Leona Leišová a kol

Leona Leišová a kol. Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví METODIKA PRO PRAXI

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2008

Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem řešení projektu: MZE0002700602 - Studium a využití biodiverzity, genetických mechanismů a nových metod pro zlepšování biologického potenciálu odrůd a setrvalý rozvoj zemědělství

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. ISBN 978-80-87011-76-8

Leona Leišová, Ladislav Kučera, Jaroslava Ovesná

Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví

METODIKA PRO PRAXI

Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.

2008

Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví Předmětem metodiky je uvedení analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa do praxe. Mikrosatelity jsou vzhledem k vysoké úrovni variability vhodné pro charakterizaci odrůd v rámci druhu. Podstatou je amplifikace úseků genomu obsahující daný mikrosatelitní lokus pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) se specifickými primery a následná analýza produktů. Aplikace metodiky předpokládá základní vybavení laboratoře molekulární biologie, jakou má např. ÚKZÚZ nebo šlechtitelské stanice. Metodika je určena především pro potřeby Národního programu konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin významných pro výživu a zemědělství (148/2003 Sb.) a dále všem uživatelům, kteří se potýkají s problémem pravosti a čistoty odrůd (ÚKZÚZ, šlechtitelské stanice, rezortní výzkumné ústavy, apod.).

The use of microsatellite analysis for the characterisation of wheat, barley and oat varieties for the wants of seed companies, breeding stations and variety testing The aim of the methodology is to launch the analysis of microsatellites for the characterisation of wheat, barley and oat into praxis. Microsatellites show a high variability and therefore they are very suitable for this purpose. The principle of the method is the analysis of length variability of the products of PCR (polymerase chain reaction) with primers specific to a microsatellite locus. The application of the method assumes the basically equipped laboratory. and It is meant basically for the use of the National Programme of Conservation and Use of Plant Genetic Resources (148/2003 Sb.) and further for all who are confronted with the problem of the purity of wheat, barley or oat varieties (ÚKZÚZ, breeding stations, Agriculture Research Institutes, and so on).

Oponenti: doc. Ing. Jan Bednář, CSc., Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Ing. Ivan Branžovský, Ministerstvo zemědělství Praha Metodika byla schválena odborem výzkumu MZe pod č.j. 46274/200818020 ze dne 10.12.2008 Ministerstvo zemědělství doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi.

Obsah: strana I. Úvod a cíl metodiky

5

II. Vlastní popis metodiky Podstata metody Potřebné technické vybavení Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti

6 6 7 8 11

III. Přednosti metody a možnosti rutinního využití

13

IV. Popis uplatnění metodiky

13

V. Použitá a další doporučená literatura

14

VI. Seznam publikací, ze kterých metodika vychází

16

Příloha 1 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd pšenice

17

Příloha 2 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ječmene

18

Příloha 3 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ovsa

19

I. Úvod a cíl metodiky Charakterizace odrůd obilnin pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví je obecným problémem. S objevem polymerázové řetězové reakce (PCR) a jejím zavedením jako rutinní metody v laboratořích molekulární biologie se však značně zrychlil vývoj metod pro studium genetické variability a tudíž se i problém charakterizace odrůd stal řešitelným. V současné době již existuje mnoho metod, které jsou vhodné pro detekci genetické variability. Jednou z metod, která se rutinně používá je analýza mikrosatelitů. Mikrosatelity jsou úseky DNA s opakujícím se motivem nejčastěji dvou nukleotidů. Počet opakování daného motivu je dán mnoha faktory a je nutno ho chápat z fylogenetického hlediska. Vlastní příčinou je chromosomální dynamika: chromosomální aberace, nerovnoměrný crossing-over, amplifikace a neúplná replikace určitých segmentů chromosomální DNA (Ondřej, 1992). Mikrosatelity se tudíž vyznačují vysokou mírou variability v počtu opakování jejich motivů, která se ve vlastní analýze projeví jako vysoká míra délkového polymorfismu amplifikovaných fragmentů DNA daného mikrosatelitního lokusu. Výhodou analýzy mikrosatelitů je hypervariabilita, kodominance alel, hojný výskyt v genomech eukaryot, potřeba pouze malého množství DNA, vysoká reproducibilita, možnost provádět analýzy jako multiplex, tj. v jedné reakci analyzovat více SSR lokusů, což výrazně zlevňuje cenu analýz (de Vienne et al., 1998). Z mnoha komparativních studií (např.: Russel et al. 1997; Nagaoka and Ogihara, 1997) se analýza mikrosatelitů ukazuje jako nejvhodnější metoda pro analýzy genetické variability v rámci druhu – jinými slovy tato metoda nejlépe detekuje rozdíly mezi odrůdami téhož rostlinného druhu. Vzhledem k tomu, že tato metoda není dosud zavedena pro potřeby charakterizace odrůd, vznikla tato metodika, jejímž cílem je zavést metodu analýzy mikrosatelitů do praxe. Metodika byla optimalizována na několika stech odrůdách pšenice, ječmene a ovsa a je potvrzena několika publikacemi (Roussel et al., 2005; Leisova et al., 2007).

