1
M. Kropáček, M. Tomeš, K. Kontrová, J. Zimová, F. Melichar
RadioMedic s.r.o. RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
Úvod o Stručný popis projektu o Monoklonální protilátka Nimotuzumab
Hlavní kroky výroby 177Lu-Nimotuzumab o Příprava konjugátu o Značení konjugátu s 177Lu
Kontrola kvality
Shrnutí a závěr
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
2
Experimentální činnost v rámci grantové podpory TAČR - projekt TA03010878 o
o
Příjemce: RadioMedic s.r.o. Další uchazeč: PřFUK Univerzita Karlova v Praze
Řešené okruhy v rámci projektu o o
Vývoj 177Lu -Nimotuzumab (hR-3) Vývoj metod přípravy derivátů bombesinů • •
o
Vývoj přípravků značených F-18 • •
Diagnostika 68Ga, 64Cu, Terapie 177Lu, 67Cu Deriváty [18F]flumazenilu 16-a-[18F]fluoroestradiol
diagnostika ložisek epilepsie diagnostika karcinomu prsu
Spolupráce o
ÚJV Řež, a.s. • •
RadioMedic s.r.o.
Laboratoř biologického testování (Bradford Assay, ELISA, preklinické testy na zvířatech) Centrální analytická laboratoř (ICP-MS)
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
3
Nimotuzumab (hR-3) o
Humanizovaná monoklonální protilátka typu IgG1 s afinifou k receptorům EGF
EGF – epidermální růstový faktor o
extracelulární protein obsahující 53 aminokyselin, řadí se mezi mitogeny (látky stimulující buněčné dělení)
o
Váže se k receptorům (EGFR) na povrchu buňky, tyto receptory fungují jako tyrosin-kinázy, jež spouští kaskádu biochemických procesů vedoucích k proliferaci buněk.
EGFR patří do skupiny receptorů ErbB (tyrosin-kináz) o
ErbB-1
epidermal growth factor receptor (EGFR)
o
ErbB-2
(HER 2)
o
ErbB-3
(HER 3)
o
ErbB-4
(HER 4)
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
4
Vyvinuto: Center of Molecular Immunology (CMI), Havana, Kuba
Komercializace:
o
Indie:
Biocon, h-R3, BIOMAb EGFR
o
Kanada
CIMYM Biosciences, TheraCIM
o
Evropa
Oncoscience, Theraloc, CIMAher
Použití - terapie o
Gliomy, skvamózní buněčný karcinom v oblasti hlavy a krku
Účinek Nimotuzumabu - blokuje EGFR a tím inhibuje nekontrolované dělení buněk
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
5
Výrobní kroky o Přípravné práce
• Sterilizace roztoků a materiálů • Zakoncentrování Nimotuzumabu o Konjugace o Purifikace o Kontrola kvality konjugátu o Značení konjugátu s 177Lu o Kontrola kvality konečného přípravku
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
6
Sterilizace roztoků filtrací přes 0,22 mm filtr o Voda (trace select)
o Fosfátový pufr
- konjugace
o Acetátový pufr
- značení s 177Lu
Sterilizace materiálů o Sterilizace 80% roztokem ethanolu
• Vivaspin 6 o Sterilizace v autoklávu
• Eppendorf, skleněné lahvičky, špičky …
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
7
Zakoncentrování hR-3 o 5 mg/ml v PBS
10-20 mg/ml
Vivaspin 6 o Cut-off
30.000 Da
o Centrifugace při
4000 ot/min
o Doba centrifugace
20 min
o Vortex 5 minut
Všechny operace probíhají v laboratoři třídy čistoty
„C“, kritické operace v laminárním boxu „A“ RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
8
Monoklonální protilátka o Nimotuzumab (Oncoscience) o po zakoncentrování v 0,1 M fosfátovém pufru pH=8,5
Ligand o p-SCN-Bn-DOTA (Macrocyclics) o rozpuštěn v DMSO (60mg/ml)
Konjugace o 2 hodiny při LT ve skleněné lahvičce, reakční objem 1 ml o Vortex
Kontrola pH reakční směsi po 60 minutách o případně úprava pH
Konec reakce přidáním 50ml TRIS (1,5M pH=8,88)
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
9
Purifikace pomocí Vivaspin 6 o Obvykle 6 purifikačních cyklů
• Centrifugace (20 minut) • Odběr filtrátu pro měření UV/VIS
0,05M Acetátový pufr pH=7
• Doplnění na 6 ml
• Vortex 5 min (omezení sorpce konjugátu)
Fosfátový pufr pH=8,5
Měření absorbance filtrátu při 280 nm o Kontrola průběhu purifikace – detekce nezreagovaného
ligandu
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
10
Absorbance filtrátu při 280 nm
2,5
2
1,5
1
1:1000 1:500 1:200 1:100 1:50 1:20
0,5
0 1
2
3
4
Počet purifikačních cyklů RadioMedic s.r.o.
