Optimasi Analisis Campuran Maltitol, Manitol, Sorbitol, dan Xilitol secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Optimasi Analisis Campuran Maltitol, Manitol, Sorbitol, dan Xilitol secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Jansen Wijaya Jap, Harmita, Herman Suryadi Fakultas Farmasi, Universitas Indonesia, Kampus UI Depok, Depok, 16424, Indonesia Email : [email protected]

Abstrak Senyawa gula poliol, seperti maltitol, manitol, xilitol dan sorbitol merupakan bahan kimia yang sering ditambahkan ke dalam produk makanan maupun farmasi sebagai pemanis, sehingga diperlukan metode analisis untuk identifikasi dan penetapan kadar senyawa tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh kondisi yang optimal pada analisis campuran keempat senyawa gula poliol dan menetapkan kadar beberapa produk pemanis buatan yang beredar dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Analisis dilakukan dengan menggunakan kolom Shodex Sugar SZ5532 (150 x 6,0 mm), detektor indeks bias RID-10A, fase gerak asetonitril-air (85:15) dengan laju alir 1,2 mL/menit pada suhu kolom sebesar 65 oC. Didapatkan koefisien korelasi (r) untuk xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol berturut-turut 0,9985; 0,9980; 0,9975; dan 0,9990 dengan rentang konsentrasi 2.000 µg/mL sampai dengan 7.000 µg/mL. Metode ini juga memenuhi kriteria uji selektivitas. Pada penetapan kadar sampel, sampel A, B, C, D, dan E yang dipreparasi menggunakan pelarut air, dilakukan pada kondisi analisis yang terpilih. Didapatkan bahwa sampel B dan C yang beredar di pasaran tidak memenuhi persyaratan kadar zat dalam sediaan, sedangkan sampel A, D, dan E memenuhi syarat. Keyword : Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Maltitol, Manitol, Sorbitol, Xilitol.

Optimization Analysis of Maltitol, Mannitol, Sorbitol, and Xylitol by High Performance Liquid Chromatography Abstract Polyol compounds, such as maltitol, mannitol, xylitol, and sorbitol, are chemical substances that often added into food and pharmaceutical products, therefore analytical method is required for its identification and for determining its concentration. This study is aimed to obtain an optimum analytical condition of the mixture of four polyol compounds and to determine its content in a few artificial sweetener products using High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Analysis was done by using Shodex Sugar SZ5532 column (150 x 6.0 mm) with refractive index detector RID-10A, acetonitrile-water (85:15) as the mobile phase, flow rate 1.2 mL/min, and the temperature of the column was 65 oC. Correlation coefficient was obtained for xylitol, mannitol, sorbitol, and maltitol consecutively 0.9985; 0.9980; 0.9975; and 0.9990 with the range of concentration from 2,000 µg/mL to 7,000 µg/mL. This method has also passed the criteria of selectivity test. Assay of the five samples which was prepared by dissolving each sample contained polyol compounds with water, was determined using the chosen analytical condition. Sample B and C didn’t meet the requirement of a chemical substance’s content in dosage form, whereas sample A, D, and E met the requirement of a chemical substance’s content in dosage form. Keyword : High Performance Liquid Chromatography, Maltitol, Mannitol, Sorbitol, Xylitol.

