49
Lampiran 1. Karakteristik Metode GC-AOAC dan Liquid Chromatography AOAC (Wood et al., 2004)
Performance characteristics for benzoic acid in almond paste, fish homogenate and apple juice (GC method) Samples No. of laboratories Units Mean value Sr RSDr SR RSDR HoR Av recovery
Almond paste
Fish homogenate
Apple juice
8
8
8
8
8
8
mg/kg 982 36 3.7 % 33 4.7 % 0.83 100.4 %
mg/kg 1987 62 3.2 % 83 5.3 % 1.04 98.8 %
mg/kg 501 14 2.8 % 27 6.1 % 0.97 100.1 %
mg/kg 2044 40 2.0 % 76 4.3 % 0.85 98.3 %
mg/kg 41 2.6 6.1 % 5.8 14.7 % 1.62 105.9 %
mg/kg 1001 9.4 2.7 % 32 3.5 % 0.61 94.4 %
Performance characteristics chromatography method) Samples (spike level) No. of laboratories Units Mean Mean recovery % Sr RSDr r SR RSDR HoR R
for
benzoic
acid
in
orange
juice
(liquid
0.5
1
3
4
10
9 µg/ml 0.57 114.0 0.113 19.91 % 0.316 0.159 27.90 % 1.60 0.445
9 µg/ml 1.01 101.0 0.084 8.27 % 0.235 0.161 15.97 % 1.00 0.451
9 µg/ml 3.01 100.3 0.159 5.28 % 0.445 0.276 9.16 % 0.68 0.773
9 µg/ml 3.78 94.5 0.184 4.87 % 0.515 0.255 6.74 % 0.52 0.714
9 µg/ml 9.61 96.1 0.461 4.79 % 0.714 0.665 6.92 % 0.61 1.862
Key Mean The observed mean. The mean obtained from the collaborative trial data. r Repeatability (within laboratory variation). The value below which the absolute difference between two single test results obtained with the same method on identical test material under the same conditions may be expected to lie with 95 % probability. Sr The standard deviation of the repeatability.
50
RSDr The relative standard deviation of the repeatability (Sr × 100/mean). R Reproducibility (between-lab variation). The value below which the absolute difference between two single test results obtained with the same method on the identical test material under different conditions may be expected to lie with 95 % probability. The standard deviation of the reproducibility. SR RSDR The relative standard deviation of the reproducibility (SR × 100/mean). HoR The HORRAT value for the reproducibility is the observed RSDR value divided by the RSDR value calculated from the Horwitz equation.
Lampiran 2. Diagram Alir Penentuan Validasi dan Verifikasi
51
52
Lampiran 3. Tabel t
Lampiran 4. Tabel F
53
54
Lampiran 5. Diagram Alir Analisis Kualitatif Natrium Benzoat (AOAC 910.02B 1999) Persiapan Sampel b. Padatan atau semi padatan : 50-100 g bahan + 300-400 ml air
Dihancurkan dalam waring blender
Ditambah NaOH 10 % sampai alkalis
Dibiarkan 2 jam, kemudian disaring b. Cairan : 50-100 ml sampel
Ditambah NaOH 10 % sampai alkalis
Disaring dengan kapas (jika kadar gula tinggi, encerkan sampai TPT 10-15 %)
Pengujian Dipipet 100 ml atau lebih filtrat
Dimasukkan ke labu pemisah
Ditambah HCl (1+3) sampai asam, ditambah lagi 5-10 ml HCl (1+3)
Diekstrak dengan 75-100 ml eter
Dicuci ekstrak eter tiga kali dengan masing-masing 5 ml air
@
55
@
Dimasukkan ekstrak eter ke pinggan porselin, diuapkan dalam penangas air Dilarutkan residu dalam air (jika perlu, panaskan sampai 80-85oC,10 menit)
Ditambah beberapa tetes NH3 sampai basa Diuapkan untuk menghilangkan kelebihan NH3 Dilarutkan residu dengan air panas (saring jika perlu)
