LAMPIRAN. Lampiran A: Alur Kerja Isolasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan

56

LAMPIRAN

Lampiran A: Alur Kerja Isolasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan

Air laut Dimasukkan ke dalam botol Winkler steril Diisolasi bakteri dengan pengenceran 100, 10-1, 10-3 Dibiakkan dalam cawan petri steril yang berisi media Bushnell Hass Agar (BHA) yang mengandung 2% naftalen dengan metode cawan sebar Diinkubasi selama 15-20 hari pada suhu 33ºC Isolat tumbuh Dimurnikan pada media TSA (Tripton Soya Agar) Diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 33ºC Diamati ciri morfologi koloni Biakan murni

Universitas Sumatera Utara

44 57 Lampiran B: Pembuatan Suspensi Isolat Bakteri 108 sel/ml Untuk Pengujian

Isolat bakteri Diambil 1-2 ose Dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi air laut steril Dihomogenkan dengan vorteks Dibandingkan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard yang setara dengan 108 CFU/ml Suspensi isolat bakteri


58 45 Lampiran C: Alur Kerja Pengujian Kemampuan Bakteri dalam Mendegradasi Naftalen Isolat bakteri Dibuat pengenceran 108 sel/ml yang disamakan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standarad Suspensi bakteri Sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam botol yang berisi 25 ml media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2% naftalen Diinkubasi pada suhu 30ºC dengan digoyang di atas shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm selama 15 hari Dilakukan estimasi kepadatan sel bakteri pada hari ke-5, 10, 15 dengan metode SPC (Standard Plate Count) Kultur Cair Bakteri Diatur pH media hingga pada 12,0 menggunakan NaOH 0,1N Disaring dengan menggunakan kertas saring

dengan

Filtrat Dimasukkan ke dalam corong pisah 50 ml Diekstraksi dengan n-hexane 10 ml selama 15 menit dengan 3x ulangan Didiamkan hingga terbentuk 2 lapisan

Lapisan Atas

Lapisan Bawah Dimasukkan ke dalam sample cup sebanyak 5 ml Diinjeksikan sebanyak 1 µl ke dalam Chromatografi Gas Dianalisis jumlah naftalen yang tersisa pada media dengan cara mensubstitusikan nilai luas area ke persamaan kurva standard Chromatografi Gas

Hasil


59 46 Lampiran D: Pembuatan Kurva Standar Naftalen Untuk Kromatografi Gas 0,1 gr Naftalen Dilarutkan dengan N-heksan Dibuat dengan konsentrasi 2 ppm, 5 ppm,100 ppm, 1000 ppm, dan 1200 ppm Dihomogenkan dengan membolak balik labu takar sehingga naftalen larut Diinjeksikan masing- masing konsentrasi sebanyak 1 µl ke dalam Chromatografi Gas Hwlet Packard 6890 Luas Area Ditentukan persamaan garis regresi kurva standar naftalen dengan memplot luas area dan konsentrasi naftalen dengan metode Least Square Kurva Standar Naftalen


47 60 Lampiran E: Alur Kerja Estimasi Kepadatan Sel Isolat Bakteri dengan Metode SPC

Sampel hasil perlakuan Diencerkan sampai konsentrasi 10-7 Diinokulasikan ke dalam cawan petri yang berisi media Plate Count Agar Disebar dengan menggunakan hockeystik Diinkubasi selama 24-48 jam pada suhu 32ºC Dihitung kepadatan sel isolat Kepadatan sel isolat


48 61 Lampiran F: Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Dibuat pengenceran 108 sel/ml yang disamakan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard Suspensi bakteri Sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam botol yang berisi 30 ml media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2% dekstrose Diinkubasi pada suhu 30ºC dengan digoyang di atas shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm selama 15 hari Dilakukan estimasi kepadatan sel bakteri pada hari ke15 dengan metode SPC (Standard Plate Count) Kultur Cair Bakteri Disaring dengan menggunakan kertas saring

Residu

Supernatan

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 ml Ditambahkan 2 ml aquadest Ditambahkan 4 ml n-heksan Divorteks selama 10 detik Didiamkan selama 1 menit Diamati terbentuknya kekeruhan dari adanya emulsi yang stabil Diukur ketebalan emulsi yang terbentuk dengan menggunakan jangka sorong Hasil


62 49 Lampiran G: Alur Kerja Pembuatan Kurva Standar Rhamnosa

Rhamnosa

Dilarutkan dengan Sodium Bikarbonat (NaHCO3) 0,05 M dengan konsentrasi 0 (blanko), 10 ppm, 50 ppm, 80 ppm, dan 400 ppm Dimasukkan sebanyak 2 ml ke dalam tabung reaksi Dihomogenkan dengan vorteks Ditambahkan 3,6 ml larutan orsinol Dididihkan Didinginkan pada suhu ruang selama 15 menit Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 421 nm Absorbansi Ditentukan persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa dengan memplot absorbansi dan konsentrasi rhamnosa dengan metode Least Square Kurva Standar Rhamnosa


63 50 Lampiran H:

