GEHALTEBEPALING VAN BENZALKONIUMCHLORIDE D.M.V. FAST LIQUID CHROMATOGRAPHY

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep FARMACEUTISCHE ANALYSE Laboratorium voor FARMACEUTISCHE MICROBIOLOGIE Academiejaar 2009-2010

GEHALTEBEPALING VAN BENZALKONIUMCHLORIDE D.M.V. FAST LIQUID CHROMATOGRAPHY Jill DEFLOU Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor

Prof. dr. H. Nelis Commissarissen

Prof. dr. T. Coenye Prof. B. De Spiegeleer

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep FARMACEUTISCHE ANALYSE Laboratorium voor FARMACEUTISCHE MICROBIOLOGIE Academiejaar 2009-2010

GEHALTEBEPALING VAN BENZALKONIUMCHLORIDE D.M.V. FAST LIQUID CHROMATOGRAPHY Jill DEFLOU Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor

Prof. dr. H. Nelis Commissarissen

Prof. dr. T. Coenye Prof. B. De Spiegeleer

AUTEURSRECHT “De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze masterproef.” Mei 10, 2010

Promotor (Ugent)

Verantwoordelijke Alcon

Auteur

Prof. dr. H. Nelis

Frederik Buysse

Jill Deflou

Dankwoord Bij deze wil ik van de gelegenheid gebruik maken om iedereen te bedanken die op één of andere manier heeft geholpen bij de uitvoering van mijn project en het schrijven van deze masterproef. Ook wil ik graag de personen bedanken die hebben bijgedragen tot de prettige omstandigheden waarin ik de afgelopen drie maanden aan mijn project heb gewerkt. In de eerste plaats wil ik graag mijn begeleidster Els De Hoef bedanken voor haar steun, inzet, advies en vertrouwen, die ertoe hebben geleid dat mijn project vrij vlot en zeer aangenaam verlopen is. Ik heb veel geleerd in verband met het bedrijfsleven zelf, wat voor mij een enorme waarde heeft. Ook Evi De Gaever, mijn buurvrouw in het bureel van QC Systems, had ik graag bedankt voor haar tijd, hulp en vooral geduld in het rondleiden in Alcon, het begeleiden van de software programma‟s,… Daarnaast zijn er teveel personen om op te noemen, die de werkervaring in Alcon voor mij zeer aangenaam hebben gemaakt. Vervolgens wil ik Dr. Marleen Ghijs, QC Systems Manager, bedanken voor haar deskundig advies, positieve feedback en gedetailleerde commentaar op mijn masterproef. Frederik Buysse wil ik tevens bedanken voor het vertrouwen in Universiteit Gent om voor de eerste maal stageplaatsen aan te bieden in Alcon. Hierbij zou ik ook mijn dank willen betuigen aan mijn promotor van Universiteit Gent, Prof. dr. Hans Nelis voor z‟n vakkundig advies bij het nalezen van mijn masterproef en de begeleiding in de presentatie van de masterproef. Tenslotte wil ik ook mijn ouders, vrienden en vriendinnen bedanken voor de steun en het luisterende oor dat zij mij hebben geboden, alsook voor het proeflezen van mijn masterproef.

INHOUDSOPGAVE 1

INLEIDING ....................................................................................................................... 1 1.1

SITUERING ALCON ................................................................................................. 1

1.2

BENZALKONIUMCHLORIDE ................................................................................. 2

1.3

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY ..................................... 6

1.3.1

Inleiding in de chromatografie ..................................................................................... 6

1.3.2

Reversed phase liquid solid chromatography (RP-LSC) ........................................... 7

1.3.3

Chromatografische parameters ................................................................................... 8

1.3.4

UV-detector .................................................................................................................. 15

1.4

TRANSFORMATIE NAAR FAST LC .................................................................... 16

1.4.1

Theoretische achtergrond Fast LC ............................................................................ 17

1.4.2

Methodevalidatie ......................................................................................................... 20

2

OBJECTIEVEN .............................................................................................................. 27

3

MATERIAAL EN METHODEN .................................................................................. 28 3.1

MATERIAAL............................................................................................................ 28

3.2

CHEMICALIËN EN REAGENTIA ......................................................................... 28

3.3

METHODE................................................................................................................ 28

3.3.1

Chromatografische parameters ................................................................................. 29

3.3.2

Bereiden van de standaardoplossing ......................................................................... 30

3.3.3

Bereiden van de analyse oplossing ............................................................................. 31

3.3.4

Procedure ..................................................................................................................... 32

3.4

SCREENING FAST LC KOLOMMEN VOOR DE BEPALING VAN BAC ......... 32

3.5

METHODEVALIDATIE .......................................................................................... 33

3.5.1

Vergelijkende datatest................................................................................................. 33

3.5.2

Robuustheid ................................................................................................................. 34

3.5.3

Batch-to-batch reproduceerbaarheid ........................................................................ 35

4

RESULTATEN................................................................................................................ 36 4.1 4.1.1

Luna C8(2) ................................................................................................................... 36

4.1.2

Halo C8 ......................................................................................................................... 36

4.1.3

YMC-Pack Pro C8....................................................................................................... 37

4.1.4

Optimale condities voor de transformatie naar Fast LC ......................................... 37

4.2

5



4.2.1


4.2.2

Robuustheid ................................................................................................................. 40

4.2.3


DISCUSSIE...................................................................................................................... 42 5.1


5.2


5.2.1


5.2.2

Robuustheid ................................................................................................................. 44

5.2.3


6

CONCLUSIES ................................................................................................................. 48

7

LITERATUURSLIJST ................................................................................................... 49

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ACN: Acetonitrile ATP: Adenosine Trifosfaat BAC: Benzalkoniumchloride BP: British Pharmacopoeia CDER: Center for Drug Evaluation and Research EP: European Pharmacopoeia FDA: Food and Drug Administration GMP: Good Manufacturing Practice HETP: Height Equivalent to a Theoretical Plate HPLC: High Performance Liquid Chromatography ICH: International Conference on Harmonization JP: Japanese Pharmacopoeia LC: Liquid Chromatography LSC: Liquid Solid Chromatography QAC: Quaternary Ammonium Compounds R&D: Research and Development RP: Reversed Phase RRT: Relative Retention Time RSD: Relative Standard Deviation UPLC: Ultra Performance Liquid Chromatography USP: United States Pharmacopoeia UV: Ultraviolet VWD: Variable Wavelength Detector

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 1 1.1

Jill Deflou

INLEIDING SITUERING ALCON Alcon Inc. is een farmaceutisch bedrijf dat instaat voor de productie en aflevering van

oogproducten in meer dan 180 landen wereldwijd. Alcon produceert een volledig assortiment aan oogheelkundig chirurgische materialen, farmaceutica en consument Vision Care producten. Alcon Laboratories Inc. werd opgericht in 1945. De grondleggers van het bedrijf, apothekers Robert Alexander en William Conner, openden een kleinschalige apotheek in Fort Worth, Texas. De naam Alcon ontstond door de combinatie van de eerste lettergreep van beide achternamen. (http://www.alcon.com/en/) In 1977 werd Nestlé, marktleider in de voedingsmiddelen, eigenaar van Alcon. Onder de vleugels van Nestlé kon Alcon uitgroeien tot een wereldwijde speler. Alcon bleef tot 2010 in de handen van Nestlé totdat Novartis, een Zwitsers farmaceutisch bedrijf, de nieuwe hoofdaandeelhouder werd. Novartis had sinds april 2008 een belang van 25 procent in Alcon en vergrootte z‟n aandeel met een bijkomende 52 procent. Novartis wil via een aandelenruil ook de resterende aandelen in handen krijgen. (http://www.standaard.be/artikel/detail.aspx?artikelid=DMF20100104 005)

Alcon is momenteel gevestigd in meer dan 75 landen. De twee hoofdzetels bevinden zich in Texas en Zwitserland. Er zijn twaalf producerende vestigingen waaronder AlconCouvreur in Puurs, België. Daarnaast zijn er vijf onderzoeks- en ontwikkelingsvestigingen en maar liefst 64 dochterondernemingen. Wereldwijd zijn 15000 mensen tewerkgesteld in Alcon, waaronder meer dan 1000 in de Belgische afdeling. De internationale samenwerking levert een significante bijdrage tot de ontdekking en ontwikkeling van innovatieve producten in de oogzorg. (http://www.alcon.com/en/) De doelstelling van Alcon is het verbeteren van de levenskwaliteit van de consument door het gezichtsvermogen te maximaliseren. De behandeling van oogaandoeningen en oogziekten start bij de kennis van de ziekte zelf en de preventie ervan. De aanpak van Alcon is drieledig: de effectieve bestrijding, het onderzoek naar nieuwe behandelingen toe en de samenwerking met oogspecialisten zodat patiënten de nodige behandeling krijgen. (http://www.alcon.com/en/)

1

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC

Jill Deflou

Het productaanbod wordt ingedeeld in drie grote groepen: chirurgische, farmaceutische en consument Vision Care producten. Onder chirurgische producten behoren onder andere de benodigdheden die vereist zijn voor cataract en refractieve operaties zoals intra-oculaire lenzen, vitreoretinale systemen, hechtingen, naalden en messen. Kortom, Alcon bevoorraadt de volledige operatiekamer, die vereist is voor een oogheelkundige operatie. De farmaceutische producten voor het oog en oor worden toegepast in de behandeling van glaucoom, ooginfecties, oogallergieën, oog- en oorontstekingen. Deze producten zijn vaak een combinatie van één of meerdere antibiotica en anti-inflammatoire middelen. In de consument Vision Care afdeling worden zachte contactlensoplossingen en een volledig assortiment aan kunsttranen en oogvitaminen geproduceerd. (http://www.alcon.com/en/) 1.2

BENZALKONIUMCHLORIDE Preferentieel worden doseringsformulaties gebruikt voor de behandeling van

oogheelkundige ziekten. (Ali & Lehmussaari, 2006) Deze formulaties bezitten echter twee nadelen, namelijk een lage oculaire biologische beschikbaarheid (Choy et al., 2008) en het risico op microbiologische contaminatie door het meervoudig gebruik. Enerzijds wordt de oculaire biologische beschikbaarheid verhoogd door de toevoeging van viscositeitsverhogers, zoals polymeren. De polymeren zorgen voor een precorneale retentie van de actieve stof ter hoogte van het oog. Anderzijds worden antimicrobiële bewaarmiddelen toegevoegd om contaminatie te voorkomen. (Shen et al.,2009) Er is eveneens significante evidentie dat bepaalde bewaarmiddelen bijdragen tot de activiteit van een antibioticum. De activiteitsverhoging is te wijten aan de snellere afdoding van potentiële pathogenen en de verlaging van de minimale inhibitorische concentratie van het antibioticum. (Rahman et al., 2006) Hoewel verschillende componenten geschikt zijn als oogheelkundig bewaarmiddel, wordt benzalkoniumchloride het meest toegepast omwille van z‟n hoge activiteit. (Labranche et al., 2007) Benzalkoniumchloride, afgekort BAC, is een chemische substantie samengesteld uit een mengsel van alkyldimethylbenzylammoniumchloride homologen. Homologe substanties verschillen enkel in het aantal methyleengroepen, voorgesteld als -CH2-, die gebonden zijn op de basisstructuur. Een bijkomende vereiste is dat de methyleengroepen één onvertakte alkylketen moeten vormen. Aan beide voorwaarden moet worden voldaan, anders zijn de structuren geen homologen van elkaar.

2


Jill Deflou

De structuurformule van BAC wordt geïllustreerd in Figuur 1.1. De R-groep stelt de verzameling voor van de mogelijke alkylketens, die kunnen gebonden zijn op de basisstructuur. De homologen worden apart benoemd naargelang de gebonden alkylketen. (The Merck Index, 2006). De volgend opgesomde BAC homologen zijn relevant in deze

masterproef: de C12-homoloog met als alkylketen -C12H25, de C14-homoloog met als alkylketen -C14H29 en tenslotte de C16-homoloog met als alkylketen -C16H33.

FIGUUR 1.1 : STRUCTUURFORMULE BENZALKONIUMCHLORIDE. (The Merck Index, 2006)

De structuurformule van BAC wordt ingedeeld in een wateraantrekkende, hydrofiele zone en een waterafstotende, hydrofobe zone. De hydrofiele zone bestaat uit een quaternair stikstofatoom, dat positief geladen is in oplossing. BAC behoort tot de quaternaire ammoniumderivaten, afgekort QAC, door de aanwezigheid van een quaternair stikstofatoom in de structuurformule. Daarentegen bestaat de hydrofobe zone uit de lange alkylketen voorgesteld als R. (Yang, 2007) Door de tweeledigheid van de structuur verschaft BAC bijzondere eigenschappen als oppervlakte-actieve stof, ook surfactans genaamd. Meer bepaald doordat de hydrofiele zone een positief geladen groep draagt, behoort BAC tot de kationische surfactanten. Een subgroep van deze surfactanten zijn de voorgenoemde quaternaire ammoniumderivaten. QAC bezitten een antimicrobiële activiteit over een breed pH gebied. Deze stoffen zijn in staat om bacteriën, gisten en bepaalde virussen af te doden. (Atkin et al., 2003) Een antimicrobieel bewaarmiddel wordt toegevoegd aan preparaten die zelf onvoldoende antimicrobiële activiteit bezitten. De toevoeging is vooral belangrijk bij waterige oplossingen, aangezien water een geschikte voedingsbodem vormt voor micro-organismen. Tevens is de toevoeging van een bewaarmiddel vereist bij preparaten voor meervoudig gebruik. Bij de opening van een product treedt namelijk steeds contaminatie op door microorganismen. Het bewaarmiddel moet deze micro-organismen bestrijden, om de steriliteit en de veiligheid van het product te behouden. (European Pharmacopoeia 6.0, 2007)

3


Jill Deflou

QAC zijn membraan-actieve stoffen. De term duidt op de lokalisatie van de target site, namelijk de cytoplasmatische membraan van bacteriën of gisten. Het werkingsmechanisme wordt beschreven als een opeenvolging van een aantal offensieve acties tegen de microorganismen. De eerste stap is de adsorptie en penetratie van het bewaarmiddel in de celwand. Daarna bindt het positief geladen stikstofatoom op negatief geladen proteïnen of lipiden, die ingebed zijn in de cytoplasmatische membraan. De hydrofobe alkylketen wordt tussengevoegd in de cytoplasmatische membraan, met als gevolg een verstoring van de membraanstructuur. Dit resulteert in het verlies van de membraanintegriteit, waardoor intracellulaire componenten verloren gaan. Tevens worden proteïnen en nucleïnezuren in de cel zelf afgebroken. Tot slot wordt cellyse, dit is het openbarsten van de cel, geïnitieerd door autolytische enzymen. (McDonnel & Russell, 1999)

Het functieverlies van de cytoplasmatische membraan heeft steeds de afsterving van het micro-organisme tot gevolg. Het is namelijk betrokken bij vitale processen zoals actief transport, oxidatieve fosforylatie en het genereren van ATP. Deze processen worden geblokkeerd bij de neutralisatie van de protonbewegende kracht. De protonbewegende kracht ontstaat door de ontlading van het protonengradiënt. Dit protonengradiënt wordt opgebouwd over de cytoplasmatische membraan, doordat protonen tijdens metabolische activiteit worden verdreven naar de buitenzijde van de cel. (McDonnel & Russell, 1999) Gram-positieve bacteriën zijn gevoeliger aan QAC dan Gram-negatieve bacteriën. Dit is te verklaren door de afwijkende structuur van hun celwand. Een Gram-negatieve bacterie bezit, naast de cytoplasmatische membraan, een buitenste membraan als onderdeel van de celwand. Deze membraan is weinig permeabel, waardoor de target site slechts in beperkte mate wordt bereikt. Er wordt wel aangenomen dat de QAC de buitenste membraan gedeeltelijk beschadigen, waardoor ze hun eigen opname bevorderen. Op die manier bereikt een bepaalde fractie van het bewaarmiddel alsnog de target site. (McDonnell & Russell, 1999) De afdoding van gistcellen verloopt vrijwel analoog. Bij de blootstelling aan QAC treedt een destructie op van lipidestructuren in de cytoplasmatische membraan. Een verstoring van de membraan leidt tot de afsterving van de gistcel. QAC zijn ook in zekere mate actief tegen sporen. QAC zijn in staat om de ontwikkeling van een ontkiemde spore tot een vegetatieve cel te inhiberen maar het ontkiemingproces wordt niet beïnvloedt. Het werkingsmechanisme is, tot nu toe, nog steeds onopgehelderd. (McDonnell & Russell, 1999) 4