Ditambah beberapa tetes FeCl3 0.5 % Endapan Ferribenzoat yang berwarna salmon menunjukkan adanya benzoat
56
Lampiran 6. Diagram Alir Analisis Kuantitatif Natrium Benzoat Secara Titrimetri (AOAC 963.19 1999)
Persiapan Sampel a. Prosedur Umum Dihomogenkan sampel
Dimasukkan 150 ml atau 150 gram sampel ke labu takar 500 ml
Ditambahkan NaCl powder
Ditambahkan NaOH 10 % hingga alkalis
Ditepatkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh
Dibiarkan + 2 jam, dikocok berulang kali, disaring
f. Sampel Saus Tomat 100 gram sampel + 15 gram NaCl powder
Dipindahkan campuran ke labu takar 500 ml
Dicuci wadah semula dengan + 150 ml larutan NaCl jenuh
Ditambahkan NaOH 10 % hingga alkalis
Ditepatkan sampai tanda tera dengan larutan NaCl jenuh
Dibiarkan + 2 jam, dikocok berulang kali (sentrifuse bila perlu)
Disaring
57
Penetapan Sampel Dipipet 100-200 ml filtrat sampel
Dimasukkan ke dalam labu pemisah
Dinetralkan dengan HCl (1 + 3) dan tambahkan lagi 5 ml HCl sesudah netral
Diekstrak dengan kloroform beberapa kali (70, 50, 40, 30 ml)
Diambil bagian jernih kloroform (Jika kloroform yang diperoleh kurang jernih, perlu dicuci dengan akuades sampai jernih)
Dibilas labu pemisah dengan 5-10 ml CHCl3 tiga kali. Didistilasi dengan lambat pada suhu rendah sampai volume ekstrak seperempat dari volume semula
Diuapkan sampai kering pada suhu kamar di atas penangas air sampai tinggal beberapa tetes cairan saja yang tinggal.
Dikeringkan residu semalaman (atau sampai bau asam asetat hilang jika sampelnya adalah saus tomat) dalam desikator yang mengandung H2SO4 pekat Dilarutkan residu asam benzoat dalam 30-50 ml alkohol
Ditambahkan 12-15 ml air dan 1 atau 2 tetes indikator PP
Dititrasi dengan NaOH 0.05 N
Standar deviasi (ppm) RSD (%) Persen recovery (%)
KETERANGAN berat benzoat (g) Volume benzoat (ml) ppm benzoat standar ppm benzoat dikali kemurnian 99% Volume sampel (ml) Berat sampel (g) Berat KHP (g) ml NaOH utk standarisasi N NaOH ml NaOH ppm benzoat Rata-rata benzoat (ppm) 15.18 1.61 95.14
2.69 98.32
PERLAKUAN 2 Ulangan 1 Ulangan 2 0.2507 0.2507 250 250 1002.8 1002.8 992.772 992.772 250 250 75.30 75.30 0.1692 0.1692 18.45 18.45 0.0449 0.0449 4.35 4.45 933.7769 955.2430 944.51
26.08
PERLAKUAN 1 Ulangan 1 Ulangan 2 0.2493 0.2493 250 250 997.2 997.2 987.228 987.228 250 250 75.01 75.01 0.2217 0.1639 24.20 17.80 0.0448 0.04509 4.60 4.40 989.0521 952.1738 970.61
Lampiran 7. Data Pengukuran Konsentrasi Natrium Benzoat pada Berbagai Perlakuan
96.15
0.80
7.63
PERLAKUAN 3 Ulangan 1 Ulangan 2 0.2507 0.2507 250 250 1002.8 1002.8 992.772 992.772 250 250 75.0979 75.0979 0.0957 0.0957 10.40 10.40 0.0450 0.0450 4.40 4.45 949.1610 959.9469 954.55
58
59
Lampiran 8. Contoh Perhitungan Konsentrasi Natrium Benzoat, SD, RSD, dan Persen Recovery
Konsentrasi natrium benzoat pada perlakuan 1, ulangan 1
N NaOH standard =
berat KHP (g) 204.228 × V NaOH (L)
N NaOH standard =
0.2217 = 0.0448 N 204.228 × 0.0242
Volume larutan Titer x N NaOH x 144 x yang dibuat pada x 106
ppm Na benzoat
=
persiapan sampel
anhidrat
Volume yang diambil x berat sampel x 1000 untuk penetapan = 4.60 x 0.0448 x 144 x 250 x 106 100 x 75.01 x 1000 = 989.0521 ppm