5

II. Vlastní popis metodiky analýzy mikrosatelitů Podstata metody I. Odběr vzorků a izolace DNA Podstatou první části je odběr vzorků. Pro izolaci kvalitní DNA se doporučuje použít mladé listy. Vzorky je tedy možno získat dvojím způsobem: napěstováním z osiva nebo na jaře odběrem přímo z pole. Podle typu analýzy je nutno odebrat listy buď z jedné rostliny (např. při analýze kříženců) nebo z nejméně 30 rostlin (např. při charakterizaci odrůd). Listový materiál je uchováván v PE zipových sáčcích nebo jsou listy zabaleny do alobalu a uchovávány při teplotě -80°C nebo je ihned zpracovány. Vzorky jsou doplněny popisem odrůdy a datem, příp. popisem lokality/místa odběru. Pro extrakci DNA je nutné její uvolnění z buněk mechanickým rozdrcením a oddělení DNA od ostatních sloučenin, zejména proteinů, polysacharidů a barviv. Přidáním detergentu CTAB dochází za přítomnosti soli NaCl k vytvoření ve vodě rozpustného komplexu [CTAB-DNA], který je následně směsí chloroformu a izoamylalkoholu (24:1) extrahován do vodné fáze a oddělen takto od proteinů a polysacharidů, které jsou spolu s chloroformovou fází odstraněny. DNA je pak srážena absolutním etanolem a zbytky soli a detergentu jsou odstraněny pomocí 75% roztoku etanolu. DNA je rozpuštěna v pufru TE, který je velmi zředěným vodným roztokem Tris a EDTA, které stabilizují DNA v roztoku. Tris upravuje pH a EDTA vyvazuje Mg2+ ionty a tím inhibuje činnost enzymů rozkládajících DNA. II. Analýza mikrosatelitů Podstatnou součástí analýzy mikrosatelitů je amplifikace lokusu DNA obsahujícího daný mikrosatelit pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s lokusově specifickými primery. Detekovaný mikrosatelit je určitý motiv bází (ACGT), který se opakuje a tyto počty opakování se mohou lišit u různých genotypů. Detekce délkového polymorfismu amplifikovaných produktů pak znamená detekci různého počtu opakování daného motivu v daném genotypu. Protože je nutno rozlišit délku produktu PCR reakce pro daný mikrosatelit s přesností na 2bp, je nutné použít přesnější metodu než je klasická elektroforéza v agarózovém gelu. Tato metodika byla optimalizována na použití kapilární elektroforézy v přístrojích ABI PRISM 310 a 3130. V tomto případě je možné provádět tzv. multiplexové analýzy a analyzovat tak více (obvykle 3-4) reakce v jedné analýze a to díky fluorescenčně značeným primerům (6-fam, hex, tet, vic, ned, pet). Součástí analýzy je velikostní standard a pokud je třeba porovnávat analýzy mezi sebou pak rovněž standardy alel. 6

