaniae C. parapsilosis C. tropicalis
20% 3%
Graf 28: Zastoupení druhů v kategorii I
V kategorii J v 57% případů (21 z 37) byla původcem C. albicans, 16% případů (6 z 37) způsobila C. tropicalis. Nejčastější diagnózou (19 případů) byla J18 – pneumonie, původce NS. (ÚZIS ČR 2013)
Zastoupení druhů kategorie J 16%
C. albicans
C. glabrata 11%
C. lusitaniae
3% 2%
57%
C. norvegensis C. parapsilosis
11%
C. tropicalis
Graf 29: Zastoupení druhů v kategorii J
V kategorii K způsobila C. albicans 54% případů (39 ze 73), C. parapsilosis 18% (13 ze 73) a C. glabrata 12% (9 ze 73). V 17 případech byla diagnóza K85 – akutní zánět slinivky břišní – pancreatitis acuta, zastoupení druhů u této diagnózy odpovídalo celkovému zastoupení v celé kategorii. (ÚZIS ČR 2013) 60
Zastoupení druhů kategorie K
1% 1%
10%
18% 54% 12%
C. albicans C. colliculosa C. dubliniensis C. fabianii C. glabrata C. parapsilosis C. sake C. tropicalis C. utilis
1% 1%
2%
Graf 30: Zastoupení druhů v kategorii K
V kategorii L byly pouze 4 případy, 3 z nich způsobila C. albicans, 1 C. parapsilosis. V kategorii M bylo pouze 5 případů, 2 způsobila C. albicans, 1 C. famata, 1 C. parapsilosis a 1 C. tropicalis. V kategorii N bylo celkem 10 případů, 7 z nich (70%) způsobila C. albicans, zbytek C. glabrata, C. parapsilosis a C. tropicalis. V kategorii P a Q byla v 77% případech (17 z 22) detekována C. albicans, C. famata ve 2 případech, C. lusitaniae v 1 případu a C. parapsilosis ve 2 případech. Nejčastější diagnóza (9 případů z 22) byla P76 - jiná střevní neprůchodnost novorozence. (ÚZIS ČR 2013) V kategorii R byla hojně zastoupena C. albicans (9 z 20), dále C. parapsilosis (4 z 20) a C. tropicalis (3 z 20). Dále byla zastoupena C. glabrata (2 z 10), C. guilliermondii a C. famata každá po 1 případu. V 8 případech byla diagnóza R10 – břišní a pánevní bolest, v 6 případech R50 – horečka jiného a neznámého původu. (ÚZIS ČR 2013) V kategorii S a T byla C. albicans detekována v 47% případů (9 z 19), C. glabrata ve 32% (6 z 19), C. parapsilosis byla detekována pouze ve 2 případech a C. krusei a C. lipolytica, každá pouze v 1 případu. 7 diagnóz bylo T06 – jiná poranění postihující více částí těla, nezařaditelná jinam, z toho v 6 případech byla detekována C. albicans, 6 diagnóz bylo T29 – popáleniny a poleptání více částí těla, z toho 5 případů s původcem C. glabrata. (ÚZIS ČR 2013) V kategorii Z byly pouze 4 případy, u 2 byla detekována C. tropicalis, u 1 C. parapsilosis a u 1 C. glabrata.