Dengan cara yang sama, didapat konsentrasi natrium benzoat pada ulangan 2 sebesar 952.1738 ppm. Rata-rata konsentrasi benzoat sebesar = 970.61 ppm
SD =
∑ (x
i
− x) 2
n -1
= =
RSD =
SD × 100 % x
Persen Recovery = =
=
(989.0521 - 970.61295) 2 + (952.1738 - 970.61295) 2 2 −1 26.08 ppm
26.0769 × 100 % = 2.69 % 970.61295
konsentrasi benzoat terukur × 100 % konsentrasi benzoat standar 970.61295 × 100 % = 98.32 % 987.228
60
Lampiran 9. Uji t dan F Untuk Perlakuan 1 dan Perlakuan 2
Uji t 1. Hipotesis H0 : µ1 = µ2 H1 : µ1 ≠ µ2 2. Hipotesis uji = uji t
t hitung =
x1 - x 2 sp (1/n 1 ) + (1/n 2 ) 2
2
sp =
(n 1 − 1)s1 + (n 2 - 1) s 2 n1 + n 2 − 2
sp =
(2 - 1) 26.08 2 + (2 - 1) 15.18 2 = 21.34 2+2-2 970.61 - 944.51
t hitung =
21.34 (1/2) + (1/2)
= 1.223
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila t hitung < tα/2 (v) atau >- tα/2 (v) t tabel = 9.925 dan -9.925 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan: rataan perlakuan 1 tidak berbeda nyata dengan rataan perlakuan 2
Uji F 1. Hipotesis H0 : s12 = s22 H1 : s12 ≠ s22 2. Hipotesis uji = uji F
F hitung =
s1
2
s2
2
=
26.08 2 = 2.952 15.18 2
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila F hitung < Fα (v1,v2) F tabel = 4052.185 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan : SD perlakuan 1 tidak berbeda nyata dengan SD perlakuan 2
61
Lampiran 10. Uji t dan F Untuk Perlakuan 2 dan Perlakuan 3
Uji t 1. Hipotesis H0 : µ2 = µ3 H1 : µ2 ≠ µ3 2. Hipotesis uji = uji t
t hitung =
x2 - x3 sp (1/n 2 ) + (1/n 3 ) 2
2
sp =
(n 2 - 1)s 2 + (n 3 - 1) s 3 n2 + n3 - 2
sp =
(2 - 1) 15.18 2 + (2 - 1) 7.63 2 = 12.01 2+2-2 944.51 - 954.55
t hitung =
12.01 (1/2) + (1/2)
= -0.836
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila t hitung < tα/2 (v) atau >- tα/2 (v) t tabel = 9.925 dan -9.925 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan: rataan perlakuan 2 tidak berbeda nyata dengan rataan perlakuan 3
Uji F 1. Hipotesis H0 : s22 = s32 H1 : s22 ≠ s32 2. Hipotesis uji = uji F
F hitung =
s2
2
s3
2
=
15.18 2 = 3.958 7.63 2
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila F hitung < Fα (v2,v3) F tabel = 4052.185 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan : SD perlakuan 2 tidak berbeda nyata dengan SD perlakuan 3
62
Lampiran 11. Uji t dan F Untuk Perlakuan 1 dan Perlakuan 3
Uji t 1. Hipotesis H0 : µ1 = µ3 H1 : µ1 ≠ µ3 2. Hipotesis uji = uji t t hitung =
x1 - x 3 sp (1/n 1 ) + (1/n 3 )
sp =
(n 1 - 1)s1 2 + (n 3 - 1) s 3 2 n1 + n 3 - 2
sp =
(2 - 1) 26.08 2 + (2 - 1) 7.63 2 = 19.21 2+2-2 970.61 - 954.55
t hitung =
19.21 (1/2) + (1/2)
= 0.836
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila t hitung < tα/2 (v) atau >- tα/2 (v) t tabel = 9.925 dan -9.925 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan: rataan perlakuan 1 tidak berbeda nyata dengan rataan perlakuan 3
Uji F 1. Hipotesis H0 : s12 = s32 H1 : s12 ≠ s32 2. Hipotesis uji = uji F F hitung =
s1
2
s3
2
=
26.08 2 = 11.683 7.63 2
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila F hitung < Fα (v1,v3) F tabel = 4052.185 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan : SD perlakuan 1 tidak berbeda nyata dengan SD perlakuan 3