Optimasi analisis..., Jansen Wijaya Jap, FF UI, 2014

Pendahuluan Pemanis yang umumnya digunakan untuk makanan atau pada sediaan farmasi adalah sukrosa. Sukrosa banyak digunakan karena sifatnya yang manis sehingga dijadikan sebagai pemanis walaupun kalorinya cukup tinggi. Akan tetapi, sukrosa diketahui merupakan salah satu faktor yang berkontribusi dalam menyebabkan berbagai penyakit, antara lain hipertensi, jantung koroner, arteriosklerosis, dan karies pada gigi. Selain itu, konsumsi sukrosa yang berlebihan dapat menyebabkan obesitas dan diabetes melitus tipe 2 (Apovian, 2004). Penyakit-penyakit tersebut menjadi suatu perhatiFan bagi tenaga kesehatan ketika sukrosa akan dijadikan sebagai salah satu bahan yang akan dikonsumsi (Olinger et al., 1998). Oleh karena itu, pada masa kini banyak produk makanan dan produk farmasi memakai pemanis yang merupakan suatu senyawa yang diketahui sebagai bahan bebas gula dan juga rendah kalori, yaitu senyawa gula golongan poliol. Gula poliol sekarang lebih digemari karena dapat ditujukan untuk orang-orang yang membutuhkan diet rendah kalori atau obesitas dan memiliki kelainan metabolik, seperti orang yang terkena penyakit diabetes melitus. Gula poliol yang biasanya digunakan antara lain sorbitol, xilitol, manitol, isomalt, maltitol, sirup maltitol, laktitol, dan polidekstrosa (Papesa et al., 2001). Gula poliol memiliki keuntungan antara lain tidak toksik, tidak iritan, dan yang paling penting adalah gula poliol tidak dimetabolisme oleh insulin sehingga tidak mempengaruhi kadar gula dalam darah (Rowe et al., 2009). Menurut keputusan kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) nomor HK.00.05.5.1.4547 tahun 2004, telah terjadi transisi epidemiologi dan perubahan gaya hidup yang mendorong meningkatnya produksi pangan dengan menggunakan bahan tambahan pangan pemanis buatan, salah satunya adalah gula poliol. Oleh karena itu, gula poliol harus dianalisis dengan menggunakan metode analisis yang efektif dikarenakan gula poliol dapat digunakan lebih dari satu di dalam suatu sediaan farmasi ataupun produk makanan sehingga diperlukan suatu metode yang dapat menganalisis lebih dari 1 gula poliol secara simultan. Metode analisis yang sudah ada belum dapat menganalisis lebih dari 1 gula poliol, selain itu kondisi analisis tiap gula poliol berbeda-beda, seperti sorbitol dan maltitol dengan fase gerak air, manitol dengan komposisi fase gerak asetonitril-air dan xilitol dengan fase gerak asam sulfat 5mM (Forget & Spagnoli, 2006; Guo et al., 2012; Papesa et al., 2001; Tomo et al., 2000). Pada penelitian ini, akan dilakukan analisis multikomponen yang belum pernah dilakukan, yaitu campuran dari gula poliol yang secara bersamaan dianalisis menggunakan


KCKT dengan menggunakan detektor indeks bias. Ada berbagai metode yang digunakan untuk menganalisis gula poliol, tetapi yang dianalisis hanya 1 saja. Ada beberapa metode untuk menentukan sorbitol, yaitu (i) dengan metode polarimetri karena sorbitol dalam air memberikan rotasi optis pada bidang polarisasi; (ii) metode enzimatik dengan menggunakan enzim sorbitol dehidrogenase menghasilkan NAD+ yang akan mengoksidasi D-sorbitol menjadi fruktosa dan NAD+ tereduksi menjadi NADH yang nantinya akan ditentukan menggunakan spektrofotometer UV-vis; (iii) metode asam periodat, dimana dapat menentukan konsentrasi sorbitol dengan menghitung seberapa banyak asam periodat yang digunakan; (iv) metode kromatografi gas menggunakan kolom kapiler dan baku dalam; dan (v) metode KCKT, dimana menggunakan baku dalam dan baku luar (Papesa et al., 2001). Metode KCKT yang digunakan dalam penelitian adalah kolom resin penukar kation yang kuat dengan ion logam yang berikatan dengan polistiren divinilbenzen tersulfonasi dan fase gerak asetonitril-air, dimana merupakan teknik pemisahan yang tepat karena gula poliol akan membentuk kompleks yang relatif kuat dengan ion logam dan terikat kuat (Heftmann, 1992). Metode tersebut adalah metode berdasarkan hasil studi literatur, dimana metode analisis tiap zat berbeda jika dianalisis secara tunggal. Pada penelitian ini, dilakukan modifikasi metode sehingga didapatkan metode yang dapat menganalisis keempat gula poliol tersebut secara simultan dan metode tersebut dapat diterapkan untuk tujuan pengawasan mutu.

Tinjauan Teoritis Sorbitol Sorbitol (C6H14O6) memiliki berat molekul 182,17 dengan nilai rotasi optik dan titik lebur masing-masing +4,0 sampai +7,0 dan 110oC-112oC. Sorbitol bersifat sangat mudah larut dalam air; sukar larut dalam metanol, etanol, dan asam asetat; dan praktis tidak larut dalam eter dan kloroform. Pemerian sorbitol adalah serbuk hablur berwarna putih atau hampir putih, tidak berbau, higroskopis, dan rasanya manis (Food Chemical Codex 5th edition, 2004; British Pharmacopoeia, 2009; Rowe et al., 2009).

Gambar 1. Struktur kimia sorbitol


Manitol Manitol (C6H14O6) memiliki berat molekul 182,17 dengan nilai rotasi optik dan titik lebur masing-masing +23 sampai +25 dan 165oC-170oC. Manitol bersifat larut dalam alkalis dan piridin; larut dalam 5,5 bagian air; larut dalam 83 bagian etanol 95%; larut dalam 18 bagian gliserin; larut dalam 100 bagian propanol; sangat sukar larut dalam alkohol; dan praktis tidak larut dalam eter dan kloroform. Pemerian manitol adalah serbuk hablur berwarna putih atau hampir putih, tidak berbau, terasa sejuk di lidah, dan rasanya semanis glukosa tetapi tidak semanis sukrosa (United States of Pharmacopoeia 32nd edition, 2008; Food Chemical Codex 5th edition, 2004; British Pharmacopoeia, 2009; Rowe et al., 2009).