Jill Deflou

Vervolgens zijn QAC niet in staat om mycobacteriën af te doden, maar wel om hun groei te inhiberen. Tot slot hebben QAC een antimicrobieel effect op lipide, omhulde virussen, maar niet op naakte virussen. Het afdoden van deze virussen wordt bereikt door de desintegratie en morfologische veranderingen, die tot stand komen in de virale structuur. Hierdoor verliest het virus z‟n vermogen tot infecteren. (McDonnell & Russell, 1999) Experimenten op QAC werden uitgevoerd om de invloed van de lengte van de alkylketen op de antimicrobiële activiteit te bestuderen. Die toonden aan dat de C12- tot C16homologen de meest uitgesproken bactericide activiteit uitoefenen. Elke homoloog vertoont licht afwijkende antimicrobiële activiteit. In het algemeen is de C12-homoloog het meest actief tegen gistcellen en fungi, de C14-homoloog tegen Gram-positieve bacteriën en de C16homoloog tegen Gram-negatieve bacteriën. (Liu et al., 2009) De C16-homoloog is het meest actief tegen Gram-negatieve bacteriën, doordat ze de buitenste membraan met hun C16alkylketen meer verstoren dan de homologen met kortere alkylketens. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de sterke interactie van de C16-alkylketen met het vetzuurgedeelte van het lipide A op een Gram-negatieve bacterie. (Tomlinson et al., 1977) Het is duidelijk geworden dat BAC een sterk uitgesproken toxiciteit bezit ten opzichte van micro-organismen. Gelukkigerwijze is de toxiciteit ten opzichte van de mens minder uitgesproken. In oogpreparaten, zoals toegepast in Alcon, wordt een 0,008% tot 0,02% BACoplossing gebruikt. Een studie van een 0,1% BAC-oplossing op 3D-corneale culturen en op apenogen stelde vast dat er geen cytotoxiciteit optrad. (Khoh-Reiter & Jessen, 2009) Dit suggereert dat de toegepaste BAC-concentratie in oogheelkundige preparaten geen significant directe toxiciteit veroorzaakt ten opzichte van het epitheel en anderzijds normale cornea. Er werd wel vastgesteld dat een hogere concentratie zoals een 10% BAC-oplossing irreversibele corneale schade kan veroorzaken. (Martindale, 2009) Inhalatie van BAC kan resulteren in een pijnlijke keel, hoest en een moeizame ademhaling. In enkele gevallen werd ook bronchoconstrictie en nasale opzwelling vastgesteld. Ingestie van BAC kan brandwonden op de lippen, tong, mond, keel of de maag veroorzaken. Het simultaan aanwezig zijn van volgende symptomen is mogelijk: abdominale pijn, branderig gevoel, nausea, braken, overvloedige speekselproductie, diarree en verwardheid. Ook levensbedreigende symptomen zoals hypotensie, shock, respiratoire paralyse en coma werden gerapporteerd. Tot slot kan percutaan contact van BAC roodheid van de huid, brandwonden en pijn veroorzaken. (http://www.cdc.gov/niosh/ipcsneng/neng1584.html) 5

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 1.3

Jill Deflou

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

1.3.1 Inleiding in de chromatografie Chromatografie is een analytische techniek, die wordt aangewend voor de scheiding van mengsels. Een mengsel op zich kan niet worden geanalyseerd, dus een scheiding in de samenstellende bestanddelen is noodzakelijk. Bij een kwalitatieve analyse wordt de identiteit van de componenten in een mengsel bepaald. Bij een kwantitatieve analyse, ook gehaltebepaling genoemd, wordt de concentratie van de componenten in een mengsel bepaald. In z‟n essentie bestaat een chromatografisch systeem uit vier fundamentele onderdelen. Een eerste onderdeel is de injector, die het te analyseren staal inbrengt in het systeem. Het staal wordt via de leidingen doorheen het volledige systeem meegevoerd met de lopende, mobiele fase. Deze leidingen vormen het tweede onderdeel van het chromatografisch systeem. Een derde onderdeel is de analytische kolom waarin de stilstaande, stationaire fase is geïmmobiliseerd. Het scheidingsproces, dat hieronder wordt verklaard, vindt plaats in deze kolom. Het vierde onderdeel tenslotte is de detector en het dataverwerkingssysteem, die samen zorgen voor de visualisatie van een scheiding. Het basisprincipe van alle vormen van chromatografie is gelijk. Na de introductie van het staal in het chromatografisch systeem, treden drie fenomenen op. Het geïnjecteerd staal wordt met behulp van de mobiele fase geleid doorheen de stationaire fase in de kolom. Dit eerste fenomeen wordt gedefinieerd als de staalmigratie. (DryLab® Chromatography Reference Guide, 2009)

In de analytische kolom vindt vervolgens het scheidingsproces plaats. Allereerst verdelen de staalcomponenten zich tussen de mobiele en de stationaire fase naar gelang hun affiniteit voor de stationaire fase. Een component kan gedurende zijn migratie doorheen de kolom even worden weerhouden of vertraagd. Dit wordt gedefinieerd als de retentie van een component. Deze retentie is te wijten aan de interactie met de stationaire fase. Het principe van de interactie wordt geïllustreerd in Figuur 1.2.

FIGUUR 1.2 : SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN DE INTERACTIE TUSSEN COMPONENTEN IN DE MOBIELE FASE MET DE STATIONAIRE FASE IN EEN KOLOM.

6


Jill Deflou

Een onweerhouden component gedraagt zich net als de mobiele fase doordat een interactie met de stationaire fase ontbreekt. Door de selectieve vertraging op de stationaire fase bewegen staalcomponenten met een verschillende snelheid doorheen de kolom. Dit tweede fenomeen wordt gedefinieerd als de differentiële migratie. (DryLab® Chromatography Reference Guide, 2009)

De differentiële migratie vormt de basis van een chromatografische scheiding. Om een efficiënte scheiding te bereiken moeten componenten voldoende verschillen in hun retentie. Door dit verschil in retentie verlaten de componenten de kolom op een verschillend tijdstip. De chromatografische term hiervoor is elueren. De elutie- of retentietijd is het tijdstip waarop een component elueert. De retentietijd is componentspecifiek en wordt om deze reden als identificatiemiddel gebruikt voor de samenstellende componenten van het staal. Staalcomponenten migreren in de vorm van verschillende banden doorheen de kolom. De termen band en piek worden in de praktijk door elkaar gebruikt. Strikt genomen wordt een band gedefinieerd als de reële fysische verdeling van de moleculen van een staal in de kolom. Een piek daarentegen wordt gedefinieerd als de grafische voorstelling van die band op een dataverwerkingssysteem op het moment dat de molecule elueert. Door de migratie doorheen de kolom verbreden de banden. Dit derde fenomeen wordt gedefinieerd als de piek- of bandverbreding. De piekverbreding limiteert de resolutie, die wordt verworven tussen aangrenzende pieken. De term resolutie wordt in het onderdeel 1.3.3.2 Scheidingsparameters nauwgezet verklaard. (DryLab® Chromatography Reference Guide, 2009) Voor de visualisatie van het scheidingsproces wordt een detector geplaatst aan het uiteinde van de kolom. De detector reageert op de aanwezigheid van eluerende componenten in de mobiele fase, via het meten van een fysische eigenschap die de componenten bezitten. De mobiele fase bezit deze fysische eigenschap niet of slechts in geringere mate dan de componenten. De gemeten eigenschap wordt vervolgens omgezet in een elektrisch signaal. De registratie van de elutie van de componenten in functie van de tijd wordt gedefinieerd als het chromatogram. 1.3.2 Reversed phase liquid solid chromatography (RP-LSC) Bij de gehaltebepaling van BAC wordt reversed phase (RP) liquid solid chromatography (LSC) toegepast. Bij RP-LSC wordt een apolaire, vaste stationaire fase gecombineerd met een polaire, vloeibare mobiele fase. (http://www.chem.agilent.com) 7


Jill Deflou

Voor de gehaltebepaling van BAC wordt een C8-RP kolom gebruikt als stationaire fase en een mengsel van fosfaatbuffer en acetonitrile, afgekort ACN, als mobiele fase. De stationaire fase is meestal opgebouwd uit een pakking van polaire silicapartikels. RP-LSC vereist een apolaire stationaire fase dus de silicapartikels moeten chemisch gemodificeerd worden. Dit gebeurt door het aanhechten van lange alkylketens aan het silica oppervlakte. In een C8-RP kolom wordt één silicapartikel chemisch voorgesteld als (CH3)3-Si-O-Si-(CH3)2-R met als R-groep een octylketen. (http://www.chem.agilent.com) Polaire componenten, die aanwezig zijn in de mobiele fase, worden sterk aangetrokken tot de polaire mobiele fase. Apolaire componenten daarentegen, worden sterk aangetrokken tot de stationaire fase, meer bepaald tot de alkylketens op het oppervlakte van de silicapartikels. Deze aantrekking wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van Van Der Waalse attractiekrachten. Dit betekent dat de meest polaire componenten van het mengsel als eerste elueren en de meest apolaire componenten als laatste. (http://www.chem.agilent.com) Bij high performance liquid chromatography (HPLC) wordt de mobiele fase doorheen het chromatografisch systeem gepompt met een maximale druk van 40000 kPa. De genereerde druk laat toe om kolommen te gebruiken met kleinere partikeldeeltjes. Dit zorgt op zijn beurt voor een groter oppervlakte, waarin de interactie optreedt tussen de stationaire fase en de componenten in de mobiele fase. Dit resulteert in een betere scheiding van de componenten in een mengsel. (http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html) 1.3.3 Chromatografische parameters Chromatografische parameters worden gebruikt om een scheiding te karakteriseren. We onderscheiden de piek-, scheidings- en kolom-afhankelijke parameters. Onderstaande definities gelden allereerst voor isocratische scheidingen, waarbij de samenstelling van de mobiele fase constant wordt gehouden. (DryLab® Chromatography Reference Guide, 2009) 1.3.3.1 Piekparameters Tot de piekparameters behoren de retentie- en de hold-up tijd, de retentiefactor, de piekhoogte, -oppervlakte, -breedte en de symmetriefactor. De retentietijd tR is de tijd vanaf de injectie tot de maximale detectorrespons van een piek in een chromatogram. Het retentievolume VR is het volume mobiele fase, dat vereist is om een piek te elueren. Tijd en volume wordt in deze context vaak door elkaar gebruikt.

8


Jill Deflou

De hold-up tijd tM is de tijd nodig om een onweerhouden component te elueren. Deze is afhankelijk van het volume mobiele fase aanwezig in de kolom. Het volume moet namelijk worden verplaatst alvorens elutie kan optreden. Het hold-up volume VM is het volume mobiele fase, dat vereist is voor de elutie van een onweerhouden component. Voor de gehaltebepaling van een component wordt de piekhoogte h of het piekoppervlakte gebruikt. De voorgenoemde piekparameters worden geïllustreerd in Figuur 1.3.

FIGUUR 1.3 : ILLUSTRATIE VAN DE RETENTIETIJD tR, DE HOLD-UP TIJD tM, DE PIEKHOOGTE h, DE PIEKBREEDTE TUSSEN DE BUIGPUNTEN wi EN DE PIEKBREEDTE OP HALVE HOOGTE wh IN EEN CHROMATOGRAM. (European Pharmacopoeia 6.4, 2008)

In Figuur 1.3 wordt tevens de breedte van een piek geïllustreerd. In de praktijk worden twee definities toegepast. Als eerste onderscheiden we wi, dit is de piekbreedte tussen de buigpunten. Hiervoor worden de raaklijnen getrokken aan het stijgende en het dalende gedeelte van een piek. De piekbreedte zelf is de afstand tussen het snijpunt van de raaklijnen met de betreffende piek. Bij voorkeur wordt de piekbreedte niet op deze manier bepaald doordat het trekken van raaklijnen uiterst subjectief is. Als tweede onderscheiden we wh, dit is de piekbreedte op halve hoogte. Hierbij wordt de afstand gemeten tussen het stijgende en het dalende gedeelte van de piek op halve hoogte. Dit is een meer reproduceerbare manier om de piekbreedte uit te drukken. (DryLab® Chromatography Reference Guide, 2009) De volgende piekparameter is de retentiefactor k. Deze dimensieloze parameter is een maat voor de retentie. De waarde geeft het aantal kolomvolumes van de mobiele fase weer, die nodig zijn om een piek te elueren, nadat het initieel volume van de kolom werd verplaatst. 9


Jill Deflou

Een piek met retentiefactor gelijk aan nul bezit een retentietijd tR gelijk aan de hold-up tijd tM. Een piek met retentiefactor gelijk aan één vereist voor de elutie een additioneel kolomvolume waardoor de retentietijd tR groter is dan de hold-up tijd tM. Bij de wijziging van de kolomlengte of de flow rate van de mobiele fase blijft de retentiefactor k onveranderd. De retentiefactor wordt berekend aan de hand van volgende formule: (1.1) waarin:

k: retentiefactor (dimensieloos) tR: retentietijd (min) tM: hold-up tijd (min)

Bij de beschrijving van een chromatografische piek is vooral de piekvorm van belang. Idealiter heeft deze de Gaussiaanse of symmetrische vorm. De vorm wordt gekarakteriseerd aan de hand van de symmetriefactor AS. Een symmetriefactor gelijk aan 1 betekent dat de piek perfect Gaussiaans is. Een waarde groter dan 1 wijst op tailing van de piek, waarbij de vorm scheefheid naar rechts vertoont. Tailing wordt veroorzaakt door de adsorptie van een component aan actieve plaatsen in de injector of in de kolom. Een waarde kleiner dan 1 wijst op fronting van de piek, waarbij de vorm scheefheid naar links vertoont. Fronting wordt veroorzaakt door de overbelading van een component op de kolom. De symmetriefactor wordt berekend aan de hand van volgende formule: (1.2) waarin:

AS: symmetriefactor (dimensieloos) w0,05: breedte van de piek op 1/20 van de piekhoogte (min) d: afstand tussen de loodrechte vanuit de maximale detectorrespons en het opstijgend gedeelte van de piek op 1/20 van de piekhoogte (min)

(DryLab® Chromatography Reference Guide, 2009)

1.3.3.2 Scheidingsparameters De belangrijkste scheidingsparameters zijn de selectiviteitsfactor en de resolutie. De selectiviteitsfactor α is een maat voor de geschiktheid van het systeem om twee componenten te onderscheiden. Deze factor wordt berekend door de retentiefactor k van de traagst eluerende component te delen door de retentiefactor k van de snelst eluerende component. De verhouding moet voldoende groot zijn om selectiviteit tussen de componenten te bekomen. 10


Jill Deflou

De resolutie RS is een maat voor de scheiding van twee opeenvolgende pieken in een chromatogram. Elk piekenpaar bezit een verschillende resolutiewaarde. Bij een scheiding wordt telkens gestreefd naar basislijnresolutie, die een waarde groter dan 1,5 vereist. Hierbij is de overlap van pieken van dezelfde grootte, kleiner dan 1% van hun piekoppervlakte. De resolutie speelt ook een rol in de robuustheid van een scheiding. Een waarde groter dan 1,7 minimaliseert de kans dat de methode in het gedrang komt door minieme variaties in de scheidingscondities. Nog hogere waarden dragen bij in de compensatie van toenemende piekverbreding door de veroudering van de kolom. De resolutie kan rechtstreeks uit het chromatogram worden berekend aan de hand van volgende formule: (1.3) waarin:

RS: resolutie tussen de twee beschouwde pieken (dimensieloos) tR1: retentietijd van de snelst eluerende piek (min) tR2: retentietijd van de traagst eluerende piek (min) wh1: piekbreedte op halve hoogte van de snelst eluerende piek (min) wh2: piekbreedte op halve hoogte van de traagst eluerende piek (min)

De resolutie kan systematisch worden aangepast door de variatie van de retentiefactor k, de selectiviteitsfactor α en het plaatgetal N. Het begrip plaatgetal zal in het volgende onderdeel, 1.3.3.3 Kolom-afhankelijke parameters, worden verklaard. De parameters verhouden zich volgens de resolutievergelijking: (1.4) waarin:

RS: resolutie tussen de twee beschouwde pieken (dimensieloos) N: plaatgetal van de twee beschouwde pieken (dimensieloos) α: selectiviteitsfactor van de twee beschouwde pieken (dimensieloos) k: gemiddelde retentiefactor van de twee beschouwde pieken (dimensieloos)

De resolutie wordt verhoogd door de verhoging van de retentiefactor k, maar tevens verkleinen de piekhoogtes en wordt de runtijd significant verlengd. Een verhoging wordt ook bereikt door het verhogen van het plaatgetal N. Hierbij vernauwen de piekbreedtes met behoud van hun positie ten opzichte van elkaar. Tenslotte bij de vergroting van de selectiviteitsfactor α verschuiven de pieken relatief ten opzichte van elkaar. Deze verschuiving kan resulteren in een verhoging van de resolutie. 11


Jill Deflou

Figuur 1.4 illustreert hoe het ongescheiden piekenpaar wordt gescheiden door de variatie van de retentiefactor k, het plaatgetal N en de selectiviteitsfactor α.

