Martin Srkala Studium vitality kvasnic kombinovanými elektrochemickými a fotometrickými metodami

Univerzita Karlova v Praze Matematicko-fyzikáln´ı fakulta

´ PRACE ´ DIPLOMOVA

Martin Srkala Studium vitality kvasnic kombinovan´ ymi elektrochemick´ ymi a fotometrick´ ymi metodami Katedra chemické fyziky a optiky Vedouc´ı diplomové práce: RNDr. Miroslav Dienstbier Studijn´ı program: Fyzika, biofyzika a chemická fyzika

2008

Podˇ ekov´ an´ı Na tomto m´ıstˇe bych velmi rád podˇekoval vedouc´ımu diplomové práce RNDr. Miroslavu Dienstbierovi za otcovské veden´ı a Mgr. Petru Gabrielovi za ˇcetné námˇety k práci a ochotu kdykoli poradit.

Prohlaˇsuji, ˇze jsem svou diplomovou práci napsal samostatnˇe a výhradnˇe s pouˇzit´ım citovaných pramen˚ u. Souhlas´ım se zap˚ ujˇcován´ım práce. V Praze dne 4. 8. 2008

Martin Srkala

2

Obsah ´ Uvod

6

1 Teorie 1.1 Kvasinky . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1 Osmóza . . . . . . . . . . . 1.2 Metabolismus kvasinek . . . . . . . 1.2.1 Transport látek . . . . . . . 1.2.2 Metabolismus sacharid˚ u . . 1.3 Vitalita a viabilita . . . . . . . . . 1.3.1 Mˇeˇren´ı viability . . . . . . . 1.3.2 Mˇeˇren´ı vitality . . . . . . . 1.3.3 Test acidifikaˇcn´ı schopnosti 1.3.4 Scénáˇr acidifikace . . . . . . 1.3.5 Acidifikace bez substrátu . . 1.3.6 Alternativy AP-testu . . . . 1.4 Bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı pH . . . . . . 1.4.1 pH indikátory . . . . . . . . 1.4.2 Absorbance . . . . . . . . . 1.5 Rozptyl svˇetla . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

8 8 10 11 11 13 16 16 17 18 20 21 22 23 24 24 26

2 Materi´ al a metody 2.1 Standardn´ı AP-test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı AP-testu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

29 29 32

3 Optimalizace AP-testu 3.1 Uchováván´ı vzork˚ u . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Pˇr´ıprava vzork˚ u . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

33 33 33

4 Vyuˇ zit´ı AP-testu 4.0.1 Vliv poˇctu nasazen´ı kvasnic v CKT na AP-test . . . . . . . . . 4.0.2 Vliv osmotického stresu na vitalitu kvasnic . . . . . . . . . . . . 4.0.3 Inhibice metabolických proces˚ u . . . . . . . . . . . . . . . . . .

40 40 41 48

3

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . .

5 Bezkontaktn´ı mˇ eˇ ren´ı pH 5.1 Volba barviva a jeho citlivost na pH 5.1.1 Bromocresol purple . . . . . . 5.1.2 Bromocresol green . . . . . . 5.1.3 Koncentraˇcn´ı citlivost barviva 5.1.4 Interakce BCG s kvasnicemi . . 5.1.5 Výpoˇcet pH ze spektra BCG . 5.2 Kombinovaná spektra . . . . . . . . . 5.2.1 Separon . . . . . . . . . . . . 5.2.2 Kvasnice . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

52 54 54 55 57 59 60 62 63 64

Z´ avˇ er

69

Literatura

71

4

Název práce: Studium vitality kvasnic kombinovanými elektrochemickými a fotometrickými metodami Autor: Martin Srkala Katedra: Katedra chemické fyziky a optiky Vedouc´ı diplomové práce: RNDr. Miroslav Dienstbier e-mail vedouc´ıho: [email protected] Abstrakt: Tato práce shrnuje metody mˇeˇren´ı vitality a viability. Dále se vˇenuje optimalizaci testu acidifikaˇcn´ı schopnosti (AP-test). Navrˇzený postup zahrnuje skladován´ı a pˇr´ıpravu vzork˚ u pˇri dosaˇzen´ı maximáln´ı hodnoty AP a reprodukovatelnosti mˇeˇren´ı. Optimalizace byla pouˇzita k rozliˇsen´ı: poklesu vitality s poˇctem nasazen´ı, vlivu osmotického stresu a vlivu inhibitor˚ u na sérii pr˚ umyslovˇe nasazených vzork˚ u kvasnic. V dalˇs´ı ˇcásti je vyuˇzito barvivo BCG k bezkontaktn´ımu fotometrickému mˇeˇren´ı pH. Je zde navrˇzen postup separace spektráln´ı sloˇzky BCG z kombinovaného spektra obsahuj´ıc´ıho rozptyluj´ıc´ı ˇcástice - separon nebo kvasnice. Ze spektra BCG je pak vypoˇcteno pH. Kl´ıˇcová slova: Acidifikaˇcn´ı schopnost, vitalita, optimalizace AP-testu, bromocresol green, bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı pH

Title: Study of yeast vitality by combined electrochemical and photometric methods Author: Martin Srkala Department: Department of Chemical Physics and Optics Supervisor: RNDr. Miroslav Dienstbier Supervisor’s e-mail address: [email protected] Abstract: This thesis summarises methods of viability and vitality measuring. Further optimized acidification power test (AP-test) is described. Suggested practice includes storage and pre-test steps that leads to maximal AP value of the yeast sample and reproducibility of this test. Optimized AP-test is used for determination of osmotic pressure influence, inhibition of part of metabolism influence and repitching of vitality of brewer yeast samples. In next chapter bromocresol green (BCG) dye is used for a contact-free fotometric determination of pH. There is described procedure of spectral part separation of BCG from composed spectra which contents scatter particles - separon or yeast. pH is calculated from BCG spectra. Keywords: Acidification power, vitality, optimized AP-test, bromocresol green, contactfree pH measurement

5

´ Uvod C´ılem této diplomové práce je studium vitality kvasniˇcné suspenze kombinovanými elektrochemickými a fotometrickými metodami u vybraných pr˚ umyslovˇe významných kmen˚ u. Za t´ımto u ´ˇcelem byly shrnuty r˚ uzné metody studia viability a vitality, jednou z nichˇz je metoda AP-testu. Jedná se o jednoduchou a nenákladnou metodu, zaloˇzenou na mˇeˇren´ı zmˇen extracelulárn´ıho pH, která pˇres svou relativn´ı nenároˇcnost m˚ uˇze dobˇre slouˇzit k rozliˇsen´ı metabolické kompetence r˚ uzných vzork˚ u kvasnic a pˇredpovˇedi pr˚ ubˇehu fermentace. Byla navrˇzena Miroslavou Opekarovou a Karlem Siglerem jiˇz na zaˇcátku osmdesátých let [10] a [14]. AP-test se bˇehem následuj´ıch let stal hojnˇe vyuˇz´ıvaným v potravináˇrském pr˚ umyslu, zejména pivovarnictv´ı. Zde byl doposud nejˇcastˇeji pouˇz´ıván v proveden´ı podle Kary [7]. Laboratorn´ı praxe vˇsak v ˇradˇe pˇr´ıpad˚ u poukazovala na ne pˇr´ıliˇs dobrou reprodukovatelnost a ne zcela jasné souvislosti výsledk˚ u testu s pr˚ ubˇehy fermentace. Detailn´ım studiem AP-testu za u ´ˇcelem nalezen´ı pˇr´ıˇcin nepˇresnost´ı ve výsledc´ıch a zp˚ usobu mˇeˇren´ı AP hodnot tak, aby odpov´ıdaly potenciáln´ı vitalitˇe, se zabývaj´ı napˇr. práce [13] a [2]. Tato diplomová práce na nˇe navazuje a v prvn´ı ˇcásti se zabývá studiem vlivu nˇekterých fyzikálnˇe-chemicko-biologických podm´ınek na výsledky AP-testu a navrhuje optimalizovaný postup pˇri nˇemˇz je dosaˇzena maximáln´ı pˇresnost testu a jeho reprodukovatelnost. Optimalizovaný AP-test je pak vyuˇzit pˇr´ımo ke studiu zmˇen vitality kvasnic opakovanˇe nasazených v pivovarském provozu. Kvasnice jsou pˇri pouˇzit´ı v pr˚ umyslovém provozu vystavovány ˇradˇe stresových faktor˚ u, které mohou ovlivnit jejich vitalitu a t´ım i výsledek celé výroby. Studium vlivu stresových faktor˚ u je pak potˇreba zejména pˇri zavádˇen´ı nových výrobn´ıch technologi´ı. Z tˇechto d˚ uvod˚ u je v této práci pomoc´ı optimalizovaného AP-testu studován vliv osmotického tlaku na vitalitu kvasnic. Pro lepˇs´ı pochopen´ı toho, jak se na výsledc´ıch AP-testu odráˇz´ı zmˇeny v metabolismu bunˇek, byla provedena pˇredbˇeˇzná studie vlivu nˇekterých inhibitor˚ u metabolických proces˚ u. Bˇeˇzná metodika mˇeˇren´ı pH kvasniˇcných suspenz´ı vyuˇz´ıvá klasickou elektrochemickou sondu, která je v pˇr´ımém kontaktu se vzorkem. Pˇr´ımý kontakt s sebou nese nˇekteré nevýhody (napˇr. moˇznost kontaminace, objemové omezen´ı, reakˇcn´ı rychlost elektrody, problémy pˇri manipulaci), které by bylo moˇzné zcela ˇci ˇcásteˇcnˇe eliminovat pˇri nekontaktn´ım mˇeˇren´ı pH s pouˇzit´ım fotometrických metod.

6

Druhá ˇcást diplomové práce je proto vˇenována ˇreˇsen´ı problematiky bezkontaktn´ıho mˇeˇren´ı pH s ohledem na konkrétn´ı podm´ınky AP-testu (obor pH, vodné prostˇred´ı, kvasniˇcná suspenze, rozptyl svˇetla na buˇ nkách). Je popsán postup nalezen´ı vhodného pH indikátoru a jeho spektráln´ı charakterizace, modelovˇe je studován vliv rozptyluj´ıc´ıho prostˇred´ı na fotometrická mˇeˇren´ı a je navrˇzen postup pro zpracován´ı spektráln´ıch dat k urˇcen´ı pH.

7

Kapitola 1 Teorie 1.1

Kvasinky

Kvasinky jsou jednobunˇeˇcné eukaryotn´ı mikroorganismy patˇr´ıc´ı mezi vyˇsˇs´ı houby (eumycota). Jakoˇzto nejniˇzˇs´ı eukaryotn´ı organismus jsou kvasinky modelovým organismem. Netvoˇr´ı vlastn´ı taxonomickou skupinu, proto nen´ı moˇzné je jednotnˇe definovat. Rozmnoˇzuj´ı se pˇreváˇznˇe vegetativnˇe a to puˇcen´ım nebo pˇrehrádeˇcným dˇelen´ım. Jsou schopny se mnoˇzit také pohlavnˇe pomoc´ı spór. Nevytváˇr´ı pravé myceliárn´ı struktury, ale jsou schopny vytváˇret pseudomycelium napodobuj´ıc´ı kolonie jednobunˇeˇcných organism˚ u, ve kterém se rozmnoˇzuj´ı pˇrehrádeˇcným dˇelen´ım. Tvar a velikost kvasniˇcné buˇ nky se liˇs´ı druh od druhu a jsou ovlivnˇeny stáˇr´ım a ploiditou, pro Saccharomyces cerevisiae je typický tvar rotaˇcn´ıho elipsoidu o pr˚ umˇeru 5 − 10 µm (obrázek 1.1). Celkovˇe existuje 457 druh˚ u ze 78 rod˚ u kvasinek. Nejstarˇs´ı dokumentac´ı fermentace pomoc´ı kvasinek jsou nálezy nádobek na v´ıno pocházej´ıc´ı z neolitické kuchynˇe v Hajji Firuz Tepe (8500 − 4000 let pˇr. n. l.) na u ´ zem´ı dneˇsn´ıho Íránu. Výrobu alkoholických nápoj˚ u z nakl´ıˇceného obil´ı znali jiˇz ve starém Babylonu 6000 − 4000 let pˇr. n. l. Prvn´ı pozorován´ı kvasinek pomoc´ı primitivn´ıho mikroskopu provedl Anton van Leeuwenhoek (1680), popsal je jako malé kuliˇcky v pivu. Roku 1837 popsal Theodor Schwann v kvas´ıc´ı tekutinˇe rozmnoˇzuj´ıc´ı se kvasinku a popsal ji jako cukernou houbu (ˇrecky saccharos=cukr a mykes=houba). Prvn´ı izolace kvasinek probˇehla v letech 1883 − 1890 z piva Emilem Christianem Hansenem a z v´ına M¨ ullerem - Thurgauem. Dnes se vyuˇz´ıvaj´ı kvasinky zejména v biotechnologi´ıch, potravináˇrstv´ı k výrobˇe pekaˇrského droˇzd´ı, mléˇcných výrobk˚ u a v kvasném pr˚ umyslu k výrobˇe piva, lihu a v´ına. Kvasinky mohou p˚ usobit i negativnˇe, napˇr. kontaminac´ı prostˇred´ı a nˇekteré druhy patogenn´ıch kvasinek (Candida albicans nebo Cryptococcus neoformans) zp˚ usobuj´ı onemocnˇen´ı. Struktura kvasinkové buˇ nky jakoˇzto eukaryotn´ıho organismu je typická. V dalˇs´ıch odstavc´ıch tedy budou zm´ınˇeny pouze ˇcásti pˇr´ımo u ´ˇcastn´ıc´ı se metabolismu buˇ nky. Nejprve se vˇsak pozastavme nad vlastnostmi pivovarských kmen˚ u kvasnic, které jsou vyuˇz´ıvané pˇri vˇsech mˇeˇren´ıch v této práci.

8

Obrázek 1.1: Sn´ımek kvasinek Saccharomyces cerevisiae poˇr´ızený elektronovým mikroskopem. Pˇrevzato z: http://www.bath.ac.uk/bio-sci/research/profiles/ wheals-a.html Pivovarsk´ e kvasinky Zvláˇstn´ı význam maj´ı jiˇz po stalet´ı pivovarské kvasinky. Jedná se o speciálnˇe vyˇslechtˇené kmeny Saccharomyces cerevisiae, které maj´ı specifické vlastnosti: • kvas´ı pˇri n´ızké teplotˇe: 5 − 10 ◦ C • maj´ı vysokou toleranci k ethanolu, 12 % letáln´ı hranice • v metabolismu sacharid˚ u pˇrevládá kvaˇsen´ı z 85 − 90 %1 • autolyzuj´ı - jsou schopny ˇr´ızeného sebezniˇcen´ı • disponuj´ı konstitutivn´ım pˇrenaˇseˇcem pro maltosu • aglutinace a sedimentace: kvasnice se po zkvaˇsen´ı média usazuj´ı na dnˇe kvasné nádoby; tato vlastnost je typická pro kvasnice spodn´ıho kvaˇsen´ı, které se pouˇz´ıvaj´ı pro výrobu piva plzeˇ nského typu Pro uvedené vlastnosti jsou tyto kmeny kvasnic zvláˇstˇe výhodné pro výrobu piva. Mezi dalˇs´ı vlastnosti, nejen pivovarských kvasnic, ale obecnˇe bunˇek vybavených plazmatickou membránou patˇr´ı schopnost odolávat osmotickému tlaku. Tato schopnost je d˚ uleˇzitá pˇri zmˇenách vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı, takˇze napˇr. pˇri výrobˇe piva kvaˇsen´ım v cylindricko-kónických tanc´ıch. Vlivem osmotického tlaku na vitalitu bunˇek se zabývá i tato práce. O tom, co to osmotické jevy jsou, pojednávaj´ı dalˇs´ı ˇrádky. 1

Tato pˇrevaha anaerobn´ıho metabolismu plat´ı pro tzv. spodn´ı pivovarské kvasnice, svrchn´ı pivovarské kvas´ı z 50 − 60 %.

9

1.1.1

Osm´ oza

Osmóza je difuze rozpouˇstˇedla pˇres polopropustnou membránu (v pˇr´ıpadˇe bunˇek pˇres plazmatickou membránu) z prostˇred´ı o n´ızké koncentraci do prostˇred´ı o vysoké koncentraci rozpuˇstˇené látky, ˇcili proti koncentraˇcn´ımu gradientu. Principem je, ˇze rozpouˇstˇedlo (napˇr. voda) membránou bez odporu projde, rozpuˇstˇená látka nikoli. Jedná se o fyzikáln´ı proces pˇri nˇemˇz pohybem rozpouˇstˇedla nen´ı spotˇrebovávána energie. Osmotické jevy jsou významnou hybnou silou mnoha biologických proces˚ u, ˇrada biologických membrán je semipermeabiln´ıch. Napˇr. napˇet´ı udrˇzuj´ıc´ı tvar buˇ nky je z velké ˇcásti zp˚ usobeno právˇe osmózou. Z pohledu buˇ nky um´ıstˇené do vodného roztoku m˚ uˇzeme definovat 3 typy prostˇred´ı: • hypotonické – velmi zˇredˇený roztok, s koncentrac´ı vody vyˇsˇs´ı neˇz v buˇ nkách • isotonické – roztok se stejnou koncentrac´ı vody jako v buˇ nkách • hypertonické – koncentrovaný roztok, koncentrace vody uvnitˇr bunˇek vyˇsˇs´ı neˇz vnˇe Na kaˇzdé z tˇechto prostˇred´ı buˇ nka reaguje jinak, v hypotonickém v d˚ usledku osmózy zaˇcne pˇrij´ımat vodu, zaˇcne se zvˇetˇsovat a je nucena vyrovnat zvýˇsené vnitˇrn´ı pnut´ı zp˚ usobené zvˇetˇsen´ım objemu, nen´ı-li toho schopna, m˚ uˇze doj´ıt k poruˇsen´ı jej´ı membrány. V hypertonickém prostˇred´ı buˇ nka naopak vodu ztrác´ı a zmenˇsuje sv˚ uj objem, to se m˚ uˇze negativnˇe projevit na pˇr´ıjmu ˇzivin. V isotonickém prostˇred´ı nedocház´ı k pˇresunu vody pˇres membránu, tud´ıˇz ani ke zmˇenˇe objemu buˇ nky. V hypertonickém a hypotonickém prostˇred´ı je tedy buˇ nka vystavena tzv. osmotickému tlaku, ten je definován jako s´ıla p˚ usob´ıc´ı na jednotku plochy, která zabrán´ı pr˚ uchodu vody pˇres membránu. Osmotický tlak je závislý pouze na molárn´ı koncentraci rozpouˇstˇené látky. Dojde-li k náhlé zmˇenˇe koncentrace roztoku s buˇ nkami, vystav´ıme je t´ımto tzv. osmotickému stresu, ˇci osmotickému ˇsoku. Kaˇzdý organizmus má vlastn´ı mechanizmus, jak se vyrovnat s touto situac´ı, která se projevuje fyziologickými, biochemickými a dalˇs´ımi zmˇenami [4]. V souvislosti s osmózou jsou definovány veliˇciny osmolarita a osmolalita. • Osmolarita - je definována jako mnoˇzstv´ı mol˚ u rozpuˇstˇené látky na litr roztoku. • Osmolalita - je definována jako mnoˇzstv´ı mol˚ u rozpuˇstˇené látky na kilogram rozpouˇstˇedla. • Osmol (Osm) - je jednotka, která je u ´ mˇerná poˇctu mol˚ u osmoticky aktivn´ı látky v roztoku Osmotické jevy maj´ı velký vliv na fyziologický stav buˇ nky. Jejich konkrétn´ı projev na vitalitˇe bunˇek bude ovˇeˇren v kapitole Vyuˇzit´ı AP-testu (viz stránka 40). Dále jiˇz k metabolismu buˇ nky, který hraje významnou roli pˇri stanoven´ı vitality pomoc´ı AP-testu. 10

1.2

Metabolismus kvasinek

D˚ usledkem metabolismu kvasinek je biosyntéza látek (sloˇzky buˇ nky a obal), jedná se o asimilaˇcn´ı proces (anabolismus) a k jeho realizaci je potˇreba dodat energii - docház´ı k endergonickým reakc´ım. Dalˇs´ım d˚ usledkem metabolismu je rozklad látek, coˇz je disimilaˇcn´ı proces (katabolismus) a docház´ı pˇri nˇem k uvolˇ nován´ı energie - exergonické reakce.

1.2.1

Transport l´ atek

Pro realizaci základn´ıho metabolismu je d˚ uleˇzitý vstup a výstup látek do a z buˇ nky. Ten ovlivˇ nuje bunˇeˇcná stˇena, která je v r˚ uzných fáz´ıch r˚ ustu r˚ uznˇe propustná, pro mladé buˇ nky je tenká a propustná, ve stacionárn´ı fázi propustnost klesá. Pˇri pr˚ uchodu bunˇeˇcnou stˇenou také závis´ı na velikosti, symetrii a náboji dané molekuly, stˇena samotná má záporný náboj. D˚ uleˇzitou roli pˇri transportu pak hraje cytoplasmatická membrána. Z hlediska energetické výmˇeny lze transport membránou rozdˇelit na pasivn´ı a aktivn´ı, z hlediska mechanizmu pak na: prostou difuzi, pˇrenaˇseˇcový pˇrenos, skupinovou translokaci a pinocytosu. Prost´ a difuze Prostá difuze je neselektivn´ı, nezávislá na teplotˇe, metabolitech a mutac´ıch. Docház´ı k n´ı prostˇrednictv´ım hydrofiln´ıch pór˚ u a lipidn´ıch oblast´ı v membránˇe. Do kvasinkových bunˇek se prostou difuz´ı dostávaj´ı napˇr.: H2 O, mastné kyseliny, ethanol, organické kyseliny (lipidy), glucerol, laktát a ribóza. Pˇ renaˇ seˇ cov´ y pˇ renos Mechanizmem je pˇrechodná reakce substrátu s nˇekterou membránovou sloˇzkou (nosiˇcem ˇci pˇrenaˇseˇcem), d˚ usledkem je tzv. usnadnˇená difuze nebo aktivn´ı transport. • usnadnˇená difuze: Pˇri tomto pˇrenosu látek nen´ı spotˇrebovávána energie, ale je nutná pˇr´ıtomnost nosiˇce. Pˇri usnadnˇené difuzi záleˇz´ı na koncentraˇcn´ım gradientu, m˚ uˇze k n´ı docházet obˇema smˇery. T´ımto mechanizmem se do buˇ nky kvasinky dostává napˇr. glukosa ˇci galaktóza. • aktivn´ı transport: Existuj´ı dva typy aktivn´ıho transportu, primárn´ı a sekundárn´ı (viz obrázek 1.2). Primárn´ı vyˇzaduje energii, ˇcili b´ yvá spˇraˇzen s exergonickou reakc´ı (napˇr. ˇstˇepen´ı ATP, oxidace substrátu, pohlcen´ı fotonu). Pˇri sekundárn´ım transportu ˇcástice je vyuˇz´ıváno spˇraˇzen´ı s disipac´ı energie gradientu elektrochemického potenciálu jiné ˇcástice (H+ nebo Na+ ). Rozliˇsujeme symport - docház´ı k transportu obou ˇcástic stejným smˇerem a antiport - ˇcástice jsou transportovány v opaˇcných smˇerech (viz obrázek 1.3).

11

Obrázek 1.2: Schéma primárn´ıho a sekundárn´ıho aktivn´ıho transportu eukaryotické buˇ nky. Pˇrevzato z: http://gvm.vm.cz/vyuka/bio pojmy/figures/transport aktivni.01.jpg

Obrázek 1.3: Schéma sekundárn´ıho aktivn´ıho transportu ˇcástic pˇres membránu. Pˇrevzato z: http://gvm.vm.cz/vyuka/bio pojmy/figures/antiport.01.jpg

12

Obrázek 1.4: Strukturn´ı vzorec α-D-glukosy v Haworthovˇe projekci. Skupinov´ a translokace T´ımto mechanizmem docház´ı k chemické pˇremˇenˇe substrát˚ u na produkty, které se vyskytuj´ı výluˇcnˇe na druhé stranˇe membrány. Koncentrace substrátu uvnitˇr buˇ nky je vyˇsˇs´ı neˇz koncentrace jeho volné formy ve vnˇejˇs´ım prostˇred´ı. Pinocytosa Jedná se o endocytický proces, pˇri nˇemˇz je do buˇ nky vnesen roztok s rozpuˇstˇenými látkami. Pˇrenos je tedy kvantovaný a velikost kvant je dána velikost´ı pˇrenáˇsených váˇck˚ u.