Gambar 2. Struktur kimia manitol

Xilitol Xilitol (C5H12O5) memiliki berat molekul 152,15 dengan nilai titik didih dan titik lebur masing-masing 215oC-217oC dan 92oC-96oC. Xilitol bersifat larut dalam 1,6 bagian air; larut dalam 15 bagian propilenglikol; larut dalam 16,7 bagian metanol; larut dalam 80 bagian etanol; larut dalam 500 bagian 2-propanol; dan sangat sukar larut dalam gliserin. Pemerian xilitol adalah serbuk hablur berwarna putih atau hampir putih, tidak berbau, terasa sejuk di lidah, dan rasanya manis (Food Chemical Codex 5th edition, 2004; British Pharmacopoeia, 2009; Rowe et al., 2009).

Gambar 3. Struktur kimia xilitol

Maltitol


Maltitol (C12H25O11) memiliki berat molekul 344,31 dengan nilai rotasi optik dan titik lebur masing-masing +105,5 sampai +108,5 dan 148oC-151oC. Maltitol bersifat sangat mudah larut dalam air dan sukar larut dalam etanol. Pemerian maltitol adalah serbuk hablur berwarna putih atau hampir putih, tidak berbau, dan rasanya manis (Food Chemical Codex 5th edition, 2004; British Pharmacopoeia, 2009; Rowe et al., 2009).

Gambar 4. Struktur kimia maltitol

Gula Poliol sebagai Pemanis Buatan Menurut keputusan kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) nomor HK.00.05.5.1.4547 tahun 2004 mengenai persyaratan penggunaan bahan tambahan pangan pemanis buatan dalam produk pangan, definisi gula poliol adalah gula alkohol yang aman dalam penggunaannya, yang secara alami dijumpai pada buah-buahan, antara lain laktitol, maltitol, manitol, xilitol, dan sorbitol, sedangkan secara komersial diperoleh melalui proses fermentasi monosakarida dengan menggunakan kapang/khamir untuk pangan, seperti Moniliella pollinis. Sedangkan, definisi pemanis buatan adalah bahan tambahan pangan yang dapat memberikan rasa manis pada produk pangan yang tidak atau sedikit mempunyai nilai gizi atau kalori, hanya boleh ditambahkan ke dalam produk pangan dalam jumlah tertentu. Sebagai contoh, sorbitol dapat digunakan dalam pembuatan produk pangan dengan persyaratan sebagai berikut : permen dengan maksimum penggunaan 99%, permen karet dengan maksimum penggunaan 75%, selai dan jelli dengan maksimum penggunaan 30%, dan produk pangan yang dipanggang dengan maksimum penggunaan 30%. Golongan poliol selain berfungsi sebagai pemanis buatan, dapat pula berfungsi sebagai pemberi rasa, bahan pengisi, penstabil, pengental, anti-kempal, humektan, sekuestran, dan bahan utama. Sebagai pemanis buatan, gula poliol dikategorikan oleh BPOM sebagai GRAS (Generally Recognized as Safe), yaitu pernyataan aman bagi bahan tambahan pangan termasuk pemanis buatan untuk ditambahkan ke dalam produk pangan dalam jumlah yang sesuai dengan CPPB (Cara Produksi Pangan yang Baik), yang merupakan suatu pedoman


yang diterapkan untuk memproduksi pangan yang memenuhi standar mutu atau persyaratan yang diterapkan secara konsisten (Badan Pengawasan Obat dan Makanan, 2004).

