PSI
50
Jakarta
LAPORAN AKHIR ·peNGEMBANGAN PROTOTIPE VAKSIN H5N1 DENGAN PENDEKATAN AGENT
KETUA PELAKSANA : Dr. dr. Budiman Bela, SpMK
Tahun 2012
PUSA T BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN BADAN LITBANG KESEHATAN DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI FKUI/ PUSAT PENELITIAN DAN LAYANAN KESEHATAN VIROLOGI DAN KANKER PATOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2012
.
� '1.. ..
.d ,
''u' ... ,.,, .. l� �· ' ' -i
• .
� !
· . : t: "'"'n � lJ·'4 ... . .. �t
l
1
/f}- �::_-�(J.___ '1 i
LAPORAN AKHIR PENGEMBANGAN PROTOTIPE VAKSIN H5N1 DENGAN PENDEKATAN AGENT
KETUA PELAKSANA : Dr. dr. Budiman Bela, SpMK
Tahun 2012
PUSAT BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN SADAN LITBANG KESEHATAN DEPARTEMEN MIKROBIOLOGI FKUI/ PUSAT PENELITIAN DAN LAYANAN KESEHATAN VIROLOGI DAN KANKER PATOLOGI FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS INDONESIA 2012
.JUDUL PENELITIAN
Pmgembangan Prototipe Vaksin H5Nl dengan Pendekatan Agent
D. LATAR BELAK.ANG Virus Influenza A galur baru penyebab pandemi dapat muncul sewaktu-waktu secara terduga karena struktur antigen virus ini dapat berubah melalui proses mutasi genetik '2rlg berlangsung cepat dan sering disebut sebagai antige nic shift maupun melalui proses
_
perubahan secara lambat yang disebut antigenic drift.
pada
unggas air liar maupun terdomestikasi,
Adanya reservoir pada hewan, yaitu
yang tidak memperlihatkan gejala jelas atau
tidak menyebabkan kematian pada saat terinfeksi virus ini mengakibatkan virus ini terus menerus bersirkulasi di alam dan menghasilkan varian-varian virus baru tanpa terdeteksi. Interaksi unggas air secara langsung dengan manusia maupun melalui unggas maupun hewan peliharaa:r:i lainnya berpotensi . menimbulkan virus influenza A galur baru yang dapat berkembang menjadi virus penyebab pandemi. Sebagian besar infeksi virus influenza A pada manusia tidak menimbulkan penyakit dengan gejala yang berat, tetapi angka kematian yang terjadi pada pandemi tidak dapat diabaikan, bahkan pada beberapa kejadian pandemi angka kematian yang ditimbulkan sangat tinggi (1). Hal ini menyebabkan Badan Kesehatan Dunia (World Health Organization/WHO) menghimbau negara-negara di dunia 1:1ntuk mengerobangkan dan mengimplementasikan rencana persiapan pandemi untuk mitigasi dampak kesehatan dan sosial pandemi (2). Virus Influenza A merupakan salah satu tipe virus influenza yang terdiri atas virus influenza A, B dan C.
Virus influenza A terdiri atas beberapa subtipe yang ditentukan
berdasarkan tipe antigen hemagglutinin (H) dan neuraminidasa (N), dimana terdapat 16 jenis antigen H
dan 9 jenis antigen N (3,4).
Subtipe virus Influenza A yang lazim ditemukan
bersirkulasi pada manusia saat ini adalah
HI NJ dan H3N2 (5).
Selain kedua subtipe
tersebut, beberapa subtipe virus Influenza A ditemukan pada rnanusia temyata berasal dari hewan.
Virus lnfluenza A berasal dari hewan yang meJewati "batas lintas spesies" sehingga
menginfeksi manusia antara lain disebabkan subtipe HlNl, H7N7, H9N2, H7N3, H5Nl dan H10N7 (1,6)
Virus influenza unggas H5Nl (Al H5N1) dipandang
berpotensi sebagai
agensia penyebab pandemi influenza global sejak virus ini ditemukan melewati "batas lintas spesies" dan ditemukan menginfeksi manusia pada tahun 1997 (1,7,8).
lnfeksi influenza A H5Nl pada manusia ditemukan pertama kali pada tahun 2005 dan sampai dengan 6 Mei 2010, jumlah kasus infeksi influenza A H5Nl terkonfinnasi mencapai 165 kasus dengan jumlah kematian sebanyak 136 orang (82,4%) (9,10).
Sejak tahun 2007
sampai saat ini jumlah kasus infeksi influenza A H5N1 terlihat menurun (10),
namun
kemungkinan munculnya virus influenza A H5Nl galur baru penyebab pandemi perlu untuk diwaspadai.
Peningkatan migrasi penduduk secara global, posisi geografis Indonesia yang
terletak pada jalur migrasi unggas liar, serta fakta bahwa unggas liar merupakan "reservoir" virus
influenza
A menjadi
alasan
penting
yang
menjadi
landasan
untuk
senantiasa
memperhitungkan influenza A, khususnya influenza A H5Nl sebagai potensi ancaman bagj kehidupan masyarakat Indonesia. Kewaspadaan terhadap munculnya virus influenza fenomena
A H5N1 galur baru akibat
antigenic drift maupun antigen ic shift yang berpotensi sebagai penyebab pandemi
perlu untuk dipertahankan mengingat berdasarkan peristiwa pandemi sebelumnya, virus influenza A penyebab pandemi merupakan virus influenza A unggas dengan kemampuan transmisi dari orang ke orang.
Penting untuk diperhatikan pula bahwa vims influenza A
H5Nl yang semula · hanya ditemukan di unggas dan tidak menginfeksi manusia kemudian menunjukkan kemampuan melintasi batas antara spesies sehingga ditemukan di manusia dan kemudian bahkan ditemukan mampu melakukan infeksi dari orang ke orang walaupun masih secara terbatas dalam kelompok tertentu yang mungkin hampir seluruhnya memiliki hubungan kekeluargaan. Salah satu upaya persiapan pandemi Influenza
A yang direkomendasikan oleh WHO
pada tahun 2005 ialah pengembangan vaksin yang efektif, spektrum proteksi yang luas (11).
khususnya yang memiliki
Vaksinasi merupakan strategi intervensi yang bersifat
..cost-effective" karena respon irnun terhadap vaksin influenza A bersifat protektif sehingga mampu mencegah terjadinya infeksi yang berpotensi menyerap pendanaan dalam jumlah besar untuk biaya diagnosis, perawatan dan pengobatan. Strategi vaksinasi merupakan salah satu strategi yang dapat diharapkan mencegah angka morbiditas dan mortalitas tinggi pada saat munculnya galur virus influenza A baru dengan struktur antigen yang belum dikenali oleh imunitas populasi manusia, namun terdapat permasalahan yang perlu untuk dipecahkan agar strategi ini dapat diterapkan secara berhasil. merupakan
strategi
pengendalian
infeksi
yang
Walaupun vaksinasi Influenza A
dapat
dianggap
murah
dan
efektit:
pengembangan vaksin Influenza A berdasarkan teknologi yang dipakai saat ini yaitu menggunakan telur ayam berembrio memiliki kendala tersendiri.
Kendala utama dalam
jpiDduksi
vaksin Influenza A pada telur ayam berembrio ialah pada potensi teknologi ini
.=enghasilkan jumlah vaksin yang mencukupi dalam waktu yang relatif cepat, dimana hal ini smgat penting agar pemberian vaksin dapat dilakukan .sebagian besar populasi penduduk suatu negara (12,13).
sebelum terjadinya infeksi pada Di sisi lain, vaksinasi seluruh
populasi negara bukanlah hal yang mudah untuk dilakukan, karena tidak hanya memerlukan ketersediaan vaksin spesifik yang mampu memberikan perlindungan terhadap galur virus baru, tetapi juga memiliki tantangan tersendiri dalam distribusi vaksin, khususnya di wilayah lndonesia yang sulit untuk dijangkau dalam waktu cepat. Vaksin DNA menarik untuk dikernbangkan dalam rangka persiapan menghadapi pandemi influenza A.
Waktu yang dibutuhkan untuk melakukan konstruksi "bibit vaksin"
serta memperoleh vaksin dalam skala besar yang mencukupi untuk vaksinasi seluruh populasi penduduk suatu negara dengan jumlab populasi yang besar seperti Indonesia dapat dilakukan dalam kurun waktu 11 minggu, sehingga vaksinasi seluruh populasi secara teoritis dapat dilakukan dalam kurun waktu kurang dari 16 minggu sejak susunan nukleotida virus penyebab pandemi diperoleh.
Sifat DNA yang relatif jauh lebih-stabil dibandingkan protein
memungkinkan vaksin DNA untuk disebarluaskan ke seluruh pelosok negara, khususnya negara kepulauan seperti Indonesia, dengan cara yang lebih mudah karena tidak tergantung kepada sistem pendingin untuk mempertahankan stabilitas dan efektivitas vaksin. Vaksin DNA telah terbukti dapat menimbulkan proteksi silang antar subtipe influenza A yang
berbeda,
bila gen
yang
disisipkan
pada
vektor vaksin
DNA
merupakan
gen
pengekspresi protein bersusunan asam amino terkonservasi pada berbagai subtipe virus influenza A, misalnya gen pengekspresi protein matriks dan nukleoprotein. Ditinjau dar.i segi keunggulan vaksin DNA dalam menginduksi respon imun seluler, maka dapat diperkirakan bahwa vaksin DNA pengekspresi protein H dan N dari subtipe tertentu berpotensi lebih besar untuk menghasilkan proteksi silang terhadap varian-varian galur tersebut karena respon imun seluler memiliki kemampuan pengenalan epitop yang lebih beragam dibandingkan respon imun humoral (14). Selain itu, tidak tertutup kemungkinan bahwa vaksin DNA berdasarkan suatu subtipe virus influenza A dapat memberikan proteksi terhadap infeksi oleh virus influen:za A subtipe lainnya.
Kemungkinan ini menjadi terbuka berdasarkan fakta yang
ditemukan bahwa infeksi sebelumnya oleh suatu subtipe influenza A dapat memberikan proteksi terhadap infeksi oleh virus influenza A subtipe lain yang terjadi kemudian (15, 16).
�ieSpOU ilnun yang diinduksi oleh vaksin DNA meliputi respon imun sel T CD8, sel T ,.,..-_ re.spcm imun humoral dan juga respon imun nonspesifik (inate immunity) melalui -. --. ....- Toll like receptor (TLR).
Respon imun humoral berperan dalam netralisasi virus
� tidak dapat melakukan penempelan pada reseptor sel targetnya, disamping itu c::�Nli yang berikatan dengan partikel virus juga mengakibatkan penempelan antibodi pada se.I urinfeksi yang mengekspresikan partikel virus sehingga sel-sel NK (natural killer) tertarik
:-.. melepaskan substansi-substansi yang bersifat toksik terhadap sel terinfeksi tersebut.
� sel T CD8 berperan dalam penghancuran sel-sel terinfeksi yang mengekspresikan virus di dalam molekul MHC kelas I akibat interaksi spesifik antara reseptor sel T c..ecgan antigen virus.
Perangsangan sel T CD4 (sel T helper) meningkatkan efektivitas
sisrem imun spesifik yang ditimbulkan oleh vaksin dalam rnelakukan eliminasi infeksi virus i!:Jaik melalui jalur respon imun humoral maupun respon imun seluler.
Vaksin DNA jauh lebih stabil dibandingkan dengan vaksin berbentuk antigen protein serta
dapat dengan mudah disediakan dalam bentuk preparat kering tanpa mengurangi
stabilitas dan kemampuannya menginduksi respon lmun.
Hal mi merupakan saJah satu
keunggulan yang mempermudah distribusi vaksin DNA ke seiuruh pelosok Indonesia tanpa kendala ketergantungan pada "rantai dingin" yang memerlukan fasilitas pendingin khusus untuk penyimpanan vaksin. Keunggulan vaksin DNA yang lain ialah pada teknik amplifikasi "seed vaccine" yang
relatif lebih murah
dan
berpotensi untuk dilakukan dengan
memanfaatkan bahan-bahan baku yang diproduksi sendiri di Indonesia. Modifikasi vaksin DNA untuk meningkatkan imunogenitas vaksin telah dilaporkan dalam beberapa penelitian. Penambahan gen Interleukin-2 (IL2) telah diketahui dapat meningkatkan efikasi vaksin DNA (J 7 ). Modifikasi lain adalah modifikasi antigen sehingga menjadi antigen yang dapat disekresikan (18). Dalam penelitian ini akan dilakukan modifikasi pada vaksin DNA sehingga antigen virus yang djhasilkan akan membentuk viral like parlicle (VLP).
Selain itu akan dilakukan fusi antara gen penyandi antigen virus dengan susunan
nukleotida penyandi peptida atau protein yang diharapkan dapat meningkatkan respon antibodi (sel B), respon sel T-CD4 dan respon sel T-CD8.
Untuk meningkatkan respon
antibodi dilakukan fusi antigen virus dengan komplemen C3d yang diharapkan akan meningkatkan stimulasi sel B yang dipicu oleh interaksi C3d-CD21 sedangkan fusi antigen dengan CD40L dilakukan untuk aktivasi sinyal kedua melalui interaksi CD40-CD40L untuk stjmulasi Janjut pada set B.
Komponen lain yang juga menarik untuk disertakan ialah
komponen interaksi CD28-B7.
Fusi antigen deogan komponen C3b diharapkan akan
C!D.ingkatkan fagositosis �ntigen oleh makrofag yang akan berubah menjadi "Antigen P:?:senting Cells" untuk stimulasi sel T-CD4 spesifik. Stimulasi sel T-CD8 oleh vaksin DNA c..ipat dikatakan merupakan sifat alamiah vaksin DNA, karena antigen yang dihasilkan oleh
:!ksin DNA diproduksi oleh sel resipien vaksin sehingga bersifat antigen endogen yang .;enlapat dalam sitosol. Vaksin jenis lainnya yang juga menarik untuk dikembangkan adalah vaksin subunit rekombinan, khususnya yang diekspresikan pada sistem ekspresi prokariota, misalnya
Escherichia coli. Vaksin rekombinan yang diekspresikan pada E.coli memiliki keunggulan dari segi biaya produksi karena
medium
yang digunakan relatif jauh
lebih
murah
dibanding.kan medium kultur sel, selain itu tingkat produksi antigen rekombinan juga relatif cinggi.
Sistem
purifikasi
antigen
rekombinan
juga
telah
dikembangkan
sehingga
memungkinkan produksi dalam jumlah besar. Untuk mengatasi pennasalahan kesulitan antigen eksogen menstimulasi respon sel T-CD8, akan dilakukan fusi antara
protein
rekombinan dengan protein listeriolysin dan susunan asam amino yang mampu meni�gkatkan ubikuitinasi. difagositosis
Protein· listeriolisin diharapkan- akan meningkatkan lokalisasi protein yang oleh
makrofag
ke
dalam
sitosol
sedangkan susunan asam amino
yang
meningkatkan ubikuitinasi diharapkan akan meningkatkan proteolisis antigen di proteasom sebingga epitop antigen eksogen yang diinjeksikan pada resipien vaksin akan terekspresi pada molekul MHC kelas I untuk stimulasi sel T-CD8 spesifik. Alternatif lain yang dapat dilakukan ialah melakukan fusi dengan protein voyager meningkatkan penetrasi antigen ke dalam set non
virus herpes simpleks
meningkatkan
fagosit.
Telah diketahui bahwa stimulasi respon antibodi oleh antigen berstruktur repetitif lcbih kuat dibandingkan stimulasi oleh antigen berepitop tunggal.
lnteraksi epitop repetitif pada
antigen berstruktur repetitif dengan reseptor spesifik pada sel B (antibodi pada permukaan sel
B) akan mengakibatkan sambung silang (cross-linking) reseptor spesifik pada permukaan sel B dan menimbulkan stimulasi kuat pada sel B.
Partikel virus pada dasarnya merupakan
komponen repetitif yang terbeotuk oleh perakitan mandiri
(selfassembly) komponen protein
pembentuk partikel virus, sehingga secara alamiah partikel virus merupakan stimulator kuat respon sel B karena interaksi reseptor spesifik pada sel B dengao epitop repetitif pada permukaan
partikel
pennukaan sel B.
virus memungkinkan
terjadinya
fenomena
sambung
silang
pada
?embentukan partikel virus tanpa kandungan materi genetik dapat terjadi secara alamiah
a::.?::!pUll secara artifisial.
Struktur partikel virus tanpa kandungan materi genetik disebut juga
�oai Viral Like Particle (VLP).
Imunisasi binatang percobaan dengan VLP influenza A
tclah terbukti dapat menghasilkan respon imun protektif pada uji tantang binatang yang telah &i:munisasi dengan partikel virus influenza A infeksius homologus (19).
Pembentukan YLP
influenza A telah dicoba pada sistem ekspresi mamalia (sel mamalia) dan sistem ekspresi baculovirus (sel serangga) (19,20). Penelitian ini secara umum bertujuan untuk menghasilkan berbagai prototipe vaksin
\-aksi:n influenza A serta melakukan penilaian efektivitas vaksin maupun aspek ekonomi Derbagai prototipe vaksin tersebut.
Vaksin yang dikembangkan berupa vaksin DNA, vaksin
'LP dan vaksin protein subunit rekombinan. Setiap jenis prototipe vaksin influenza A yang embangkan dalam penelitian ini akan diteliti potensinya sebagai kandidat vaksin persiapan ?Jldemi melalui uji respon imun humoral, uji respon irnun selular dan uji tantang terhadap �rbagai jenis galur virus influenza A H5Nl yang berkembang di Indonesia, rnaupun �adap virus influenza A subtipe lainnya. Institusi pelaksana penelitian, telah
berpengalaman dalam pengembangan prototipe
Vclksin DNA, maupun prototipe vaksin protein subunit rekombinan.
Berbeda dengan
prototipe vaksin DNA influenza A H5Nl yang akan dikembangkan dalam penelitian ini, pototipe vaksin influenza A H5N 1 yang dikembangkan sebelumnya di institusi pelaksana �elitian tidak difusikan dengan susunan nukleotida yang bersifat ajuvan.
PERMASALAHAN Galur virus influenza A H5N1 penyebab pandemi sulit untuk diprediksi karakteristik �iknya karena informasi yang dimiliki mengenai pola replikasi virus serta faktor-faktor c::cleku lar yang mendasari tahapan inteksi virus pada berbagai spesies belum mencukupi 1-
dipakai dalam penentuan arah evolusi virus influenza A H5Nl yang berpotensi sebagai
� influenza A penyebab pandemi.
Walaupun demikian, dapat diperkirakan bahwa
tlrur antigen yang dimiliki oleh virus influenza A H5Nl galur baru akan memiliki pt:ESamaan epitop dengan virus influenza A yang beredar saat ini sehingga respon imun yang Chduksi oleh antigen virus influenza A H5Nl berbasis susunan asam amino galur tahun ini bapotensi memiliki daya proteksi silang dengan galur baru virus influenza A H5Nl yang
- bu] di kemudian hari sebagai penyebab pandemi. Potensi persamaan epitop ini khususnya Lehih tinggi pada epitop yang dikenali oleh sel T, baik sel T CD4 maupun sel T CD8.
Untuk menghadapi kemungkinan timbulnya virus influenza A non H5Nl sebagai j)eflyebab pandemi influenza A, perlu diteliti potensi protein virus influenza A dengan susunan asam amino terkonservasi pada semua subtipe influenza A untuk dikembangkan sebagai vaksin persiapan pandemi influenza A baru.
Protein matriks dan
berpotensi sebagai kandidat vaksin yang memenuhi persyaratan ini.
nukleoprotein
Di sisi lain, perlu
dipikirkan penghambatan replikasi virus oleh respon antibodi netralisasi yang sebagian besar bekerja berdasarkan interaksi dengan protein permukaan Hemaglutinin.