1.2.2

Metabolismus sacharid˚ u

Metabolismus sacharid˚ u jakoˇzto hlavn´ıho zdroje energie a uhl´ıku prob´ıhá ve dvou fáz´ıch. V prvn´ı fázi je cukr transportován do buˇ nky, ve druhé nastupuje urˇcitou metabolickou dráhu - volba je závislá na pˇr´ıstupu kysl´ıku, coˇz je typické pro Saccharomyces cerevisiae, která je tzv. fakultativn´ım anaerobem. V nepˇr´ıtomnosti kysl´ıku docház´ı ke zkvaˇsen´ı cukr˚ u, v pˇr´ıtomnosti kysl´ıku se spouˇst´ı respiraˇcn´ı procesy. Plat´ı, ˇze dýchán´ı má vyˇsˇs´ı energetický výtˇeˇzek (cca 40 %), avˇsak je zhruba 100× pomalejˇs´ı neˇz kvaˇsen´ı (´ uˇcinnost cca 2 %). O tom, která z metabolických drah bude nastoupena pˇredevˇs´ım rozhoduj´ı genetické dispozice bunˇek (mnoˇzstv´ı enzymu pyruvát-dehydrogenasy resp. pyruvát-dekarboxylasy) a ˇzivotn´ı podm´ınky (zejména pˇr´ısun kysl´ıku). Transport sacharid˚ u do buˇ nky Mechanismus pˇrenosu látek pˇres cytoplazmatickou membránu byl objasnˇen výˇse. Kaˇzdý ze sacharid˚ u je transportován pomoc´ı charakteristického pˇrenaˇseˇce. My se zamˇeˇr´ıme pouze na pˇrenos glukosy a maltosy. Existuj´ı dva druhy pˇrenaˇseˇc˚ u: • konstitutivn´ı: takový pˇrenaˇseˇc je pˇr´ıtomen v cytoplasmatické membránˇe permanentnˇe • alternativn´ı: pˇrenaˇseˇc je syntetizován teprve je-li ho potˇreba

13

Obrázek 1.5: Strukturn´ı vzorec α-D-maltosy v Haworthovˇe projekci. Glukosa (viz obrázek 1.4) do buˇ nky proniká usnadnˇenou difuz´ı (plat´ı pro Saccharomyces cerevisiae) a ˇcásteˇcnˇe také prostou difuz´ı (nˇekteré druhy kvasinek, napˇr. Rhodotorula nebo Candida transportuj´ı glukosu aktivnˇe). Glukózový pˇrenaˇseˇc je konstitutivn´ı a pˇrenáˇs´ı také fruktosu a xylosu. Maltosa (viz obrázek 1.5) je disacharid sloˇzený ze dvou glukos. Významná je pˇredevˇs´ım v pivovarnictv´ı, jelikoˇz tvoˇr´ı vˇetˇsinu zkvasitelného obsahu mladiny. Pˇrenáˇsena do bunˇek je pomoc´ı aktivn´ıho symportu se stechiometri´ı 1 : 1 s H+ . Pˇrenos umoˇzn ˇ uje pˇrenaˇseˇc maltopermeasa, která je u pr˚ umyslových kmen˚ u konstitutivn´ım pˇrenaˇseˇcem (obecnˇe se jedná o alternativn´ı pˇrenaˇseˇc). Maltopermeasa pˇrenáˇs´ı kromˇe maltosy také sacharosu a maltotriosu. Hydrolýza maltosy na glukosu prob´ıhá pomoc´ı enzymu maltasy. Syntéza tohoto vnitrobunˇeˇcného enzymu je indukovaná, závis´ı na pˇr´ıtomnosti maltosy v médiu, a m˚ uˇze být reprimována pˇr´ıtomnost´ı glukosy. Metabolick´ a dr´ aha glukosy Metabolické dráhy pro r˚ uzné druhy sacharid˚ u se mohou odliˇsovat, nicménˇe základn´ı dráha je pro vˇsechny stejná. My se zamˇeˇr´ıme na metabolické zpracován´ı konkrétn´ıho monosacharidu - glukosy, schéma jej´ıho zpracován´ı je na obrázku 1.6. Základn´ı dráha cukr˚ u je tzv. glykolytická dráha, nebo také glykolýza, nebo EmbdenMeyerhof-Parnasovo schéma. Jedná se o sled deseti reakc´ı, do prvn´ı vstupuje jedna molekula glukosy a koneˇcným produktem jsou dvˇe molekuly pyruvátu. Glukosa je po vstupu do buˇ nky fosforylována hexokinasou (minoritnˇe glukokinasou) na glukosu-6-fosfát. Tento d˚ uleˇzitý meziprodukt (Robinson˚ uv ester) poj´ı tˇri vˇetve metabolismu: • syntetická: vede k syntéze oligosacharid˚ u (glukan, glykogen, manan, atd.) • pentosa-fosfátový cyklus: výsledkem je produkce NADPH (vyuˇzije se v anabolických dˇej´ıch, zejména pˇri syntéze mastných kyselin a steroidn´ıch látek) a pentos (napˇr. ribosy) • pokraˇcován´ı glykolytické: glukosa-6-fosfát je pˇremˇenˇena na fruktosa-6-fosfát a ta (pomoc´ı fosfofruktokinasy) na fruktosa-1,6-bisfosfát a ten v dalˇs´ıch reakc´ıch postupnˇe pˇremˇenˇen na koneˇcný produkt této vˇetve: kyselinu pyrohroznovou neboli pyruvát

14

Obrázek 1.6: Schematické zpracován´ı glukosy v eukaryotické buˇ nce vˇcetnˇe následovného anaerobn´ıho resp. aerobn´ıho zpracován´ı pyruvátu. Produktem glykolýzy je tedy pyruvát. Tato významná slouˇcenina je výchoz´ı pro dalˇs´ı tˇri metabolické smˇery, které spouˇst´ı tˇri významné enzymy: • fosfoenolpyruvát-karboxylasa: dráha spouˇstˇená t´ımto enzymem se nazývá glukoneogeneze a jedná se v podstatˇe o obrácenou glykolýzu (koneˇcným produktem je glukosa) • pyruvát-dekarboxylasa: tento enzym spouˇst´ı za anaerobn´ıch podm´ınek dráhu, která vede k tvorbˇe aldehydu, popˇr´ıpadˇe ethanolu - jedná se o proces kvaˇsen´ı • pyruvát-dehydrogenasa: spouˇst´ı pˇremˇenu pyruvátu na acetyl-CoA a jeho vstup do tzv. Krebsova cyklu (citr´ atového cyklu) v mitochondri´ıch - jedná se o proces dýchán´ı

15

Tabulka 1.1: Shrnut´ı energetického zisku z jedné molekuly glukosy. Vycház´ı z pˇredpokladu, ˇze z (NADH + H+ ) lze z´ıskat 3 × ATP a z FADH2 lze z´ıskat 2 × ATP. Z jedné molekuly glukosy tedy lze z´ıskat 38 molekul ATP pˇri zpracovan´ı glykolýzou a následnou oxidativn´ı fosforylac´ı; oproti celkovému zisku dvou molekul ATP pˇri odbourán´ı glukosy glykolýzou a následným alkoholovým kvaˇsen´ım. metabolický proces energetický zisk glykolýza 2 × ATP + 2 × (NADH + H+ ) oxidace pyruvátu 2 × (NADH + H+ ) citrátový cyklus 2 × [3 × (NADH + H+ ) + 1 × FADH2 + 1 × ATP]

⇒ 8 × ATP ⇒ 6 × ATP ⇒ 24 × ATP

Energetick´ a bilance zpracov´ an´ı glukosy Pˇr´ı odbouráván´ı glukosy se uvolˇ nuje velké mnoˇzstv´ı energie. Energetický zisk je shrnut v tabulce 1.1. Dalˇs´ım efektem, je uvolˇ nován´ı mnoˇzstv´ı H+ iont˚ u (taktéˇz tabulka 1.1), coˇz zp˚ usobuje vnitˇrn´ı okyselen´ı buˇ nky. Následkem je aktivace membránových H+ -ATPas, které acidifikuj´ı vnˇejˇs´ı prostˇred´ı. Podrobnˇeji o funkci tˇechto pump v dalˇs´ım textu. Nyn´ı následuje vymezen´ı pojm˚ u viability a vitality, které jsou pouˇz´ıvány v této práci, a jejich metod mˇeˇren´ı.

1.3

Vitalita a viabilita

Vitalita Pojem vitalita popisuje kvasnou kapacitu bunˇek a nˇekdy se oznaˇcuje jako kvasná mohutnost. Tato vlastnost závis´ı na fyziologickém stavu a biochemických podm´ınkách uvnitˇr i vnˇe bunˇek. Je tedy ovlivnˇena stáˇr´ım ˇci stresovými faktory. Mˇeˇren´ı vitality je oproti mˇeˇren´ı viability komplikovanˇejˇs´ı a m˚ uˇze b´ yt dlouhodobˇe nároˇcné.

Viabilita Pojem viabilita je definován jako schopnost bunˇek se mnoˇzit a vykazovat metabolickou aktivitu, coˇz jedn´ım slovem m˚ uˇzeme vyjádˇrit jako ˇzivotaschopnost. Tato vlastnost se dobˇre urˇcuje pomoc´ı fotometrických metod.

1.3.1

Mˇ eˇ ren´ı viability

Metody zaloˇ zen´ e na reprodukˇ cn´ı schopnosti Tyto metody jsou zaloˇzené na schopnosti bunˇek tvoˇrit kolonie. Plotnové výsevy na agaru jsou výhodné t´ım, ˇze zároveˇ n stanovuj´ı proliferaci bunˇek. Nevýhodné jsou naopak v tom, ˇze mohou být zkresleny u silnˇe flokuluj´ıc´ıch bunˇek a pˇredevˇs´ım jsou ˇcasovˇe nároˇcné (2 − 3 dny). Délka testu lze znaˇcnˇe zredukovat pouˇzit´ım modifikované metody s mikroskopickými podloˇzn´ımi skl´ıˇcky. 16

Metody zaloˇ zen´ e na barven´ı Viabilita urˇcená touto metodou neodpov´ıdá pˇr´ımo schopnosti bunˇek se mnoˇzit, ale permeabilitˇe membrány a aktivitˇe intracelulárn´ıch enzym˚ u. Tyto techniky jsou zaloˇzeny na schopnosti membrány zabránit pronikan´ı barviva do cytoplazmy a naopak neschopnosti mrtvých bunˇek tomuto procesu zabránit. Rozd´ıly v zabarven´ı bunˇek se projev´ı t´ım, ˇze barvivo, které projde membránou do buˇ nky je chemicky zmˇenˇeno metabolickými procesy v cytoplazmˇe a ztrat´ı barvu (methylenová modˇr), nebo nebarevná látka je uvnitˇr buˇ nky zmˇenˇena na barevnou (fluorescein diacetát). Urˇcen´ı viability pak spoˇc´ıvá ve spoˇc´ıtán´ı obarvených ˇci neobarvených bunˇek. Barevné rozd´ıly lze pozorovat dvˇema zp˚ usoby: optickým mikroskopem a fluorescenˇcn´ım mikroskopem. Pozorován´ı optickým mikroskopem: Bˇehem let bylo vyzkouˇseno mnoho barviv, napˇr.: erythrosin, rhodamin B, eosin Y a methylenová modˇr, která je ˇsiroce nejpouˇz´ıvanˇejˇs´ı (jiˇz od 20. let 19. stolet´ı) a doporuˇcovaná varianta. Methylenová modˇr je vyuˇz´ıvána ke stanoven´ı viability v pivovarnickém pr˚ umyslu. Takto urˇcená viabilita dobˇre odpov´ıdá stanoven´ı jinými metodami (výsevov´ y test), pˇri viabilitˇe nad 90 %. Pˇri niˇzˇs´ıch hodnotách viability se jej´ı urˇcen´ı m˚ uˇze liˇsit aˇz o 30 − 50 %. Dalˇs´ı nevýhodou této metody je subjektivn´ı chyba pozorovatele. Pozorován´ı fluorescenˇcn´ım mikroskopem: Bˇehem let bylo objeveno mnoho opticky aktivn´ıch látek, ty jsou dnes vyuˇz´ıvány nejen k mˇeˇren´ı viability, ale také k urˇcen´ı ˇ vitality. Rada z nich vykazuje fluorescenci a to na r˚ uzných vlnových délkách. Mechanizmy fluorescenˇcn´ıho barven´ı mohou být rozdˇeleny do dvou kategori´ı: (a) látka procház´ı membránou a je metabolicky aktivn´ı látkou chemicky pˇremˇenˇena na produkt, který vykazuje fluorescenci; (b) fluorescenˇcn´ı barvivo procház´ı na základˇe membránového potenciálu do cytoplazmy. Fluorescenˇcn´ım barvivem doporuˇcovaným American Society of Brewing Chemists je 1-anilin-8-naftalen sulfonát hoˇreˇcnatý (Mg-ANS). Tato látka se po pr˚ uchodu buˇ nkou naváˇze na jeden z cytoplazmatick´ ych protein˚ u a stane se fluorescenˇcn´ı. Výsledky z´ıskané touto metodou jsou pˇresné i pod hranic´ı viability 90 % oproti barven´ı methylenovou modˇr´ı. Metody zaloˇ zen´ e na stanoven´ı obsahu d˚ uleˇ zit´ ych komponent Stanoven´ım obsahu d˚ uleˇzitých látek v tˇele buˇ nky lze urˇcit nejen viabilitu, ale také vitalitu kvasnic. Mezi nepostradatelné látky v tˇele ˇzivých bunˇek patˇr´ı ATP, jakoˇzto základn´ı energetická jednotka a NADH, jakoˇzto redukˇcn´ı ˇcinidlo. Obˇe tyto látky lze ve vzorku spektroskopicky detekovat.

1.3.2

Mˇ eˇ ren´ı vitality

Metody zaloˇ zen´ e na stanoven´ı obsahu d˚ uleˇ zit´ ych komponent Pˇredpokladem této metody pˇri pouˇzit´ı k mˇeˇren´ı vitality je, ˇze indikované látky podstatnˇe ovlivˇ nuj´ı fermentaci kvasnic. Jejich zastoupen´ı v buˇ nce vˇsak závis´ı i na sloˇzen´ı ˇzivného média. Mezi zm´ınˇené d˚ uleˇzité látky patˇr´ı glykogen - zásobn´ı polysacharid, nenasycené mastné kyseliny a steroly nebo ATP - základn´ı energetická jednotka.

17

Stanoven´ı aktivity d˚ uleˇ zit´ ych enzym˚ u Obsah enzym˚ u lze dobˇre a pˇresnˇe stanovit spektroskopickými metodami. Takto urˇcené výsledky také velmi dobˇre odpov´ıdaj´ı fyziologickému stavu bunˇek. Mezi zjiˇst’ované enzymy patˇr´ı: maltasa - ˇstˇep´ı maltosu, pyruvát-dehydrogenasa - katalyzuje pˇremˇenu pyruvátu na acetyl-CoA, pyruvát-dekarboxylasa - katalyzuje pˇremˇenu pyruvátu na acetyl-A, alkohol-dehydrogenasa - katalyzuje pˇremˇenu acetaldehydu na ethanol. Metabolick´ a rychlost bunˇ ek Jedná se o klasické mˇeˇren´ı produkce CO2 , ˇci spotˇreby O2 . Tyto faktory jsou v pˇr´ımé korelaci s fermentativn´ı schopnost´ı bunˇek, nevypov´ıdaj´ı vˇsak nic o r˚ ustu bunˇek. Energetick´ y stav bunˇ ek Tyto metody jsou zaloˇzeny na vztahu mezi energizac´ı bunˇeˇcné membrány, procesy na membránˇe prob´ıhaj´ıc´ımi a celkovým fyziologickým stavem a metabolickou kompetenc´ı bunˇek. Mezi typické zástupce této metody mˇeˇren´ı vitality patˇr´ı test acidifikaˇcn´ı schopnosti (AP-test nebo APT) a jeho pozdˇejˇs´ı modifikace: CAP a ICP.

1.3.3

Test acidifikaˇ cn´ı schopnosti

Poslednˇe jmenovaná metoda mˇeˇren´ı vitality, konkrétnˇe AP-test, je vyuˇzita v této práci a proto si nyn´ı vysvˇetleme, na jakém principu funguje. Kvasinkové buˇ nky je moˇzné vystavit nejr˚ uznˇejˇs´ım stimul˚ um: pˇridán´ı substrátu nebo soli (napˇr. KCl), okysliˇcován´ı média v nepˇr´ıtomnosti substrátu. Základn´ı odezvou na tyto stimuly je okyselen´ı vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı. Test pro mˇeˇren´ı acidifikaˇcn´ı s´ıly (acidification power - AP) vyvinutý Miroslavou Opekarovou a Karlem Siglerem [10] a [14] je dobˇre pouˇzitelný pro pˇredpovˇed’ fermentaˇcn´ı potence násadn´ıch kvasnic v následuj´ıc´ı fermentaci na základˇe znalosti ˇrady membránových pochod˚ u prob´ıhaj´ıc´ıch v kvasinkách metabolizuj´ıc´ıch endogenn´ı i exogenn´ı substráty. Tyto membránové pˇrechody, projevuj´ıc´ı se poklesem pH vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı, zahrnuj´ı ˇcinnost H+ -ATPasy, výstup ˇrady slabých kyselin vznikaj´ıc´ıch bˇehem metabolických pochod˚ u a transmembránové pohyby iont˚ u. Principem AP-testu je mˇeˇren´ı zmˇen vnˇejˇs´ıho pH po pˇridán´ı vhodného substrátu. Odezva na pˇ r´ıtomnost/nepˇ r´ıtomnost substr´ atu v mediu Substráty pouˇz´ıvané pro acidifikaˇcn´ı testy kvasinek Saccharomyces cerevisiae jsou: glukosa, fruktosa, manosa, sacharosa, galaktosa, maltosa (k jej´ımu transportu do bunˇek docház´ı H+ -symportem a m˚ uˇze tedy zp˚ usobit alkalizaci vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı) a ethanol v pˇr´ıpadˇe provzduˇsnˇené suspenze. Asi nejˇcastˇeji pouˇz´ıvaný substrát je glukosa, která bude také výhradnˇe pouˇz´ıvána v této práci. K saturaci docház´ı pˇri 20 − 30 mM koncentraci glukosy a pˇribliˇznˇe 10 mg mokré váhy kvasnic/ml. Saturaˇcn´ı kinetika glukosou

18

indukovaného protonového toku má dvˇe ˇcásti. Odpov´ıdaj´ı n´ızkoafinitn´ımu konstitutivn´ımu systému pˇrij´ımán´ı glukosy (usnadnˇená difuze) a vysokoafinitn´ımu systému spojenému s expres´ı glukokinasy (H+ -symport). Docház´ı-li k aerobn´ımu hladovˇen´ı kvasnic v destilované vodˇe po dobu delˇs´ı neˇz 4 − 5 h, zaˇcne se zvyˇsovat pH suspenze v d˚ usledku zámˇeny H+ (ve vnˇejˇs´ım prostˇred´ı) + za K (uvnitˇr bunˇek) a v d˚ usledku produkce NH3 v deaminaˇcn´ıch reakc´ıch. Rozsah acidifikace prudce klesá. Hladovˇen´ı je doprovázeno poklesem hladiny vnitrobunˇeˇcného ATP, m´ıry respirace a pufrovac´ı schopnosti suspenze. Podobnou oslabenou acidifikaˇcn´ı odezvu na pˇridán´ı substrátu m˚ uˇzeme pozorovat pˇri pouˇzit´ı nˇekterých inhibitor˚ u, zvýˇsené teplotˇe, kyselosti a dalˇs´ıch nepˇr´ıznivých faktorech. Acidifikaˇcn´ı odezva na pˇridán´ı substrátu tud´ıˇz m˚ uˇze být pouˇzita jako diagnostický nástroj pro stanoven´ı metabolické kompetence bunˇek napˇr´ıklad u pr˚ umyslových kultur. Acidifikace vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı po pˇridán´ı glukosy je zp˚ usobena vyluˇcován´ım CO2 a organických kyselin z buˇ nky, ˇcinnost´ı H+ -ATPasy v plasmatické membránˇe provázej´ıc´ı výmˇenu K+ a dalˇs´ıch iont˚ u. Po pˇridán´ı glukosy v pr˚ ubˇehu AP-testu docház´ı k pˇrechodnému masivn´ımu odbouráván´ı endogenn´ıch zdroj˚ u za vyuˇzit´ı respirace a tedy tvorbˇe CO2 . Bˇehem této fáze ˇcin´ı objem produkce 500 − 600 µl/mg mokré váhy za minutu. Tato produkce CO2 z mobilizovaných vnitˇrn´ıch zdroj˚ u rychle klesá v souvislosti s vyˇcerpán´ım kysl´ıku v suspenzi a prudkým nár˚ ustem pomˇeru NADH/NAD+ uvnitˇr bunˇek a je nahrazena produkc´ı CO2 z pˇridaného substrátu. Alkoholové kvaˇsen´ı 100 mmol glukosy vynese 140 − 190 mmol CO2 . Pˇritom obvyklá koncentrace CO2 ve vodˇe v rovnováze se vzduchem ˇcin´ı 3 · 10−5 mol/l. Spoleˇcnˇe s CO2 vzniklým z glukosy koncentrace CO2 v suspenzi m˚ uˇze vyˇsplhat na 1 − 2 mmol/l (pro 10 mg mokré váhy kvasnic/ml). Nen´ı pˇresnˇe známo, procház´ı-li oxid uhliˇcitý plasmatickou membránou ve formˇe CO2 ˇci HCO− enˇe propustnost kva3 , nicm´ − −8 −7 sinkové membrány ˇcin´ı 10 − 10 cm/s pro HCO3 a 0.3 − 0.6 cm/s pro CO2 . Nav´ıc kvasinkové buˇ nky obsahuj´ı anhydrasu, která m˚ uˇze katalyzovat rovnováhu CO2 /HCO− 3. Dalˇs´ım krokem po pˇridán´ı glukosy do suspenze je alkoholové kvaˇsen´ı, které vede k produkci: acetátu, butylenglykolu, acetoinu, acetaldehydu, glycerolu a sukcinátu. H+ -ATPasa Nejvýznamnˇeji k acidifikaci vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı pˇrisp´ıvá ˇcinnost kvasinkové H+ -ATPasy. Ta je ze dvou tˇretin zanoˇrena do plasmatické membrány bunˇek a patˇr´ı k ATPase typu E1 E2 ˇci P-typu, které pˇremist’uj´ı kationty pˇres plasmatické membrány zv´ıˇrec´ıch, rostlinných i bakteriáln´ıch bunˇek. Obsahuje rezidua pro navázán´ı ATP a enzymovou fosforylaci, která je závislá na navázán´ı transportovaného kationtu, jenˇz je typický pro daný druh ATPasy: H+ , Na+ nebo Ca2+ , zat´ımco zpˇet do cytoplasmy je vetˇsinou pˇremist’ován K+ . V ATPasách, které pumpuj´ı K+ do cytoplasmy, je K+ nezbytný pro hydrolýzu fosfoenzymu. Enzym alternuje mezi dvˇema hlavn´ımi stavy E1 a E2 a tvoˇr´ı pˇrechodný fosforylovaný intermediát, v kyselém prostˇred´ı stabiln´ı a v zásaditém labiln´ı β-aspartylfosfát. Jeho pˇremˇena je podstatná pro rychlost hydrolýzy ATP (20 − 60 mmol Pi /mg proteinu za minutu). V nepˇr´ıtomnosti nukleotidu je enzym pˇreváˇzné ve stavu E1 , hladina E2 pak nar˚ ustá bˇehem hydrolýzy ATP. Transport zahrnuje hydrolýzu jedné molekuly ATP 19

za souˇcasného vylouˇcen´ı jednoho H+ . Protony jsou vázány na E1 formu na vnitˇrn´ım membránovém povrchu a jsou uvolˇ novány z E2 formy na vnˇejˇs´ım povrchu. Pˇri absenci substrátu jsou vazebná m´ısta obou povrch˚ u vetˇsinou neprotonovaná a pumpa je v rovnováze. V okamˇziku acidifikace cytoplasmy vˇsak pumpa výraznˇe zrychl´ı svou ˇcinnost. Analogicky je pumpa spouˇstˇena pˇri intracelulárn´ı acidifikaci indukované ˇstˇepen´ım glukosy. Pumpa tedy zp˚ usob´ı sn´ıˇzen´ı extracelulárn´ıho pH, avˇsak v d˚ usledku nadbytku + H vnˇe buˇ nky docház´ı k obsazován´ı vazebných m´ıst na povrchu pumpy a k jej´ımu zpomalen´ı. Zásoba energie pro H+ -symport ˇzivin je jednou z fyziologických rol´ı ATPasy, jinou je jej´ı u ´ˇcast na regulaci bunˇeˇcného pH. Ke konci exponenciáln´ı fáze r˚ ustu Saccharomyces cerevisiae dvakrát aˇz tˇrikrát klesá aktivita jejich ATPas. Aktivita enzymu se liˇs´ı u bunˇek pˇestovaných na r˚ uzných cukrech v závislosti na zp˚ usobu, jakým jsou tyto cukry transportovány do buˇ nky. ATPasa je vratnˇe aktivována glukosou, maltosou, trehalosou a galaktosou. Tento proces je doprovázen nár˚ ustem fosforylace enzymu, zásaditým posunem v pH optimu a zvýˇsen´ım afinity k ATP [12].

1.3.4

Sc´ en´ aˇ r acidifikace

Pravdˇepodobný scénáˇr acidifikace po pˇridán´ı substrátu do media (konkrétnˇe glukosy) bude vypadat takto: 1. Glukosa je rychle pˇrij´ımána buˇ nkami a je fosforylována na membránˇe pˇr´ısluˇsnými kinásami (hexokinasa). Pˇri fosforylaci se uvolˇ nuj´ı protony, coˇz zp˚ usob´ı okamˇzitou vnitˇrn´ı acidifikaci. Pokles intracelulárn´ıho pH je nav´ıc podpoˇren akumulac´ı bikarbonátu pocházej´ıc´ıho z CO2 produkovaného z vnitˇrn´ıch energetických zdroj˚ u. Výsledná vnitˇrn´ı acidifikace m˚ uˇze zp˚ usobit otevˇren´ı iontových kanál˚ u v membránˇe, coˇz zp˚ usob´ı depolarizaci membrány. Rozsah této depolarizace závis´ı na hodnotˇe extracelulárn´ıho pH. 2. Následkem n´ızkého pHi , ˇci následkem zmˇen v hladinˇe cAMP uvnitˇr bunˇek, m˚ uˇze doj´ıt k uzavˇren´ı K+ -kanál˚ u v souladu se sniˇzuj´ıc´ım se membránovým potenciálem. 3. V d˚ usledku glukosou indukovaných reakc´ı je H+ -ATPasa fosforylována a jej´ı aktivita roste. Pˇrechodnˇe docház´ı k poklesu hladiny ATP uvnitˇr bunˇek (a nadbytku cAMP - fosforylace bˇehem glykolýzy), coˇz silnˇe stimuluje energetický metabolismus (bunˇeˇcné dýchán´ı). 4. Následná produkce CO2 sniˇzuje hyperpolarizaˇcn´ı efekt enzymu a spolu s u ´ nikem iont˚ u vede k nár˚ ustu ∆pH. 5. Nár˚ ust ∆pH je doprovázen pˇrij´ımán´ım K+ ; glukosa tedy aktivuje nejen H+ -ATPasu, ale i kvasinkový systém pˇr´ıjmu K+ . Pˇr´ıliv K+ iont˚ u do buˇ nky zp˚ usobuje, i pˇresto, ˇze je ˇcásteˇcnˇe kompenzován ˇcinnost´ı H+ -ATPasy, pomalou avˇsak stabiln´ı depolarizaci membrány a alkalizaci vnitˇrku buˇ nky (zejména v pˇr´ıpadech vysoké hladiny K+ vnˇe buˇ nky).

20

6. V d˚ usledku vyˇsˇs´ıho vnitˇrn´ıho pH buˇ nky pˇrestanou být K+ kanály blokovány a dojde k výstupu K+ iont˚ u ven z bunˇek. Tento K+ proud m˚ uˇze být kompenzován odtokem organických aniont˚ u, které se nahromadily v buˇ nkách. 7. Vyˇcerpán´ı glukosy postupnˇe zp˚ usobuje r˚ ust pH vnˇe buˇ nky (protoˇze ménˇe energie je dostupné pro H+ -ATPasu). Mnoˇzstv´ı extracelulárn´ıch organických kyselin z˚ ustává pˇri anaerobn´ıch podm´ınkách znaˇcné, pˇri aerobn´ıch jsou buˇ nkami pˇrij´ımány zpátky. Hlavn´ım rysem acidifikaˇcn´ıho scénáˇre je, ˇze otevˇren´ı iontových kanál˚ u nezáleˇz´ı pouze na membránovém potenciálu, ale i na pHi (nebo mnoˇzstv´ı cAMP). Zmˇeny v pHi pak závis´ı na: • koncentraci glukosy • extracelulárn´ı koncentraci K+ a pufrovac´ı kapacitˇe • hustotˇe suspenze.

