Kloneren - deel 2
LIGATIE Brown 4.3.1en 4.3.2
Ligatie • T4 DNA ligase + bijbehorende buffer (bevat ATP) – Vergelijkbaar met restrictie-enzymen (10xbuffer, glycerol bij enzym, ..) – Werken vaak in allerlei buffers, mits ATP wordt toegevoegd
• Sticky ends gemakkelijker te ligeren dan blunt ends • Temperatuur en tijd: zie advies firma (bijsluiter); 15-22°C (uiteinden moeten elkaar vinden)
Ligatie • Ligatie van geknipte insert in geknipte vector: – Diverse trucs ter bevordering van recombinante moleculen (ten koste van zelfsluiters); zie huiswerk en werkcollege – In ieder geval: molaire ratio vector : insert = 1:2/1:3/1:4/1:5
Nieuwste ontwikkeling • Ligation Independent Cloning – Niet meer knippen en niet meer ligeren – Zie bijvoorbeeld 4.3.4 (geen leerstof!) – Nu nog duurder (lineaire vectoren, die altijd besteld moeten worden en niet zelf ‘bijgemaakt’ kunnen worden)
TRANSFORMATIE EN SELECTIE Brown 5.1 en 5.2 (en stukje van 6.1.4)
5.1.1: Transformatie • Transformatie = opname van DNA door (bacterie)cellen • Een bacteriecel die in staat is tot DNA-opname noemen we competent • Natuurlijke transformatie = bacteriën die van nature DNA kunnen opnemen (geen leerstof) – Meestal in bepaalde groeifase en/of onder bijzondere omstandigheden: cellen zijn dan competent – Iets anders dan conjugatie: actieve opname van ‘vrij DNA’ (afkomstig van lysis van soortgenoten) uit de omgeving – Opgenomen DNA wordt geïntegreerd in eigen genoom – Een van de manieren van horizontale DNA-overdracht voor genetische variatie (bv antibioticumresistentieversprijding) – Ca. 1% van de bacteriën is hiertoe in staat: Bacillus soorten, Streptococcus soorten, Acinetobacter calcoaceticus, …….
• Soorten zonder natuurlijke transformatie – zoals E. coli – moeten competent worden gemaakt via een fysische en/of chemische behandeling
5.1.2: E. coli cellen competent maken 1.
Chemisch competent maken en transformeren: CaCl2-behandeling + heatshock – Competente cellen kunnen (met glycerol) worden bewaard bij -80°C – Competente cellen zijn ook te koop
2.
Elektroporatie: voorbehandeling (verzwakking celwand) en daarna gaten slaan in plasmamembraan met een stroomstoot
Mogelijke resultaten van een klonering Bij gebruik van één restrictie-enzym!
Alleen als je een mengsel van restrictiefragmenten als uitgangsmateriaal hebt!
Selectie 1. Selectie van transformanten 2. Selectie van recombinanten 3. Selectie van juiste kloons
5.1.3: Selectie van transformanten • 1 ng plasmide/construct levert 1000 – 10.000 transformanten (transformatiefrequentie: 106 – 107 transf. per µg DNA); dit is maar een fractie van het aantal aanwezige competente cellen • Selectie: Antibioticumresistentiegen; bijbehorend antibioticum in platen (en in vloeibare kweken!) • Meest gebruikt in E. coli: ampicillineresistentiegen: AmpR, ApR, bla – Product = beta-lactamase
5.1.3: Selectie van transformanten • Praktische aspecten: – Geef na de transformatie (heatshock of elektroporatie) de cellen de kans het opgenomen plasmide te repliceren en het resistentiegen tot expressie te brengen: incubatie in vloeibaar medium zonder antibtiocum (= herstelstap) vóór uitplaten op platen met antibioticum – Platen met ampicilline niet te lang laten staan na transformatie (max. 16 uur bij 37°C), anders ontstaan satellietkolonies.
Stel ik zou de inhoud van de cellen in satellietkolonies bekijken. Bevatten deze een plasmide of niet? Hint: Hoe werkt Amp-resistentie op basis van een beta-lactamase? A. Ja B. Nee
© 2011 Pearson Education, Inc.
5.2.2: Selectie van recombinanten • Niet bij alle vectoren mogelijk • Insertie-inactivatie: – Eerste toepassingen (b v pBR322) met een tweede antibioticumresistentiegen – Meest gebruikt: lacZ’ gen en blauw/wit-screening • Primeur: pUC-vectoren van Yanisch-Perron, Vieira en Messing (1985) • Tweede innovatie: de multiple cloning site
Blauw/wit-screening • IPTG = inducer: vangt Lac repressor weg (zie lessen Zantinge); alleen nodig bij een gastheer die een actief lacI gen heeft.
