PR,CEEDNGSnBloL 20, No.112,1987
4l
ANALISISASAM AMINO DENGAN KROMATOGRAFICAIRAN KINERJA TINGGISECARADERIVATISASI PRAKOLOMDAN PASCAKOLOM
Oleh: lvayanRediatningS*. da Nanny Karti i H.*
ABSTRACT Tlrough an experiment process,an optimum condition of amino acid analysisusing High krformance Liquid Chlromatography(HPl{) with post- and pre+olumn derivatization methodshasbeen found. The optimum condition of the analysisfor the post{olumn deriyatization was obtained (R-SO3 Na) as the column,citric acidbuffer of the pH 3,0 by usingresincation exchanger and bodc acid buffer of the pH 9,? as the mobile phase,and O-phtalaldehyde(OPA) /2-mercaptoethanolasthe derivator, Cl8 wasusedasthe colunn, In the pre-columnderivatizationmethod,Resolve5;r spherical = (methanol : which 2 : 96) 2 contains 005 M Na2HPOa and : THF ; H2O solution A = 0.05M NaOAc) and solutionB(methanol:H2O 65 : 35) as the mobile phase,and OPA/ ethantiolasthe derivator. Each of both HPlf methods can separatemore than 17 kinds of amino acids.The result showstiat the prc-column derivatization method was more sensitiveand took a shorter analysingtime than the post{olumn derivatizationme'thod;how€yer,secondaryamino acid couldnot be determinedby the first method. SARI T€lah dilakukan percobaan untuk mencari kondisi optimum proses analisisasam amino dergan komatograii cair kineda tinggi (KCKT) secaraderiyatisasiprakolom dan pascakolom. Kondisi analisisoptirnuri untuk cara derivatisasi pascakolomdiperoleh dengan menggunalon resin penukar kation (R-SO; Na), larutan dapar sitrat pH 3,0 dan larutan daparborat pH 9,? sebaSaifase gerak, serta O-ftalaldehila (OPA)/2flerkaptoetanol sebagaipenderivalisasinya. Unluk c{n derivatisasiprakolom, sebaSaikolom digunakanResolvesphericalCl8, sebagai fasegerak digunakan larutan A yang terdid dari metanol : THF : air (2:2: 96) yang mengndung 0p5 M Na2HPOa dan larutan B yang terdiri dari metanol : air (65 :35), sedangkan sebaSai zal penderivalisasidigunakanOPA/etantiol. I Purat Penelitian Teknik Nuuir- BATAN, alumtri ITB
42
PROCEEDINGS nB yol 20,No. l/2, 1987
Kedua metode KCKT ini rBsir8-masing dapat memisahkan 17 macam campuBn asam amino. Diketahui bahwakepekaancarad€rivatisasiprakolom lebih tinggi dan waktu analisisnya lebih cepat daripada cara derivatisasipascakolom,tetapi ca.rapnkolom tidak dapat menentukan asamamino sekunder.