Je-li testována pravost odrůdy musí být součástí analýzy referenční DNA dané odrůdy nebo jsou-li k dispozici pouze sestavy alel (např. z jiného pracoviště), pak je vhodné doplnit analýzy o standardy alel společné oběma pracovištím. Potřebné technické vybavení I. Odběr vzorků a izolace DNA Pro uchovávání vzorků a izolaci DNA je třeba následující zařízení:  mrazicí box (-80°C)  centrifuga s otáčkami min. 11000 otáčet/min. s úhlovým rotorem na mikrozkumavky z umělé hmoty (Ependorfky) o objemu 2 ml  třepačka  vodní lázeň nebo blokový termostat  zařízení na horizontální elektroforézu  automatické pipety  mikrozkumavky na izolaci DNA – 2ml  špičky na automatické pipety  elektronické předvážky Pro izolaci DNA jsou potřebné následují roztoky a chemikálie:  tekutý dusík  2 x CTAB PUFR: 2 M NaCl 40 ml 5 M roztoku 0,2 M Tris 20 ml 1 M rozt. o pH 8,0 50 mM EDTA 10 ml 0,5 M rozt. o pH 8,0 2 % CTAB (Sigma Aldrich) 2 g CTAB s do 100 ml H2O up  TE PUFR: 10 mM Tris 2,5 ml 1 M roztoku o pH 8,0 1 mM EDTA 0,5 ml 0,5 M rozt. o pH 8,0 do 250 ml H2O up  směs chloroform : isoamylalkohol (24:1)  absolutní tj. min. 96% roztok izopropanolu – vychlazený na teplotu 20°C  70 % roztok etanolu  1 x TAE PUFR TRIS báze (s) 4,8 g 0,48% roztoku 1,5 ml 0,5M ledová CH3COOH EDTA (pH = 8,0) 2,0 ml 1mM roztok do 1000ml H2O up 7

 Velikostní standard λ HindIII (Fermentas), vč. nanášecího pufru II. Analýzy mikrosatelitů pšenice, ječmene a ovsa Pro analýzu mikrosatelitů jsou potřebné následující chemikálie a zařízení:  primery specifické pro daný druh rostliny (viz přílohy)  dNTP  Tth polymeráza vč. pufru a MgCl2 (Biotools)  H2O up  agaróza (SERVA)  PCR destičky vč. víček či folie (AB gene), lze použít jednotlivé PCR zkumavky od různých výrobců  automatické pipety  špičky na automatické pipety  termocykler  stolní minicentrifuga  přístroj na kapilární elektroforézu a vyhodnocení dat Pracovní postup a vyhodnocení experimentálních dat I. Odběr vzorků a izolace DNA  Odebrané listy jsou umístěny do zipového sáčku nebo zabaleny do alobalu a opatřeny popisem (název odrůdy, datum odběru, příp. lokalita a další údaje).  Asi 0,5 mg rostlinného materiálu je rozetřeno ve třecí misce v prostředí tekutého dusíku; prášek je ihned přemístěn do 2ml mikrozkumavky se 700l pufru 2xCTAB a promíchán na třepačce. Poté jsou vzorky 30 minut inkubovány ve vodní lázni při teplotě 60°C. Pak je směs ochlazena na laboratorní teplotu.  Ke směsi je přidán 1x objem směsi chloroformu a izoamylalkoholu (24:1). Po 10 minutách třepání jsou vzorky centrifugovány při maximálních otáčkách po dobu 10 minut a je odebrána vodná fáze. Tento krok je ještě jednou zopakován.  K roztoku vzorku je přidán 1x objem 96% vychlazeného izopropanolu. Pro úplnou precipitaci DNA jsou vzorky inkubovány po dobu asi 15 minut při teplotě 4°C. Poté je DNA odebrána pomocí skleněných háčků vyrobených zatavením konců Pasteurových pipet (Obrázek 1). Vzorky na háčcích jsou umístěny do nových mikrozkumavek s 500l 75% roztoku etanolu. Vzorky jsou inkubovány min. 1 hodinu (nejlépe přes noc) při teplotě 4°C. 8