61
8.8 Případy s více druhy z jednoho vzorku U sedmi pacientů bylo detekováno z jednoho vzorku více druhů najednou. V roce 2008 to byla žena ve věku 68 let, základní diagnóza byla K80 – žlučové kameny –cholelithiasis, z jednoho vzorku byly identifikovány C. albicans, C. glabrata a C. tropicallis. V roce 2009 byl pacientem muž ve věku 48 let s diagnózou R10 – břišní a pánevní bolest, identifikované druhy byly stejně jako u předchozí pacientky C. albicans, C. glabrata a C. tropicalis. (ÚZIS ČR 2013) V roce 2010 byly tři případy: muž ve věku 62 let s diagnózou L02 – kožní absces, furunkl a karbunkl, detekované druhy byly C. albicans a C. parapsilosis. Druhým případem byla žena ve věku 68 let s diagnózou C83 – non-folikulární lymfom, detekované druhy byly C. lusitaniae a C. tropicalis. Třetím případem byl muž ve věku 76 let s diagnózou K63 – jiné nemoci střev, identifikované druhy byly C. albicans, C. parapsilosis a C. sake. (ÚZIS ČR 2013) V roce 2011 byl pacientem muž ve věku 69 let s diagnózou C83, identifikována byla C. glabrata a C. parapsilosis. V roce 2013 byla pacientkou žena ve věku 39 let s diagnózou A15 – tuberkulóza dýchacího ústrojí bakteriologicky a histologicky ověřená, identifikována byla C. albicans a C. utilis. (ÚZIS ČR 2013) V roce 2012 byl zajímavostí muž ve věku 38 let s diagnózou K85 – akutní zánět slinivky břišní – pancreatitis acuta, u kterého byla 1.10.2012 diagnostikována C. albicans a 4.10.2012 C. glabrata. (ÚZIS ČR 2013)
62
8.9 Opakovaně pozitivní hemokultury Celkem 25 pacientů mělo opakovaně pozitivní hemokultury po více než 7 dnech, z toho bylo 10 žen a 15 mužů. V souboru opakovaně pozitivních hemokultur byly zastoupeny 4 druhy kvasinek, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis a C. parapsilosis. Nejvíce zastoupená byla C. albicans (45% hemokultur).
7
C. albicans
C. glabrata
26 17
C. tropicalis C. parapsilosis 8
Graf 31: Zastoupení nejčastějších druhů v opakovaně pozitivních hemokulturách
U třech pacientů byly identifikovány s odstupem času různé druhy kvasinek, pacientka ve věku 72 let měla 2.11.2010 nález C. parapsilosis a 17.5.2011 C. albicans. Druhá pacientka ve věku 84 let měla 9.10.2012 a 16.10.2012 nález C. albicans, 26.11.2012 C. parapsilosis a 1.12.2012 opět C. albicans. Třetí pacient byl muž , 23.11.2007 (ve věku 54 let) měl nález C. tropicalis, 19.12.2012 (ve věku 59 let) C. parapsilosis. U ostatních pacientů byl opakovaně nalezen stejný druh.
63
8.10 Diskuze Na základě zpracovaných dat bylo zjištěno několik informací o případech hemokultur kultivačně pozitivních na kvasinky. Dle kritéria výběru dat uvedeného v kapitole 8.1 bylo zjištěno, že v období od 1.1.2007 do 31.12.2014 bylo ve FN Brno diagnostikováno celkem 325 případů. Jak již bylo uvedeno, nejméně případů bylo v roce 2012 a 2014, což by mohlo svědčit pro klesající tendenci v počtu případů za rok, avšak v roce 2013 byl počet případů nadprůměrný. Nejvýrazněji byla ve FN Brno zastoupena C. albicans (49,8%), C. parapsilosis (13,5%), C. glabrata (12,6%) a C. tropicalis (10,5%). Toto rozložení odpovídá publikovaným datům. V práci Pfaller a kol. byla C. albicans zastoupena v 45,6%, C. glabrata v 26%, C. parapsilosis v 15,7% a C. tropicalis v 8,1% případů. Ve FN Brno byla oproti datům z této studie méně zastoupena C. glabrata (12,6%; ve studii 26%). (Pfaller a Diekema 2010) C. non-albicans byly původcem sepse ve 49,5%, což