1.3.5

Acidifikace bez substr´ atu

V tomto pˇr´ıpadˇe hraje velkou roli mnoˇzstv´ı kysl´ıku v médiu. Okysliˇcen´ı kvasinkové suspenze bez substrátu znaˇcnˇe ovlivn´ı tok K+ iont˚ u do buˇ nky a mnoˇzstv´ı bunˇeˇcného ATP, jeho d˚ usledkem je pˇrechodná acidifikace média. Okysliˇcen´ı média lze provést probubláván´ım ˇci pˇridán´ım H2 O2 . Pˇridán´ı bunˇek Saccharomyces cerevisiae do vody zp˚ usob´ı rychlé vyˇcerpán´ı kysl´ıku, který je spotˇrebováván na vyuˇzit´ı energie z vnitˇrn´ıch zdroj˚ u. Schopnost bunˇek takto spontánnˇe acidifikovat v ˇcerstvém médiu bez substrátu je ovlivnˇena r˚ ustovou fáz´ı a klesá pokud byly buˇ nky vystaveny hladovˇen´ı (zásoby vnitˇrn´ıch zdroj˚ u jsou n´ızké). Spontánn´ı acidifikace nastává pouze pokud jsou buˇ nky schopny respirace. Reakce kvasinek stimuluj´ıc´ı endogenn´ı respiraci a produkci CO2 pˇri spontánn´ı acidifikaci je analogická jako reakce po pˇridán´ı substrátu do média. Stejnˇe jako substrátem indukovaná acidifikace, tak i spontánn´ı acidifikace je ovlivnˇena aerobn´ım hladovˇen´ım, které vede k tvorbˇe NH3 v deaminaˇcn´ıch reakc´ıch. Hladovˇen´ı má také za následek sn´ıˇzen´ı bunˇeˇcné hladiny ATP a pokles poˇcáteˇcn´ı rychlosti endogenn´ı respirace. Souˇcet spontánn´ı a substrátem indukované acidifikace, mˇeˇrený pˇri definovaných podm´ınkách, který odráˇz´ı schopnost bunˇek mobilizovat endogenn´ı substráty a utilizovat exogenn´ı, klesá lineárnˇe s pokraˇcuj´ıc´ım hladovˇen´ım. Provzduˇsnˇen´ı média m˚ uˇze aktivovat membránovou H+ -ATPasu. Pˇridán´ı H2 O2 do suspenze zp˚ usob´ı patrné zmˇeny ve vývoji hladiny kysl´ıku následované intenzivn´ı respirac´ı. M˚ uˇze doj´ıt k poklesu extracelulárn´ıho pH aˇz na 3.5. Tento proces tedy pravdˇepodobnˇe zahrnuje aktivaci H+ -ATPasy, jelikoˇz hodnoty pH pod 4.5 nen´ı moˇzné dosáhnout produkc´ı CO2 . Zároveˇ n pˇri tomto procesu nedocház´ı k vyluˇcován´ı organických kyselin z buˇ nky a docház´ı k pˇr´ıjmu K+ buˇ nkou.

21

Rozd´ıl v porovnán´ı s glukosou indukovanou acidifikac´ı je v tom, ˇze vypuzován´ı H+ se zdá být kompenzováno výhradnˇe pˇr´ıjmem K+ . Proto, klesne-li mnoˇzstv´ı K+ vnˇe buˇ nky pod jistou mez, peroxidem indukovaná acidifikace zp˚ usob´ı hyperpolarizaci membrány, coˇz zastav´ı dalˇs´ı vyluˇcován´ı H+ a endogenn´ı respiraci, aˇckoliv by zbylé mnoˇzstv´ı O2 v suspenzi staˇcilo k pokraˇcován´ı [12]. K acidifikaci bez substrátu neboli spontánn´ı acidifikaci tedy docház´ı po vloˇzen´ı vzorku kvasnic do destilované vody, coˇz se dˇeje v pr˚ ubˇehu AP-testu (viz n´ıˇze). Jak jiˇz bylo zm´ınˇeno, výsledek této acidifikace je ovlivnˇen pˇredevˇs´ım obsahem kysl´ıku v médiu a objemem endogenn´ıch energetických zdroj˚ u kvasinek. K vyˇcerpán´ı kysl´ıku v médiu a ustálen´ı pH docház´ı bˇehem prvn´ıch minut po vloˇzen´ı kvasnic do destilované vody. Na výsledek AP-testu nemá spontánn´ı acidifikace vliv.

1.3.6

Alternativy AP-testu

Metoda AP-testu proˇsla bˇehem let ˇradou modifikac´ı. Mˇeˇreným parametrem nemus´ı být extracelulárn´ı pH, ale pˇr´ımo titrimetricky zjiˇstˇené mnoˇzstv´ı proton˚ u vypuzených z bunˇek (cumulative acidification power - CAP ˇci titrated acidification power - TAP). Pˇri pouˇzit´ı této metody se postupuje stejnˇe jako pˇri AP-testu, nicménˇe zpracován´ı hodnot se liˇs´ı. Dalˇs´ı modifikac´ı AP-testu je tzv. vitáln´ı titrace. Mˇeˇr´ı se pˇri n´ı ˇcas nutný k dosaˇzen´ı hodnoty vnˇejˇs´ıho pH = 6.3 po alkalizaci suspenze na pH = 10. Kvasinky s lepˇs´ı metabolickou aktivitou sniˇzuj´ı pH rychleji. Pˇri testu nen´ı kvasinkám dodán ˇzádný vnˇejˇs´ı zdroj energie a proto docház´ı ke zmˇenˇe pH pouze za vyuˇzit´ı vnitˇrn´ıch zdroj˚ u energie. Výsledky tohoto testu se vˇsak neshoduj´ı s AP-testem na spodnˇe kvas´ıc´ıch kmenech [9]. Dalˇs´ı modifikac´ı AP-testu je tzv. ICP-test, kde je mˇeˇreno pˇr´ımo vnitrobunˇeˇcné pH pomoc´ı fluorescenˇcn´ıch barviv [6].

22

1.4

Bezkontaktn´ı mˇ eˇ ren´ı pH

Mˇeˇren´ım pH pomoc´ı elektrochemických elektrod je v laboratorn´ıch i provozn´ıch podm´ınkách zvládnuto velice dobˇre a dosahuje vysoké pˇresnosti a reprodukovatelnosti. Pˇresto vˇsak s sebou nese problémy, které jsou spojené s vˇetˇsinou mˇeˇren´ı kontaktn´ı povahy. Mˇeˇren´ı pH pomoc´ı klasické elektrody má nˇekteré nevýhody: − elektrodu je nutné kalibrovat na mˇeˇrený rozsah pH a teplotu − mˇeˇren´ı je limitováno mnoˇzstv´ım vzorku resp. velikost´ı elektrody, mnoˇzstv´ı vzorku mus´ı být dostateˇcné pro ponoˇren´ı aktivn´ı ˇcásti elektrody − elektroda samotná m˚ uˇze se vzorkem interagovat (kontaminace) a ovlivnit tak mˇeˇren´ı − u ´ drˇzba elektrody (zanesená elektroda m˚ uˇze mˇeˇrit zkreslenˇe) − omezená reakˇcn´ı doba elektrod − hodnota pH je ovlivnˇena m´ıchán´ım vzorku Z tˇechto d˚ uvod˚ u je u ´ˇcelné nalezen´ı postup˚ u, které by dovolily mˇeˇren´ı pH sledovaných vzork˚ u bezkontaktn´ım zp˚ usobem. K tomu se pˇrirozenˇe nab´ız´ı vyuˇzit´ı nˇekteré z optických metod - tj. interakce svˇetelného záˇren´ı se vzorkem. Jedn´ım z c´ıl˚ u této práce bylo ovˇeˇrit moˇznosti bezkontaktn´ıho fotometrického mˇeˇren´ı pH vodných roztok˚ u zejména s ohledem na mˇeˇren´ı zakalen´ ych vzork˚ u a simultánn´ı sledován´ı v´ıce vzork˚ u. Tˇechto moˇznost´ı by pak mˇelo být vyuˇzito k bezkontaktn´ımu mˇeˇren´ı pH pˇri AP-testu, coˇz by pˇrineslo vyˇsˇs´ı efektivitu mˇeˇren´ı. Za t´ımto u ´ˇcelem bylo nutné vybrat vhodný pH indikátor s ohledem na rozsah pH pro jaký ho lze pouˇz´ıt (viz experimentáln´ı ˇcást diplomové práce, stránka 54). Pouˇzit´ı barviva jakoˇzto pH indikátoru a mˇeˇren´ım jeho spektráln´ıch zmˇen má následuj´ıc´ı výhody a nevýhody: + bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı: + mnoˇzstv´ı vzorku nen´ı omezeno rozmˇery elektrody + nedocház´ı k ovlivnˇen´ı vzorku elektrodou + lze paralelnˇe sn´ımat v´ıce spekter + k mˇeˇren´ı pH docház´ı v celém objemu vzorku − m˚ uˇze doj´ıt k reakci mezi vzorkem a pH indikátorem

23

1.4.1

pH indik´ atory

Indikátor pH je chemická látka, která se v malém mnoˇzstv´ı pˇridává do roztoku (kyselého ˇci zásaditého) a na základˇe jeho pH zmˇen´ı své fyzikáln´ı vlastnosti, napˇr. absorpˇcn´ı spektrum, coˇz je moˇzné detekovat. Dnes je známa a pr˚ umyslovˇe vyuˇz´ıvána celá ˇrada indikátor˚ u pH, patˇr´ı mezi nˇe napˇr.: fenolftalein, thymolftalein, methylenová oranˇz, thymolinová modˇr, bromocresol blue (bromokresolová modˇr), bromocresol green (bromokresolová zeleˇ n) a bromocresol purple (bromokresolová ˇcerveˇ n). O jejich vyuˇzit´ı rozhoduje pˇredevˇs´ım rozsah pH, pˇri kterém je lze pouˇz´ıt. pH indikátory ˇcasto samotné bývaj´ı slabými kyselinami ˇci zásadami. Po pˇridán´ı do roztoku mohou navázat volné H+ nebo OH− ionty. Pˇri vytvoˇren´ı vazby dojde zároveˇ n ke zmˇenˇe elektronové konfigurace a tedy i zmˇenˇe absorpˇcn´ıho spektra, coˇz se projev´ı zmˇenou barvy indikátoru. Urˇcen´ı barvy indikátoru a tedy pH roztoku m˚ uˇze být zat´ıˇzeno znaˇcnou subjektivn´ı chybou. Za t´ımto u ´ˇcelem se v laboratorn´ı praxi urˇcuje hodnota pH vzorku pomoc´ı elektrochemické pH elektrody, lze ji vˇsak urˇcit zmˇeˇren´ım a analýzou spektra daného roztoku s barevným indikátorem. Druhý postup má ˇradu výhod. Uˇzité pH citlivé barvivo, obecnˇe HI, po rozpuˇstˇen´ı v roztoku nabývá následuj´ıc´ı rovnováhy: HIacid form ←→ H+ + I− alkaline form , (1.1) kde HIacid form je tedy kyselá forma a I− asaditá forma barviva. alkaline form z´ − Je-li C celková koncentrace a [HI], [I ] jsou koncentrace jednotlivých forem rozpuˇstˇeného barviva, pak C = [HI] + [I− ].

(1.2)

Absorbance roztoku, která je funkc´ı vlnové délky je pak následuj´ıc´ı: A(λ) = αI (λ) · [I− ] · l + αHI (λ) · [HI] · l,

(1.3)

kde αI (λ) je molárn´ı absorpˇcn´ı koeficient alkalické sloˇzky a αHI (λ) kyselé sloˇzky a l je optická dráha. V namˇeˇreném absorpˇcn´ım spektru rozpuˇstˇeného barviva pak uvid´ıme p´ıky odpov´ıdaj´ıc´ı absorpci tˇechto dvou sloˇzek [15].

1.4.2

Absorbance

Fyzikáln´ı veliˇcina absorbance je ve spektroskopii definována jako: A(λ) = − log

I , I0

(1.4)

kde I je intenzita záˇren´ı o vlnové délce λ proˇslého vzorkem a I0 intenzita p˚ uvodn´ıho paprsku. Jedná se tedy o logaritmický u ´ tlum svˇetla pˇri pr˚ uchodu svˇetla vzorkem. Tento u ´ tlum závis´ı na vlastnostech vzorku a do souvislosti s absorbanc´ı je dává empirický Lambert˚ uv-Beer˚ uv zákon, který lze vyjádˇrit mnoha zp˚ usoby: 24

I = I0 · eǫ(λ)lc = I0 · eα(λ)l ,

(1.5)

kde l je dráha po jakou svˇetlo procház´ı vzorkem, ǫ(λ) je extinkˇcn´ı koeficient (jedná se o imaginárn´ı sloˇzku komplexn´ıho indexu lomu), c je koncentrace a α(λ) je molárn´ı absorpˇcn´ı koeficient (nˇekdy také turbidita nebo optická hustota). Posledn´ı dva parametry charakterizuj´ı vlastnosti vzorku. Lambert˚ uv-Beer˚ uv zákon lze vyjádˇrit pomoc´ı absorbance takto: I = I0 · 10−ǫ10 cl = I0 · 10−A , (1.6) . kde ǫ10 je dekadický extinkˇcn´ı koeficient (ǫ10 = ǫ/ ln 10 = ǫ/2.303). Pomˇer T = I/I0

(1.7)

se pak nazývá transmitance (propustnost). Z uvedených vztah˚ u vyplývá, ˇze mˇeˇren´ım absorbance vzorku (resp. intenzity proˇslého svˇetla) m˚ uˇzeme urˇcit jeho vlastnosti (koncentraci nebo turbiditu), coˇz je vyuˇz´ıváno napˇr. v analytické chemii. Mˇeˇren´ım u ´ hlové závislosti intenzity (charakteristiky rozptylu) pak také m˚ uˇzeme urˇcit tvar a velikost rozptyluj´ıc´ıch ˇcástic, viz dále. V reálných pˇr´ıpadech docház´ı k u ´ tlumu záˇren´ı pˇri pr˚ uchodu vzorkem z d˚ uvod˚ u rozptylu svˇetla a nav´ıc absorpce vzorku. Formálnˇe pro výslednou absorbanci plat´ı: A = Aa + As ,

(1.8)

kde Aa je absorbance absorbuj´ıc´ı sloˇzky a As je absorbance rozptyluj´ıc´ı sloˇzky vzorku. Tato aditivita absorbanc´ı vˇsak plat´ı pouze za pˇredpokladu nezávislosti efekt˚ u rozptylu svˇetla a selektivn´ı absorpce, coˇz obecnˇe nen´ı splnˇeno. Platnost této podm´ınky je splnˇena pro zˇredˇené roztoky. Selektivn´ı absorpce Vˇetˇsina látek absorbuje svˇetlo selektivnˇe, ˇcili po pr˚ uchodu záˇren´ı látkou je p˚ uvodn´ı spektrum ochuzeno o nˇekteré vlnové délky (resp. pásy). To je zp˚ usobeno elektronovými pˇrechody v dané látce. Elektrony excitované procházej´ıc´ım záˇren´ım, mohou energii zpˇet vyzáˇrit nebo ji pozbýt tepelným pohybem. D˚ usledkem toho se napˇr´ıklad nˇekteré látky jev´ı jako barevné. Namˇeˇren´ım charakteristického absorpˇcn´ıho spektra m˚ uˇzeme urˇcit druh a vlastnosti látek, které se ve vzorku vyskytuj´ı. V této práci je spektra selektivn´ı absorpce pH citlivé látky vyuˇz´ıváno ke stanoven´ı hodnoty pH vzorku.

25

1.5

Rozptyl svˇ etla

Intenzita (resp. absorbance) rozptýleného záˇren´ı tedy ovlivˇ nuje celkové absorpˇcn´ı spektrum vzorku. Jak k rozptylu svˇetla docház´ı a jak jej lze charakterizovat se dozv´ıme v následuj´ıc´ıch ˇrádc´ıch. Pˇri ˇs´ıˇren´ı elektromagnetického záˇren´ı hmotným prostˇred´ım, osciluj´ıc´ı elektrické pole vyvolává v molekulách nucené oscilace nábojové hustoty, které jsou v prvn´ım pˇribl´ıˇzen´ı synchronn´ı s bud´ıc´ım polem. Kmity nábojové hustoty v molekule, které je moˇzné aproximovat kmity elementárn´ıho dipólu, jsou zdrojem sekundárn´ıho elektromagnetického záˇren´ı o stejné frekvenci. V dokonale homogenn´ım prostˇred´ı, jakým je napˇr´ıklad ideáln´ı krystal, má záˇren´ı emitované bl´ızkými molekulami definovaný fázový rozd´ıl, a proto navzájem interferuje. Tato interference je, v pˇr´ıpadˇe buzen´ı rovinnou vlnou destruktivn´ı ve vˇsech smˇerech kromˇe smˇeru ˇs´ıˇren´ı bud´ıc´ıho záˇren´ı [11]. Sloˇzen´ım rozptýlené a bud´ıc´ı vlny vzniká rovinná vlna, jej´ıˇz fázová rychlost je v=

c , n

(1.9)

kde c je rychlost svˇetla ve vakuu a n je index lomu daného prostˇred´ı. V anizotropn´ım prostˇred´ı je fázová rychlost svˇetla závislá na smˇeru jeho ˇs´ıˇren´ı a k popisu nestaˇc´ı skalár n, ale je nutné pouˇz´ıt tenzorové veliˇciny. Této interakci svˇetla s prostˇred´ım se ˇr´ıká elastický rozptyl a je pˇri n´ı zachován zákon zachován´ı energie a hybnosti, nedocház´ı ke zmˇenám vnitˇrn´ı energie molekul. Naopak v pˇr´ıpadˇe kdy docház´ı ke zmˇenám vnitˇrn´ı energie molekul se jedná o rozptyl neelastický, coˇz je napˇr´ıklad Raman˚ uv rozptyl. Sloˇzitˇejˇs´ı popis elastického rozptylu nastává v pˇr´ıpadˇe, kdy prostˇred´ı, kterým záˇren´ı procház´ı, obsahuje nehomogenity. Tyto nehomogenity mohou být tvoˇreny napˇr. buˇ nkami rozptýlenými v roztoku, makromolekulami v n´ızkomolekulárn´ım rozpouˇstˇedle nebo oblastmi v kapalinˇe o rozd´ılné hustotˇe vzniklé tepelným pohybem molekul. Nehomogenity tvoˇr´ı rozptylová centra, která naruˇs´ı destruktivn´ı interferenci sekundárn´ıch vln, jejichˇz následné ˇs´ıˇren´ı ve vzorku se r˚ uzn´ı od zákona odrazu a lomu. Polarizaˇcn´ı vlastnosti a u ´ hlové rozloˇzen´ı intenzity rozptýleného záˇren´ı jsou závislé na velikosti a tvaru rozptylových center. D´ıky teorii elastického rozptylu jsme schopni z namˇeˇrených charakteristik rozptýleného záˇren´ı urˇcit vlastnosti rozptylových center. Pˇri popisu elastického rozptylu na nehomogenitách lze pouˇz´ıt aproximace, ty jsou závislé na pomˇeru velikosti rozptylových center v˚ uˇci vlnové délce elektromagnetického záˇren´ı, tento pomˇer je definován jako bezrozmˇerná veliˇcina x: x=

2πr , λ

(1.10)

kde r je polomˇer rozptylového centra a λ je vlnová délka dopadaj´ıc´ıho záˇren´ı. Na základˇe velikosti veliˇciny x rozliˇsujeme tˇri typy rozptylu: Rayleigh˚ uv rozptyl, Rayleigh˚ uv-Debye˚ uv rozptyl a Mie˚ uv rozptyl.

26

Rayleigh˚ uv rozptyl Pˇredpokladem pro popis Rayleighova rozptylu je, ˇze velikost rozptylových center a je mnohem menˇs´ı neˇz vlnová délka procházej´ıc´ıho záˇren´ı, konkrétnˇe se uvád´ı: a<

λ . 20

(1.11)

Tomu odpov´ıdá hodnota x < 0.3. V tomto pˇr´ıpadˇe lze povaˇzovat rozptylová centra za elementárn´ı dipóly. D˚ usledek této aproximace je nepˇr´ımá závislost intenzity rozptylu na ˇctvrté mocninˇe vlnové délky záˇren´ı (I ∼ 1/λ4 ). Rayleigh˚ uv rozptyl je nejˇcastˇeji pozorován pˇri pr˚ uchodu záˇren´ı plyny a je zodpovˇedný mimo jiné za modrou barvu oblohy. Rayleigh˚ uv-Debye˚ uv rozptyl Toto pˇribl´ıˇzen´ı vycház´ı z pˇredstavy, ˇze rozptylové centrum libovolného tvaru je sloˇzeno z objemových element˚ u, jeˇz lze popsat Rayleighovou teori´ı. Základn´ım pˇredpokladem je, ˇze fáze d´ılˇc´ı vlny emitované libovolným objemovým elementem je závislá pouze na poloze daného elementu v˚ uˇci bodu pozorován´ı, nikoliv na vzdálenosti po které se ˇs´ıˇr´ı v objemu rozptylového centra. Tedy vˇsechny objemové elementy daného rozptylového centra povaˇzujeme za excitované p˚ uvodn´ı dopadaj´ıc´ı vlnou. Ke splnˇen´ı tohoto poˇzadavku je nutné, aby platily následuj´ıc´ı dvˇe podm´ınky: a ≈ λ,

(1.12)

ˇcili velikost rozptylových center je srovnatelná s vlnovou délkou dopadaj´ıc´ıho záˇren´ı a zároveˇ n: n − n0 x· < 1, (1.13) n0 neboli index lomu rozptylového centra n mus´ı být bl´ızký indexu lomu média n0 . Mie˚ uv rozptyl Popis Mieova rozptylu je nejobecnˇejˇs´ı, ale také nejsloˇzitˇejˇs´ı, z toho d˚ uvodu je pro ˇreˇsen´ı ˇcasto tˇreba pouˇz´ıt numerické výpoˇcty. D´ıky své obecnosti popisu rozptylu na sféricky symetrických centrech o libovolné velikosti se dobˇre shoduje s Rayleighovou teori´ı pro malá rozptylová centra a naopak s výsledky urˇcenými zákony odrazu, lomu a difrakc´ı záˇren´ı pro velká rozptylová centra. Závislost absorbance na vlnové délce pˇri Mieovˇe rozptylu má obecnˇe následuj´ıc´ı tvar: As ≈ λ−n ,

(1.14)

kde n je empirický parametr nabývaj´ı hodnoty menˇs´ı neˇz ˇctyˇri. Tato závislost znesnadˇ nuje korekci absorpˇcn´ıch spekter na rozptyl svˇetla.

27

V´ıcen´ asobn´ y rozptyl Vliv ˇcástic na rozptyl a absorpci dopadaj´ıc´ıho záˇren´ı závis´ı nejen na jejich vlastnostech, ale i na vzájemné vzdálenosti a poloze. Jsou-li ˇcástice bl´ızko sebe, m˚ uˇze být záˇren´ı rozptýleno na v´ıce ˇcástic´ıch, dojde k tzv. mnohonásobnému rozptylu. Vzájemná pozice ˇcástic urˇcuje, zda p˚ ujde o rozptyl koherentn´ı ˇci nekoherentn´ı. Prvn´ı pˇr´ıpad nastává, jsou-li ˇcástice um´ıstˇeny v pˇresnˇe urˇcených m´ıstech, napˇr. atomy v krystalové mˇr´ıˇzce, pak jsou fáze rozptýlených vln dobˇre definovány a elektrické intenzity se sˇc´ıtaj´ı (Braggova difrakce). O nekoherentn´ı rozptyl se jedná v pˇr´ıpadˇe, jsou-li ˇcástice rozm´ıstˇeny náhodnˇe, napˇr. pevné ˇcástice v kapalinách. Pˇri popisu v´ıcenásobného rozptylu máme následuj´ıc´ı moˇznosti: • zanedbán´ı v´ıcenásobného rozptylu: tento postup je pouˇzitelný u velmi zˇredˇených vzork˚ u, kde intenzita jednou rozptýleného svˇetla je ˇrádovˇe vyˇsˇs´ı neˇz intenzita mnohonásobnˇe rozptýleného svˇetla • prvn´ı pˇribl´ıˇzen´ı mnohonásobného rozptylu: vycház´ı z popisu jednonásobného rozptylu se zapoˇc´ıtán´ım u ´ tlumu intenzity dopadaj´ıc´ı vlny zp˚ usobeného pˇredchoz´ım rozptylem • difuzn´ı pˇribl´ıˇzen´ı: vycház´ı z popisu difuzn´ıho rozptylu, ˇcili dopadaj´ıc´ı vlna se prakticky rovnomˇernˇe ve vˇsech smˇerech rozptyluje na mnoha ˇcástic´ıch, u ´ hlové rozdˇelen´ı je témˇeˇr izotropn´ı Které z uvedených pˇribl´ıˇzen´ı pouˇz´ıt je pˇredurˇceno koncentrac´ı vzorku. Pˇribliˇznˇe plat´ı, ˇze je-li objemová koncentrace menˇs´ı neˇz 0.1 %, pak lze pouˇz´ıt prvn´ı pˇribl´ıˇzen´ı v´ıcenásobného rozptylu.