Untuk ini dapat
dipertimbangkan perancangan susunan asam nukleat penyandi antigen Hemaglutinin beberapa subtipe influenza A yang berpotensi penyebab pandemi, dengan susunan asam amino konsensus pada setiap subtipe tersebut.
Antigen permukaan yang mungkin dapat
dianggap mendesak untuk dikembangkan ialah antigen hemaglutinin HS, H9, dan H l (2009), neuraminidasa NI dan N2. Keunggulan vaksin DNA dalam menginduksi respon sel T-CD8 spesifik secara efisien pada pernberian vaksin untuk "priming" dapat berpotensi merugikan dalam pemakaian vaksin DNA sebagai "booster".
Respon sel T-CD8 yang dihasilkan melalui vaksinasi
sebelumnya dapat mengakibatkan destruksi sel yang mengekspresikan antigen vaksin DNA, sehingga stimulasi respon imun oleh vaksinasi booster kurang efektif akibat penurunan jumlah dan masa pemaparan antigen dengan sistem imun. Untuk mengatasi permasalahan ini diperlukan vaksinasi menggunakan antigen eksogen yang tidak hanya mampu menginduksi respon antibodi dan respon sel T-CD4 secara efisien, tetapi juga mampu menginduksi respon sel T-CD8 yang diperlukan untuk eliminasi sel terinfeksi virus. Antigen eksogen yang dipakai untuk imunisasi booster pasca imunisasi awal dengan '":1'3.ksin DNA dapat berupa virus hidup dilemahkan, partikel vims terinaktivasi, Viral Like Particle maupun protein subunit. Jenis antigen yang paling mudah dan relatif paling murah JDtuk dikembangkan ialah vaksin protein subunit, khususnya yang diekspresikan pada sistem ekspresi prokariota.
Telah diketahui bahwa protein hemaglutinin virus influenza A dapal
diekspresikan secara efisien pada sistem ekspresi prokariota dengan melakukan optimasi pada susunan kodon serta menggunakan galur sel Escherichia coli (E. coli) tertentu yang dapat i:nengatasi permasalahan toksisitas protein rekombinan sel E. coli. rekombinan menggunakan sistem ekspresi E. coli
Produksi protein
relatif jauh lebih murah dibandingkan
�·--.u· antigen virus menggunakan kultur sel mamalia ataupun menggunakan telur ayam �rio.
Antigen eksogen lainnya yang dapat dipakai untuk imunisasi booster ialah
� eksogen berbentuk VLP. Antigen jenis ini dapat menginduksi respon sel B yang kuat tQCaJ3 mampu rnelakukan cross-linking reseptor sel B spesifik oleh epitop repetitif pada
ukaan VLP.
Antigen VLP dapat diproduksi pada sistem ekspresi mamalia, sistem
c...spresi baculovirus, dan sistem ekspresi tumbuh-turnbuhan. Proses produksi maupun antigen yang dihasilkan dari tumbuh-tumbuhan, sistem -d:spresi prokariota tidak mengandung komponen binatang, seperti halnya antigen virus yang Cproduksi menggunakan kultur sel MOCK (berasal dari anjing), sehingga permasalahan ��g terkait produk binatang seperti kandungan patogen hewani dan permasalahan halal :::m.upun haram dapat terhindarkan.
Vaksin protein subunit rekombinan berpotensi untuk
digunakan dalam vaksinasi "booster" pasca imunisasi dengan vaksin DNA.
Pemberian
Tak.sin ini dengan jalur administrasi ataupun pencampuran dengan ajuvan yang sesuai juga dapat diarahkan untuk merangsang respon lgA spesifik maupun respon sel T-CD8. Beberapa pertanyaan yang perlu dijawab dafam pengembangan vaksin influenza A· berbasis DNA, antigen rekombinan prokariota dan VLP ialah: I.
Bagaimana pengaruh fusi antigen vaksin influenza A dengan masing-masing komponen C3d, CD40L, CD28, listeriolysin, Vif HIV-I dan protein voyager Herpes Simpleks terhadap respon imun humeral dan selular?
2.
Apakah
vaksinasi
dengan antigen NJ konsensus dapat menimbulkan respon. sel T
sitotoksik terhadap sel pengekspresi antigen neuraminidasa HlNl dan H5Nl? 3.
Bagaimana respon antibodi netralisasi yang ditimbulkan oleh imunisasi antigen H5 dan HI bersusunan asam amino konsensus terhadap infeksi beberapa galur H5 dan HJ?
-t Bagaimana kombinasi pemberian vaksin untuk "priming" dan "booster" yang dapat
secara efisien merangsang respon imun humoral, sel T CD4 dan sel T CD8? 5.
Apakah respon protektif terhadap infeksi virus influenza A HINI dan H5Nl bervirulensi tinggi dapat pasca "priming" menggunakan vaksin DNA influenza A?
6.
Apakah respon protektif terhadap infeksi virus influenza A H1Nl dan H5N1 dapat diperoleh dalam tempo kurang dari I minggu pasca vaksinasi menggunakan kombinasi vaksin yang akan diteliti?
7.
Apakah respon protektif masih dapat diinduksi oleh vaksinasi pada individu yang berada pada fase dini infeksi influenza A?
IAi� :IL MANFAAT PENELlT
_
peneliti lain untuk litian ini dapat dimanfaatkan oleh Infonnasi yang diperoleh dari pene pun vaksin virus A berdaya proteksi tinggi mau pengembangan vaksin influenza berenvelop lainnya
Prototipe vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini berpotensi untuk dipatenkan sebagai "seed vaccine" nasional yang merupakan hak milik bangsa Indonesia "'
.knis vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini dapat digunakan sebagai model
notuk penelitian respon imun humeral, respon imun set T CD4 maupun sel T CD8 terhadap berbagai jenis antigen lainnya -r...
Berbagai jenis "platform'' prototipe vaksin yang dikembangkan dalam penelitian ini akan memberikan alternatif yang lebih luas untuk mendapatkan prototipe vaksin influenza A yang efektif, aman dan stabil, serta dapat diproduksi secara cepat dan mudah dengan biaya produksi yang relatif lebih ekonornis.
5. Infonnasi yang diperoleh melalui eksperimen imunisasi dengan berbagai komposisi vaksin pada vaksinasi "priming" dan "booster'' bermanfaat untuk menentukan komposisi vaksin pada "priming" dan "booster" yang mampu merangsang respon imun secara lebih dini dan eftsien Pengalarnan yang diperoleh dari penelitian ini meningkatkan kemampuan peneliti untuk merancang strategi pengembangan vaksin .
.
7. Pengalaman yang diperoleh dalam melakukan pengembangan vaksin DNA dan vaksin rekombinan yang diproduksi dalam berbagai sistem ekspresi dapat dibagikan kepada kelompok
penelitian
Indonesia
lainnya
untuk
meningkatkan
kemandirian
bangsa
Indonesia dalam teknologi pengembangan vaksin
8. Keterlibatan peneliti-peneliti muda dalam penelitian ini akan menghasilkan generasi peneliti baru yang memiliki wawasan luas ser:ta keterampilan menyusun strategi penelitian dan keterampilan teknis yang lebih tinggi dalam pengembangan dan penelitian vaksin
JC. TUJUAN PENELITIAN
T� uan Umum: Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mendapatkan beberapa kandidat vaksin influenza A H5Nl dalam bentuk vaksin DNA, antigen rekombinan prokariota dan antigen VLP dalam bentuk protein fusi maupun non fusi dengan komponen C3d, CD40L, CD28 dan listeriolisin Listeria
monocytogenes serta mendapatkan informasi
mengenai respon imun humoral dan selular yang ditimbulkan oleh kombinasi vaksin yang diberi.kan sebagai "priming" dan "booster" sebagai landasan untuk menetapkan
komposisi serta
cara
pemberian
vaksin
yang memberikan respon irnun protektif yang
lebih dini dan lebih efisien.
jaan Khusus Tujuan khusus penelitian ini ialah: 1.
Mendapatkan konstruksi vektor vaksin DNA fusi dan non-fusi pengekspresi antigen H5, NI, MA dan NP.
2. Mendapatkan
kandidat
vaksin
VLP
mengandung komponen
HA+NA+MA
(dengan atau tanpa NP) untuk influenza A subtipe H5Nl 3.
Mendapatkan kandidat vaksin influenza A H5, HI, MA dan NP berupa protein rekombinan prokariota
4.
Mendapatkan informasi mengenai pengaruh penambahan C3d, CD40L dan CD28 pada antigen prokariota terhadap respon sel T CD4 dan respon antibodi
5.
Mendapatkan infonnasi mengenai pengaruh
fusi
antigen influenza A dengan
listeriolisin, Vif HIV-I dan protein Vp22 Herpes Simpleks terhadap pembentukan respon sel T CD8 spesifik epitop antigen virus influenza 6. Mendapatkan
informasi
mengenai potensi
vaksin
DNA influenza A
untuk
menimbulkan respon imun protektif pasca pemberian vaksin untuk "priming" 7.
Mendapatkan
komposisi
vaksin
"priming"
dan
"booster"
yang
dapat
menimbulkan respon protektif lebih dini secara lebih _efisien 8. Mendapatkan
infonnasi
m engenai
.
pemakaian
vaksin
influenza
A
untuk
mendapatkan efek kuratif pada individu (hewan coba) yang telah terinfeksi 9.
Mendapatkan informasi mengenai jangka waktu timbulnya respon protektif pada komposisi vaksin yang dinilai memiliki respon imun seluler dan humoral yang terbaik serta memiliki potensi paling tinggi pada uji tantang hewan coba dengan infeksi virus influenza A H5NI atau HIN I
"
:\fETODE PENELITIAN
_ !Keraogka Konsep Penelitian
Subtipe Virus Influenza A
-H5N1
I
-HlN'I -
H9N2
I
i
I I
1 I
Komponen anngen virus: - Hemaglutrnrn (HA) - Neuraminldase (NA) -Malrrks (MA1) • Nukleoprotern (NP)
I
.i.
Daya Proteksi .S1lan1J
·�
I
---
Strmu l asi
f
Pen rn gkatan
Peningkatan
titer anhbodi spesifik
JUmlahSelT CD8 spesrfik
I I
I�;E::�1 I I:r;:�is I
Peptida aJ Lrvan
-C3d -CD40L - CD28
- Listenolysm ' Peptida VP22
Komposls1 d1m cara pemberian vaksin • Komblnasi]enis vaksin - Cara pemberian vaksrn
I
-..
Dosis Vaksin
P-eningkaran JU'mlah SelT CD4spesrftk
II
Efektivitas Vaksin sebagai � vaksin Pre� pandemidan Pandemi
I
V'l•ulUtd'!:>I
SelTCD4
�....01'>•':1 .
Stimulas1
L -
,,,. TLR
/
Ben1ukvaksrr1
- DNA
- protein rekombrnan E. coli
y
-
..·""'
-�
I
hayau pada proses produ",;' ••'"' I C:1 i'\
-
l\ecepatan produksiveksm
. VLP (baculovirus) Stabrhtas vaksrn -
I II
Variabel yang berada di Juar kotak tidak tennasuk dalam variabel yang ak:an diteliti dalam penelitian yang diusulkan
··i Tempat Penelitian -
-
Laboratorium dengan fasiJitas Biologi Molekular, Rekayasa DNA dan Rekayasa Protein
Laboratorium dengan fasilitas BSL-2 dan BSL-3 laboratorium dengan fasilitas BSL-3 hewan
1 Waktu Penelitian Lama Pene litian: 3 tahun
2012
- 2014
A. Jenis Penelitian Penelitian intervensi
..5.. Disain Penelitian Disain penelitian ini ialah eksperimen
Populasi dan Sampel
ft>pulasi penelitian ialah hewan coba berupa mencit (Mus musculus) galur Balb/c atau .:!rlY.
Akan dilakukan beberapa eksperimen menggunakan hewan coba untuk meniJaj
-;:engaruh fusi peptida ajuvan, dosis dan kombinasi pemakaian prototipe vaksin dalam ZKSinasi "priming" dan "booster", maupun pengaruh pencampuran prototipe vaksin C:tlam satu sediaan terhadap respon imun spesifik (antibodi, sel T CD4, sel T CD8), daya teksi silang, proteksi dini dan efek kuratif vaksinasi. Perhitungan sampel dilakukan berdasarkan rumus Federer:
t-1) (n-1) 2:_ 15, dimana =
jum lah kelompok perlakuan
-=
-
jumlah individu dalam setiap kelompok perlakuan
Variab el
1 �.:i:c:I;ksi" Struktur Sekunder dan Tersier Protein Fusi _:::!>e l independen: Smunan Asam Amino H5, NI, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell pene�ating peptide
CPP) · Listeriolysin
dan
VP22,
situs insersi peptida ajuvan pada susunan asam amino
protein virus, posisi relatif dan susunan peptida protein virus (pada Scrambled Antigen 'accine) ?:rt::bel terkendali: Piranti lunak untuk prediksi struktur sekunder serta piranti lunak untuk prediksi struktur :essier protein ::r.iabel dependen: f.ksposisi peptida ajuvan pada ·perm ukaan molekul protein virus, prediksi struktur sekunder peptida ajuvan, prediksi struktur tersier peptlda ajuvan
truksi dan ekspresi Vaksin DNA i::!Jel independen: Su:sunan nukleotida H5, Nl, MA 1, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide CPP) Listeriolysin dan VP22 -;,:be/ terkendali: ·ektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli
E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, ::xtoda sekuensing, kondisi kultur sel mamalia, metoda transfeksi, metoda deteksi ckspresi antigen ::3el dependen:
_
Smtman nukleotida vaksin DNA, ekspresi antigen virus pada sel mamalia Kr;:ms:tnitl!� i vektor dan _ .... ...,, .... Ota .
ekspresi antigen rekombinan virus pada sistem ekspresi
Susunan nukleotida H5, N l , MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22
'c:riahe/ terkenda/i.· Vektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli
(E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, metoda sekuensing, galur Escherichia coli (E. coli) untuk ekspresi protein rekom binan, kondisi kultur E. coli, metoda deteksi ekspresi antigen
't.iabel dependen: Susunan nukleotida antigen virus, ekspresi antigen virus pada kultur sel SF9 �-mtruksi
vektor dan ekspresi VLP pada sistem ekspresi bacu lovi rus
.::nabel independen: Susunan nukleotida H5, NI, MAI, NP, C3d, CD40L, CD28, cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22
".::riabel terkenda/i.· Vektor ekspresi sistem mamalia, situs insersi pada vektor ekspresi, galur Escherichia coli
(E. coli) untuk propagasi plasmid, kondisi kultur E. coli, metoda purifikasi plasmid, metoda sekuensing, Jenis sel serangga (SF9) kondisi kultur set SF9, metoda transfeksi, metoda deteksi ekspresi antigen
'ariabel dependen: Susunan nukleotida antigen virus, ekspresi antigen virus pada ku.ltur sel SF9 .o..u.A.U.3 . is
respon antibodi, sel T CD4 dan sel T CDS mencit diimunisasi Vaksin DNA
t::riabel independen: Vaksinasi dengan vaksin DNA mengandung gen H5, N l , MA1 dan NP, dengan dan ranpa fusi C3d, CD40L, CD28; cell penetrating peptide (CPP) Listeriolysin dan VP22, \'ak.sinasi dengan antigen non fusi
"'cTiohel terkenda/i_· dosis vaksin, volume injeksi vaksin, species dan galur hewan coba (mencit galur Balb/c atau
ddY), jenis kelamin hewan coba (betina), usia hewan coba (6-8 minggu), tenggang
\'aktu antara vaksinasi awal, booster dan pengambilan sampel (darah dan splenosit)
::rtobel dependen: Titer antibodi hemaglutinin; titer antibodi neuraminidase; titer antibodi matriks; titer IL
�
titer interferon gamma, jumlah sel T-CD4 produsen sitokin per I 06 splenosit pasca
papa.ran dengan antigen dalam kondisi kultur sel; jum lah sel T-CD8 produsen sitokin per
Cl° splenosit I
pasca paparan dengan sel pengekspresi
2
,. . ...._. ... .... ·. .
respon antibodi, sel T CD4 dan sel T CD8 mencit diimunisasi Vaksin VLP dan
:;::xm·:u. reko mbinan ..::J!"J::l:i:ll�· independen: Dosi.s vaksinasi dengan antigen VLP baculovirus (H5Nl, H l N l , H9N2); vaksinasi oc::.gan antigen rekombinan prokariota H5, Hl , H9, Nl dan Nl dengan dan tanpa fusi
dengan C3d, CD40L, CD28, Listeriolysin dan VP22; komposisi vaksin "priming" dan ""'booster''; dosis imunisasi priming vaksin DNA (pada uji coba analisis respon imun protektif vaksin DNA)
':riabel terkendali: dosis vaksin antigen rekombinan prokariota, volume injeksi vaksin, usia hewan coba (6-8 minggu), galur hewan coba (mencit galur Balb/c atau ddY), jenis kelamin hewan coba 1>etina), tenggang waktu antara vaksinasi awal, booster dan pengambilan sampel (darah clan splenosit); tenggang waktu antara "priming" vaksin DNA dan pencabaran dengan
irus influenza A
=-:abel dependen : Titer antibodi hemaglutinin; titer antibodi neuraminidase; titer antibodi matriks; jumlah 6 sel T-CD4 produsen sitokin per l 0 splenosit pasca paparan dengan antigen dalam 6 ondisi kultur sel; jumlah sel T-CD8 produsen sitokin per 10 splenosit; respon protektif terhadap variabel independen dosis vaksin DNA pada imunisasi "priming") dan waktu timbulnya respon protektif
a.;tilD 3 ;tiohel independen: Komposisi vaksin dengan respon imun seluler dan hu.moral terbaik berdasarkan hasil penelitian tahun 1 dan 2, dosis vaksinasi "priming" dan "booster"; jenis antigen (HA, �A, MAI atau NP)
i::nabel terkendali: dosis vaksin, volume injeksi vaksin, usia hewan coba (6-8 minggu), galur hewan coba (mencit galur Balb/c atau ddY), jenis kelamin hewan coba (betina), tenggang waktu antara vaksinasi awal, booster dan pengambilan sampel (darah .dan splenosit), tenggang
waktu antara "priming" komposisi vaksin terbaik dan pencabaran dengan virus influenza A
�el dependen: Efek kuratif; waktu timbulnya respon protektif; Efek proteksi silang; titer antibodi hemaglutinin;titer antibodi neuraminidase; titer antibodi matriks; jumlah sel T-CD4 6 produsen sitokin per 10 splenosit pasca paparan dengan antigen dalam kondisi kultur
sel; jumlah sel T-CD8 produsen sitokin per 10° splenosit; perubahan berat badan, perubahan konsumsi makanan, hitung sel darah tepi, rasio albumin/globulin, berat organ, abnormalitas histopatologi (otak, ginjal, hati, lokasi vaksinasi) Ba ban dao cara Kcrja l: lhrartuan susunan asam amino konsensus HA, NA, Ml, N P
�..:::;:::::;:m asam amino protein virus influenza A yang akan dianalisis untuk perancangan asam amino antigen vaksin diunduh dari situs "influenza A resources" NCBI,
?:t:JiIDk.
Karena susunan asam amino hemaglutinin (HA), neuraminidase (NA), matriks
dan nukleoprotein (NP) HINJ telah diperoJeh dari penelitian sebelumnya, maka ..-... ..... asam amino yang akan dianalisis untuk perancangan vaksin adalah susunan asam
:\... _
A, Ml
dan NP virus influenza A subtipe H5Nl. Analisis sekuen konsensus masing
g susunan asam amino dilakukan menggunakan perangkat lunak Bioedit 7.0. dengan ;:Olli dahulu melakukan penyejajaran sekuen (alignment). _...,_,.,,.an
Sekuen konsensus yang
akan dianaJisis posisinya terhadap susunan asam amino berbagai virus yang
an dengan menggunakan perangkat lunak MEGA 4.1.
