PENENTUAN KEMURNIAN ADENOVIRUS MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

1

PENENTUAN KEMURNIAN ADENOVIRUS MENGGUNAKAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FEBRI ANNURYANTI* Pharmaceutical Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, Airlangga University, Surabaya, 60286 [email protected]

ABSTRACT Adenoviruses are potentially useful vectors for vaccination and gene therapy. An extensive purification is done during the production of recombinant adenoviruses in order to obtain the pure final products. However, productrelated impurities, such as virus aggregates and virus incomplete particles, can be present in the final product and may lead to adverse effects or lack of efficacy. The goal of this study was to obtain a suitable analytical method for determining the purity of adenovirus based on the content of product-related impurities. RP-HPLC was used to differentiate between the complete and incomplete particles based on the protein profiles. The mobile phase was (A) 0.1 % TFA in 5% acetonitrile and (B) 0.1% TFA in 99% acetonitrile. The column and autosampler temperatures were maintained at 45oC and 4oC, respectively. The flow rate was 0.2 mL/min with gradient program. The chromatograms were monitored at 280 nm. The proposed method can be used for determining the purity of adenovirus. Keyword: adenovirus, HPLC, purity determination.

PENDAHULUAN Adenovirus (Gambar 1) adalah virus DNA golongan adenoviridae yang berbentuk ikosahedral, tidak bersampul, dan memiliki ukuran antara 90 hingga 100 nm. Adenovirus dikenal sebagai virus yang bertanggung jawab terhadap berbagai penyakit pernapasan, infeksi lambung dan usus serta mata pada manusia. Namun, perkembangan ilmu pengetahuan menunjukkan bahwa adenovirus

merupakan vektor yang banyak digunakan untuk terapi gen dan berperan sebagai bahan pembawa vaksin. Beberapa keunggulan yang dimiliki oleh adenovirus adalah kemampuan melakukan penetrasi ke dalam sel inang, dapat diproduksi dalam jumlah tinggi, tingkat immunogenitas yang kuat, serta profil keamanan yang sangat bagus [1-3].

Gambar 1: Gambaran adenovirus. Protein adenovirus terbagi menjadi 3 grup besar, yakni: protein kapsid [hekson (II), basa penton (III), fiber (IV)], protein minor, and inti protein. DNA virus digambarkan sebagai garis tebal hitam, yang terhubung dengan inti protein. [2]

Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.3 No. 1 Juni 2014

2

Dalam proses produksi adenovirus, diharapkan akan diperoleh hasil akhir berupa rekombinan adenovirus utuh dengan derajat kemurnian yang tinggi. Namun, hasil akhir produksi adenovirus umumnya mengandung pengotor, berupa adenovirus tidak utuh, dalam jumlah tertentu. Adenovirus utuh memiliki tiga komponen protein utama serta memiliki DNA dengan genom 36-38 kb, sedangkan adenovirus tidak utuh pada umumnya tidak memiliki DNA ataupun DNA yang terbentuk tidak memiliki genom yang sempurna. Adanya pengotor ini dapat menimbulkan efek samping yang tidak diinginkan, seperti penghambatan efektifitas vaksin maupun reaksi alergi pada tubuh manusia. Oleh karena itu, untuk menjamin keamanan, khasiat dan kualitas dari vaksin, maka perlu dikembangkan metode analisis yang mampu menghitung kadar pengotor dalam produk adenovirus yang dihasilkan. [4]. Metode yang umum digunakan untuk penentuan kemurnian adenovirus adalah metode cesium chloride (CsCl) density gradient centrifugation. Dalam metode ini, adenovirus utuh dipisahkan dari adenovirus yang tidak utuh berdasarkan berat jenis adenovirus. Adenovirus utuh akan membentuk lapisan dibawah (lower band) sedagkan adenovirus METODE PENELITIAN Bahan Asetonitril grade HPLC (J.T Baker), asam trifluoro asetat (Sigma Aldrich), air bidestillata disiapkan menggunakan sistem Milli-Q (Millipore), dapar fosfat saline (Sigma Aldrich). Alat Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Alliance seri 2695 yang terdiri pompa kuartener, autosampler, detektor PDA dan kompartemen kolom. Kolom Xbridge BEH300 C4 (150 x 2.1, 3.5 µm ID). Fase gerak terdiri dari (A) 0.1% asam trifluoro asetat dalam 5% asetonitril, dan (B) 0.1% asam trifluoro asetat dalam 99 % asetonitril. Temperatur kolom dan sampel diatur berturut-turut pada suhu 45oC