28

Kapitola 2 Materi´ al a metody 2.1

Standardn´ı AP-test

Kvasnice, voda a chemik´ alie Pro mˇeˇren´ı byly pouˇz´ıvány pivovarské kvasinky (spodnˇe kvas´ıc´ı) Saccharomyces cerevisiae kmen 95 (z pivovaru Velké Popovice), které byly odeb´ırány v r˚ uzných fáz´ıch výroby (kvasinky z propagaˇcn´ı fáze, kvasinky po prvn´ım, druhém a tˇret´ım nasazen´ı v CKT). K mˇeˇren´ı byla pouˇz´ıvána deionizovaná voda pˇripravená pˇr´ıstrojem Aqual 35, jej´ı vodivost byla menˇs´ı neˇz 0.2 µS. Pro vystaven´ı kvasnic osmotickému stresu byl pouˇz´ıván sorbitol o r˚ uzných koncentrac´ıch (0.4 M aˇz 1.7 M). Sorbitol je alkoholický cukr, jehoˇz sumárn´ı vzorec je C6 H14 O6 a hmotnost jednoho molu ˇcin´ı 182.17 g. Pr˚ umyslovˇe je tato látka vyuˇz´ıvána k výrobˇe umˇelých sladidel pro diabetiky, v lidském tˇele se totiˇz odbourává minimálnˇe nebo v˚ ubec. Tento polyol neprocház´ı plazmatickou membránou kvasinkových bunˇek a je proto vhodný pro modelovan´ı osmotického tlaku. Za u ´ˇcelem studia vlivu vybraných xenobiotik na vitalitu kvasnic, byly pouˇzity tyto látky: • Iodoacetamide (iodoacetamid, IAA) - jedná se o inhibitor blokuj´ıc´ı fermentaci kvasnic. Jeho sumárn´ı vzorec je C2 H4 INO a váha jednoho molu ˇcin´ı 184.96 g. Ve vyˇsˇs´ıch koncentrac´ıch je karcinogenn´ı. (dodáván firmou Sigma-Aldrich, Inc.) • Glucosamine (glukosamin) - je inhibitorem fosforylace glukosy na samém zaˇcátku glykolýzy. Jeho sumárn´ı vzorec je C6 H13 NO5 a váha jednoho molu ˇcin´ı 179.17 g. Lidskému tˇelu je tato látka vlastn´ı jako souˇcást polysacharid˚ u obsaˇzených v kloubn´ı chrupavce. (dodáván firmou Sigma-Aldrich, Inc.) • Malonate (malonát) - inhibuje oxidaci sukcinátu na fumarát v citrátovém cyklu, ˇcili potlaˇcuje respiraci kvasinek. (dodáván firmou Sigma-Aldrich, Inc.)

29

Obrázek 2.1: Aparatura YATA - Yeast Acidification and Turbidity Analyzer vyvinutá na Katedˇre chemické fyziky a optiky pˇri MFF UK. • YC-TETRA - je chmelový extrakt podporuj´ıc´ı tvorbu a stabilitu pivn´ı pˇeny. Jedná se o roztok sodných sol´ı z chmele odvozených tetrahydroiso-alfa kyselin. Tato látka je hojnˇe vyuˇz´ıvána nˇekterými pivovary. (dodáván firmou Yakima Chief, Inc.) Centrifuga Vzorky byly odstˇred’ovány v centrifuze Janetzki T30. Pˇri 1000 ot/min na vzorek p˚ usobilo 145 × g, pˇri 3000 ot/min pak 1300 × g. Mˇ eˇ r´ıc´ı aparatura Mˇeˇren´ı bylo provádˇeno na kombinované pH-turbidimetrické titraˇcn´ı aparatuˇre (YATA) (viz obrázek 2.1), jej´ıˇz hlavn´ı ˇcást´ı je mˇeˇr´ıc´ı komora naplnˇená imerzn´ı kapalinou. Teplota uvnitˇr komory je stabilizována extern´ım termostatem. Mˇeˇr´ıc´ı komora obsahuje magnetické m´ıchadlo s nastavitelnou rychlost´ı m´ıchán´ı a fotometr pro mˇeˇren´ı turbidity vzorku. Souˇcást´ı aparatury je také pH-metr s extern´ım výstupem (PHI-04 s ˇ pH-elektrodou Theta 90 HC133, Labio a.s., CR) a dávkovac´ı pumpa s nastavitelným dávkovac´ım reˇzimem (NE1000, New Era Pump Systems, Inc., USA). Aparatura je ˇr´ızena z PC pomoc´ı speciáln´ıho software vyvinutého Petrem Gabrielem. Mˇeˇr´ıc´ı komora je pˇrizp˚ usobena pro 15 ml vzorky mˇeˇritelné ve zkumavkách o pr˚ umˇeru 2 cm. Turbidimetr jeˇz je souˇcást´ı aparatury je vybaven LED zdrojem svˇetla o vlnové délce λ = 660 nm, lze j´ım mˇeˇrit u ´ tlum svˇetla pˇri pr˚ uchodu svˇetelného paprsku vzorkem.

30

Pˇ r´ıprava vzork˚ u a postup mˇ eˇ ren´ı pˇ ri standardn´ım AP-testu Bˇeˇzný postup pˇr´ıpravy vzork˚ u a pr˚ ubˇehu mˇeˇren´ı pouˇz´ıvaný Karou (viz [7]) je modifikac´ı p˚ uvodn´ıho postupu navrˇzeného Opekarovou a Siglerem. Na následuj´ıc´ıch ˇrádc´ıch je v bodech shrnut standardn´ı Karou navrˇzený postup AP-testu (podrobnosti v [7]): • Odváˇz´ıme 9 g kvasnic. • Kvasnice pˇridáme do 50 ml destilované vody o teplotˇe 4 ◦ C a promyjeme. • Poté vzorek odstˇred´ıme v centrifuze po cca 10 min pˇri 3000 × g. • Promýván´ı a odstˇredˇen´ı provedeme celkem tˇrikrát. • Po posledn´ım odstˇredˇen´ı samotné kvasnice pˇridáme do 50 ml destilované vody o teplotˇe 25 ◦ C a protˇrepeme. Zároveˇ n spouˇst´ıme ˇcas. • Následnˇe celou suspenzi pˇridáme do 50 ml destilované vody o teplotˇe 25 ◦ C. • Vzorek (objem suspenze 100 ml) nyn´ı stále m´ıcháme (200 ot/min) ve 250 ml zkumavce. • V desáté minutˇe pˇridáme 5 ml glukosy (20.2 % roztok). • Odeˇcteme hodnoty pH v desáté a dvacáté minutˇe. Tento postup byl upravován a optimalizován, viz kapitola Optimalizace AP-testu. V´ ypoˇ cet hodnoty AP Hodnota AP je urˇcována za pˇredpokladu, ˇze hodnota pH ve zkumavce na zaˇcátku mˇeˇren´ı je 6.3, coˇz je pK hodnota systému CO2 -HCO− 3 [13]. Veliˇcina AP10 odpov´ıdá výsledku spontánn´ı acidifikace pˇred pˇridán´ım glukosy. Vypoˇc´ıtá se z hodnoty pH v desáté minutˇe mˇeˇren´ı (pH10 ) takto: AP10 = 6.3 − pH10 .

(2.1)

Veliˇcina AP20 odpov´ıdá výsledku glukosou indukované acidifikace. Vypoˇc´ıtá se z hodnoty pH ve dvacáté minutˇe mˇeˇren´ı (pH20 ) takto: AP20 = 6.3 − pH20 .

(2.2)

Za výslednou hodnotu AP-testu je povaˇzována veliˇcina AP20 . V této práci jsou pouˇz´ıvány jako ekvivalentn´ı pojmy: výsledek AP-testu, hodnota AP a AP20 .

31

Výsledná hodnota AP20 pak odráˇz´ı fyziologický stav bunˇek: AP20 stav bunˇek 2.5 − 2.0 dobrý fyziologický stav 2.0 − 1.5 ˇcásteˇcnˇe poˇskozené < 1.5 znaˇcnˇe poniˇcené

2.2

Bezkontaktn´ı mˇ eˇ ren´ı AP-testu

Mˇeˇren´ı absorpˇcn´ıch spekter bylo provádˇeno na spektrometru Specord 40 od firmy Analytik Jena a to v rozsahu vlnových délek 350 nm aˇz 850 nm. Pouˇzité kyvety byly plastové, optická dráha 1 cm. pH indikátory BCP a BCG byly od firmy Sigma-Aldrich, Inc. Destilovaná voda byla vyrábˇena na laboratorn´ım pˇr´ıstroji Aqual 35, jej´ı vodivost byla pod 0.2 µS. Byl pˇripraven pufr, citrát-fosfátový, o pH = 4.5. Hodnota pH roztok˚ u byla upravována pomoc´ı 0.1 M roztoku NaOH a HCl. Kvasinky pouˇz´ıvané pˇri spektroskopických mˇeˇren´ıch byly spodnˇe kvas´ıc´ı pivovarské kmen 95. Kontroln´ı mˇeˇren´ı metodou AP-testu byla provádˇena na pˇr´ıstroji YATA specifikace výˇse. Pro souˇcasné bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı pH spektrometrem a kontaktn´ı mˇeˇren´ı pH pomoc´ı klasické elektrochemické sondy byla pouˇzita pr˚ utoková cela, která byla um´ıstˇena ve fotometru, a pH elektroda do zkumavky (25 ml, stejná, která byla pouˇz´ıvána pro mˇeˇren´ı na YATA). Tyto dva prvky pak byly spojeny do uzavˇreného obvodu i s peristaltickou pumpou pomoc´ı hadiˇcek. Pˇ r´ıprava vzork˚ u a postup mˇ eˇ ren´ı Skladován´ı a promýván´ı kvasnic bylo provádˇeno shodnˇe s pˇr´ıpravou vzork˚ u pro optimalizovaný AP-test (viz strana 39). Rozd´ıl nastává v pouˇzité koncentraci mˇeˇreného vzorku. Pro u ´ˇcely bezkontaktn´ıho mˇeˇren´ı pH pˇri AP-testu bylo odvaˇzováno definované mnoˇzstv´ı kvasnic (mokré váhy), které byly pˇridávány do definovaného mnoˇzstv´ı destilované vody resp. pufru.

32

Kapitola 3 Optimalizace AP-testu Pr˚ ubˇeh a výsledek AP-testu je ovlivnˇen mnoha vnˇejˇs´ımi a vnitˇrn´ımi faktory. Pro zajiˇstˇen´ı reprodukovatelnosti mˇeˇren´ı je nutné tyto vlivy minimalizovat nebo u ´ plnˇe odstranit. Mezi zásadn´ı patˇr´ı napˇr´ıklad skladován´ı vzorku (pˇri dlouhodobém skladován´ı je nutné utlumit metabolickou aktivitu kvasnic sn´ıˇzen´ım teploty nebo inhibuj´ıc´ımi látkami), pˇr´ıprava (promýván´ı, hladovˇen´ı) a parametry mˇeˇren´ı (teplota a koncentrace kvasnic a glukosy). V této kapitole jsou faktory ovlivˇ nuj´ıc´ı výsledek testu popsány a navrˇzen postup pro minimalizaci jejich vlivu.

3.1

Uchov´ av´ an´ı vzork˚ u

Kontrola vitality kvasnic nen´ı mnohdy moˇzná ihned po odbˇeru a vzorky tak bývaj´ı pˇred vlastn´ım mˇeˇren´ım po nˇejakou dobu skladovány, coˇz m˚ uˇze ovlivnit jejich fyziologický stav a následnˇe vitalitu. Snahou je kvasnice skladovat tak, aby se maximálnˇe prodlouˇzila doba, po kterou si zachovaj´ı sv˚ uj fyziologický stav. Na nˇekolika vzorc´ıch bylo ovˇeˇreno, ˇze pˇri skladován´ı kvasniˇcných suspenz´ı pod vrstvou piva v lednici pˇri teplotˇe 0 − 2 ◦ C, výsledná hodnota AP, bˇehem prvn´ıch tˇrech dn´ı skladován´ı roste, po dalˇs´ı tˇri dny se drˇz´ı konstantn´ı a po ˇsestém dni klesá. Pokles výsledku AP-testu je i po deseti dnech skladován´ı vzork˚ u pod u ´ rovn´ı 3 %, jak je ukázáno i v [2]. Data z tˇechto mˇeˇren´ı nejsou publikována. Vitalitu kvasnic také ovlivˇ nuje sloˇzen´ı média, ve kterém jsou skladovány. Bylo prokázáno, ˇze skladován´ı kvasnic ve vodˇe nasycené CO2 , fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) a fosfát-citrátovém pufru (pH = 4.5) má negativn´ı vliv na vitalitu [2]. Viabilitu si kvasnice nejdéle udrˇz´ı právˇe pˇri uchováván´ı pod pivem.

3.2

Pˇ r´ıprava vzork˚ u

Pˇr´ıprava vzorku pˇred samotným mˇeˇren´ım zásadnˇe ovlivˇ nuje výsledek AP-testu. Je nutné ji provádˇet tak, aby hodnota AP20 byla co nejvyˇsˇs´ı a zároveˇ n reprodukovatelná. Bylo ovˇeˇreno, ˇze právˇe maximáln´ı hodnota výsledku AP-testu je správným výsledkem odpov´ıdaj´ıc´ım vitalitˇe kvasnic [10]. Tato hodnota odpov´ıdá nejen vitalitˇe kvasnic, 33

2.20

2.15

AP20

2.10

2.05

2.00

1.95 0

1

2

3

pocet promyti

Obrázek 3.1: Závislost hodnoty AP20 na poˇctu promyt´ı vzorku pˇred mˇeˇren´ım. ale také mnoˇzstv´ı endogenn´ıch energetických zásob. Kvasinky s velkými vnitˇrn´ımi zásobami (napˇr. kvasinky z propagace) mohou vykazovat slabou acidifikaci i po pˇridán´ı exogenn´ı glukosy a zkreslit tak výsledek AP-testu (výsledná hodnota bude niˇzˇs´ı). Tzv. hladovˇen´ım lze kvasnice donutit k vyˇcerpán´ı endogenn´ıch energetických zásob, coˇz vede k nár˚ ustu výsledné hodnoty AP, nicménˇe delˇs´ı hladovˇen´ı m˚ uˇze naopak vést k poklesu acidifikaˇcn´ı schopnosti. Prom´ yv´ an´ı Mladina, ve které jsou vzorky skladovány, obsahuje zdroje energie, neˇcistoty a také p˚ usob´ı jako pufr. Promýván´ım vzorku dojde k nahrazen´ı mladiny deionizovanou vodou, ˇcili ke sn´ıˇzen´ı pufrovac´ı kapacity média a odstranˇen´ı adsorbovaných látek na povrchu bunˇek, a také k temperaci na teplotu, pˇri které prob´ıhá mˇeˇren´ı. Promýván´ı bylo provádˇeno destilovanou vodou o teplotˇe 25 ◦ C. Poˇcet promyt´ı ovlivˇ nuje výslednou hodnotu AP-testu, jak je vidˇet na obrázku 3.1. Z grafu je zˇrejmé, ˇze trojnásobné promyt´ı je postaˇcuj´ıc´ı, hodnota AP20 dosahuje maxima jiˇz po druhém promyt´ı. Po posledn´ım promyt´ı následuje prudké“ odstˇredˇen´ı (cca ” 3000 ot/min po 10 min). Po nˇem, jsou vˇsechny kvasnice ve vzorku sedimentované, lze dekantovat supernatant a odváˇzit ˇcistou váhu kvasnic.

34

6.5

vzorek 1, 0h vzorek 2, 0h vzorek 1, 24h vzorek 2, 24h

6

pH

5.5

5

4.5

4

3.5 00:00

02:00

04:00

06:00

08:00

10:00 t [min:s]

12:00

14:00

16:00

18:00

20:00

Obrázek 3.2: Pr˚ ubˇeh AP-testu dvou r˚ uzných vzork˚ u po tˇrech promyt´ıch provedený okamˇzitˇe a následuj´ıc´ı den. Doba skladov´ an´ı pˇ red samotn´ ym mˇ eˇ ren´ım Byla ovˇeˇrena také doba, po kterou m˚ uˇze být vzorek po trojnásobném promyt´ı a prudkém odstˇredˇen´ı skladován pˇred vlastn´ım mˇeˇren´ım, tuto prodlevu definujme jako doba leˇzen´ı. Z praktického hlediska je výhodné ovˇeˇrit, jak dlouho m˚ uˇzou být vzorky uloˇzeny pˇred mˇeˇren´ım, kdy docház´ı k prodlevám napˇr. pˇri pˇr´ıpravˇe v´ıce vzork˚ u. Pro ovˇeˇren´ı vlivu doby leˇzen´ı na AP-test, byly pˇripraveny dva r˚ uzné vzorky kvasnic, trojnásobnˇe promyté a prudce odstˇredˇené. Poté byl na vzorc´ıch zmˇeˇren test, zbytek kvasnic byl uloˇzen do lednice pro srovnávac´ı mˇeˇren´ı po 24 hodinách (jiˇz bez jakéhokoli odstˇred’ován´ı ˇci promýván´ı). Pr˚ ubˇeh test˚ u je na obrázku 3.2 a výsledky v tabulce 3.1. Z výsledných hodnot je zˇrejmé, ˇze hodnota AP20 se bˇehem 24 h pro jednotlivé vzorky zmˇenila jen minimálnˇe, konkrétnˇe o 0.06 resp. 0.04, coˇz ˇcin´ı zmˇenu o 3 % resp. 2 %. Lze tedy pˇredpokládat, ˇze po tˇrech promyt´ıch a prudkém odstˇredˇen´ı kvasnic lze takto sedimentovaný vzorek skladovat v lednici v ˇrádu hodin bez vlivu na vitalitu. Jelikoˇz je na obrázku 3.2 zachycen v˚ ubec prvn´ı pr˚ ubˇeh mˇeˇren´ı AP-testu v této práci, okomentujme si jej podrobnˇe. Jak jiˇz bylo ˇreˇceno, spuˇstˇen´ı ˇcasu mˇeˇren´ı poˇc´ıná pˇridán´ım vzorku kvasnic do destilované vody. Kvasniˇcnˇe buˇ nky pˇrirozenˇe reaguj´ı adaptac´ı na nové prostˇred´ı. Na zaˇcátku prob´ıhá tzv. acidifikace bez substrátu (spontánn´ı acidifikace), pˇri n´ıˇz je spotˇrebováván kysl´ık obsaˇzený v mediu a utilizovány endogenn´ı zdroje energie. Vyˇcerpán´ı tˇechto zdroj˚ u se projev´ı poklesem pH suspenze a jeho stabilizac´ı. Hodnota pH dosaˇzená spontánn´ı acidifikac´ı (pH10 ) tedy ukazuje na mnoˇzstv´ı endogenn´ıch zdroj˚ u energie bunˇek. Po pˇridán´ı glukosy v desáté minutˇe mˇeˇren´ı docház´ı 35

Tabulka 3.1: Výsledky vlivu doby leˇzen´ı vzorku pˇred vlastn´ım mˇeˇren´ım na výsledky AP-testu. ˇcas [h] 0 24

popis pH10 vzorek 1 4.39 vzorek 2 4.32 vzorek 1 5.00 vzorek 2 4.96

pH20 3.96 3.88 3.90 3.84

AP10 1.91 1.98 1.30 1.30

AP20 2.34 2.42 2.40 2.46

k jej´ımu zpracován´ı, coˇz se projev´ı vypuzován´ım H+ vnˇe bunˇek a dalˇs´ım poklesem hodnoty extracelulárn´ıho pH. Na výsledc´ıch pˇredchoz´ıch test˚ u je tedy vidˇet zˇretelný nár˚ ust (o cca 14 %) hodnoty pH10 (pokles AP10 o cca 33 %) dosaˇzené mˇeˇren´ım jednotlivých vzork˚ u po 24 hodinách oproti p˚ uvodn´ı hodnotˇe. Zmˇeny výsledných hodnot testu (AP20 ) byly komentovány výˇse. Plat´ı, ˇze pr˚ ubˇeh spontánn´ı acidifikace nemá vliv na výsledky testu. Ukazuje pouze na mnoˇzstv´ı energetických zásob bunˇek. Hladovˇ en´ı Hladovˇen´ı je proces, pˇri nˇemˇz jsou buˇ nky v mediu bez utilizovatelných substrát˚ u a jsou tak odkázány pouze na vlastn´ı zdroje energie. Pˇri mˇeˇren´ı AP-testu se m˚ uˇze stát, ˇze kvasnice s bohatými endogenn´ımi zdroji energie po pˇridán´ı glukosy (nebo jiného zdroje energie) do media nereaguj´ı tak aktivnˇe jako buˇ nky, které maj´ı n´ızké zásoby vnitˇrn´ıch zdroj˚ u. To se samozˇrejmˇe projev´ı niˇzˇs´ı výslednou hodnotou AP20 , která pak neodpov´ıdá potenciáln´ı vitalitˇe. Hladovˇen´ı, tedy sn´ıˇzen´ı mnoˇzstv´ı vnitˇrn´ıch zásob, pak uvede buˇ nky do správného fyziologického stavu, ve kterém projev´ı maximáln´ı potenciál kvasné mohutnosti. Projev vitality na výsledek AP-testu byl ovˇeˇren v následuj´ıc´ım experimentu. Za pokojové teploty (cca 25 ◦ C) hladovˇel vzorek kvasnic v destilované vodˇe (pomˇer husté suspenze kvasnic a vody 1 : 1). Po celou dobu bylo médium m´ıcháno magnetickým m´ıchadlem (cca 150 ot/min), tak aby nedoˇslo k sedimentaci. Pˇred celou procedurou byl vzorek tˇrikrát promyt. Bˇehem hladovˇen´ı byla ˇcást kvasnic odeb´ırána a byl na nich zmˇeˇren AP-test (prvn´ı vzorek bez hladovˇen´ı). Na obrázku 3.3 je pak vynesena závislost výsledné hodnoty AP20 na dobˇe hladovˇen´ı. Po 404 minutách se výsledek AP-testu zmˇenil o 3 % od výsledku testu bez hladovˇen´ı. Lze tedy pˇredpokládat, ˇze trojnásobné promyt´ı zajist´ı dostateˇcnou utilizaci endogenn´ıch zdroj˚ u energie a dalˇs´ı hladovˇen´ı jiˇz nemá vliv na hodnotu AP a nemus´ı být proto uplatˇ nováno. Tento výsledek dobˇre souhlas´ı s výsledky uvedenými v [2], kde byly porovnány mˇeˇren´ı AP hodnoty vzork˚ u vystavených hladovˇen´ı bez pˇredchoz´ıho promyt´ı a s trojnásobným promyt´ım.

36

2.3

2.25

AP20

2.2

2.15

2.1

2.05

2 0

50

100

150

200 t [min]

250

300

350

400

Obrázek 3.3: Závislost výsledku AP-testu na dobˇe hladovˇen´ı vzorku pˇred mˇeˇren´ım. Koncentrace glukosy a kvasnic Zvyˇsován´ım koncentrace glukosy pˇridané do vzorku kvasnic se zvýˇs´ı i u ´ roveˇ n acidifikace, potaˇzmo výsledek AP-testu, stejnˇe tak zmˇenami koncentrace kvasnic (viz [7]). Snahou následuj´ıc´ıho experimentu bylo tuto závislost AP20 ovˇeˇrit a následnˇe nalézt vhodné koncentrace kvasnic a glukosy tak, aby byl jejich vliv (napˇr. pˇri nepˇresném odváˇzen´ı) na výsledek testu minimalizován. Bˇehem testu nesm´ı doj´ıt k vyˇcerpán´ı glukosy v mediu (resp. k významným zmˇenám jej´ı koncentrace) a zmˇenit se tak podm´ınky testu. Za u ´ˇcelem nalezen´ı optimáln´ı koncentrace glukosy resp. kvasnic pˇri AP-testu byly namˇeˇreny závislosti vynesené na obrázku 3.4. Z graf˚ u je zˇrejmé, ˇze teprve pˇri pouˇzit´ı koncentrace glukosy ve vzorku nad 3.13 % se jiˇz hodnota AP20 mˇen´ı minimálnˇe (konkrétnˇe o cca 1 %). Pˇri pouˇzit´ı koncentrace kvasnic nad 1.33 g na 15 ml docház´ı k satuˇ v rozsahu hodnot hmotnosti raci pr˚ ubˇehu závislosti výsledk˚ u AP20 na koncentraci. Cili mokré váhy kvasnic 1.33 − 2 g se výsledná hodnota AP mˇen´ı o necelé procento a minimalizuje se tak chyba výsledku testu pˇri nepˇresném naváˇzen´ı. Namˇeˇrené vzorky mˇely relativnˇe n´ızkou hodnotu AP20 a to pod 2.0. Z d˚ uvodu moˇzného vyˇcerpán´ı glukosy v mediu u mnohem aktivnˇejˇs´ıch kvasnic (hodnota AP20 na u ´ rovni 2.5 aˇz 2.7) lze doporuˇcit pouˇz´ıván´ı koncentrace glukosy 4.55 % a koncentrace kvasnic 1.5 g na 15 ml destilované vody. Je samozˇrejmˇe moˇzné pro potˇreby metody AP-testu pouˇz´ıvat i niˇzˇs´ı gramáˇz kvasnic ve vzorku (jak je nakonec uˇcinˇeno v kapitole Bezkontaktn´ım mˇeˇren´ı pH), ale je nutné dbát na pˇresnost naváˇzky a srovnán´ı výsledk˚ u test˚ u pouze o stejných koncentrac´ıch vzork˚ u. Je také nutné poˇc´ıtat se zpomalen´ım acidifikace vzorku. 37

2

glukosa 0.17% glukosa 0.98% glukosa 3.13% glukosa 4.55%

1.9

AP20

1.8

1.7

1.6

1.5

1.4 0.6

0.8

1

1.2 1.4 hmotnost kvasnic [g]

1.6

1.8

2

Obrázek 3.4: Závislost výsledku AP-testu na pouˇzité koncentraci glukosy a kvasnic v 15 ml H2 O. Dalˇ s´ı vlivy Podstatný vliv na pr˚ ubˇeh AP-testu má teplota. Jak bylo prokázáno v pˇredchoz´ıch prac´ıch [13], zmˇena teploty o 1 ◦ C zp˚ usob´ı zmˇenu hodnoty AP20 o 0.1. Z tohoto d˚ uvodu byly vzorky bˇehem naˇsich experiment˚ u pˇred samotným mˇeˇren´ım temperovány na teplotu mˇeˇren´ı (25 ◦ C), která byla udrˇzována konstantn´ı pomoc´ı termostatu. Dalˇs´ı jev, který ovlivˇ nuje mˇeˇren´ı vitality pomoc´ı AP-testu je flokulace kvasnic. Flokulace je typickým projevem pivovarských kvasnic, kterým po prokvaˇsen´ı mladiny usnadˇ nuje sedimentaci (zp˚ usob výroby piva spodn´ım kvaˇsen´ım). Aglutinaci bunˇek lze zabránit nˇekolika zp˚ usoby, napˇr´ıklad pˇridán´ım EDTA do vzorku, m´ıchán´ım vzorku nebo také pˇridán´ım glukosy. Po vytvoˇren´ı shluk˚ u kvasinek a jejich sedimentaci se efektivnˇe sniˇzuje plocha, kterou buˇ nky mohou pˇrij´ımat ˇziviny. Jevem flokulace, který je zp˚ usoben interakc´ı bunˇeˇcných stˇen kvasnic se zabývá napˇr´ıklad práce [8]. Pro u ´ˇcely mˇeˇren´ı AP-testu je nutné flokulaci zabránit napˇr. vhodným m´ıchán´ım vzorku bˇehem mˇeˇren´ı (v naˇsem pˇr´ıpadˇe magnetickým m´ıchadlem). Rychlost m´ıchán´ı je závislá na geometrickém uspoˇrádán´ı experimentu, na aparatuˇre YATA s pouˇzit´ım zkumavky o objemu 25 ml a objemu vzorku 15 ml (resp. 16.5 ml po pˇridán´ı glukosy) je postaˇcuj´ıc´ı 200 ot/min (viz [2]).