FIGUUR 1.4 : EFFECT OP DE RESOLUTIE DOOR DE VARIATIE VAN RETENTIEFACTOR k, PLAATGETAL N EN SELECTIVITEITSFACTOR α. (DryLab® Chromatography Reference guide, 2009)

1.3.3.3 Kolom-afhankelijke parameters De belangrijkste kolom-afhankelijke parameters zijn het plaatgetal N en de plaathoogte HETP. De efficiëntie van een scheiding wordt traditioneel uitgedrukt aan de hand van het plaatgetal N. Het is de verzameling van het aantal theoretische platen die een kolom bezit. Eén theoretische plaat wordt beschouwd als het volume van de stationaire fase en de voorbijgaande mobiele fase, waarin één volledige uitwisseling plaatsvond. Het plaatgetal beschrijft dus het aantal successieve theoretische platen, die een kolom bevat. De grootte van één theoretische plaat is niet gekend, maar met behulp van volgende formule kan het plaatgetal berekend worden: (1.5) waarin:

N: plaatgetal (dimensieloos) tR: retentie van de piek (min) wh: piekbreedte op halve hoogte (min)

Het plaatgetal varieert naargelang de te analyseren component, de gebruikte kolom, de kolomtemperatuur, de mobiele fase en de retentietijd van de component. Figuur 1.5 illustreert hoe een piek smaller wordt, naarmate het plaatgetal N van een piek groter wordt.

12


Jill Deflou

De initieel scherp afgelijnde concentratieverschillen van het geïnjecteerd staal worden weergegeven met behulp van een stippellijn. Tijdens de migratie doorheen de kolom vervaagt deze vorm en neemt de Gaussiaanse vorm aan.

FIGUUR 1.5 : VERBAND TUSSEN HET PLAATGETAL N EN DE VORM VAN EEN CHROMATOGRAFISCHE PIEK.

Een tweede belangrijke parameter is de plaathoogte HETP naar de Engelse term „Height Equivalent to a Theoretical Plate‟. De plaathoogte wordt uitgedrukt in het aantal millimeter waarin een volledige uitwisseling en verdeling heeft plaatsgevonden. Een kleine waarde in plaathoogte resulteert in een groot plaatgetal. Dergelijke kolom voor een gegeven kolomlengte bezit een goed scheidend vermogen door de productie van smalle pieken. Er zijn drie factoren die een invloed hebben op de piekhoogte namelijk de Eddy diffusie (term A), de longitudinale diffusie (term B) en de massatransfer (term C). Deze processen worden gebruikt voor de beschrijving van de piekverbreding. De relatie tussen de processen wordt geformuleerd aan de hand van de Van Deemter vergelijking: 𝐻𝐸𝑇𝑃 = 𝐸𝑑𝑑𝑦 𝑑𝑖𝑓𝑓𝑢𝑠𝑖𝑒 𝐴 +

𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑𝑖𝑛𝑎𝑙𝑒 𝑑𝑖𝑓𝑓𝑢𝑠𝑖𝑒 𝑓𝑙𝑜𝑤 𝑟𝑎𝑡𝑒 𝜇

𝐵

+ 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑓𝑒𝑟 𝐶 x 𝑓𝑙𝑜𝑤 𝑟𝑎𝑡𝑒 (𝜇)

(1.6)

* De Eddy diffusie is verantwoordelijk voor piekverbreding doordat de kolompakking diverse banen met een verschil in lengte en diameter bezitten. Elke molecule volgt willekeurig een baan met als gevolg dat verschillende moleculen met een verschillende snelheid diffunderen doorheen de kolom. Figuur 1.6 illustreert de piekverbreding ten gevolge van de Eddy diffusie.

FIGUUR 1.6 : PIEKVERBREDING VEROORZAAKT DOOR DE EDDY DIFFUSIE.

13


Jill Deflou

* De longitudinale diffusie treedt op doordat moleculen diffunderen van een plaats met hoge naar een plaats met lage concentratie ten gevolge van de willekeurige beweging van deeltjes. De beweging doorheen de kolom gebeurt zowel in de voor- als achterwaartse richting. Dit zorgt voor piekverbreding. Het effect van de longitudinale diffusie verkleint naarmate de flow rate groter wordt. Het concentratieverschil in de kolom wordt geïllustreerd in Figuur 1.7.

FIGUUR 1.7 : OORZAAK VAN DE LONGITUDINALE DIFFUSIE IN EEN KOLOM.

* De massatransfer wordt veroorzaakt door het continu overgaan van componenten van de stationaire naar de mobiele fase en omgekeerd. Elke overgang wordt voorafgegaan door het bereiken van een evenwicht. Hoe meer tijd het bereiken van het evenwicht in beslag neemt, hoe groter de piekverbreding zal zijn. Normaliter verloopt de overgang van de stationaire fase naar de mobiele fase het traagst. In Figuur 1.8 worden zowel de afzonderlijke componenten van de Van Deemter vergelijking geïllustreerd als de resultante van de drie curven namelijk de Van Deemter curve. De Van Deemter curve vertoont een minimum in plaathoogte HETP bij een bepaalde flow rate µ van de mobiele fase. In dit punt wordt de optimale efficiëntie van het chromatografisch systeem bereikt. Dit betekent dat het grootst mogelijke plaatgetal N wordt behaald.

FIGUUR 1.8 : DE OPTIMALE EFFICIËNTIE WORDT BEREIKT BIJ DE MINIMALE PLAATHOOGTE HETP BIJ EEN BEPAALDE FLOW RATE µ VAN DE MOBIELE FASE.

14


Jill Deflou

1.3.4 UV-detector De ultraviolet (UV)-detector is, ondanks zijn gebrek aan specificiteit, de meest toegepaste detector in de HPLC. Het toepassen van UV-detectie vereist dus een hoge graad aan resolutie voor de te analyseren componenten. De UV-detector wordt verkozen boven andere detectoren door z‟n uitstekende lineariteit en de mogelijkheid om snelle kwantitatieve analysen uit te voeren ten opzichte van één enkele standaardoplossing van een component. (Nikolin et al., 2004)

Bij een gehaltebepaling wordt een Variable Wavelength Detector (VWD) gebruikt. Deze is opgebouwd uit een UV-lamp, hier een deuteriumlamp die licht uitzendt gaande van 190 nm tot 400 nm. Een volgend onderdeel is een spleet, die zorgt voor de regeling van de lichtintensiteit, die invalt op een rooster. Het rooster zorgt voor de golflengteselectie van het monochromatisch licht. Via een andere spleet wordt het licht gestuurd naar de flowcel. Tenslotte valt de lichtbundel in op een lichtsensor, waar het detectorsignaal wordt opgewekt. Figuur 1.9 illustreert de opbouw van een VWD.

FIGUUR 1.9 : SCHEMATISCHE VOORSTELLING VAN EEN VARIABLE WAVELENGTH DETECTOR. (http://www.lcresources.com/resources/getstart/2e01.htm)

UV-detectie is gebaseerd op de absorptie van UV-licht door een chromofoor. BAC bezit slechts één chromofoor namelijk de aromatische ring. Deze absorbeert een bepaalde hoeveelheid UV-licht, afhankelijk van de concentratie BAC aanwezig in de mobiele fase. De wet van Lambert-Beer beschrijft het rechtlijnig verband tussen de absorptie van licht en de concentratie van een component: 𝐴 = 𝜀x𝑀x𝑙 waarin:

(1.7)

A: absorptie (dimensieloos) ε: molaire absorptiecoëfficiënt (L/mol.cm) M: molaire concentratie (mol/L) l: weglengte van het licht (cm)

15


Jill Deflou

Bij de gehaltebepaling van BAC wordt golflengte 214 nm geselecteerd. De mobiele fase bestaat uit een mengsel van fosfaatbuffer/ACN die een cutt-of waarde van 190 nm bezit. Bij elutie van enkel mobiele fase wordt er geen licht geabsorbeerd, waardoor een maximale hoeveelheid licht de sensor bereikt. BAC absorbeert een hoeveelheid licht, waardoor minder licht de sensor bereikt. Dit zorgt voor een verandering in het detectorsignaal. Dit signaal wordt elektronisch geïnverteerd door het dataverwerkingssysteem, waarbij een positieve piek verschijnt in het chromatogram. De grootte van de piek is in verhouding met de BAC concentratie. (http://www.lcresources.com/resources/getstart/2e01.htm) De concentratie van een component wordt vervolgens berekend aan de hand van zijn piekoppervlakte. De piekoppervlakte is namelijk in verhouding met de concentratie van een eluerende component. De piekoppervlakte en bijbehorende concentratie wordt automatisch berekend door middel van het EZChrom Elite datasysteem. De manuele berekening van de concentratie wordt toegelicht in het onderdeel 4.2.1 Vergelijkende datatest. 1.4

TRANSFORMATIE NAAR FAST LC Conventioneel gebeurt de gehaltebepaling van BAC door middel van HPLC. De

methode heeft als nadeel dat de runtijd 55 minuten bedraagt indien de C16-homoloog aanwezig is. Een evolutie naar snellere, maar even efficiënte methoden is noodzakelijk voor de farmaceutische industrie door de stijgende tijdsdruk om stalen te analyseren. Een bijkomende reden is de belasting op het milieu door het hoge solvensverbruik. Dergelijke lange analysen vereisen namelijk een grote hoeveelheid solvens. Een reductie in de runtijd resulteert dus ook in een reductie van het solvensverbruik. (Nováká et al., 2006) De meest drastische reductie in de runtijd, met behoud van resolutie, wordt bekomen door Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC). Hierbij worden kolommen gebruikt met zeer kleine afmetingen namelijk 50 mm kolomlengte en 1 mm interne diameter. De kolommen zijn opgebouwd uit sub-2 µm partikeldeeltjes. Dit resulteert in scheidingen binnen een aantal minuten of zelfs seconden. Nadelen van UPLC is de vereiste aankoop van enerzijds aangepaste pompen door de hoge gegenereerde druk en anderzijds een aangepaste detector en dataverwerkingssysteem doordat de componenten elueren in een korte tijdspanne. De detector en het dataverwerkingssysteem moeten in staat zijn om meer metingen per seconde uit te voeren en te verwerken. (Nováká et al., 2006)

16


Jill Deflou

Bij Fast Liquid Chromatography worden kolommen gebruikt met afmetingen in de orde van 50 mm kolomlengte en 3 mm interne diameter. De kolommen zijn gepakt met 3 µm partikeldeeltjes. Een conventionele HPLC kolom bezit een kolomlengte van 150 mm, een interne diameter van 4,6 mm en is gepakt met 5 µm partikeldeeltjes. Bij Fast LC blijft de gegenereerde druk onder 40000 kPa, waardoor de conventionele HPLC toestellen kunnen gebruikt worden. Anderzijds elueren de componenten in dergelijke tijdspanne dat de conventionele detector en dataverwerkingssysteem kunnen gebruikt worden. Fast LC is als het ware een compromis tussen HPLC en UPLC. (Guillarme et al., 2007) Dit is niet de hoofdreden waarom in Alcon de transformatie naar Fast LC wordt verkozen boven de transformatie naar UPLC. De gehaltebepaling van BAC door middel van HPLC is een gevalideerde methode. Concrete informatie wat deze methodevalidatie inhoudt, wordt nader verklaard in het onderdeel 1.4.2 Methodevalidatie. De transformatie naar UPLC vereist telkens hervalidatie van de methode. Hervalidatie bezit een hoge kostprijs en neemt tevens veel tijd in beslag waardoor de financiële voordelen van UPLC, naast het aankopen van aangepaste apparatuur, al wat vervagen. De transformatie naar Fast LC daarentegen, vereist niet steeds hervalidatie. Er mogen namelijk bepaalde aanpassingen worden uitgevoerd op een gevalideerde methode. De toegestane aanpassingen worden zorgvuldig gedocumenteerd in de verschillende Pharmacopoeiae. Deze worden nader toegelicht in het onderdeel 1.4.2 Methodevalidatie. 1.4.1 Theoretische achtergrond Fast LC De belangrijkste aanpassing in de transformatie naar Fast LC is het gebruik van Fast LC kolommen. De kolommen zijn korter en bezitten een kleinere interne diameter waardoor de flow rate kan worden opgedreven, resulterend in een kortere runtijd. De kolommen zijn gepakt met kleinere partikels om verlies in resolutie te vermijden. De kolomefficiëntie is namelijk omgekeerd evenredig met de vierkantswortel van de partikeldiameter. (Guillarme et al., 2007) Eveneens is de vereiste druk om mobiele fase doorheen het systeem te pompen

omgekeerd evenredig met de vierkantswortel van de partikeldiameter. Een reductie in de partikeldiameter heeft een stijging in druk tot gevolg. Bij gebruik van 3 µm gepakte kolommen is de druk lager dan 40000 kPa. Dit is de maximale druk die conventionele HPLC systemen kunnen genereren. (Fekete et al., 2010) Figuur 1.10 illustreert de invloed van de partikeldiameter van een kolom op de Van Deemter curve.