je v těsné shodě s 49,6% z další studie prováděné pod Prospective Antifungal Therapy Alliance (PATH Alliance). (Pfaller et al. 2014) Ve studii Weinbergera z roku 2005 byly v součtu detekovány C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis a C. glabrata v 96% izolátů, ve FN Brno byl tento součet téměř o 10% nižší (86,5% případů). (Weinberger et al. 2005) V souboru převažovali muži v zastoupení 55%, C. albicans byla u obou pohlaví nejzastoupenější, rozdíly však byly u C. glabrata, která byla více zastoupena u žen a u C. parapsilosis, která byla naopak více zastoupena u mužů. Takové zastoupení publikoval i Pfaller, u C. parapsilosis bylo procento mužů 58,1% (ve FN Brno bylo 70,5%), u C. glabrata bylo procento mužů 46,9% (ve FN Brno 41,5%). (Pfaller et al. 2014) Průměrný věk pacientů byl 50,9 let se směrodatnou odchylkou 27,2 let. V epidemiologické studii z roku 2014 byl průměrný věk pacientů 53,3 let se směrodatnou odchylkou 20,0 let, ovšem pouze u pacientů, u kterých byly identifikovány C. non-albicans druhy. (Pfaller et al. 2014) Nejstarší pacient byl ve věku 91 let. C. albicans byla významně zastoupena ve všech věkových kategoriích, naopak C. glabrata byla významně zastoupena u pacientů nad 45 let věku, což potvrzuje fakt, že je častějším původcem u dospělých pacientů (viz kapitola 3.5.2). C. parapsilosis byla také hojně zastoupena ve všech věkových kategoriích (pouze u pacientů nad 85 let byl výskyt nulový), u dětí ve věku 1-3 roky byla dokonce nejzastoupenějším druhem, což je v kontextu s publikovanými daty. (Pfaller et al. 2014) Nejvíce pacientů mělo kód diagnózy v kategorii K – nemoci trávicí soustavy, u těchto pacientů může docházet k poruše střevní sliznice a prostupu kvasinek do krevního řečiště. Dále bylo hodně pacientů s diagnózou v kategorii C a D, příčinou by mohlo být to, že do této 64
kategorie spadají i hematoonkologičtí pacienti, kteří patří mezi rizikové skupiny vzniku kandidemie. V kategorii J – nemoci dýchací soustavy bylo 11% pacientů, to může souviset s případným poškozením plic a zvýšeným průnikem kvasinek do krve nebo s dlouhodobou antibiotickou léčbou těchto pacientů. V kategorii I – nemoci oběhové soustavy bylo také 11% pacientů, důvodem by mohla být porušená stěna cév, dlouhodobá hospitalizace těchto pacientů (nozokomiální nákaza) nebo jejich katetrizace. Nejvíce pacientů bylo z oddělení Interních oddělení, což může být dáno tím, že do této kategorie bylo zahrnuto celkově nejvíce oddělení. Zajímavé je, že C. albicans byla na chirurgických odděleních zastoupena 68,4%, zatímco na hematoonkologických odděleních pouze 23,7%. Důvodem tohoto jevu je pravděpodobně historicky dlouhodobé používání antimykotické profylaxe flukonazolem u hematoonkologických pacientů, na který je C. albicans obvykle dobře citlivá. Na ostatních odděleních se procenta pohybovala kolem 50%. C. krusei byla významně zastoupena pouze u hematoonkologického oddělení, zatímco u ostatních se vyskytovala ojediněle. Vysoké zastoupení C. parapsilosis na dětských odděleních (24,5%) souhlasí s hojným výskytem u dětí. U 7 pacientů bylo detekováno více druhů najednou, toto číslo je porovnatelné se studií, ve které takovýchto pacientů bylo 8, počet epizod u studie bylo 311, zatímco ve FN Brno bylo 325 epizod. (Weinberger et al. 2005) Údaje o mortalitě pacientů nebyly dostupné, proto nelze provést porovnání dat s daty ze světových studií.