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam, dapat berupa zat cair atau zat padat (Johnson & Stevenson, 1991). Salah satu kromatografi yang paling sering digunakan sebagai metode analisis kuantitatif dalam industri farmasi dan analisis farmasi di laboratorium adalah KCKT (Kupiec, 2004). KCKT merupakan teknik yang lahir dari aplikasi teori dan instrumentasi kromatografi cair yang sebenarnya dikembangkan untuk kromatografi gas (Lindsay, 1992). Keuntungan KCKT bila dibandingkan dengan kromatografi cair tradisional adalah waktu analisis cepat, daya pisahnya baik, peka, pemilihan kolom dan eluen yang bervariasi, kolom dapat digunakan kembali, ideal untuk molekul besar dan ion, mudah untuk memperoleh kembali cuplikan, dan dapat menghitung sampel dengan kadar yang sangat rendah (Johnson & Stevenson, 1991; Harmita, 2006). Selain digunakan untuk menganalisis sampel, KCKT juga dapat digunakan untuk pemurnian pada berbagai industri, baik industri farmasi, bioteknologi, lingkungan, polimer, ataupun makanan (Settle, 1997). Berdasarkan jenis fase yang berperan, KCKT dapat dibagi menjadi kromatografi adsorpsi, kromatografi partisi, kromatografi ion, dan kromatografi eksklusi. Kromatografi ion menggunakan fase diam yang dapat menukar ion dengan ion dari fase gerak. Fase penyangga dari fase diam yang sering digunakan adalah polistirena divinilbenzen yang memiliki kelebihan pada selektivitas dan kestabilan (Harmita, 2006). Detektor indeks bias merupakan detektor yang yang dikenal sebagai detektor universal karena semua zat yang terlarut dapat dideteksi jika indeks biasnya berbeda dengan indeks bias fase geraknya (Settle, 1997). Analisis Kualitatif dan Analisis Semi-Kuantitatif Menurut International Conference on Harmonisation, 1994, analisis kualitatif atau identifikasi ditujukan untuk memastikan identitas suatu analit di dalam suatu sampel. Menurut Community Reference Laboratories Residues, 2010, uji kualitatif memberikan hasil benar atau tidak dengan menghiraukan konsentrasi analit. Analisis kualitatif dilakukan dengan


membandingkan sifat suatu sampel (contoh : spektrum, kromatogram, reaktivitas kimia, dan sebagainya) dengan standar (International Conference on Harmonisation, 1994). Untuk analisis kualitatif, parameter validasi yang dilakukan hanya uji spesifisitas atau selektifitas. Analisis semi-kuantitatif bertujuan untuk mendapatkan konsentrasi suatu analit yang mendekati konsentrasi aslinya. Analisis semi-kuantitatif berguna bagi analis untuk mendapatkan rentang kurva kalibrasi untuk uji konfirmasi selanjutnya (kuantitatif). Contohnya: uji inhibisi pertumbuhan mikroba, dimana yang dilihat adalah ukuran dari zona penghambatan dengan suatu konsentrasi analit tertentu; uji biokimia, dimana harus mendapat kurva kalibrasi (seperti ELISA, tetapi hanya jika uji tersebut spesifik untuk analit tunggal saja); uji kromatografi, yang dikalibrasi untuk jangka waktu yang pendek dimana tidak menguji respon sampel; uji fisikokimia (KCKT, KC-SM/SM) dimana uji presisi suatu metode yang terukur tidak memenuhi persyaratan untuk uji kuantitatif. Berdasarkan definisi analisis semi-kuantitatif yang telah disebutkan sebelumnya, maka dalam melakukan analisis semikuantitatif perlu juga dilakukan uji linearitas untuk mendapatkan rentang kurva kalibrasi, yang kemudian dapat juga menentukan batas deteksi dan batas kuantitasi (Community Reference Laboratories Residues, 2010). Metode Penelitian Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah kromatografi cair kinerja tinggi yang terdiri dari pompa (LC20AT), injektor manual, kolom Shodex Sugar SZ5532 (150 x 6,0 mm; Shodex, Jepang), detektor indeks bias RID-10A (Shimadzu, Jepang), penghilang gas (Elmasonic S60H, Jerman), syringe 50 µL ujung tumpul (Hamilton, Swiss), timbangan analitik (Shimadzu, Jepang), oven kolom CTO-6AS (Shimadzu, Jepang), pengolah data komputer (CBM-106), dan alat-alat gelas. Bahan yang digunakan adalah manitol (Amresco); maltitol (JK BioChem); sorbitol (Sorini Towa Berlian Corporindo); xilitol (Shandong Longlive BioTechnology); asetonitril (HPLC grade, Fulltime); aquabidest (PT Ikapharmindo Putramas); sampel yang beredar di pasaran berupa serbuk gula dalam sachet, gula bubuk, dan gula cair. Larutan Standar Maltitol, manitol, sorbitol, dan xilitol ditimbang seksama masing-masing 50,0 mg dilarutkan dengan air dalam labu ukur 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi 5.000,0 µg/mL. Kemudian dibuat larutan standar campuran yang mengandung maltitol, manitol, sorbitol, dan