PENDAIIULUAN Asam amino adalah senyawayang mempunyai rumus umum +H3NCH - (R) COO- , benifat ion dan hidrohl. Asam-asamamino salingberbedagugusR-nyii. Ada sekitar 20 macam asamamino penting yang merupakanpembentuk prG tein dan disebut asam amino hidrolisat, seperti Alanin (Ala), Arginin (Arg), Sistein (Sis),Glutamin (Gln), Asam glutamat (Glu), Glisin (Gly), Histidin (His), Iso leusin (Leu), Lisin (Lys), Metionin (Met), Fenilalanin(Phe), Prolin (Pro), Serin (Ser),Treonin (Thr), Triptofan (Trp), Tirosin (Tyr), dan Valin (Val). Analisis asam amino ini sangat diperlukan, misalnyauntuk mengaralisishasil industri seperti makaran, makanan temak, obat-obatan,juga untuk analisis caira:rbiologi dan hidrolisat protein. Cara a-nalisisasam amino yang masih lazim digunakansampaisaat ini adalah kronratografi denganb!'rbageinracanrteknik scpcrti kromatogratikertas,lapise n t i p i s , d a r rk o l o i r . K r o n l l r t i j g f : r tkl o l o n r l c b i h b a n y : k , - l i k c n t ' . ; . t i i g kh:ar r, c i - , : i selain dapat digunakanuntuk kcpcrluan kualitatifjuga dapi.ltuntLrkkeperluair kuantitatif dan prcparatif. Akan tetapi pada kromatografi kolont biasa(open column), diperlukan waktu yang lama untuk memisahkanasam amino secara sempuma. Karena itu perlu ada metode analisisyang dapat memisahkanasam amino tersebut secarasempurna dalam waktu singkat dengan hasil yang tepat dan teliti. Analisisasamamino dengankromatograhcair yang menggunakanresinpenukar kation sebagaifase diam, pertama kali dikembangkanoleh Williem Stein dkk. (8) pada tahun 1951, yarg kernudian dikembangkanbenama Sparknran(8) menjadi sistenryang otomatis pada tahuD I958. Akar tetapi metode ini masih sangat rumit, biayanya mahal, dan peralatannyakurang dapat disesuaikan dengan keadaan. Akhir-akhir ini kromatografi cair dengan kinerja tinggi (fligft PerJormanceLiquid Chromatography)banyak digunakanuntuk analisisasam anino. Metode ini ditunjang oleh peralatanyang baik dan modcnl, menggunakan kolom yang sangatefisien dan di bawah tekananyang besar,;:hingga ana,lisis asam amino dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti. Percobaanini dilakukan oleh Pfeiferdkk. pada tahun I 983 (7). Untuk mendeteksi asam amino dapat digunakan detektor ultra-lembayung, sinar tampak. atau detektor fluoresensi. Dalam hal ini asam amiro harus
43
PROCEEDINGSNB T/OL20, NO. 1/2, 1987
diderivatisasi terlebih dahulu supaya dapat membentuk derivat yang dapat menyerap cahaya UV, tampak, atar.l berfluoresensi. Senyawa yang banyak digunakan untuk tujuan ini adalah o-ftalaldehida (Qptr)/etantiol (ETSH), dan OPA/2-merkaptoetanol(2-ME). Pereaksiini dengan asam amino dapat membentuk derivat iso-indolyang berfluoresensi kuat, sehinggadapat terdeteksi oleh detektor fluoresensi. Ada I macam cara derivatisasi, yaitu derivatisasi pascakolom dan derivatisasi prakolom (4. 5, 6). Pada cara derivatisasipascakolom,mekanismepemisahan asamamino adalah tegadinya penukaranion antara gugusamino yang terprotonasi denganion Na+ dari resin penukar kation (R SO3-Na+) pada pH ren, dah. Bila pH fase gerak dinaikkan secaragradien kontinu, protonasi asam amino akan berkurang, yang menyebabkan asam amino akan terelusi berturut-turut sesuai denganderajat protonasinya,dan hal ini berkaitandenganpH isoelektrikasam anlino tersebut.Asanr anrino yang mempunyai pH isoelektrikrendahakan terelusilebih dahulu (4, 5, 6). Dalam teknik derivatisasi prakolom, ttekanisme pemisahan adalah partisi dengan sistem kromatografi fase balik (reverse phase chrcmatoglaphy). Asam sii,rr,v
prrr,r\
r
jclord
spsslrrn
udrr
r!,r!A!rr
uwr1E,.ur \_/r rt/:,_rvr[
aLdu
OPA/ETSH. Terbelrtuk suatu derivat yang selainberfluoresensikuat juga bersitat hidrofob yang memungkinkan tedadinyapemisahansecarakromatograti fase balik menggunakankolom nonpolar dan fase gerak yang polar (4, 5, 6). Asam amino terderivatisasiyang rlempunyai kepolaran tinggi akan terelusi lebih dahulu. Dalam percobaanini dicari kondisi pemisahanyang baik dengan menggunakankedua metode di atas, dan dicoba menganalisisasamamino dari beberapacuplikan sepertimakanar temak, bir, dan berem.