38

Z´ avˇ ery kapitoly Minimalizac´ı faktor˚ u ovlivˇ nuj´ıc´ıch pr˚ ubˇeh a výsledky AP-testu, které zahrnuj´ı uchováván´ı vzork˚ u, pˇr´ıpravu vzork˚ u (vˇcetnˇe promýván´ı, doby leˇzen´ı vzorku pˇred samotným mˇeˇren´ım a hladovˇen´ı), koncentrace kvasnic a glukosy, teplota a flokulace, bylo dosaˇzeno optimáln´ıho postupu, pˇri kterém lze doc´ılit: maximáln´ı výsledné hodnoty AP a reprodukovatelnosti mˇeˇren´ı. Pˇri optimáln´ım postupu je nutné pouˇz´ıt vzorky kvasnic uchovávané v mladinˇe pˇri teplotˇe 0 − 2 ◦ C po dobu aˇz deseti dn˚ u. Pˇri pˇr´ıpravˇe vzork˚ u je nezbytné trojnásobné promyt´ı kvasnic za u ´ˇcelem odstranˇen´ı zdroj˚ u energie a neˇcistot obsaˇzených v mladinˇe a adsorbovaných na povrchu bunˇek, odstranˇen´ı pufrovac´ıho u ´ˇcinku mladiny a temperace vzorku na teplotu mˇeˇren´ı (25 ◦ C). Bylo ukázáno, ˇze po trojnásobném promyt´ı a prudkém odstˇredˇen´ı si takto sedimentované kvasnice udrˇz´ı svou vitalitu v ˇrádu hodin. Ovlivnˇen´ı AP-testu hladovˇen´ım vzorku v destilované vodˇe po jeho trojnásobném promyt´ı nebylo prokázáno. Dále je nutnost´ı pouˇz´ıt koncentraci kvasnic a glukosy pˇri testu za saturaˇcn´ı hranic´ı závislosti AP20 , která ˇcin´ı cca 1.5 g kvasnic na 15 ml destilované vody a 4.55 % koncentrace glukosy, kdy nepˇresné naváˇzen´ı kvasnic neovlivn´ı výsledek testu a nedojde k vyˇcerpán´ı glukosy v mediu. V pr˚ ubˇehu AP-testu je nutné udrˇzovat ◦ konstantn´ı teplotu (25±0.1) C a zabránit flokulaci kvasnic vhodným m´ıchán´ım vzorku (200 ot/min). Optimalizovaný postup AP-testu lze shrnout do následuj´ıc´ıch krok˚ u: • Zásobn´ı roztok s kvasnicemi roztˇrepeme (kv˚ uli homogenizaci) a odebereme z nˇej dostateˇcné“ mnoˇzstv´ı (cca 5 ml) koncentrované suspenze. ” • Vzorek krátce odstˇred´ıme, cca 1000 ot/min po dobu 60 s (cca 145 × g), a dekantujeme pivo. • Promyjeme destilovanou vodou (cca 15 ml) o teplotˇe cca 25 ◦ C. • Promýván´ı (vˇcetnˇe krátkého odstˇredˇen´ı) opakujeme, provedeme celkem tˇrikrát. • Po tˇret´ım promyt´ı následuje prudké odstˇredˇen´ı, cca 3000 ot/min po 10 min (1300 × g), slit´ı supernatantu. • Odváˇz´ıme (1.5 ± 0.1) g ˇcisté váhy kvasnic. • Pˇridáme 15 ml destilované vody do vzorku, spust´ıme mˇeˇren´ı ˇcasu a vzorek roztˇrepeme. • Mˇeˇren´ı prob´ıhá za stálého m´ıchán´ı (200 ot/min, mus´ı zabránit flokulaci) a pˇri stabiln´ı teplotˇe 25.0 ± 0.1 ◦ C. • V desáté minutˇe pˇridáme 1.5 ml glukosy (50 % roztok); koneˇcná koncentrace glukosy v mediu 4.55 % (hmotnost glukosy na objem vzorku). • Odeˇcteme hodnoty pH v desáté a dvacáté minutˇe.

39

Kapitola 4 Vyuˇ zit´ı AP-testu Pˇredchoz´ı kapitola byla vˇenována studiu vlivu vnˇejˇs´ıch faktor˚ u na pr˚ ubˇeh a výsledky AP-testu. Navrˇzený optimalizovaný postup mˇeˇren´ı (viz Materiál a metody) tyto vlivy minimalizuje a je pˇri nˇem dosaˇzeno maximáln´ı hodnoty AP a reprodukovatelnosti mˇeˇren´ı. Hlavn´ım c´ılem pro pouˇzit´ı AP-testu v praxi je nalezen´ı souvislosti mezi jeho výsledky a pr˚ ubˇehem fermentace. T´ımto se zabývala a korelaci potvrdila napˇr. práce [7]. V této diplomové práci je ovˇeˇrena souvislost mezi výsledky testu a poˇctem nasazen´ı kvasnic v pivovarském provozu. Dále se nab´ız´ı otázka, jestli lze test uplatnit pro studium p˚ usoben´ı stresových faktor˚ u na buˇ nky. Za t´ımto u ´ˇcelem bylo konkrétnˇe sledováno p˚ usoben´ı osmotického stresu na vitalitu bunˇek. Neménˇe zaj´ımavá m˚ uˇze být informace jak konkrétnˇe odráˇz´ı test acidifikaˇcn´ı schopnosti pr˚ ubˇeh metabolismu. Za t´ımto u ´ˇcelem bylo vybráno a pouˇzito v pr˚ ubˇehu testu nˇekolik druh˚ u xenobiotik. Tyto látky byly také pouˇzity s c´ılem nalézt inhibitor acidifikace, ˇcehoˇz by mohlo být vyuˇzito v dalˇs´ı kapitole pro studium spekter rozptyluj´ıc´ıho vzorku (kvasniˇcná suspenze) na absorpˇcn´ı spektra pH citlivé látky.

4.0.1

Vliv poˇ ctu nasazen´ı kvasnic v CKT na AP-test

Hlavn´ı proces kvaˇsen´ı pˇri výrobˇe piva dnes v mnoha pivovarech prob´ıhá v CKT (cylindricko-kónických tanc´ıch), coˇz jsou nádrˇze o objemu 2000 hl a v´ıce. Kvasnice jsou pˇri tomto procesu vystaveny r˚ uzným stresovým faktor˚ um, coˇz se m˚ uˇze projevit na kvalitˇe prokvaˇsen´ı a v koneˇcném d˚ usledku i na chuti piva. Po prokvaˇsen´ı a flokulaci jsou kvasnice odebrány z tanku a opˇet nasazeny k dalˇs´ı fermentaci. Kvalita odebraných kvasnic samozˇrejmˇe závis´ı na vrstvˇe, ze které jsou odebrány. Napˇr. na samém dnˇe tanku se vyskytuj´ı buˇ nky ve ˇspatném fyziologickém stavu (velké a staré), které ˇcasto autolyzuj´ı. Naopak ve vyˇsˇs´ıch vrstvách tanku je pak vyˇsˇs´ı zastoupen´ı mladých bunˇek (50 % aˇz 65 % panenských). Kvalita kvasnic je také ovlivnˇena poˇctem opˇetovného nasazen´ı. S vyˇsˇs´ım poˇctem nasazen´ı klesá viabilita a roste poˇcet bunˇek, jeˇz jsou v r˚ uzné r˚ ustové fázi, coˇz v d˚ usledku vede k projevu sn´ıˇzen´ı vitality.

40

2.8

2.7

AP20

2.6

2.5

2.4

2.3

2.2 -1

0

1 2 generace kvasnic

3

4

Obrázek 4.1: Závislost výsledku AP-testu na poˇctu nasazen´ı kvasnic k fermentaci, kde −1: jsou kvasnice z propagace, 0: kvasnice pˇred prvn´ım nasazen´ım v CKT. Za u ´ˇcelem zachycen´ı poklesu vitality pˇri opˇetovném nasazován´ı kvasnic pomoc´ı AP-testu byly promˇeˇreny vzorky (n = 20) odebrané pˇri prvn´ım aˇz ˇctvrtém nasazen´ı v CKT. Pro srovnán´ı byly namˇeˇreny také AP-testy kvasnic z propagace (−1. nasazen´ı) a testy kvasnic pˇred prvn´ım nasazen´ım (0. nasazen´ı). Výsledky test˚ u jsou vyneseny v grafu na obrázku 4.1. Mˇeˇren´ı byla provádˇena dle optimalizovaného postupu, vyneseny jsou pr˚ umˇerné hodnoty se standardn´ı odchylkou. Z grafu je vidˇet, ˇze s rostouc´ı generac´ı nasazených kvasnic klesá jejich AP20 , coˇz odpov´ıdá pˇredpoklad˚ um. Tento pokles ˇcin´ı 13 % mezi kvasnicemi z propagace a poˇctvrté nasazenými. S poˇctem nasazen´ı také roste smˇerodatná odchylka mˇeˇren´ı, coˇz je zp˚ usobeno zvýˇseným poˇctem výskytu jednotlivých bunˇek v r˚ uzných r˚ ustových fáz´ıch. Nejvˇetˇs´ı relativn´ı chyby mˇeˇren´ı je dosaˇzeno pro poˇctvrté nasazené kvasnice a ˇcin´ı 3 %, tato n´ızká hodnota relativn´ı chyby ukazuje na dobrou optimalizaci testu.

4.0.2

Vliv osmotick´ eho stresu na vitalitu kvasnic

Kvasnice pouˇz´ıvané k výrobˇe piva jsou vystaveny mnoha stresovým faktor˚ um, napˇr. zmˇeny pH (kyselé promýván´ı zabraˇ nuj´ıc´ı bakteriáln´ı kontaminaci), osmolarity (promýván´ı, lisován´ı a fermentace v mladinˇe vysoké stupˇ novitosti), koncentrace ethanolu, pˇr´ısunu ˇzivin nebo teploty. Následný pr˚ ubˇeh fermentace je pak ovlivnˇen schopnost´ı adaptovat se na tyto zmˇeny.

41

V pˇrirozeném prostˇred´ı pak kvasinky neustále podléhaj´ı r˚ uzným zmˇenám vnˇejˇs´ıch podm´ınek, napˇr. zmˇenám osmotického tlaku, a z d˚ uvod˚ u evoluˇcn´ıch jsou schopny se jim pˇrizp˚ usobit. Pˇri vloˇzen´ı bunˇek do destilované (tedy deionizované) vody, jeˇz je pro nˇe hypotonickým prostˇred´ım, je vystav´ıme osmotickému stresu. Buˇ nky jsou nuceny se vyrovnat s pˇr´ısunem vody v d˚ usledku osmózy, coˇz zp˚ usob´ı nár˚ ust objemu buˇ nky. Je-li buˇ nka v dobrém fyziologickém stavu a osmotický tlak nen´ı pˇr´ıliˇs velký, je schopna se s touto stresovou situac´ı vyrovnat. V opaˇcném pˇr´ıpadˇe m˚ uˇze doj´ıt k nevratnému poˇskozen´ı buˇ nky. Bylo prokázáno, ˇze je-li buˇ nka vystavena pomalým zmˇenám osmotického tlaku, je schopna se mu pˇrizp˚ usobovat (napˇr. pos´ılen´ım cytoskeletu) a odolat vyˇsˇs´ım rozd´ıl˚ um osmotických sil. Pˇri prudkém zmˇenˇe koncentrace roztoku s buˇ nkami je vyˇsˇs´ı pravdˇepodobnost jejich poˇskozen´ı. V souvislosti s výrobou piva jsou kvasinky pˇri hlavn´ım kvaˇsen´ı mladiny vystaveny osmotickému tlaku. Mladina je vysoce koncentrované médium bohaté na zkvasitelné cukry a je pro kvasnice hypertonickým prostˇred´ım. V tomto prostˇred´ı kvasinky zmenˇsuj´ı sv˚ uj objem v d˚ usledku u ´ bytku vody osmózou. Za u ´ˇcelem studia vlivu osmotického stresu na vitalitu bunˇek byly promˇeˇreny série AP-test˚ u s pouˇzit´ım r˚ uzných koncentrac´ı sorbitolu. Nejprve byl ovˇeˇren vliv pouˇzit´ı sorbitolu v r˚ uzných ˇcástech AP-testu na jeho výsledek. Pouˇ zit´ı sorbitolu v r˚ uzn´ ych ˇ c´ astech AP-testu Pro pˇredstavu o tom, jak buˇ nky na osmotický stres reaguj´ı byl navrˇzen následuj´ıc´ı experiment. Dle optimalizovaného postupu (viz stránka 39) byly skladovány a pˇripraveny vzorky kvasnic pro mˇeˇren´ı testu do momentu, kdy maj´ı být odváˇzeny. Dále byly namˇeˇreny ˇctyˇri stejné vzorky r˚ uzným zp˚ usobem: 1. Referenˇcn´ı mˇeˇren´ı, ˇcili dalˇs´ı postup mˇeˇren´ı testu beze zmˇeny, tedy odváˇzen´ı 1.5 g kvasnic mokré váhy, pˇridán´ı 15 ml H2 O a spuˇstˇen´ı ˇcasu, v 10. minutˇe pˇridán´ı 1.5 ml glukosy (jej´ı koneˇcná koncentrace 4.55 %) - standardn´ı AP-test. 2. Stejný postup jako v bodˇe 1., ale m´ısto 15 ml H2 O pouˇzito 15 ml sorbitolu (1.7 M roztok) a 1.5 g mokré váhy kvasnic - AP-test v sorbitolu. 3. Pˇred mˇeˇren´ım AP-testu hladovˇen´ı kvasnic v sorbitolu (1.7 M roztok) po dobu 1 h, poté jeˇstˇe jedno promyt´ı v destilované vodˇe, odstˇredˇen´ı (3000 ot/min po 10 min), odváˇzen´ı 1.5 g mokré váhy a spuˇstˇen´ı testu v 15 ml H2 O, v 10. minutˇe pˇridán´ı 1.5 ml glukosy (jej´ı koneˇcná koncentrace 4.55 %) - hladovˇen´ı v sorbitolu. 4. Pˇred mˇeˇren´ım AP-testu hladovˇen´ı kvasnic v H2 O po dobu 1 h, poté odstˇredˇen´ı (3000 ot/min po 10 min), odváˇzen´ı 1.5 g mokré váhy a spuˇstˇen´ı testu v 15 ml H2 O, v 10. minutˇe pˇridán´ı 1.5 ml glukosy (jej´ı koneˇcná koncentrace 4.55 %) - hladovˇen´ı v H2 O. Pr˚ ubˇehy AP-test˚ u namˇeˇrených pˇredchoz´ımi postupy jsou zobrazeny na obrázku 4.2 a výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.1. 42

6

standardni AP-test AP-test v sorbitolu hladoveni v sorbitolu hladoveni v H2O

5.5

pH

5

4.5

4

3.5 00:00

02:00

04:00

06:00

08:00

10:00 12:00 t [min:s]

14:00

16:00

18:00

20:00

22:00

Obrázek 4.2: Pr˚ ubˇehy AP-test˚ u v závislosti na pouˇzit´ı 1.7 M roztoku sorbitolu v r˚ uzných ˇcástech jejich pr˚ ubˇehu. Výsledky v tabulce 4.1 ukazuj´ı, ˇze byl-li AP-test proveden optimalizovaným zp˚ usobem je výsledná hodnota AP20 = 2.56, coˇz ukazuje na velmi dobrý fyziologický stav kvasnic. Pˇredcházelo-li mˇeˇren´ı hodinové hladovˇen´ı vzorku v destilované vodˇe, mˇelo to na výsledek testu minimáln´ı vliv (zmˇena AP20 o cca 1 %), coˇz odpov´ıdá výsledk˚ um pˇredchoz´ıch experiment˚ u s hladovˇen´ım provedeným v pˇredchoz´ı kapitole (viz stránka 36). V této souvislosti stoj´ı za povˇsimnut´ı (viz tabulka 4.1) rozd´ılné hodnoty pH dosaˇzené v desáté minutˇe mˇeˇren´ı (pH10 ) pro vzorky namˇeˇrené postupem 1. a 4., ve kterých se projevilo hodinové hladovˇen´ı pˇred testem poklesem výsledku spontánn´ı acidifikace AP10 o 14 %. Tabulka 4.1: Výsledky AP-test˚ u pˇri pouˇzit´ı 1.7M roztoku sorbitolu v r˚ uzných ˇcástech jejich pr˚ ubˇehu. postup 1. 2. 3. 4.

popis pH10 standardn´ı AP-test 4.06 AP-test v sorbitolu 4.39 hladovˇen´ı v sorbitolu 5.34 hladovˇen´ı v H2 O 4.38

43

pH20 3.74 4.38 4.93 3.76

AP10 2.24 1.91 0.96 1.92

AP20 2.56 1.92 1.37 2.54

Pro srovnán´ı s mˇeˇren´ım testu dle optimáln´ıho postupu byl pouˇzit postup ˇc. 2., tedy m´ısto 15 ml destilované vody (do které se následnˇe pˇridává 1.5 g kvasnic) bylo pouˇzito 15 ml sorbitolu (1.7 M roztok). Z grafu na obrázku 4.2 je zˇrejmé, ˇze pˇri takovémto postupu kvasinky vykazuj´ı nulovou acidifikaci po pˇridán´ı vnˇejˇs´ıho substrátu (1.5 ml glukosy) v desáté minutˇe mˇeˇren´ı. Hodnota pH dosaˇzená spontánn´ı acidifikac´ı je pravdˇepodobnˇe ovlivnˇena pH samotného sorbitolu a nevratným poˇskozen´ım bunˇek. Hodnota pH samotného sorbitolu nebyla namˇeˇrena. Posledn´ı vzorek byl pˇripraven dle postupu 4. a byl tedy vystaven hodinovému hladovˇen´ı v sorbitolu (1.7 M roztok). Výsledná hodnota AP20 ˇcin´ı pouze 1.37 a z pr˚ ubˇehu kˇrivky (obrázek 4.2) je vidˇet velmi slabá odezva na pˇridán´ı glukosy v desáté minutˇe mˇeˇren´ı, coˇz je pravdˇepodobnˇe zp˚ usobeno poˇskozen´ım bunˇek. M˚ uˇzeme tedy usoudit, ˇze vzorku vystavenému hladovˇen´ı po dobu jedné hodiny ve výraznˇe hypertonickém prostˇred´ı v podobˇe roztoku sorbitolu klesla hodnota viability a zbylé buˇ nky byly schopny jen velmi slabˇe acidifikovat vnˇejˇs´ı prostˇred´ı po pˇridán´ı glukosy. Tento jev souvis´ı s faktem, ˇze koncentrace sorbitolu 1.7 M odpov´ıdá asi trojnásobku pˇrirozené vnitˇrn´ı osmolarity bunˇek kvasnic (viz [1]) a docház´ı pˇri n´ı k plazmolýze bunˇek. Jelikoˇz vzorek namˇeˇrený modifikac´ı AP-testu dle postupu ˇc. 2 (AP-test v sorbitolu) na pˇridán´ı vnˇejˇs´ıho substrátu v˚ ubec nereagoval, v dalˇs´ıch experimentech bylo postupováno dle alternativy 3. a byla promˇeˇrena závislost v´ ysledku testu na koncentraci sorbitolu (ve kterém vzorek hladov´ı). Vliv hladovˇ en´ı v sorbitolu r˚ uzn´ e koncentrace na v´ ysledek AP-testu V pˇredchoz´ıch odstavc´ıch jsme z´ıskali pˇredstavu o tom, jak osmotický stres simulovaný p˚ usoben´ım molekul sorbitolu ovlivˇ nuje pr˚ ubˇeh a výsledky AP-testu. Nyn´ı se zamˇeˇr´ıme na jednu z alternativ pouˇzitých v pˇredchoz´ım experimentu. Pro u ´ˇcely mˇeˇren´ı vlivu hladovˇen´ı kvasnic v sorbitolu o r˚ uzné koncentraci, jeˇz je pro kvasnice osmotickým stresovým prostˇred´ım byl pozmˇenˇen optimalizovaný AP-test následovnˇe. Vˇsechny kroky zahrnuj´ıc´ı skladován´ı a pˇr´ıpravu vzorku z˚ ustaly nezmˇenˇeny, po trojnásobném promyt´ı vzorku byly kvasnice um´ıstˇeny do roztoku sorbitolu (o koncentraci: 1.2 M, 0.8 M a 0.4 M), kde byly m´ıchány po dobu 30 min. Jako reference byl zmˇeˇren ˇctvrtý vzorek standardn´ım zp˚ usobem, ˇcili bez hladovˇen´ı. Buˇ nky nebylo nutné vystavovat hladovˇen´ı v destilované vodˇe (tak jako v pˇredchoz´ım experimentu), jelikoˇz po trojnásobném promyt´ı vzorku nemá na výsledek AP-testu vliv. Pr˚ ubˇehy takto provedených AP-test˚ u jsou na obrázku 4.3 a výsledné hodnoty shrnuty v tabulce 4.2. Pˇri standardn´ım proveden´ı AP-testu kvasinky vykazovaly výslednou hodnotu AP20 = 2.42, coˇz ukazuje na dobrou vitalitu bunˇek. Pˇri hladovˇen´ı bunˇek po 30 min v sorbitolu se hodnota AP20 s rostouc´ı koncentrac´ı sorbitolu sniˇzovala. Maximáln´ı pokles byl zaznamenán pˇri nejvyˇsˇs´ı pouˇzité koncentraci sorbitolu (1.2 M roztok) na AP20 = 1.31, coˇz je pokles o 46 % z p˚ uvodn´ı hodnoty namˇeˇrené bez sorbitolu. Výsledná hodnota testu AP20 = 1.31 jiˇz odpov´ıdá znaˇcnˇe poˇskozeným buˇ nkám. Pr˚ ubˇeh poklesu hodnot AP20 je zachycen na obrázku 4.4. Výsledky naznaˇcuj´ı, ˇze ˇc´ım vyˇsˇs´ı je osmotický tlak (v podobˇe pˇr´ıtomnosti sorbitolu v roztoku) p˚ usob´ıc´ı na buˇ nky bˇehem hladovˇen´ı, t´ım menˇs´ı je projev vitality v následném

44

6

0.4M sorbitol 0.8M sorbitol 1.2M sorbitol bez hladoveni

5.5

pH

5

4.5

4

3.5 00:00

02:00

04:00

06:00

08:00

10:00 t [min:s]

12:00

14:00

16:00

18:00

20:00

Obrázek 4.3: Pr˚ ubˇeh AP-testu po hladovˇen´ı vzork˚ u v r˚ uzných koncentrac´ıch sorbitolu. AP-testu. Tento jev m˚ uˇze být zp˚ usoben zvýrazˇ nován´ım vlivu osmotického stresu na buˇ nky a také poklesem viability vzorku. Uvedená mˇeˇren´ı ukazuj´ı jednoznaˇcný vliv p˚ usoben´ı osmotického stresu na vitalitu bunˇek. V pivovarském provozu jsou kvasnice vystaveny osmotickému tlaku zejména pˇri procesu hlavn´ıho kvaˇsen´ı, které prob´ıhá v CKT. Mladina bohatá na zkvasitelné cukry (zejména maltosu) je pro pivovarské kvasnice vynikaj´ıc´ı ˇzivné médium. Obsahuje vˇsak i jiné látky, které pro buˇ nky zkvasitelné nejsou a neprocház´ı ani pˇres plazmatickou membránu. Mladina je tedy pro kvasinky prostˇred´ı hypertonické a u ´ roveˇ n osmotického tlaku na buˇ nky roste se stupˇ novitost´ı mladiny. Vliv osmotického tlaku na vitalitu bunˇek fermentuj´ıc´ıch v mladinˇe (prostˇred´ı bohaté na ˇziviny) o r˚ uzné stupˇ novitosti byl studován v následuj´ıc´ım experimentu. Ten byl provádˇen ve spolupráci s Výzkumným ´ u ´ stavem pivovarským a sladaˇrský, a.s (VUPS). Tabulka 4.2: Shrnut´ı výsledk˚ u AP-testu s vlivem osmotického stresu pˇri hladovˇen´ı v r˚ uzných koncentrac´ıch sorbitolu. c [M] 0 0.4 0.8 1.2

pH10 4.53 4.52 4.76 5.36

pH20 3.88 3.91 4.25 4.99

45

AP10 1.77 1.78 1.54 0.94

AP20 2.42 2.39 2.05 1.31

2.6

2.4

2.2

AP20

2

1.8

1.6

1.4

1.2 0

0.2

0.4

0.6 c [M]

0.8

1

1.2

Obrázek 4.4: Závislost výsledku AP-testu na koncentraci sorbitolu, ve kterém kvasnice hladovˇely. Vliv osmotick´ eho tlaku na vitalitu kvasnic fermentuj´ıc´ıch v mladinˇ e r˚ uzn´ e stupˇ novitosti V pˇredchoz´ım experimentu bylo ukázáno, ˇze osmotický tlak v podobˇe hladovˇen´ı bunˇek v sorbitolu má jednoznaˇcný vliv na vitalitu. Nyn´ı bude studováno, jakou roli pˇri p˚ usoben´ı osmotického stresu na buˇ nky hraje mladina, ve které buˇ nky fermentuj´ı. Mˇeˇren´ı vˇsech AP-test˚ u probˇehlo dle optimalizovaného postupu (viz stránka 39), vzorky se liˇsily v tom, za jakých podm´ınek buˇ nky fermentovaly. Kaˇzdý vzorek byl celkem tˇrikrát nasazen do kvasného válce a to cca s týdenn´ım odstupem: 1. Byla pˇripravena mladina o tˇrech r˚ uzných stupˇ novitostech: 12 ◦ , 16 ◦ a 20 ◦ . Mladiny 16 ◦ a 20 ◦ byly pˇripraveny z mladiny 12 ◦ pˇridán´ım sorbitolu pro vyvolán´ı osmotického tlaku odpov´ıdaj´ıc´ıho poˇzadované stupˇ novitosti (takˇze obsah zkvasitelných cukr˚ u z˚ ustal zachován). Do jednotlivých mladin pak byly nasazeny kvasnice a bylo provedeno modelové kvaˇsen´ı v kvasném válci (cca 5 dn´ı). Poté byla z kaˇzdého válce odebrána ˇcást kvasnic (z kaˇzdého po dvou vzorc´ıch) a na nich pak zmˇeˇren AP-test. 2. Byla opˇet pˇripravena mladina stejnˇe jako v pˇredchoz´ım pˇr´ıpadˇe. Do jednotlivých kvasných válc˚ u pak byly opˇetovnˇe nasazeny kvasnice z 1. nasazen´ı dle mladiny odpov´ıdaj´ıc´ı stupˇ novitosti. Po skonˇcen´ı modelového kvaˇsen´ı byla opˇet odebrána ˇcást kvasnic (po dvou vzorc´ıch) a na nich zmˇeˇren AP-test. 46

Tabulka 4.3: Shrnut´ı výsledk˚ u mˇeˇren´ı vlivu nasazen´ı kvasnic v mladinˇe r˚ uzné stupˇ novitosti na vitalitu. Oznaˇcen´ı vzorku odpov´ıdá stupˇ novitosti mladiny, v n´ıˇz fer◦ c´ı kvasnice nasazené poprvé a podruhé v 16 ◦ mladinˇe, analomentoval, 12 16 ◦ pak znaˇ ◦ gicky pro 12 20 ◦. nasazen´ı ˇcas [dn˚ u] 1. 0

2.