Obrázek 1 – Skleněný háček na zachycení DNA

 Supernatant je odstraněn, k peletce DNA je přidáno 500 l 75% roztoku etanolu a vzorky jsou inkubovány alespoň 1 hodinu při teplotě 4°C.  Supernatant je odstraněn včetně zbytků etanolu vysušením a DNA je rozpuštěna podle velikosti peletky ve 300 - 500l TE pufru.  K roztokům DNA je přidáno 20l roztoku RNázy (20mg/ml) a vzorky jsou inkubovány 10 minut při 37°C.  Kvalita a koncentrace izolované DNA je ověřena elektroforézou v 0,8% agarózovém gelu. K 1 l vzorku DNA je přidáno 10l H2O a 3l nanášecího pufru a směs je nanesena na gel. DNA je vizualizována pomocí ethidiumbromidu (0,3l/ 60 ml gelu) a detekována pod UV lampou. Koncentrace DNA vzorku je odhadnuta srovnáním se standardem λ Hind III (6l - podle koncentrace standardu).  Vzorky DNA jsou naředěny H2Oup na pracovní koncentraci 100ng/μl. II. Analýza mikrosatelitů  Do PCR zkumavek nebo PCR destičky je napipetována reakční směs. Doporučuje se připravit si nejprve mastermix (reakční směs bez templátové DNA) do zvláštní zkumavky, ten rozpipetovat a k němu nakonec přidat po 1l roztoku vzorku DNA. Reakční směs: směs primerů F+R (5M) 1,0l dNTP (2,5 mM) 1,5l pufr (BioTools) (10x) 1,5l 2,0l MgCl2 (15mM) Tth polymeráza (BioTools) (5U/l) 0,2l templátová DNA (100ng/l) 1,0l 9,2l H2O reakční objem 15,0l

 0,33 M  0,25 mM 1x  2,0 mM 1 U  100ng

9

 Vzorky jsou zcentrifugovány na minicentrifuze nebo na centrifuze na PCR destičky a jsou umístěny v termocykleru. PCR reakce se sestává z následujících kroků: 1 cyklus: 95°C ........... 5 min. 35 cyklů: 95°C ........... 30 sec. TM* ........... 30 sec. 72°C ........... 40 sec. 1 cyklus: 72°C ........... 5 min. 10°C ..........  * Hodnoty TM jsou pro vybrané mikrosatelitní markery uvedeny v přílohách.  Produkty amplifikace jsou separovány elektroforeticky metodou kapilární elektroforézy na přístroji ABI PRISM 310 (Perkin-Elmer) nebo na přístroji ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems): 1. Analýza PCR produktů v přístroji ABI PRISM 310  Jako interní velikostní standard se používá Tamra 500 pro kombinaci primerů fluorescenčně značených 6-FAM, HEX, TET).  Vzorky pro analýzu jsou připravovány do zkumavek (PN401957, Applera), uzavřeny víčkem (PN401956, Applera) a zcentrifugovány. Příprava vzorků pro analýzu: Formamid (Applera) 4,8μl Tamra 500 (Applera) 0,4 μl Vzorky 6-FAM 0,2-0,5 μl podle intenzity píků HEX 0,2-0,5 μl podle intenzity píků TET 0,2-0,5 μl podle intenzity píků  Vzorky jsou poté inkubovány 7 minut při teplotě 95°C a následně rychle ochlazeny na teplotu 4°C a krátce zcentrifugovány. Nastavení elektroforézy:

Kapilára 47cm Gel: POP4 Modul: GS POP4_1ml_C Matrice: C Injektáž: 5-7 sec. Doba běhu: 20-24 minut podle velikosti produktu  Výsledkem analýzy elektroforetogramů programem GeneScan a Genotyper jsou velikosti jednotlivých fragmentů v bp a jejich zařazení do kategorií podle velikosti v bp. 10

