LAMPIRAN
Lampiran 1. Tatacara analisis kimia limbah tanaman jagung a.
Analisis Kadar Air (SNI 01-2891-1992)
Cawan alumunium yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya diisi sebanyak 2 g sampel lalu ditimbang (W1) kemudian dimasukkan ke dalam oven suhu 105 0C selama 1-2 jam. Cawan alumunium dan sampel yang telah dikeringkan dimasukkan ke dalam desikator kemudian ditimbang. Ulangi pemanasan sampel sampai dicapai bobot konstan (W2). Sisa contoh dihitung sebagai total padatan dan air yang hilang sebagai kadar air. Kadar Air (%) = (W1-W2) W1 b.
x 100%
Kadar Abu (AOAC, 1995)
Sebanyak 2 g contoh ditimbang dalam cawan porselin yang telah diketahui bobotnya (A), kemudian diarangkan dengan menggunakan pemanas bunsen hingga tidak mengeluarkan asap lagi. Cawan porselin berisi contoh (B) yang sudah diarangkan kemudian dimasukkan ke dalam tanur bersuhu 6000C selama 2 jam untuk mengubah arang menjadi abu (C). Cawan porselin berisi abu didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga mencapai bobot tetap. Kadar Abu (%) = (C-A) B c.
x 100%
Kadar Protein (AOAC, 1995)
Sebanyak 0.1 g contoh dimasukkan ke dalam labu kjeldahl lalu ditambahkan 2.5 ml H2SO4 pekat, 1 g katalis dan beberapa butir batu didih. Larutan didestruksi hingga menghasilkan larutan jernih kemudian didinginkan. Larutan hasil destruksi dipindahkan ke alat destilasi dan ditambahkan 15 ml NaOH 50%. Labu erlenmeyer yang berisi 25 ml HCl 0.02 N dan 2-4 tetes indikator mengsel (campuran metil merah 0.02% dalam alkohol dan metil biru 0.02% dalam alkohol (2:1)) diletakkan dibawah kondensor. Ujung tabung kondensor harus terendam dalam larutan HCl. Destilasi dilakukan sampai volume larutan dalam erlenmeyer mencapai 2 kali volume awal. Ujung kondensor dibilas dengan akuades (ditampung dalam erlenmeyer). Larutan yang berada dalam erlenmeyer dititrasi dengan NaOH 0.02 N hingga diperoleh perubahan warna dari hijau menjadi ungu. Setelah itu dilakukan pula penetapan blanko. Kadar protein kasar = (A-B) x N x 0.014 x 6.25 x 100% W Keterangan : A = ml NaOH untuk titrasi blanko N = normalitas NaOH d. Kadar Lemak (AOAC, 1995)
B = ml NaOH untuk titrasi contoh W = bobot contoh (g)
Sebanyak 2 g contoh bebas air diekstraksi dengan pelarut organik heksan dalam alat soxlet selama 6 jam. Contoh hasil ekstraksi diuapkan dengan cara diangin-anginkan dan dikeringkan dalam oven bersuhu 1050C. Contoh didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Kadar lemak = bobot lemak bobot contoh e.
x 10
Kadar Serat Kasar (AOAC, 1995)
Sebanyak 2 g contoh dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 ml dan ditambahkan 100 ml H 2SO4 0.325 N. Kemudian dihidrolisis dalam otoklaf selama 15 menit pada suhu 1050C dan didinginkan serta ditambahkan NaOH 1.25 N sebanyak 50 ml. Kemudian dilakukan hidrolisis kembali dalam otoklaf
selama 15 menit. Contoh disaring dengan kertas saring yang telah dikeringkan dan diketahui bobotnya. Kertas saring tersebut dicuci berturut-turut dengan air panas, 25 ml H2SO4 0.325 N lalu dengan air panas dan terakhir menggunakan aceton atau alkohol 25 ml. Kertas saring tersebut dikeringkan dalam oven bersuhu 1050C selama 1 jam dan dilanjutkan sampai bobotnya tetap. Kadar serat ditentukan dengan rumus : Kadar serat kasar (%) = A – B x 100% C Keterangan : A = bobot residu serat dalam kertas saring (g) C = bobot bahan awal (g) f.