Posisi sekuen konsensus
Z3J>kan berada tepat di pertengahan pada kJadogram yang diperoleh. � gan
susunan asam amino protein HA, NA, Ml, NP mengandung peptida ajuvan
CD28, CD40L, CPP Listeriolisin, CPP VP22 �:i::l:!lll asam amino peptida ajuvan C3d, CD28, CD40L, CPP Listeriolisin dan CPP VP22
.:.:S!SUa.iikan dengan susunan asam amino yang berdasarkan publikasi dapat melakukan fungsi =:::. :&SJ dengan ligannya (C3d, CD28, CD40L). atau fungsi "cell penetrating peptide" �--·�lisin dan VP22) dan diposisikan sedemikian rupa terhadap susunan asam amino .... virus (HA, NA, Ml dan NP) agar susunan asam amino peptida ajuvan dapat Pemilihan posisi peletakan peptida ajuvan dilakukan berdasarkan hasil analisis
--=:�si- struktur sekunder menggunakan piranti lunak online pada situs "predictprotein.org" .... -=--.. - memilih posisi peletakan yang menghasilkan struktur s�kunder peptida ajuvan yang ·
dengan struktur aslinya.
Se\ain itu pemilihan posisi peletakan juga dilakukan
� prediksi struktur tersier menggunakan piranti lunak online EsyPred3D dan ii:..=Jisasi dengan piranti lunak RasMol 2.7.5 dengan memilih posisi peletakan
yang
-�·2<:"1·lkan struktur tersier protein virus dengan peptida ajuvan terekspos di pennukaan
=:::�:!I protein fusi. Perancangan posisi peletakan susunan asam amino peptida ajuvan juga �tb:::!tan dengan mempertahankan susunan peptida yang telah diketahui atau diperkirakan �r:=!::icc;tuk epitop netralisasi (dikenali oleh antibodi) maupun epitop yang dapat berinteraksi lHC kelas I atau MHC kelas II (prediksi interaksi dilakukan dengan menggunakan - hmak pada situs online. __,_ .... � - ...
DNA penyandi susunan asam amino konsensus HA, NA, Ml, NP, C3d, CD28,
__.__., =,, ....
CPP Listeriolisin, CPP VP22
en-fragmen DNA gen-gen penyandi protein HA, NA, M l dan NP akan dipesan pada :ir:::.sahaan yang mampu melakukan sintesis fragmen DNA berdasarkan infonnasi susunan tida yang telah dioptimasi untuk ckspresi �chia coli.
pada sistem
ekspresi
mamalia
dan
Gen ajuvan CD40L, C3d dan CD28 diperoleh dengan memesan pada
�aan penyedia jasa sintesis nukleotida atau dengan cara ampli fikasi materi genetik
:::gan
PCR.
Penyisipan gen ditengah open reading frame gen penyandi protein virus
.:.......*ukan dengan teknik Overlap &tention PCR.
J-erlap extention PCR .=t.esis DNA dengan teknik Overlap extention PCR dilakukan dengan terlebih dahulu �dakukan sintesis DNA serat ganda yang akan berfungsi scbagai DNA pola cetak dalam --upanjangan serat ganda tersebut.
Mula-mula digunakan sepasang oligonukleotida dengan
.:gian 3' yang saling komplementer satu terhadap yang lain.
Pada polimerasa berantai,
111.Zdua oligonukleotida tersebut akan membentuk DNA serat ganda yang selanjutnya akan gunakan sebagai DNA pola cetak dalam reaksi polimerasa berantai berikutnya dimana "danjutnya akan digunakan pasangan oligonukJeotida dengan bagian 3' yang berlekatan ....mgan daerah target pada ujung
3' DNA
serat
ganda yang
komplementer dengan
g · onukleotida mengandung tambahan susunan nukleotida pada ujung 5' yang berfungsi
ruk perpanjang DNA serat ganda.
Langkah ini diulang dengan pasangan-pasangan
�onukleotida berikutnya sehingga diperoleh DNA serat ganda lengkap mengandung gen �gan susunan sesuai dengan susunan nukleotida penyandi sekuen asam amino konsensus.
?engklona an ke dalam plasmid ekspresi sistem mamatia :>�A serat ganda yang diperoJeh secara sintetik diklona ke dalam vektor pengekspresi sistem mamalia
di bawah kendali promoter CMV atau SV40.
Akan dilakukan pengklonaan ke
.:ialam vektor ekspresi mamalia yang tersedia secara komersial, melalui proses ligasi, ligasi
...an skrining E.coli transforman dengan analisis rcstriksi enzimatik .
' on firmasi DNA pengekspresi protein virus dengan sekuensing
•
·nruk memastikan kebenaran susunan nukleotida DNA pengekspresi protein virus yang .erklona
dalam
plasmid
ekspresi
sistem
mamalia,
dilakukan
analisis
sekuensing
:nenggunakan reagensi dye terminator dan analisis sekuen dengan piranti lunak sescape.
Transfeksi ke dalam sel mamalia Sebelum sistem penembak DNA diperoleh, prototipe vaksin DNA akan diekspresikan !erlebih dahulu dalam sel fibroblas mamalia (galur sel Hela, MDCK atau 293) menggunakan
lipofeksi.
Bila alat penembak sudah dikonstruksi, akan dilakukan transfeksi
�nakan alat penembak yang dirancang melalui penelitian ini.
� ekspresi protein ::5.sis ekspresi protein pada sel transfektan akan dilakukan dengan menggunakan metoda tluoresens, western blot dan mikroskopi elektron. ::::asi :::nis mencit BABVc ..mcit BALB/c (Mu s musculus
strain BALB/c atau ddY) berusia 6 sampai 8 m inggu
;:makan sebagai hewan coba untuk menilai respon imun humoral dan selular terhadap :.;;erapa formulasi vaksin DNA yang diprediksi membentuk struktur vaksin subunit dan
� like particle (VLP) bila diekspresikan dalam sel mamalia. Sejumlah 100 ug DNA �in DNA) diinjeksikan secara intramuskuler ke dalam paha kanan mencit.
Untuk
ghindari rasa tidak nyaman yang mungkin ditimbulkan pada injeksi vaksin hewan coba cmebih dahulu dianestesi. Pemeliharaan binatang dilakukan dalam fasilitas kamar binatang c..mgan suhu udara dan kelembapan diatur oleh penyejuk .ruangan selama 24 jam
� isertai -
.&em
..:.:dam
aliran udara untuk pengeluaran ke luar kamar hewan dan pemasokan udara segar ke kamar
hewan.
Jumlah
binatang
percobaan
yang
akan digunakan
dihitung
CQCOggunakan rumus Federer (t- 1 ) (n-1) � 1 5 untuk mendapatkan tingkat kepercayaan yang pada analisis statistik.
Serum mencit dikumpulkan sebelum imunisasi, 3 hari setelah
unisasi pertama (priming), 1 minggu setelah imunisasi dan setiap minggu selama 8 ::inggu. Pada minggu ke dua dan minggu ke tiga pasca priming dilakukan injeksi vaksin
� sejumlah 100 ug pada setiap kali pemberian sebagai bo oster, dimana sampel darah Lrrlebih dahulu diambil sebelum injeksi booster dilakukan.
Untuk analisis respon imun
.:dular diperlukan pengambilan organ limpa mencit, sehingga setiap kali pengam bilan sampel ..:;ewan coba akan dikorbankan dengan terl ebih dahulu dimatikan dengan teknik dis1okasi servikal. ?engukuran respon antibodi :espon antibodi dinilai dengan menggunakan uji EUSA, dengan mengamati nilai absorbans _:-ang diperoleh pada setiap serum. -era.ta absorbans.
?engukuran respon imun selular
Setiap serum diuji secara duplo untuk mendapatkan ni1ai
an respon imun selular dilakukan dengan menggunakan uji ELJSPOT sel T-CD4 sel T-CD8, menggunakan susunan peptida yang diprediksi secara in silico dapat
:::::::aaksi dengan MHC-I dan MHC-Il mencit BALB/c atau ddY. Respon imun selular stimulasi ekspresi sitokin oleh sel T diukur dengan menghitung jumlah bintik yang ruk menggunakan ELISPOT reader.
·
Analisis Data l: =sis sekuen nukleotida:
sekuen nukleotida dilakukan dengan menggunakan piranti lunak Bioedit dan � untuk melihat tingkat homologi sekuen nukleotida in silico dengan susunan .__.�,u-da yang diperoleh melalui proses sekuensing terhadap gen virus influenza A H5Nl Tingkat kesamaan homologi harus _ terklona pada plasmid sistem ekspresi mamalia. dengan semua komponen sistem ekspresi maupun kodon penyandi asam amino sesuai � ekspresi protein dalam bentuk yang sesuai bentuk asli. -'" -� � -
::US ekspresi protein:
·
protein dinilai
·
berdasarkan
adanya fluoresensi
sel
ditransfeksi pada uji
!luoresens dengan analisis mikroskopi konfokal serta adanya pita reaktif spesifik pada iieStem blot dan peningkatan sinyal di atas nilai ambang pada uji ELISA. --� - respon I.'maan
antibodi pada hewan coba
perbedaan respon
antibo�i
antar kelompok hewan coba dilakukan dengan
uji statistik pada nilai rerata absorbans yang diperoleh pada uji ELISA serum coba, dengan membandingkan pengaruh variabel independen terhadap variabel =-?t:C:Oilell menggunakan piranti lunak SPSS. __.....,.....,u.i
__... _ ... - respon
sel T pada hewan coba
�::z!t!l32LD perbedaan respon sel T CD4 dan CD8 antar kelompok hewan coba dilakukan _..,....._ melak.'llkan uji statistik pada nilai rerata "hitung titik" (spot counts) yang diperoleh ,,1 ELISPOT PBMC hewan coba, dengan membandingkan pengaruh variabel �t:;;ll:mlien terhadap variabel dependen menggunakan piranti lunak SPSS.
?ERTIMBANGAN ETIK PENELITIAN ?errirnbangan etik penelitian untuk penggunaan hewan coba diajukan kepada Komite 2ik Litbangkes Kementerian Kesehatan clan Komite Etik Fakultas Kedokteran l.mversitas Indonesia
HASTL PENELITIAN Pembuatan sikuen konsensus dan DNA sintetik Hemaglutinin dan neuraminidase virus HSNl Konsensus gen Hemagl utinin dan Neuraminidase dibuat berdasarkan sikeun asam
amino yang diunduh dari genbank. Kriteria yang dimasukkan adalah asal isolat
dari manusi� lokasi asal sample adalah seluruh dunia, dengan tahun pengumpulan sampel 2005-2012. Setelah di lakukan pengunduhan asam amino, dilakukan penentuan sikuen konsensus mengguankan fasilitas yang disediakan oleh genbank. Sekucn ronsensus yang dihasilkan selanjutnya di sejajarkan dengan - asam amino isolat A/Indonesia/5/2005 dan asam amino gen HA asal manusia yang · terklona dalam pcDNA3 . l (plasmid merupakan hasil peneitian konsorsium vaksin influenza), untuk :::nengetahui adanya keragaman hemaglutinin antar isolat. Terdapat beberapa perbedaan :'!.SaID
amino antara hemaglutinin isolat Nlndonesia/5/2005, yang merupakan salah satu
mlat yang direkomendasikan WHO untuk
see d vaccine, dengan protein hemaglutinin
konsensus antara lain T86A, S94N, L l l OH, Ll 38Q, S 1 40R, P 1 4 J S, S l 55N, K1 62R, COOV, M282I, S325R, I482V, N488D, M533V.
Mulai penomoran asam amino HA (posisi nomor 1) 10 · · ·
.- r
-i:::..:..u: ::::c5 85 :;=z::SC 2005
�_::ecs_2012
� :..u 1!5 /2005 -== "3
__2005_2012
� :"1 �-ll.l: 115 =3/2005
_2005_2012
.
::::aa ll.I 85 ..::..= :S/2005 ::::..sES 2005-2 012
:� u.:
85 -llC.:<�/2005 2005 2012
·
I
·
·
·
r.
I
· ·
.
.
20 I ·
·
·
10
30
I
·
·
·
·
I
·
·
I
· · ·
·
·
I
· ·
· · ·
50
I
·
·
·
·
I
·
60
·
·
·
I
·
· ·
·
I
·
·
·
·
70
I
·
·
·
·
80
J....I. . . .I
.
.
.
.
.
.
90 ·
·
·
I
·
·
·
·
·
•
.
•
.
.
.
.
.
JOO
I
·
·
·
I
·
·
·
·
·
.
.
.
.
•
•
.
.
.
•
l.10
I
·
·
·
I
·
·
·
·
•
.
.
•
.
.
.
.
.
.
l.20
I
·
.
·
·
·
I
·
I
· · · ·
.
.
.
•
,
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . s. . . . . . .
I
. , .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . S. . . . .
.
·
. ,
,
.
·
.
G.
.
·
.
,
130 ·
·
·
I
·
·
·
140
l
· ·
·
I
· · ·
·
·
·
150
I
·
·
·
·
I
·
·
,
·
160
I
·
·
·
·
I
·
l?NCDE?INVPEWSYIVEKANt'TNDLCYPGSl'NDYEELJIEI.LSRDILFEIUQIIPKSSWSDHEASSGVSSACPYLGSPSFF
8.
T.
.
.
.
.
.
XX .
.
.
.
.
.
. .
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
. . . .
.
•
.
.
•
•
•
•
• • •
•
• • • • . • • •
•
•
• •
•
•
.
•
•
•
.
•
.
• •
•
•
• • • . • •
H.
•
•
•
•
•
•
•
.
.
.
.
.
.
.
.
..
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
N•
•
•
•
.
. • . • • . . . .
H•
.
.
.
•
•
•
•
· · · ·
I
·
·
·
·
·
I
·
·
·
180 · I · ·
·
·
·
.
.
170 ·
·
I
·
.
.
.
.
.T .
.
.
.
.
A•
·
.
·
I
130 ·
I
· · · ·
•
.
.
.
• •
.
.
. .
200
I
·
·
·
·
I
I
· · · ·
. .
no · · · ·
I
· · · ·
•
Y.
•
.
.
•
.
.
.
.
.
XX
A. . . . . . ,
. . .
. • • . • • . • • • • •
•
.
I
· · · ·
.
•
.
• • • • • • • • • • • . . . . .
220
l
·
· · ·
I
.
•
I
.
.
.
.
•
•
•
•
Q.RS . . .
230 · · · ·
.
I
· · · -
240 ·
·
·
I
·
RNVVWLIKKNSTYPTIKKSYNNTNQEDLLVLWGIBBPNDAAEQTRLYQNPTl'YISIGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSG •
•
.
.
T•
•
.
•
•
.
.
.
• . • • •
.
.
•
•
•
N.
.
•
•
· · ·
·
l
250
I
. .
· ·
I
I.
.
.
•
•
•
N•
R•
•
•
.
.
•
•
•
•
•
260 · · · ·
l
· ·
· ·
.
•
l
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
.
•
•
. •
•
•
.
•
•
•
•
•
•
• . . • • . • . . • • • • • • • • •
:no ·
·
·
·
l
· · · ·
I
•
2/JO · ·
· ·
,
ll! . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
•
I
· · · ·
l
230 · · · ·
l
· · · ·
l
V.
.
•
•
.
.
•
.
300 · · · ·
l
· · · ·
•
l
.
•
. . .
.
•
.
.
, .
.
.
.
.
•
·
I
no · · · ·
l
· . .
.
.
•
.
.
.
.
•
•
.
•
320 · ·
· ·
I
RUE?f'lllA.ILJtPNDAINl'ESNGNFIAPEYAJnUVIOtGilSAD(KSEI.EYGNCN'l'ltCQS TPMGAINS UP!'HNIHPLTIGECPK .I•
•
•
•
•
•
.
.
.
S . T•
•
•
.
•
•
•
• •
•
•
.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
.
.
.
•
•
•
•
, • . . • . . . • . • • . . •
. • • • • • • • • • . • . . • •
T•
•
• •
•
•
•
•
•
.
.
.
•
•
•
•
•
•
•
.
.
•
•
.
.
•
•
•
•
•
•
• • • • • . . • . . • . . • • • • .
T.
.
.
.
.
.
.
•
•
.
.
.
.
.
.
•
•
. .
•
•
.
.
.
.
l
·
·
·
·
·
l
·
·
·
·
.
.
.
.
.
· · · ·
l
· · · ·
.
.
.
.
.
.
·
·
·
l
· · · ·
330
l
·
340
l
. .
· ·
.
350 ·
l
·
·
• . . • . . • . . • • . • •
.
• . • • • . . . • . . . • • • . .
360
l
· · · ·
l
370 · · · ·
l
· · · ·
l
I.
.
.
.
.
•
.
.
· · · ·
l
·
380 · · · ·
l
.
•
•
•
.
.
•
.
.
•
•
•
•
•
•
•
, •
•
•
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
· · · ·
I
· ·
, .
.
.
390 . .
·
l
.
.
400 · ·
I
YVKSNRLVLATGLRNSPQRES�GL?GAIAG?IEGGWQGNVDGN i'lYGYBllS EQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNS
•
•
.
.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
.
.
.
410 · · · ·
.:c:::m:::::c =' -s:::•aL:u.t 8s ...:m::'S/2005
·
·
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . s. . . . . . .
· · · ·
:ii-:. ,.,
· ·
MEKIVLLLAIVSLVRSOQICIG�STEQVDTIWERNVTVTHAQDILERTIJNGKLCDLDGVKPLILRDCGVAGWLLGN
·
=- T
I
·
I
· ·
·
·
I
·
.
.
R•
420 ·
·
·
I
·
· · ·
I
·
•
.
•
•
•
•
. ·
I
·
· ·
. .
.
•
.
.
•
•
· ·
·
�.30 ·
I
·
•
I
•
•
.
•
.
. •
.
.
·
·
440 · · ·
·
I
· ·
.
I
.
.
.
·
· ·
•
•
•
.
•
.
.·.
·
460 ·
I
·
•
I
.
.
.
.
·
·
· ·
.
.
.
.
•
.
.
•
•
· ·
·
I
·
·
·
460
I
·
•
•
.
•
.
.
•
•
.
•
·
·
·
I
·
·
·
470 ·
I
·
.
.
480 · I
IIDIIN?EA NTQ VGRE?NNLERE:NLNKRW RI EDG?'LDVW'l'YNAELLVLUENER'l'LD FHDSNVIOILY'C>KVRLQLRDNAK£LG
�-�005_2012
� :-, -:i::::&3- llI B5 �:'5/2005
·
·
·
·
I
490 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
500 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
510 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
520 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
530 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
540 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
5SO · · · ·
I
·
·
·
·
I
560 ·
·
·
·
I
NGC?E?YHKCDNECMESIRNGTYNYPQYSEEAP.LKREEISGVRLESIGTYQILSIYSTVASSLALADUAGLSLWMCSNG . • . . . . •
• • • •
.G.
• • . . . .
• • • . • • • . . . • • • • •
. . . . . . . • . . . . . • . . . • • • • • • . • . • • ·
• • .
• . . . • . . .
• . • . • . • • . . . .
• • • · • · • · · · • • ·
. • . . . . . . . . • • • • • • • . . . . • . . . • • • . .
. . • • • . . . • . . • . . . • . .
N•
. . • • • • . .
· •
�_2005_2012
. . . . . . . . . . . . . . . . . v.
= 117
SLQCR.ICI•LEASQLGSPYSX- -------------------�--------------------------------------
·
�.!A! BS -:x.e312005 ::=:::a_.2005_2012
·
·
·
I
570 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
. . . .
c.
.
.
.