xilitol ditimbang seksama masing-masing 50,0 mg dan dilarutkan dengan air dalam labu ukur 10,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi 5000,0 µg/mL. Optimasi Kondisi Analisis Larutan standar maltitol, maltitol, xilitol, dan sorbitol masing-masing dengan konsentrasi 5.000,0 µg/mL disuntikkan sebanyak 20,0 µL dengan menggunakan fase gerak asetonitril-air (70:30), (80:20), dan (85:15) dengan laju alir 0,8, 1,0 dan 1,2 mL/menit pada suhu 60 oC dan 65oC. Waktu retensi (tR), jumlah lempeng teoritis (N), Height Equivalent to a Theoritical Plate (HETP), faktor ikutan (Tf), dan resolusi (R) yang diperoleh dicatat. Uji Kesesuaian Sistem Larutan induk campuran yang mengandung maltitol, manitol, xilitol, dan sorbitol dengan masing-masing konsentrasi sebesar 5.000,0 µg/mL disuntikkan sebanyak 20,0 µL dengan menggunakan kondisi analisis terpilih. Waktu retensi, N, HETP, faktor ikutan, dan resolusi yang diperoleh dicatat, serta presisi pada 6 kali penyuntikan. Pembuatan Kurva Kalibrasi Larutan Standar, Penentuan Koefisien Regresi (r), Limit Deteksi (LOD), dan Limit Kuantitasi (LOQ) Larutan standar maltitol, manitol, xilitol dan sorbitol dibuat dengan masing-masing konsentrasi 10.000,0 µg/mL. Lalu, masing-masing larutan standar tersebut diencerkan sehingga didapatkan konsentrasi masing-masing zat sebesar 2.000; 3.000; 4.000; 5.000; 6000; dan 7000 µg/mL. Masing-masing larutan dengan seri konsentrasi tersebut disuntikkan sebanyak 20,0 µL ke alat KCKT dengan menggunakan kondisi analisis yang terpilih sebanyak 2 kali dan dihitung nilai rata-ratanya. Kurva kalibrasi dibuat antara konsentrasi larutan standar maltitol, manitol, xilitol, dan sorbitol dengan area kromatogram. Dari data yang diperoleh, dilakukan perhitungan untuk mendapatkan persamaan regresi linier, koefisien korelasi (r), batas deteksi (LOD), dan batas kuantitasi (LOQ). Uji Selektivitas Uji selektivitas dilakukan dengan cara menyuntikkan larutan yang mengandung matriks plasebo untuk melihat kemungkinan gangguan dari eksipien pada daerah waktu retensi setiap gula poliol tersebut. Hasil kromatogram larutan hasil uji selektivitas tidak boleh mengandung gangguan di sekitar waktu retensi gula poliol sehingga tetap terpisah dengan baik walaupun ada komponen lain.


Penetapan Kadar Sampel Penetapan kadar sampel dilakukan pada beberapa sampel yang beredar di pasaran. Sampel A, sampel B, dan sampel C berupa sachet berisi serbuk berwarna putih, sampel D berupa serbuk berwarna putih, serta sampel E berupa cairan berwarna kuning yang jernih. Sampel A ditimbang, dilarutkan dengan aquabidest dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL. Kemudian, disonikasi selama 2 menit. Pengenceran dilakukan dengan mengambil 1,5 mL dari larutan tersebut, dimasukkan ke dalam labu ukur 50 mL, dan volume dicukupkan hingga batas. Sampel B ditimbang, dilarutkan dengan aquabidest, dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL, dan dicukupkan volumenya hingga batas. Selanjutnya, diambil 3,0 mL dari larutan tersebut, lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL. Volume dicukupkan hingga batas. Sampel C ditimbang, dilarutkan dengan aquabidest dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL. Setelah itu, diambil 5,0 mL, dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL, dan dicukupkan volumenya hingga batas. Sampel D ditimbang seberat 1,5 g dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL. Selanjutnya, dilarutkan dengan menggunakan aquabidest dan dicukupkan volumenya hingga batas. Dari larutan tersebut, diambil 2,0 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL. Volume dicukupkan hingga batas. Sampel E diambil sebanyak 0,5 mL dan dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 mL. Kemudian, dilarutkan dengan menggunakan aquabidest dan volume dicukupkan hingga batas. Masing-masing sampel di atas diambil sebanyak 20,0 µL dengan menggunakan kondisi analisis terpilih, lalu disuntikkan sebanyak 2 kali pada masing-masing sampel. Dihitung kadar gula poliol yang terkandung pada masing-masing sampel. Hasil Penelitian Optimasi Kondisi Analisis Analisis maltitol, manitol, sorbitol, dan xilitol diperoleh kondisi optimum dengan menggunakan kolom Shodex Sugar SZ5532 (150 x 6,0 mm) pada suhu 65°C; fase gerak asetonitril − air (85:15); dan laju alir 1,2 mL/menit. Nilai statistik yang didapat mulai dari nilai area, waktu retensi (tR), resolusi (R), faktor ikutan (Tf), jumlah lempeng teoritis (N) dan Height Equivalent to a Theoritical Plate (HETP) pada kondisi optimum memenuhi syarat metode analisis. Uji Kesesuaian Sistem