17


Jill Deflou

FIGUUR 1.10 : DE VAN DEEMTER CURVE VOOR 3, 5 en 10 µm GEPAKTE KOLOMMEN. DE 3 µm GEPAKTE KOLOM WORDT PREFERENTIEEL GEKOZEN VOOR FAST LC DOOR HET VLAKKER VERLOOP VAN DE VAN DEEMTER CURVE. (http://las.perkinelmer.de/Content/TechnicalInfo/TCH VanDeemtersCurves.pdf)

We merken op in Figuur 1.10 dat de optimale efficiëntie een steeds vlakker verloop kent naarmate de kolommen met kleinere partikels zijn gepakt. Deze afvlakking is te wijten aan de reductie van de massatransfer, term C, in de Van Deemter vergelijking. Bij de 3 µm gepakte kolommen kan de flow rate dus voorbij de optimale waarde worden opgedreven, zonder dat er een significant verlies optreedt in resolutie. (http://www.dionex.com/en-us/webdocs/66091-Fast%20LC%20LPN%202030-01.pdf)

Een correct gepakte kolom vertoont een plaathoogte HETP die bij benadering equivalent is aan de partikeldiameter. Het plaatgetal N wordt berekend aan de hand van de volgende formule: 𝑁=

𝐿 𝐻𝐸𝑇𝑃

waarin:

≈

𝐿 𝑑𝑝

(1.8)

N: plaatgetal (dimensieloos) L: kolomlengte (mm) HETP: plaathoogte (mm) dp: partikeldiameter (mm)

Uit Formule (1.8) blijkt eveneens dat een reductie in de kolomlengte resulteert in een verlaging van het plaatgetal N. Bij het gebruik van Fast LC kolommen wordt een verdere daling in het plaatgetal gerapporteerd, te wijten aan extra-kolom piekverbreding. Verbreding van een piek wordt zowel veroorzaakt door de migratie in de kolom, als door extra-kolom effecten die optreden buiten de kolom. (Dolan, 2010) 18


Jill Deflou

Tot de extra-kolom effecten behoren het injectievolume, de afmetingen van de leidingen tussen de injector, de kolom en de detector, het volume van de flowcel van de detector en de snelheid van het dataverwerkingssysteem. Deze extra-kolom effecten worden geminimaliseerd aan de hand van volgend opgesomde aanpassingen. (Dolan, 2010) Een eerste aanpassing is de reductie van het injectievolume, waarbij een richtwaarde van 5 µl wordt gebruikt. Dit vermijdt de overbelading op de kolom en bijgevolg fronting van de pieken in het chromatogram. Een tweede aanpassing is het gebruik van een detector uitgerust met een kleinere flowcel. Het intern volume van de flowcel, waarin de detectie van het product gebeurt, moet preferentieel kleiner zijn dan 10 µl. De detectie zal op die manier gebeuren op een kleiner volume, waardoor een preciezere detectie wordt bereikt. (Dolan, 2010) Veel analysen vereisen ook een verhoging van de uitvoeringssnelheid van metingen door de detector. Componenten van een mengsel elueren bij snellere analysen veel sneller na elkaar. Bij Fast LC wordt aangeraden om een meting uit te voeren om de 0,1 seconde of zelfs nog sneller. Om de extra-kolom effecten te minimaliseren kan het ook noodzakelijk zijn om de leidingen van de conventionele HPLC systemen te vervangen door kortere en smallere leidingen. De belangrijkste leidingen zijn deze van de injector naar de kolom en van de kolom naar de detector. Indien mogelijk worden leidingen gebruikt met de kleinst mogelijke lengte en diameter om de extra-kolom effecten te minimaliseren. (Dolan, 2010) Bij de transformatie naar Fast LC heeft de reductie in de interne diameter van een kolom een aantal belangrijke gevolgen voor het chromatografisch systeem. Als eerste resulteert het in een daling van solvensverbruik doordat er minder volume migreert doorheen de kolom. Ten tweede ziet men een verbetering in de detectielimieten doordat de detectie gebeurt op een kleiner volume mobiele fase met daarin de componenten. Ten derde wordt ook een daling opgemerkt in de piekverbreding. Het volume mobiele fase waarin de componenten zitten is kleiner, waardoor ze sneller onafhankelijk kunnen overgaan van de stationaire naar de mobiele fase en omgekeerd, zonder elkaar te hinderen. Dit vermindert de piekverbreding. (http://www.dionex.com/en-us/webdocs/66091-Fast%20LC%20LPN%202030-01.pdf)

Door de reductie in interne diameter van de kolom moet de flow rate worden aangepast in verhouding met de verandering in interne diameter. Dit is noodzakelijk doordat de dwarsdoorsnede oppervlakte van de kolom hetzelfde moet zijn voor de HPLC kolom als voor de Fast LC kolom. In dit oppervlakte vindt de interactie plaats tussen de mobiele fase met daarin de componenten en de stationaire fase. 19


Jill Deflou

De aanpassing van de flow rate wordt berekend aan de hand van volgende formule: µ2 = µ1 x waarin:

𝐷2² 𝐷1²

(1.9)

µ2: flow rate van de Fast LC methode (ml/min) µ1: flow rate van de HPLC methode (ml/min) D2: interne diameter van de Fast LC kolom (mm) D1: interne diameter van de HPLC kolom (mm)

(http://www.dionex.com/en-us/webdocs/66091-Fast%20LC%20LPN%202030-01.pdf)

1.4.2 Methodevalidatie Elke analytische methode die gebruikt wordt in een laboratorium, dient gevalideerd te worden. Hierbij wordt nagegaan in hoeverre de methode voldoet aan de vooropgestelde analytische vereisten. Een methodevalidatie wordt uitgevoerd om te controleren of specifieke omstandigheden, waarin de methode wordt uitgevoerd, niet van die aard zijn dat er minder goede resultaten worden geproduceerd dan voorzien. (SIGMA Diagnostics, 1999) Voor de validatie van analytische methoden wordt gebruik gemaakt van een algemene procedure die opgesteld wordt in Alcon. In dit document, getiteld BESOP-00313, worden de verschillende validatietesten met hun bijbehorende specificaties beschreven. Specificaties zijn vooropgestelde waarden waaraan moet worden voldaan om wettelijk in orde te zijn. Dit wordt aangeduid met de term „in compliance zijn‟. BESOP-00313 wordt toegepast op de analyse van grondstoffen, actieve stoffen, hulpstoffen, onzuiverheden en afbraakproducten die aanwezig zijn in de producten. Validatie is een onderdeel van de algemene kwaliteitsbeoordeling „Good Manufacturing Practice‟, afgekort GMP. Het bestaat uit verschillende voorschriften waaraan producenten en personen, verantwoordelijk voor de bewerking en de verpakking van geneesmiddelen, moeten voldoen. Dit verzekert de veiligheid, de zuiverheid en de effectiviteit van het product. De GMP voorschriften vereisen een kwalitatieve aanpak in het volledige productieproces. Dit stelt bedrijven in staat om contaminatie, mix-up en fouten gedurende het productieproces te minimaliseren en zelfs te elimineren. Wanneer niet wordt voldaan aan de GMP voorschriften worden ernstige consequenties genomen zoals inbeslagname, boetes en zelfs gevangenisstraf. (http://www.gmp1st.com/gmp.htm)

20


Jill Deflou

Harmonisatie ten opzichte van de verschillende regulatoire instellingen wereldwijd is noodzakelijk gezien het internationaal karakter van Alcon. BESOP-00313 werd opgesteld rekening houdende met de volgende regulatoire instellingen: - ICH guidelines (International Conference on Harmonization) - FDA (Food and Drug Administration) - CDER (Center for Drug Evaluation and Research) - EP (European Pharmacopoeia) - USP (United States Pharmacopoeia) - JP (Japanese Pharmacopoeia) - BP (British Pharmacopoeia) BESOP-00313 beschrijft de validatietesten voor een analytische methode ter evaluatie van de specificiteit, lineariteit, accuraatheid, precisie, detectielimiet, kwantificatielimiet en de robuustheid. Het document beschrijft slechts algemene richtlijnen, dus specifieke validatie van een bepaald product kan noodzakelijk zijn. Indien dit voorkomt, wordt een validatieprotocol opgesteld, waarin extra vereisten en/of andere evaluatiecriteria worden vermeld. De ICH richtlijnen definiëren vier types van analytische methoden: de identificatietesten, de kwantitatieve testen voor onzuiverheden, de limiettesten voor onzuiverheden en de gehaltebepalingen. Voor de gehaltebepalingen zijn volgende validatietesten vereist: accuraatheid, precisie (herhaalbaarheid en intermediaire precisie), specificiteit, lineariteit en bereik. Bij de FDA vereisten wordt ook de robuustheid erbij gerekend. Deze validatietesten werden uitgevoerd bij de validatie van de gehaltebepaling van BAC d.m.v. HPLC. De toegestane aanpassingen op een gevalideerde HPLC methode voor isocratische scheidingen, zoals beschreven in BESOP-00313, zijn de volgende: - Samenstelling mobiele fase: de hoeveelheid component aanwezig in de laagste concentratie, mag tot ± 30% relatief of ± 2% absoluut worden aangepast. De grootste waarde mag worden gebruikt. Geen enkele component mag meer dan 10% absoluut worden aangepast. - pH van de waterige component van de mobiele fase: ± 0,2 pH variatie wordt aanvaard tenzij anders beschreven. Bij niet-ioniseerbare substanties wordt een ± 1,0 pH variatie aanvaard. - Zoutconcentratie in de buffer van de mobiele fase: ± 10% variatie wordt aanvaard. - Flow rate: ± 50% variatie wordt aanvaard, bij de variatie van één van de kolomdimensies wordt een grotere variatie aanvaard. 21


Jill Deflou

- Kolomdimensies: de kolomlengte mag ± 70% worden veranderd, de interne diameter ± 25%. - Stationaire fase: geen enkele verandering in de gebonden fase van de stationaire fase wordt toegelaten. De partikeldiameter van de stationaire fase mag worden verkleind met 50%. Geen enkele stijging in de partikeldiameter wordt toegelaten. - Temperatuur: indien de temperatuur vermeld wordt in de methode wordt een ± 10% variatie aanvaard, tenzij anders beschreven. - Detectorgolflengte: geen enkele aanpassing wordt toegelaten. - Injectievolume: een daling wordt toegestaan zolang de detectie en de herhaalbaarheid van de te bepalen pieken geschikt blijven. Geen enkele stijging wordt toegestaan. Bij de transformatie van de gehaltebepaling van BAC naar Fast LC worden enkel de gebruikte kolom, de flow rate en het injectievolume aangepast. De aanpassingen van deze parameters vallen onder de opgestelde grenzen zoals opgesomd in BESOP-00313. Dit betekent dat er geen hervalidatie van de methode wordt vereist. Om de transformatie op te starten wordt een „change control‟ opgesteld van BEMET00385. Dit is een intern rapport in Alcon, dat alle informatie bevat over de door te voeren aanpassing. Elke afdeling en persoon in Alcon, die een verantwoordelijkheid heeft in deze aanpassing, zal zijn betreffende informatie hieraan toevoegen en ondertekenen. Dit document wordt vervolgens gebruikt om voor te leggen aan de regulatoire instellingen dat de alternatieve kolom mag gebruikt worden in het laboratorium. Als eerste stap in de transformatie worden drie verschillende Fast LC kolommen gescreend. Uit deze resultaten wordt de beste kolom gekozen waarop de vergelijkende datatest, robuustheid en tenslotte batch-to-batch reproduceerbaarheid worden uitgevoerd. De laatste test is niet verplichtend, aangezien het niet werd opgenomen in BESOP-00313, maar het is voor Alcon zelf een meerwaarde. De testen worden achtereenvolgend uitgelegd. De procedure van de testen zelf wordt beschreven in het onderdeel 3 Materiaal en Methoden. 1.4.2.1 Screening Fast LC kolommen voor de bepaling van BAC Bij de screening van de Fast LC kolommen worden verschillende waarden van temperatuur, flow rate en samenstellingen van de mobiele fase getest op de verschillende kolommen. Telkens worden de chromatogrammen bestudeerd en wordt een system suitability uitgevoerd op vijf opeenvolgende injecties van een BAC standaardoplossing. 22


Jill Deflou

De system suitability toont aan of het chromatografisch systeem onder controle is. De volgende parameters worden berekend: de retentietijd, het plaatgetal en de symmetriefactor van de C12- en C14-homoloog, de resolutie tussen de C12- en de C14-homoloog en het percentage relatieve standaarddeviatie (RSD) op de totale piekoppervlakte van de BAC standaardoplossing. De grenzen waarbinnen de waarden moeten liggen, werden opgesteld aan de hand van de methodevalidatie. Indien de waarden zich buiten deze grenzen bevinden, wordt besloten dat het chromatografisch systeem niet onder controle is. Na een reeks van vijf injecties van een BAC standaardoplossing mogen maximaal zes injecties gebeuren van de bijbehorende analyse oplossingen. Een sequence, dit is de opeenvolging van injecties, wordt namelijk opgesplitst in verschillende blokken van vijf standaarden zes analyse injecties. Hieronder volgt een korte beschrijving van de Fast LC kolommen, die getest werden in de screening. Enkel de belangrijkste eigenschappen van de kolommen worden opgesomd. Luna C8(2) kolom “De Luna C8, generatie 2, kolom is opgebouwd uit ultrapure (99,99% zuiverheid), metaalvrije silicapartikels. De silicapartikel is perfect sferisch van vorm en bezit een extreem glad oppervlakte. Dit resulteert in een uniform gebonden silica oppervlakte, die zorgt voor een consistent gebonden stationaire fase. Dit betekent dat de vrije silanolgroepen virtueel geëlimineerd zijn door een complete binding en endcapping van de stationaire fase. De kolommen zijn stabiel bij een pH van 1,5 tot 10,0. Kortom, de Luna kolommen bezitten een hoge kolomefficiëntie, een grote methodeflexibiliteit en een lange kolomlevensduur.” (http://www.instrument.com.cn/Quotation/Manual/103841.pdf)

Halo C8 kolom “Halo C8 is een Fast LC kolom gebaseerd op het Fused-Core partikeldesign. Een Fused-Core partikel is opgebouwd uit een dun, poreus omhulsel van ultrapure silica rond een vaste silicakern. Dit design vertoont zeer hoge kolomefficiëntie te wijten aan de oppervlakkige diffusiewegen in het 0,5 µm dikke, poreuze omhulsel en een totale partikelafmeting van 2,7 µm. De Halo C8 kolom wordt best gebruikt bij een temperatuur lager dan 60°C voor een maximale levensduur van de kolom. Voor een maximale kolomstabiliteit wordt een pH van de mobiele fase aangeraden tussen pH 2 en 9. De Halo C8 kolommen zijn eveneens stabiel bij een gegenereerde druk tot 60000 kPa.” (http://www.hichrom.co.uk/assets/Products/AMT/HALO/Hilic-general-info.pdf)

23


Jill Deflou

YMC-Pack Pro C8 kolom “De YMC-Pack Pro C8 kolom behoort tot de ProFamilie en produceert hierdoor excellente piekvormen zelfs voor basische substanties. Dit is te wijten aan het laag metaalgehalte en de endcappingprocedure van de stationaire fase. De partikels zijn opgebouwd uit ultrapure silica en bezitten een partikeldiameter van 3 µm. De kolom is extreem stabiel in zure en alkalische solventen. De pH waarin de kolommen worden gebruikt wordt aangeraden binnen de range van 2,0 tot 7,5. De YMC-Pack Pro C8 bezit een exceptionele levensduur te wijten aan effectievere bindingstechnologieën met verdere bescherming en verlenging van de levensduur en de performantie van het silicapakkingsmateriaal.”(http://www.ymc-europe.com/ ymceurope/ products/analyticalLC/analyticalColumns/proFam/YMC_ProFamC8.html)

1.4.2.2 Vergelijkende datatest Bij de ontwikkeling van een nieuwe analytische methode, die bedoeld is equivalent te zijn aan een bestaande methode, moet een vergelijking van de methoden worden uitgevoerd. De vergelijking heeft als doel het aantonen van de equivalentie van de methoden. Elk te analyseren product met de bestaande methode, wordt geanalyseerd met beide methoden binnen een bepaalde tijdslimiet. Van elk product worden drie batchen geanalyseerd, bij voorkeur een out-of-shelf-life batch en twee recente batchen. Iedere batch wordt in drievoud geanalyseerd, dit betekent dat elke batch drie afzonderlijk bereide analyse oplossingen vereist. Belangrijk is dat de stalen uit eenzelfde batch worden gepooled alvorens de drie analyse oplossingen eruit worden bereid. Stel dat er vier oogdruppelflesjes van elke batch worden genomen, dan is het belangrijk dat alle vier de flesjes eerst homogeen worden gemengd. Dit compenseert voor de mogelijke variabiliteit van de BAC concentratie aanwezig in de afzonderlijke flesjes. Hierdoor kan gegarandeerd worden dat de gemeten BAC concentratie uit de drie afzonderlijk bereide analyse oplossingen gelijk is. De gegevens die moeten gerapporteerd worden zijn de gemiddelde BAC concentratie en het percentage RSD, van beide methoden. De evaluatiecriteria voor de gehaltebepaling van hulpstoffen, zoals BAC, worden als volgt beschreven: - het verschil in de gemiddelde BAC concentratie tussen beide methoden is kleiner of gelijk aan 5% - het percentage RSD van de resultaten van beide methoden is kleiner of gelijk aan 5% De methoden zijn equivalent indien er wordt voldaan aan deze evaluatiecriteria.