2. Analýza PCR produktů v přístroji ABI PRISM 3130  Jako interní velikostní standard se používá LIZ500 (Applera) pro kombinaci primerů fluorescenčně značených 6-FAM, VIC, NED a PET.  Vzorky pro analýzu jsou pipetovány do optických PCR destiček (PN 4306737, Applera) a překryty speciálními víčky (PN4315933, Applera). Příprava vzorků pro analýzu: Formamid (Applera) 10 μl LIZ500 (Applera) 0,5 μl Vzorky 6-FAM 0,2-0,5 μl podle intenzity píků VIC 0,2-0,5 μl podle intenzity píků NED 0,2-0,5 μl podle intenzity píků PET 0,2-0,5 μl podle intenzity píků  Vzorky jsou poté inkubovány 7 minut při teplotě 95°C a následně rychle ochlazeny na teplotu 4°C a krátce zcentrifugovány. Nastavení elektroforézy: Set kapilár: 36 cm Gel: POP7 Matrice: G5 Modul: Fragment Analysis 36_POP7  Výsledkem analýzy elektroforetogramů programem GeneMapper jsou velikosti jednotlivých fragmentů v bp a jejich zařazení do kategorií podle velikosti v bp. Analýza výsledků Tabulky kategorií (alel) jsou transportovány do programu MS Excel a zpracovány do uživatelské podoby sestavy alel pro daný genotyp nebo do podoby binární tabulky. Zhodnocení finanční, časové a kapacitní náročnosti Analýza je založena na PCR reakci a následné přesné detekci velikosti produktů. Před vlastní analýzou je nutné extrahovat DNA. Časově náročná je extrakce DNA a analýza PCR produktů v závislosti na typu přístroje, ve kterém je prováděna kapilární elektroforéza. Analýza 96 vzorků (počet pozic v PCR destičce) včetně extrakce DNA a analýz 20 mikrosatelitních lokusů trvá min. 14 dnů v případě, že na analýze pracuje 1 člověk. Analýza produktů PCR reakce je finančně náročnější než vlastní PCR reakce. Cena analýzy jednoho vzorku pšenice všemi markery uvedenými 11

v příloze 1 činí 1375,-Kč včetně izolace DNA a analýzy v přístroji ABI PRISM 310. Cena analýzy jednoho vzorku ječmene i ovsa všemi markery uvedenými v příloze 2 a 3 činí 1115,-Kč včetně izolace DNA a analýzy v přístroji ABI PRISM 3130. Ceny analýz jsou uvedeny pouze orientačně, neboť závisejí na kurzu US dolaru a aktuálních cenách. S vlastním přístrojovým vybavením a větším počtem analyzovaných vzorků jsou výsledné ceny analýz výrazně nižší.

12

III. Přednosti metody a možnosti rutinní ho využití Základní předností metody je, že je analýza mikrosatelitů dobře aplikovatelná pro rutinní využití, je robustní a s vysokou mírou reproducibility. Pomocí této metodiky lze rozlišit i velmi příbuzné genotypy mnohem spolehlivěji, než je tomu u dosud používaných klasických postupů zejména proto, že mikrosatelity pokrývají celý genom nikoliv pouze určitý fenotypově se projevující gen. Cena analýz se výrazně zlevňuje, čím více vzorků je analyzováno. Jediným úskalím metody je, že bez aplikace standardů alel a referenčních odrůd není možné porovnávat výsledky z analýz prováděných v různou dobu či v různých laboratořích a pak není možné identifikovat danou odrůdu. Toto úskalí lze však snadno překonat zvolením tzv. standardů alel a ty pak analyzovat vždy s danými vzorky. IV. Popis uplatnění metodiky Metodika je určena všem, kdo se zabývají konzervací genových zdrojů, dále pracovníkům šlechtitelských stanic a semenářských podniků, tj. všude tam, kde se potýkají s otázkou charakterizace odrůd, pravosti osiva a míry diverzity mezi sledovanými odrůdami pšenice, ječmene a ovsa. Uplatní se jako konkrétní protokol pro analýzu odrůd pšenice, ječmene a ovsa v laboratořích molekulární biologie spolupracujících s genovými bankami, zejm. v Praze a v Kroměříži, dále v laboratořích šlechtitelských stanic, ÚKZÚZ a semenářských podniků. Kromě předání metodiky je Laboratoř genetické diverzity VÚRV, v.v.i. otevřena pro případné zaškolení pracovníků z jiných pracovišť.