B = bobot kertas saring kering (g)
Kadar Karbohidrat (By Difference) Kadar karbohidrat dihitung dengan rumus sebagai berikut : Kadar Karbohidrat (%) = 100% - (A + B + C + D+E)
Keterangan : A = Kadar Abu B = Kadar Protein C = Kadar Lemak D = Kadar Air E = Kadar Serat Kasar
Lampiran 2. Tatacara karakterisasi limbah tanaman jagung (Konversi Biomaterial-LIPI) a.
Biomassa-UPT
Kadar Air
Cawan kosong (ukuran medium) diletakkan dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan cawan kosong tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Cawan kosong tersebut ditimbang. Bahan masing-masing ditimbang 2 gram ke dalam cawan. Masukkan cawan yang telah berisi bahan ke dalam oven 105oC selama 16-24 jam. Pindahkan menggunakan penjepit ke desikator untuk didinginkan selama 30 menit. Cawan berisi bahan tersebut ditimbang. Kadar air% (bk) = (berat awal sampel – berat sampel akhir) x 100 berat sampel awal b.
Kadar Bahan Ekstraktif
Labu didih ukuran 250 ml disiapkan dalam oven (105 oC) atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan labu kosong tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Labu kosong tersebut ditimbang. Keran air dicek menyala atau tidak sebagai pendingin sokhlet. Siapkan kertas saring segi empat (sebagai kokon), tali pengikat, gunting, kapas, dan pensil 2B. Masukkan bagas masing-masing sebanyak 3 gram (berat kering oven) ke dalam kokon, tutup dengan kapas dan ikat dengan tali, kemudian tuliskan kode sampel pada kokon menggunakan pensil 2B. Kokon dipasangkan pemberat yaitu magnetic stirer. Masukkan kokon pada perangkat sokhlet dan tuang pelarut alkohol-benzene (1:2) sebanyak sekitar 2/3 isi labu didih. Ekstraksi selama 6 jam pada suhu sekitar 90 oC (set angka 50 pada hot plate), keluarkan kokon dari sokhlet, masukkan ke oven 105 oC semalam. Masukkan kembali pelarut dalam wadahnya, sementara labu yang berisi hanya zat ekstraktif di dalam oven 105oC, keringkan semalam. Masukkan labu yang berisi zat ekstraktif ke desikator selama 30 menit, kemudian timbang. Catatan : sampel yang telah bebas ekstraktif dipisahkan untuk uji klason lignin dan holoselulosa. c.
Klason Lignin
Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut, sedangkan cawan digunakan untuk mengukur kadar air bagas bebas ekstraktif (lihat prosedur pengukuran kadar air, namun berat bagas diganti hanya 0,5 gram). Siapkan labu takar ukuran 50 ml untuk membuat larutan H2SO4 72%. Masukkan bagas bebas ekstrakif sebanyak 0.5 gram kering ke dalam beaker glass ukuran 50 ml. Selanjutnya masukkan 7.5 ml H2SO4 72%. Diaduk sesekali (dapat digunakan dengan menggunakan magnetic stirer dan memasang angka 10 pada stirer plate) selama 4 jam pada suhu kamar (dilakukan dengan menuangkan air sebelum pengadukan sekitar beaker glass yang telah disangga cawan petri), masukkan bagas yang telah diaduk selama 4 jam tersebut ke dalam erlenmeyer ukuran 300 ml. Tambahkan masing-masing 280 ml akuades ke dalam erlenmeyer. Tutup erlenmeyer dengan alumunium foil rangkap dua dan diautoklaf 121oC selama 15 menit (pada autoklaf pasang timer +20, sehingga menjadi 35). Saring langsung dengan gelas filter IG3. Cuci dengan air panas masing-masing 100 ml. Keringkan gelas IG3 yang telah berisi filtrat pada suhu 105oC selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang. Catatan : Pembuatan H2SO4 72% yaitu tuangkan 37.89 ml H2SO4 95% ke dalam labu takar 50 ml, kemudian secara perlahan tambahkan akuades sampai tanda tera. d.