65
Závěr Jedním z cílů této bakalářské práce bylo osvojení technik laboratorní diagnostiky kvasinek. V laboratořích Oddělení klinické mikrobiologie FN Brno byly kultivovány vybrané vzorky od pacientů za účelem osvojení postupu při identifikaci kvasinek a současně byly porovnávány výsledky získané s pomocí moderní MALDI-TOF metody s výsledky identifikace bez použití MALDI-TOF. Byla potvrzena hypotéza, že identifikace s použitím metody MALDI-TOF je nejen časově úspornější, ale také úspěšnější. Dalším cílem bylo zhodnocení získaných dat o hemokulturách kultivačně pozitivních na kvasinky ve FN Brno, obdržená data byla třízena a vyhodnocena v závislosti na počtu případů v jednotlivých letech, bylo zhodnoceno zastoupení jednotlivých rodů a druhů v celém souboru a jednotlivých letech, zastoupení pohlaví a závislost druhů na pohlaví, věkové rozložení pacientů a s ním související zastoupení druhů, počet případů na jednotlivých odděleních, zastoupení dle kategorií diagnóz a vliv diagnózy na identifikované druhy, dále byly zhodnoceny případy s více identifikovanými druhy z jednoho vzorku a pacienti s opakovaně pozitivními hemokulturami. Bylo zjištěno, že data z vybraného období z FN Brno jsou srovnatelná s daty ze světových studií. Kandidémie patří stále mezi závažná onemocnění s vysokou celosvětovou mortalitou, u kterého je velice důležitá včasná diagnostika a vhodná léčba.
66
Použitá literatura ADVANDX. Reference Results Images: PNA FISH for Blood Cultures [online]. 2014. [cit. 20. ledna 2015]. Dostupné z: http://www.advandx.com/wp-content/uploads/2014/03/PNAFISH-Assay-Procedure-Guide-PN1622C.pdf ANAISSIE, E. J., M. R. MCGINNIS a M. A. PFALLER. Clinical mycology. 2nd ed. Edinburgh: Churchill Livingstone, 2009. ISBN 978-1-4160-5680-5. ASSOCIATES OF CAPE COD INCONPORATED. Příbalový leták: Stanovení pro (1-3)β-D-glukanu v séru FUNGITELL [online]. 2007. [cit. 24. března 2015]. Dostupné z: http://www.acciusa.com/pdfs/accProduct/Fungitell_multilang_pisheets/Fungitell%20Insert%2 0CZ.pdf AVOLIO, M. et al. Direct antifungal susceptibility testing of positive Candida blood cultures by sensititre YeastOne. NEW MICROBIOLOGICA [online]. 2009, roč. 32, č. 2, s. 179–184 [cit. 17. března 2015]. Dostupné z: www.newmicrobiologica.org/PUB/allegati_pdf/2009/2/179.pdf BEDNÁŘ, M. Mikrobiologie. 1. vyd. Praha: Marvil, 1996. BIO-RAD. Příbalový leták: PLATELIATM Candida Ab Plus, detekce protilátek kvasinky Candida proti mannanu v lidském séru nebo plazmě imuno-enzymatickou metodou [online]. 2009.
[cit.
24.
března
2015].
Dostupné
z:
http://www.bio-
rad.com/webroot/web/pdf/inserts/CDG/cs/62785_881050_CZ.pdf BIOVENDOR. Návod k použití pro tablety NEO-SENSITABSTM [online]. [cit. 22. ledna 2015]. Dostupné z: https://www.biovendor.cz/download/9569/Navod_NeoSensitabs.pdf LABORATORIOS
CONDA,
S.A.