13

V. Použitá a další doporučená literatura DE VIENNE D., SANTONI S. (1998): Les principales sources de marqueur moléculaires. In: de Vienne et al.: Les marqueur moléculaire en génétique et biotechnologies végétales. INRA, Paris, 1998: 15-47. GOLDSTEIN D.B., SCHLÖTTERER CH. (2000): Microsatellites: evolution and application. Oxford university press, New York, US, 2000. LEIŠOVÁ L., KUČERA L., DOTLAČIL L. (2007): Genetic resources of barley and oat characterised by microsatellites. Czech Journal of Plant Breeding 43(3): 97-104. LI C.D., ROSSNAGEL B.G., SCOLES G.J. (2000): The development of oat microsatellite markers and their use in identifying relationships among Avena species and oat cultivars. Theor Appl Genet 101: 1259-1268. Literatura: LIU Z.W., BIYASHEV R.M., SAGHAI MAROOF M.A. (1996): Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map. Theor Appl Genet 93: 869-873. NAGAOKA T., OGIHARA Y. (1997): Applicability o inter-simple sequence repeat polymorpisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theoretical and Applied Genetics 94: 597-602. ONDŘEJ M. (1992): Genové inženýrství kulturních rostlin. Academia, Praha 1992. PAL N., SNADHU J.S., DOMIER L.L., KOLB F.L. (2002): Development and characterisation of microsatellite and RFLP-derived PCR markers in oat. Crop Science 42: 912-918. RAMSAY L., MACAULAY M., IVANISSEVICH S., MACLEAN K., CARDLE L., FULLER J., EDWARDS K.J., TUVESSON S., MORGANTE M., MASSARI A., MAESTRI E., MARMIROLLI N., SJAKSTE T., GANAL M., POWELL W., WAUGH R. (2000): A simple sequence repeat-based linkage map of barley. Genetics 156: 1997-2005. RÖDER M.S., KORZUN V., WENDEHAKE K., PLASCHKE J., TIXIER M.H., LEROY P., GANAL M.W. (1998): A MICROSATELLITE MAP OF WHEAT. GENETICS 149: 2007-2023. ROUSSEL V., LEISOVA L., EXBRAYAT F., STEHNO Z., BALFOURIER F. (2005): SSR allelic diversity changes in 480 European bread wheat varieties released from 1840 to 2000. Theoretical and Applied Genetics 111: 162-170. RUSSEL J.R., FULLER J.D., MACAULAY M., HATZ B.G., JAHOOR A., POWELL W., WAUGH R. (1997): Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs and RAPDs. Theoretical and Applied Genetics 95: 714-722. 14

RUSSELL J., FULLER J., YOUNG G., THOMAS B., TARAMINO G., MACAULAY M., WAUGH R., POWELL W. (1997): Discriminating between barley genotypes using microsatellite markers. Genome 40: 442-450. SPOONER D., VAN TREUREN R., DE VINCENTE M.C. (2005): Molecular Markers for genebank management. IPGRI Technical bulletin no.10, IPGRI, Italy 2005.

15

VI. Seznam publikací, ze kterých metodika vychází LEIŠOVÁ L., KUČERA L., DOTLAČIL L. (2007): Genetic resources of barley and oat characterised by microsatellites. Czech Journal of Plant Breeding 43(3): 97-104. LEIŠOVÁ L., KUČERA L., DOTLAČIL L. (2007): Microsatellites as a tool to evaluate and characterise bread wheat core collection. In: BUCK H.T., NISI J.E., SALOMÓN N. (eds.): Wheat Production in Stressed Environments, Springer 2007, 12: 771-778. ROUSSEL V., LEISOVA L., EXBRAYAT F., STEHNO Z., BALFOURIER F. (2005): SSR allelic diversity changes in 480 European bread wheat varieties released from 1840 to 2000. Theoretical and Applied Genetics 111: 162-170. POLÁKOVÁ K., OVESNÁ J., LEIŠOVÁ L. (2001): Identification of Barley (Hordeum vulgare L.) cultivars using microsatellite analyses. Czech Journal of Plant Breeding 37: 23-28. LEIŠOVÁ L., OVESNÁ J. (2001): The use of microsatellite analysis for the identification of wheat varieties. Czech Journal of Plant Breeding 37: 29-33.