7

3.

13

vzorek 12 ◦ 16 ◦ 20 ◦ 12 ◦ 16 ◦ 20 ◦ 12 ◦ ◦ 12 16 ◦ ◦ 12 20 ◦

pH10 3.91 4.03 4.02 3.96 3.99 4.22 3.98 4.03 3.97

pH20 3.76 3.79 3.83 3.77 3.81 3.89 3.76 3.75 3.74

AP10 2.40 2.27 2.29 2.34 2.32 2.08 2.32 2.28 2.34

AP20 2.55 2.52 2.47 2.54 2.49 2.41 2.55 2.55 2.56

3. Potˇret´ı byla pˇripravena tˇrikrát tatáˇz 12 ◦ mladina. Následovalo opˇetovné nasazen´ı kvasnic (jiˇz tˇret´ı) do kvasných válc˚ u. Po ukonˇcen´ı modelového kvaˇsen´ı byla opˇet odebrána ˇcást vzork˚ u (z kaˇzdého válce dvakrát) a na nich zmˇeˇren AP-test. Výsledky vˇsech namˇeˇrených test˚ u jsou shrnuty v tabulce 4.3, hodnoty jsou pr˚ umˇerné z kaˇzdé dvojice namˇeˇrených vzork˚ u. Maximáln´ı dosaˇzená standardn´ı odchylka mˇeˇren´ı je pod u ´ rovn´ı 4 %, v tabulce nejsou chyby mˇeˇren´ı uvedeny (viz obrázek 4.5 i s chybami mˇeˇren´ı). Z hodnot uvedených v tabulce vid´ıme, ˇze po prvn´ım nasazen´ı je výsledek APtestu kvasnic fermentuj´ıc´ıch v 12 ◦ mladinˇe AP20 = 2.55, coˇz odpov´ıdá velmi dobrému fyziologickému stavu bunˇek. Ostatn´ı výsledky AP-test˚ u vzork˚ u fermentuj´ıc´ıch v prostˇred´ı o vyˇsˇs´ım osmotickém tlaku se m´ırnˇe liˇs´ı od této hodnoty, lze zaznamenat pokles AP20 s rostouc´ı stupˇ novitost´ı mladiny. Ve výsledc´ıch AP-testu po druhém nasazen´ı je vidˇet pokles hodnot AP20 o 0 %, 1 % a 2.5 % oproti prvn´ımu nasazen´ı. Tyto zmˇeny ve vitalitˇe se pohybuj´ı pod a nad hranic´ı pˇresnosti AP-testu. Nakonec po tˇret´ım nasazen´ı výsledné hodnoty AP20 vzrostly na u ´ roveˇ n hodnot po prvn´ım nasazen´ı nebo byly dokonce jeˇstˇe výˇse. Zároveˇ n po posledn´ım nasazen´ı vzrostly standardn´ı odchylky mˇeˇren´ı na jiˇz zmiˇ novaných cca 4 %. Grafický pr˚ ubˇeh hodnot výsledk˚ u testu i se standardn´ımi odchylkami mˇeˇren´ı je znázornˇen na obrázku 4.5. Z tohoto obrázku je vidˇet, ˇze poˇcáteˇcn´ı vitalita jednotlivých vzork˚ u byla niˇzˇs´ı s vyˇsˇs´ı stupˇ novitost´ı mladiny. Po druhém nasazen´ı je zˇretelný pokles vitalit vzork˚ u a po tˇret´ım nasazen´ı opˇetovný nár˚ ust. S rostouc´ım poˇctem dn˚ u od prvn´ıho nasazen´ı kvasnic rostla i standardn´ı odchylka mˇeˇren´ı, to je zp˚ usobeno vˇetˇs´ım poˇctem bunˇek ve vzorku, jeˇz jsou v r˚ uzných r˚ ustových fáz´ıch. Lze tedy usuzovat, ˇze dlouhodobý vliv osmotické stresu pˇri kultivován´ı kvasnic ˇ e médium v podobˇe na zkvasitelné cukry bohaté se neprojevuje na jejich vitalitˇe. Zivn´ mladiny p˚ usob´ı jako ochranný faktor pro buˇ nky, jeˇz jsou schopny se osmotickému tlaku 47

2.65

12°, 12°, 12° 16°, 16°, 12°16° 20°, 20°, 12°20°

2.6

AP20

2.55

2.5

2.45

2.4

2.35 1

2 nasazení kvasnic

3

Obrázek 4.5: Grafické znázornˇen´ı výsledk˚ u AP-testu mˇeˇreného po jednotlivých nasazen´ıch kvasnic, jeˇz studuje vliv osmotického tlaku pˇri fermentaci bunˇek v mladinˇe r˚ uzné stupˇ novitosti. pˇrizp˚ usobit. V porovnán´ı s pˇredchoz´ım experimentem, kdy se vliv osmotického stresu na vitalitu jednoznaˇcnˇe projevil poklesem vitality, m˚ uˇzeme ˇr´ıci, ˇze osmotický stres má pouze akutn´ı u ´ˇcinek a z dlouhodobého hlediska se neprojev´ı na vitalitˇe kvasnic.

4.0.3

Inhibice metabolick´ ych proces˚ u

Inhibice je oznaˇcen´ı procesu, který brzd´ı, omezuje, zadrˇzuje, zamezuje, utlumuje nebo zpomaluje jiný subjekt nebo jev, v naˇsem pˇr´ıpadˇe chemickou reakci. Látkám, jeˇz chemické reakce inhibuj´ı se ˇr´ıká inhibitory a vˇetˇsinou se jedná o xenobiotika, neboli cizorodé látky jeˇz nevznikaj´ı v lidském tˇele. Z pohledu této práce jsou inhibitory zaj´ımavé pro studium vlivu inhibice nˇekteré z reakc´ı metabolické dráhy zpracován´ı cukr˚ u v buˇ nkách kvasinek na zpomalen´ı nebo zastaven´ı acidifikace vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı, coˇz se odraz´ı na pr˚ ubˇehu a výsledc´ıch AP-testu. Dalˇs´ı motivac´ı, pro studium vlivu inhibitor˚ u na test vitality je nalezen´ı takové látky, která by zastavila acidifikaci a zároveˇ n jinak neovlivnila pr˚ ubˇeh testu a charakter bunˇek. Toho by bylo moˇzné vyuˇz´ıt v dalˇs´ı kapitole (Bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı pH), pˇri studiu vlivu mnohonásobného rozptylu (na buˇ nkách) na spektra absorbuj´ıc´ı látky (podrobnosti v dalˇs´ı kapitole).

48

V následuj´ıc´ım experimentu byl zkoumán vliv tˇrech inhibitor˚ u blokuj´ıc´ıch r˚ uzné ˇcásti metabolismu a jako ˇctvrtý inhibitor byla pouˇzita látka YC-TETRA, coˇz je chmelový extrakt. Vliv této látky na metabolismus nen´ı zcela objasnˇen. Inhibuj´ıc´ı látky byly zvoleny dle osobn´ıho doporuˇcen´ı Karla Siglera, konkrétnˇe se jednalo o tyto látky: iodoacetamid (IAA), glukosamin a malonát, charakteristika tˇechto látek viz Materiál a metody. Pro u ´ˇcely následuj´ıc´ıch mˇeˇren´ı byla zachována pˇr´ıprava vzork˚ u dle optimalizovaného AP-testu (viz strana 39), byl vˇsak upraven postup mˇeˇren´ı. D˚ uleˇzité kroky experimentu lze shrnout do následuj´ıc´ıch bod˚ u: • Byly pˇripraveny roztoky inhibitor˚ u a dále vzorky kvasnic dle optimalizovaného postupu, ˇcili tˇrikrát promyté, odstˇredˇené (3000 ot/min po 10 min) a z nich odváˇzeno 1.5 g mokré váhy. • Kvasnice byly zality destilovanou vodou a bylo spuˇstˇeno mˇeˇren´ı ˇcasu. Objem H2 O ve vzorku: – 16.5 ml pro referenˇcn´ıho mˇeˇren´ı AP-testu bez vlivu xenobiotika – 15 ml pro mˇeˇren´ı AP-testu s xenobiotikem. • V desáté minutˇe pˇridáno 1.5 ml (50 % roztoku glukosy), koneˇcná koncentrace glukosy ve vzorku 4.2 % (se zapoˇcten´ım dávky inhibitoru). • Bezprostˇrednˇe po pˇridán´ı glukosy bylo do vzorku nadávkováno 1.5 ml inhibitoru (36.4 mM roztok v koneˇcné koncentraci). Pr˚ ubˇehy AP-test˚ u namˇeˇrených dle uvedeného postupu jsou na obrázku 4.6 a souhrn výsledných hodnot pak v tabulce 4.4. Výsledek testu pro referenˇcn´ı vzorek, jeˇz nebyl ovlivnˇen pˇridán´ım inhibitoru (jehoˇz pr˚ ubˇeh mˇeˇren´ı byl modifikován oproti optimalizovanému postupu pouze pˇridán´ım 16.5 ml H2 O m´ısto 15 ml kv˚ uli srovnán´ı koncentrac´ı glukosy a kvasnic s ostatn´ımi vzorky), ˇcin´ı AP20 = 2.53, coˇz odpov´ıdá buˇ nkám v dobrém fyziologickém stavu. Z pr˚ ubˇeh˚ u test˚ u na obrázku 4.6 je zˇrejmé, ˇze látky malonát a YC-TETRA maj´ı znaˇcný alkalizuj´ıc´ı u ´ˇcinek na vzorek. Po pˇridán´ı tˇechto látek do vzorku vzrostlo pH o v´ıce neˇz 40 % (malonát) a v´ıce neˇz 20 % (YC-TETRA), coˇz znehodnocuje výsledky Tabulka 4.4: Souhrn výsledk˚ u AP-testu s pouˇzit´ım r˚ uzných typ˚ u inhibitor˚ u. vzorek bez inhibitoru IAA glukosamin malonát YC-TETRA

pH10 4.21 4.16 4.25 4.27 4.22

49

pH20 3.77 4.16 4.09 5.68 5.26

AP10 2.09 2.14 2.05 2.03 2.08

AP20 2.53 2.14 2.21 0.62 1.04

6.5

bez inhibitoru IAA glukosamin malonat YC-TETRA

6

pH

5.5

5

4.5

4

3.5 00:00

02:00

04:00

06:00

08:00

10:00 t [min:s]

12:00

14:00

16:00

18:00

20:00

Obrázek 4.6: Pr˚ ubˇehy AP-test˚ u s pouˇzit´ım r˚ uzných typ˚ u inhibitor˚ u. AP-testu tˇechto vzork˚ u. Zásaditá povaha malonátu, která se projevila zvýˇsen´ım pH vzorku po jeho pˇridán´ı, odpov´ıdá inhibuj´ıc´ım vlastnostem této látky. Malonát totiˇz blokuje pˇremˇenu sukcinátu na fumarát, která v rámci citrátového cyklu prob´ıhá v mitochondriáln´ı matrix, kde je cca pH = 8. Z pr˚ ubˇehu kˇrivek AP-testu po pˇridán´ı glukosaminu a IAA v desáté minutˇe mˇeˇren´ı je vidˇet, ˇze tyto látky nezmˇenily bezprostˇrednˇe pH vzorku jako pˇredchoz´ı látky. Dalˇs´ı zmˇeny pH v pr˚ ubˇehu testu jsou skuteˇcným projevem metabolizmu v podobˇe acidifikace vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı na pˇridán´ı xenobiotika. Po pˇridán´ı glukosaminu vzorek vykazuje témˇeˇr nulovou acidifikaci, jinými slovy buˇ nky nereaguj´ı na pˇridán´ı vnˇejˇs´ıho substrátu v podobˇe glukosy. Tomuto výsledku neodpov´ıdá stále relativnˇe vysoká hodnota AP20 = 2.21 tohoto vzorku, která je zkreslena spontánn´ı acidifikac´ı v prvn´ıch deseti minutách mˇeˇren´ı. Pr˚ ubˇeh AP-testu s glukosaminem dobˇre odpov´ıdá charakteru p˚ usoben´ı tohoto inhibitoru na buˇ nku. Glukosamin je látka velmi podobná glukose, liˇs´ı se pouze zmˇenou hydroxylové skupiny (OH) na uhl´ıku 2 za skupinu NH2 . Tato chemická podobnost ˇcin´ı glukosamin tzv. kompetitivn´ım inhibitorem glukosy pˇri jej´ı fosforylaci (prvn´ı reakce glykolýzy). Metabolická dráha glukosy je t´ım pádem zablokována hned na zaˇcátku, coˇz se v koneˇcném d˚ usledku projev´ı nulovou acidifikac´ı vnˇejˇs´ıho prostˇred´ı. Jak jiˇz bylo ˇreˇceno a z grafu je vidˇet, byla zaznamenána malá zmˇena pH po pˇridán´ı glukosaminu a to o cca 4 %. To lze vysvˇetlit zp˚ usobem pˇridán´ı této látky do vzorku. Nejprve byla buˇ nkám nadávkována glukosa a teprve po cca 20 − 25 sekundách glukosamin. Bˇehem této doby zˇrejmˇe doˇslo k difuzi ˇcásti glukosy do bunˇek a spuˇstˇen´ı glykolýzy jeˇstˇe pˇred pˇridán´ım inhibitoru. 50

Výsledky AP-testu s IAA uvedené v tabulce 4.4 ukazuj´ı, ˇze buˇ nky po prvn´ıch deseti minutách dosáhly spontánn´ı acidifikac´ı pH10 = 4.16 a tato hodnota pH byla stejná i na konci mˇeˇren´ı po dvaceti minutách. To je ostatnˇe vidˇet i na uvedeném obrázku 4.6, graf kˇrivky se vˇsak vyznaˇcuje razantn´ımi zmˇenami pH ve svém pr˚ ubˇehu. Po pˇridán´ı glukosy následuje pokles pH aˇz na minimum pH = 3.7, tato hodnota je srovnatelná s koneˇcnou hodnotou pH20 na konci referenˇcn´ıho mˇeˇren´ı. Poté následuje netypický nár˚ ust pH aˇz na koneˇcnou zmiˇ novanou hodnotu pH20 = 4.16. Tento pr˚ ubˇeh je pravdˇepodobnˇe zp˚ usoben pomalým pronikán´ım IAA do bunˇek, který se projev´ı opoˇzdˇeným zastaven´ım acidifikace. Mˇeˇren´ı AP-test˚ u s pouˇzit´ım r˚ uzných inhibitor˚ u v jejich pr˚ ubˇehu ukázala, ˇze xenobiotické látky mohou zásadn´ım zp˚ usobem ovlivnit metabolismus bunˇek, coˇz se projev´ı na pr˚ ubˇehu ˇci výsledc´ıch testu. Výsledky naznaˇcuj´ı, ˇze glukosamin a IAA jsou vhodnými látkami pro zastaven´ı acidifikace, za t´ımto u ´ˇcelem by mˇely být aplikovány pˇred pˇridán´ım glukosy do media a IAA nav´ıc s vˇetˇs´ım ˇcasovým pˇredstihem. Tato vlastnost glukosaminu se dobˇre hod´ı pro analýzu vlivu rozptylu na kvasniˇcných buˇ nkách na absorpˇcn´ı spektrum látky citlivé na pH, ˇcehoˇz vˇsak nebylo z ˇcasových d˚ uvod˚ u v dalˇs´ı kapitole vyuˇzito. Malonát a YC-TETRA ovlivˇ nuj´ı pr˚ ubˇeh AP-testu svou zásaditou povahou, ˇcili vliv na vitalitu kvasnic nen´ı zˇrejmý. Pro dalˇs´ı studium vlivu tˇechto látek se nab´ız´ı nˇekolik u ´ prav navrˇzeného experimentu, napˇr. u ´ prava pH chemické látky pˇred pˇridán´ım do vzorku. Z´ avˇ ery kapitoly V této kapitole byly provedeny experimenty, jeˇz mˇely ovˇeˇrit vyuˇzitelnost optimalizovaného AP-testu na vzorc´ıch kvasnic pouˇzitý v pr˚ umyslovém provozu. Za t´ımto u ´ˇcelem byl pomoc´ı AP-testu sledován vliv opˇetovného nasazen´ı kvasnic na jejich vitalitu. Z experimentáln´ıch výsledk˚ u je zˇrejmý pokles vitality se zvyˇsuj´ıc´ım se poˇctem nasazen´ı aˇz o 13 % mezi kvasnicemi z propagace a poˇctvrté nasazenými kvasnicemi (viz obrázek 4.1). Mˇeˇren´ı simuluj´ıc´ı p˚ usoben´ı osmotického stresu na buˇ nky v podobˇe r˚ uzných osmotických tlak˚ u vyvolaných pouˇzit´ım alkoholického cukru sorbitolu naznaˇcuj´ı, ˇze osmotický tlak p˚ usob´ıc´ı dlouhodobˇe pˇri fermentaci bunˇek v mladinˇe nemá na vitalitu bunˇek vliv, projevuje se pouze takzvaný akutn´ı u ´ˇcinek. Akutn´ı u ´ˇcinek se na vitalitˇe projevil pˇri hladovˇen´ı bunˇek v hypertonickém prostˇred´ı. Potvrzuje se tak, ˇze mladina má ochranný vliv na kvasniˇcné buˇ nky pˇri p˚ usoben´ı zvýˇseného osmotického tlaku, jemuˇz jsou vystaveny napˇr. pˇri výrobˇe piva vyˇsˇs´ı stupˇ novitosti. Byl ovˇeˇren vliv vybraných xenobiotik na pr˚ ubˇeh a výsledky AP-testu. Ukázalo se, ˇze látky IAA a malonát jsou vhodné pro zablokován´ı acidifikace.

51

Kapitola 5 Bezkontaktn´ı mˇ eˇ ren´ı pH V pˇredchoz´ıch dvou kapitolách byla popsána optimalizace metody AP-testu a byla ukázána jeho vyuˇzitelnost pˇri studiu vitality pr˚ umyslovˇe nasazených vzork˚ u ˇci pˇri reakci kvasnic na r˚ uzné stresové faktory. Mˇeˇren´ı pH bylo bez výhrad provádˇeno klasickou elektrochemickou sondou. To pˇrináˇs´ı nˇekteré nevýhod, jak jiˇz bylo zm´ınˇeno dˇr´ıve. Z tˇechto d˚ uvod˚ u se nab´ız´ı pouˇzit´ı bezkontaktn´ıho mˇeˇren´ı pH pouˇzit´ım pH-senzitivn´ıch látek a fotometrickým sn´ımán´ım vzork˚ u. Jedn´ım z u ´ kol˚ u této práce bylo ovˇeˇrit pouˇzitelnost tˇechto mˇeˇren´ı, která nejsou limitována mnoˇzstv´ım vzorku, nav´ıc je pˇri nich pH mˇeˇreno z celého objemu vzorku a umoˇzn ˇ uj´ı principiálnˇe mˇeˇrit v´ıce vzork˚ u souˇcasnˇe. Spektrometrická mˇeˇren´ı kvasniˇcných suspenz´ı (pouˇz´ıvaných pˇri AP-testu) vˇsak pˇrináˇs´ı jiné nevýhody a to pˇredevˇs´ım problémy s vysokou absorbanc´ı a vlivem mnohonásobného rozptylu na mˇeˇrené spektrum. V tˇechto vzorc´ıch jsou rozptylovými centry celé buˇ nky a jednotlivé organely a vzhledem k jejich charakteristickým velikostem se pouˇz´ıvá popisu Mieova rozptylu. Ten je vˇsak pˇresný pro koule s homogenn´ım rozloˇzen´ım indexu lomu. Buˇ nky (konkrétnˇe kvasinky) jsou vˇsak objekty r˚ uzných tvar˚ u a maj´ı sloˇzitou vnitˇrn´ı strukturu, ˇc´ımˇz se stává obecný popis u ´ hlové charakteristiky rozptylu na tˇechto vzorc´ıch velmi sloˇzitý. Rozptylu svˇetla na bunˇeˇcných suspenz´ıch se bˇeˇznˇe vyuˇz´ıvá napˇr. k mˇeˇren´ı r˚ ustových kˇrivek kvasinek sledován´ım zmˇen intenzity pod daným u ´ hlem. V této práci konkrétnˇe jsou namˇeˇrená kombinovaná spektra (viz obrázek 5.9 nebo 5.11) tvoˇrena rozptyluj´ıc´ı sloˇzkou v podobˇe separonu nebo suspenze kvasnic a absorbuj´ıc´ı sloˇzkou v podobˇe pH citlivé látky. C´ılem je z takového spektra extrahovat ˇcást patˇr´ıc´ı pH-indikátoru a z nˇej urˇcit pH suspenze. Za t´ımto u ´ˇcelem bylo nutné nejdˇr´ıve nalézt vhodný pH-indikátor, namˇeˇrit jeho spektráln´ı charakteristiku a urˇcit vhodnou koncentraci pro mˇeˇren´ı s rozptyluj´ıc´ımi ˇcásticemi. Stejnˇe tak bylo nutné namˇeˇrit spektroskopické vlastnosti rozptyluj´ıc´ı ˇcásti vzorku (bunˇek kvasnic) pˇredevˇs´ım s ohledem na koncentraci, která ovlivˇ nuje mnohonásobný rozptyl. Koncentrace obou látek nav´ıc musela být taková, aby absorbance vzorku byla pod tˇremi absorpˇcn´ımi jednotkami maximáln´ı citlivost´ı spektrometru. Jak bylo napsáno dˇr´ıve, absorpˇcn´ı spektrum barviva je sloˇzeno za dvou ˇcást´ı (alkalické a acidické dle vztahu 1.3), oznaˇcme ho jako ABCG (λ). Je ovlivnˇeno pˇridán´ım rozptyluj´ıc´ıch center do vzorku (napˇr. kvasnice nebo separon), jejich absorbanci

52

oznaˇcme jako Arozptyl (λ). Dohromady tato dvˇe spektra daj´ı spektrum výsledné, které mˇeˇr´ıme, oznaˇcme ho jako A(λ). Pˇri n´ızkých koncentrac´ıch rozptyluj´ıc´ıch center plat´ı, ˇze Arozptyl (λ) je u ´ mˇerná koncentraci rozptylových center a celková absorbance vzorku A(λ) je dána souˇctem absorbance rozptyluj´ıc´ı ˇcást´ı vzorku a absorbuj´ıc´ı ˇcást´ı vzorku: A(λ) = Arozptyl (λ) + ABCG (λ).

(5.1)

Tento vztah vˇsak neplat´ı pro vyˇsˇs´ı koncentrace rozptyluj´ıc´ıch ˇcástic a vliv rozptylu na spektra je komplexn´ı. Nedocház´ı tak pouze ke zvýˇsen´ı hodnot absorbance v d˚ usledku rozptylu, ale také k celkovému zploˇstˇen´ı absorpˇcn´ıho spektra. Dalˇs´ı postup pro z´ıskán´ı pH z namˇeˇreného spektra tedy spoˇc´ıvá v odeˇcten´ı rozptylové sloˇzky spektra (Arozptyl (λ)) od celkového spektra A(λ) a nalezen´ı funkce, která jednoznaˇcnˇe pˇriˇrad´ı spektru ABCG (λ) hodnotu pH. Za t´ımto u ´ˇcelem zaved’me parametr R, který vypoˇcteme z namˇeˇreného spektra, a ten bude promˇennou funkce pH(R). Výpoˇcet parametru R ze spektra ABCG (λ) lze provést mnoha zp˚ usoby, napˇr. rozloˇzen´ım kombinovaného spektra do jednotlivých sloˇzek (rozptyluj´ıc´ı ˇcást, alkalická ˇcást BCG a acidická ˇcást BCG) a z nich pak urˇcit R (kombinac´ı rovnic 5.1 a 1.3, v´ıce v [3]) nebo vypoˇcten´ım plochy pod kˇrivkou spektra, která se mˇen´ı s pH. Druhý zp˚ usob je pouˇzit v této práci. V´ ypoˇ cet parametru R V této práci je tedy parametr R vypoˇcten z plochy pod kˇrivkou daného absorpˇcn´ıho spektra barviva. Pro tento parametr jsou d˚ uleˇzité následuj´ıc´ı pˇredpoklady: nezávislost na koncentraci barviva ve vzorku a jednoznaˇcné pˇriˇrazen´ı R (resp. pH) danému spektru. Prvn´ı pˇredpoklad je splnˇen pˇri pouˇzit´ı normovaných spekter a n´ızkých koncentrac´ıch BCG ve vzorku (do 1 µM koncentrace roztoku BCG, jak je urˇceno na stranˇe 58). Druhý pˇredpoklad pro takto zavedený parametr je také splnˇen, podrobnosti na stranˇe 60. Spektra barviva je tedy nutné normovat a to na absorbanci na vlnové délce isobestickému bodu (viz dále) kv˚ uli nezávislosti jejich pr˚ ubˇehu na koncentraci (v pˇr´ıpadˇe BCG se jedná o λ = 512 nm). Integrac´ı normovaného spektra pak z´ıskáme parametr R. Integraˇcn´ı meze byly zvoleny v rozsahu vlnových délek λ = 400 nm aˇz λ = 750 nm. Na vlnové délce λ = 400 nm je totiˇz vedlejˇs´ı maximum alkalické sloˇzky BCG a na vlnové délce λ = 750 nm jiˇz barvivo neabsorbuje, coˇz je významné pˇri zpracován´ı kombinovaných spekter. Výpoˇcet R tedy: R=

Z750

A¯BCG (λ),

(5.2)

400

kde A¯BCG (λ) je absorpˇcn´ı spektrum samotného barviva normované na absorbanci na vlnové délce λ = 512 nm.