Alur Kerja Produksi Biosurfaktan dan Kuantifikasi dengan Metode Orsinol yang Dimodifikasi

Isolat bakteri Dibuat pengenceran 108 sel/ml yang disamakan dengan kekeruhan Mac Farland 0,5 standard Suspensi bakteri Sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam botol yang berisi 25 ml media Bushnell Hass Broth yang mengandung 2% naftalen Diinkubasi pada suhu 30ºC dengan digoyang di atas shaker pada kondisi gelap dengan kecepatan 150 rpm selama 15 hari Kultur Cair Bakteri Disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 10 menit

Supernatan

Pellet Dimasukkan sebanyak 4 ml ke dalam tabung reaksi Masing-masing tabung diekstrak dengan 2 ml diethylether selama 5 menit Diulangi sampai 3 kali Diambil lapisan ether, dikeringkan, dilarutkan kembali dalam 2 ml 0,05 M sodium bikarbonat Dihomogenkan dengan vorteks Ditambahkan 3,6 ml larutan orsinol Dididihkan selama 20 menit Didinginkan pada suhu ruang selama 15 menit Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 421 nm

Hasil


51 64 Lampiran I: Komposisi Media Bushnell-Hass, Larutan Standar Mac Farland, dan Larutan Orsinol a. Komposisi Media Bushnell-Hass Agar per Liter (Atlas, 1946) 1. KH2PO4

= 1,0 gr

2. K2HPO4

= 1,0 gr

3. NH4NO3

= 1,0 gr

4. MgSO4. 7H2O

= 0,2 gr

5. FeCl3

= 0,05 gr

6. CaCl2. 2H2O

= 0,02 gr

7. Agar

= 20 gr

Kemudian seluruh komposisi ini dilarutkan dengan air laut dan disterilkan dengan autoklaf. b. Komposisi Larutan Mac Farland (Lorian, 1980) Sebanyak 0,5 ml BaCl2 0,048 M ditambahkan ke dalam 99,5 ml H2SO4 0,35 N. Kemudian divorteks sampai homogen. c. Komposisi Larutan Orsinol (Chandrasekaran & Be Miller, 1980; Koch et al., 1991) sebanyak 100 mg orsinol dilarutkan dalam 100 ml H2SO4 53%, kemudian didiamkan selama 12 jam hingga warna kuning sempurna.


52 65 Lampiran J : Penentuan Kurva Standar Naftalen dan Kurva Standar Rhamnosa a. Penentuan Kurva Standar Naftalen

Std. No.

Konsentrasi Naftalen (ppm)

Luas Area

1

2

3,331

2

5

8,358

3

10000

11353,593

4

12000

13593,468

Kurva Standar Naftalen Untuk menentukan persamaan garis regresi kurva standar naftalen digunakan metode Least Square, masukkan nilai konsentrasi naftalen sebagai nilai X dan nilai luas area sebagai Y. Tabel penentuan persamaan garis regresi kurva standar naftalen metode Least Square No

X

1 2 2 5 3 10000 4 12000 n=4  X  22007

X = 5501,75

Y

X2

3,331 4 8,358 25 11353,593 108 13593,468 144 x 106  Y  24958,75  X 2=

Y = 6239,6875

244000029

Y2

XY

11,095561 69,856164 128904074 184782372,3  Y 2=

6,662 41,79 113535930 163121616  XY =

313686527,3

276657594,5

Untuk mencari nilai R (Regresi) masukkan nilai yang diperoleh ke rumus

berikut : R =

( X)( Y) n  ( X ) 2   ( Y) 2  2 2  X    Y   n   n  

 XY 

R= 1


53 66 Dan untuk mencari persamaan garis dari data dan kurva di atas, masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut:

Y = a  bX b=

Y = a  bX

n ( XY)  ( X)( Y)

a = Y - bX

n ( X 2 )  ( X ) 2

b = 1,1336

= 3,1159

Dari nilai a dan b yang diperoleh dari data di atas, maka persamaan kurva standar naftalen adalah: Y = 1,1336X + 3,1159. Dimana Y = Luas Area X = Konsentrasi naftalen (ppm)

Tabel Hasil Analisa Naftalen pada Sampel

Sampel

Luas Area

Konsentrasi Naftalen (ppm)

Sp 4

44,916

36,87

Sp 7

33,211

26,55

Sp 10

2809,472

2475,61

Sp 13

12317,643

10863,20


54 67 Kurva Analisa Naftalen dengan Kromatografi Gas Konsentrasi Naftalen 2 ppm

Konsentrasi Naftalen 5 ppm


68 55 Konsentasi Naftalen 10000 ppm

Konsentrasi Naftalen 12000 ppm


56 69 Kurva Analisa Sp 4

Kurva Analisa Sp 7


57 70 Kurva Analisa Sp 10

Kurva Analisa Sp 13


58 71 b. Penentuan Kurva Standar Rhamnosa No 1 2 3 4

Kosentrasi Rhamnosa (ppm) 10 50 80 400

Absorbansi 0,152 0,351 0,483 2,137

Untuk menentukan persamaan garis regresi kurva standar rhamnosa digunakan metode Least Square, masukkan nilai konsentrasi rhamnosa sebagai nilai X dan nilai absorbansi sebagai nilai Y. Tabel Penentuan Persamaan Regresi Kurva Standar Rhamnosa Metode Least Square No