I
·
·
·
580 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
. . . . . . . .
S!)O ·
I
·
·
·
·
I
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
600 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
610 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
620 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
v. . . . . . . . . . 630
·
·
·
·
I
·
.
· · ·
I
.
640 ·
· ·
I
• . . . . . . . . RX--------------------------------------------------------------------- . . . . . . . .
K
1 . Hasil pensejajaran asam amino hemaglutinin isolat Nlndonesia/5/2005, Human 07 (isolat asal manusia tahun 2007), pcDNA3.1 AI_H 5 mengandung insert Hemaglutinin asal ayam, ConsH_2005_200 1 2 merupakan sikeun gen hemaglutinin !soalt H5Nl dari tahun 2005 sampai dengan 2012 .
..-_.,.,��ya dilakukan optimasi gen terhadap asam amino sikuen konsensus. Optimasi gen dengan
menggunakan
piranti
lunak
DNA2.0.
Optimasi
ditujukan
untuk
� kegagalan transkripsi dan translasi akibat perbedaan /bias kodon antar spesies. ini adalah has.ii optimasi DNA penyandi protein hemaglutinin konsensus. Sikeun ::mi.no Hemaglutinin dan sikuen DNA konsensus berpotensi diajukan paten.
�GATCGTGCTGCTGCTGGCCATCGTGTCCCTGGTGAAGTCCGACCAGATCTGCATCGGCTACCACGCCAACAT AC C .?.i!X:GAGCAGGTGGACACCATCATGG.AAAG AGAAC TGACCGTGACCCACGCCCAGGACATCCTGGAGAAGACCCACAACGGCA ;-:'GTGCGACCTGGACGGCGTGAAGCCCCTGATCCTGAGGGACTGCTCCGTGGCCGGCTGGCTGCTGGGCAACCCCATGTGC �TTCATCAACGTGCCCGAGTGGAGCTACATCGTGGAGAAGGCCAACCCCGCCAACGACCTGTGCTACCCCGGCAACTT ::LCGACTACGAGGAGCTGAAGCACCTGCTGTCCAGGATCAACCACTTCGAGAAGATCCAGATCATCCCCAAGAGCAGCTGGA CACGAGGCCAGCAGCGGCGTGAGCAGCGCCTGCCCCTACCAGGGCAGGAGCAGCTTCTTCAGGAACGTGGTGTGGCTG ��AAGAACAACACCTACCCCACCATCAAGAGGAGCTACAACAACACCAACCAGGAGGACCTGCTGGTGCTGTGGGGCAT �CCCCAACGACGCCGCCGAGCAGACCAGGCTGTACCAGAACCCCACCACCTACATCAGCGTGGGCACCAGCACCCTGA �GGCTGGTGCCCAAGATCGCCACCAGGAGCAAGGTGAACGGCCAGAGCGGCAGGATGGAGTTCTTCTGGACCATCCTG AACGACGCCATCAACTTCGAGAGCAACGGCAACTTCATCGCCCCCGAGTACGCCTACAAGATCGTGAAGAAGGGCGA -.:GCCATCATGAAGAGCGAGCTGGAGTACGGCAACTGCAACACCAAGTGCCAGACCCCCATCGGCGCCATCAACAGCAGCA
:a:TTCCACAACATCCACCCCCTGACCATCGGCGAGTGCCCCAAGTACGTGAAGAGCAACAGGCTGGTGCTGGCCACCGGC �CAGCCCCCAGAGGGAGAGGAGGAGGAAGAAGAGGGGCCTGTTCGGCGCCATCGCCGGCTTCATCGAGGGCGGCTG �ATGGTGGACGGCTGGTACGGCTACCACCACAGCAACGAGCAGGGCAGCGGCTACGCCGCCGACAAGGAGAGCACCC !f:GGCCATCGACGGCGTGACCAACAAGGTGAACAGCATCATCGACAAGATGAACACCCAGTTCGAGGCCGTGGGCAGGGAG �CCTGGAGAGGAGGATCGAGAACCTGAACAAGAAGATGGAGGACGGCTTCCTGGACGTGTGGACCTACAACGCCGA ::::r:s:T ::tGG GCTGATGGAGAACGAGAGGACCCTGGACTTCCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGACAAGGTGAGGCTGC Gi'.GGGAC�-ACGCCAAGGAGCTGGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACGAGTGCATGGAGAGCGTG �ACCTACGACTACCCCCAGTACAGCGAGGAGGCCAGGCTGAAGAGGGAGGAGATCAGCGGCGTGAAGCTGGAGAG ::::r;t:CAC C TACCAGATCCTGAGCATCTACAGCACCGTGGCCAGCAGCCTGGCCCTGGCCATCATGGTGGCCGGCCTGAGCC TGTGCAGCAACGGCAGCCTGCAGTGCAGGATCTGCATCAAG
Konsensus asam amino Neuraminidase virus H5Nl dibuat berdasarkan sikuen asam :>
yang diunduh dari genbank dan pembuatan sikuen asam amino konsensus dilakukan menggunakan piranti lunak dari Genbank. Berikut ini adalah hasil pensejajaran asam Neuraminidase
konsensus
dengan
asam
amino
neuram inidase
H5Nl
esia/5/2005. Terdapat perbedaan beberapa asam amino antara konsensus dengan esia/5/2005, pada posisi I35S, S48P, P54F, H80Y, N85S, E l 8 1G,D202N,M317V dan -;-c.::r:;imbaban asam amino pada posisi 437 sampai dengan 450 yaitu WPDGAELPFTIDKY. amino 437 sampai dengan 450 belum ada pada isolat A/indonesia/5/2005 kemungkinan sikeunsing yang dilakukan saat itu belurn sampai ke asam amino N terminal.
·
".:ndo/5/2005
·
·
·
10
I
·
.
.
·
·
I
·
·
·
·
20
I
·
·
·
·
.
.
.
.
.
.
.
·
·
·
I
·
· ·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
40
I
· ·
·
·
·
·
I
·
50
·
·
·
·
I
·
.
.
·
·
I
·
•
•
•
F
•
•
•
•
•
•
•
.
•
•
•
•
·
·
·
·
·
·
·
·
·
I
80
I
I
.
S.
I
. . .
.
.
90 I
.
.
.
P. .
100
·
·
·
·
I
·
·
·
·
•
•
.
.
•
•
•
.
.
·
·
·
·
·
·
I NTNPLTEKAVASVTLAGNSSLCPIRGWAVHSRDNNIRlGSKGDVFVIREP
B5N12005-2012
-:../Indo/5/2005
70
·
-
=sS'l
30
I
· ·
·
. . . . . . • . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
....=�Sl
·
MNPNQKIITIGSICMVIGIVSLMLQIGNMISIWVIBSIQTGNQBQAESIS
� B5N12005 2 0 1 2
Indo/5/2005
I
·
I
·
110 ·
I
·
·
·
·
.
•
.
·
·
·
·
·
·
•
.
•
•
·
·
•
·
·
I
·
·
·
·
.
.
•
•
·
·
·
·
•
120
I
·
·
·
Y. . . . S
130
I
·
·
·
I
·
·
·
I
·
·
·
·
·
•
•
.
.
·
·
•
140 ·
·
I
·
·
I
.
150 I
FISCSBLECRTFFLTQGALLND:KBSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPY
E5N12005-2 0 1 2
-
160 Ulndo/5/2005 .,.=s'll B5N12005 2012
';./Indo/5/2005
-
B5N12005 2012
s�
·
·
.
.
•
·
·
·
·
·
·
.
•
.
.
·
I
·
·
I
.
•
.
·
·
·
·
I
170
•
.
•
•
·
·
·
·
I
•
•
•
.
.
I
·
·
210 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
.
.
.
•
·
I
180
•
·
·
·
·
I
•
.
.
.
•
I
·
·
·
220 ·
·
·
·
·
I
·
•
·
·
·
·
I
190 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
•
.
.
•
.
.
.
.
.
.
I
·
·
·
·
·
·
I
200
G
•
.
.
·
·
·
230 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
·
.
.
.
.
.
I
·
·
·
.
.
240 ·
I
·
•
250 ·
I
NDILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASYKIFKME.KGKVVKSVELD .N
.
.
.
I
.
.
.
.
.
.
.
.
•
.
•
.
.
260
I
.
.
.
.
.
.
270 I · · · · I · · · ·
•
I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
280 I
.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
290
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
I
.
.
.
.
300
.
I APNYBYEECSCYPDAGEITCVCRDNWBGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSG ·
Indo/5/2005 .
I
I NSRFEsVAWSASACBDGTSWLTIGISGPDNEAVAVLKYNGIITDTIKSWR ·
·
·
·
·
·
· · · ·
· · · ·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
· · .
B5N12005-2012
�
-
310 · ·
Indo/5/2005
--=s'fl
B5N12005 2 0 1 2
;./Indo/5/2005 B5N12005-2012
-
;./Indo/5/2005
�
B5N12005 2012
·
.
·
·
I
·
320 ·
·
·
I · · · ·
I
·
·
·
·
I
330
I
·
340
I
·
I
350 ·
·
·
·
I
VFGDNPRPNDGTGSCGPMSPNGAYGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSG
. . . . . . . . . . . . . . . . . v. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
·
�
I
·
·
·
I
360 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
370 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
380 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
390 ·
·
·
·
I
·
.
400 ·
·
·
I . . . . I
FEMIWOPNGWTGTOSSFSVKQDIVAITOWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRP •
•
•
•
·
·
·
·
•
I
•
•
'
·
·
·
•
9
•
•
•
•
410 ·
I · · · ·
•
I
•
•
I
.
0
I
I
9 .
420 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
•
I
'
0
·
·
0
o .
•
0
'
'
·
·
·
430 ·
·
I
·
o
I
o
•
o
o
·
·
·
·
o
o
o
•
o
440
C.FWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVSWS
I · · · ·
0
I
o
·
o
·
0
·
0
o
450 I
·
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . WPDGAELPFTIDKY
� 2. Hasil pensejajaran asam amino neuraminidase isolat A/Tndonesia/5/2005 dengan amino Neuraminidase konsnsus yang dibuat berdasarkan isolat manusia tahun 2005 :=pai dengan 2012. Terdapat perbedaan beberapa asam amino antara konsensus dengan =-:donesia/5/2005, pada posisi 1358, S48P, P54F, H80Y, N85S, E 18 1G,D202N,M3l7V dan bahan asam amino pada posisi 437 sampai dengan 450 yaitu WPDGAELPFTIDKY. amino 437 sampai dengan 450 belum ada pada isolat A/indonesia/5/2005 kemungkinan sikeunsing yang dilakukan saat itu belum sampai ke asam amino N terminal.
�ya dilakukan optimasi gen terhadap asam amino sikuen konsensus. Optimasi gen _._ .. Iran
dengan
menggunakan
.:::ghlndari kegagalan
transk.ripsi
piranti dan
lunak translasi
DNA2.0.
Optimasi
akibat perbedaan
�rutama sistem ekspresi marnalia, prokariota dan Baculovirus.
ditujukan
/bias
kodon
untuk antar
Berikut ini adalah
optimasi DNA penyandi protein konsensus Neuraminidase. Sikeun Asam amino �inidase dan sikuen DNA konsensus berpotensi diajukan paten. ::o::isensus
-
HSNl
-
�CCA.�CCAGAAGATCATCACCATCGGCAGCATCTGCATGGTGATCGGCATCGTGAGCCTGATGCTGCAGATCGGCAA �GCATCTGGGTGAGCCACAGCATCCAGACCGGCAACCAGCACCAGGCCGAGCCCATCAGCAACACCA.�CTTCCTGA �-?lGGCCGTGGCCAGCGTGACCCTGGCCGGCAACAGCAGCCTGTGCCCCATCAGGGGCTGGGCCGTGTACAGCAAGGAC
�TCAGGATCGGCAGCAAGGGCGACGTGTTCGTGATCAGGGAGCCCTTCATCAGCTGCAGCCACCTGGAGTGCAGGAC _ CC:GACCCAGGGCGCCCTGCTGAACGACAAGCACAGCAACGGCACCGTGAAGGACAGGAGCCCCCACAGGACCCTGA
�CCGTGGGCGAGGCCCCCAGCCCCTACAACAGCAGGTTCGAGAGCGTGGCCTGGAGCGCCAGCGCCTGCCACGAC �.GCTGGCTGACCATCGGCATCAGCGGCCCCGACAACGGCGCCGTGGCTGTGCTGAAATACAACGGCATCATCACCGA �AGAGCTGGAGGAACAACATCCTGAGGACCCAGGAGAGCGAGTGCGCTTGCGTGAACGGCAGCTGCTTCACCGTGA �.cGGCCCCAGCAACGGCCAGGCCAGCTACAAGATCTTCAAGATGGAGAAGGGCAAGGTGGTGAAGAGCGTGGAGCTG ,:;;xccCAACTACCACTACGAGGAGTGCAGCTGCTACCCCGACGCCGGCGAGATCACCTGCGTGTGCAGGGACAACTGGCA �.ACAGGCCCTGGGTGAGCTTCAACCAGAACCTGGAGT]\.CCAGATCGGCTACATCTGCAGC.GGCGTGTTCGGCGACA ;;:;GCCCAACGACGGCACCGGCAGCTGCGGCCCCGTGAGCCCCAACGGCGCCTACGGCGTGAAGGGCTTCAGCTTCA.�G -,_ ;cGGCGTGTGGATCGGCAGGACCAAGTCCACCAACTCCAGGAGCGGCTTCGAGATGATCTGGGACCCCAACGGCTG �& 4;.cCGACAGCAGCTTCAGCGTGAAGCAGGACATCGTGGCCATCACCGACTGGAGCGGCTACAGCGGCAGCTTCGTGC :::=:r:cGCTGACCGGCCTGGACTGCATCAGGCCCTGCTTCTGGGTGGAGCTGATCAGGGGCAGGCCCAAGGAGAGCACC cx;A �AGCGGCAGCAGCATCAGCTTCTGCGGCGTGAACAGCGACACCGTGAGCTGGAGCTGGCCCGACGGCGCCGAGCT �...CATCGA .C CAAGTA
...:.. .Panboatan sikuen konsensus dan DNA sintetik Hemaglutinin dan neuraminidasc HU 1 pdm Konsensus gen Hemaglutinin dan Neuraminidase dibuat berdasarkan sikeun asam ::;a:ng diunduh dari genbank. Kriteria yang dimasukkan adalah asal isolat dari manusia, -
asa1 sample adalah seluruh dunia, dengan tahun pengumpulan sampel 20 1 1 -2012.
di lakukan pengunduhan asam amino, dilakukan penentuan sikuen konsensus :::::a :::;;=;?=!aK' n fasilitas yang disediakan oleh genbank. Sekuen konsensus yang dihasilkan � � ... ....
di sejajarkan dengan asam amino konsensus protein hcmaglutinin yang dibuat
:=:::::S�� isolat tahun 2009 yang kami peroleh dari penelitian didanai oleh kemenristek 20 l 0. HAsil pensejajaran menunjukkan perubahan asam amino yang pada posisi nsensus asam amino H l 2010-2012 tidak memiliki asam amino pada posisi 559Y/G, 562L.
Perubahan ini terutama terjadi pada bagian cytoplasmic tail.
lO
::::...i:. .lUNlpan 2010 2012 �-2009 Asian isolated :2009:11.nycountry
20
30
40
50
· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · .. - 1 MKAJ: LVl/LLYTFA'l'ANADTLCIG'lliANS N TOTVDTVLEKNVTVTHSVMLL
ISO
70
80
90
100
· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · . - - I
lllNlpan 2010 2012 -2009 �Ian isolate� �:2009:anycountry
EDKHNGKLCRI.RGVAPLRLGKCNL IAGWI GNPECESLSTASSWSYIVETS
� 31.Nlpan 2010 2012 --2009 .uian isolated -:2009:anycountry
SSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPK'l'SSWPNRDSNXGVT
110
120
130
140
150
· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · ! · · · · I · · - - I
160
l 70
180
· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · ·
I · · · · I · · · · I · · .
190 1 . . .
.
.
1
200 .
.
.
- I
.Z:. aim.pan 2010 2012 -2009 Asian isolated ....: .. 2 009:1U1ycountry
AACPHAG.ARSF'll
El.Rlpan 2010 2012 -2009 >...Ian isolated :200s:anycountry
TSADQQSLYQNADAYVFVGTSl\YSKKFKPEIAIJU>KVRDQEGRMNYYWTL
210
220
230
240
250
· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · ·- I · · · · I · · . . 1
2&0
270
280
290
300
· I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I
· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I ·
iE!Hlpan 2010 2012 -=:!09 .uian isolated :�s_:::anycountry
VEPGDKITFE.ATGNLVVPRYAFAMEIUIAGSGIIlSDTPVEDCNTTCQTPK
::::.sipan 2010 2012 -:i.'liOS .>Jia.n isolated :2ll07.:::a.nycountry :
GAINTSLP5'0NIHPITIGRCPRYVRSTKLIU.A.TGLRNVPSIQSRGI.FGAI
.'10 •
320
330
340
350
· ; . J . · · · I · · · · I · : . · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · .-1 . · · · I · . . · I
.!ISO
370
380
390
400
· · · · I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I···· I · · · ·I····I··· · I · · · · I AGFlEGGWTGMVDGWYGYEBQN'.tQGSGYAADLKSTQNAIDKlTNKVNSVl'. . •
•
.
. • • .
.
.
•
• •
.
.
.
.
E•
.
.
•
•
.
.
•
.
. . . .
.
•
. • . . • . . . . • • • . • . . . . . . • • .
•
• • . . • •
E•
.
.
•
•
.
•
.
.
.
1 . · . . 1 . . . . 1
.
.
.
.
.
.
.... 1 .
•
410 .
.
.
1
.
.
.
.
.
.
.
.1 .
.
.
.
. • •
. • .
420 .
· · I ·
.
.
.
1
.
.
.
.
.
•
130 1 .
. . . .
•
•
.
.
.
440 .
.
450 1
E.KMNTQFTAVGKEFNBLElCRIENLNXKVDDGFLOIWTYNAELLVLI.ENER
flSO
'70
180
f90
500
I · · · · I · · · · I · · · · I · · · · I···· I · · · ·I····I···· I · · · ·I TI.DYBDSNVKNLYEKVRSQLXNNAKEIGNGCFEFYRKCDN'ICMESVKNGT
510
520
530
540
550
· · · I · · · · I···· I · · · · I · · · ·I···· I · · · · I····; ... · I···· I YDYPKYSE.EAKI.NREI E DGVKLl:STRIYQILAIYSTVASSLVl.VVSLGAI
,.
560 .
.
.
,
. . . .
,.
570 .
.
.
,
Snll-ICS--NGS-LQCRICI .
•
.
.
.
.
NY -
.
•
.
.
.
.
GG •
.
.L . . . . • . . I
. .
L.
.
•
.
.
•
.
3.. Hasil pensejajaran asam amino konsensus Hl konsensus tahun 2010-20 1 2 dan --- tahun
2009 asal isolat Asia dan negara-negara lain. Perubahan asam amino
� posisi K392E, konsensus asam amino Hl 2010-20 1 2 tidak memiliki asam _posisi 558N/G, 559Y/G, 562L.
, � ya dilakukan optimasi gen terhadap asam amino sikuen konsensus. Optimasi ..
-
-
dengan menggunakan piranti lunak DNA2.0. Optimasi ditujukan untuk ��==:z=- tegagalan transkripsi dan translasi akibat perbedaan /bias kodon antar spesies. =
c5optimasi dalarn penelitian ini ditujukan untuk meminimalkan bias kodon pada
"-·· --- �Ota dan baculovirus. Berikut ini adalah hasil optimasi DNA penyandi protein ""-----·�-- konsensus. Sikeun Asam amino Hemaglutinin dan sikuen DNA konsensus filajukan paten.