Holoselulosa
Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut. Masukkan bagas ekstraktif sebanyak 1.5 gram kering ke dalam erlenmeyer 100 ml. Kemudian masukkan masing-masing 90 ml akuades, 2.4 ml NaClO 2 , 25% dan 0.12 ml asam asetat glasial 100%. Tutup dengan plastik tahan panas kemudian alumunium foil rangkap, panaskan dalam waterbath selama 1 jam (gunakan masker udara). Kemudian tanpa
menunggu dingin tambahkan masing-masing 2.4 ml NaClO2 25% dan 0.12 ml asam asetat glasial 100% berulang-ulang setiap jam sampai serbuk bagas berwarna putih (untuk TKKS 2 x penambahan, untuk hardwood 3x penambahan, untuk softwood 2x penambahan). Serbuk bagas yang telah menjadi putih segera dimasukkan ke dalam gelas filter IG3 sambil divakum, sementara menunggu penyaringan siapkan nampan yang telah diberi es batu dan air untuk memadamkan erlenmeyer yang belum disaring. Cuci dengan air dingin 250 ml pada setiap bagas. Bilas dengan aseton. Keringkan gelas filter IG3 yang telah berisi filter pada suhu 105 oC selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian timbang. Catatan : Hasil penyaringan holoselulosa siap digunakan untuk persiapan kadar alfaselulosa. e.
Alfaselulosa
Siapkan gelas filter IG3 kosong dan cawan ukuran kecil dalam oven sehari atau minimal 3 jam sebelum pengujian. Masukkan gelas IG3 kosong dan cawan tersebut dalam desikator sekitar 30 menit. Timbang gelas IG3 kosong tersebut. Timbang 2 labu takar 100 ml untuk membuat larutan NaOH 17.5%. Letakkan di atas cawan penyangga yang telah dituang air di stirer plate yang dipasang pada angka 10 selama 30 menit. Tambahkan maing-masing 12.5 ml akuades, biarkan selama 5 menit. Saring menggunakan gelas filter IG3. Cuci dengan akuades selama sekitar 3 menit. Cuci dengan 20 ml asam asetat glasial 10%. Cuci masing-masing dengan 500 ml air panas. Keringkan glass filter IG3 yang telah berisi filter pada suhu 105oC selama 16-24 jam. Dinginkan dalam desikator selama 30 menit kemudian ditimbang. Catatan : Pembuatan NaOH 17.5% : larutkan 17.5 gram NaOH pure pellets ke dalam labu takar 100 ml dengan akuades sampai tanda tera. Pembuatan asam asetat 10% : larutkan 10 ml asam asetat glasial 100% ke dalam labu takar 100 ml dengan akuades sampai tanda tera.
Lampiran 3. Diagram alir perlakuan awal
Limbah tanaman jagung (40 mesh) + air (1:5 (b/v)) Delignifikasi (1jam, 74,60C)
Air + Lignin
Ca(OH)2 7,3% (b/b)
Air
Pencucian dan Penyaringan
Air cucian +Lignin
Limbah tanaman jagung hasil delignifikasi
Limbah tanaman jagung hasil delignifikasi + air (1:5 (b/v))
Air
Hidrotehermal I (1jam, 121 0C)
Air + wax
Pencucian dan Penyaringan
Air cucian + wax
Limbah tanaman jagung hasil hidrothermal I
Limbah tanaman jagung hasil hidrothermal I + air (1:5 (b/v))
Hidrothermal II (20 menit, 180 0C)
Cairan hasil hidrothermal II
Air
Pencucian dan Penyaringan
Air cucian
Limbah tanaman jagung hasil hidrothermal II
Lampiran 4. Tatacara analisis parameter fermentasi a.
Total Biomassa (Hartoto, 1992)
Sebanyak 1.5 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang telah diketahui bobot awalnya. Setelah itu sampel disentrifugasi pada kecepatan 13,000 rpm selama 5 menit. Kemudian dilakukan pemisahan antara supernatan dengan biomassanya. Tabung eppendorf yang telah berisi biomassa dimasukkan aquades steril sebanyak 1.5 ml kemudian dilakukan sentrifugasi kembali. Pemisahan aquades dan biomassa dilakukan, kemudian tabung eppendorft yang berisi biomassa dikeringkan pada suhu 50oC selama 24 jam. Bobot kering biomassa adalah bobot tabung yang berisi biomassa yang telah dikeringkan dikurangi dengan bobot awal tabung. Bobot sel kering (g/l) = bobot biomasssa kering (g) volume sampel (l) b.
Kadar Etanol
Pengukuran kadar etanol sampel dilakukan menggunakan GC (Gas Chromatography). Penentuan dilakukan dengan membandingkan waktu retensi sampel dengan waktu retensi standard etanol. Standard etanol yang diinjeksikan dengan konsentrasi 99.8% (v/v). Kadar etanol yang terdapat dalam sampel dihitung dengan menggunakan persamaan berikut : Kadar etanol =
c.