SABOURAUD
DEXTROSE
AGAR
+
CHLORAMPHENICOL : For selective cultivation and isolation of yeasts and molds [online]. [cit. 12. ledna 2015]. Dostupné z: http://www.condalab.com/products/ search/?tx_condalabproducts_busqueda%5BproductoCod%5D=1090&tx_condalabproducts_ busqueda%5Bcat1%5D=&tx_condalabproducts_busqueda%5Bcat2%5D=&tx_condalabprodu cts_busqueda%5Bcat3%5D=&tx_condalabproducts_busqueda%5Baction%5D=show&tx_con dalabproducts_busqueda%5Bcontroller%5D=Categoria&cHash=61b48b767dccc0328278b9c c08278e62 67
DE PAUW, B. et al. Revised definitions of invasive fungal disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group (EORTC/MSG) Consensus Group. Clinical Infectious Diseases [online]. 2008, roč. 46, č. 12, s. 1813–1821 [cit. 7. dubna 2015]. Dostupné z: doi:10.1086/588660 DIATKOVÁ, J. et al. Antimykotická léčba invazivních mykóz imunosuprimovaných nemocných. Onkologie [online]. 2012, roč. 6, č. 6, s. 304–308. [cit. 10. dubna 2015] Dostupné
z:
http://www.solen.cz/artkey/xon-201206-
0003_Antimykoticka_lecba_invazivnich_mykoz_imunosuprimovanych_nemocnych.php?bac k=%2Fsearch.php%3Fquery%3D%20Psychofarmakologie%20v%20onkologii%2C%20mo% BEnosti%20ovlivn%ECn%ED%20bolesti%26sfrom%3D1740%26spage%3D30 DOCTORFUNGUS. Candida Species [online]. 2007. [cit. 21. října 2014]. Dostupné z: http://www.doctorfungus.org/thefungi/candida_spp.php ELITECHGROUP. ElitechGroup : Mycology [online] [cit. 20. ledna 2015]. Dostupné z: http://www.elitechgroup.com/corporate/products/market-segment/microbiology/mycology FERRARI, M. D. et al. Visual analysis of DNA microarray data for accurate molecular identification of non-albicans Candida isolates from patients with candidemia episodes. Journal of Clinical Microbiology [online]. 2013, roč. 51, č. 11, s. 3826–3829. [cit. 21. ledna 2015]. Dostupné z: http://jcm.asm.org/content/51/11/3826 GREENWOOD, D. et al. Lékařská mikrobiologie: přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita, laboratorní diagnostika a epidemiologie. 1. vyd. Praha: Grada, 1999. ISBN 8071693650. HARRIS, D. M. a D. J. HATA. Rapid identification of bacteria and candida using pna-fish from blood and peritoneal fluid cultures: a retrospective clinical study. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials [online]. 2013, roč. 12. ISSN 1476-0711. [cit. 16. ledna 2015] Dostupné z: doi:10.1186/1476-0711-12-2 HORVATH, L. L. et al. Direct Comparison of the BACTEC 9240 and BacT/ALERT 3D Automated Blood Culture Systems for Candida Growth Detection. Journal of Clinical Microbiology [online]. 2004, roč. 42, č. 1, s. 115–118 [cit. 20. ledna 2015]. Dostupné z: doi:10.1128/JCM.42.1.115-118.2004 68