1:10 5
6
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
11
nRIU *1000
Sig A
0,0
-20,0
-40,0 0,00
5,00
40 20 0 0,00 30
10,00
15,00
min UV_A
hR3-konjugat
mAU
5,00
10,00
15,00
min
CPS
ChB
25 20 15 0,00
Konjugát Nimotuzumab před purifikací
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
5,00
10,00
15,00
min
Konjugát Nimotuzumab po purifikaci Vivaspin 6 12
Stanovení koncentrace - zkouška podle Bradfordové Tvorba komplexu mezi konjugátem a činidlem (Brilliant Blue G) Činidlo váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech Absorbance při 595 nm úměrná koncentraci konjugátu.
Lineární rozsah zkoušky 1.25 - 20 µg/ml. RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
14
Metoda HPLC Separace o
-20,0
-40,0 0,00
Kolona: TSK-GEL SW 3000 (7,5x300 nm, 10mm)
40
Mobilní fáze 0,1M PBS + EDTA
o
1 ml/min
Nástřik 20ml
Detekce o UV detektor 280 nm
RadioMedic s.r.o.
5,00
mAU
o
Sig A
20 0 0,00 30
10,00
15,00
min UV_A
hR3-konjugat
nRIU *1000 0,0
5,00
10,00
15,00
min
CPS
ChB
25 20 15 0,00
5,00
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
10,00
15,00
min
15
Sodium Dodecylsulfate Polyacrylamide gel Electrophoresis Proteiny (1 µg/jamku) byly denaturovány při 100°C během 5 min v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného (SDS). Elektroforéza - podmínky β-merkaptoethanol (redukce proteinů) Komerční gradientový gel 4-12% NuPAGE (MES) pufr 2-(N-morpholin)ethansulfonová kys.
Konstantní I=15 mA/gel. Barvivo Coomassie Blue R-250 RadioMedic s.r.o.
hR3: K1: K2:
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
Originální Nimotuzumab konjugát hR3-DOTA 1:200 konjugát hR3-DOTA 1:50 16
ELISA - Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay 1.
2.
Inkubace při 4°C přes noc
HRP (Horseradish Peroxidase)
Vizualizace komplexů kojugát-HRP
3% BSA v PBS, pH 7.4
Vazba sekundárního antigenu
5.
imobilizovaný lidský EGFR
Vazba konjugátu na antigen
4.
3
Saturace
3.
1-2
Vazba antigenu na jamku
4
5
Reakce substrátu o-phenylendiaminu s HRP peroxidázou produkuje barevný komplex s maximem absorbance při 492 nm.