X 10 50 80 400 n=4  X  540

X = 135

Y 0,152 0,351 0,483 2,137  Y  3,123

X2 100 2500 6400 160000 2  X  169000

Y2 0,023104 0,123201 0,233289 4,566769  Y 2  4,9463

XY 1,52 17,55 38,64 854,80  XY  912,51

Y = 0,780

Untuk mencari nilai R (Regresi) masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut :

R=

( X)( Y) n 2  ( X )   ( Y ) 2  2 2  X    Y   n   n  

 XY 

R= 0,9998


59 72 Dan untuk mencari persamaan garis dari data dan kurva di atas, masukkan nilai yang diperoleh ke rumus berikut:

Y = a  bX b=

Y = a  bX

n ( XY)  ( X)( Y) n ( X 2 )  (  X ) 2

b = 0,0051

a = Y - bX = 0,0911

Dari nilai a dan b yang diperoleh dari data di atas, maka persamaan kurva standar naftalen adalah: Y = 0,0911 + 0,0051X. Dimana Y = Absorbansi X = Konsentrasi biosurfaktan (ppm) Tabel Hasil Analisa Absorbansi dan Konsentrasi Biosurfaktan pada Sampel Sampel

Absorbansi

Sp 01 Sp 02 Sp 03 Sp 04 Sp 05 Sp 06 Sp 07 Sp 08 Sp 09 Sp 10 Sp 11 Sp 12 Sp 13

0,187 0,172 0,177 0,474 0,195 0,323 0,405 0,286 0,219 0,205 0,186 0,180 0,166

Konsentrasi Biosurfaktan (ppm) 18,763 15,806 16,786 75,180 20,455 45,531 61,547 38,298 25,124 22,322 18,564 17,467 14,786


73 60 Lampiran K : Data dan Analisis RAL Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Laut Belawan, Sumatera Utara a. Tabel Data Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Laut Belawan, Sumatera Utara Isolat Ketebalan Emulsi (mm) Bakteri U1 U2 U3

Sp 01 Sp 02 Sp 03 Sp 04 Sp 05 Sp 06 Sp 07 Sp 08 Sp 09 Sp 10 Sp 11 Sp 12 Sp 13

10,91 3,62 4,54 18,12 6,10 15,72 15,04 12,92 13,32 6,72 6,05 2,63 2,63

9,82 3,34 5,03 20,72 4,52 12,56 15,72 12,03 14,01 7,34 6,86 3,34 2,34

9,62 4,13 5,95 17,41 5,03 14,56 17,05 13,94 13,81 7,05 5,86 3,42 3,42

Total

30,35 11,09 15,52 56,25 15,65 42,84 47,81 38,89 41,14 21,11 18,77 9,39 8,39

(mm)

Rata-Rata Nilai Hasil Konversi ke ml Duncan

10,12 3,70 5,17 18,75 5,22 14,28 5,94 12,96 13,71 7,04 6,26 3,13 2,80

1,56 0,57 0,79 2,89 0,80 2,19 2,45 1,99 2,11 1,08 0,96 0,48 0,43

fF kK** IjIJ aA* jJ cC* bB* eE dD gG hH lL** mM**

Keterangan : U = Ulangan ` * = Tiga nilai aktivitas tertinggi ** = Tiga nilai aktivitas terendah

b. Tabel Analisi RAL (Rancangan Acak Lengkap) Screening Aktivitas Biosurfaktan Isolat Bakteri Laut Belawan SK

DB

Perlakuan 12 Galat 26 Total 38 ** SK DB JK KT Fh

JK

1053,91 20,72 1074,63

KT

87,82 0,80 -

Fh

Ft

109,77** -

5% 2,96

1% 2,15

= Berbeda sangat nyata = Sumber Keragaman = Derajat Bebas = Jumlah Kuadrat = Kuadrat Tengah = Faktor Hitung


7461 Lampiran L: Dokumentasi Penelitian

a. Uji Biokimia Sederhana Isolat Bakteri Laut Belawan

Uji Hidrogen Sulfida (TSIA)

Uji Sitrat

b. Uji Potensi Isolat Bakteri Laut Belawan pada Media Bushnell-Hass Broth

c. Ekstraksi Media Bushnell-Hass Broth untuk Analisa Naftalen Sisa Degradasi


62 75 d. Emulsifikasi pada Screening Aktivitas Biosurfaktan

Keterangan : a. Lapisan N-heksan b. Lapisan Emulsi c. Lapisan Air Alat-Alat Penelitian

Kromatografi Gas Hwlet Packard 6890

Spektrofotometer UV-Visibel Shimadzu 1240


LAMPIRAN. Lampiran A: Alur Kerja Isolasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan

Recommend Documents