6.1.4: De voordelen van de pUC-vectoren 1. 2. 3.
Copy number 500-700 Eenstaps identificatie van recombinanten (blauw/wit screening) De multiple cloning site
• Veel modernere vectoren bevatten een of meer van de onderdelen van de pUC-vectoren
De multiple cloning site (polylinker)
Wat gebeurt bij een klonering in een pUCvector als ik vergeet X-gal aan de platen toe te voegen? Ik vind de volgende dag … A. een compleet volgegroeide plaat met alleen witte kolonies B. een compleet volgegroeide plaat met vooral witte kolonies en enkele blauwe kolonies C. een compleet volgegroeide plaat met alleen blauwe kolonies D. een compleet volgegroeide plaat met vooral blauwe kolonies en enkele witte kolonies E. losse kolonies; deze zijn allemaal wit F. losse kolonies; deze zijn allemaal blauw
© 2011 Pearson Education, Inc.
Wat gebeurt bij een klonering in een pUCvector als ik vergeet IPTG aan de platen toe te voegen? Ik vind de volgende dag … A. een compleet volgegroeide plaat met alleen witte kolonies B. een compleet volgegroeide plaat met vooral witte kolonies en enkele blauwe kolonies C. een compleet volgegroeide plaat met alleen blauwe kolonies D. een compleet volgegroeide plaat met vooral blauwe kolonies en enkele witte kolonies E. losse kolonies; deze zijn allemaal wit F. losse kolonies; deze zijn allemaal blauw
© 2011 Pearson Education, Inc.
Wat gebeurt bij een klonering in een pUCvector als ik vergeet ampicilline aan de platen toe te voegen? Ik vind de volgende dag … A. een compleet volgegroeide plaat met alleen witte kolonies B. een compleet volgegroeide plaat met vooral witte kolonies en enkele blauwe kolonies C. een compleet volgegroeide plaat met alleen blauwe kolonies D. een compleet volgegroeide plaat met vooral blauwe kolonies en enkele witte kolonies E. losse kolonies; deze zijn allemaal wit F. losse kolonies; deze zijn allemaal blauw
© 2011 Pearson Education, Inc.
Waarom wordt het lacZ’ gen gebruikt en niet het volledige lacZ gen denk jij? Hint: volledige beta-galactosidase is 1023 az lang.
© 2011 Pearson Education, Inc.
Stel ik krijg satellietkolonies bij een klonering in een pUC-vector. Welke kleur hebben de satellietkolonies logischerwijs? A. Blauwe satellietkolonies rond de blauwe kolonies, witte satellietkolonies rond de witte kolonies B. Blauwe satellietkolonies rond de witte kolonies, witte satellietkolonies rond de blauwe kolonies C. Altijd witte satellietkolonies, ongeacht de kleur van de ‘hoofdkolonies’ D. Altijd blauwe satellietkolonies, ongeacht de kleur van de ‘hoofdkolonies’
© 2011 Pearson Education, Inc.
Selectie van juiste kloons • Vroeger maakte je heel veel inserts tegelijkertijd, omdat je het hele genoom in stukken knipte waarin zich het gen van interesse bevond • Je maakte dus heel veel verschillende kloons, met allerlei inserts: een genomische bank (genomic library) • Elke recombinante kolonie kon dus een vector met een andere insert bevatten • Zoeken naar de juiste kloon was als zoeken naar een speld in een hooiberg – Allerlei methodes (hoofdstuk 8; geen leerstof)
• Dit hoeft tegenwoordig niet meer! Moderne aanpak: 1. Sequentie te kloneren gen uit databank halen 2. PCR-primers aan weerszijden van het gen ontwerpen mbv software • Eventueel voorzien van gewenste restrictiesites
3. Genomisch DNA PCRen 4. PCR-product knippen en in vector ligeren (of ‘Ligation Independent Cloning’)
Afsluiting • We hebben de essentiële stappen van DNA-klonering in E. coli gezien: – – – – –
Knippen DNA analyseren (nodig in verschillende stappen) Plakken Transformeren Selecteren
• De belangrijkste toepassing van kloneringen in E. coli anno nu is het tot expressie brengen van eiwitten om deze vervolgens te kunnen bestuderen – Op deze manier bestudeert men bijvoorbeeld bij de UT de eiwitten betrokken bij hersenziektes, zoals Parkinson en Alzheimer – Expressievectoren – Meer hierover later
EINDE DEEL 2