BAHANDAN TATA KE RJA Bohan dan perolaton Bahar terdiri atas asam amino baku fr.ratan Sigma, BRIJ 30 (Polyoxy ethylene lauryl ether) buatan Pierce, natrium sitrat, asam borat buatan Univar, Ajax chemical,2-merkaptoetanol (Sigma), oftalaldehida (Pierce),dan pereaksiyang lain buatan E. Merck. Semua pereaksi yang digunakan mempunyai tingkat kemumian pro anaLisis. Selainitu digunakal _iugaplasmatikus. ntakananayam. dan bir. Air yang digunakanadalahair yang telah dilewatkanMilli Q system. Peralatanyang digunakan adalah KCKT (Waten, Model 244) yang dilengkapi dengandetektor fluoresensi(Model 420-AC, eksitasi= 334 nm, dan emisi = 425 mm), Autotrwted Gradient Contrcller (Waten, Model 680), Data Modul (Waten, Model '13O).Amino Acid Analysis ColumnrM (Waten), ResolverM 5p SphericalCts (3,9 mm I.D x 15 cm) Radial Pak p Bondapak Cls (8 mm I.D x l0 cm) dari Waters,alat vakum, oven, dan lampu infra merah.
44
PROCEEDINGS NB VoL20,No,1/2, ]987
Tata keria a Penyedidanlarutan baku Asam amino baku ditimbang masing-masing25 mg, kemudian dilarutkan dalam HCI 0,01 M (tirosin dilarutkan dalam dapar fosfat pH = 7,0) sampai volume mencapai 25 ml. Dari masing-masinglarutan diambil sejumlah volume tertentu, kemudian diencerkandenganHCI 0,01 M sampai kadar asamamino 50 nmol/ ml untuk cara derivatisasipascakolomdan 0,5 nmol/ml untuk cara derivatisasi prakolom. Sebelum dbuntikkan, senrua larutan disarirg dengan penyaring milipore ukuran 0,45 gm. b Penyediaot cuplikan Untuk analisis asam amino dari makanan temak, cuplikan harus dihidrolisis dahulu dengan cara sebagaiberikut: Makanan ayarn ditimbang 10-15 mg, ditambalkan 25 nl HCI 6 N,lalu dimasukkanke dalam tabung hidrolisis.Cairan dalam tabung dibekukan dengannitrogen cair atau CO2 padat (es kenng), lalu tabung divakumkan, dan setelahvakum, ditutup kedap. Selanjutnya,tabung dipanaskan di dalam oven pada suhu I l0"C selama 6 jam, lalu didinginkan. Setelah itu HCI dihilangkan denganpenguapandi bawah sinar inframerah. Residu yang mengardungasam amino dilarutkan dalam HCI 0,01 M, dan untuk melarutkan tirosinnya digunakan dapar fosfat pH 7,0. Ahhimya larutan disaringdenganpenyaringmilipore ukurar 0,45 grn. c Perryediaanlarutan dapar I Larutad dapar sitrat dibuat denganmelarutkan 19,6 g natrium sitrat dalam air. pH diatur dengan larutan HCI 6 N sampaimencapai3,0; volume akhir I liter. 2 Larutar dapar borat untuk fasegerak Ke dalam 800 ml air dilarutkan 2,5 g asamborat dan 14,6 g NaCl. pH diatur denganlarutan NaOH 6 N sampai9,7; volume akhir I liter. 3 Larutan sediaandapar borat Ditinrbarg 48 g asamborat, kemudiandilamtkan dalam 1800 ml air dan ditambah 30 g KOH. pH larutan diatur sampai10,4 dengank. .trn KOH 6 N, volume akhir 2 liter. Semua larutan dapar tenebut kemudian disaring dengan penyaring milipore ukuran 0,45 /um dan diawagaskan(dihilangkangas yrr 6 Lsrl "',t di dalamnya) denganalat Utasortic batft;pH ditentukan kembaLisebelumdipax i. d Pembuatan larutan hipo kloit Larutan sediaan dapar borat diambil 500 ml, ditambah 1 ml larutan I a-hipoklorit 0,5%, kemudian diawagaskan.