16

Příloha 1 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd pšenice (Triticum aestivum L.) SSR primer-značka Xgwm 135-6-FAM Xgwm 99-TET Xgwm 11-TET Xgwm 413-TET Xgwm 337-6-FAM Xgwm 642-HEX Xgwm 312-TET Xgwm 372-TET Xgwm 120-6-FAM Xgwm 257-TET Xgwm 261-FAM Xgwm 539-HEX Xgwm 2-TET Xgwm 480-HEX Xgwm 285-FAM Xgwm 566-TET Xgwm 341-HEX Xgwm 664-TET Xgwm 610-HEX Xgwm 149-HEX Xgwm 251-TET Xgwm 194-6-FAM Xgwm 186-6-FAM Xgwm 415-TET Xgwm 234-6-FAM Xgwm 408-HEX Xgwm 190-HEX Xgwm 272-FAM Xgwm 169-HEX Xgwm 427-TET Xgwm 219-HEX Xgwm 626-6-FAM Xgwm 325-TET

Chrom Motiv opakování o-zom 1A 1A 1B 1B 1D 1D 2A 2A 2B 2B 2D 2D 3A 3A 3B 3B 3D 3D 4A 4B 4B 4D 5A 5A 5B 5B 5D 5D 6A 6A 6B 6B 6D

(GA)20 (CA)21 (TA)6CATA(CA)19(TA)6 (GA)18 (CT)5(CACT)6(CA)43 (GT)14 (GA)37 (GA)>51 (CT)11 (CA)18 (GT)30 (CT)21 (GA)27 (CA)18 (CT)16 (CA)13 (GA)27 (CA)21(GA)2(TA)8 (CT)26 (GA)22 (GA)17imp (GA)23imp (CA)28 (CT)32imp (GA)26 (GA)25imp (CT)16(CA)20 (CA)>22(TA)(CA)7(TA)9 (CT)22 (CA)17 (GA)23 (CA)31 (CA)22 (GA)35imp (CT)5(GT)13 (CT)16

Rozsah Tm velikosti alel (°C) (bp) 60 137-201 60 98-142 60 189-217 60 88-118 55 163-209 60 189-209 55 184-240 60 285-349 60 120-159 60 193-199 60 165-219 60 123-185 60 112-130 57 153-201 55 204-242 60 118-132 60 124-162 55 151-155 60 158-192 55 153-173 55 81-123 60 116-137 55 101-157 55 127-135 55 202-247 55 149-203 60 202-218 50 127-145 55 176-226 50 192-230 60 149-219 50 104-135 60 135-151 17

Xgwm 469-TET Xgwm 233-TET Xgwm 260-FAM Xgwm 400-6-FAM Xgwm 46-HEX Xgwm 437-HEX Xgwm 44-6-FAM

6D 7A 7A 7B 7B 7D 7D

(CT)19(CA)10 (CT)24 (GA)20 (CA)21 (GA)2GC(GA)33 (CT)24 (GA)28

60 45 60 60 60 60 60

160-190 238-276 166-184 130-162 146-188 91-127 164-192

18

Příloha 2 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ječmene (Hordeum vulgare L.) SSR primer-značka

Rozsah Tm velikosti (°C) alel (bp) (CA)21 60 190-228 (AT)5(CA)22 60 192-276 (GA)8(AT)9(CA)20 60 187-237 (GA)13 60 104-140 (GA)14 60 107-165 (C)10(A)11 60 178-200 (AG)6-(AG)10-(AG)6 60 184-202 (AG)11,(GA)14 60 107-120 (GA)11 60 235-265 (GA)6(GT)4(GA)7 55 131-161 (GA)11 60 99-119 (AT)29 55 160-218 55 131-157 (AC)20 55 158-184 (AC)9(AG)17 50 148-184