HOSPENTHAL, D. R. et al. Persistence of Pigment Production by Yeast Isolates Grown on CHROMagar Candida Medium. Journal of Clinical Microbiology [online]. 2002, roč. 40, č. 12, s. 4768–4770 [cit. 13. ledna 2015]. Dostupné z: doi:10.1128/JCM.40.12.4768-4770.2002 JEDLIČKOVÁ, A. Systémové mykózy: průvodce ošetřujícího lékaře. 1. vyd. Praha: Maxdorf, 2006. ISBN 80-7345-000-X. JOSHI, K. R. et al. The morphological identification of pathogenic yeasts using carbohydrate media. Journal of Clinical Pathology [online]. 1975, roč. 28, č. 1, s. 18-24 [cit. 21. dubna 2015]. Dostupné z: www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC475587/pdf/ jclinpath00135-0025.pdf JURÁNKOVÁ, J. Klinická mikrobiologie v laboratorní praxi: bakalářský obor Zdravotní laborant. Brno: Masarykova univerzita, 2011. ISBN 9788021056572. KAUR, R. et al. A yeast by any other name: Candida glabrata and its interaction with the host. Current Opinion in Microbiology [online]. 2005, roč. 8, č. 4, s. 378–384 [cit. 26. ledna 2015]. ISSN 1369-5274. Dostupné z: doi:10.1016/j.mib.2005.06.012 KĘDZIERSKA, A. et al. Current status of fungal cell wall components in the immunodiagnostics of invasive fungal infections in humans: galactomannan, mannan and (1→3)-β-D-glucan antigens. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases [online]. 2007, roč. 26, č. 11, s. 755–66 [cit. 22. ledna 2015]. Dostupné z: http://dx.doi.org.ezproxy.muni.cz/10.1007/s10096-007-0373-6 KIRAZ, N. et al. The Usefulness of DNA Sequencing After Extraction by Whatman FTA Filter Matrix Technology and Phenotypic Tests for Differentiation of Candida albicans and Candida dubliniensis. Mycopathologia [online]. 2014, roč. 177, č. 1-2, s. 81–86 [cit. 10. dubna 2015]. Dostupné z: doi:10.1007/s11046-014-9728-6 KORANDOVÁ, H. Plísňová onemocnění nehtů. Praktické lékárenství [online]. 2014, roč. 10,
č.
3,
s.
105–108.
[cit.
26.
ledna
2015]
Dostupné
z:
http://www.praktickelekarenstvi.cz/artkey/lek-2014030006_Plisnova_onemocneni_nehtu.php LIMA-NETO, R. et al. Application of MALDI-TOF MS for requalification of a Candida clinical isolates culture collection. Brazilian Journal of Microbiology [online]. 2014, roč. 45, 69
č.
2,
s.
515–522
[cit.
16.
ledna
2015].
Dostupné
z:
http://dx.doi.org.ezproxy.muni.cz/10.1590/S1517-83822014005000044 MALLÁTOVÁ, N. a MENCL K. Laboratorní diagnostika invazívní kandidózy. Postgraduální medicína [online] 2010, č. 5, s. 51-58 [cit. 7. dubna 2015]. Dostupné z: http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina-priloha/laboratorni-diagnostika-invazivnikandidozy-455845 MCS DIAGNOSTICS. SENSITITRE®, YEASTONE® For in vitro Diagnostic Use [online]. 2012. [cit. 17. března 2015]. Dostupné z: www.mcsdiagnostics.com/site/upload/file/pdf/yo_8_yo10_v1.4_e.pdf MURRAY, P. R et al. Medical microbiology. 7th Edition. Philadelphia: Elsevier/Saunders, 2013. ISBN 9780323086929. OBAYASHI, T. et al. Plasma (1-3)-β-D-glucan measurement in diagnosis of invasive deep mycosis and fungal febrile episodes. Lancet [online]. 1995, roč. 345, č. 8941, s. 17–20 [cit. 23. ledna 2015]. ISSN 0099-5355. Dostupné z: doi:10.1016/S0140-6736(95)91152-9 PFALLER, M. A. et al. Epidemiology and Outcomes of Invasive Candidiasis Due to Nonalbicans Species of Candida in 2,496 Patients: Data from the Prospective Antifungal Therapy (PATH) Registry 2004-2008. PLOS ONE [online]. 2014, roč. 9, č. 7 [cit. 5. února 2015]. ISSN 1932-6203. Dostupné z: doi:10.1371/journal.pone.0101510 PFALLER, M. A. a D. J. DIEKEMA. Epidemiology of Invasive Mycoses in North America. Critical Reviews in Microbiology [online]. 