Luas area sampel x [standard] Luas area standard
Penetapan Gula Total Metode Fenol H2SO4 (Dubois et al, 1956)
Sebelum melakukan pengujian sampel maka perlu diketahui kurva baku fenol yang digunakan. Pembuatan kurva baku mengandung 0, 10, 20, 30, 40 dan 60 ppm glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 5 ml larutan fenol 5 persen dan dikocok. Kemudian 5 ml asam sulfat pekat ditambahkan dengan cepat. Biarkan selama 15 menit. Absorbansinya diukur pada 490 nm. Pengujian sampel sama dengan pembuatan kurva baku fenol hanya 2 ml larutan glukosa diganti dengan 2 ml sampel. d.
Penetapan Gula Pereduksi Hidrolisat Metode DNS (Miller, 1959)
Prinsip metode ini adalah dalam suasana alkali gula pereduksi akan mereduksi 3,5dinitrosolisilat (DNS) membentuk senyawa yang dapat diukur absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm. Kurva baku dibuat dengan mengukur nilai gula pereduksi pada glukosa 0.2 – 0.5 mg/l. Kemudian nilai gula pereduksi dicari dengan metode DNS. Hasil yang didapatkan diplotkan dalam grafik secara linier. Contoh sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 3 ml pereaksi DNS, dipanaskan dalam air mendidih selama 5 menit, kemudian didinginkan sampai suhu kamar. Ukur pada panjang gelombang 550 nm.
Lampiran 5. Diagram alir pembuatan etanol melalui sakarifikasi dan fermentasi simultan pada limbah tanaman jagung
Buffer sitrat fosfat pH 5 + cairan hasil hidrothermal II (1:1 (v/v))
Pencampuran
Substrat cair fermentasi 40 ml
Kultur mikroorganisme pada media agar 48 jam, 300C, aerobik
Limbah tanaman jagung setelah perlakuan awal 2,75 g Hidrolisis enzim (24 jam, 50 0C) Selulase 7 IU/g selulosa + Xilanase 3 IU/g hemiselulosa
Nutrien fermentasi (Urea 24%) Sakarifikasi dan Fermentasi Simultan (Kondisi Anaerobik, 32oC) Selulase 7 IU/g selulosa + Xilanase 3 IU/g hemiselulosa + Β-Glucosidase 1 IU/g selulosa
Analisis produk (0, 12, 24, 48,72 dan 96 jam)
Inokulasi pada media cair, 24 jam, aerobik, suhu ruang, 100 rpm
Starter mikroorganisme 10% (v/v) (Biakan Zymomonas mobilis, biakan campuran Zymomonas mobilis dan Pichia stipitis, dan biakan Pichia stipitis)
Lampiran 6. Kurva baku gula pereduksi a.
Penetapan baku gula pereduksi
Konsentrasi Glukosa (mg/ml)
Absorbansi (OD)
0.00
0.000
0.10
0.271
0.15
0.497
0.20
0.709
0.25
0.919
Blanko
b.
Kurva baku
0.079
Lampiran 7. Kurva baku gula total a.
Penetapan kurva baku gula total
Konsentrasi Xilosa (mg/ml)
Absorbansi (OD)
0.00
0.000
0.01
0.127
0.02
0.249
0.03
0.441
0.04
0.521
0.05
0.675
0.06
0.694
0.07
0.863
Blanko
b.