53

Obrázek 5.1: Strukturn´ı vzorec pH indikátoru bromocresol purple (BCP).

5.1

Volba barviva a jeho citlivost na pH

Volbu pH citlivé látky je nutné provést pˇredevˇs´ım s ohledem na rozsah pH, pro který lze spektroskopicky detekovat zmˇeny v absorpci. V této práci byly na doporuˇcen´ı Karla Siglera. ovˇeˇreny vlastnosti dvou pH indikátor˚ u a to Bromocresol purple - BCP a Bromocresol green - BCG, vzhledem k jejich vlastnostem: nepronikaj´ı pˇres cytoplasmatickou membránu kvasinek a nejsou adsorbovány jejich povrchem (v pˇr´ıpadˇe BCG byla tato vlastnost ovˇeˇrena experimentálnˇe, viz strana 59). Charakteristická absorpˇcn´ı spektra tˇechto dvou látek v závislosti na pH roztoku jsou na obrázc´ıch 5.2 a 5.5.

5.1.1

Bromocresol purple

Tato látka má chemický vzorec C21 H16 Br2 O5 S a váha jednoho molu této látky ˇcin´ı 540.223 g. Strukturn´ı vzorec molekuly je na obrázku 5.1. Na obrázku 5.2 jsou vynesena absorpˇcn´ı spektra roztok˚ u BCP pˇri r˚ uzných pH. Z graf˚ u je zˇrejmé, ˇze spektrum BCP má dvˇe hlavn´ı maxima na vlnových délkách λ = 431 nm a λ = 588 nm odpov´ıdaj´ıc´ı absorpci acidické a alkalické formy této látky (dle rovnice 1.3). pH roztok˚ u bylo upravováno pomoc´ı 0.1 M NaOH a HCl. Namˇeˇrená spektra nejsou korigovaná na zmˇeny koncentrace zásobn´ıho roztoku, z tohoto d˚ uvodu se kˇrivky neprot´ınaj´ı v jediném bodˇe - isobestickém. Absorpˇcn´ı spektra tzv. ˇcistých“ forem (ˇcili pouze alkalické a pouze acidické sloˇzky) ” této látky nebyla namˇeˇrena. K urˇcen´ı vhodnosti barviva BCP pro pouˇzit´ı pˇri metodˇe AP-testu bylo nutné kvantifikovat jeho spektráln´ı citlivost pˇri zmˇenách pH. Za t´ımto u ´ˇcelem je z obrázku 5.2 vynesena závislost absorpˇcn´ıch maxim λ = 431 nm a λ = 588 nm na hodnotˇe pH, pr˚ ubˇeh této závislosti je na obrázku 5.3. Z tˇechto graf˚ u lze urˇcit, ˇze zmˇena maxim absorbance pˇri zmˇenˇe pH v rozsahu 3.5 − 5.0 ˇcin´ı cca 8 % resp. 19 %. Zmiˇ novaný rozsah pH je významný pˇri metodˇe AP-testu (pˇresnˇeji pH = 3.6 − 5.3). Vzhledem k tomu, 54

0.5

pH=3.7 pH=4.2 pH=4.8 pH=5.4 pH=6.1 pH=6.6

Absorbance

0.4

0.3

0.2

0.1

0 350

400

450

500 λ [nm]

550

600

650

Obrázek 5.2: Závislost absorbance roztoku BCP v destilované vodˇe na pH (nekorigované spektrum). ˇze zmˇeny hodnot absorpˇcn´ıch maxim jsou v tomto rozsahu relativnˇe malé, tato látka nen´ı vhodná pro bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı zmˇen pH pˇri metodˇe AP-testu. Analogickou analýzu jsme provedli pro barvivo BCG.

5.1.2

Bromocresol green

Tento pH indikátor má chemický vzorec C21 H14 Br4 O5 S a váha jednoho molu této látky ˇcin´ı 698.02 g. Strukturn´ı vzorec molekuly je na obrázku 5.4. Stejnˇe jako v pˇr´ıpadˇe barviva BCP byla namˇeˇrena závislost absorpˇcn´ıho spektra roztoku BCG pˇri zmˇenách pH (viz obrázek 5.5). K tomuto mˇeˇren´ı byl pˇripraven roztok o sloˇzen´ı 50 ml pufru (citrát-fosfátový) + 150 µl BCG, jednalo se tedy o 0.43 µM roztok (0.003 % koncentrace, ta byla zvolena na základˇe promˇeˇren´ ych závislost´ı viz stránka 57). pH bylo upravováno pomoc´ı 0.1 M roztoku NaCl a HCl. Celkové mnoˇzstv´ı pˇridané kyseliny resp. zásady bylo minimáln´ı (relativn´ı zmˇena koncentrace BCG v roztoku v ˇrádu procent) a tud´ıˇz nebylo nutné spektra korigovat. V namˇeˇrených spektrech (viz obrázek 5.5) lze rozliˇsit dvˇe hlavn´ı maxima na vlnových délkách λ = 450 nm a λ = 620 nm, z nichˇz kaˇzdé patˇr´ı jedné ze dvou sloˇzek tohoto barviva: acidické, která má maximum na vlnové délce λ = 450 nm, a alkalické, která má maximum na vlnové délce λ = 620 nm. Kaˇzdá absorpˇcn´ı kˇrivka se skládá z tˇechto dvou ˇcást´ı.

55

0.6

λ = 431nm λ = 588nm

0.5

absorbance

0.4

0.3

0.2

0.1

0

-0.1 3.5

4

4.5

5

5.5

6

6.5

7

pH

Obrázek 5.3: Závislost absorbance absorpˇcn´ıch maxim (431 nm a 588 nm) barviva BCP na pH. Tzv. spektra ˇcistých“ forem této látky (ˇcili pouze acidické a alkalické sloˇzky) lze ” namˇeˇrit pˇri krajn´ıch hodnotách pH v ˇcisté kyselinˇe nebo zásadˇe a jsou vynesena spolu s ostatn´ımi spektry do obrázku 5.5. Na vlnové délce λ = 400 nm je pak zˇretelné dalˇs´ı maximum, které je vedlejˇs´ım maximem alkalické sloˇzky této látky. Jeho intenzita je i pro pH = 12 (pˇri tomto pH se BCG vyskytuje pouze v alkalické formˇe, viz obrázek 5.5 nebo 5.7) v˚ uˇci hlavn´ımu maximu o ˇrád menˇs´ı a pro naˇse u ´ˇcely má druhoˇradý význam. Spektra na obrázku 5.5 se setkávaj´ı v jediném m´ıstˇe, které se nazývá isobestický bod. Ten je charakteristický t´ım, ˇze na vlnové délce odpov´ıdaj´ıc´ı tomuto bodu (v naˇsem pˇr´ıpadˇe λ = 512 nm) je absorbance obou forem barviva BCG stejnˇe intenzivn´ı a tud´ıˇz je hodnota absorbance v tomto bodˇe nezávislá na hodnotˇe pH. Informaci o tom, zda je tato pH-senzitivn´ı látka vhodná pro mˇeˇren´ı zmˇen pH z pohledu AP-testu (charakteristické zmˇeny pH pˇri testu ˇcin´ı 3.6 − 5.3) z´ıskáme vynesen´ım hodnot absorbance maxim (λ = 450 nm a λ = 620 nm) v závislosti na pH. Tak je uˇcinˇeno na obrázku 5.6. Pro kontrolu je v tomto grafu vynesena absorbance isobestického bodu (λ = 512 nm), která by se teoreticky nemˇela pˇri zmˇenˇe pH roztoku mˇenit, ˇcemuˇz hodnoty odpov´ıdaj´ı. Zmˇeny absorbanc´ı obou hlavn´ıch maxim pˇri zmˇenách pH v rozsahu 3.6 − 5.3 ˇcin´ı cca 79 % a 92 %. Tyto zmˇeny v absorpˇcn´ım spektrum ˇcin´ı zmˇeny pH detekovatelnými a barvivo Bromocresol green vhodným pro dalˇs´ı pouˇzit´ı. Dalˇs´ı informac´ı, kterou m˚ uˇzeme z´ıskat z obrázku 5.6 je hodnota pKa . Po pˇridán´ı barviva do vodného roztoku dojde k jeho disociaci a vyskytuje se tak ve dvou formách, 56

Obrázek 5.4: Strukturn´ı vzorec pH indikátoru bromocresol green (BCG). acidické a alkalické, které lze spektroskopicky odliˇsit (viz rovnice 1.3). Rovnováˇzné zastoupen´ı tˇechto dvou sloˇzek v roztoku nastává pˇri urˇcitém pH, které se znaˇc´ı pKa a nazývá se disociaˇcn´ı konstanta [5]. Hodnotu pKa z´ıskáme z inflexe kˇrivek absorpˇcn´ıch maxim na obrázku 5.6 a ˇcin´ı pKa = 4.33 ± 0.031 . Tato hodnota se liˇs´ı oproti hodnotˇe uvádˇené v literatuˇre, pKa = 4.7.

5.1.3

Koncentraˇ cn´ı citlivost barviva

V pˇredchoz´ıch odstavc´ıch jsme provedli analýzu spekter BCG, nyn´ı jeˇstˇe zbývá promˇeˇrit, jak koncentrace tohoto barviva v roztoku ovlivˇ nuje hodnotu absorbance, neboli do jaké m´ıry je závislost absorpce lineárn´ı s koncentrac´ı dle vyjádˇren´ı Lambertova-Beerova zákona z rovnice 1.6: A = ǫ10 cl. Mˇeˇr´ıme-li kombinované spektrum obsahuj´ıc´ı absorbuj´ıc´ı látku - barvivo a rozptyluj´ıc´ı sloˇzku - kvasnice (viz napˇr. obrázek 5.11), je snahou pouˇz´ıt takovou koncentraci barviva aby bylo ve spektru rozliˇsitelné a tud´ıˇz aby z nˇej bylo moˇzné urˇcit pH vzorku. Pˇri vysokých koncentrac´ıch barviva vˇsak pˇrestává platit charakteristika LambertovaBeerova zákona nebo se m˚ uˇzeme pˇribl´ıˇzit na hranici absorbance rozliˇsitelné pouˇzitým spektrometrem (tˇri jednotky absorbance v pˇr´ıpadˇe naˇseho spektrometru). Je tedy nutné znát maximáln´ı pouˇzitelnou hodnotu koncentrace barviva v roztoku. Za u ´ˇcelem jej´ıho zjiˇstˇen´ı jsme promˇeˇrili závislost absorbance na koncentraci pouˇzitého barviva BCG v roztoku pufru pˇri konstantn´ım pH = 3.64 (viz obrázek 5.7A) a pˇri pH = 12.0 (viz obrázek 5.7C). Hodnota pH = 3.64 je minimáln´ı hodnotou, kterou dosáhnou kvasinky acidifikac´ı pˇri AP-testu. Pˇri hodnotˇe pH = 12.0 se barvivo BCG v roztoku vyskytuje pouze v alkalické formˇe a tud´ıˇz se ve spektru projev´ı pouze hlavn´ı maximum na vlnové délce λ = 620 nm a vedlejˇs´ı maximum na vlnové délce λ = 400 nm. Pro mˇeˇren´ı koncentraˇcn´ı závislosti pˇri pH = 3.64 byl pˇripraven roztok o 50 ml pufru (citrát-fosfátový) + 20 µl HCl (0.1 M roztok) a postupnˇe do nˇej bylo pˇridáváno BCG po 50 µl dávkách. 1

Hodnota byla urˇcena proloˇzen´ım kˇrivky sigmoidáln´ı z´ avislost´ı v programu gnuplot.

57

2.5

absorbance

2

1.5

pH=6.2 pH=5.9 pH=5.5 pH=5.3 pH=5.1 pH=4.8 pH=4.5 pH=4.3 pH=4.1 pH=4.0 pH=3.9 pH=3.7 pH=3.6 pH=3.5 pH=3.4 pH=3.3 pH=12 pH=0.2

1

0.5

0 350

400

450

500

550

600

650

700

λ [nm]

Obrázek 5.5: Závislost absorbance 0.43 µM roztoku BCG na pH v citrát-fosfátovém pufru. Na obrázku jsou také absorpˇcn´ı kˇrivky tzv. ˇcistých“ forem barviva v samotné ” kyselinˇe (pH = 0.2) a zásadˇe (pH = 12) a byly namˇeˇreny na 0.57 µM roztoku. Maj´ı témˇeˇr shodný pr˚ ubˇeh jako kˇrivky odpov´ıdaj´ıc´ı pH = 3.3 a pH = 6.2, proto nebyly pro pˇrehlednost obrázku korigovány na koncentraci. Ve druhém pˇr´ıpadˇe byl pˇripraven roztok 50 ml NaOH o pH = 12.0 a do nˇej pˇridáváno BCG. V obou pˇr´ıpadech bylo BCG dávkováno do dosaˇzen´ı hodnoty maxima absorbance 2.5 absorpˇcn´ıch jednotek, kdy se bl´ıˇz´ı hranice detekovatelnosti pouˇzitého spektrometru. Z namˇeˇrených hodnot byly dále vyneseny závislosti absorpˇcn´ıch maxim (na vlnové délce λ = 450 nm resp. λ = 620 nm) na koncentraci barviva BCG, viz obrázky 5.7B a 5.7D. Ze závislost´ı vynesených dat vyplývá, ˇze závislost absorpˇcn´ıho maxima λ = 450 nm resp. λ = 620 nm lze povaˇzovat za lineárn´ı aˇz do cca 2.5 absorpˇcn´ıch jednotek, coˇz odpov´ıdá koncentraci cca 1.4 µM. Z´ avislost parametru R na koncentraci BCG Neménˇe d˚ uleˇzitá je závislost (pˇresnˇeji ˇreˇceno nezávislost) parametru R (viz rovnice 5.2), d˚ uleˇzitého pro vypoˇcten´ı pH z namˇeˇreného spektra, na koncentraci barviva ve vzorku. Tato závislost byla namˇeˇrena a z výsledných hodnot vyplývá, ˇze parametr R lze povaˇzovat nezávislým na mnoˇzstv´ı BCG ve vzorku do koncentrace cca 1 µM, pˇri vyˇsˇs´ıch koncentrac´ıch klesá hodnota R o 6 % a v´ıce. Jinými slovy, urˇcen´ı hodnoty pH z namˇeˇreného spektra barviva je nezávislé na jeho koncentraci pˇri pouˇzit´ı maximálnˇe 1 µM roztoku, coˇz bylo vˇzdy splnˇeno. Data nejsou publikována.

58

2

λ = 450nm λ = 512nm λ = 620nm

1.8 1.6 1.4

absorbance

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 3.5

4

4.5

5

5.5

6

pH

Obrázek 5.6: Závislost absorbance záˇren´ı o vlnových délkách 450 nm, 512 nm a 620 nm v 0.43 µM roztoku barviva BCG na pH. Tabulka 5.1: Absorbance roztoku BCG pˇred a po 6 hodinovém m´ıchán´ı se vzorkem kvasnic. pˇred po λ 512 0.389 0.385

5.1.4

Interakce BCG s kvasnicemi

Barvivo BCG bylo zvoleno s ohledem na své vlastnosti. Je významnˇe spektrálnˇe citlivé v oblasti pH = 3.6 − 5.3 a neinteraguje s buˇ nkami kvasnic. Prvn´ı vlastnost jsme experimentálnˇe ovˇeˇrili (viz pˇredchoz´ı odstavce), druhou vlastnost jsme ovˇeˇrili následuj´ıc´ım pokusem. Bylo namˇeˇreno absorpˇcn´ı spektrum roztoku BCG v pufru (20 ml 0.5 M citrátfosfátový). Poté byly do tohoto vzorku pˇridány kvasnice (0.3 g, kvasnice pˇripraveny dle optimalizovaného postupu na stranˇe 39) a vzorek m´ıchán po 6 h, následovalo odstˇredˇen´ı na 3000 ot/min po dobu 20 min a namˇeˇren´ı dalˇs´ıho spektra supernatantu. Z výsledných hodnot v tabulce 5.1 je vidˇet, ˇze pokles absorbance na vlnové délce λ = 512 nm (hodnota isobestického bodu BCG) ˇcin´ı po ˇsesti hodinách m´ıchán´ı 1 %, coˇz je zanedbatelná zmˇena. M˚ uˇzeme tedy pˇredpokládat, ˇze barvivo BCG neinteraguje s buˇ nkami.

59

A 0.14µM 0.29µM 0.43µM 0.57µM

2.5 2 absorbance

B 3 2.5 2

1.5 1

1.5

0.5

1

0 350

A(λ = 620nm)

0.5 400

450

500

550

600

650

700

0.1

0.2

0.3

C

absorbance

2 1.5 1

0.6

A(λ = 450nm)

2.5 2 1.5 1

0.5 0 350

0.5

D 0.14µM 0.29µM 0.43µM 0.57µM 0.72µM 0.86µM 1.00µM 1.15µM 1.29µM 1.43µM

2.5

0.4

0.5 0 400

450

500 550 λ [nm]

600

650

700

0.2

0.4

0.6

0.8 c [µM]

1

1.2

1.4

Obrázek 5.7: Charakterizace spekter roztok˚ u BCG pˇri r˚ uzných koncentrac´ıch a hodnotách pH. Obrázek A: závislost absorbance roztoku BCG o r˚ uzných koncentrac´ıch pˇri konstantn´ım pH = 3.64. Obrázek B: z obrázku A vynesená závislost absorbance na vlnové délce 450 nm na koncentraci roztoku. Obrázek C: závislost absorbance roztoku BCG o r˚ uzných koncentrac´ıch pˇri konstantn´ım pH = 12.0. Obrázek D: z obrázku C vynesená závislost absorbance na vlnové délce 620 nm na koncentraci roztoku.

5.1.5

V´ ypoˇ cet pH ze spektra BCG

Jak jiˇz bylo ˇreˇceno dˇr´ıve, z kaˇzdého absorpˇcn´ıho spektra m˚ uˇzeme vypoˇc´ıst hodnotu parametru R (dle rovnice 5.2), tato hodnota (za dodrˇzen´ı pˇredpokladu n´ızkých koncentrac´ı) je nezávislá na koncentraci barviva a závis´ı pouze na pH roztoku. D˚ uleˇzitým krokem nyn´ı je nalézt kalibraˇcn´ı kˇrivku závislosti pH(R) a na jej´ım základˇe poté pˇridˇelit namˇeˇrenému spektru vzorku správné pH. Za t´ımto u ´ˇcelem byly vyneseny hodnoty koeficientu R jednotlivých spekter z obrázku 5.5 v závislosti na pH namˇeˇreném klasickou elektrodou, viz obrázek 5.8. Tyto hodnoty byly proloˇzeny teoretickou závislost´ı parametru pH(R) ve tvaru: c−R pH(R) = a + b · ln R−d

Zvolený tvar závislosti vycház´ı z disociaˇcn´ı rovnice.

60

(5.3)

6.5

6

5.5

pH

5

4.5

4

3.5

3 300

350

400

450

500

550

600

R

Obrázek 5.8: Závislost parametru R vypoˇcteného z absorpˇcn´ıch spekter roztok˚ u BCG pˇri r˚ uzných pH z obrázku 5.5 Výsledné parametry proloˇzen´ı kˇrivky a jejich chybami jsou: hodnota relativn´ı chyba parametr a 4.334 ± 0.021 0.5 % b 0.315 ± 0.007 2.3 % c 293.6 ± 2.3 0.8 % 629.6 ± 0.1 0.02 % d 2 χ 0.003 Nyn´ı jsme tedy schopni na základˇe funkce 5.3 urˇcit pH libovolného roztoku BCG na z jeho absorpˇcn´ıho spektra. To bylo také provedeno na vzorc´ıch obsahuj´ıc´ıch nejen barvivo, ale i rozptyluj´ıc´ı sloˇzku. Z´ avˇ ery Pro bezkontaktn´ı mˇeˇren´ı pH bylo vylouˇceno barvivo BCP a zvoleno barvivo BCG, které dobˇre spektrálnˇe reaguje na zmˇeny pH v poˇzadované oblasti významné pro metodu AP-testu (pH = 3.6 − 5.3). Byla namˇeˇrena závislost hodnot absorbance v hlavn´ıch maximech a hodnot parametru R na zmˇenách koncentrace barviva BCG za u ´ˇcelem nalezen´ı oblasti platnosti pˇredpoklad˚ u rovnice 5.1. Odtud vyvozená maximáln´ı pouˇzitelná koncentrace pro mˇeˇren´ı spekter, která ˇcin´ı 1 µM. Byla parametrizována kalibraˇcn´ı kˇrivka pˇriˇrazuj´ıc´ı hodnotu pH parametru R urˇcenému z absorpˇcn´ıho spektra BCG (viz rovnice 5.3 a 5.2). Dále bylo ovˇeˇreno, 61

ˇze barvivo neinteraguje s buˇ nkami kvasnic a byly vypoˇcteny parametry teoretické závislosti pH(R). Na základˇe zm´ınˇených výsledk˚ u bylo BCG pˇridáváno do vzork˚ u obsahuj´ıc´ıch rozptylovou sloˇzku, viz dalˇs´ı odstavce.

5.2

Kombinovan´ a spektra

Pojmem kombinovaná spektra jsou v této práci myˇslena absorpˇcn´ı spektra vzork˚ u, jeˇz obsahuj´ı silnˇe absorbuj´ıc´ı (v naˇsem pˇr´ıpadˇe pH-citlivé barvivo BCG) a silnˇe rozptyluj´ıc´ı sloˇzku, zejména v podobˇe suspenze kvasnic nebo separonu. Jelikoˇz pˇri mˇeˇren´ı takovéhoto vzorku docház´ı v d˚ usledku rozptylu ke zkreslen´ı absorpˇcn´ıho spektra barviva, jehoˇz pr˚ ubˇeh je d˚ uleˇzitý pro urˇcen´ı pH vzorku, bylo naˇs´ı snahou rozptylovou ˇcást ze spektra odeˇc´ıst. V pˇr´ıpadˇe pouˇzit´ı kvasniˇcné suspenze jako vzorku docház´ı pˇri mˇeˇren´ı spekter k dalˇs´ım komplikac´ım: mnohonásobný rozptyl zp˚ usobuj´ıc´ı nelinearitu závislosti absorbance na koncentraci a spontánn´ı zmˇeny pH vzorku zp˚ usobené aktivitou kvasnic. Experiment smˇeˇruj´ıc´ı k nalezen´ı vhodné koncentrace kvasniˇcné suspenze je zpracován dále. Kvasnice jakoˇzto ˇzivé buˇ nky pˇrirozenˇe reaguj´ı na vnˇejˇs´ı prostˇred´ı at’ uˇz v nˇem jsou ˇziviny nebo ne (viz Teorie). Tato reakce se projev´ı zmˇenami pH media. Zmˇeny pH jsou vˇsak neˇzádouc´ı ve chv´ıli, kdy máme ovˇeˇrit kalibraci pˇriˇrazen´ı pH namˇeˇrenému spektru. Z toho d˚ uvodu jsme hledali moˇznosti, jak zastavit acidifikaci kvasnic ve vzorku, k tomu se nab´ız´ı inhibitory metabolismu pouˇzité v kapitole Vyuˇzit´ı AP-testu (viz stránka 48). Poˇzadavk˚ um zastaven´ı acidifikace dobˇre odpov´ıdá napˇr. glukosamin, který inhibuje fosforylaci glukosy. K uplatnˇen´ı inhibitor˚ u k tomuto u ´ˇcelu nakonec z ˇcasových d˚ uvod˚ u nedoˇslo. Dalˇs´ı moˇznost´ı jak ovˇeˇrit kalibraci na vzorku s rozptyluj´ıc´ı sloˇzkou je pouˇzit´ı ˇcástic maj´ıc´ıch stejné (nebo podobné) spektráln´ı vlastnosti jako kvasnice a pˇritom by neovlivˇ novaly pH bˇehem mˇeˇren´ı. Jako vhodné se ukazuj´ı ˇcástice separonu. Postup v´ ypoˇ ctu pH z kombinovan´ eho spektra Neˇz-li se pust´ıme do charakterizace ˇcástic separonu, shrˇ nme ve struˇcnosti postup, j´ımˇz z namˇeˇreného kombinovaného spektra z´ıskáme informaci o hodnotˇe pH vzorku. • Z namˇeˇreného kombinovaného spektra (A(λ)) odeˇcteme ˇcást patˇr´ıc´ı rozptylové sloˇzce (Arozptyl (λ)). Z´ıskáme ˇcást spektra patˇr´ıc´ı samotnému BCG (ABCG (λ)). • Spektrum BCG (ABCG (λ)) normujeme na hodnotu absorbance na vlnové délce isobestického bodu λ = 512 nm. • Z normovaného spektra BCG (A¯BCG (λ)) vypoˇcteme R dle rovnice 5.2. • Parametru R pˇriˇrad´ıme hodnotu pH dle kalibrace.

62

2.6

pH=4.80 pH=4.70 pH=4.50 pH=4.40 pH=4.33 pH=4.30 pH=4.28 pH=4.00 pH=3.85 pH=3.72 pH=3.63 pH=3.56 pH=3.50 separon

2.4

absorbance

2.2

2

1.8

1.6

1.4

1.2 350

400

450

500

550 λ [nm]

600

650

700

750

Obrázek 5.9: Kombinovaná spektra (0.14 µM roztok BCG + 0.5 g separonu - 10 µm) v závislosti na pH vzorku.