2010, roč. 36, č. 1, s. 1–53 [cit. 10. února 2015]. ISSN 1040-841X. Dostupné z: doi:10.3109/10408410903241444 RÁČIL, Z. et al. Invazívní mykotické infekce u onkologických nemocných: změny v epidemiologii a diagnostice. Postgraduální medicína [online]. 2007, č. 3, s. 240–252. [cit. 7. dubna 2015] Dostupné z: http://zdravi.e15.cz/clanek/postgradualni-medicina/invazivnimykoticke-infekce-u-onkologickych-nemocnych-zmeny-v-ep-295143 RÁČIL, Z. et al. Terapie invazivních mykóz. Interní medicína pro praxi [online]. 2008, roč. 10, č. 4, s. 167–171. [cit. 10. dubna 2015] Dostupné z: http://www.internimedicina.cz/artkey/int-200804-0005.php
70
RAMANI, R. et al. 1998. Efficacy of API 20C and ID 32C systems for identification of common and rare clinical yeast isolates. Journal of Clinical Microbiology [online]. 1998, roč. 36, č. 11, s. 3396–3398. [cit. 13. ledna 2015] Dostupné z: http://www-ncbi-nlm-nihgov.ezproxy.muni.cz/pmc/articles/PMC105341/ ROSENTHAL, S. A. a D. FURNARI. Chlamydospore Production by Candida Albicans Comparison of Dehydrated Rice Extract Agar with Other Media. The Journal of Investigative Dermatology [online]. 1959, roč. 32, č. 2/1, s. 115–116 [cit. 13. ledna 2015]. ISSN 0022202X. Dostupné z: doi:10.1038/jid.1959.23 SAMARANAYAKE, Y. H. a LP SAMARANAYAKE. Candida krusei: biology, epidemiology, pathogenicity and clinical manifestations of an emerging pathogen. Journal of Medical Microbiology [online]. 1994, roč. 41, č. 5, s. 295–310 [cit. 4. února 2015]. ISSN 0022-2615. Dostupné z: doi:10.1099/00222615-41-5-295 SARDI, J. C. O. et al. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology [online]. 2013, roč. 62, s. 10–24. [cit. 21. října 2014]. ISSN 0022-2615. Dostupné z: doi:10.1099/jmm.0.045054-0 SILVA, J. O. et al. Performance of selective and differential media in the primary isolation of yeasts from different biological samples. Mycopathologia [online]. 2004, roč. 157, č. 1, s. 29–36. [cit. 13. ledna 2015]. Dostupné z: http://search.proquest.com.ezproxy.muni.cz/ docview/221211619?accountid=16531 SILVA, S. et al. Biofilms of non-Candida albicans Candida species: quantification, structure and matrix composition. Medical Mycology [online]. 2009, roč. 47, č. 7, s. 681–689 [cit. 28. října 2014]. ISSN 1369-3786. Dostupné z: doi:10.3109/13693780802549594 SILVA, S. et al. Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis: biology, epidemiology, pathogenicity and antifungal resistance. FEMS Microbiology Reviews [online]. 2012, roč. 36, č. 2, s. 288–305 [cit. 28. října 2014]. ISSN 1574-6976. Dostupné z: doi:10.1111/j.1574-6976.2011.00278.x SIVAKUMAR, V. G. et al. Use of CHROMagar in the Differentiation of Common Species of Candida. Mycopathologia [online]. 2009, roč. 167, č. 1, s. 47–49 [cit. 13. ledna 2015]. ISSN 0301-486X. Dostupné z: doi:10.1007/s11046-008-9149-5 71