24


Jill Deflou

1.4.2.3 Robuustheid De robuustheid van een analytische methode wordt beschreven als de bepaling van de capaciteit van een methode om onveranderd te blijven bij kleine maar doelbewuste variaties in de chromatografische parameters. De test zorgt voor een indicatie van de betrouwbaarheid van een methode gedurende normaal gebruik. De opstelling van de test is gebaseerd op een Plackett-Burnam design. Een Plackett-Burnam design is een fractioneel design waarbij een aantal factoren K en het aantal experimenten N worden berekend volgens N = K + 1. Een bijkomende vereiste is dat het aantal uitgevoerde experimenten een veelvoud van vier moet zijn. Indien de berekening van N een getal oplevert dat geen veelvoud van vier is, moet het daarop volgende veelvoud van vier worden genomen. Bij de Fast LC methode worden acht factoren onderzocht dus N = 9. Het eerst volgende veelvoud van vier is twaalf, dus een design van twaalf experimenten wordt opgesteld. Dit design bezit elf factoren dus drie factoren worden niet ingevuld, genaamd de dummy factoren. Elk design bezit minstens drie dummy factoren. Het nominaal niveau bestaat uit de chromatografische parameters zoals bepaald in de Fast LC methode. Vervolgens wordt van elke parameter een plus en een min-niveau opgesteld door symmetrisch kleine veranderingen door te voeren ten opzichte van het nominale niveau. Elk van de twaalf runs is een samenstelling van een aantal plus en min-niveaus van de verschillende factoren. Voor en na de twaalf runs wordt een nominale run gelopen om aan te tonen dat er geen tijdseffect optreedt tussen de eerste en de twaalfde run. Een PlackettBurnam design samengesteld uit twaalf experimenten wordt geïllustreerd in Figuur 1.11.

FIGUUR 1.11 : PLACKETT-BURNAM DESIGN VOOR TWAALF EXPERIMENTEN.

25


Jill Deflou

Het grote voordeel van het Plackett-Burnam design is dat het aantal experimenten wordt beperkt tot een minimum, hoewel aanzienlijke hoeveelheid aan informatie wordt verschaft uit deze test. De resultaten tonen aan welke chromatografische parameters kritisch zijn voor de Fast LC methode. Bij een gehaltebepaling wordt vooral de invloed op de recovery bekeken, dit is de verhouding van de gemeten BAC concentratie tot de theoretische concentratie aanwezig in de analyse oplossing. 1.4.2.4 Batch-to-batch reproduceerbaarheid In deze test worden verschillende batchen van de gekozen Fast LC kolom getest. Het gebruik van andere batchen zou geen significant verschil mogen geven in de resultaten. Indien er toch afwijkende resultaten uit deze test treden, kan enerzijds worden gekozen om enkel de geschikte batch(en) te gebruiken bij de toepassing van de methode. Anderzijds voorspellen afwijkende resultaten niet veel goeds over de stabiliteit en de productie van de kolom, waardoor besloten kan worden dat de kolom niet geschikt is om te gebruiken in het laboratorium.

26

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 2

Jill Deflou

OBJECTIEVEN Benzalkoniumchloride is een antimicrobieel bewaarmiddel, dat wordt toegevoegd aan

oogproducten voor meervoudig gebruik. De gehaltebepaling van BAC dient ter controle van de concentratie vereist voor de antimicrobiële activiteit. Momenteel wordt de gehaltebepaling uitgevoerd d.m.v. HPLC, waarbij de runtijd 55 min bedraagt. Dit project kwam tot stand wegens de druk op de farmaceutische industrie om te evolueren naar snellere, maar even efficiënte methoden en bijkomend om de impact op het milieu te beperken. De meest revolutionaire methode voor de reductie van de runtijd is UPLC. Dit vereist echter het aankopen van aangepaste apparatuur zoals een UPLC systeem met bijbehorende detector en dataverwerkingssysteem. Fast LC daarentegen levert een minder drastische reductie in de runtijd op, maar de conventionele HPLC systemen kunnen, mits een aantal aanpassingen, gebruikt worden. Dit is echter niet de hoofdreden waarom Fast LC in Alcon wordt verkozen boven UPLC. De transformatie naar UPLC vereist steeds een kostelijk en tijdrovende hervalidatie van de methode. De transformatie naar Fast LC daarentegen kan worden verwezenlijkt zonder hervalidatie, indien de aanpassingen aan de methode zich binnen de toegestane grenzen van de verschillende regulatoire instellingen bevinden. De transformatie gaat van start door het opstellen van een „change control‟. Dit is een intern rapport, dat alle nodige informatie bevat om de transformatie te rechtvaardigen aan de autoriteiten. Men wil in de gehaltebepaling van BAC d.m.v. HPLC de Fast LC kolom en zijn bijbehorende aanpassingen aan de methode toevoegen als alternatief. Allereerst worden alle potentieel geschikte Fast LC kolommen met hun bijbehorende aanpassingen gescreend aan de hand van de te analyseren producten. Uit deze screening wordt de meest geschikte Fast LC methode geselecteerd aan de hand van de resultaten van de system suitability en de bijbehorende chromatogrammen. Daarna volgt de vergelijkende datatest op de gekozen Fast LC methode om de equivalentie met de huidige HPLC methode aan te tonen. Een volgende stap is het achterhalen of de Fast LC methode wel robuust is. Tevens wordt in deze test uitgezocht welke chromatografische parameters kritisch zijn voor de methode. Tot slot wordt de batch-to-batch reproduceerbaarheid van de Fast LC kolom onderzocht op drie verschillende batchen. Deze test wordt uitgevoerd om te controleren of de batchsoort geen invloed heeft op de resultaten. 27


Jill Deflou

MATERIAAL EN METHODEN MATERIAAL Er werd gebruik gemaakt van het HPLC systeem Agilent 1100 series met een UV-VWD

detector (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA). Het signaal werd gecontroleerd en verwerkt door gebruik te maken van het EzChrom Elite Chromatography Data System (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA) op een Dell computer. De volgende analytische kolommen werden gebruikt: Zorbax Eclipse XDB-C8 (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA), Luna C8(2) (Phenomenex, Torrance, California, USA), Halo C8 (HiChrom, Theale, UK) en YMC-Pack Pro C8 (YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan). Vervolgens worden ook een analytische balans Mettler Toledo (Zürich, Zwitserland), een pH-meter Metrohm 780 (Herisau, Zwitserland), een vortex VWR international (West Chester, Pennsylvania) en een centrifuge Eppendorf (Hamburg, Duitsland) gebruikt. 3.2

CHEMICALIËN EN REAGENTIA De volgende opgesomde chemicaliën en reagentia zijn vereist voor de uitvoering van de

gehaltebepaling van BAC volgens BEMET-00385. Acetonitrile geschikt voor HPLC (Merck 30) werd aangekocht bij Sigma-Aldrich (Saint-Louis, Missouri, USA). Geconcentreerd fosforzuur 85% (Merck 573) werd aangekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). Natrium hydroxide (Baker 7067) werd aangekocht bij J.T. Baker (Lopatcong Townchip, New Jersey, USA). Gedestilleerd water beschikbaar in het laboratorium werd voor gebruik gefiltreerd doorheen een 0,22 µm filter. De 50% waterige oplossing van BAC werd aangekocht bij FeF Chemicals (Køge, Denemarken). 3.3

METHODE In dit onderdeel volgt de volledige beschrijving van BEMET-00385, vereist voor de

gehaltebepaling van BAC op de te analyseren producten. Het document kan worden ingedeeld in drie onderdelen: de chromatografische parameters, de bereiding van de standaarden de analyse oplossingen en tenslotte de procedure om de stabiliteit van het chromatografisch systeem te garanderen. De te analyseren producten worden opgelijst onder 3.3.3 Bereiden van de analyse oplossing. Tevens worden de actieve bestanddelen en hun toepassing van deze producten opgesomd.

28


Jill Deflou

3.3.1 Chromatografische parameters Volgende chromatografische parameters worden ingesteld voor de bepaling van BAC door middel van HPLC. - Kolom: Zorbax Eclipse XDB-C8, 150 mm x 4,6 mm, 5 µm - Loopvloeistof: 500 ml fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / 500 ml ACN (Merck 30) Breng op pH 4,0 met geconcentreerd fosforzuur 85% (Merck 573). Bereiding fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 Verdun 5,8 ml geconcentreerd fosforzuur 85% (Merck 573) in ongeveer 900 ml water. Hierbij is het belangrijk om eerst water in de maatkolf te brengen want geconcentreerd fosforzuur is namelijk erg viskeus. Breng op pH 5,0 met NaOH (Baker 7067). Leng aan tot 1000 ml met water. - Kolomoven: 40°C - Flow rate: 1,2 ml/min - Detectie: UV, 214 nm - Injectievolume: 40 µl voor standaardoplossingen en producten met 0,1 mg BAC/ml 50µl voor alle andere standaardoplossingen en producten - Runtijd: 55 min (C16-homoloog aanwezig) - Retentietijden: C12-isomeer: 7,0 min (RRT 0,83) C12-homoloog: 8,4 ± 2,0 min (RRT 1,00) C14-homoloog: 17,7 min (RRT 2,11) C16-homoloog: 38,6 min (RRT 4,59). - System Suitability criteria op de standaard: TABEL 3.1 : SYSTEM SUITABILITY CRITERIA MET BIJBEHORENDE SPECIFICATIES GETEST OP VIJF OPEENVOLGENDE INJECTIES VAN DE BAC STANDAARDOPLOSSING

Retentietijd C12-homoloog (tr) Retentietijd C14-homoloog (tr) Plaatgetal C12- en C14-homoloog (N) Symmetriefactor C12- en C14-homoloog (AS) %RSD op totale oppervlakte van 5 STD injecties Resolutie tussen C12- en C14-homoloog (RS)

6,4 – 10,4 min 13,4 – 22,0 min ≥ 3000 ≤ 3,0 ≤ 2,0% ≥ 7,0

29


Jill Deflou

3.3.2 Bereiden van de standaardoplossing Weeg de BAC standaardoplossing steeds af in een bruine maatkolf gevuld met een beetje water om te vermijden dat het product aan de wand blijft kleven. De waterige BAC oplossingen mogen nooit worden geschud omwille van sterke schuimvorming. BAC bevindt zich namelijk in het schuim. Deze oplossingen moeten bijgevolg zeer voorzichtig worden gemengd. 3.3.2.1 Standaardoplossing voor producten met 0,1 mg BAC/ml Deze standaardoplossing wordt gebruikt voor de gehaltebepaling van BAC in Flucon, Isopto Carpine, Tetracaine 0,5%, Tears Naturale, Cyclogyl, Betaxolol, Dexa Sine, Isopto Alkaline, Isopto Tears, Cyclopentolat en Timolol 0,5%. Weeg nauwkeurig ongeveer 200,0 mg BAC 50% (gefactoriseerd ten opzichte van de Fort Worth R&D referentiestandaard) af in een bruine maatkolf van 100,0 ml. Leng aan met water en meng zorgvuldig. Verdun verder 2,0 ml tot 50,0 ml met mobiele fase en meng zorgvuldig. De eindconcentratie van deze standaardoplossing is 0,04 mg BAC/ml. 3.3.2.2 Standaardoplossing voor producten met 0,05 mg BAC/ml Deze standaardoplossing wordt gebruikt voor de gehaltebepaling van BAC in Carbachol en Protagent. Weeg nauwkeurig ongeveer 240,0 mg BAC 50% (gefactoriseerd ten opzichte van de Fort Worth R&D referentiestandaard) af in een bruine maatkolf van 100,0 ml. Leng aan met water en meng zorgvuldig. Verdun verder 2,0 ml tot 100,0 ml met mobiele fase en meng zorgvuldig. De eindconcentratie van deze standaardoplossing is 0,02 mg BAC/ml. 3.3.2.3 Standaardoplossing voor producten met 0,06 mg BAC/ml Deze standaardoplossing wordt gebruikt voor de gehaltebepaling van BAC in Ciprofloxacin. Weeg nauwkeurig ongeveer 240,0 mg BAC 50% (gefactoriseerd ten opzichte van de Fort Worth R&D referentiestandaard) af in een bruine maatkolf van 100,0 ml. Leng aan met water en meng zorgvuldig. Verdun verder 2,0 ml tot 100,0 ml met mobiele fase en meng zorgvuldig. De eindconcentratie van deze standaardoplossing is 0,02 mg BAC/ml.