Kurva baku
0.106
Lampiran 8. Karakterisasi limbah tanaman jagung
Hasil Analisis Proksimat No. 098/13.11.2/PM/2010
Jenis Sampel : limbah tanaman jagung Kadar Abu %
Kadar Lemak
Kadar
(bk)
% (bk)
% (bk)
Protein
Kadar
Serat
Kadar
Kasar
Karbohidrat
% (bk)
(by diff) % (bk)
Ulangan 1
2.09
0.54
4.15
27.54
65.68
Ulangan 2
1.90
0.59
4.16
26.87
66.48
Rata-rata
2.00
0.57
4.16
27.21
66.06
Kadar
Air
% ( bb)
Kadar Abu
Kadar Lemak
Kadar
% (bb)
% (bb)
Protein
%
(bb)
Kadar
Kadar
Serat Kasar
Karbohidrat
% (bb)
(by diff) % (bk)
Ulangan 1
13.21
1.81
0.47
3.60
23.90
57.01
Ulangan 2
13.00
1.65
0.51
3.62
23.38
57.84
Rata-rata
13.11
1.73
0.49
3.61
23.64
57.42
Lampiran 9. Data biomassa total pada cairan hasil sakarifikasi dan fermentasi simultan
Biomassa Biakan
Waktu (jam) (g/l) 0
0.60
12
0.67
24
0.80
48
1.07
72
1.60
96
1.53
0
0.87
12
0.93
Zymomonas mobilis dan
24
1.27
Pichia stipitis
48
1.57
72
1.97
96
1.77
0
0.53
12
0.67
24
0.87
48
1.60
72
1.87
96
1.47
Zymomonas mobilis
Pichia stipitis
Lampiran 10. Data pH pada cairan hasil sakarifikasi dan fermentasi simultan
pH Biakan
Waktu (jam) 0
6.29
12
6.08
24
5.67
48
5.61
72
5.52
96
5.47
0
6.28
12
6.10
Zymomonas mobilis dan
24
5.72
Pichia stipitis
48
5.69
72
5.56
96
5.45
0
6.33
12
6.12
24
5.98
48
5.69
72
5.47
96
5.43
Zymomonas mobilis
Pichia stipitis
Lampiran 11. Data gula pereduksi pada padatan dan cairan hasil sakarifikasi dan fermentasi simultan
Padatan
Cairan
Konsentrasi
(g/g limbah kering)
(g/l)
Gula Pereduksi (g/l)
0
0.62
12.87
12.91
12
0.55
11.35
11.38
24
0.53
8.65
8.68
48
0.44
8.54
8.57
72
0.32
6.03
6.04
96
0.29
4.54
4.56
0
0.62
12.87
12.91
12
0.61
10.56
10.60
Zymomonas mobilis dan
24
0.48
10.25
10.28
Pichia stipitis
48
0.44
5.74
5.77
72
0.44
4.26
4.28
96
0.34
4.13
4.15
0
0.62
12.87
12.91
12
0.60
12.46
12.49
24
0.60
10.59
10.62
48
0.60
10.10
10.14
72
0.59
2.04
2.07
96
0.40
1.02
1.04
Biakan
Zymomonas mobilis
Pichia stipitis
Waktu (jam)
Perhitungan : Gula pereduksi (g/l) = 2.67 x gula pereduksi di padatan (g) + gula pereduksi di cairan (g/l) 46.67 ml
Lampiran 12.
Data gula total pada padatan dan cairan hasil sakarifikasi dan fermentasi simultan
Biakan
Waktu (jam)
Padatan (g/g limbah kering)
Cairan
Konsentrasi
(g/l)
Gula Total (g/l)
0
0.77
75.539
75.58
12
0.73
32.381
32.42
24
0.69
29.222
29.26
48
0.69
21.062
21.10
72
0.52
17.155
17.18
96
0.30
11.227
11.24
0
0.77
75.539
75.58
12
0.74
21.466
21.51
Zymomonas mobilis dan
24
0.65
19.713
19.75
Pichia stipitis
48
0.65
10.679
10.72
72
0.52
5.419
5.45
96
0.51
4.250
4.28
0
0.77
75.539
75.58
12
0.74
42.021
42.06
24
0.74
21.724
21.77
48
0.70
14.109
14.15
72
0.66
1.810
1.85
96
0.34
1.453
1.47
Zymomonas mobilis
Pichia stipitis
Perhitungan : Gula total (g/l) = 2.67 x gula total di padatan (g) + gula total di cairan (g/l) 46.67 ml
Lampiran 13. Data kadar etanol pada cairan hasil sakarifikasi dan fermentasi simultan
Laboratorium Analisis Mutu dan Standardisasi (FTP UGM) Hasil Perhitungan Analisis Kadar Etanol Gas Chromatography Method
Kadar Etanol (g/l) Waktu
Zymomonas mobilis dan
(jam)
Zymomonas mobilis
Pichia stipitis
Pichia stipitis
12
4.73
0.55
1.97
24
9.31
1.34
11.68
48
10.34
4.81
13.49
72
8.36
13.49
36.93
96
1.89
10.81
5.84