�_,,._.T ....,.::'CCTGG GGTGCTGCTGTACACCTTCGCCACCGCCP..ACGCCGACACCCTGTGCATCGGCTACCACGCCA_TJ.,.CAJ>. �--�G ���..r:cGT GACACCGTGCTGGAGAAGAACGTGACCGTGACCCACAGCGTGAACCTGCTGGAGGACAAGCACAACG __;:.:::T :���.,AGC GAGGGGCGTGGCCCCCCTGCACCTGGGCAAGTGCAACATCGCCGGCTGGATCCTGGGCAACCCCGAG �CCGCCAGCAGCTGGAGCTACATCGTGGAGACCAGCAGCAGCGACAACGGCACCTGCTACCCCGGCGA c:7\CGAGGAGCTGAGGGAGCAGCTGAGCAGCGTGAGCAGCTTCGAGAGGTTCGAGATCTTCCCCAAGACCAGCA ���CGACAGCAACAAGGGCGTGACCGCCGCCTGCCCCCACGCCGGCGCCAAGAGCTTCTACAAGAACCTGATC " ':bf-�_TJ.,.GG G CAACAGCTACCCCAAGCTGAGCAAGAGCTACAT�CGACAAGGGCAAGA G GGTGCTGGTGCTGTG �CCCC CAG AGCAGCGCCGACCAGCAGAGCCTGTACCAGAACGCCGACGCCTACGTGTTCGTGGGCACCAGCA �.GTTCAAGCCCGAGATCGCCATCAGGCCCAAGGTGAGGGACCAGGAGGGCAGGATGAACTACTACTGGACC �GGCGACAAGATCACCTTCGAGGCCACCGGCAACCTGGTGGTGCCCAGGTACGCCTTCGCCATGGAGAGGAA �-'6CGGCATCATCATCAGCGACACCCCCGTGCACGACTGCAACACCACCTGCCAGACCCCCAAGGGCGCCATCAACA �CCAGAACATCCACCCCATCACCATCGGCAAGTGCCCCAAGTACGTGAAGAGCACCAAGCTGAGGCTGGCC _:;z;:;;c_lil"-G GG.n.AC TGCCCAGCATCCAGAGCAGGGGCCTGTTCGGCGCCATCGCCGGCTTCATCGAGGGCGGCTGGACCGG �GGTACGGCTACCACCACCAGAACGAGCAGGGCAGCGGCTACGCCGCCGACCTGAAGAGCACCCAGAACG �GATCACCAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTCACCGCCGTGGGCAAGGAGTTCAAC �GGATCGAGAACCTGAACAA AG l\GGTGGACGACGGCTTCGTGGACATCTGGACCTACAACGCCGAGCTGCT --......... � _ ... GGA GAA CGAGAGGACCCTGGACTACCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAG GTGAGGAGCCAGCTGA -�CAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACACCTGCATGGAGAGCGTG�.AGAAC r.;LG.�CTACCCCAAGTACTCCGAGGAGGCCAAGCTGA.TJ.,.CAGGGAGGAGATCGACGGCGTGAAGCTGGAGAGCACCAG �TCCTGGCCATCTACAGCACCGTGGCCAGCAGCCTGGTGCTGGTGGTGAGCCTGGGCGCCATCAGCTTCTGGA �CGGCAGCCTGCAGTGCAGGATCTGCAT
konsensus Neuraminidase H I N I pdm dibuat seperti dijelaskan untuk pem buatan konsensus Hemaglutinin H I N !
pdm. Asam amino konsensus
yang dihasilkan
-'-"""'-uUJya di sejaj arkan dengan asam amino konsensus protein Neuraminidase yang dibuat t:::a ::nsark n
isolat tahun 2009 yang kami
peroleh dari penelitian
yang didanai
oleh
�ek periode tahun 2009-2010. Hasil pensejajaran menunjukkan tidak ada perubahan amino, namun di lakukan perubahan pada susunan asam nukleat penyandi kodon. dalam litian ini asam
nukleat penyandi kodon dioptimasi supaya daat diekspresikan dalam
mamalia, prokariota dan baculovirus.
..::=s SA BlNl 2009
:.=A_B1Nlpan_2010_2012
.-::.s: NA BlNl 2009
�_B1Nlpan_2010_2012
� N1\ BlNl 2009 •
-�5il._H1Nlpan_2010_2012
i::�. NA BlNl 2009
...._ ._s'i:i!. BlNlpan_2010_2012
� NA BlNl 2009
-�s'R�B1Nlpan_2010_2012
:r,:a,s Nl\ BlNl 2009
=::a.siA_BlNlpan_2010_2012
E:=s � HlNi 2-009
�_B1Nlpan_2010_2012
� NA HlNl 2009
�_H1Nlpan_2010_2012
=m.s NA BlNl 2009
�_B1Nlpan_2010_2012
·
·
·
10
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
20
I
·
·
·
·
·
30
J.
.
·
J .
· .
·
·
40
I
·
·
·
.
I
-
·
.
.
50
I
.
.
.
·
·
.
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
·
l
·
MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISBSIQLGNQNQIETCN . . . . . . . . . . . . . . . . . .
·
·
"
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
.
.
�
I
·
·
·
I
·
·
·
·
�
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
I
·
·
·
·
·
·
·
"
I
·
·
.
I
·
·
.
.
1�
I
.
.
·
.
.
·
·
.
.
·
·
·
. .
·
.
.
·
·
.
·
·
·
·
··
·
·
·
·
·
.
-
I
QSVIT�QTYVNISNTNFAAGQSVVSVlCLAGNSSLCPVSGWAIY
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
llO
I
I
·
120
J .
·
·
·
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
130
I
I
·
l40
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
-
I
-
.
.
·
·
·
·
.
.
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
.
150
I
I
SRDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDICHSNGT!K
160
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
I
·
l 70
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
I
·
180
I
I
·
190
J.
·
·
·
·
·
-
·
·
·
I
·
·
·
·
·
·
I
·
·
·
·
·
·
-
·
·
·
·
·
·
·
·
I
·
l
200
J
DRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDG!NWLTIGISGPDN
I
210 ·
I
·
I
220
I
·
I
230 ·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
I
·
1
240 -
I
·
I
250
- I
GAVAVLKYNGIITDT!KSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVl-lTDGPSDGQ
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
I
260
I
·
I
270
I
·
I
280
I
·
290
1
-
I
300
I
ASYK!FRIEKGK!VKSVENNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWBGSN
I
310
I
·
I
320 .
l
·
I
330
-1
·
340 ·
J.
I
350
I
.RPWVSFNQNLEY�IGYI.CSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFS
I
360
I
·
I
370
I
·
I
380
I
·
I
390
I
·
I
400
I
FKYGNGVWIGRTKS!SSRNGFElilWDPNGWTGTDNNFSIKQDIVGINEWS
I
410
I
·
I
420
I
·
I
430 ·
·
I
·
I
440 ·
·
J .
J.
450
I
GYSGSFVQHPELTGLDCJ:RPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNS
460
;�s NJ< HlNl 2009
I
·
I
I
·
·
·
·
I
470
I
DTVGWSWPDGAELPFTIDK-
�'U!._BlNlpan_2010_2012
....:b :m ar 4. Hasil pensejajaran asam amino konsensus neuroaminidase tahun 2009 dengan amino konsensus tahun 2010-2012, tidak ditemukan adanya perbedaan asam amino.
� penyandi asam amino konsensus neuraminidase tahun 2010-2012 dibuat dengan ggunakan program DNA2.0. Sikuen asam amino konsensus neuraminidase dan DNA yandi asam amino neuraminidase konsensus berpotensi untuk paten. Berikut ini sikuen neuraminidase konsensus.
_:.2ConsOPT CAT GGCAGCGTGTGCATGACCATCGGCATGGCCAACCTGATCCTGCAGATCGGCA.� CAACCAGAAGATCATC..�CC �CATCTGGATCAGCCACAGCATCCAGCTGGGCAACCAGAACCAGATCGAGACCTGCAACCAGAGCGTGATCACCT
�CACCTGGGTGAACCAGACCTACGTGAACATCAGCAACACCAACTTCGCCGCCGGCCAGAGCGTGGTGAGCGTG ::::GG GCC GCAACAGCAGCCTGTGCCCCGTGAGCGGCTGGGCCATCTACAGCAAGGACAACAGCATCAGGATCGGCAGCAA ....G ..;::�::GT TTCGTGATCAGGGAGCCCTTCATCAGCTGCAGCCCCCTGGAGTGCAGGACCTTCTTCCTGACCCAGGGCGCCC
....,.C .._�CGA AAGCACAGCAACGGCACCATCAAGGACAGGAGCCCCTACAGGACCCTGATGAGCTGCCCCATCGGCGAGGTG CTACAACAGCAGGTTCGAGTCCGTGGCCTGGAGCGCCAGCGCCTGCCACGACGGCATCAACTGGCTGACCATCGG :;ry;;;cr,c;ccccGACAACGGCGCCGTGGCCGTGCTGAAGTACAACGGCATCATCACCGACACCATCAAGAGCTGGAGGAACA .:::!XTGAGGACCCAGGAGAGCGAGTGCGCCTGCGTGAACGGCAGCTGCTTCACCG'I'GATGACCGACGGCCCCAGCGACGGC �TACAAGATCTTCAGGATCGAGAAGGGCAAGATCGTGAAGAGCGTGGAGATGAACGCCCCCAACTACCACTACGA �CTGCTACCCCGACAGCAGCGAGATCACCTGCGTGTGCAGGGACAACTGGCACGGCAGCAACAGGCCCTGGGTGA CAGAACCTGGAGTACCAGATCGGCTACA'I'CTGCAGCGGCATC'I'TCGGCGACAACCCCAGGCCCAACGACAAGACC �GGCCCCGTGAGCAGCAACGGCGCCAACGGCGTGAAGGGCTTCAGCTTCAAGTACGGCAACGGCGTGTGGATCGG �GAGCATCAGCAGCAGGAACGGCTTCGAGATGATCTGGGACCCCAACGGCTGGACCGGCACCGACAACA.�CTTCA �-:.GCAGGACATCGTGGGCATCAACGAGTGGAGCGGCTACAGCGGCAGCTTCGTGCAGCACCCCGAGCTGACCGGCCTG
"'1'CAGGCCCTGCTTCTGGGTGGAGCTGATCAGGGGCAGGCCCAAGGAGAACACCATCTGGACCAGCGGCAGCAGCAT �---G -- CGGCGTGAACAGCGACAC CGTGGGCTGGAGCTGGCCCGACGGCGCCGAGCTGCCCTTCACCATCGACAAG
:..!.. Pembuatan sikuen konsensus dan siotetik Nucleoprotein "---.u ..., s
gen Nucleoprotein
dibuat berdasarkan sikeun asam amino yang diunduh dari
:::i::::ank·. Kriteria yang dimasukkan adalah asal isolat dari manusia, lokasi asal sample adalah c-·-·
dunia, dengan tahun pengumpulan sampel 2005-20 1 2 danjenis virus H5Nl. Setelah
kan pengunduhan asam amino, dilakukan penentuan sikuen konsensus menggunakan ·ras yang disediakan oleh genbank. Sekuen konsensus yang dihasilkan selanjutnya di an dengan asam amino konsensus nucleoprotei n asal
virus
H l N l pdm tahun 20 1 1
i 2012 untuk mengetahui perbedaan asam amino antar isolat. Basil pensejajaran �uk.kan perbedaan asam amino antara H5N 1 dan H I N I pdm yaitu N26D, V391, S40G, •
R83K,RJ06l, Y1 1 I M, I l 25Y,L l421, M l 951, V I 96A, T223V, Y295H, R3 1 J K, F31 9V,
:.:.1f, D56K, R357K, V359I, Q360K, M377V A379T, R406K, 1431 V, T436S, T439N, -
.', R458K, V462L, N488S, N504S, dan R505Q
•
OPT Orde.r
�-BS 200S 2012
·
�:B1Nlpan::::2009_2012
OPT Order
.s;,.!fP-BS 200S 2012 �:BlNlpan::::2009_2012
·
·
I
·
·
·
10 I ·
·
·
·
·
20
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
30
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
40
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
50
I
·
I
· · · ·
MSDU:.IUQSQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASV'GRMVSGIGRFYIQMC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . D . . . . . . . . . . . IG . . . . . . . . .
·
·
·
60
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
70
I
·
I
·
·
·
·
.
.
.
.
·
·
·
·
.
.
.
·
·
·
·
. .
.
.
.
·
·
.
.
·
80
I
·
·
·
·
.
.
.
·
·
·
·
.
.
.
·
·
I
·
·
·
.
.
·
90
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
100
I
·
.
·
·
·
I
·
TELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNRY!.E.EBPSAGKDPKKTGG . . . . . . . .D
·
·
.
110
I
·
·
. . . .
.
·
·
·
·
.
.
·
·
I
.
.
!20
I
· · · ·
. I
· · · ·
.
I
.
.
K. . . . . . . . . . . . . . . .
130
I
140
·
·
·
·
I
· · ·
·
.
.
.
.
.
. .
.
.
·
·
·
I
· · · ·
.
150
I
I
· · · ·
!Cl' O?T Order
PIYRRRDGRWV'REI.ILYDKE.EI.RRIWRQANS NGEDATAGLTBLMIWB NLN
�=BlNlpan::::2009_2012
. . . . . I.
�-BS 200S 2012
· Oi'T
Order
�-BS 200S 2012
�=BlNlpan::::2o09_2012
O?r Order
�-RS 200S 2012 O:::z:.s:S:BlNlpan::::2009_2012 IP
· on
Order
�-BS 200S 2012 1:.:=.slfi':BlNlpan::::2009_2012
·
·
·
.
.
.
.
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
.
•
•
�-RS 200S 2012 ::.::sliP::::a1ii1pa.n::::2009_2012
.
.
·
·
.
·
·
I
·
·
.
•
�-BS 200S 2012
O?T Order
�bl>-BS 2005 2012 �::::a1iilpan::::2009_2012
......,, OPT Order
-=isSP-BS 2005 2012 ::::asSP::::a1N1pan::::2009_2012
II:? O?T
Order
-..:;.s:p-as 2005 2012
::::::::a1Nl.pan::::2009_2012 :::ts.SP
I
V.
I. . . . . . .
.
.
.
·
·
·
·
.
. . . . . . . . • . . . . . . . . . . . . . .
.
170
I
.
. .
.
.
.
.
.
210
I
I
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
•
•
•
.
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
.
.
.
I
.
220 ·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
260
I
I
I
·
·
·
I
I
.
180 ·
·
I
·
·
·
.
190
I
·
.
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
.
200 · I
·
·
I
230 ·
·
·
·
240
I···· I
·
·
·
I
·
·
·
·
·
IA. . . . 250
I
· · · ·
I
·
·
·
·
.v . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
270 ·
I
·
·
· ·
•
.
.
.
·
M.
I
280 ·
·
·
·
.
.
.
.
.
·
I
·
·
·
·
.
•
•
.
•
.
I
·
·
·
·
.
.
.
.
·
·
·
·
.
.
.
.
I
·
·
·
290 . J .
.
•
.
.
·
·
·
·
.
•
•
•
· · ·
300
I
· · · ·
I
SRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFERE
:
·
·
.
.
.
310
I
·
.
·
·
·
I
·
·
·
·
·
K.
.
•
I
.
.
.
·
·
·
•
.
•
.
320 ·
I
·
·
.
330
I
.
I
.
• . . .
340
I
·
·
·
·
•
.
.
•
B. . . . .
350
I
·
·
·
·
I
•
.
.
.
.
GYSLVGIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVS . . • . . . . . . .
.
.
360
::::a.s.li::::BlNlpan::::2009_2012 P
.
RMIKRGINDRNFWRGENGRRTRllYERMCNILKGKFQ'lAAQRAMQ MD VRE
V•
•
370
•
.
380
•
.
3!10
400
I · .. 1 ·· I · · · I · . . , · · I · · · · I I--··I··..1 SFIRGTRVVPRGQLSTRGVQIASNENMEAMDSNTLELRSRYW.!RTR.SGG ·
IE<' OPT Order
.
DAT'lQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTI.PRRSGAAGAL AVKGVGTMVME I
·
D OPT Order
M.
160
I
·
.
·
·
. • . . .
.
KK . I
·
·
·
·
I
•
.
.
.
.
·
·
·
·
•
.
.
.
•
•
•
K•
. · ·
.
410 ·
·
·
·
K.
.
.
I
·
·
·
·
•
I
•
•
·
•
·
•
•
.
.
• •
•
420 ·
·
, ,
.
.
.
·
·
·
I
·
·
. . .
.
·
·
•
.
V . T•
I
.
•
.
.
.
·
·
.
•
439 ·
·
· ·
I
·
·
·
·
I
·
.
·
•
•
•
•
•
.
•
•
440 ·
·
·
·
I
· · · ·
•
I
.
.
.
450
I
· · · ·
NTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFERATIMAA.FTGNTEGRTSDMRTEI •
. • .
.
460
I
·
·
.
.
·
·
I
·
·
·
·
L.
.
.
I
.•
4 70 ·
I
·
·
·
·
. I
. .
•
·
·
.
.V
. . .
480 ·
·
I
· · · ·
. S . . N. . . . . . . .
I
4!10 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
.
I
.
V
500 ·
·
·
·
I
IRMl-!ESARPEDVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMNNEGSYFFGDNAE .
K. .
.
. . . • • • . . . . . . . • . • . . . . . • .
S
. . . . . • . . . • . •
....j EYDNR . . . SQ
G:!mbar 5. Hasil pensejajaran asam amino gen Nucleoprotein yang akan
digunakan
dalam
litian ini dengan asam amino konsensus NP H5Nl dan asam amino konsensus NP H l N l ::.!D. Perbedaan asam amino antara NP HSNI dan NP HINI pdm antara lain N26D, V39T, '-00, E59D, R83K,Rl 061, Vl I IM, 1 1 25V,Ll421, M J 95T, V 1 96A, 1223V, Y295H, R31 IK, """: i9V, I322M, T356K, R357K, V359l, Q360K, M377V A379T, R406K, 1431V, T436S, --39N, 1450V, R458K, V462L, N488S, N504S,
dan R505Q
DNA penyandi asam amino konsensus NP dibuat dengan menggunakan program DNA2.0.