30


Jill Deflou

3.3.2.4 Standaardoplossing voor producten met 0,04 mg BAC/ml Deze standaardoplossing wordt gebruikt voor de gehaltebepaling van BAC in Maxitrol. Weeg nauwkeurig ongeveer 160,0 mg BAC 50% (gefactoriseerd ten opzichte van de Fort Worth R&D referentiestandaard) af in een bruine maatkolf van 100,0 ml. Leng aan met water en meng zorgvuldig. Verdun verder 2,0 ml tot 100,0 ml met mobiele fase en meng zorgvuldig. De eindconcentratie van deze standaardoplossing is 0,016 mg BAC/ml. 3.3.3 Bereiden van de analyse oplossing De stalen mogen nooit worden geschud omwille van sterke schuimvorming! Om deze reden moeten de stalen zeer voorzichtig worden gemengd. De stalen met een verschillende BAC concentratie worden op eenzelfde manier bereid. Weeg nauwkeurig ongeveer 10,0 g product af in een bruine maatkolf van 25,0 ml. Leng aan met mobiele fase en meng zorgvuldig. De suspensies Flucon en Maxitrol moeten eerst worden gecentrifugeerd gedurende 15 min bij 15000 toeren per minuut totdat de bovenstaande vloeistof helder is. Volgende producten, met hun actief bestanddeel en toepassing,worden geanalyseerd met behulp van BEMET-00385: TABEL 3.2 : OVERZICHT VAN DE TE ANALYSEREN PRODUCTEN MET BEMET-00385. DE ACTIEVE BESTANDDELEN EN HUN TOEPASSING WORDEN TOEGELICHT

Product Flucon Isopto Carpine 1, 2 en 4% Cyclogyl 0,5 en 1% Dexa Sine Isopto Tears Timolol 0,5% Tetracaine 0,5% Cyclopentolat 0,5 en 1% Isopto Alkaline Tears Naturale Betaxolol Protagent Isopto Carbachol 1,5 en 3% Ciprofloxacin Maxitrol

Actief bestanddeel Fluorometholon Pilocarpinehydrochloridum Cyclopentolaathydrochloride Dexamethason Hypromellose Timolol Tetracaïnehydrochloride Cyclopentolaathydrochloride Hypromellose Dextran/Hypromellose Betaxolol Polyvinylalcohol Carbachol Ciprofloxacin Dexamethason Neomycinesulfaat/Polymyxine B

Toepassing Corticosteroid Cholinomimetica Anticholinergica Corticosteroid Kunsttranen β-blokker Lokale anesthetica Anticholinergica Kunsttranen Kunsttranen β-blokker Kunsttranen GM bij oogchirurgie Antibiotica Corticosteroid Antibiotica

31


Jill Deflou

3.3.4 Procedure Stabiliseer het chromatografisch systeem met behulp van mobiele fase totdat een stabiele basislijn wordt bekomen. Voer een system suitability uit op vijf opeenvolgende BAC standaardinjecties en controleer of de resultaten voldoen aan de system suitability criteria. Start de sequence, die opgebouwd is uit opeenvolgende blokken van vijf BAC standaardinjecties gevolgd door maximaal zes analyse injecties. Spoel na afloop gedurende tenminste een half uur de kolom en het chromatografisch systeem met ACN/water 500/500. 3.4

SCREENING FAST LC KOLOMMEN VOOR DE BEPALING VAN BAC Bij de screening wordt telkens één van de kritische chromatografische parameters

gevarieerd om de optimale condities te selecteren. De andere parameters worden behouden zoals in BEMET-00385. Volgende parameters worden één voor één gevarieerd: - temperatuur: 25°C, 30°C en 40°C - flow rate: 0,85 ml/min, 1,0 ml/min, 1,3 ml/min en 1,5 ml/min - verhouding ACN/water: 450/550 en 500/500 (zie 3.3.1 Chromatografische parameters) - injectievolume: 5 µl en 7 µl Als eerste wordt de screening uitgevoerd op de 0,1 mg BAC/ml standaardoplossing (zie 3.3.2.1 Standaardoplossing voor producten met 0,1 mg BAC/ml). Hieruit worden de geschikte chromatografische parameters geselecteerd. Vervolgens wordt een screening uitgevoerd op elk te analyseren product. Hierbij wordt een injectie van BAC standaardoplossing gevolgd door afwisselend een injectie van een te analyseren product en een injectie van de mobiele fase. De sequence wordt afgesloten door een injectie van de BAC standaardoplossing. Tot slot wordt een BAC identificatieoplossing geïnjecteerd waarin de C12-, C14- en de C16-homologen aanwezig zijn. Er wordt gebruik gemaakt van de gekozen optimale condities zoals bepaald in de screening van de Fast LC kolommen. Opnieuw wordt de sequence gestart en beëindigd met een injectie van de BAC/ml standaardoplossing. Bereiding identificatieoplossing BAC * Breng 50,0 mg C12-homoloog (Fluka Chemie, benzyldimethyldodecylammoniumbromide), 50,0 mg C14-homoloog (Sigma-Aldrich, benzyldimethyltetradecylammoniumchloride) en 50,0 mg C16-homoloog (Sigma-Aldrich, benzyldimethylhexadecylammoniumchloride) in een bruine maatkolf van 50,0 ml en leng aan met water tot volume. * Verdun 1,0 ml van deze oplossing in 10,0 ml mobiele fase 32


Jill Deflou

De volgende Fast LC kolommen worden gescreend: - Luna C8(2), 50 x 3 mm, 3 µm (Phenomenex) - Halo C8, 50 x 3 mm, 2,7 µm (HiChrom) - YMC-Pack Pro C8, 50 x 3 mm, 3 µm (YMC Co., Ltd.) 3.5

METHODEVALIDATIE

3.5.1 Vergelijkende datatest Voor de vergelijkende datatest worden drie batchen van elk product in drievoud ingezet voor zowel de HPLC methode als de Fast LC methode. Er wordt vertrokken vanuit een gepooled staal van elke batch. Hierbij wordt product, afkomstig uit verschillende oogdruppelflesjes van eenzelfde batch, zorgvuldig gemengd alvorens de analyse oplossing eruit wordt bereid. Een batch in drievoud inzetten betekent dat er drie opeenvolgende analyses gebeuren op eenzelfde batch. Elk van de drie analyses vereist een eigen set van bereide BAC standaardoplossingen (zie 3.3.2 Bereiden van de standaardoplossing) en analyse oplossingen van elk product (zie 3.3.3 Bereiden van de analyse oplossing). Gezien de grote hoeveelheid mobiele fase, die nodig is bij de HPLC methode om één analyse in te zetten, wordt voor elk van de analysen een vers bereide mobiele fase aangemaakt. (zie 3.3.1 Chromatografische parameters) Elke analyse is een opeenvolging van een aantal blokken. Een blok bestaat uit vijf opeenvolgende injecties van een BAC standaardoplossing, gevolgd door maximaal zes injecties van analyse oplossingen. Het te analyseren product moet volgen op de vijf injecties van de bijbehorende BAC standaardoplossing. De chromatografische parameters voor de HPLC methode worden behouden zoals weergegeven in BEMET-00385. Voor de Fast LC methode worden de optimale condities geselecteerd, die volgden uit de screening van de Fast LC kolom: - Kolom: YMC-Pack Pro C8 - Flow rate: 1,3 ml/min - Injectievolume: 5 µl voor standaarden analyse oplossing met 0,1 mg/ml BAC 7 µl voor de andere standaarden analyse oplossingen. De andere chromatografische parameters werden behouden zoals in BEMET-00385.

33


Jill Deflou

3.5.2 Robuustheid Voor de robuustheid wordt een Plackett-Burnam design toegepast. In de gehaltebepaling van BAC worden slechts drie dummy factoren gebruikt, die de factor E, F en G toegewezen krijgen. Een nominaal, een plus en een min-niveau wordt opgesteld voor elk van de factoren. De waarde van de verschillende niveaus zijn opgesomd in Tabel 3.3. TABEL 3.3 : OPSOMMING VAN HET NOMINAAL, PLUS EN MIN-NIVEAU VOOR DE ROBUUSTHEID VOLGENS EEN PLACKETT-BURNAM DESIGN

Elk van de twaalf verschillende runs is een combinatie van plus en min-niveaus van de verschillende factoren. Deze runs moeten worden gelopen in de opgestelde volgorde, zoals geïllustreerd in Tabel 3.4. TABEL 3.4 : PLACKETT-BURNAM DESIGN VOOR DE VARIATIE VAN MAXIMAAL 8 FACTOREN.

Elke run bestaat uit vijf injecties van de 0,1 mg BAC/ml standaardoplossing waarop een system suitability wordt uitgevoerd. Dit wordt gevolgd, in deze test, door elk één injectie van de worst case producten Isopto Carpine 4% en Cyclogyl 1%. 34


Jill Deflou

Volgende oplossingen moeten worden bereid voor de uitvoering van de robuustheid. Er wordt telkens verwezen tussen haakjes naar het bijhorend onderdeel van deze bereiding. - 0,1 mg BAC/ml standaardoplossing (3.3.2.1 Standaardoplossing voor producten met 0,1 mg BAC/ml) - Isopto Carpine 4% en Cyclogyl 1% (3.3.3 Bereiden van de analyse oplossing) - 5 liter fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 (3.3.1 Chromatografische parameters) - telkens 1 liter mobiele fase (3.3.1 Chromatografische parameters) * 500/500 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 4,0 (nominaal niveau) * 475/525 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 3,8 (min-min-niveau Halo) * 475/525 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 4,2 (min-plus-niveau Halo) * 575/425 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 3.8 (plus-min-niveau Halo) * 575/425 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 4,2 (plus-plus-niveau Halo) * 475/525 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 3,8 (min-min-niveau YMC) * 475/525 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 4,2 (min-plus-niveau YMC) * 525/475 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 3,8 (plus-min-niveau YMC) * 525/475 fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN. Breng op pH 4,2 (plus-plus-niveau YMC) De chromatografische parameters zoals de temperatuur, het injectievolume, de flow rate en de golflengte van de detector worden ingesteld in het EZChrom Elite datasysteem. Er worden dus twaalf verschillende methoden aangemaakt op basis van de opgegeven PlackettBurnam design volgens de plus en min-niveaus. De procedure hierbij gehanteerd is dezelfde zoals beschreven in 3.3.4 Procedure. 3.5.3 Batch-to-batch reproduceerbaarheid Voor de batch-to-batch reproduceerbaarheid wordt één injectie van de 0,1 mg BAC/ml standaardoplossing (zie 3.3.2 Bereiden van de standaardoplossing) uitgevoerd op elk van de drie beschikbare batchen van de Fast LC kolom. De gebruikte condities voor de chromatografische parameters zijn deze die volgden uit de screening van de Fast LC kolom: - Kolom: YMC-Pack Pro C8 - Flow rate: 1,3 ml/min - Injectievolume: 5 µl voor standaarden analyse oplossing met 0,1 mg BAC/ml 7 µl voor de andere standaarden analyse oplossingen. De andere chromatografische parameters werden behouden zoals in BEMET-00385.

35


Jill Deflou

RESULTATEN SCREENING FAST LC KOLOMMEN VOOR DE BEPALING VAN BAC De screening van de Fast LC kolommen bestaat uit diverse chromatogrammen van de

0,1 mg BAC/ml standaardoplossing en elk van de twintig te analyseren producten. Bij elke run worden de system suitability parameters bestudeerd. Hieronder worden de chromatogrammen en bijbehorende system suitability resultaten van één van de worst case producten, Cyclogyl 1%, weergegeven voor de drie verschillende Fast LC kolommen. De runs werden gelopen bij dezelfde temperatuur (40°C), flow rate (1,0 ml/min) en samenstelling van de mobiele fase fosfaatbuffer 0,1 M pH 5,0 / ACN (550/450). Het injectievolume bedraagt 5 µl. De overige parameters werden behouden zoals beschreven in BEMET-00385. 4.1.1 Luna C8(2) Chromatogram Cyclogyl 1% N C12: 5133 N C14: 5611 As C12: 1,21 As C14: 1,10 Rs tussen C12 en C14: 14,43

4.1.2 Halo C8 Chromatogram Cyclogyl 1% N C12: 3169 N C14: 5204 As C12: 1,60 As C14: 1,53 Rs tussen C12 en C14: 13,38

36


Jill Deflou

4.1.3 YMC-Pack Pro C8 Chromatogram Cyclogyl 1%

4.1.4 Optimale condities voor de transformatie naar Fast LC De onderstaande condities worden als optimaal beschouwd voor de Fast LC methode. Deze informatie werd gehaald uit de resultaten van de screening van de Fast LC kolommen. - Kolom: YMC-Pack Pro C8 - Flow rate: 1,3 ml/min - Injectievolume: 5 µl voor standaarden analyse oplossing met 0,1 mg BAC/ml 7 µl voor de andere standaarden analyse oplossingen. De overige parameters werden behouden zoals beschreven in BEMET-00385. In bijlage 2 worden typische chromatogrammen van elke BAC standaardoplossing en elk te analyseren product weergegeven zoals gelopen met de Fast LC methode. Tevens wordt hieronder het chromatogram van de injectie van de BAC homologen weergegeven. Injectie van de BAC homologen

37

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 4.2

Jill Deflou

METHODEVALIDATIE

4.2.1 Vergelijkende datatest Elke blok in een sequence wordt op onderstaande manier verwerkt: - uitvoeren van een system suitability test op de BAC standaardoplossing - correct benoemen en integreren van de BAC-pieken. De integratie gebeurt aan de hand van de threshold, width en valley to valley. De threshold beïnvloedt de positie van het starten stoppunt van de integratie en is gebaseerd op het principe van de eerste afgeleide (helling van een rechte). De width is een soort ruisonderdrukking, hoe groter de waarde des te meer datapunten worden samengevoegd via het gemiddelde en des te meer ruis wordt onderdrukt. Valley to valley gaat bij aaneensluitende pieken van het laagste tot laagste punt integreren. - berekening van het %RSD op elke run. De RSD is de verhouding van de standaarddeviatie tot de gemiddeld gemeten BAC concentratie. - berekening van de recovery van elk product. De recovery uitgedrukt in percentage wordt het „% label claim‟ genoemd. Dit is de BAC concentratie die aanwezig moet zijn in het product. De grenzen zijn vastgesteld op 95-105%. De gemeten BAC concentratie, wordt berekend aan de hand van volgende formule: 𝐵𝐴𝐶

mg 𝑚𝑙 = waarin:

𝐼𝑊𝑡𝑜𝑡𝑎𝑎𝑙 𝐴𝑛 x 𝑚𝑔 𝑆𝑇𝐷 x 0,5 x 2 𝑚𝑙 x 25 𝑚𝑙 x 𝑑 𝐼𝑊𝑡𝑜𝑡𝑎𝑎𝑙 𝑆𝑇𝐷 x 100 𝑚𝑙 x 50 𝑚𝑙 x 𝑔 𝐴𝑛 x 𝐹

IWtotaal = (IWC12 + IWC12-isomeer) x MgC12 + (IWC14 + IWC14-isomeer) x MgC14 + IWC16 x MgC16 MgC12: 340 g/mol MgC14: 368 g/mol MgC16: 396 g/mol IW: integratiewaarde van de piek, dit is de piekoppervlakte (dimensieloos) An / STD: analyse oplossing / standaardoplossing g: gewicht (gram) d: dichtheid van het product (g/ml) F: factor van de BAC standaardoplossing (dimensieloos)

Het % label claim wordt vervolgens berekend door de gemeten BAC concentratie, uitgedrukt in mg/ml te delen door de theoretische BAC concentratie aanwezig in het product. Deze verhouding wordt vermenigvuldigd met 100. Voor de verschillende producten is de theoretische BAC concentratie verschillend, zie 3.3.2 Bereiden van de standaardoplossing. De resultaten van de vergelijkende datatest wordt weergegeven in Tabel 4.1. 38


Jill Deflou

TABEL 4.1 : RESULTATEN VERGELIJKENDE DATATEST: DE GEMIDDELDE BAC CONCENTRATIE IN DRIE BATCHEN VAN ELK PRODUCT BEPAALD MET BEIDE METHODEN. HET VERSCHIL TUSSEN BEIDE CONCENTRATIES MOET KLEINER OF GELIJK ZIJN AAN 5% OM TE VOLDOEN AAN DE SPECIFICATIES. EVENEENS MOET HET %RSD OP ELK RESULTAAT BINNEN EEN METHODE KLEINER OF GELIJK ZIJN AAN 5% OM TE VOLDOEN AAN DE SPECIFACTIES ZOALS BEPAALD IN BESOP-00313

Product

Flucon

I. Carpine 1%

I. Carpine 2%

I. Carpine 4%

Cyclogyl 1%

Dexa sine

I. Tears

Timolol 0,5%

Tetracaïne 0,5% Cyclopentolat 1% Cyclogyl 0,5% Cyclopentolat 0,5%

I. Alkaline

Batch

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 1 2 1 2 3 1 2 3

Gemiddelde BAC concentratie Zorbax Eclipse (%) 99,17 97,70 98,93 98,27 98,37 98,10 100,57 100,27 100,23 101,97 100,20 101,93 107,17 106,30 106,67 97,60 97,07 95,60 96,67 95,17 96,37 101,67 102,20 100,63 105,07 105,87 107,90 97,60 96,13 107,63 106,90 96,90 95,30 96,93 96,43 95,70 96,67

Gemiddelde BAC concentratie YMCPack Pro (%) 99,83 98,43 98,43 98,07 98,53 98,13 100,40 100,00 100,30 101,30 100,40 100,77 106,87 106,50 106,93 97,07 97,00 95,17 98,13 95,80 97,10 101,30 102,27 99,83 105,33 107,03 108,17 98,33 95,07 107,80 106,97 96,90 96,93 96,43 95,87 95,30 96,43

Verschil (HPLC Fast LC)

% RSD Zorbax Eclipse (%)

% RSD YMCPack Pro (%)