ITR VoL20,Na 1/2, 1987 PROCEEDINGS
45
e Pembuatanlarutan OPA (o-ftalaldehida) Larutansediaandaparborat diambil 500 ml, lalu ditambah0,2 ml larutan3O7o BRIJ 30 dalamair. Di dalamgelaspiala kecil ditimbang350 mg OPA dan dilarutkan dalam l0 ml metanol. Kemudian ditambahkan2 ml 2-merkaptoetanol/etantiol;dilakukan di dalam ruang asam.Larutan OPA-merkaptoetanol Larutan ini ini ditambahkanke dalam larutan borat, kemudian diawagaskan. akanlebih stabil bila disimpandi bawahnitrogen. f Pembuatan fasegemkA untuk teknik deritatisasiprakolom Dibuat campuranlarutanmetanol: TIIF (tetrahidrofuran):ah (2 : 2 : 96) yang mengandung 0,05 M Na2HPO4dan 0,05 M Na-asetat.pH larutandiatur sampai 7,5 denganmenggunakan asamasetat.Kemudianlarutandisaringdan diawagaskan. g Pembuatanlarutanpendeivatisasiuntuk caradeitatisasi prakolom DitimbangOPA 50 rng,dilarutkandalam4,5 ml etanol,dan ditambahkan50 trrl 2-merkaptoetanol atau etantiol serta0,5 ml larutandaparborat. h Deivatisdsiasamamino baku dan cuplikan Larutanasanlanino 250p1 ditambah250pllanttardaparboratdan l00gl larutan OPA/merkaptoetanol.Kemudian larutan diencerkal sampaivolume I ml denganmetanol,dan dibiarkanbereaksipadasuhukamarselama5 menit. i Cleanup cuplikandengan:SEP-PAKCB cattidge Larutanyangdibuatadalah: LarutanI :0,1%TFA (asamtrifluoro asetat)dalamair; Larutan2:0,1%TFAdalamair: metanol= 80: 20i Larutan3 : O,I%TFA dalamair : metanol= 70 : 20. SEP-PAKC18yang baru, diaktifkan dua kali denganl0 ml metanol,kemudian dicucidua kali denganl0 ml larutan1. Setelahitu cucilagisatukali denganl0 ml larutan2. Larutancuplikan sebanyakI ml dicampurdengan2 ml larutan3 (larutanharus larut dalamair atauasamdan bebasdari partikel). Cuplikandilewatkanmelalui SEP-PAKC1scartridge.Eluat pertama1 ml dan 2 ml, eluatberikutnyayangmengandung asamaminoditampung. HASILDANPEMBAHASAN Dalam analisisasam amino dengan cara derivatisasipascakolom,derivatisasi denganOPA/2-merkapto€tanoldilakukan setelahasamamino keluar dari kolom dan telah tedadi pemishhan.Karenaitu, sebelummasukke dalamkolom, asamamino tersebutberadadalambentuk ion, sehinggamekanismepemisahan yangcocok adalahpenukaranion denganmenggunakan kolom penukarkation (R-S03-Na+ ).
i
46
PROCEEDINGSITB Vol 20, No. 1/2. 1987
Dalam hal ini, pemisahandan elusi asamamino didasarkanpadaperbedaanpI (pH isoelektrik) asamamino tenebut dan pengaturanpH fasegeraknya.Pada pH yang rendah(= 3,0) asamaminoberadadalambentuk terprotonasi,sehingga dapat terikat denganresin penukarkation (R SO3-) menggantikanke{u-' dukan Na*. Bila pH dinaikkansecaragradien(berangsur-angsur dengantetap), maka setelahpI di lewati, gugusNI{3r dari asamamino tersebutakanberubah menjadi gugusNH2 yang menyebabkanterlepasnyaasamamino dari resindan terelusi.Makin kecil pI, asamamino makin cepat terelusi.Asam amino yang mempunyai pI yang samaakan terpisahberdasarkanperbedaanukuran molekul, karena selain mempunyaisifat menukarkanion, resin yang digunakan juga mempunyaisifat molecularsieve(7,8).