Sikuen asam amino konsensus neuraminidase dan DNA penyandi asam amino neuraminidase r.-onsensus berpotensi untuk paten. Berikut ini sik:uen DNA NP k:onsensus. >
NPcons OPT
ATGAGCGACATCGAGGCTATGGCCTCCCAAGGCACCAAACGCTCCTACGAGCAGATGGAGACCGGCGG CGAAAGGCAAAACGCTACAGAAAT TAGGGCTAGC GTGGGCCGCATGGTGAGCGGCATCGGCCGCTTC T ATATCCAGATGTGCACCGAACTGAAGCTGAGCGACTACGAAGGCCGCCTGAT CCAAAACAGCATCACA ATTGAAAGGATGGTCCTGTCCGCTTT CGATGAACGCCGCAACCGCTACCTGGAGGAACATCCTAGCGC �GGCAAGGACCCCAAGAAGACC GGCGGCCCCATCTATAGGAGGAGGGACGGCAAGTGGGT GCGCGAGC �GATCCTGTACGACAAGGAAGAAATCAGGAGGATCTGGAGGCAGGCCAACAACGGCGAGGACGCCACC GCTGGCCT GACCCACCT GATGATCT GGCACAGCAACCTGAACGACGCTACATATCAGAGGACCAGGGC �CTGGTGAGGACCGGCATGGATCCTAGGATGTGTAGCCTCATGCAAGGCAGCACCCTGCCCAGGAGGT CCGGCGCTGCTGGCGCTGCTGTCAAAGGCGT GGGCACAATGGT GATGGAGCTGATCCGCATGAT CAAG AGGGGCATCAACGACAGGAACTTCTGGAGGGGCGAGAACGGCAGGAGGACAAGGATTGCTTATGAAAG GATGTGTAATATCCTGAAGGGCAAGTTCCAGACCGCTGCTCAAAGGGCTATGATGGACCAAGTCAGGG AAAGCAGGAACCCTGGCAACGCTGAAATTGAGGACCT.GATCTTCCTGGCTAGGAGCGCTCTGATTCTG AGGGGCTCCGTGGCTCACAAGAGCTGTCTGCCTGCTTGCGTGTACGGCCTGGCTGTCGCTAGCGGCTA CGA TTTTGAAAGGGA.AGGCTACAGCC TGGTGGGCAT CGATCCT TTCAGGCTGCTGCAAAACAGCCAAG �GTTCAGCCTGATCAGGCCTAACGAAAATCCTGCTCACAAAAGCCAACTCGT GTGGATGGCTTGCCAT AGCGCTGCTTT TGAAGATCTCAGGGTGAGCAGCTTCATCAGGGGCACAAGGGTGGTGCCTAGGGGCCA ACTGAGCACACGCGGCGTGCAGATCGCCAGCAACGAGAACATGGAGGCCATGGACAGCAACACCCTGG AGCTGAGGAGCCGCTACTGGGCTATCAGGACCAGGAGCGGCGGCAACACCAACCAGCAGAGGGCTAGC GCTGGCCAGATCAGCGTGCAAC CTACATTTAGCGTGCAAAGGAAC CTGCCTTT CGAAC GCGCTACAAT CATGGCTGCTTTCACAGGCAACACAGAAGGCAGGACATCCGATATGAGGACAGAAATTATTAGGATGA 7GGAAAGC GCTAGGCCTGAAGACGTGTCCTT CCAGGGCC GCGGCGTGTTCGAGCTGAGCGACGAGAAG GCTACAAACCCTATTGTCCCTTCCTTTGACATGAACAACGAAGGCAGCTACTTCTTCGGCGACAACGC 7GAAGAATATGATAACAGG
V.4. Pembuatan DNA sintetik Lysteriolisin
Hasil pensejajaran asam amino listeriolisin tidak menunjukkan ada perbedaan asam amino !isteriol.isin yang diunduh dari genbank dengan asam amino hasil translasi gen listeriolisin yang telah dioptimasi kodon untuk sistem mamalia.
10 ·
�7steriolisin M24199-M29030 -TsteriolisinORD
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
20
I
·
·
·
·
I
·
30
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
40
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
50
·
.
.
I
.
·
.
.
I
.
MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSl-!APPASPPASPK
·
�7steriolisin_M24199_M2 9030
·
·
·
·
60
I
·
·
·
I
·
70
·
·
·
·
I
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
80 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
90 ·
·
·
-
I
·
·
-1
·
100 ·
·
·
I
·
TPIEKKBADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYBGOAVTNVPPRRGYRDGNEYIV
_7steriolisinORD 110 ·
:.ysteriolisin M2 4199-M29030
:ysteriolisinORD
·
·
I
·
·
·
I
·
·
120 ·
·
·
I
·
·
·
I
140
130
·
·
·
I
·
·
·
·
I · · · · I
·
·
·
150
- I . . . . I . . . . I
·
·
·
·
I
·
·
160 I ·
·
·
·
·
·
I
l 70 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
180 ·
·
·
·
I
·
190
·
·
·
I
·
·
200
. . I . . . . I . . . . I
SLTLSIDLPGMTNQDNKIVVI
210 ·
:.ysteriolisin_M24 1 99_M29030
·
VEKKKKSINQNN.ADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRD
·
�ysteriolisin M24199-M29030 lysteriolisinORD
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
220 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
230 ·
·
·
·
I
·
240 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
250 ·
·
·
I
·
·
-
·
I
SAKIDYODEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVIS
:ysteriolisinORO
260 ·
:.ysteriolisin �124199-M29030 lysteriolisinORD
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
270 ·
·
·
I
·
·
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
360
·
·
I
·
·
·
·
I
·
290 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
300 I
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
. 330 I ·
· · · ·
" 350
340 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
I
·
·
·
·
I
· ·
·
·
I
:no ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
380 ·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
390 ·
·
·
·
I
·
400 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
SAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVI
410 .
Lysteriolisin M24199 M29030
280 ·
Qvn.KLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGOVELTNIIKNSSFKAVIYGG
·
Lysteriolisin M24199-M29030 lysteriolisinORD
·
320
- 310
Lysteriolisin M24199-M29030 lysteriolisinORD
I
FKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGR
·
Lysteriolisin M24199-M29030 lysteriolisinORD
·
.
.
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
420 · ·
·
·
I
·
440
430 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
450
·
·
·
I
·
·
. . I
KNNSEYIETTSKAYTDGKINIDBSGGYVAQFNISWDEVNYDPEGNEIVQH
.
·
.
.
·
·
.
.
· I
.
·
.
•
··
..
.
.
.
.
. .
.
.
.
I · · · · I
.
.
.
.
·
·
·
.
.
.
·
·
.
4 70
460 ·
. .
·
·
·
·
I
·
.
". . . .
.
.
.
.
480 I
·
·
I
·
.
.
� .
.
.
.
.
.
·
·
I
·
·
.
490 ·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
.
.
SOD I
·
KNWSENNKSKI.AHFTSSIYLPGNARNINVYAKECTGLAWEt��TVIDDRN
lysteriolisinORD 520
510 ·
Lysteriolisin_M24199_M29030
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
I
·
·
·
·
LPLVRNRNISIWGTTLYPKYSNKVDNPIE
lysteriolisinORD
Gambar 5. Hasil pensejajaran asam amino lysteriolysin yang diunduh dari genbank dengan asam
amino hasil traslasi gen sintetik ayng telah dioptimasi untuk sistem mamalia
menunjukkan tidak ditemukan adanya perbedaan asam amino antara lysteriolisin yang diunduh dari genbank dengan hasil tran slasi gen lysteriolisin sintetilk.
_.elanjutnya asam amino listeriolisin dibuat sikuen DNAnya dengan bantuan piranti lunak .... NA . .2.0 dan dioptimasi untuk sistem mamali, berikut ini adalah sikuen DNA penyandi .JSteriol isin. Sikuen asam amino dan DNA yang dihasilkan dalam penelitian ini berpotensi --::uen. >lysteriolisinORD ATGAAGAAGAT CATGCTGGTGTTCATCACCCTGATCCTGGTGAGCCTGCCCATCGCC CAGCAGACCGAGGCCAAGGACGCCAGCGCCTTCAACAAGGAGAACAGCATCAGCAGC ATGGCCCCCCCCGCCAGCCCCCCCGCCAGCCCCAAGACCCCCATCGAGAAGAAGCAC GCCGACGAGATCGACAAGTACATCCAGGGCCTGGACTACAACAAGAACAACGTGCTG GTGTACCACGGCGACGCCGTGACCAACGTGCCCCCTAGGAAGGGCTACAAGGACGGC AACGAGTACATCGTGGTGGAGAAGAAGAAGAAGAGCATCAACCAGAACAACGCCGAC ATCCAGGTGGTGAACGCCATCAGCAGCCTGACCTACCCCGGCGCCCTGGTGAAGGCC AACAGCGAGCTGGTGGAGAACCAGCCCGACGTGCTGCCCGTGAAGAGGGACAGCCTG ACCCTGAGCATCGACCTGCCCGGCATGACCAACCAGGACAACAAGATCGTGGTGAAG AACGCCACCAAGAGCAACGTGAACAACGCCGTGAACACCCTGGTGGAGAGGTGGAAC GAGAAGTACGCCCAGGCCTACCCCAACGTGAGCGCCAAGATCGACTACGACGACGAG ATGGCCTACAGCGAGAGCCAGCTGATCGCCAAGTTCGGCACCGCCTTCAAGGCCGTG AACAACAGCCTGAACGTGAACTTCGGCGCCATCAGCGAGGGCAAGATGCAGGAGGAG GTGATCAGCTTCAAGCAGATCTACTACAACGTGAACGTGAAC GAGCCCACCAGGCCC AGCAGGTTCTTCGGCAAGGCCGTGACCAAGGAGCAGCTGCAGGCCCTGGGCGTGAAC GCCGAGAACCCCCCCGCCTACATCAGCAGCGTGGCCTACGGCAGGCAGG TGTACCTG AAGCTGAGCA�CAACAGCCACAGCACCAAGGTGAAGGCCGCCTTCGACGCCGCCGTG AGCGGCAAGAGCGT GAGCGGCGACGTGGAGCTGACCAACATCATCAAGAACAGCAGC TTCAAGGCCGTGATCTACGGCGGCAGCGCCAAGGACGAGGTGCAGATCATCGACGGC AACCTGGGCGACCTGAGGGACATCCTGAAGAAGGGCGCCACCTTCAACAGGGAGACC CCCGGCGTGCCCATCGCCTACACCACCAACTTCCTGAAGGACAACGAGCTGGCCGTG ATCAAGAACAACAGCGAGTACATCGAGACCACCAGCAAGGCCTACACCGACGGCAAG ATCAACATCGACCACAGCGGCGGCTACGTGGCCCAGTTCAACATCAGCTGGGACGAG GTGAACTACGACCCCGAGGGCAACGAGATCGTGCAGCACAAGAACTGGAGCGAGAAC AACAAGAGCAAGCTGGCCCACTTCACCAGCAGCATCTACCTGCCCGGCAACGCCAGG AACATCAACGTGTACGCCAAGGAGTGCACCGGCCTGGCCTGGGAGTGGTGGAGGACC GTGATCGACGACAGGAACCTGCCCC TGGTGAAGAACAGGAACATCAGCATCTGGGGC ACCACCCTGTACCCCAAGTACAGCAACAAGGTGGACAACCCCATCGAG
-. Pembuatan DNAsintetik fusi SPD-CD40L human
Fusi SPD_CD40L dilakukan dengan cara mengunduh sikuen mRNA penyandi protein
surfactan protein D manusia diunduh dari gen bank dengan nomor akses
NM_003019 versi NM_00301 9.4 GI:61 699225. Sikeun mRNA penyandi protein CD40L manusia diunduh dari gen bank dengan nomor akses NM_000074 versi NM_000074.2 GI:58331233. Fusi gen mengandung sinyal peptide yang diperlukan supaya protein dapat diekspresikan di membran sel. Sinya peptide berada pada bagian C terminal. Gen SpD yang diambil dalam fusi ini merupakan bagian yang dapat membentuk strukur trimer. Hal ini ditujukan supaya CD40L yang terfusi dibagian N terminal SPD dapat membentuk struktur trimer, karena fungsi biologis CD40L ditentukan oleh struk:tur polimemya. Bagian CD40L yang difusi merupakan bagian globular, yang merupakan bagian fungsional CD40L. Bagian transmembrane CD401 tidak diikut sertakan dalarn pembuatan fusi. Fusi yang dilakukan dalam peneltian ini berbeda dengan peneltian terdah�lu yang memfusikan SPD secara utuh dengan CD40L. Berikut ini adalah basil pensejajaran asam amino fusi SPD_CD40L, CD40L dan SPD.
20
lO
30
40
50
[i� �� ��ki.TQ���� 4�§.��1.���ht Yi'.f��§.�:�§tR�k=: ::=J --------------------------------------------------
FusiSPD co40L CD40Lliuman SPOhuman
6() 70 8() 90 100 ,...:..:..:...:.l..: : d..:..:...:..:..L:...:..:.."..l..:...:..:..:..l..:..:...:..:..L.:..:..:...d ....._ . . .__ . ...:..:_d..:__,__,__,_L,_�__.__,_J_:...:.. _ FusiSPD CD40L L!?.§.�§RE��<,;_:;.!?. 11:G.�:;>G.h GM§2!:'l�!1.�§Q�G.�.YG .G.fJl:GJ;m .$.Y.§.;.�§.?..!SG.... ...J
--------------------------------------------------
co4oLBuiiian SPDhuman
ONG-SVGE'P"GPKG
-Pll:i.'iEKG �Gt15G1iAGQAGM!_)GQJl:GPVGPl\G. r t>G�!iG'!lE"<�l5 ·
:....·----··-·-·--··--·--························--·
:
""" · · " ··
--------···········--·······-··-··-····-·········-············..·-····-······:
110
120
130
140
150
......:...:..:..:...l..:..:...:..:_.L.:..:..:...:..L.:..:..:..:...l..:..:...'...:..1..:•.:..:...:.. J.. :...:..:..:...L:..:...'...:...l..:..:..:...'...1..:...:..:..:...1......... . FusiSPD_CD4 OL L. ..!?.!.(;J.:;?_�l:':r'�J:'.:E'.0!:r'.�J:'�§.�.�l?,�Ci.�Q-�l:l!(;J:'9.Ci.�J:'�J:'�.��(;.J:'���Y..c;�J:'......J
--------------------------------------------------
CD40LHuman SPDhuman
160
170
180
190
200
: :..: .-.. .1 .. :..:...:.. :.. 1..:..:..:...:..L:..:..:..:...l..:..:...:.. :.. L:..:..:... :.. L.-...:..:..:...l..:.. :...: .. :.. L:..:..:...:..L:...:..:.. :... I.............. FusiSPO CD40L Lc;�qc;�.?1-�(;Yl,(;l:'.IS(;�B:c;Y.:P.YP.c;!i'.!'.(;JY.l:(; .Ci.�B:c; :?.��c;g_g_c;:?..?..�c;.P.___________' ••. ••
•.
--------------------------------------------------
co40LBuiiian SPOhuman
210
220
230
240
250
L J..,._,__,__,_J..,..... , :.....1...-• ••:•.:•..-..J..,,..-...:..:..l....� L ___,__,..L..,..,...-..J..,........_,._L.. FusiSPD_CD4OL L..l?.Gl. .S �:!.�P.Yll.$. :t.BQ Q.�Q@YQIU1QMf..�.Q � .........i . G. G. M t .KG.P.KG.ll'G.P.K ····'··"··•··'·:
C040LBuman SPDhuman
, ... :..:..
_,
�--'-·'··'·.
--------- ----MJ:ETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYl.LTVFLITQMI ..
L..� � � �� � � P -� E § Ii>G � K � !f � �� � �gg� !?.Y.'.. � i � i!f9.AA"f� q� � � � J 260
_,_,__,__,_j
• • •
.:..i.-..:....'. I
270 ·
·
· ·
l
· ·
280 ·
300
290
.:.. :.l�L:...:. - ...L.:..:... L:...:.
·
-
I
LF!;GGstt.1R.RLDr 1 r OF V F ff£0ERN M K TIQRCNTGER L:i SLSL l ' C LNetf FusiSPO C040L l VE ,....GSAµ"A�K HRRLD IEOERNLHEOFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEI � C040LHuman L_yg_!-_gPNGQSVG�ltl'.rt('1'l'O)l.� \�G�F'1'£AQLtc ts��ioou; SPOhuman
-···'
310 320 330 340 350 __,_.._,_,_L,__ _,-'J..,..,...:.. :..l..,..,..,__, .-._, __,____ ._L _ L.:..:..:...,.L_., , L:. .:...:.....L:...:..:...:. L:...-...,_,_.J..,____,�_,_ FusiSPD C040L jKSQFEGFVKDIMLNKEETKKE.NSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSV j , _ ,
! KSQFEGFVKDI�ll.NKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSV_____�_ ..QQL�Si-ITDSKTEGKFTYPTGESLVisNWAi>Gt1>Ni5oGGSEi5
C040LHuman SPDhuman
360 370 380 390 400 _:..:...:..:..L:...:..:...-...1..:•.:_.:.�..L.�...:..:..l..:...:..:.... : .L:..:...:..:..L:..:.. :...:.L...:..:....: .l..:..:__:__:...1...:..:_.:._:__J...___ FusiSPD C040L i LQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYI>.QVTFC SNREASSQA i ! LQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQA i co40LHuiiian �rKtU.wc� cwir'l'NG
SPOhuman
'··
r
RWI:iru\:C
410
·······················-··················----------········-··---·----------·······'
420
430
440
450
"".:...:..:..:..l.:...!..:_:_l.:__,__,___d__.-...:..:..:..L.:,.:_:..:..L..�..:..:..l..:...�.:-"..1..c.:•.:...:..l..:...,..:..:..l..:...:..:..:..l........,
FusiSPO C040L 1 PFIASLCLKSPGRFERILLR.?i.MlTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASV ! CD40LHuiiian j---��E�_s_ l :.���:;-�_(;_���-�!�����!-��-�-<:,�3.9.:.�-�-�(;�::'!,�.L..9.��:'.?;�_Y.______J SPOhuman 460
__
4i0
.:..:..:..:..l..:..:..:...:..L..:...:..:..L :."--'--'-..1..:..:..o..:.•l.........
FusiSPO C040L i FVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL C040LBuman i__ �i:>-�:g� _'l:'-�-��-:--�!?.:.:.._______, �'.1�.(;� SPOhuman
Garn bar 6
.
Pensejajaran asam amino fusi SPD_CD40L dengan SPD dan CD40L asal
manusia. Sikuen asam amino SPD berada dalam kotak warna biru, pada sikuen Fusi SPD_CD40L dipisahkan oleh asam amino GGGS, sikuen asam amino CD40L berada dalam kotak wama kuning.
Gen penyandi asam amino protein fusi SPD CD40L selanjutnya disusun dengan _
menggunakan piranti lunak DNA2.0. Berikut ini adalah sikeun DNA penyandi protein fusi SPD CD40L. >
HumanSPD-CD40L
ATGCTGCTCTTCCTCCTCTCTGCACTGGTCCTGCTCACACAGCCCCTGGGCTACCTGGAAGCAGGAATGAAGACCTACTCCCA CAGAACCATGCCCAGTGCTTGCACCCTGGTCATGTGTAGCTCAGTGGAGAGTGGCCTGCCTGGTCGCGATGGACGGGATGGGA GAGAGGGCCCTCGCGGCGAG.l\AGGGCGACCCAGGTTTGCCAGGAGCTGCAGGGCAAGCAGGGATGCCTGGACAAGCTGGCCCA GTTGGCCCCAAAGGGGACAATGGCTCTGTTGGAGAACCTGGACCAAAGGGAGACACTGGGCCAAGTGGACCTCCAGGACCTCC CGGTGTGCCTGGTCCAGCTGGAAGAGAAGGTCCCCTGGGGAAGCAGGGGAACATAGGACCTCAGGGCAAGCC.�GGCCCAA.AAG GAGAAGCTGGCCCCAAAGGAGAAGTAGGTGCCCCAGGCATGCAGGGCAGCGCAGGGGCAAGAGGCCTCGCAGGCCCTAAGGGA GAGCGAGGTGTCCCTGGTGAGCGAGGAGTCCCTGGAAACACAGGGGCAGCAGGGTCTGCTGGAGCCATGGGTCCCCAGGGAAG TCCAGGTGCCAGGGGACCCCCGGGATTGP.AGGGGGACAAAGGCATTCCTGGAGACAAAGGAGCAAAGGGAGAAAGTGGGCTTC CAGATGTTGCTTCTCTGAGGCAGCAGGTTGAGGCCCTGCAAGGACAAGTACAGCACCTCCAGGCTGCTTTCTCTCAGTATAAG AAAGTTGAGCTCTTCGGAGGTGGATCTCTTCATAGAAGGTTGGACAAGATAGAAGATGAAAGGAATCTCCATGAAGATTTTGT ATTCATGAA.l\ACCATCCAGCGGTGTAACACCGGCGAAAGATCCCTGTCCCTGCTCAACTGCGAAGAGATTAAA.�GCCAGTTTG AAGGCTTTGTGAAGGATATAATGCTGAACAAAGAGGAGACCAAGAAAGAAAACAGCTTTGAA.'f\.TGCAAAAAGGCGATCAGAAT CCTCAAATTGCTGCTCACGTCATAAGCGAGGCTAGCAGCAAAA ACAAC TCTGTGCTGCAGTGGGCTGA.�GGATACTACAC CATGTCCAATAATCTGGTAACCCTGGAAAATGGGAAACAGCTGACCGrTAAAAGACAAGGACTCTATTATATCTATGCCCAAG TCACCTTCTGTTCCAATCGGGAAGCTAGCAGCCAAGCTCCTTTTATAGCCAGCCTCTGCCTGAAGTCCCCCGGCAGATTCGAG AGAATCCTGCTCCGGGCTGCTAATACCCACTCCTCCGCCAAACCTTGCGGCCAACAATCCATTCACCTGGGCGGCGTGTTCGA GCTGCAGCCTGGCGCCTCCGTGTTTGTGAATGTGACAGATCCTAGCCAAGTGAGCCATGGCACAGGCTTCACATCCTTTGGCC TCCTCAAACTC
V.6. Perancaogan dao Konstruksi vektor pengekspresi vaksin DNA berfusi dengan gen adjuvant. Gen periyandi protein adjuvant ·yaitu gen VP22 penyandi pmtein VP22, gen C3b atau P28 penyand i protein C3b (P28). Gen akan di klona secara berfusi pada bagian C tenninal prote in Hemaglutinin, menggantikan posisi Tran.s·membrane dan Cytoplasmic tail sehingga protein yang dihasilkan merupakan protein hemaglutinin berfusi dengan gen penyandi VP22 atau P28. Dalam peneltian ini kemampuan hemaglutinin untuk membentuk struktur trimeric tidak dihilangkan, sehingga protein fusi yang dihasilkan akan dapat membentuk struktur trimer dan protein adjuvant akan ada dalam keadaan multimer. Gen adjuvant CD40L akan dibuat dengan memfusikan surface protein D pada bagian N terminal CD40L. gen fusi selanjutnya akan diklona dalam vektor pcDNA 3.1, sehingga akan
diperoleh
pCDNA3.1 SPD-CD40L.