Hodnocení: křivky závislostí absorbance imunokomplexu na koncentraci protilátky
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
17
mg/ml
hR3
100 log c (hR3)
Vzorek 10mg/ml
Absorbance (492-630)
Rel. Asorbance [%]
hR-3
2,089
100,0
hR-3*)
1,996
95,5
1:10
1,560
74,7
1:20
1,168
55,9
1:50
0,659
31,5
hR-3 *) RadioMedic s.r.o.
y = 0,2566ln(x) + 2,0 1,3957 1,0R² = 0,9998 0,0 0,0001 0,1 A (492-630 nm)
Vliv nadbytku ligandu na imunoreaktivitu konjugátu Srovnání imunoreaktivity s původní protilátkou Nimotuzumab
3,0
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
původní hR-3, zpracovaný identicky jako konjugáty 18
Radionuklid
177LuCl 3
v 0.05 M HCl I.T.G. Garching, Německo Dodaná aktivita 3-10 GBq/0,5ml Forma – bez nosiče (n.c.a.)
Podmínky značení
Specifická aktivita 100 – 400 MBq/mg konjugátu 0.5 M octan amonný pH=7 Reakční objem 1 ml Inkubace při 42°C po dobu 60 minut.
Před analýzou HPLC a TLC přídavek DTPA (0.01 M, pH 6.0) a inkubace dalších 15 min při LT
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
20
Pro značení vybrán konjugát připravený molárním poměrem hR-3:DOTA 1:20
Množství konjugátu [mg]
Objem roztoku 177Lu [ml]
Reakční směs pH
Specifická aktivita 177Lu-DOTA-hR3 [MBq/mg]
Radiochemická čistota [%]
0,96
9,79
6,88
100
100
0,96
19,58
6,79
200
100
0,96
39,16
6,66
400
97,79
0,96
78,32
6,39
800
84.79
Odhad přípravy terapeutické dávky 7500 MBq?
Při dodržení 200 – 400 MBq/mg je chemický obsah konjugátu cca 15–50 mg.
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
21
Radiochemická čistota (HPLC) Separace
nRIU *1000
RI-detectorSig
A
0
Kolona: TSK-GEL SW 3000
EDTA 1 ml/min
0,00 200 mAU
5,00
min
UV/VIS
0 0,00
5,00
CPS *1000 2,00
Detekce 0,00 0,00
5,00
177Lu-hR3
konjugát RadioMedic s.r.o.
15,00
UV_A
100
Nástřik 20ml Radiodetektor - NaI(Tl)
10,00
10,00
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
15,00
10,00
min
Radiodetector ChB
177Lu-DTPA
Mobilní fáze 0,01M PBS +
-500
177Lu-DOTA-hR3
(7,5x300 nm, 10mm)
15,00
min
177Lu-DTPA 22
Radiochemická čistota (ITLC-SG) 100
Octan amonný 10% (w/v) a methanol (1:1) Před separací inkubace s DTPA vazba volného 177Lu
80 70 60 50 40 30
177Lu-DTPA
(20 x 150 mm)
90
20 10
0
50
Rf~0 hR-3 konjugát RadioMedic s.r.o.
TLC
Front
Separace: ITLC-SG
177Lu-DOTA-hR3
C/mm *1000 110
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
100
150
mm
Rf~0,8 177Lu-DTPA 23
Připraveny konjugáty Nimotuzumab (hR3) pro značení s 177Lu
Při přípravě použity různé molární nadbytky ligandu DOTA 1:10, 1:20, 1:50, 1:200, 1:500 and 1:1000
Sledování vlivu ligandu na imunoreaktivitu konjugátů (ELISA) Zvolen nadbytek ligandu 1:10
Konjugáty označeny 177Lu
Radiochemická čistota > 90% dosažena bez nutnosti purifikace radioaktivního konjugátu
Výroba konjugátů a značení probíhá v čistých prostorech „C“, kritické operace v „A“
Výroba konjugátů a značení respektuje principy SVP
Studie biodistribuce na zdravých potkanech do konce listopadu 2014
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
24
Náš tým: Mgr. Marek Tomeš, Ph.D. Ing. Kateřina Kontrová, Ph.D. Ing. Jana Zimová, Ph.D. Ing. Martin Kropáček, Ph.D. Spolupráce: ÚJV Řež, a.s. Laboratoř biologického testování Finanční podpora: TAČR – projekt TA03010878
RadioMedic s.r.o.
51.DNM 12.-14. 11. 2014 Seč
25