Pada metode terpilih, dilakukan uji kesesuaian sistem sebanyak enam kali berupa penyuntikan larutan campuran maltitol, manitol, sorbitol, dan xilitol dengan konsentrasi masing-masing 5.000,0 µg/mL. Dari hasil penyuntikan tersebut, diperoleh waktu retensi dan area masingmasing zat. Waktu retensi (tR) xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol berturur-turut adalah 15,785 menit, 21,509 menit, 24,685 menit, dan 56,959 menit. Koefisien variasi yang didapat dari uji kesesuaian sistem untuk xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol berturut-turut adalah 11,87%, 42,33%, 35,16%, dan 1,97%.

Gambar 5. Kromatogram uji kesesuaian sistem larutan standar xilitol (A), manitol (B), sorbitol (C), dan maltitol (D)

Pembuatan Kurva Kalibrasi Larutan Standar, Penentuan Koefisien Regresi (r), Limit Deteksi (LOD), dan Limit Kuantitasi (LOQ) Berdasarkan perhitungan statistik regresi linear diperoleh persamaan kurva kalibrasi dan nilai koefisien korelasi (r) untuk larutan xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol masing-masing y = 79,79x – 6337 dan r = 0,9985; y = 100,6x - 80288 dan r = 0,9980; y = 88,09x – 85207 dan r = 0,9975; dan y = 103,3x – 12889 dan r = 0,9990. Batas deteksi untuk xilitol adalah 337,49 µg/mL, untuk manitol adalah 349,57 µg/mL, untuk sorbitol adalah 410,12 µg/mL, dan untuk maltitol adalah 4.144,55 µg/mL. Batas kuantitasi untuk xilitol adalah 1.124,96 µg/mL, untuk manitol adalah 1.165,24 µg/mL, untuk sorbitol adalah 1.367,05 µg/mL, dan untuk maltitol adalah 13.815,18 µg/mL. Uji Selektivitas Uji selektivitas dilakukan dengan cara menyuntikkan larutan yang mengandung matriks plasebo untuk melihat kemungkinan gangguan dari eksipien pada daerah waktu retensi setiap gula poliol tersebut. Hasil kromatogram larutan hasil uji selektivitas tidak mengandung


gangguan di sekitar waktu retensi gula poliol sehingga metode tersebut dinyatakan memenuhi persyaratan uji selektivitas.

Gambar 6. Kromatogram matriks blanko (kiri) dan kromatogram campuran xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol dalam matriks (kanan)

Penetapan Kadar Sampel Penetapan kadar sampel dilakukan pada beberapa sampel yang beredar di pasaran. Sampel A, sampel B, dan sampel C berupa sachet berisi serbuk berwarna putih, sampel D berupa serbuk berwarna putih, serta sampel E berupa cairan berwarna kuning yang jernih. Setelah ditimbang sejumlah sampel padat dan diambil sejumlah volume untuk sampel cair masing-masing sebanyak 2 kali, setiap sampel dilarutkan dalam air, disonikasi jika perlu, dan dicukupkan volumenya hingga batas. Masing-masing sampel di atas diambil sebanyak 20,0 µL dengan menggunakan kondisi analisis terpilih, lalu disuntikkan sebanyak 2 kali pada masing-masing sampel. Dari hasil pengukuran, sampel A, B, C, D, dan E didapatkan kadar berturut-turut sebesar 99,62% dan 98,30%; 86,07% dan 89,61%; 72,76% dan 75,06%; 99,18% dan 99,72%; dan 100,26% dan 99,46%.

Pembahasan Pada penelitian ini telah dilakukan optimasi analisis campuran gula poliol, yaitu maltitol, manitol, sorbitol, dan xilitol secara kromatografi cair kinerja tinggi. Metode analisis dengan menggunakan alat KCKT dipilih karena memiliki banyak kelebihan, yaitu daya pisahnya baik, cara kerja yang sederhana, dan sensitif. Detektor yang digunakan pada penelitian adalah detektor indeks bias karena gula poliol tidak memiliki gugus kromofor yang dapat dideteksi dengan sinar UV dan tidak berfluorosensi. Selain itu, detektor indeks bias bersifat universal, yaitu mendeteksi dan mengukur zat-zat dengan indeks bias yang berbeda dengan fase gerak sehingga dapat mendeteksi dan menganalisis za-zat secara simultan.