5.2.1

Separon

Jako rozptylová centra pro modelový rozptyl na kvasnic´ıch byly pouˇzity ˇcástice separonu (Separon SI VSK). Jedná se o hydrofiln´ı silikagel, který je tvoˇren ˇcásticemi SiO2 o pr˚ umˇeru 10 µm. Tento materiál se pouˇz´ıvá jako plnidlo do HPLC (High Performance Liquid Chromatography) kolon a vykazuje kulovitý tvar s u ´zkou distribuc´ı velikosti ˇcástic, proto je vhodný pro modelován´ı tvaru a velikosti bunˇek kvasnic (charakterisˇ astice separonu jsou tická velikost bunˇek Saccharomyces cerevisiae ˇcin´ı 5 − 10 µm). C´ nav´ıc neˇzivé a nemˇen´ı spontánnˇe pH vzorku. Charakteristické absorpˇcn´ı spektrum separonu je zachyceno na obrázku 5.9. Namˇeˇrená absorbance klesá s rostouc´ı vlnovou délkou a neobsahuje ˇzádné maximum. Pˇri mˇeˇren´ı vzork˚ u obsahuj´ıc´ıch BCG a separon jsme vˇzdy namˇeˇrili i spektrum separonu samotného, které bylo odeˇc´ıtáno od celkového kombinovaného spektra. Kombinovaná spektra se separonem pˇri r˚ uzných hodnotách pH jsou zachycena na obrázku 5.9. Zásobn´ı roztok obsahoval 80 ml H2 O, 0.5 g separonu (10 µm) a 60 µl BCG (0.14 µM roztok BCG). pH vzorku bylo ladˇeno pomoc´ı 1.5 M roztoku HCl, celkové mnoˇzstv´ı pˇridané kyseliny bylo cca 200 µl, coˇz zp˚ usobilo zanedbatelné zmˇeny koncentrace roztoku BCG (v ˇrádu procent) a spektra tak nen´ı nutné korigovat. Zmˇeny pH vzorku se pohybuj´ı v rozmez´ı 4.8 − 3.5 (pH = 3.5 je doln´ı mez pH dosaˇzitelná kvasnicemi acidifikac´ı). Obrázek 5.9 také obsahuje spektrum samotného separonu (bez BCG), které jasnˇe ukazuje, o kolik je posunuto spektrum BCG (linearita plat´ı pˇri n´ızkých koncentrac´ıch). Barvivo samotné na vlnové délce λ = 750 nm 63

Tabulka 5.2: Teoretické hodnoty pH vypoˇctené na základˇe namˇeˇrených kombinovaných spekter (se separonem) a namˇeˇrené hodnoty pH z´ıskané klasickou elektrodou. R pHteor 579.4 4.88 567.6 4.80 552.4 4.71 535.5 4.63 518.2 4.55 515.2 4.54 497.1 4.47 410.9 4.14 391.8 4.06 367.2 3.93 357.4 3.88 342.2 3.77 331.6 3.69

pH 4.80 4.70 4.50 4.40 4.33 4.30 4.28 4.00 3.85 3.72 3.63 3.56 3.50

jiˇz neabsorbuje a tud´ıˇz hodnota absorbance v tomto bodˇe odpov´ıdá absorbanci ˇcistˇe separonu. D´ıky tomu jsme schopni ze spektra odeˇc´ıst rozptyluj´ıc´ı sloˇzku (separon) a z´ıskat spektrum samotného BCG. Takto z´ıskané spektrum poté normujeme na hodnotu absorbance na vlnové délce λ = 512 nm (nezávislost na koncentraci) a vypoˇcteme hodnotu parametru R dle rovnice 5.2. Z parametru R pak vypoˇcteme pH dle rovnice 5.3 a výsledky porovnáme s namˇeˇreným pH. Výsledné vypoˇctené hodnoty pH vˇcetnˇe parametru R a kontroln´ı hodnoty pH namˇeˇrené klasickou pH elektrodou jsou v tabulce 5.2. Z tabulky 5.2 je vidˇet, ˇze vypoˇctené a namˇeˇrené hodnoty se kolem pH = 3.60 liˇs´ı aˇz o 8 %. Relativn´ı chyba vypoˇctené hodnoty pH z kalibrace je kolem 2.5 % a relativn´ı chyba urˇcen´ı pH klasickou elektrodou je kolem 1.5 %. Tyto chyby vˇsak nekompenzuj´ı rozd´ıl mezi obˇema hodnotami. Jak je vidˇet z grafického vynesen´ı hodnot pH namˇeˇrených elektrodou a teoretických hodnot na obrázku 5.12 (kˇrivka S1 ), namˇeˇrené hodnoty jsou v˚ uˇci tˇem teoretickým pouze vertikálnˇe posunuty, pr˚ ubˇehy obou závislost´ı se vˇsak shoduj´ı. Tento jev byl pozorován i v dalˇs´ıch pˇr´ıpadech a je diskutován dále.

5.2.2

Kvasnice

Jedn´ım z c´ıl˚ u této práce bylo ovˇeˇrit moˇznosti bezkontaktn´ıho mˇeˇren´ı pH na vzorc´ıch kvasniˇcných suspenz´ı, ˇcehoˇz by bylo moˇzné vyuˇz´ıt pˇri metodˇe AP-testu. Za t´ımto u ´ˇcelem bylo nutné charakterizovat spektra kvasnic. Pˇri mˇeˇren´ı optimalizovanou metodou AP-testu pomoc´ı kontaktn´ıho mˇeˇren´ı pH elektrodou byla pouˇzita koncentrace kvasnic 1.5 g/15 ml. Uˇzit´ı této koncentrace pˇrináˇs´ı nˇekteré výhody, napˇr. výsledek testu tak nebyl ovlivnˇen pˇresnost´ı naváˇzen´ı kvasnic 64

1.5

kvasnice/H2O: 0.15g/15ml kvasnice/H2O: 0.15g/20ml kvasnice/H2O: 0.15g/25ml

1.14

1.12

1.4 1.1

absorbance

1.3

1.08

1.06 1.2 1.04

1.1

1.02

1 1 0.98

0.9 400

450

500

550

600 650 λ [nm]

700

750

800

0.96 850

Obrázek 5.10: Závislost absorbance roztoku kvasnic o tˇrech r˚ uzných koncentrac´ıch, vˇcetnˇe normovaných spekter na absorbanci na λ = 750 nm. (viz stránka 37). Pˇri bezkontaktn´ım mˇeˇren´ı pH je vˇsak pouˇzit´ı takto vysoké koncentrace kvasnic neˇzádouc´ı kv˚ uli vysoké absorbanci vzorku, nic nám vˇsak nebrán´ı v pouˇzit´ı niˇzˇs´ı gramáˇze kvasnic, je ale nutné dbát na pˇresnost odváˇzen´ı kv˚ uli principiáln´ımu srovnán´ı výsledk˚ u r˚ uzných test˚ u. Dalˇs´ı nevýhodou pak je, ˇze acidifikace bunˇek bude pomalejˇs´ı a délka testu se tak prodlouˇz´ı. Jak jiˇz bylo naznaˇceno výˇse, z namˇeˇreného kombinovaného spektra vzorku je nutné odeˇc´ıst rozptylovou sloˇzku, v tomto pˇr´ıpadˇe spektrum kvasnic. Proto jsme namˇeˇrili spektra roztoku kvasnic pˇri r˚ uzných koncentrac´ıch. V´ ysledné pr˚ ubˇehy absorbance jsou zachyceny na obrázku 5.10. Sloˇzen´ı mˇeˇreného roztoku bylo: 0.15 g kvasnic na 15 ml, 20 ml a 25 ml pufru. Z obrázku 5.10 je vidˇet, ˇze maximum absorbance je pod 2 absorpˇcn´ı jednotky, coˇz je v lineárn´ı oblasti pouˇzitého spektrometru, nav´ıc je tˇreba poˇc´ıtat s pˇridán´ım pH citlivého barviva, které také absorbuje. Spektrum nemá ˇzádné maximum, se zvyˇsuj´ıc´ı se vlnovou délkou se sniˇzuje hodnota absorbance. Po normován´ı tˇechto spekter (viz obrázek 5.10) na absorbanci na vlnové délce λ = 750 nm je vidˇet, ˇze namˇeˇrená spektra se shoduj´ı témˇeˇr v celém mˇeˇreném rozsahu vlnových délek, ˇcili se neprojevuje vliv mnohonásobného rozptylu, ke kterému vˇsak pˇri tˇechto koncentrac´ıch jiˇz docház´ı. Tato shoda normovaných spekter kvasnic pˇri vyˇsˇs´ıch koncentrac´ıch obecnˇe nemus´ı platit. V ˇzádném z dalˇs´ıch mˇeˇren´ı ale nebyla vyˇsˇs´ı koncentrace pouˇzita. Odeˇcten´ı sloˇzky spektra odpov´ıdaj´ıc´ı rozptylu na kvasnic´ıch by tedy nemˇelo výraznˇe zmˇenit tvar absorpˇcn´ıho spektra BCG. 65

kvasnice + BCG kvasnice BCG BCG512nm

4.5 4 3.5

absorbance

3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 350

400

450

500

550 λ [nm]

600

650

700

750

Obrázek 5.11: Kombinované spektrum (kvasnice + BCG) a jeho postupné zmˇeny pˇri separaci spektráln´ı sloˇzky patˇr´ıc´ı barvivu. Normovaná spektra se rozcház´ı na krátkých vlnových délkách pod λ = 470 nm. Pˇri hodnotˇe λ = 470 nm byl zpozorován skok i v jiných namˇeˇrených spektrech nezávisle na druhu vzorku. Proto tuto diskontinuitu pˇripisujeme vlastnostem spektrometru, pravdˇepodobnˇe chybné zaˇrazován´ı filtr˚ u. Pouˇzitá vlnová délka pro normován´ı (λ = 750 nm) byla zvolena zámˇernˇe, na této vlnové délce totiˇz barvivo BCG neabsorbuje, ˇcehoˇz lze vyuˇz´ıt pˇri zpracován´ı kombinovaných spekter. Pro dalˇs´ı mˇeˇren´ı je tedy vhodné pouˇz´ıt koncentraci kvasnic do 0.15 g na 15 ml pufru. Tato relativnˇe n´ızká gramáˇz (10× niˇzˇs´ı neˇz pˇri optimalizované metodˇe AP-testu) m˚ uˇze být obt´ıˇzná k naváˇzen´ı (vlastn´ı zkuˇsenost). Tato nevýhoda je vˇsak kompenzována moˇznost´ı pouˇz´ıt k mˇeˇren´ı v´ıce vzork˚ u (paraleln´ı mˇeˇren´ı) touto metodou. Jak jiˇz bylo ˇreˇceno urˇcen´ı pH z namˇeˇreného kombinovaného spektra vzorku obsahuj´ıc´ıho kvasnice a BCG spoˇc´ıvá v izolován´ı ˇcásti spektra patˇr´ıc´ı barvivu. Podrobný popis tohoto postupu si ukáˇzeme na následuj´ıc´ım experimentu. Na obrázku 5.11 je spektrum vzorku obsahuj´ıc´ıho 0.04 g kvasnic v 15 ml pufru s pˇridanými 30 µl BCG, 0.29 µM roztok (viz kˇrivka s popisem kvasnice + BCG“). ” Tato hmotnostn´ı koncentrace kvasnic ve vzorku (cca 0.3 %) je na u ´ rovni koncentrace zákvasné dávky pouˇz´ıvané v pivovarech. I pˇri této relativnˇe n´ızké hustotˇe vzorku vˇsak docház´ı k mnohonásobnému rozptylu na buˇ nkách. Pouˇzit´ı niˇzˇs´ı dávky kvasnic by vˇsak nereflektovalo podm´ınky pouˇz´ıvané v pivovarech a nav´ıc by byl výsledek znaˇcnˇe ovlivnˇen pˇresnost´ı naváˇzen´ı. 66

5.4

vzorek K1 vzorek K2 vzorek S1 vzorek S2 kalibrace

5.2 5 4.8

pH

4.6 4.4 4.2 4 3.8 3.6 3.4 350

400

450

500

550

600

R

Obrázek 5.12: Souhrnné výsledky namˇeˇrených hodnot pH (klasickou sondou) z kombinovaných spekter v˚ uˇci kalibraˇcn´ı kˇrivce (teoretické hodnoty). Vzorek K1 : kvasnice/BCG/pufr 0.04 g/30 µl/15 ml (viz mˇeˇren´ı na obrázku 5.11); vzorek K2 : 0.1 g/60 µl/20 ml; vzorek S1 : separon/BCG/pufr 0.5 g/60 µl/80 ml (viz mˇeˇren´ı z obrázku 5.9); vzorek S2 : 0.1 g/60 µl/20 ml. Spektrum na obrázku 5.11 obsahuje ˇcást patˇr´ıc´ı barvivu a ˇcást patˇr´ıc´ı kvasnic´ım (dle rovnice 5.1). Odeˇcten´ım spektra samotných kvasnic (viz kˇrivka kvasnice“) z´ıskáme ” spektrum samotného BCG (viz kˇrivka BCG“), to je pak nutné normovat na hodnotu ” absorbance na vlnové délce λ = 512 nm (viz kˇrivka BCG512 nm “) a vypoˇc´ıst parametr ” R z plochy pod kˇrivkou (dle rovnice 5.2). Z nˇej podle kalibrace (rovnice 5.3) urˇc´ıme pH vzorku. T´ımto postupem byla z namˇeˇrených dat vypoˇctena teoretická hodnota pH vzorku pH = 4.73, kontrolnˇe namˇeˇrená hodnota klasickou elektrodou ˇcinila pH = 4.6, coˇz ˇcin´ı rozd´ıl 2.9 %. Nepˇresnost ve vypoˇctené hodnotˇe pH se projevila i pˇri sérii dalˇs´ıch mˇeˇren´ı pˇri r˚ uzných koncentrac´ıch kvasnic a barviva. Výsledky dalˇs´ıch mˇeˇren´ı jsou vyneseny spolu s kalibraˇcn´ı kˇrivkou na obrázku 5.12. Jak je z obrázku vidˇet vypoˇctené hodnoty pH z kombinovaných spekter, at’ uˇz s kvasnicemi nebo separonem, se neshoduj´ı ani v rámci chyby, která v pˇr´ıpadˇe teoretických hodnot ˇcin´ı cca 2.5 % a v pˇr´ıpadˇe namˇeˇrených hodnot (klasická elektrochemická sonda) cca 1.5 %. Z´ avˇ ery kapitoly Bylo vybráno barvivo BCG, jeˇz má vhodnou spektráln´ı citlivost v rozsahu zmˇen pH významném pˇri metodˇe AP-testu (pH = 3.6 − 5.3). Byla namˇeˇrena jeho spektráln´ı 67

charakteristika, experimentálnˇe ovˇeˇren rozsah koncentrac´ı, pˇri kterých je absorbance závislá lineárnˇe na koncentraci a zároveˇ n parametr R nezávislý na koncentraci. Jej´ı maximáln´ı hodnota ˇcin´ı 1 µM roztok (0.007 %). Dále byl zaveden parametr R, navrˇzen jeho výpoˇcet a parametrizována závislost pH(R) na základˇe spekter roztoku samotného barviva (v závislosti na pH) z obrázku 5.5. Hodnota statistické veliˇciny χ2 zvolené teoretické závislosti (pH(R)) ˇcin´ı 0.003, coˇz ukazuje na velmi dobˇre zvolený tvar modelové funkce. I pˇres tuto teoretickou shodu se pˇri ovˇeˇrován´ı metody vyskytly neshoduj´ıc´ı výsledky. Byla namˇeˇrena kombinovaná spektra se separonem, který je rozmˇery a tvarem podobný buˇ nkám kvasnic. Vypoˇctené hodnoty pH uvedené v tabulce 5.2 se liˇs´ı od namˇeˇrených (pˇri pH = 3.60) aˇz o 8 %. Podobných nepˇresnost´ı dosahuj´ı i výsledky dosaˇzené mˇeˇren´ım kombinovaných spekter s kvasnicemi. Výsledky tˇechto mˇeˇren´ı jsou souhrnnˇe uvedeny na obrázku 5.12. Metoda je pravdˇepodobnˇe zat´ıˇzena systematickou chybou, jej´ıˇz pˇr´ıˇcin m˚ uˇze být hned nˇekolik. Zˇrejmˇe se projevuje vliv mnohonásobného rozptylu na spektra a to i pˇri pouˇzit´ı ˇrádovˇe r˚ uzných koncentrac´ı rozptylové sloˇzky vzorku - kvasnice nebo separon, viz výsledky mˇeˇren´ı na obrázku 5.12. Dalˇs´ım faktorem ovlivˇ nuj´ıc´ım nepˇresnost metody je zkreslen´ı spektra pˇri n´ızkých vlnových délkách zp˚ usobené vlastnostmi spektrometru (cca pˇri vlnové délce λ = 450 nm a ménˇe). Znaˇcný vliv má také závislost pKa konstanty barviva na iontové s´ıle (viz [16]) a zp˚ usob výpoˇctu parametru R. Pˇri námi zvoleném postupu je sice minimalizována chyba zp˚ usobená celkovým zploˇstˇen´ım spekter po pˇridán´ı rozptylové sloˇzky d´ıky normalizaci spekter na hodnotu absorbance na vlnové délce λ = 512 nm. Ale deformaci spekter zp˚ usobené r˚ uzným vlivem rozptylové sloˇzky (na spektrum barviva) pˇri krátkých a dlouhých vlnových délkách zabránˇeno nen´ı. Ke kumulaci dalˇs´ıch chyb docház´ı pˇri normován´ı spekter (BCG na vlnové délce λ = 512 nm a separonu resp. kvasnic na λ = 750 nm) kde se prom´ıtá chyba namˇeˇrené hodnoty absorbance na pˇr´ısluˇsných vlnových délkách.

68

Z´ avˇ er V pˇredloˇzené práci se podaˇrilo (v návaznosti na pˇredchoz´ı ˇclánky [13] a [2]) optimalizovat metodu AP-testu pro pr˚ umyslovˇe významné pivovarské kvasinky. Navrˇzeným postupem pˇr´ıpravy vzork˚ u a mˇeˇren´ı je dosaˇzeno maximáln´ı hodnoty AP, která odpov´ıdá potenciáln´ı vitalitˇe kvasnic, a reprodukovatelnosti testu s pˇresnost´ı do 3 %. Skladován´ı kvasnic mezi odbˇerem a vlastn´ım mˇeˇren´ım by mˇelo prob´ıhat v lednici pod pivem pˇri teplotˇe 0 − 2 ◦ C a nemˇelo by pˇresáhnout maximáln´ı dobu deseti dn˚ u. Po dobˇe delˇs´ı buˇ nky ztrác´ı vitalitu. Navrˇzený optimáln´ı metodický postup pˇri provádˇen´ı AP-testu je následuj´ıc´ı: • Zásobn´ı roztok s kvasnicemi roztˇrepeme (kv˚ uli homogenizaci) a odebereme z nˇej dostateˇcné“ mnoˇzstv´ı (cca 5 ml) koncentrované suspenze. ” • Vzorek krátce odstˇred´ıme, cca 1000 ot/min po dobu 60 s (cca 145 × g), a dekantujeme pivo. • Promyjeme destilovanou vodou (cca 15 ml) o teplotˇe cca 25 ◦ C. • Promýván´ı (vˇcetnˇe krátkého odstˇredˇen´ı) opakujeme, provedeme celkem tˇrikrát. • Po tˇret´ım promyt´ı následuje prudké odstˇredˇen´ı, cca 3000 ot/min po 10 min (1300 × g), slit´ı supernatantu. • Odváˇz´ıme (1.5 ± 0.1) g ˇcisté váhy kvasnic. • Pˇridáme 15 ml destilované vody do vzorku, spust´ıme mˇeˇren´ı ˇcasu a vzorek roztˇrepeme. • Mˇeˇren´ı prob´ıhá za stálého m´ıchán´ı (200 ot/min, mus´ı zabránit flokulaci) a pˇri stabiln´ı teplotˇe 25.0 ± 0.1 ◦ C. • V desáté minutˇe pˇridáme 1.5 ml glukosy (50 % roztok); koneˇcná koncentrace glukosy v mediu 4.55 % (hmotnost glukosy na objem vzorku). • Odeˇcteme hodnoty pH v desáté a dvacáté minutˇe. Optimalizovaný test byl následnˇe pouˇzit na vzorc´ıch z pr˚ umyslové praxe pˇri mˇeˇren´ı vitality kvasnic z výroby piva v CKT. Bylo prokázáno, ˇze buˇ nky pˇri opˇetovném nasazován´ı ztrác´ı svoji vitalitu.

69

Pivovarské kmeny kvasnic jsou bˇehem procesu výroby piva vystaveny mnoha stresovým faktor˚ um, napˇr. pˇri modern´ı technologii HGB (high-gravity brewing) mohou být pˇri nasazen´ı do CKT s mladinou vysoké stupˇ novitosti ovlivnˇeny vysokým osmotickým tlakem. Navrˇzený optimalizovaný AP-test byl proto pouˇzit pˇri studiu vlivu osmotického tlaku na vitalitu bunˇek. Výsledky ukázaly, ˇze vystaven´ı bunˇek osmotickým zmˇenám se projev´ı krátkodobým poklesem vitality, zat´ımco pˇri fermentaci kvasnic v mediu s obsahem mladiny odpov´ıdaj´ıc´ım pivu o stupˇ novitosti 12 ◦ , ale osmotickým tlakem (simulovaným obsahem sorbitolu) odpov´ıdaj´ıc´ım pivu o stupˇ novitosti aˇz 20 ◦ se pokles vitality dlouhodobˇe neprojev´ı. Mladina má tedy ochranný vliv na pivovarské kvasnice a pomáhá jim pˇrizp˚ usobit se osmotickým zmˇenám. Dalˇs´ım vyuˇzit´ım optimalizovaného AP-testu bylo pˇri sérii prvotn´ıch mˇeˇren´ı studuj´ıc´ıch vliv xenobiotických látek, inhibuj´ıc´ıch nˇekteré metabolické pochody, na pr˚ ubˇeh AP-testu. Potvrdilo se, ˇze pr˚ ubˇeh a výsledky testu odráˇz´ı pr˚ ubˇeh metabolismu. V dalˇs´ı ˇcásti práce byly ovˇeˇreny moˇznosti bezkontaktn´ıho mˇeˇren´ı pH, které by bylo moˇzné vyuˇz´ıt pˇri metodˇe AP-testu a jeho specifických podm´ınkách. Za t´ımto u ´ˇcelem bylo vybráno vhodné barvivo (Bromocresol green) a provedena jeho spektráln´ı charakterizace. Na sérii absorpˇcn´ıch spekter této látky pˇri r˚ uzných hodnotách pH byla vypoˇctena kalibrace, která parametru R pˇriˇrazuje hodnotu pH. Navrˇzený zp˚ usob výpoˇctu parametru R vycház´ı z integrace absorpˇcn´ıho spektra BCG normovaného na hodnotu absorbance na vlnové délce λ = 512 nm (isobestický bod). Navrˇzená kalibrace a zp˚ usob výpoˇctu pH byly pouˇzity na vzorc´ıch obsahuj´ıc´ıch rozptyluj´ıc´ı ˇcástice (kvasnice nebo separon). Na tˇechto vzorc´ıch se namˇeˇrené a vypoˇctené hodnoty pH liˇs´ı aˇz o 8 %. Výsledky metody jsou zat´ıˇzeny systematickou chybou, která je zp˚ usobena nˇekolika faktory a to zejména vlivem mnohonásobného rozptylu a závislost´ı pKa konstanty barviva na iontové s´ıle roztoku. Dalˇs´ı ovlivnˇen´ı pˇresnosti výsledk˚ u je zp˚ usobeno pouˇzitým spektrometrem, který zkresluje spektra pˇri n´ızkých vlnových délkách (pod λ = 470 nm) a zvoleným postupem výpoˇctu parametru R. Pˇri navrˇzeném výpoˇctu je minimalizována chyba zp˚ usobená celkovým zploˇstˇen´ım spekter po pˇridán´ı rozptyluj´ıc´ı sloˇzky (kvasnice nebo separon) do vzorku oproti p˚ uvodn´ım spektr˚ um barviva samotného, na kterém byla provádˇena kalibrace. Chyba zp˚ usobená deformac´ı spektra barviva r˚ uzným vlivem rozptyluj´ıc´ı sloˇzky na dlouhých a krátkých vlnových délkách kompenzována nen´ı. Navrˇzená metodika bezkontaktn´ıho mˇeˇren´ı pH prozat´ım nen´ı pˇripravena pro pouˇzit´ı pˇri metodˇe AP-testu, ale m˚ uˇze slouˇzit pro hrubé rozliˇsen´ı kvality kvasnic. Odstranˇen´ı systematických chyb metodiky a zvýˇsen´ı pˇresnosti by mˇelo umoˇznit jej´ı vyuˇzit´ı pˇri mˇeˇren´ı metodou AP-testu a mohlo by být nápln´ı dalˇs´ı práce.

70

Literatura ˇ [1] Cejka P. a kol.: Vyuˇzit´ı kryoskopie ke stanoven´ı extraktu v p˚ uvodn´ı mladinˇe, Kvasný pr˚ umysl 43(9) (1997), 237 − 238 [2] Gabriel P., Dienstbier M., Matoulková D., Kosaˇr K., Sigler K.: Optimized acidification power test of yeast vitality and its use in brewing practice, J. Inst. Brew., v tisku [3] Gabriel P., Dienstbier M., Sladký P., Sigler K.: A new method of optical detection of yeast acidification power, Folia Microbiologica, v tisku [4] http://en.wikipedia.org/wiki/Osmosis [5] http://en.wikipedia.org/wiki/PKa [6] Imai, T., Nakajima I., Ohno T.: Development of a new method for evaluation of yeast vitality by measuring intracellular pH, J. Am. Soc. Brew. Chem. 52(1) (1994), 5 − 8 [7] Kara B. V., Simpson W. M., Hammond R. M.: Prediction of the fermentation performance of brewing yeast with the acidification power test, J. Inst. Brew. 94 (1988), 153 − 158 [8] Kodedová M.: Studium sedimentace a flokulace vybraných kmen˚ u kvasnic metodami komplexn´ı turbidimetrické analýzy, Diplomová práce (2006) ˇ [9] Koˇsin P., Savel J., Kolouchová I., Broˇz A.: Viabilita a vitalita kvasnic v provozn´ım kvaˇsen´ı, Kvasný pr˚ umysl 53 (2007), 30 − 34 [10] Opekarová M. a Sigler K.: Acidification power: Indicator of metabolic activity and autolytic changes in Saccharomyces cerevisiae, Folia Microbiologica 27 (1982), 395 − 403 [11] Prosser V. a kol.: Experimentáln´ı metody biofyziky, Academia, Praha, (1989) [12] Sigler K. a Höfer M.: Mechanisms of acid extrusion in yeast, Biochemica et Biophysica Acta 1071 (1991), 375 − 391 [13] Sigler K., Mikyˇska A., Kosaˇr K., Gabriel P., Dienstbier M.: Factors affecting the outcome of the acidification power test as a measure of yeast quality: critical reassessment, Folia Microbiologica 51(6) (2006), 525 − 534 71

ˇ [14] Susta J., Hodaˇ n J., Opekarová M., Sigler K.: A simple method for determining the metabolic activity of brewer’s yeast during the brewing process, Food Microbiologica 1 (1984), 168 − 171 [15] Thomas Lee S. a kol.: A sensitive fibre optic pH sensor using multiple sol-gel coatings, J. Opt. A: Pure Appl. Opt. 3 (2001), 355 − 359 [16] Yamazaki H., Sperline R. P., Freiser H.: Spectrophotometric determination of pH and its application to determination of thermodynamic equilibrium constants, Anal. Chem. 64 (1992), 2720 − 2725

72

Martin Srkala Studium vitality kvasnic kombinovanými elektrochemickými a fotometrickými metodami

Recommend Documents