63
Lampiran 12. Hasil Uji ANOVA pada Berbagai Perlakuan
64
Lampiran 13. Rincian Biaya pada Berbagai Perlakuan (satu kali ulangan, duplo)
Jenis Perlakuan
Perlakuan 1
Perlakuan 2
Perlakuan 3
Bahan Kimia NaCl powder p.a NaOH p.a HCl pekat p.a Kloroform p.a Alkohol p.a NaCl powder p.a NaOH p.a HCl pekat p.a Kloroform teknis Alkohol teknis NaCl powder teknis NaOH p.a HCl pekat p.a Kloroform teknis Alkohol teknis
Harga Rp 353,600/500 g Rp 708,900/500 g Rp 222,700/L Rp 344,250/2.5 L Rp 272,850/2.5 L TOTAL BIAYA Rp 353,600/500 g Rp 708,900/500 g Rp 222,700/L Rp 130,000/L Rp 35,000/L TOTAL BIAYA Rp 14,000/kg Rp 708,900/500 g Rp 222,700/L Rp 130,000/L Rp 35,000/L TOTAL BIAYA
Kebutuhan 100 g 1g 5 ml 500 ml 100 ml 100 g 1g 5 ml 500 ml 100 ml 100 g 1g 5 ml 500 ml 100 ml
Biaya Rp 70,720 Rp 1,418 Rp 1,114 Rp 68,850 Rp 10,914 Rp153,016 Rp 70,720 Rp 1,418 Rp 1,114 Rp 65,000 Rp 3,500 Rp141,752 Rp 1,400 Rp 1,418 Rp 1,114 Rp 65,000 Rp 3,500 Rp 72,032
3.12
RSD (%)
785.9446 24.84
773.8197
2.60
0.0550
7.40
0.0832
65.5008
100
250
Ulangan 4
Standar Deviasi
842.5748
2.15
0.0560
7.20
0.0823
65.8977
85
250
Ulangan 3
796.34
802.9397
2.65
0.0558
6.55
0.0746
63.1792
100
250
Ulangan 2
Rata-rata ppm benzoat
ppm benzoat
2.75
ml NaOH
8.25
ml NaOH utk stdr 0.0553
0.0932
Berat KHP (g)
N NaOH
68.1832
100
Volume yg diambil (ml)
Berat sampel (g)
250
Ulangan 1
Volume sampel (ml)
KETERANGAN
785.5948
2.65
0.0543
6.65
0.0738
65.9401
100
250
Ulangan 5
Lampiran 14. Data Analisis Natrium Benzoat pada Saus Sambal dengan Metode Labu Pemisah
772.4071
2.95
0.0543
6.55
0.0726
74.6583
100
250
Ulangan 6
811.0654
3.20
0.0562
7.00
0.0803
79.8239
100
250
Ulangan 7
65
2.92
RSD (%)
841.4827 23.85
791.0586
2.60
0.0568
6.60
0.0765
70.1999
90
250
Ulangan 4
Standar Deviasi
806.4654
2.60
0.0561
6.75
0.0774
66.3789
100
250
Ulangan 3
817.46
800.1864
2.65
0.0564
6.60
0.0761
66.7178
100
250
Ulangan 2
Rata-rata ppm benzoat
ppm benzoat
2.65
ml NaOH
6.75
ml NaOH utk stdr 0.0558
0.0770
Berat KHP (g)
N NaOH
66.5260
100
Volume yg diambil (ml)
Berat sampel (g)
250
Ulangan 1
Volume sampel (ml)
KETERANGAN
Lampiran 15. Data Analisis Natrium Benzoat pada Saus Sambal dengan Metode Shaker
858.271
2.85
0.0565
6.40
0.0739
67.5416
100
250
Ulangan 5
813.3358
2.65
0.0569
7.50
0.0872
66.7407
100
250
Ulangan 6
811.4312
3.10
0.0486
7.60
0.0754
66.8419
100
250
Ulangan 7
66
67
Lampiran 16. Metode Laboratorium Terakreditasi
68
69
Lampiran 17. Hasil Analisis Kuantitatif dari Laboratorium Terakreditasi
70
71
72
Lampiran 18. Uji t dan F Untuk Metode Labu Pemisah (1) dan Shaker (2)
Uji t 1. Hipotesis H0 : µ1 = µ2 H1 : µ1 ≠ µ2 2. Hipotesis uji = uji t
t hitung =
x1 - x 2 sp (1/n 1 ) + (1/n 2 ) 2
2
sp =
(n 1 − 1)s1 + (n 2 - 1) s 2 n1 + n 2 − 2
sp =
(7 - 1) 24.84 2 + (7 - 1) 23.85 2 = 24.35 7+7-2 796.34 - 817.46
t hitung =
24.35 (1/7) + (1/7)
= -1.623
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila t hitung < tα/2 (v) atau >- tα/2 (v) t tabel = 3.055 dan -3.055 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan: rataan metode 1 tidak berbeda nyata dengan rataan metode 2.