pada pH rendah
SO. - Na'
Resin
+
lil t H a N +- L - n
cooH )
SO. -H^+
Besin
H I N-C-R I
+ Na+
cooH
)
paoa pH tinggi
Resin
\TF S O - - N a /
H^N-C-R
Joo
Padapemisahanasamamino denganmekanismepemisahanion, pH memegang peranan penting. Pengaturan pH ini dilakukan dengan mengatur komposisi (perbandinganvolume) dapar sitrat (pH = 3,0) dan dapar borat (pH = 9.8) secara gradienkontinu, yang didasarkanpada kurva titrasi dapar sitrat dan dapar borat sepertiterterapada gambar l. Untuk menyempumakan pemisahan asam amino yang keluar terlebih dahulu seperti treonin dan serin, perlu ditanrbahkar metanol pada daparsitral. Hal ini disebabkanUeonin dan serin mempunyai pl dan ukuran molekul yang hampir samatetapi kelarutandalammetanol berbeda(7). Mekanisme derivatisasi asam amino dengan o-ftalaldehida (OPA)/2-merkaptoetanol atau etanol/etantroladalahsebagaiberikut (7).
l'
/
r 1,.
47
PROCEEDINGS NB VOL20,NO.I12, 1987 2ME - H
H S - C H 2- C H 2 - O H
-H
H 2 N- C H - C O O H
R
o OPA
1" asamamino N-CH-COOH R derivatisoindol berfluoresensi kuat dan bersitathidrofil
1m %B ,l.90
I
180 70 60 50 40 30 20 10
3456789 Grn$.r 1 KurvatitrasidariNa-sitrat{A} denganNaSorat(B)
48
PROCEEDINGS ITB VoL 20, No. ]/2, 1987
OPA dan 2-merkaptoetanol atau OPA dan ESTH akan bereaksi secaraspesifrk dan selektif dengan asam amino primer membentuk derivat isoindol yang berfluoresensi yang relatif sangat peka. Karena OPA/2-merkaptoetanol (ME) atau OPA/ESTH hanya dapat bereaksidengan asam amiro primer saja, maka asam amino sekunder seperti prolin dan hidroksi prolin harus dioksidasi dahulu menjadi asam amino primer denganmenggunakanasamhipoklorit (HCLO). Dari gambar 2 terlihat bahwa sekitar l8 macam asamamino dapat terpisah dengan sempurna dengan rnengg.rnakan KCKT secara derivatisasi pascakolom, yang pemisahannyadidasarkan pada kromatografi penukaran ion. Untuk memisahkan asam amino tenebut hanva dioerlukan waktu kira-kira 85 menit- waktu
I I
85 menit Gambar 2 Kromatogram yang diperolehdenganmenggunakanalat KCKT secaraderivatisasi pascakolom dari 0,25 nmol asamamino Kondisi pemisahaountuk Eambar2 Kolom : Amino Acid Analysiscolum-TM.Resinpenukarkation (SO3-Na+) Fasegerak : A DaparsitratpH = 3,0 B Oaparborat pH = 9,8
49
PROCEEDINCSIT8 Vot. 20, No. 1/2, 1987 Kondisielusi gradien
kec. aliran (ml/min)
0,4 o,4 o,4
Volumesuntikan : Detektor :
awal
4A 71 72
A (%)
B {%)
100
0 100 100 0
o 0 100
kurua
o
6
10gl Fluoresensi l\tlodel420 E m i s i: 4 2 5 n m Eksitasi: 338 nm A t e n u a s:i4 x
yang relatif singkat dibandingkandenganrnetodelain. Di sampingitu terlihat bahwaprolin yang menrpakan asam amino sekunderdapat terdeteksi.Dengan demikian cara derivatisasi pascakolom dapat digunakan untuk menganalisis asamamino, baik asamamino primer maupun sekunder. Pada cara derivatisasiprakolom, derivatisasidilakukan sebelum asam amino tenebut masuk ke dalam kolom, sehinggabentuk isoindolnya yang hidrofil dapat drpisahkan.karena perbedaanderivat dari asan amino tersebut terletak pada bagian nonpolamya. Karena itu cara yang cocok untuk memisahkannya adalahkromatografi fase balik. Dalamhal ini mekanismepemisahannyaadalahpartisi yang elusinyadidasarkan pada kehidrofilan derivat asam amitronya serta pengaturan kepolaran fase geraknya. Derivat asam amino yang bersifat hidrofil akan tertahan lebih lama pada kolom yang bersifat nonpolar, sehingga asam amino yang paling polar akan terelusi paling dahulu. Dengan menggunakancara ini diperlukan waktu beberapalarna (tergantungpada lamanyapemisahanoleh kolom) dari saatderivatisasisarnpaiderivat asanlanrino tersebut dideteksi.Dengandemikiiurdiperlukan zat peraksiyang dapat membentlrk derivatasamamino yang stabil dalani selangwaktu tersebut. Dari percobaandiperoJih data seperti terlihat padagambar3. Gambartersebut menunjukkan bahwa derivat asam amino-OPA/ESTH lebih stabil daripada derivat asam arninoOPA/2-ME. Karena itu pereakSiyang dipilih untrlk cara prakolonradalahOPA/ESTH. derivatisasi Di samping itu temyata derivatisasiprakolom ini hanya djgunakan untuk menganalisis asamamino primer, karenaOPA/ESTH ataupunOPA/2-ME hanya dapatbereaksidenganasantamino primer saja.Di sini tidak mungkin dilakukan
50
PROCEEDINGS ITB VoL20,No. 1/2. 1987
Rispons
1I '-.-, derivat glisin- OPA,/ETSH d e r i v a tg l i s i n' O P A / 2 - M E
4 5 6 7 8 I
l0 11
1 4 1 51 61 7 l 8 1 9 _) t {jam)
Gambar3 Kestabilan derivatglisin-OPA/ETSHdan glisin- OPA/2 ME terhadapwaktu dengankondisi kolom ; ResolveTM 5p Cr" fasegerak : 5OmM Na3POa,pH 7,2/CH:CN{70/3O) detektor : Fluoresensi eksitasi : 338 nm emisi : 425 nm vol, suntikan: 10 l.d oksidasi asam andno sekunder menjadi asam amino primer sebelum melalui kolom. Bila oksidasi ini dilakukan, dapat tedadi kerusakan pada kemasan kolom, yaitu pecahnya ikatan antara fase diam (C18) dengan pendukung padat-
nya. Dari data yang terlihat pada gamba.r4 temyata sekitar 17 asarnamino dapat terpisahdalam waktu sekitar 30 menit, bahkansepertiterlihat padagambar5 hanya23menit,danyangterdeteksi hanyaasamaminoprimersaja. Dengankadar asamamino sekitar 50 pmol, responsyang diberikansudahcukup tinggi. Karena itu caraderivatisasiprakolom ini lebih peka dibandingkan dengancaraderivatisasipascakolom.Dari hasil percobaanterlihat bahwasalah pascasatu faktor penyebabnya ialahpenggunaan HCIOdalamcaraderivatisasi kolom yang temyata dapat menurunkankepekaan,karenadapat terbentuk derivatlain yangkekuatanfluoresensinya kurang. Untuk menganalisisasam amino dalam makananternak ternyata harus dilakukan hidrolisis terlebih dahulu dengan HCI 6 N untuk memisah-kan asam amino dari proteinnya,sedangkan untuk cuplikanbir dan berem,asam-asam aminonyadapatlangsungdianalisis. Padamakananternakditemukanbeberapa macamasamamino,antaralail: asamaspartat,treonin,serin,asanlglutamat, prolir, glisin,alanin,valin, isoleusin,leusin,fenilalanin,histidin, triptofan, lisin, dan arginin.Prolin dan triptofan dapatdideteksihanyadengancaraderivatisasi
51
PROCEEDINGSITB Vol.20,No. I/2, 1987
6
)
It
/1 il
: It
Gambar 4 Kromatogram yang diperoleh denganmenggunakanalat KCKT secaraderivatisasi prakolomdari 5Opmol asamamino baku
Kondisi pemisahanuntuk gambar4 Kolom Fasegerak
: :
ResolveTM 5/-rCl8 Kondisigradien P e l a r uA t ; M e O H : T H F : H r O = 2 : 2 : 9 6 , y a n gm e n g a n d u n0g, 0 5 M Na, HPO4dan 0.05 M Na-asetat; pH diatur sampai7,5 denganasamasetat. P e l a r uB t : M e O H: H " O = 6 5 : 3 5
52
PROCEEDINCSnBVoL20, No. 112. 1987
Waktu (m.nit)
Aliran (ml/r|gnir)
%A
%B
Kurva
Awal 2,@ 2,W 14,00 23.00 28,00 35,@
0 0,10 r.50 1,50 1,50 1,50 0
100 100 r00 50 0 100 100
0 0 0 50 100 0 0
01 06 07 07 ll ll
Detektor tt4odel420 AC FluorecenceDerektor. g' Catrtln: Padakromatogram dalam gambar 4 tidak ditemukan prolin (asa.namino sekunder). karena derivatisasi hanyamungkinterjadiuntuk asamaminoprimersaja,Di sampingitu oleh karena di sini tidak digunakanhipokrorit,makakepekaannya akanrebihtinggidibandingkan dengan caraderivatisasipascakolom.