tidak utuh akan membentuk lapisan di bagian atas (upper band) [5]. Lapisan atas cesium chloride (CsCl) density gradient centrifugation tidak sepenuhnya mengandung partikel adenovirus yang tidak utuh melainkan juga mengandung partikel yang utuh. Jumlah partikel utuh yang mengontaminasi lapisan atas dapat ditentukan dengan menggunakan teknik AUC (Analytical Ultra Centrifugation). Kekurangan metode cesium chloride (CsCl) adalah tidak dapat digunakan untuk analisis kuantitatif adenovirus [6, 7]. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa kromatografi ion exchange [8-10], kromatografi size exclusion [11] serta kromatografi affinitas [12] dapat digunakan untuk menentukan kemurnian serta kuantitas adenovirus hasil proses produksi. Studi ini bertujuan untuk menemukan metode analisis yang dapat digunakan untuk menentukan tingkat kemurnian adenovirus hasil produksi. Metode yang dikembangkan harus mampu memberikan informasi mengenai kualitas dan kuantitas adenovirus utuh yang dihasilkan. Kromatografi Cair Kinerja Tingkat Tinggi (KCKT) dengan kolom fase terbalik digunakan untuk penentuan kemurnian adenovirus.

dan 4oC. Laju alir diatur sebesar 0.2 mL/menit dengan menggunakan sistem gradient. Absorban sampel diamati pada panjang gelombang 280 nm. Penyiapan Larutan Standar Adenovirus Dan Larutan Sampel Larutan standard dan sampel dibiarkan pada suhu ruangan dan dibiarkan hingga mencair. Adenovirus lapisan bawah dan atas hasil cesium chloride (CsCl) density gradient centrifugation digunakan sebagai standar. Lapisan atas dan bawah dipipet dan dicampurkan dengan perbandingan yang tertera pada tabel 1.

Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.3 No. 1 Juni 2014

3

Tabel 1. Larutan standar adenovirus yang terdiri dari lapisan bawah dan lapisan atas cesium chloride (CsCl) density gradient centrifugation Lapisan atas (µL)

Lapisan bawah (µL)

Dapar fosfat (µL)

Konsentras i akhir (PV/mL)

Volume akhir (µL)

89.0

0.0

411.0

2.49E+11

500

75 %

66.7

11.5

421.8

2.49E+11

500

50 %

44.5

23.0

432.5

2.49E+11

500

25 %

22.3

34.6

443.1

2.49E+11

500

0%

0.0

46.1

453.9

2.49E+11

500

Komposisi (% adenovirus tidak utuh) 100 %

*Partikel virus Penyiapan sampel larutan standar dan sampel adenovirus dikerjakan dalam Laminar Air Flow (LAF). Larutan standa dan sampel siap untuk disuntikkan ke dalam sistem KCKT. HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis kuantitatif adenovirus menggunakan sistem KCKT didasarkan pada profil protein adenovirus. Penggunaan fase gerak asam trifluoro

asetat serta asetonitril membuat partikel adenovirus utuh menjadi rusak dan dapat diamati protein penyusunnya. Kromatogram larutan standar adenovirus disajikan dalam gambar 2.

Gambar 2. Kromatogram protein adenovirus. () partikel adenovirus tidak utuh dan () partikel adenovirus utuh. Perbedaan protein yang bermakna ditandai dengan tanda panah. Beberapa protein (protein V, VI, dan VII) menunjukkan penurunan area puncak pada partikel adenovirus yang tidak utuh, sedangkan protein IIIa dan 52.55K mengalami peningkatan area puncak. Profil area puncak kromatogram protein adenovirus sesuai dengan teori yang berkembang. Protein V, VI, dan VII merupakan protein yang terkait dengan pembentukan DNA. Menurunnya area puncak ketiga protein tersebut membuktikan bahwa pembentukan DNA pada partikel adenovirus tidak utuh terjadi tidak sempurna. Ada dua kemungkinan yang dapat terjadi, yakni DNA terbentuk, namun panjang genom tidak sempurna (< 36 kb) atau DNA

sama sekali tidak terbentuk. Protein 52.55K adalah protein yang juga berperan dalam pembentukan DNA. DNA yang terbentuk sempurna pada partikel adenovirus utuh dapat diamati dengan hilangnya area puncak protein 52.55K pada partikel adenovirus utuh [13]. Protein III dan VIII menunjukkan area puncak yang sama baik pada partikel adenovirus utuh maupun tidak utuh. Untuk melihat adanya korelasi linier antara area puncak 52.55K dengan komposisi partikel adenovirus tidak utuh yang ditambahkan pada larutan standar, maka dilakukan pencampuran lapisan atas dan lapisan bawah cesium chloride

Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.3 No. 1 Juni 2014

4

(CsCl) density gradient centrifugation sesuai dengan tabel 1. Sebelum dilakukan analisis kuantitatif adenovirus utuh, maka perlu dilakukan perhitungan adenovirus utuh yang mengontaminasi lapisan atas cesium chloride (CsCl) density gradient centrifugation menggunakan metode AUC. Dari hasil AUC (data tidak disajikan), diketahui bahwa 17% partikel adenovirus utuh terdapat pada lapisan

atas CsCl gradient. Nilai 17% ini digunakan untuk mengoreksi persentase partikel adenovirus tidak utuh yang digunakan untuk membuat larutan standar. Korelasi linear masing-masing protein diamati dengan memplot % adenovirus tidak utuh vs area puncak. Profil kromatogram protein adenovirus yang terdapat dalam larutan standar, disajikan dalam Gambar 3.