0,66 0,73 0,50 0,20 0,16 0,03 0,17 0,27 0,07 0,67 0,20 1,16 0,30 0,20 0,26 0,53 0,07 0,43 1,46 0,63 0,27 0,37 0,07 1,20 0,26 1,16 0,27 0,73 0,06 0,17 0,07 0,00 1,63 0,50 0,56 0,40 0,24

0,72 0,18 0,69 0,51 0,16 0,62 2,42 2,76 2,54 3,37 2,95 4,13 0,55 0,56 0,75 0,47 0,63 1,37 0,42 0,49 0,32 0,64 0,54 0,98 3,72 0,93 1,37 1,21 2,04 0,51 0,09 0,52 4,05 0,99 0,63 0,89 1,55

1,89 0,79 0,79 0,77 0,33 0,48 2,17 3,14 3,20 3,36 3,29 3,44 0,70 0,38 0,19 0,63 0,37 1,22 1,75 0,58 1,08 1,00 1,07 0,42 1,52 1,92 0,35 0,31 0,58 0,80 0,48 0,10 0,66 0,63 0,34 0,76 0,32

39


Jill Deflou

TABEL 4.1 “(vervolg)” : RESULTATEN VERGELIJKENDE DATATEST: DE GEMIDDELDE BAC CONCENTRATIE IN DRIE BATCHEN VAN ELK PRODUCT BEPAALD MET BEIDE METHODEN. HET VERSCHIL TUSSEN BEIDE CONCENTRATIES MOET KLEINER OF GELIJK ZIJN AAN 5% OM TE VOLDOEN AAN DE SPECIFICATIES. EVENEENS MOET HET %RSD OP ELK RESULTAAT BINNEN EEN METHODE KLEINER OF GELIJK ZIJN AAN 5% OM TE VOLDOEN AAN DE SPECIFACTIES ZOALS BEPAALD IN BESOP-00313

Product

Tears Naturale

Betaxolol

Protagent

I. Carbachol 1,5%

I. Carbachol 3%

Ciprofloxacin

Maxitrol

Batch

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Gemiddelde BAC concentratie Zorbax Eclipse (%) 106,87 105,87 106,07 103,53 100,90 101,47 101,57 100,23 99,47 96,00 97,90 95,20 95,53 97,40 94,87 100,97 101,70 96,77 96,03 94,93 94,73

Gemiddelde BAC concentratie YMCPack Pro (%) 106,57 106,33 106,43 102,67 100,87 102,17 101,23 100,57 99,47 96,63 98,67 95,63 96,53 99,43 96,90 101,33 101,73 99,50 96,23 96,00 97,20

Verschil (HPLC – Fast LC)

% RSD Zorbax Eclipse (%)

% RSD YMCPack Pro (%)

0,30 0,46 0,36 0,86 0,03 0,70 0,34 0,34 0,00 0,63 0,77 0,43 1,00 2,03 2,03 0,36 0,03 2,73 0,20 1,07 2,47

1,82 1,07 1,18 2,38 1,54 1,31 0,79 1,80 1,10 1,15 1,44 1,55 2,04 1,28 1,78 1,77 1,81 0,83 0,57 1,08 1,57

0,67 0,05 0,82 1,53 0,77 0,34 1,03 0,65 0,82 0,30 0,38 0,64 0,66 0,99 0,37 0,90 0,97 3,31 0,16 0,42 1,41

4.2.2 Robuustheid Enkel de resultaten van het worst case product Cyclogyl 1% worden weergegeven, aangezien deze met Isopto Carpine 4% dezelfde kritische factoren aantoonden. Wanneer een bepaalde factor een significante invloed heeft op de recovery of op een system suitability parameter wordt dit aangeduid met een kruisje. Dit zijn de kritische factoren die verder onderzocht moeten worden. Een samenvatting van de kritische factoren wordt weergegeven in Tabel 4.2.

40


Jill Deflou

TABEL 4.2 : ROBUUSTHEID: SIGNIFICANTIE VAN DE VERSCHILLENDE FACTOREN OP DE RECOVERY OF OP EEN VAN DE SYSTEM SUITABILITY PARAMETERS

4.2.3 Batch-to-batch reproduceerbaarheid De resultaten van de system suitability test uitgevoerd op de BAC standaardoplossing met de drie batchen van de YMC-Pack Pro C8 kolom worden weergegeven in Tabel 4.3. TABEL 4.3 : BATCH-TO-BATCH REPRODUCEERBAARHEID OP DRIE BATCHEN VAN DE YMC-PACK PRO C8 KOLOM. DE SYSTEM SUITABILITY CRITERIA WORDEN WEERGEGEVEN VOOR ELK VAN DE DRIE BATCHEN

System Suitability criteria Retentietijd C12 (min) Retentietijd C14 (min) Plaatgetal C12 (dimensieloos) Plaatgetal C14 (dimensieloos) Symmetriefactor C12 (dimensieloos) Symmetriefactor C14 (dimensieloos) %RSD op totale oppervlak van 5 STD-injecties (%) Resolutie tussen C12 en C14 (dimensieloos)

Batch 1 1,61 3,55 3438 4319 1,37 1,34 0,12 11,91

Batch 2 1,62 3,50 3916 4956 1,33 1,21 0,16 12,40

Batch 3 1,62 3,48 4045 5350 1,36 1,23 0,09 12,72

41


Jill Deflou

DISCUSSIE SCREENING FAST LC KOLOMMEN VOOR DE BEPALING VAN BAC Een eerste vaststelling in het bestuderen van de chromatogrammen van Cyclogyl 1% is

dat de Luna C8 kolom geen stabiele basislijn bezit. Dit is te wijten aan interferentie van de matrixcomponenten in het product. Vervolgens worden de system suitability criteria bestudeerd, waaruit blijkt dat de YMC-Pack Pro C8 kolom een kleinere symmetriefactor en een significant hoger plaatgetal voor de C12-homoloog bezit dan de Halo C8 kolom. Om deze reden wordt de YMC-Pack Pro C8 kolom verkozen boven de Halo C8 kolom. In het chromatogram van Cyclogyl 1%, zoals bepaald met de YMC-Pack Pro C8 kolom, zien we dat de eerste piek, het C12-isomeer, elueert na 1,56 min. De laatst eluerende matrixpiek bezit een retentietijd van 1,05 min. Hieruit besluiten we dat de methode nog een bepaalde marge bezit om de runtijd te verkorten. Dit gebeurt enerzijds door de flow rate op te drijven naar 1,3 ml/min en anderzijds door extra ACN toe te voegen aan de mobiele fase zodat een samenstelling 500/500 wordt bereikt. In bijlage 2 worden typische chromatogrammen van de BAC standaardoplossingen en de te analyseren producten weergegeven die werden gelopen met de Fast LC methode. Elk van de chromatogrammen voldoen aan de specificaties van de system suitability op de BAC standaardoplossing. De injectie van de BAC-identificatieoplossing wordt gebruikt om de relatieve retentietijd (RRT) zoals weergegeven in BEMET-00385, te controleren. Deze zijn nagenoeg onveranderd gebleven. De specificatie op de retentietijd van C12 wordt aangepast naar 1,5 min ± 0,5 min, hierdoor elueert de C16-homoloog maximaal bij 9 min. Uit deze resultaten besluiten we dat de YMC-Pack Pro C8 kolom met z‟n bijbehorende condities geschikt is om de vergelijkende datatest op uit te voeren. 5.2

METHODEVALIDATIE

5.2.1 Vergelijkende datatest De resultaten kunnen ook geïllustreerd worden aan de hand van grafieken. Figuur 5.1 toont grafisch onmiddellijk aan dat het verschil in de gemeten BAC concentratie tussen beide methoden, in elk van de drie batchen van ieder product, kleiner is dan de specificatie van 5%. Figuur 5.2 (Zorbax) en Figuur 5.3 (YMC) tonen aan dat de %RSD op elk van de resultaten kleiner is dan de specificatie van 5%. De specificaties zijn opgelijst in BESOP-00313. 42


Jill Deflou

Verschil gemiddelde BAC concentratie (%) 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Batch 1 Batch 2 Batch 3

FIGUUR 5.1 : VERGELIJKENDE DATATEST: VERSCHIL IN GEMIDDELDE BAC CONCENTRATIE BEPAALD MET DE HPLC METHODE EN DE FAST LC METHODE OP DRIE BATCHEN VAN ELK STAAL. HET VERSCHIL (HPLC MIN FAST LC) MOET KLEINER OF GELIJK ZIJN AAN 5% OM TE VOLDOEN AAN DE SPECIFICATIE.

5 Percentage RSD op de 4,5 resultaten (%) 4

Zorbax Eclipse C8

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Batch 1 Batch 2 Batch 3

FIGUUR 5.2 : VERGELIJKENDE DATATEST: %RSD OP DRIE BATCHEN VAN ELK PRODUCT BEPAALD MET ZORBAX ECLIPSE C8. DIT PERCENTAGE MOET KLEINER OF GELIJK ZIJN AAN 5% OM TE VOLDOEN AAN DE SPECIFICATIE.

43

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 5 Percentage 4,5 RSD op de resultaten (%) 4

Jill Deflou

YMC-Pack Pro C8

3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Batch 1 Batch 2 Batch 3

FIGUUR 5.3 : VERGELIJKENDE DATATEST: %RSD OP DRIE BATCHEN VAN ELK PRODUCT BEPAALD MET YMC-PACK PRO C8. DIT PERCENTAGE MOET KLEINER OF GELIJK ZIJN AAN 5% OM TE VOLDOEN AAN DE SPECIFICATIE.

Uit deze resultaten besluiten we dat de Fast LC methode equivalent is aan de HPLC methode. Hierdoor mag de Fast LC methode als alternatieve methode worden gebruikt in BEMET-00385. Belangrijk hierbij is dat duidelijk wordt vermeld in BEMET-00385 dat bij gebruik van de YMC-Pack Pro C8 kolom de aangepaste flow rate (1,3 ml/min) en het aangepast injectievolume (5 µl of 7 µl) moeten worden toegepast. 5.2.2 Robuustheid Elke kritische factor, als kruisje weergegeven in Tabel 4.2, wordt opeenvolgend verklaard. Een kritische factor is een factor die bij een bepaalde variatie, aan de hand van het plus en min-niveau, faalde in het behalen van de recovery en/of één van de system suitability criteria. De system suitability criteria voor de Fast LC methode zijn identiek als weergegeven in Tabel 3.1, met dit verschil dat de retentietijd van de C12-homoloog werd aangepast naar 1-2 min en de C14-homoloog naar 2,5-4,5 min. Vervolgens wordt, indien de aard van de kritische factor dit toelaat, een interval opgesteld. Het interval toont aan binnen welke waarden van de kritische factor er moet gewerkt worden, opdat de factor onder controle zou zijn. Een interval opstellen voor de flowcel of het type Fast LC kolom is dus niet mogelijk. 44


Jill Deflou

Het interval wordt opgesteld aan de hand van de Ex- en Ecritical- waarde. Ex is het effect van een factor X op de recovery of op één van de system suitability criteria. Ecritical wordt afgeleid uit de t-test statistiek: Ecritical = tcritical x (SE)e. (SE)e is de standard error van een effect binnen het design. Een effect wordt als significant beschouwd indien de absolute waarde van Ex groter is dan Ecritical op het 0,05 α-niveau. Een schatting van (SE)e wordt berekend aan de hand van de dummy factoren. Aangezien de power van een statistische test met beperkt aantal vrijheidsgraden laag is, moeten er tenminste drie dummy factoren worden ingevoegd. Het interval wordt opgesteld aan de hand van volgende formule: [ Xnom ± ( ‫׀‬Xplus – Xmin‫ ׀‬x Ecritical ) / 2Ex ] waarin:

(5.1)

Xnom/plus/min: waarde van factor X bij het nominaal/plus/min-niveau Ecritical: kritisch effect Ex: effect van factor X op de recovery en de system suitability parameters

De gegevens nodig voor de berekening van het interval worden weergegeven in Tabel 5.1. De resultaten van system suitability voor de twaalf experimenten worden opgesomd in Tabel 5.2. TABEL 5.1 : ROBUUSTHEID: GEGEVENS VOOR DE BEREKENING VAN HET INTERVAL VAN DE KRITISCHE FACTOREN VAN DE FAST LC METHODE Factor Buffer YMC Buffer YMC Buffer YMC Buffer YMC Buffer Halo Buffer Halo Buffer Halo Buffer Halo Temperatuur Temperatuur Temperatuur pH MF pH MF Injectievolume Injectievolume Injectievolume Injectievolume Injectievolume Injectievolume Flow rate Golflengte

Parameter Nominaal

Min

Plus

tr C12 500ml 475ml 525ml tr C14 500ml 475ml 525ml N C12 500ml 475ml 525ml Rs 500ml 475ml 525ml tr C12 550ml 525ml 575ml tr C14 550ml 525ml 575ml N C12 550ml 525ml 575ml Rs 550ml 525ml 575ml Recovery 40°C 35°C 45°C tr C12 40°C 35°C 45°C tr C14 40°C 35°C 45°C tr C12 4 3,8 4,2 tr C14 4 3,8 4,2 %RSD 5µl 3µl 7µl N C12 5µl 3µl 7µl N C14 5µl 3µl 7µl As C12 5µl 3µl 7µl As C14 5µl 3µl 7µl Rs 5µl 3µl 7µl tr C12 1,3ml/min 1,2ml/min 1,4ml/min Recovery 214nm 208nm 220nm

Ecritical

Ex

Interval (-)

Interval (+)

11,83 17,64 21,50 12,23 11,83 17,64 21,50 12,23 1,03 11,83 17,64 11,83 17,64 55,15 21,50 20,46 13,42 15,99 12,23 11,83 1,03

66,42 86,69 30,50 26,51 66,42 86,89 30,50 26,51 1,12 15,81 23,41 12,67 18,69 65,81 30,06 21,21 14,59 18,93 13,44 12,50 1,12

496ml 495ml 482ml 488ml 546ml 545ml 532ml 538ml 35,4°C 36,3°C 36,2°C 3,81 3,81 3,3µl 3,6µl 3,1µl 3,2µl 3,3µl 3,2µl 1,21ml/min 208,48nm

504ml 505ml 518ml 512ml 554ml 555ml 568ml 562ml 44,6°C 43,7°C 43,8°C 4,19 4,19 6,7µl 6,4µl 6,9µl 6,8µl 6,7µl 6,8µl 1,39ml/min 219,52nm

45


Jill Deflou

TABEL 5.2 : OPSOMMING VAN DE SYSTEM SUITABILITY RESULTATEN VOOR ELK VAN DE TWAALF EXPERIMENTEN VAN HET PLACKETT-BURNAM DESIGN Assay

Recovery(%)

%RSD(%)

Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Y7 Y8 Y9 Y10 Y11 Y12

104,76 103,79 106,41 104,37 105,90 105,59 102,48 102,30 104,36 103,98 105,40 104,72

0,31 0,23 0,47 0,07 0,10 0,13 0,30 0,04 0,02 0,25 0,24 0,08

Retentietijd(min) C12 C14 2,08 5,15 1,21 2,41 1,95 4,36 1,30 2,81 1,05 2,13 1,08 2,33 2,45 6,33 2,77 7,15 1,75 4,00 0,98 1,91 1,86 4,15 1,40 3,12

Plaatgetal Symmetriefactor C12 C14 C12 C14 5197 6734 1,51 1,34 3090 4205 1,33 1,34 4937 5460 1,21 1,16 2576 4576 1,64 1,72 3204 4609 1,28 1,25 2635 4656 1,53 1,70 4785 6307 1,66 1,45 2704 4459 2,28 2,05 3369 4198 1,42 1,34 3081 4409 1,20 1,22 4194 5086 1,40 1,29 4049 6461 1,47 1,40

Resolutie 16,74 10,25 13,92 11,25 10,79 11,35 16,87 13,66 12,22 10,08 13,18 14,10