Saat
digunakan
sebagai
adjuvant,
plasmid
pcDNA3. l SPD-CD40L akan dimasukkan/disuntikkan bersama-sama dengan DNA vaksin. Diharapkan penyuntikan plasmid penyandi protein CD40L akan meningkatkan respon kekebalan humoral.
Adjuvant Lysteriolisin dibut berdasarkan kemampuan lysteriolisin untuk melepaskan '5ri dari endosom sehingga protein tidak dihancurkan oleh protease lisosom. Dalam
;enelitian ini gen Jysteriolisin akan diklona dalam vektor ekspresi prokariota. Protein �"Steriolisin akan ditambahkan pada saat formulasi vaksin DNA, Baculovirus atau protein sub .::n it.
V.7. Pengklonaan gen HA -H5Nl tanpa daerah transmembran dan
cytoplasmic tail
{HAACTM) ke dalam vektor plasmid pcDNA3.1(+) Fraginen gen HA H5NI tanpa daerah cytoplasmic tail dan transmembran domain diamplifikasi menggunakan teknik PCR dengan template berupa fragmen gen HA full yang relah diklona ke dalam plasmid pcDNA3. l (+). Ukuran pita DNA yang diharapkan dari basil amplifikasi adalah
±
1400 bp. Gambar 7 menunjukkan hasil amplifikasi DNA sisipan dan
pemotongan DNA vektor.
�et-: :M..t&l>NA..-ule< M 1 : he:lll PCR HMTM : pcDHJ\3.Hfhd
Gambar 7. Persiapan DNA vektor dan insert HAL\TM DNA insert dan vektor yang telah direstriksi dengan enzim restriksi Nhel dan EcoRJ kemudian dipurifikasi dan diisolasi menggunakan 0,8% Low Melting Agarosa dan diligasi dengan perbandingan DNA sisipan:vektor
=
3:1.
Seleksi menggunakan teknik PCR koloni d engan pasangan primer yang daerah MCS
mengamplifikasi
vektor. Gambar 8 menunjukkan bahwa 1 2 dari 14 klon teridentifikasi positif
mengandung sisipan HA�TM.
Aprosa0,8%; l.10 V; 30 menit
Agarosa0,8"; 110 V; 30 menit
Keten.npn:
Keteransan: 7-11 : plasmid rekombinan pcDNA 3.1· M :MarbDNA Wt :�id wild-type (271bp)
12-20 M wt
: pla=>id ieb>mbinanpcDNA 3.1.-HA (174lbp)
: Matb DNA
: plasmid wild-type (271 bp)
b
a
Gambar 8. Ha5il Salah
satu
verifikasi PCR dari pcDNA 3 l HA�TM .
klon,
yaitu
·pcDNA3 1 (+)J:-IA�1M(13)
diverifikasi
sekuensing
dan
menunjukkan kesesuaian DNA sisipan dengan template gen HA H5N1 . Hasil sekuensing menunjuk.kan bahwa gen HA telah berhasil diklona ke dalam plasmid pcDNA3.l (+) (Gambar 9). Plasmid kemudian diperbanyak dan disimpan dalam
bentuk stok kultur.
10
lC
lO
. I .
I
50
. I .
·
I · · · ·
60
I . .
I ·
I.
HAH5
ATGGAGAAAATAGTGCTTCTTCTTGCAATAGTCAGTCTTGTTAAAAGTGATCAGATTTGCAT
pc0N"31HATM
AT QQA Q A A A A T A Q T C C T T CT T C T T Q C A A T A Q T C A G T C T T GT T A A A A G T G A T C A G A TT T G C A T
E
M
E
M
V
l
S
L
S
V
A
L
K
V
A
l
L
L
V
K
V
100 I . . HAHO
::o
I . .
·
·
C
·zo
I ·
130
.
. . . I
i .
.
'
ATGCAAACAATTCAACAQAGCAGGTTQACACAATCATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACAT
S
N
N
A
H pcDNA31 HATM
I
C
0
D
S
K
0
D
S
K
V
N
K
E
M
T
D
V
Q
E
T
S
N
N
A
H
150
>to
. I .
. I ·
D
V
Q
E
T
170
N
"
I . .
·
K
E
M
T
180
I .
V
T
AT G C A A A C A A T T C A A CA G A G C A GG T T G A C A C A A T C A T G G A A A A GA A C G T T A
c
V
T
H
T
190
. I
H
T
T G T TA C A C A T
200
I
HAH5
CATACTGGAAAAGACACACAACGGGAAGCTCTGCQATCTAGATGGAGTGAAGCCTCTAATTT
p.cDNA31HATM
C A T A c T G G A A AA G A C A C A C A A C G G G A A G C T
K
E
L
L
K
E
N
H
T
H
T
Z20 I · ·
·
230
I . . · · I ·
I
. . · ·
I ·
L
P
K
V
G
0
T G C G A T C T A G A T G G A G I GA A G C C T C T A A T T T
D
C
L
K
G
N
c
L
D
C
L
K
G
2<.0
250
. I·
. I .
P
K
V
G
D
L
260
· I . . ·
270
· · I ·
I ·
I .
HAH5
TGTAGTGTAGCTGGATGGCTCCTCGQQAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTACCGGA
pc:ONA31HATM
T O T A G T GT A QCT QQA T G G C T C C T C Q G G A A CCCA A T G T G I g A C G A A T T C A T C A A T GT A C CGGA
c
C
300
. I
I.
E.
P
V
N
))0
I .
V
N
A
K
E
V
N
A
K
E
l60
I . . .
T
P
T
P
. I .
. . . I
N
0
L
N
D
L
370 I .
I .
GAAACACCTATTQAGCAGAATAAACCA
K' pc:ONA31HATM
F
E
D
C
e
p
v
N
I .
. I
C
Y
P
G
N
S
O
Y
A C A T A G t GGA G A A G G C C A A T C C A A C C A A T G. A C C T C T G T T A C C C A G G G A G T T T C A A C G A C T A I
Y
HAH5
M
F
e
0
ACATAGTGGAGAAGGCCAATCCAACCAATGACCTCTGllACCCAGGGAGTTTCAACGACTAT
Y pc0NA31HATM
c
M
P
�
G
L
W
G
p
N
G
l
L
w
G
�
V
S
I . HAH5
A
v
s
H
L
S
f\
N
G A A A C A T C t AT T G A G C C G A A T A A A C C A K
H
S
R
N
Garnbar 9. Hasil alignment pcDNA3.1 (+)HAll.TM
C
Y
P
G
S
F
N
0
Y
V.8. Pengklonaan adjuvan gen Cd40L ke dalam vektor plasmid pcDNA3.1(+) Sintesis DNA sisipan CD40L yang menyandi protein CD40L dilakukan melalui proses amplifikasi polymerase chain reactor reverse transcriptase (RT-PCR) menggunakan RNA yang diekstraksi dari sel PMBC mencit sebagai materi genetik pola cetaknya.
Amplifikasi
DNA penyandi protein CD40L menggunakan reagen One Step RT-PCR Superscript 111/Taq Platinum dan pasangan primer
MSCD40L_F l dan CD40L F2. Gambar IO menunjukkan
hasil PCR dari DNA sisipan Cd401.
10000
l'et�: M :MMUOHA......,.... ·
: ha
Garn bar I 0. Hasil PCR CD40L DNA adjuvan Cd401 akan diklona ke dalam plasmid ekspresi mamalia pcDNA3. l dengan situs restriksi HindIII
dan EcoRI.
Gambar 1 1 menunjukkan skema pengklonaan
DNA adjuvan Cd401 ke daI11:m vektor pcDNA3.1 .
Gambar 1 1 . Skema pengklonaan DNA adjuvan CD40L dalam vektor pcDNAJ. l Plasmid pcDNA3. l (+) pertama-tama direstriksi dengan enzim restriksi Hindll l selama 16 jam.
Hasil yang diharapkan
menggunakan
QIAEXII
gel
adalah plasmid terlinearisasi, kemudian dipurifikasi
extraction
kit
dengan
metode
desalting.
Gambar
12
menunjukkan plasmid pcDNA3. l yang telah direstriksi dengan Hindlll dan dipurifikasi menggunakan kit tersebut.
bp
3000 -
ret�nt"ft:
1000
"'
:"'acbDHA�
•
: �pdlNAl.l .. ld l}'PP : pl..smldpcDN3.1dioettb Hindlll(5427 hp) :p�•DHApdlNA3.l�
Gambar 12. Restriksi plasmid pcDNA3.l dengan HindIII. Plasmid pcDNA 3 . 1 (+) yang telah dilinearkan dengan HindIII kemudian direstriksi kembali dengan EcoRI. Pengklonaan menggunakan dua enzim restriksi memiliki keuntungan yaitu tidak diperlukan verifikasi orientasi DNA sisipan.
Gambar 1 3 menunjukkan hasil
restriksi pcDNA3.l Hine/Ill dengan EcoRI
M
bp
1
2
10000 -
6000 -
3000 -
500 -
l(et�npn: : Malb DH.A lf'IM"Uler M : plasmid pcONA3.1wild type : plasmid pcON3.l din:strit:siHindlll-fooRI (5427 hp) : pibtDNA pc:DNA3.1tetfine.arisasi
AprosaO,B'l(,; 100Y; 30menit
Gambar 13. Hasil purifikasi restriksi plasmid pcDNA3.l dengan HindllI dan EcoRl
DNA sisipan CD40L yang telah berhasil diamplifikasi juga harus direstriksi dengan enzim restriksi Hindl ll dan EcoRI. Gambar 14 menunjukkan hasil purifikasi DNA sisipan setelah direstriksi dengan kedua enzim restriksi tersebut.
M
bp
1
10000 -
1000 500 -
1(--: : Mad:aONA,.....uler M 1
-
: DNA act;uv ...Cd40Idirestribidet>Pft Hindl9-Ea>RI
: p;ta ONA adj<Moned4CI {7112 bp)
Aposa0,11%; 100\f; 30 menit
Gambar 14. DNA sisipan CD40L direstriksi dengan Hindlll dan EcoRI DNA plasmid dan sisipan yang telah diisolasi menggunakan Low Melting Agarosa kemudian diligasi dengan enzim T4 DNA ligase.
Perbandingan DNA vektor dan sisipan
adalah 1 :3. Campuran reaksi ligasi diinkubasi pada suhu l6°C overnight. Hasil ligasi akan
TOPI 0
ditransformasi ke dalam sel Escherichia coli menggunakan metode heat shock.
kompeten.
Proses transformasi
Pertumbuhan _bakteri terlihat berupa koloni p�tih pada
.
.
plate sebaran hasil ligasi pcDNA 3 . 1 (+) dengan CD40L, �enunjukkan keberhasilan ligasi. Namun demikian, perlu verikasi lebih lanjut apakah koloni yang tumbuh membawa DNA sisipan CD40L. Koloni putih juga tumbuh pada kontrol positif transformasi, yaitu pcDNA
3.1 (+) wildtype ( 1 0 ng/µ1) (Tabel 1). kompeten E.
coli TOPI 0
Kontrol negati f transforrnasi yang hanya berisi sel
tidak menunjuk.kan pertumbuhan sama sekali.
Hasil perhitungan
efisiensi transformasi menunjukkan efisiensi yang tinggi yaitu sebesar 8,25
x
105 cfu/µg._
Tabet 1 . Jumlah koloni hasil transformasi Jumlah koloni
HasiI transformasi
Transformasi hasil Ji_gasi pcDNA 3 . 1 (+)
-
Transformasi hasil ligasi pcDNA 3 . 1 (+)
-
Cd401 (50 µI)
Cd40/ (200
µI)
Kontrol ligasi pcDNA 3 . 1 (+)
-
Cd40/
Kontrol positifpcDNA 3 . 1 (+) widtype ( 1 0 ng/µl) Kontrol negatif transformasi (sel kompeten)
5 23 -
1650 -
Verifikasi DNA rekombinan dengan tek.nik PCR koloni menggunakan pasangan primer vektor yaitu CMV_F dan BHG_R, pasangan primer tersebut akan mengapit daerah vektor yang membawa DNA sisipan. Hasil analisis pada gel agarosa 0,8% menggunakan marka gene
ruler DNA ladder mix menunjukkan adanya pita DNA pada lajur 1 --3, 6, dan 12 yang berrni grasi hampir sej ajar dengan marka DNA 900 pb dan kemungkinan merupakan insert
Visualisasi agarosa 0,8% hasil amplifikasi PCR koloni rekombinan dapat dilihat
CD40L.
pada gambar 1 5. bp
M
wt 1
2
3
4
s 6
7
8 9 10 11 U 13
3000 1000
•
500
Ketennpn: M :M•rbDNA�
""' 1-13 ->
: pd)NA3.lwild-type
: pd)NA3.1 Cd40I reiDmbinan : pita DNA hasil.wnplifibsiprw.-CMVMHGR (i90D bp)
Gambar 15. PCR koloni plasmid rekombinan Sebanyak 2 plasmid
re
kom binan pcDNA3.l-Cd40L yang positif mengandung sisipan
CD40L dengan verifikasi PCR kemudian dikultur ke dalam 4 ml media Luria Bertani cair dan diisolasi plasmi� untuk kemudian diverifi_kasi dengan sekuensing.
Hasil sek �ensin g gen
CD40L telah berhasil diklona ke dalam plasmi.d pcDNA3.l. Gambar 1 6 menunjukkan hasil pensejajaran plasm id rekombinan dengan sekuen CD40L awal.
pc0NAJ.IC0401..,.8HOA'
�H/..11CD.\Ol.8HGR
CO"'°"'o-rl
Cl\ltl>I COl"lteMu�
CO'Ot.ori
!
0.H'I Co1u•n•u.s
pd)NAl1C04C>L.BHO.A: COIOl.o" Cltnul Co1n•nt1u
td)HJ.l1CC»OL ..B>tGR ....... ... Ow\QjCOM.eft'HH
!( •
I
,
I
-) I
·�
I
C G � A G � G G 4 A G T � A , C C T T C A T0 A A G � l. T l 1 G T � T 1 C A T �
pc0H,A:)1CO.Ol.._8HOR COo40l.ori
C1un•1 C...,,.",.,,''
.
I
I
C040!..on
Clu1UI c-'•"'-'"
I
;. .:. ;. ;. � G C T • • � G � 0 4 T O C A • C · · � G G .& G � .& GG A T C T T T • T - ! � A A G C l A .;. l Q A O • T G C > .& C ll 4 • G G � G � • GG A � C T T 1 • 1 poc0UAJtC�L.,.6HCA
CO�o"
C IU•ulC9ft• :: · " • " ..'
'
�IC�_811GR
Cl).t:OLof'I Ornul Con'"'""''
:
....,�
Cl1.1•UICO"',
... r
•
td)+WtCO-*OL._8'.HGR a:MCl\.on
G � � � �C ! G C l T T G � � A lOCA A�OAOOiGJIG!QGATCCTC G ; ;. � a C r G C T T l O � t � 1 G C A � ' 0 4 0 G i G � T O r G O � t C C 1 C
C C T • G 1 c ;. ;. Q G � l � T ;. � C O T T � � � c - � � G � - G � G ;. � - � , ;.
I
'
I
.: · I
�
.
Ont.a1Conu11n1t
1
•
'
:• .
I
1�.1 I
I
'
I
'
'
.:.�
'
C TO ... G
:. G .:. ;. T C T "I ;. C 1 C. .:. .:. o O C. C C C . - - T .o.. CCC .:... C .11. G l '! C - r e T T .;. c I c :. ..;.. Q O C O O C .a. .I. A 1 .- . e c. c ... cs.GT "J C
c j Q .lt. G .\ G .t
'
c · c c c -c;e'! T t G C C - G C - c c .. G : c · e r 1 c ;. .: ' t T G G G C G G • c · c c c .o.GC"! 1 1 C. C G - tl C -oc .. c re t G . "' C ;. c J l G G G C G G
I
! � � l ! GC ; G C A C � CO T l 0 l 1 r O CG - � o c c , � c � u 1 r ... 1 a c ! � � 1 1 o c ; G C .O C A C G T T G l � � o c c � - o cc , • c � G 7 � ! T GC
� T C ... ;:.. T T ;. c ... .. G c 1 OG T 0 c r i e - 0 T 0 � T
... - C G - M C; G
••ONAl 1CC..OL_8HOA CO.liOl..•rl
G
pc.O"Al 1Cl).tOl.,,.BHOR CO-'OL..o"
T G � C T G � � G C & • G C C A 4 G l 0 A l CC � C � 0 A C 1 T O G � T T C T C: r G .i:. c 1 c .:.. .; G C .1. • G C C ..., ... G r o .0 1 c c .. c .... o A C r 1 � G c r r c r c
Cl1.1•u•C-••"'•1.1•
I
·� I
C C � 1 T C .t T C G T C G G C C T C T O O c · o - .1. o c c c 6 G C • G l G G .o.. T C C � 1 T C 6 T C G � c G G C C T C l G Q c f o ... � o c c c ..;.. G C ; G T G G .o. 1
I
C C T T G T C ! ;. G G - T ! T ! � e o r r � � � c - � -=- G .t � G � G ;. ;. � � � �
..oN.UtCD&.Ol_BHGR
pcOHAl1CO-.,..&HCR CQ.IOt..on
f
!
I
c c ; •Ge l G .... � c f G T G ,,. G G ... o Ii TG ..c:. :.GGC - ... i'. T J G . o. G ;. C C T T GC t G ;. :. c r G J G , G G .& 0 4 T O A 0 ,;. ,t. G G C :. - � T T G • ,;. G -'
�1C0.&.01.._IWGR CDoO<.on Oir\ut ConHn�1n
awo<.on OM:uf COl'l••n'l.1o1t.
i
�- �
p.<01!.\31CC)..IOL..8HGR ··r
I
4 T a lo. ' }'. .... G c ,I. . .;,,, c l t GG r " � f 0 c f r 0 It. A ,\ J. r GG G 4 .. ... c AG c 4 T G A � � � a c � � C � T G G l � A t f C f T Q A � A A T GG G A A A C A O C
c o ; � G ! G G 4 ; G f A A • C C T T C 4 T Q A j � � T T T t G , ;. r T C A T ;.