Kondisi analisis yang optimal didapatkan dengan mengoptimasi komposisi fase gerak, laju air, dan suhu kolom. Komposisi fase gerak yang digunakan terdiri dari asetonitril-air (7:3), (8:2), dan (85:15). Kondisi analisis lainnya adalah menggunakan laju alir 0,8 mL/menit, 1,0 mL/menit, dan 1,2 mL/menit serta menggunakan suhu kolom 60oC dan 65oC. Pemilihan kondisi analisis tersebut didasarkan pada teori bahwa semakin banyak asetonitril di dalam komposisi fase gerak pada analisis gula poliol, semakin bagus pemisahannya karena semakin sedikit air di dalam komposisi fase gerak, maka akan meningkatkan interaksi yang terjadi antara gula poliol dengan ion logam yang terikat dengan fase diamnya sehingga pemisahannya serta selektivitasnya meningkat (Corradini, 2000). Selain itu, suhu juga sangat mempengaruhi kondisi analisis karena ketika suhu dinaikkan, maka indeks bias suatu zat juga meningkat sehingga pemisahannya juga semakin bagus dan waktu analisisnya juga lebih singkat. (Corradini, 2000). Kondisi terbaik yang didapatkan untuk analisis campuran maltitol, manitol, sorbitol, dan xilitol adalah komposisi fase gerak asetonitril-air (85:15), laju alir 1,2 mL/menit, dan suhu kolom 65oC karena didapatkan faktor ikutan (Tf) kurang dari 2, HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate) yang mendekati nol dan resolusi (R) yang lebih besar dari 1,5 walaupun waktu analisisnya lebih lama bila dibandingkan dengan kondisi analisis lainnya. Pada metode terpilih, dilakukan uji kesesuaian sistem sebanyak enam kali berupa penyuntikan larutan campuran maltitol, manitol, sorbitol, dan xilitol masing-masing berkonsentrasi 5.000,0 µg/mL. Dari hasil penyuntikan tersebut, diperoleh waktu retensi dan area masing-masing zat yang kemudian dihitung rasio area setiap zat aktif. Waktu retensi setiap zat mulai dari xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol berturur-turut adalah 15,785 menit, 21,509 menit, 24,685 menit, dan 56,959 menit untuk komposisi fase gerak terpilih, yaitu fase gerak asetonitril-air (85:15). Koefisien variasi yang didapat dari uji kesesuaian sistem untuk xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol berturut-turut adalah 11,87%, 42,33%, 35,16%, dan 1,97%. Walaupun hasil yang didapatkan tidak memenuhi persyaratan uji kesesuaian sistem karena tidak presisi (nilai koefisien variasi > 2), akan tetapi metode ini dapat digunakan untuk analisis semikuantitatif sehingga dapat menentukan kadar suatu sampel yang mendekati kadar aslinya (Community Reference Laboratories Residues, 2010). Kurva kalibrasi menggambarkan hubungan antara resnpon detektor dengan konsentrasi analit yang diketahui. Selama penelitian, kurva kalibrasi disiapkan setiap hari selama proses analisis berlangsung karena sebaiknya kurva kalibrasi disiapkan pada waktu yang bersamaan dengan persiapan larutan yang akan diinjeksikan. Hal tersebut dilakukan untuk meminimalisasi


kesalahan yang disebabkan oleh kondisi alat KCKT. Berdasarkan perhitungan statistik regresi linear diperoleh nilai koefisien korelasi dan persamaan kurva kalibrasi untuk larutan xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol masing-masing sebesar 0,9985 dan y = 79,79x - 6337; 0,9980 dan y = 100,6x - 80288; 0,9975 dan y = 88,09x - 85207; dan 0,9990 dan y = 103,3x - 12889. Metode tersebut memberikan linearitas yang baik. Persamaan kurva kalibrasi tersebut digunakan untuk menghitung batas deteksi dan batas kuantitasi untuk setiap zat. Batas deteksi dan batas kuantitasi untul xilitol, manitol, sorbitol, dan maltitol berturut-turut sebesar 337,49 µg/mL dan 1.124,96 µg/mL; 349,57 µg/mL dan 1.165,24 µg/mL; 410,12 µg/mL dan 1.367,05 µg/mL; dan 4.144,55 µg/mL dan 13.815,18 µg/mL. Metode analisis yang digunakan harus bersifat selektif, yaitu mampu mengkuantifikasi dan memisahkan analit dari komponen dalam matriks sampel. Dalam suatu produk pemanis buatan rendah kalori, komponen lain yang mungkin terdapat di dalamnya adalah pemanis buatan lain dengan golongan yang berbeda dan eksipien-eksipien lainnya. Oleh karena itu, untuk menguji selektivitas disuntikkan larutan yang mengandung pemanis buatan bukan golongan gula poliol yang dilarutkan dalam air, kemudian diencerkan dengan fase gerak. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode tersebut selektif karena tidak terdapat interferensi dari pemanis buatan bukan golongan gula poliol pada waktu retensi zat aktif, baik xilitol, manitol, sorbitol, ataupun maltitol. Penetapan kadar sampel dilakukan pada sampel yang berupa produk pemanis rendah kalori mengandung gula poliol. Metode analisis yang didapatkan dapat menganalisis sampel secara semi-kuantitatif, yaitu mendekati kadar aslinya. Dari hasil pengukuran, didapatkan bahwa ada 2 sampel (sampel B dan C) yang tidak memenuhi kriteria, yaitu nilai persen kadar yang berkisar dari 90,0%-110,0% dan 3 sampel lainnya (sampel A, D, dan E) memenuhi persyaratan kadar zat dalam sediaan.