Verschillende besluiten worden getrokken uit de combinatie van Tabel 4.2, 5.1 en 5.2. Ten eerste is de samenstelling van de mobiele fase zeer kritisch. De factor is niet onder controle, indien het berekende interval [496-504 ml] voor de YMC-Pack Pro C8 kolom en het berekende interval [546-554 ml] voor de Halo C8 kolom in Tabel 5.2, niet worden behaald. Het nominaal niveau van de Halo C8 kolom werd ingesteld op 550/525, aan de hand van de vaststelling in de screening dat bij de 500/500 samenstelling de pieken te snel elueren en hierdoor interfereren met de matrixpieken. Uit Tabel 4.2 volgt dat de mobiele fase een invloed heeft op de retentietijd van de C12- en de C14-homoloog, op het plaatgetal van de C12homoloog en op de resolutie tussen de C12- en C14-homoloog. Ten tweede volgt uit Tabel 4.2 dat de flowcel een invloed heeft op de recovery. Het min-niveau van de flowcel bezit een kleinere afmeting waardoor kleinere piekoppervlakten worden geproduceerd. Tabel 5.2 toont aan dat de specificatie van de recovery 95-105% niet wordt behaald bij assay Y3, Y5, Y6 en Y11. In Tabel 3.4 vinden we terug dat deze runs werden gelopen op de kleinere flowcel (factor B, min-niveau). Hieruit besluiten we dat de kleinere flowcel niet geschikt is voor de gehaltebepaling van BAC. Tabel 5.2 toont eveneens aan dat de specificatie van het plaatgetal van de C12-homoloog niet wordt behaald bij assay Y4, Y6 en Y8. In Tabel 3.4 vinden we terug dat deze runs werden gelopen met de Halo C8 kolom (factor C, min-niveau). Hieruit besluiten we dat de Halo C8 kolom niet geschikt is voor de gehaltebepaling van BAC. Om deze reden is de bespreking van de invloed op system suitability parameters, zoals weergegeven in Tabel 4.2, overbodig. 46


Jill Deflou

Een volgende kritische factor die in Tabel 4.2 wordt aangetoond is de temperatuur. De temperatuur heeft een invloed op de recovery en op de retentietijd van de C12- en de C14homoloog. Het berekende interval [36,3 – 43,7°C] in Tabel 5.1 moet worden gerespecteerd opdat de factor onder controle zou zijn. Het behalen van het interval is geen probleem aangezien de temperatuur wordt ingesteld op 40°C in het EZChrom Elite datasysteem. De foutmarge van het HPLC systeem op de temperatuur is kleiner dan 3°C. Uit Tabel 4.2 volgt dat de pH van de mobiele fase eveneens kritisch is doordat het een invloed heeft op de retentietijd van de C12- en de C14-homoloog. Het berekende interval in Tabel 5.1 bedraagt [3,81-4,19]. Om deze reden wordt in de Fast LC methode een opmerking geschreven dat de pH van de mobiele fase zeer nauwkeurig moet worden bepaald. Tabel 4.2 toont eveneens aan dat het injectievolume een kritische factor is. Het injectievolume heeft een invloed op het %RSD, op de resolutie tussen de C12- en de C14homoloog en op het plaatgetal en de symmetriefactor van de C12- en de C14-homoloog. Het berekende interval in Tabel 5.1 bedraagt [3,6 - 6,4µl]. Het behalen van het interval is geen probleem aangezien het injectievolume wordt ingesteld op 5 µl in het EZChrom datasysteem. De foutmarge van het HPLC systeem op het injectievolume is kleiner dan 1,4 µl. Met dezelfde gedachtengang is de flow rate een kritische factor, die een invloed heeft op de retentietijd van de C12-homoloog. Het berekende interval in Tabel 5.1 bedraagt [1,21-1,39 ml/min]. Het behalen van het interval is geen probleem aangezien de flow rate wordt ingesteld op 1,3 ml/min in het EZChrom datasysteem. De foutmarge van het HPLC systeem op de flow rate is kleiner is dan 0,09 ml/min. Tot slot is de golflengte van de detector eveneens een kritische factor die een invloed heeft op de recovery. Het berekende interval in Tabel 5.1 bedraagt [208,5-219,5 nm]. Het behalen van het interval is geen probleem aangezien de golflengte wordt ingesteld op 214 nm in het EZChrom Elite datasysteem. De foutmarge van het HPLC systeem op de golflengte is kleiner dan 5 nm. Uit deze resultaten wordt besloten dat Fast LC methode robuust is. 5.2.3 Batch-to-batch reproduceerbaarheid De resultaten van de system suitability test op de BAC standaardoplossing, bepaald op de drie batchen, vertonen geen significante verschillen. Hieruit besluiten we dat de batchsoort geen invloed heeft op de resultaten.

47


Jill Deflou

CONCLUSIES De meest geschikte Fast LC methode werd geselecteerd uit de resultaten van de

screening. De Fast LC methode maakt gebruik van de YMC-Pack Pro C8 kolom, een flow rate van 1,3 ml/min en een injectievolume van 5 µl. De overige chromatografische parameters zijn dezelfde gebleven als in de HPLC methode. De runtijd werd gereduceerd van 55 min naar 10 min. De impact van deze reductie in de runtijd wordt hieronder in kaart gezet. Een analyse vereist een bepaalde hoeveelheid mobiele fase om het systeem te stabiliseren, om een proefinjectie uit te voeren en vervolgens om een blok van vijf standaarden drie analyse injecties te lopen. De berekening van de hoeveelheid mobiele fase nodig voor de gehaltepaling van BAC in één product d.m.v. HPLC en d.m.v. Fast LC is als volgt: - HPLC methode: 30 min + 55 min + (8 x 55 min) x 1,2 ml/min = 525 ml - Fast LC methode: 30min + 10min + (8 x 10 min) x 1,3 ml/min = 120 ml We concluderen dat een 77% reductie in de hoeveelheid mobiele fase wordt bereikt bij het gebruik van de Fast LC methode. Het duurste reagens in de mobiele fase is ACN waarbij een fles van 2,5 liter 100 euro kost. Wetende dat er twintig producten worden bepaald met deze methode en bijna dagelijks een product wordt geanalyseerd, zal deze transformatie veel tijd en geld besparen. Een bijkomend voordeel is dat de HPLC systemen vervroegd vrijkomen om andere analysen op uit te voeren. De equivalentie met de HPLC methode werd aangetoond via de vergelijkende datatest. De specificatie van 5% in het verschil van de gemeten BAC concentratie, bepaald met beide methoden, werd behaald. Eveneens werd de specificatie van 5 % in het percentage RSD, op elke run in beide methoden, behaald. Hieruit concluderen we dat de Fast LC methode equivalent is aan de HPLC methode. Uit de resultaten van de robuustheid volgt dat de Fast LC methode robuust is, op voorwaarde dat zowel de opgegeven samenstelling, als de pH van de mobiele fase zeer nauwkeurig worden gerespecteerd. De opgestelde „change control‟ voor de transformatie naar Fast LC werd vervolledigd. Dit rapport gaat vervolgens naar het „change control committee‟ in Alcon. Aangezien de aanpassingen aan de methode binnen de toegestane grenzen vallen, wordt er geen variatie (aanvraag tot afwijking van het registratiedossier) ingediend bij de autoriteiten. Tot slot wil ik vermelden dat door deze succesvolle transformatie naar Fast LC, ook andere HPLC methoden voor de gehaltebepaling van BAC dit jaar nog op het programma staan. 48


Jill Deflou

LITERATUURSLIJST

Ali, Y.; Lehmessaari, K.(2006). Industrial perspective in ocular drug delivery. Adv Drug Deliv Rev, 58(11), 1258-1268. Atkin, R.; Craig, V. S. J.; Wanless, E. J.; Biggs, S.(2003). Mechanism of cationic surfactant adsorption at the solid-aquous surface. Adv Colloid Interfac, 103, 219-304. Benzalkonium chloride. In: The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals 14th edition (2006), O‟Neil, M. J. (Ed.), Merck & Co., Inc, New Jersey, USA, pp. 165 Choy, Y. B.; Park, J. H.; McCarey, B. E.; Edelhauser, H. F.; Prausnitz, M. R.(2008). Mucoadhesive microdiscs engineered for ophthalmic drug delivery: effect of particle geometry and formulation on preocular residence time. Invest Ophth Vis Sci, 49(11), 48084815. Chromatographic separation techniques. In: European Pharmacopoeia 6th edition, supplement 6.4 (2008), EDQM, Strasbourg, Frankrijk, pp. 4407-4413 (2.2.46) Disinfectans and Preservatives. In: Martindale: The Complete Drug Reference 36th edition (2009), Sweetman, S. C. (Ed.), The Pharmaceutical Press, London, UK, pp. 1097-1102. Dolan, J. W.(2010). Column Diameter, Linear Velocity, and Column Efficiency. LC GC N AM, 28(2), 114-120. DryLab® Chromatography Reference Guide (2009). Molnár, Berlin, Germany, Chapter 1. Fekete, S.; Ganzler, K.; Fekete, J.(2010) Facts and myths about columns packed with sub3µm and sub-2µm particles. J Pharmaceut Biomed, 51, 56-64. Guillarme, D.; Nguyen, D. T-T.; Rudaz, S.; Veuthey, J-L.(2007). Method transfer for liquid chromatography in pharmaceutical analysis: Application to short columns packed with small particle. Part I: Isocratic separation. Eur J Pharm Biopharm, 66, 475-482. http://las.perkinelmer.de/Content/TechnicalInfo/TCH_VanDeemtersCurves.pdf (04-04-2010) http://www.alcon.com/en/ (27-02-2010) http://www.cdc.gov/niosh/ipcsneng/neng1584.html (28-02-2010) 49


Jill Deflou

http://www.chem.agilent.com (28-03-2010) http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html (28-03-2010) http://www.dionex.com/en-us/webdocs/66091-Fast%20LC%20LPN%202030-01.pdf (04-04-2010) http://www.gmp1st.com/gmp.htm (04-04-2010) http://www.instrument.com.cn/Quotation/Manual/103841.pdf (06-04-2010) http://www.lcresources.com/resources/getstart/2e01.htm (05-04-2010) http://www.hichrom.co.uk/assets/Products/AMT/HALO/Hilic-general-info.pdf) (06-04-2010)

http://www.standaard.be/artikel/detail.aspx?artikelid=DMF20100104_005 (27-02-2010) http://www.ymceurope.com/ymceurope/products/analyticalLC/analyticalColumns/proFam/YMC_ProFamC8. html (06-04-2010) Khoh-Reiter, S.; Jessen, B. A.(2009). Evaluation of the cytotoxic effects of ophthalmic solutions containing benzalkonium chloride on corneal epithelium using an organotypic 3-D model. BMC Ophtalmology, published ahead-of-print as doi:10.1186/1471-2415-9-5. Labranche, L. P.; Dumont, S. N.; Levesque, S.; Carrier, A.(2007). Rapid determination of total benzalkonium chloride content in ophthalmic formulation. J Pharmaceut Biomed, 43, 989-993. Liu, F.; Xiao, K. P.; Rustum, A. M.(2009). Determination of Individual Homologues and Total Content of Benzalkonium Chloride by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography using a Short Butyl Column. J AOAC Int, 92(6), 1644-1651. Martindale: The Complete Drug Reference 36th edition (2009). Pharmaceutical Press, London, United Kingdom, Disinfectans and Preservatives. McDonnell, G.; Russell, A. D.(1999). Antiseptics and Disinfectans: Activity, Action and Resistance. Clin Microbiol Rev,12(1), 147-179. Nikolin, B.; Imamović, B.; Medanhodzić-Vuk, S.; Sober, M.(2004). High performance liquid chromatography in pharmaceutical analyses. Bosnian J Basic Med, 4(2), 5-9. 50


Jill Deflou

Nováká, L.; Matysová, L.; Solich, P.(2006). Advantages of application of UPLC in pharmaceutical analysis. Talanta, 68, 908-918. Rahman, M. Q.; Tejwani, D.; Wilson, J. A.; Butcher, I.; Ramaesh, K.(2006). Microbial contamination of preservative free eye drops in multiple application containers. Brit J Ophthalmology, 90, 139-141. Shen, Y.; Xu, S-J.; Wang, S-C.; Tu, J-S.(2009). Determination of benzalkonium chloride in viscous ophthalmic drops of azithromycin by high-performance liquid chromatography. J Zhejiang Univ-Sc B, 10(12), 877-882. SIGMA Diagnostics, Groupe de travail SFBC: Vassault, A.; Grafmeyer, D.; De Graeve, J.; Cohen, R.; Beauonnet, A.; Bienvenu, J.(1999). Anayses de biologie médicale: specifications et norms d‟acceptabilité à l‟usage de la validation de techniques. Ann Biol Clin-Paris, 57, 685-695. Sterility. In: European Pharmacopoeia 6th edition (2007), EDQM, Strasbourg, Frankrijk, pp. 155-158 (2.6.1) Tomlinson, E.; Brown, M. R. W.; Davis, S.S.(1977). Effect of colloidal association on the measured activity of alkylbenzyldimethylammonium chloride against Pseudomonas aeruginosa. J Med Chem, 20, 1277-1282. Yang J. (2007). Fate and effect of alkyl benzyl dimethyl ammonium chloride in mixed aerobic and nitrifying cultures. Master thesis at Georgia Institute of Technology, United States of America.

51


Jill Deflou

BIJLAGEN Bijlage 1 : Typische chromatogrammen van de geanalyseerde producten bepaald met de HPLC methode met behulp van de Zorbax Eclipse XDB-C8 kolom Bijlage 2 : Typische chromatogrammen van de geanalyseerde producten bepaald met de Fast LC methode met behulp van de YMC-Pack Pro C8 kolom


Jill Deflou

Bijlage 1 : Typische chromatogrammen van de geanalyseerde producten bepaald met de HPLC methode met behulp van de Zorbax Eclipse XDB-C8 kolom 1. BAC Standaardoplossing (0,1 mg/ml en 0,2 mg/ml)

2. Flucon

3. Isopto Carpine 1%

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 4. Isopto Carpine 2%


6. Cyclogyl 1%

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 7. Dexa Sine

8. Isopto Tears

9. Timolol 0,5%

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 10. Tetracaine 0,5%

11. Cyclopentolat 1%

12. Cyclogyl 0,5%

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 13. Cyclopentolat 0,5%

14. Isopto Alkaline

15.Tears Naturale

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 16. Betaxolol

17. BAC Standaardoplossing (0,05 mg/ml)

18. Protagent

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 19. Isopto Carbachol 1,5%

20. Isopto Carbachol 3%


Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 22. Ciprofloxacin


24. Maxitrol

Jill Deflou


Jill Deflou

Bijlage 2 : Typische chromatogrammen van de geanalyseerde producten bepaald met de Fast LC methode met behulp van de YMC-Pack Pro C8 kolom 1. BAC Standaardoplossing (0,1 mg/ml en 0,2 mg/ml)

2. Flucon


Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 4. Isopto Carpine 2%


6. Cyclogyl 1%

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 7. Dexa Sine

8. Isopto Tears

9. Timolol 0,5%

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 10. Tetracaine 0,5%

11. Cyclopentolat 1%

12. Cyclogyl 0,5%

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 13. Cyclopentolat 0,5%

14. Isopto Alkaline

15. Tears Naturale

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 16. Betaxolol


18. Protagent

Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 19. Isopto Carbachol 1,5%

20. Isopto Carbachol 3%


Jill Deflou

Gehaltebepaling BAC d.m.v. Fast LC 22. Ciprofloxacin


24. Maxitrol

Jill Deflou

GEHALTEBEPALING VAN BENZALKONIUMCHLORIDE D.M.V. FAST LIQUID CHROMATOGRAPHY

Recommend Documents