BAB VII Kromatografi Cairan Kinerja Tinggi (KCKT) (High Performance Liquid Chromatography)HPLC
HPLC adalah produk mutakhir kromatografi yang banyak diminati untuk keperluan analisis ataupun preparatif. Untuk keperluan analisis sangat bermanfaat karena resolusinya tinggi yaitu karena koJom yang digunakan mempunyai harga N yang sangat tinggi (10.000 untuk 10 cm kolom). Juga mempunyai kecepatan analisis yang tinggi dan dengan kepekaan dan ketepatan yang tinggi. Untuk keperluan operasi ini digunakan pompa penggerak fase gerak yang canggih. Sepertihalnya kromatografi gas maka kolom HPLC ini dapat dipergunakan kembali. Kelemahannya sample yang digunakan hanya sedikit, sekali injeksi hanya l-10|nl. Untuk keperluan preparatif digunakan kolom semi preparatif ataupun preparatif. Mengikuti perkembangan teknologi dan IT, maka HPLC yang diproduksi sekarang dilengkapi dengan software yang dibuat pabriknya. Perintah melalui key board dan pengolahan data diproses melalui system computerized (mikroprosesor), kromatogram ditampilkan pada layar monitor dan bila dikehendaki dapat langsung dicetak atau disimpan dalam disket.
Alat dan Cara kerja
Gambar : 11, Diagram Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Cara kerja alat 1. Rangkainan pompa, kolom dan detektor yang dipilih diperiksa ada tidaknya kebocoran fase gerak. 2. Ditentukan menggunakan elusi isokratik atau gradient. Bila menggunakan elusi gradient diatur bagaimana perubahan perbandingan fase geraknya. 3. Bila fase gerak sudah mengalir dengan steady akan diberi signal dapat memasukkan sample dengan cara menyuntikkan pada tempat injeksi. 4. Sampel yang berupa larutan akan dibawa fase gerak memasuki kolom, disini terjadi proses pemisahan dengan mekanisme partisi (pada kolom fasa terikat). 5. Komponen hasil pemisahan akan mengalir masuk detektor, disini karena komponen mengenai detektor, kesan tadi diubah menjadi signal listrik yang diteruskan ke rekorder atau layar monitor diekspresikan sebagai puncak-puncak. 6. Fase gerak yang membawa komponen pemisahan keluar dan ditampung. Untuk keperluan preparatif fraksi-fraksi ditampung untuk pemeriksaan kebih lanjut.
Fase gerak Syarat fase gerak adalah : o Tidak boleh mengubah sifat kolom o Sesuai dengan detector o Haras dapat melarutkan sample o Viskositas rendah o Murni Bila digunakan elusi bergradien maka diperlukan dua wadah fase gerak yang masing-masing dihubungkan dengan pompa penggerak. Jenis pompa dapat dibedakan : reciprocating, displacement, bejana tekanan. Sebagai fase gerak umumnya adalah pelarut organik atau air atapun campurannya. Fase gerak yang digunakan harus jernih, maka perlu disaring dengan miliphore. Biasanya penyaringan menggunakan pompa hisap, karena volume fase gerak cukup banyak. Setelah itu fase gerak perlu di degassing, yaitu proses penghilangan gas yang terlarut dalam fase gerak. Gas-gas terlarut ini
dapat dihilangkan dengan cara pemanasan, atau dengan divakumkan. Namun cara yang mudah digunakan adalah dengan ultrasonifikasi, yaitu fase gerak di masukkan dalam bak berisi air dan digetarkan dengan gelombang suara selama 15 menit. Sampel Sample harus larut dalam fase gerak dengan kadar lebih kurang Img/lml disaring dengan disposible mikro filter (milex). Diinjeksikan dengan microsyringe, volume 1-10 µl.
Fase diam Fase pendukung berdiameter 3-10 µm berpori, biasanya dipilih ukuran 5µm dengan kisaran yang sangat sempit (±1 (µm), oleh karena itu untuk mengalirkan fase gerak diperlukan tekanan yang cukup tinggi.yaitu :6000-10.000 psi. Makin kecil ukuran fase pendukung makin besar tekanan yang diperlukan untuk mengalirkan fase gerak. Pada GLC fase diam ini disalutkan tipis pada permukaan fase pendukung, sedangkan pada HPLC fase diam diikatkan secara kimia dengan fase pendukung. Sebagai bahan fase pendukung adalah silika gel ataupun alumina, gugus OH dipermukaan dimodifikasi direaksikan dengan fase diam, maka disebut kolom terikat. Sedangkan penyangga yang masih mempunyai gugus OH bebas disebut kolom tak terikat dengan demikian sifat kolom adalah polar. Pada bonded column sifat polaritasnya dapat diatur dari polar, semi polar maupun non polar, tergantung pada fase diam apa yang akan diikatkan pada gugus OH fase pendukung, contoh terlihat pada Tabel 12. Maka dibedakan fase pendukung atau penyangga terikat dan tak terikat. Istilah pendukung atau penyangga dan fase diam sekarang akan menjadi kabur. Untuk mudahnya orang menyebutnya kolom terikat (bonded column) dan kolom tak terikat (non-bonded column).