pascakolom.Padamakanantemak ini tidak ditemukanasparagin. Hal ini mungkin disebabkanadanyadeaminasipadasaathidrolisismenladiasamaspartat(Z) atau memangproteinnyii tidak mengandungasparagin.Denganmenggunakan caradi atas,tanpamelakukanhidrolisissebelumnya, dalamcuplikanbir dike_ temukan juga beberapamacamasamamino seperti asamaspartat,asamgiu_ tamat, asparagin,serin,histidin, glisin,treonin,arginin,tirosin,metionin,valin, isoleusin,leusin, dan prolin seperti terlihat padagambar6 dan 10. Demikian pula pada cuplikan berem denganmenggunakan caraderivatisasipascakolom, tanpa hidrolisis sebelumnyadapat dideteksiadanyaasamamino sepertiasam aspartat, treonin, serin, asam glutamat, prolin. glis.in,alanin, sistein, valin, metionin, isoleusin, leusin,tirosin, fenil alanin, histidin, dan arginin, s€perti terlihat padagambar8. Dalam bir ditemukan asparaginkarenatidak dilakukanhidrolisisdenganHCI 6 N sebelumanalisis,sehingga asparaginnya masihutuh, tidak mengalamideaminasi. Asparagin dan glutamin umumnya ditemukan pada cuplikan asam protein secaraenzimatis(7). aminoyang diperolehdenganmenghidrolisis pH dan KCKT ini, pengendalian Dalam pemisahanasamamino menggunakan kepolaranfasegerakmudahdilakukandenganmengubahperbandilganvolume 2 larutan dapar atau fasegerakyang dapat diatur dengarsistemgradienkontinu (bukan gradien bertahap),sehinggatidak mengganggu bentuk kromatogram.Dengandemikian dalam analisiskuantitatif,perhitunganluas puncak pereaksiOPA/2kromatogrammenjadilebih teliti. Demikianpula penggunaan
53
PROCEEDINGS ITB VoI.20;No. 1/2, T987
ME dan OPA/ESTH menyebabkan metode ini mempunyai kepekaan yang lebih tinggi dan oleh karena reaksinya denganasa:namino spesifik dan selektif, maka metodeini tidak banyak dipengaruhioleh gargguanmatriks.
A
23 menit q,
Gamblr 5 Kromatogramyangdiperolehdenganmenggunakan alat KCKT secaraderiyatisasi prakolomdari 50 omol asamamino baku
Konditi p€mirahanuntuk gambar5 Kolom : ResolveTM 5t c18 Fase g e r a k : A : M e O H : T H F : H 2 O , 2 : 2 , 9 6 , y a n gm e n g a n d u 0n ,g0 5M N a 2 H P O 4 pH diaturdenganasamasetatsampai7.5. dan 0,05 M Na-asetat; B : MeOH : H"O. 65 : 35
54
PRoCEEDINGS ITB VoL20, No. 1/2, 1987
K o n d i sei l u s g i radien: t (menit)
kec. aliran (ml/min)
A (%)
awal
2,OO 2,OO 2,OO 2,@ 2,OO 2,W 1,00 0.50 0,10
95 90 70 70 65 100 100 100 100
t5
20 25 30 35 40 45 Volumesuntikan : Detektor :
10 = l Fluoresen'4x E m i s i 4, 2 5 n m Eksitasi338 nm
B (%)
kurna
5
10 30 30
o o
6 o
o 0 0 0
6 6 6 o
rFF^''
iil
z !