SOBEL, JD. Vulvovaginal candidosis. Lancet [online]. 2007, roč. 369, č. 9577, s. 1961–1971 [cit. 6. března 2015]. ISSN 0140-6736. Dostupné z: doi:10.1016/S0140-6736(07)60917-9 SOBEL, JD et al. Vulvovaginal candidiasis: Epidemiologic, diagnostic, and therapeutic considerations. American Journal of Obstetrics and Gynecology [online]. 1998, roč. 178, č. 2, s. 203–211 [cit. 6. března 2015]. ISSN 0002-9378. Dostupné z: doi:10.1016/S00029378(98)80001-X SPIESS, B. et al. DNA Microarray-Based Detection and Identification of Fungal Pathogens in Clinical Samples from Neutropenic Patients. Journal of Clinical Microbiology [online]. 2007, roč. 45, č. 11, s. 3743–3753 [cit. 21. ledna 2015]. ISSN 0095-1137. Dostupné z: doi:10.1128/JCM.00942-07 STÁTNÍ VETERINÁRNÍ ÚSTAV JIHLAVA. Státní veterinární ústav Jihlava | Oddělení bakteriologie | Diagnostické metody | MALDI-TOF. MALDI-TOF [online] © 2003 - 2015 [cit. 20. ledna 2015]. Dostupné z: http://www.svujihlava.cz/229-maldi-tof.html SUSANNE G., D. SIEGEL a N. WELLINGHAUSEN. Rapid detection of pathogens in blood culture bottles by real-time PCR in conjunction with the pre-analytic toot MolYsis. Journal of Infection [online]. 2008, roč. 57, č. 4, s. 307–316. [cit. 20. ledna 2015]. Dostupné z: http://www.sciencedirect.com.ezproxy.muni.cz/science/article/pii/S0163445308002582 TROFA, D., A. GÁCSER a J. D. NOSANCHUK. Candida parapsilosis, an Emerging Fungal Pathogen. Clinical Microbiology Reviews [online]. 2008, roč. 21, č. 4, s. 606–625 [cit. 4. února 2015]. ISSN 0893-8512. Dostupné z: doi:10.1128/CMR.00013-08 ÚZIS ČR. MKN – 10: Mezinárodní klasifikace nemocí a přidružených zdravotních problémů: desátá revize. Aktualizované vydání k 1.1.2013 [online]. 2013. [cit. 1. března 2015]. Dostupné z: http://www.uzis.cz/cz/mkn/index.html VERSTREPEN, K. J. a F. M. KLIS. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Molecular Microbiology [online]. 2006, roč. 60, č. 1, s. 5–15 [cit. 28. října 2014]. ISSN 1365-2958. Dostupné z: doi:10.1111/j.1365-2958.2006.05072.x VOTAVA, M. Lékařská mikrobiologie vyšetřovací metody. Brno: Neptun, 2010. ISBN 97880-86850-04-8.
72
WEEMS, J. J. Candida parapsilosis: Epidemiology, Pathogenicity, Clinical Manifestations, and Antimicrobial Susceptibility. Clinical infectious diseases [online]. 1992, roč. 14, č. 3, s. 756–766 [cit. 4. února 2015]. ISSN 1058-4838. Dostupné z: doi:10.1093/clinids/14.3.756 WEINBERGER, M. et al. Characteristics of candidaemia with Candida albicans compared with non-albicans Candida species and predictors of mortality. Journal of Hospital Infection [online]. 2005, roč. 61, č. 2, s. 146–154 [cit. 6. března 2015]. ISSN: 0195-6701. Dostupné z: doi:10.1016/j.jhin.2005.02.009 WELLINGHAUSEN, N. et al. Rapid diagnosis of candidaemia by real-time PCR detection of Candida DNA in blood samples. Journal of Medical Microbiology [online]. 2009, roč. 58, č.
8,
s.
1106–1111.
[cit.
20.
ledna
2015]
ISSN:
0022-2615.
Dostupné
z:
doi:10.1099/jmm.0.007906-0 ZAZULA, R. et al. Současný pohled na mykotické plicní infekce. Interní medicína pro praxi [online]. 2005, roč. 7, č. 7-8, s. 349–353. [cit. 8. dubna 2015]. Dostupné z: http://www.internimedicina.cz/pdfs/int/2005/07/07.pdf
73