Chro- Zdroj Motiv opakování mozom *

BMS02-6-FAM BMS32-VIC BMS90-NED HVM36-PET HVM54-6-FAM HVBKASI-VIC Bmag0136-NED HVM60-PET HVM62-6-FAM HVM40-VIC HVM67-NED BLYRCAB-PET EBmac0906-6-FAM Bmac0181-VIC Bmag0222-NED

1H 1H 1H 2H 2H 2H 3H 3H 3H 4H 4H 4H 4H 4H 5H

a a a b b b c b b b b a c c c

Bmag0394-PET

5H

c

HVM30-6-FAM Bmag0500-VIC BMS18-NED BMS40-PET Bmag0021-6-FAM Bmag0135-VIC HVCMA-NED Bmag0496-6-FAM Bmag0807-VIC HVM74-NED

5H 6H 6H 6H 7H 7H 7H 6H 6H 6H

b c a a c c b c c b

(AG)9CG(AG)4CG(A G)4 (CA)8 (AG)7C(AG)30-(AG)6 (CT)9(CA)12 (CA)21(GA)21 (CA)10AA(GA)28 (AG)10GG(AG)12 (AT)9 (CT)20 (TC)18 (GA)13

55

161-179

60 60 60 60 55 60 60 60 55 55

135-155 139-209 123-141 177-237 99-169 117-157 119-139 170-227 95-113 168-246

* a - Russell et al., 1997; b - Liu et al., 1996; c - Ramsay et al., 2000

19

Příloha 3 - Vybrané mikrosatelitní markery pro charakterizaci odrůd ovsa (Avena sativa L.) SSR primerznačka AM1-6-FAM AM2-VIC AM3-NED AM4-PET AM6-6-FAM AM13-VIC AM14-NED AM20-PET AM25-6-FAM AM40-VIC AM42-NED AM47-PET AM53-6-FAM AM54-VIC AM61-NED AM83-PET AM84-6-FAM AM87-VIC AM92-6-FAM AM102-NED AM103-PET AM104-6-FAM AM107-VIC AM112-NED AM114-PET AM115-6-FAM

Vazbová Zdroj* Motiv opakování skupina 1

2 3, 4

30 24 22

2 23

a a a a a a a a a a a a a a a b b b b b b b b b b b

(AG)21(CAGAG)6 (AG)24 (AG)35 (AG)34 (AG)20 (AG)15 (AC)21 (TG)10(CG)5 (AC)8(AC)4(CT)4 (GAA)7 (GAA)16 (AC)14 (AC)10 (AC)9 (TTTC)4..(CCT)6 (AC)11 (AC)9 (AC)13 (AC)13 (AC)9 (AC)16 (AG)36 (AC)3(AC)4 (AG)3(AC)9(AT)8 (AG)24(AC)14 (AC)9

Tm (°C) 60 50 60 60 60 46 60 60 60 60 60 60 60 60 60 46 46 60 60 60 46 60 60 60 60 60

Rozsah velikosti alel (bp) 157-225 129-163 243-325 133-227 205-329 182-206 111-161 245-263 215-233 235-255 177-213 255-273 245-323 177-181 206 187-197 116-192 148-170 121-161 201-251 189-193 185-223 265-267 231-297 175-267 209-213

* a - Li et al., 2000; b - Pal et al., 2002

20

Autoři: Název: Vydal: Náklad:

RNDr. Leona Leišová, Ph.D., Ing. Ladislav Kučera,CSc., RNDr. Jaroslava Ovesná,CSc. Použití metody analýzy mikrosatelitů pro charakterizaci odrůd pšenice, ječmene a ovsa pro potřeby semenářských podniků, šlechtitelských stanic a odrůdového zkušebnictví Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 - Ruzyně 20 ks

Vyšlo v roce 2008 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autora:

[email protected]

© Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN 978-80-87011-76-8 2

Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. v Ústavu zemědělských a potravinářských informací Slezská 7, 120 56 Praha 2 2008