,t_,
"H I
A G C � l C C G l f C T • C A G T 0 0 0 C C A � C � .l. � G G £ T a ? T A � � c c 'GC � T C C G l l C T n C �O T G G O C C A &0 � £ A G G � T � T T � T A C C
..
Cl1.1t.t•I C:O ,•rt11.1•
0 �G f
,GT
T TG
.::.
� T J
,. � ..
;. G c 1 G G , G c f • c T G T Ci
I
·�
;
tG T c T rGT c
.
pcCHlAl IC:0.-:01...BttOA
CD"«.o"
Cl1.1•u•I Co"t•"'Mn
EcoRI
Gambar 16. Hasil alignment DNA sisipan dengan gen CD40L mus musculus Plasmid pcDNA3. J -Cd401 yang telah terverifik.asi dengan sekuensing kemudian akan diisolasi skala besar dan dibuat stok kultur untuk digunakan pada penelitian selanjutnya.
Hind Ill
n
I
I
m I
I
• I
I
pc0NA31P28(131_BHGR pcDNA31P28(13)_CMVF p28 Clu•tlll Consensu•
C T T A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C CG C C A A G G A C A A G A A C C C T T A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A GG A C A A G A A C C A A G C T T A AG T T C C TG A C C A C C G C C A AGG A C A A G A A C C
pc0NA31P28(131_BHGR pc0NA31P28(13)_CMVF p28 Clust•I Consensus
G G T G G G A G G A C C C C G G C A A G C T G T A C A A C G T G G A GG C C A C G G T G G G A G G A C C C C G G C A A G C T G T A C A A CG T G G A GG C C A C G G T G G G A G G A C C C CG G C A A G C T G T A C A A C G T G G A G G C C A C
50 I
60
I
I
i20
MO
1�
NO
180
190
200
I I I I I I I I A A G C T G T A C A A C G TGGAG G C C A C CAGC T A CGC A T A AG G A T A A G C T G T A C A A C G TGGAGG C C A C CA N C T A C G C A T A A G G A T
210
pc0NA31P28(13)_BHGR pcDNA31P28(13)_CMVF p28 Chatal Coni.•nsus
m
I I I I I I I I G A C C A C CG C C A AG G A C A A G A A C C G G T G G G A G G A C C C CG G C G A C C A C CG C C A A G G A C A A G A A C C G G T G G G A G G A C C C C G G C
170
pcDNA31P28(13J_BHGR pc0NA31P28(13)_CMVF p28 Clusul Consensus
80 I
I
I I I I I I I I C AG C T A C G C A T A AG G A T C C G G T TGGAGGG AGC A AG T T C C T C A G C T A CG C A T A A G G A T C C G G T TG G A G GG A G C A ; G T T C C T C A G C T A CG C A T A AG G A T C C
1m
pcDNA31P28(13)_BHGR pcDNA31P28(131_CMVF p28 Clusul Consensus
I
Ba rn HI
90
pc0NA31P28(131_BHGR pc0NA31P28{13)_CMVF p28 Clusul ConHnsus
70
I
I
230
220
2•
I I I I I I I I C C G G A A C C A A G C T T A A G T T C C TG A C C A C C G C C A A G G A C A A C C G G A A C C A A G C T T A A G T T C C T G A C C A C C G C C A A GG A C A A
I
2-5.0 I
I
260 I
I
270 I
I
280 I
pc0NA31P28(13)_BHGR p�DNA31P28(13)_CMVF p2B Clustal Cons•nsus
G A C G G T G G G A GG A C C C C G G C A AG C TG T A C A A CG T G G A G G C G A C G G T G G G A G G A C C C C G G C A A G C TG T A C A A C G T G G A G G C
pc0NA31P28(131_BHGR pcDNA31P28(131_CMVF p28 Clusul Consensu.s
C A C C AG C T A C G C A T A AG GA T C C A C T AG T C C A G T G T G G T G G C A C C AG C T A C G C A T A AG G A T C C A C T AG T C C A G T G i G G T G G
pc0NA31P28(131_BHGR pcDNAl1P28(13)_CMVF p28 Clusul Con ..nsu•
A A T T C T G C AGA T A T C C A G C � C AGTGGCG A A T T C T G C A G A T A T C C AG C A C AGTGGCG
290 I
I
I
JN I
I
I
300 I
l•O I
I
310 I
I
320 I
I
Gambar 19. Hasil sekuensing plasmid pcDNA-P28(1 3 ) Sisa ligasi kemudian ditransfonnasi ulang, kemudian dilakukan seleksi koloni terhadap plasmid rekombinan yang dihasilkan. Verifikasi sekuensing tehadap plasmid pcDNA3. J -P28(5) menunjukkan bahwa fragmen P28 telah berhasil diklona ke dalam plasmid pcDNA3 . 1 (+) (Garn bar 20).
w
�
I
I
· · · ·
·
·
I
·
• ·
I
m
· · · ·
I
�
·
I
·
I
·
� ·
·
I
·
·
70
00
I
P,1(5),_CMVF
A A OCT TA AOT 1 CCT QACCACCOCCAAGOACA AOAACCQOTGQOAGOACCCCCCCAACCT ('1" A CAA CGTGG
pU
· · · · · · AAOTTCCTOACCACCQCCAA00ACAA0AACC001000A00ACCCCGOCAAGCTQTACAACGTOG
K
L
K
F
�
· · · ·
I
· · ·
L
f
1
T
T
T
l
K
A
K
A
ACOCCACCAOCT ACOCA T AAGGA TCC
-·
AOOCCACCAQCTACOCATAAGQATCC
!
A A
T T
S S
V
V
A
A
• •
0
K K
N N
A
W
R
W
! E
D D
P P
0
G
K K
l L
V
Y
U
N
V
V
- - I -
I - - - - I - - - - I
!>29(�)..CMV,-
!
D
G 4
S S
Garn bar 20. Hasil alignment pcDNA3. l P28(5) V.10. Pengklonaan adjuvan gen VP22 ke dalam vektor plasmid pcDNA3.l(+) DNA sisipan VP22 diamplifikasi dengan template gen sintetik VP22, DNA sisipan kemudian direstriksi dengan enzim restriksi Hindlll dan BamHI (Garnbar 2 1 )
bp
bp
10000 -
3000 -
3()001000 · soo-
1000 -
100 ·
5001.llO -
Ketennpn:
M 1 •
b
z
:MaibDNA
: - f'Cll VP'22 (1.17 bp) : VP22 llunHl-Hindlll (117 bp)
Gambar 2 1 . DNA insert VP22 dan vektor pcDNA3.1 (+) Hasil ligasi dari DNA vektor dan sisipan VP22 kemudian diseleksi dengan PCR ko]oni menggunakan primer yang mengamplifikasi daerah Mutiple Cloning Sites (MCS) dari vektor plasmid pcDNA3. l(+). Berdasarkan hasil seleksi PCR (Gambar 22), beberapa kJona yang diperkirakan positif mengandung DNA sisipan Yn2 kemudian diverifikasi sekuensing (Gambar 23).
bp
1000 500 100 -
bp
Keteranpn: 1-14 : plasmid reloombinanpcDNA3.l-VP22 {388bp) : Mam DNA M Wt : plasmidwild-type(271 bp)
Garnbar 22. Hasii PCR sekuensing klona plasmid pcDNA3. l -VP22 .10
pc0NA31VP22(4J_BHOR pe.ONAl1VP22(4)_CMVF ' VPMR
&O
I J I l I I I G A G C T C T C T G GC T A O C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G O C T GAGC TC�CTOGC T A A C T AGAGAACCCACTGCTTAC �GOC l
Clusul Cons•n•u•
pcDNA31VP2:214)_8HOR pc0NA31VP22(4)_CMVI' PMR Clu·:naf Con1o•n1u1
V
:J ?.a :-o I I I I I I T • T CG A A A T T A A T A C O A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A � O C T T A T CG A A A T T A a T A C O A C T C A C T a T A G G G A G A C C C A N G C T
Hindll 100
oo
pcDNAJ1VP22(4)_8HOR pcDNA31VP22(4)_CMVF VPMR Clustal Con••n1ua
pc
_
R
ONA31VP22(4) 8HG
pcDNA.J1VP22f4l_CMVF VPMR Ctust:al Con••nt.ut.
I I I I GGC T A GCG T T T A A A C T T A A G C T G G C T O GCG T T T A a A C T T A A GC T
'------' l
1.H1 J
1.sO j
I
pc:.ONA31VP2'(4')_8HGR pcONA31VP22(4)_CMVF VPMR Clust.-1 Con$•ntus
I
I
I
1.:v I
G � C O C TG C T A C AG C T A C
$
'::V !
1
1H>· I
A C G � G G T C G T T C T G C T� C T T C T A A O C C • A C T G A A C G 1 C C A • C G T GG T C G T T C T G C T G C T T C T A A A C C � A C T G A A C G , C C A A C G T O G T C G T T C T G C T G C T l C T A A A C C � A C T G A • CG T C C A
HUI
pc0NA31VP22(4)_8HGR pc:ONA31VP22(.&)_CMVIE VPMR Cluu�I Cona•n•u�
110
TG A C G C T G C T A C A G C T A C TG • C G C T GC T A C A G C T A C
I I CGTG C T C C � G C T CG T T c i o C G � G C T C C � G C T C G T T C TG COTGCTCCAGC l C G T T C T G
Bamff ;.. l
T TG T AA T TG � � T � A T T G .1. A
.
bb �...,;:.
�1
:g..,.
;<.)1
I I r l J c T T C T CG T C C � C G T C G T C C � G C T TC T C G T C C � C G T C G T C C A C C T T CTCGTC C � CGTCGTCC�G
l
T C C T �G G AT C CAC T A N
Garn bar 23. Hasil sekuensing pcDNA3. l -VP22(4) 5.7.Pengklonaan gen HA-HSNJ tanpa daerah traosmembran dan cytotoxic tail ke daJam vektor plasmid pcDNA3-1(+)VP22 dan pcDNA3.1(+)Cd401
Tahap selanjutnya setelah semua gen berhasil dik.Jona ke dalam plasmid pcDNA3.l (+) adalah pembuatan vektor untuk fusi gen hemaglutinin dan adjuvan gen. Gen HA�TM dik.Jona
ke dalam vektor yang telah mengandung adjuvan gen, yaitu adjuvan gen CD40L, VP22, dan P28. DNA insert HALffM diamplifikasi menggunakan enzim diklona
ke dalam pcDNA 3 . l (+)CD40L.
kemudian direstriksi menggunakan enzim
Fragmen
TaqHifi polymerase, kemudian
HAf1TM basil PCR dipurifikasi,
Nhel dan Hind/JI secara sekuensial. pcDNA 3 . 1 (+)
yang telah mengandung fragmen CD40L digunakan sebagai vektor juga direstriksi dengan enzim yang sama.
Gambar 24 merupakan visualisasi hasil restriksi fragmen HA11TM dan
pcDNA3 . 1 CD40L
bp
bp
6000 5000
3000
3000
1500
--
1200 1000
1000
500
-soo
Agarosa 0,8 %, 100 V, 30 menit
Keterangan: M
1 2
Keterangan: M
: marker : pcDNA3.1(+) Cd401 uncur
: pcDNA3.1(+} Cd401- Nhel Hindi II
1
: Marker :
HAllTM - Nhel Hindlll
(1470 bp)
(6.210 bp}
Gambar 24. Restriksi DNA insert HAf1TM dan vektor pcDNA3. I CD40_L dengan enzim
Nhe1 dan HindlII
Hasil digesti fragmen HALffM dan pcDNA. l CD40L dipurifikasi dengan low melting
agarose, selanjutnya diligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase. Campuran reaksi ligasi diinkubasi 1 6°C selama 1 6 jam. Kontrol ligasi yang digunakan yaitu campuran ligasi yang hanya berisi
vektor terlinearisasi, tanpa diberi
ditransformasi ke dalam set kompeten
DNA
insert.
Hasil
ligasi
selanjutnya
Escherichia coli TOP 10 dengan metode heat shock
Hasil koloni yang tumbuh diverifikasi dengan PCR koloni dan dibuat replika koloni. Garn bar 25 merupakan visualisasi hasil PCR koloni pada agarosa 0,8%.
Berdasarkan hasil PCR
koloni, terdapat 4 koloni dari total 8 koloni yang diverifikasi, mengindikasikan membawa fragmen HAt1TM yaitu koloni no. 2,3,6, dan 7.
bp 3000 2500
-
1000 500
Agarosa 0,8%, lOOV, 30 men it Keter,rng.rn: 1-8
: rekombinan pcDNA3.l(+)Cd401-HAbTM (2523 bp)
Wt
: pcDNA3.l(+)Cd401 (1053 bp)
M
: marker
Gambar 25. PCR koloni plasmid rekombinan pcDNA3. l CD40L HA�TM Koloni yang menunjukkan hasil positif pada PCR koloni kemudian diverifikasi kembali dengan teknik digesti. Plasmid rekombinan dilinearisasi menggunakan enzim
HindIII untuk memastikan ukuran plasmid rekombfoan. Gambar 1 8 menunjukkan hasil visualisasi verifikasi digesti plasmid · rekombinan pada gel agarosa 0,8%. Hasil linearisasi plasmid rekombinan pcDNAJ.l (+)Cd401 HALffM koloni 2,3,6, dan · 7 menunjukkan pola . m igrasi antara marka DNA 6.000 dan 7.000 bp. Sesuai dengan yang diharapkan yaitu berukuran 7.680 bp, gabungan antara pcDNA3 . 1 CD40L (6.2 1 0 bp) dan .HA�TM ( 1 .470 bp).
bp
8000 6000 5000 3000
1000 soo
Agarosa 0,8%, lOOV, 30 m;.>nit Keterangan: M
: marker
Wt
: pcDNA3. l(+)Cd401-HA6TM uncut
1-8
: linearisasi pcDNA3.l(+)Cd401-HA6TM dengan Hindlll (7.680 bp)
Garn bar 26. Linearisasi rekombinan pcDNA 3. l CD40L HA6TM dengan enzim
HindIII
Analisis urutan basa nukleotida plasmid rekombinan pcDNA 3 . 1 CD40L HAlffM dilakukan dengan metode sekuensing. Plasmid rekombinan pcDNA 3. CD40L HAO.TM no 2, 3, dan 7 disekuensing dengan primer CMVF. Hasil pensejajaran sebagian hasil sekuensing menunjukkan bahwa gen HALffM telah berhasil diklona ke dalam plasmid pcDNA3.1 (+) Cd40l. Plasmid pcDNA3.1
VP22 dan gen HALiTM hasil amplifikasi PCR direstriksi
menggunakan enzim restriksi Nhel dan HindlII. Gambar 27 merupakan visualisasi gel agarosa 0,8% hasil restriksi DNA insert HALiTM dan vektor pcDNA3.1 VP22 menggunakan enzim NheI dan HindllI.
bp
bp
6000 5000 3000
1000 500
3000 1500 1200 1000
-·
500
Agarosa 0,8%, 100 V, 30 menit Keterangan: Wt
: pcDNA3.l(+) wild eype Nhel Hindlll (5.428 bp)
: rekombinan pcDNA3.l(+)VP22-
Keterangan: M
: Marka DNA
1
: H.-v.nr - Nhel Hindlll (1470 bp)
N/Jel ·Hindlll (5.545 bp) M
: marka ONA
Gambar 27. Restriksi fragmen HALffM dan vektor pcDNA3. l VP22 menggunakan enzim Nhel dan HindlII
Hasil digesti fragmen HALiTM dan pcDNA. 1 VP22 dipurifikasi dengan low melting agarose, selanjutnya diligasi menggunakan enzim T4 DNA ligase. Campuran reaksi ligasi diinkubasi 16°C selama 16 jam. Kontrol ligasi yang digunakan yaitu campuran ligasi yang hanya berisi vektor terlinearisasi, tanpa diberi DNA insert. Hasil ligasi selanjutnya ditransformasi ke dalam sel kompeten Escherichia coli TOPI 0 dengan metode heat shock. Hasil koloni yang tumbuh diverifikasi dengan PCR koloni dan dibuat replika koloni. Gambar 28 merupakan visualisasi hasil PCR koloni pada agarosa 0,8%. Seleksi PCR koloni terhadap
1 1 klon plasmid pcDNA3 . l VP22-HAlffM menunjukkan hanya terdapat 1 klon yang diduga mengandung sisipan gen HAilTM.
bp
- 3000 - 1000 - 500
Agarosa0,8%; 100V; 30 menit
ll:eteninpn: 1-11
: plasmid relcombinanpcDNA 3.1-VP22HMTM (l.BS8bp)
M
: Marita DNA
wt
: plasmid wild-type (388 bp)
Garnbar 28. PCR koloni pcDNA3 . 1 VP22 HA6TM Koloni
l
yang
menunjukkan basil positif pada PCR koloni kemudian diveri ftkasi
kembali dengan teknik digesti menggunakan enzim insert HAilTM
NheI dan HindJ.11. Keberadaan DNA
diketahui dari hasil digesti, yaitu hasil digesti menunjukkan terbentuknya 2
pita spesifik yang berukuran
5.545 hp yang merupakan vektor pcDNA3 . 1 VP22 dan pita
berukuran 1 .470 bp yang merupakan fragmen HAilTM (Garnbar 29).
6000
�888
1500
M88
pcON.0.3.1l•)VP22 15.S•S bp) -- '--' --
1
HA�Tl\!(l
500
470bp)
I
Agaros.;i 0,8%, 100V, 30 menit Keterangan:
M Wt
: Marka ONA
1
: rekombinan pcDNA3.l(+)VP22 H.AllD-1 - Nhel Hindll l
: rekombinari pcDNA3.l{+)VP22 H.�.lff'.\l 1111c11r
Gambar 29. Verifikasi digesti rekombinan pcDNA3.1 VP22 HAilTM
Analisis urutan basa nukleotida plasmid rekombinan pcDNA 3 . 1 dilakukan dengan metode sekuensing.
VP22 HA�1M
Hasil pensejajaran menunjukkan bahwa fragmen
HA�TM telah berhasiJ diklona ke dalam plasmid pcDNA3.1 VP22.
6.
KESIMPULAN
I.
Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3. l P28
2.
Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3 . I HA�CTM
3.
Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3.1 Cd401
4.
Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3 . l VP22
5.
Telah didapatkan klona plasmid pcDNA3.1 Cd401-HA�CTM
6.
Telah didapatkan klona plasmid pcDNA 3 . l VP22-HA�CTM
7.
TARGET PENCAPAIAN TAHUN I
1.
Diperoleh _prediksi struktur sekunder dan tersier protein fusi
2.
Diperoleh konstruksi dan ekspresi vaksin DNA,
3.
Diperoleh konstruksi vektor dan ekspresi antigen rekombinan virus pada sistem ekspresi
56
prokariota 4. Diperoleh konstruksi vektor dan ekspresi VLP pada sistem ekspresi baculovirus
PERSETUJUAN ATASAN
Jakarta, 01 Februari 2013
MEN YETUJU I : Ketua Pelaksa na
Kepala Bidang Biomedis
�
dr. Roselinda, M. Epid N I P. 19650409 199203 1 002
N I P. 19580701 1987012001
D I SETUJUI,
Ketua Panitia Pembin a llmiah
Dr.drg. Magdarina 0.A,MSc N IP 195012061984022001
N I P 19621119 198803 1 001