Uji F 1. Hipotesis H0 : s12 = s22 H1 : s12 ≠ s22 2. Hipotesis uji = uji F
F hitung =
s1
2
s2
2
=
24.84 2 = 1.085 23.85 2
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila F hitung < Fα (v1,v2) F tabel = 8.466 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan : SD metode 1 tidak berbeda nyata dengan SD metode 2
73
Lampiran 19. Uji t dan F Untuk Metode Labu Pemisah (1) dan Laboratorium Terakreditasi (2)
Uji t 1. Hipotesis H0 : µ1 = µ2 H1 : µ1 ≠ µ2 2. Hipotesis uji = uji t
t hitung =
x1 - x 2 sp (1/n 1 ) + (1/n 2 ) 2
2
sp =
(n 1 − 1)s1 + (n 2 - 1) s 2 n1 + n 2 − 2
sp =
(7 - 1) 24.84 2 + (2 - 1) 14.40 2 = 23.63 7+2-2 796.34 - 839.00
t hitung =
23.63 (1/7) + (1/2)
= -2.252
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila t hitung < tα/2 (v) atau >- tα/2 (v) t tabel = 3.499 dan -3.499 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan: rataan metode 1 tidak berbeda nyata dengan rataan metode 2.
Uji F 1. Hipotesis H0 : s12 = s22 H1 : s12 ≠ s22 2. Hipotesis uji = uji F
F hitung =
s1
2
s2
2
=
24.84 2 = 2.976 14.40 2
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila F hitung < Fα (v1,v2) F tabel = 5858.950 4. Keputusan H0 diterima
74
5. Kesimpulan : SD metode 1 tidak berbeda nyata dengan SD metode 2 Lampiran 20. Uji t dan F Untuk Metode Shaker (1) dan Laboratorium Terakreditasi (2)
Uji t 1. Hipotesis H0 : µ1 = µ2 H1 : µ1 ≠ µ2 2. Hipotesis uji = uji t
t hitung =
x1 - x 2 sp (1/n 1 ) + (1/n 2 ) 2
2
sp =
(n 1 − 1)s1 + (n 2 - 1) s 2 n1 + n 2 − 2
sp =
(7 - 1) 23.85 2 + (2 - 1) 14.40 2 = 22.74 7+2-2 817.46 - 839.00
t hitung =
22.74 (1/7) + (1/2)
= -1.181
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila t hitung < tα/2 (v) atau >- tα/2 (v) t tabel = 3.499 dan -3.499 4. Keputusan H0 diterima 5. Kesimpulan: rataan metode 1 tidak berbeda nyata dengan rataan metode 2
Uji F 1. Hipotesis H0 : s12 = s22 H1 : s12 ≠ s22 2. Hipotesis uji = uji F
F hitung =
s1
2
s2
2
=
23.85 2 = 2.743 14.40 2
3. Wilayah kritik pada α = 0.01 H0 diterima bila F hitung < Fα (v1,v2) F tabel = 5858.950 4. Keputusan H0 diterima
75
5. Kesimpulan : SD metode 1 tidak berbeda nyata dengan SD metode 2 Lampiran 21. Hasil Uji ANOVA pada Metode Labu Pemisah, Metode Shaker, dan Metode Laboratorium Terakreditasi