Tabel: 12, Contoh Fase Diam pada Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Kolom Kolom berukuran diameter dalam 3-5 mm, panjang 5-30 cm, detail kolom tidak diberitahukan oleh pabrik pembuatnya hanya hal yang penting disertakan pada lebelnya. Berdasarkan kegunaan dibedakan kolom analitik, semipreparatif dan preparative. Karena kolom buatan pabrik ini mahal harganya maka perlu perawatan yang baik. Setelah pemakaian hendaknya kolom dicuci dengan fase gerak yang digunakan beberapa saat, kemudian disimpan pelarut yang cocok (heksan untuk fase normal dan isopropil alkohol untuk fase terikat). Untuk memperpanjang masa pakai kolom maka perlu dipakai Pra kolom = kolom
pelindung (Guard column). Sesuai dengan namanya maka kolom ini diletakkan didepan kolom utama. Kolom pelindung berisi fase diam yang sama dengan kolom utama, tetapi ukuran partikelnya lebih besar (20-40jnm) dan digunakan penyangga berbutir pelikel bukan berpori seperti yang digunakan pada kolom utama. Kolom pelindung berfungsi untuk menahan sample yang dapat meng inaktifkan dan menyumbat kolom.
Pengembangan (Elusi) Seperti kromatografi lain, elusi adalah proses fase gerak membawa sample menelusuri kolom. Bila selama elusi digunakan fase gerak dengan polaritas tetap maka disebut elusi isokratik., sedangkan bila pada proses elusi digunakan fase gerak dengan polaritas berubah (biasanya dari nonpolar ke polar) maka disebut elusi bergradien (gradient elutiori). Elusi bergradien ini digunakan untuk memperoleh pemisahan (puncak) yang lebih baik. Dikenal istilah : Kromatografi fase normal (normal phase chromatography): bila digunakan fase gerak lebih non polar daripada fase diam Kromatografi fase terbalik (reverse phase chromatography): bila digunakan fase gerak lebih polar daripada fase diam. Untuk analisis obat biasanya digunakan fase terbalik misalnya menggunakan kolom C-18 dan fase gerak campuran methanol-air atau asetonitril.
Detektor Detektor spektrofotometer paling banyak digunakan. Pada umumnya fase gerak tidak mengabsorpsi sinar yang digunakan, sedangkan yang mengabsorpsi adalah molekul sample. Untuk itu digunakan sinar pada panjang gelombang ()גdidaerah UV, maka disebut detektor UV. Sesuai dengan hukum Lambert Beer maka bila konsentrasi sample tinggi akan memberikan absorban tinggi dan signal yang sampai ke detektor akan memberikan puncak yang tinggi pula. Detekor UV yang sederhana biasanya menggunakan ג, 254 dan untuk detektor yang lebih sempurna גdapat diubah-ubah 190-700 nm, dengan demikian dapat dipilih ג, yang paling tepat sehingga akan meminimalkan serapan oleh fase gerak. Bila fase gerak mempunyai kromofor yang mengabsorpsi pada daerah
UV-Vis dan sample tidak mempunyai gugus kromofor yang menyerap di daerah itu maka detektor UV tak dapat digunakan. Sebagai pilihan adalah detektor indeks bias yaitu menggunakan refraktrometer diferensial. Refraktrometer ini dapat mengukur perbedaan antara indeks bias fase gerak dengan atau tanpa komponen sample. Detektor indeks bias ini tidak dapat digunakan untuk elusi bergradien. Detektor fluoresensi adalah detektor yang lebih peka dari kedua detektor tadi, namun detektor ini terbatas pada penggunaan sample yang dapat berfluoresensi, adakalanya untuk dapat digunakan detektor ini molekul sample diubah dulu menjadi senyawa yang berfluoresensi. Jenis detector, kepekaandetektor dan kemungkinan dapat dipakai pada elusi bergradien disajikan pada Tabel 13. Tabel: 13, Kepekaan detektor dan penggunaan pada elusi bergradien Detektor
Kepekaan deteksi
Dapat untuk gradien
1. 2. 3. 4.
10-10 g/ml 10-7 g/ml 10-11 g/ml 10-12 g/ml
Ultraviolet Indeksbias Flouresensi Elektrokimia
Ya Tidak Ya Tidak
Penggunaan HPLC untuk analisis HPLC sekarang menjadi instrumen analisis pilihan dengan ketelitian dan ketepatan yang tinggi. Tidak dihadapkan pada masalah apakah senyawa yang dianalisis dapat diuapkan atau tidak stabil pada pemanasan seperti masalahmasalah pada kromatografi gas. Metoda analisis pada HPLC sama dengan metoda analisis pada kromatografi gas, baik itu pada analisis kualitatif maupun kuantitattif termasuk cara perhitungannya. Untuk keperluan preparatif HPLC lebih unggul dari pada kromatografi gas. Hasil pemisahan atau senyawa-senyawa dibawa keluar kolom oleh fase gerak kemudian masuk ke dalam detektor tanpa mengalami kerusakan (detektor UV, indeks bias). Penginjeksian berulang-ulang dengan menggunakan kolom preparatif akan
diperoleh
eluate yang mengandung
dikehendaki untuk analisis lebih lanjut.
senyawa murni yang
Referensi: 1.
Sherman,
J.,
Bernard,
F.,
1996,
Hand
book
of
Thin-Layer
Chromatography, Second ed., Marcel Dekker INC, New York. 2.
Grob, R.L., 1977, Modern Practice of Gas Chromatography., John Wiley & Sons INC, New York.
3.
Neue, U.D.,1997, HPLC Columns. Theory Technology and Practice, John Wiley & Sons INC, New York.
4.
Gritter, R.J., Bobbitt, J.M., Schwarting, A. E., 1985, Introduction to Chromatography, Holden-Day INC, Oakland, USA.
5.
Clarke,
E.G.C.,
1971,
pharmaceuticals,
body
Isolation fluid
Pharmaceutical Press, London.
and and
Identification post-mortem
Of
Drugs,
material,
in The