3
c U)
Gambar6 Kromatogramdari cuplikanbir dengankondisiyangsamadengangambar2 secara derivatisasi kolom Dasca
>1
o-,a
) >:
i'i 2 ts; 85 menit
: Gambar7 Kromatogramdari cuplikanmakananternakdengankondisiyangsamadengan gambar2, secaraderivatisasi pascakolom
*
PR0CEEDINGSrTB Vot. 20, No. I /2, js8Z
a r_-_____
85 menit ___
Gambar8 Kromatogram dari cuplikanberemdengan.unggunik"n kondisiKCKT yang samadengangambar2, secara derivatisasi pascakolom J
TJJ I I J
o ILI ii
re
rl i
't,
i\..---.---._; r [-__________...
vt-i
I
30 menit c
Gambar9 Kromatogramdari cuplikanmakanan ternakyangdiperoleh - derrgan ' menggunakan KCKT secaraderivarisasiprakotom (kondisi ,urna a"ng"n g";,U;, ai
O
z a.l
32 menit Gambar 10 Kromatogramdari cuplikan bir yang diperoleh denganmerEgunakanKCKT secaraderivatisasiprakolom (kondisi samadengangambar4)
2
L
PROCEEDINGS nB VoI 20, No. I /2, 1987
59
KESIMPULAN Analisis asam anrino dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan menggunakano-ftalaldehida/etantiolsebagaizat penderivatisasi, m:mpunyai beberapa keunggulan, yaitu: daya pisahnya tinggi karena menggunakankolom yang sangatefisien,sertaditurdangoleh penggunaanperalatan yang baik; kepekaan tinggi, sehinggadapat digunakan untuk menganalisis asm-asam amino dengan kadar yang rendah;waktu analisisnyasingkat, serta tidak banyak dipengaruhi oleh matrils; pengendalianpH dan kepolaran fase gerakmudah diatur denganmenggunakansistemgradienkontinu. Derivatisasi asam amino dapat dilakukan dengan cara derivatisasi pascakolom dan derivatisasiprakolom. Cara derivatisasi pascakolom dapat digunakan untuk menganalisisasam amino primer maupun asam amino sekunder, sedangkanderivatisasi prakolom hanya dapat digunakan untuk menganalisis asam amino primer saja. Akan tetapi saat ini cara derivatisasi pascakolom memerlukan waktu pemisahan yang lebih lama dan kepekaannya relatif lebih rendah dibandingkan cara derivatiiasi prakolom.
DAFTARPUSTAKA Anderson,e/ d/., Remington's phanraceuticalssdence,lSth ed.1975. Amino Acid Analysis System, Operator's Manual, Waters, The Liquid Chrom a t o g r a p h yp e o p l e . Amino Acid Analysis, Liquid ChromatographyColumn, Care and Use Manual, Waters,The Liquid ChromatographyPeople,Millipore. Hill D., L. Burnworth, W. Shea and R. Preifer,Quantitative HPLC Analysisof Plasma Amino Acids as o-Phtalaldehyde/ethanthiol Deivatives, J. Liq. Chromatog.,5(12), ?369 - 93 (1982). Hill D.. et al., Hieh PerformanceLiquid ChromatographyDetermination of A m i n o A c i d s i n t h e P i c o m o l eR a n g eA , n a l . C h e n . , 5 l , 1 3 3 8 ( 19 7 9 ) . Pfeifer R. , ct a/., PracticalAppiication of HPLC to Amino Acid Analysis,lrrerican Laboratory',March, I 983. S p a c k m a nD . H . , W . H . S t e i n ,a n d S . M o o r e , , 4 n a lA . e m . , 3 O ,I 1 9 0 , 1 9 5 8 . Wheler G. H. T. and J. T. Russel,Separationand Quantitation of oPhtalaldehyde DerivativesofTaurine and RelatedCompound in a High Performance Liq uid Chromatography (HPLC) System, J. Liq. Chromatog.. 4(7),
l 2 8 r - 1 2 9 1( l 9 8 1 ) .