Kesimpulan Kondisi optimal untuk analisis camapuran maltitol, manitol, sorbitol, dan xilitol secara KCKT, yaitu komposisi fase gerak asetonitirl-air (85:15), suhu kolom 65oC, dan laju alir 1,2 mL/menit dengan nilai resolusi ≥ 1,5; nilai HETP mendekati 0; dan nilai faktor ikutan ≤ 2. Kadar yang diperolah pada sampel A, D, dan E memenuhi persyaratan kadar zat dalam sediaan, yaitu 90,0% - 110,0%, sedangkan sampel B dan C tidak memenuhi persyaratan. Saran


Untuk penelitian selanjutnya, perlu digunakan jenis kolom dan detektor lain untuk memperoleh kondisi analisis yang lebih baik sehingga metode tersebut dapat dilanjutkan menjadi metode yang dapat menganalisis secara kuantitatif. Referensi Apovian, C.M. (2004). Sugar-Sweetened Soft Drinks, Obesity, and Type 2 Diabetes. JAMA, 292(8). Badan Pengawasan Obat dan Makanan. (2004). Persyaratan Penggunaan Bahan Tambahan Pangan Pemanis Buatan dalam Produk Makanan. Jakarta : Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia Community Reference Laboratories Residues (CRLs). (2010). Guidelines for the Validation of Screening Methods for Residues of Veterinary Medicines (Initial Validation and Transfer). 2 Juni 2014 < http://crl.fougeres.anses.fr/publicdoc/Guideline_Validation_Screening_en.pdf>. Corradini, C. (2000). Liquid Chromatography. Italy : Academic Press. Food Chemical Codex. (2004). Food Chemical Codex 5th edition. Washington : The National Academies Press Forget, R., & Spagnoli, S. (2006). Excipient quantitation and drug distribution during formulation optimization. J. Pharm. Biomed. Anal., 41(3), 1051–5. doi:10.1016/j.jpba.2006.01.039 Harmita. (2006). Buku Ajar Analisis Fisikokimia. Depok : Departemen Farmasi FMIPA UI Heftmann, E. (1992). Chromatography : Fundamentals and Applications of Chromatography and Related Differential Migration Methods. New York : Elsevier Science Publishing Company. International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use. Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1). October 1994. 8 Januari 2014 < http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R 1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf>. Johnson, E.L., & Stevenson, R. (1991). Dasar Kromatografi Cair (Kosasih Padmawinata, Penerjemah.). Bandung : Institut Teknologi Bandung Lindsay, S. (1992). High Performance Liquid Chromatography. England : John Wiley & Sons Ltd. Olinger, I. P. M., & Haute, T. (1998). United States Patent [ 19 ], 3–8.


Papesa, S., Jezek, D., & Kujundzic, D. (2001). Determination of Sorbitol Concentration in Diet Chocolate by High-Performance Liquid Chromatography, 39(2), 129–133. Rowe, R.C., Sheskey, P.J., & Quinn, M.E. (2009). Handbook of Excipients 6th edition. USA : RPS Settle, F. (1997). Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry. New Jersey : Prentice-Hall, Inc. Tatebe, C., Ohtsuki, T., Otsuki, N., Kubota, H., & Sato, K. (2012). Extraction Method and Determination of Sudan I Present in Sunset Yellow FCF by Isocratic High-Performance Liquid Chromatography, 2012(August), 570–575. The Department of Health. (2007). British Pharmacopoeia 2007. London : The Department of Health. The United States of Pharmacopoeial Convention. (2008). United States Pharmacocpoeia 32. USA : The United States of Pharmacopoeial Convention. Tomo, T., Shibata, T., Nasu, M., Shibata, K., Izumi, G., & Sofue, K. (2000). Evaluation of Several Saccharides as Osmotic Agent for Peritoneal Dialysate. Perit. Dial. Int., 20, 727–733.


Optimasi Analisis Campuran Maltitol, Manitol, Sorbitol, dan Xilitol secara Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Recommend Documents