Gambar 3. Kromatogram larutan standar adenovirus dengan berbagai persentase partikel adenovirus tidak utuh. Pada penelitian ini, protein 52.55K digunakan sebagai marker partikel adenovirus tidak utuh dikarenakan protein hanya terdapat pada adenovirus yang sedang dalam proses pembentukan DNA. Protein VIII, yang memiliki area puncak konstan, digunakan sebagai internal standar. Kuantifikasi protein menggunakan respon detektor KCKT dilakukan berdasarkan jurnal yang ditulis oleh Eberlein dan Lehmberg. Menurut, Eberlein, konsentrasi adenovirus dapat digunakan untuk menghitung protein. Untuk perhitungan molaritas protein, diperlukan data area puncak, tinggi puncak, laju alir, koefisien ekstingsi dan berat molekul

protein. Data koefisien ekstingsi dan berat molekul protein diperoleh dari ProtParam tool, ExPasy (14). Hubungan antara % adenovirus tidak utuh dengan rasio molaritas protein 52.55K/protein VIII ditunjukkan dalam tabel 2 dan gambar 4. Persentase adenovirus tidak utuh dalam sampel adenovirus dilakukan dengan menghitung ratio molaritas protein 52.55K/protein VIII dan memasukkan nilai ratio molaritas ke dalam kurva kalibrasi larutan standar adenovirus. Hasil perhitungan % adenovirus tidak utuh pada sampel adenovirus berkisar antara 4.8 hingga 8.1%.

Tabel 2. Hubungan antara persentase adenovirus tidak utuh vs ratio molaritas protein 52.55K/prot VIII

% adenovirus tidak utuh

Ratio molaritas p52.55K/pVIII

0%

0.2

21%

0.1

42%

2.0

62%

3.0

83%

3.6

Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.3 No. 1 Juni 2014

5

rasio molaritas p52.55K/pVIII

4,0 3,0

y = 4,2454x + 0,185 R² = 0,9955

2,0 1,0 0,0 0%

20%

40%

60%

80%

100%

% adenovirus tidak utuh Gambar 4. Plot rasio molaritas protein 52.55K/protein VIII vs % partikel adenovirus tidak utuh. KESIMPULAN Metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) yang dikembangkan dapat digunakan untuk penentuan kemurnian adenovirus hasil produksi. Penentuan adenovirus tidak utuh dapat berguna untuk memperkirakan potensi dari produk vaksin maupun terapi gen yang diproduksi. ACKNOWLEDGEMENT Ucapan terima kasih saya sampaikan kepada Marta Germano, Ewoud van Tricht, serta rekan sejawat di Crucell Holland BV dan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya. DAFTAR PUSTAKA San Martin C. Latest insights on adenovirus structure and assembly. Viruses;4(5):84777. Russell WC. Adenoviruses: update on structure and function. Journal of General Virology 2009;90(1):1-20. Chawla

T, Khanna N, Swaminathan S. Adenovirus-vectored vaccines, 2008. p. 293-307.

Shih S-J, Yagami M, Tseng W-J, Lin A. Validation of a Quantitative Method for Detection of Adenovirus Aggregation. Bioprocessing Journal 2011;9(2):25-33. Vellekamp G, Porter FW, Sutjipto S, Cutler C, Bondoc L, Liu Y-H, Wylie D, CannonCarlson S, Tang JT, Frei A. Empty capsids in column-purified recombinant adenovirus preparations. Human gene therapy 2001;12(15):1923-36.

Vectors for Gene Therapy: Academic Press, San Diego, CA, 2002. p. 167-203. Vellekamp PSG, Scandella C. Purification of Adenovirus. Adenoviral Vectors for Gene Therapy 2002:167-203. Whitfield RJ, Battom SE, Barut M, Gilham DE, Ball PD. Rapid high-performance liquid chromatographic analysis of adenovirus type 5 particles with a prototype anionexchange analytical monolith column. Journal of Chromatography A 2009;1216(13):2725-29. Blanche F, Cameron B, Barbot A, Ferrero L, Guillemin T, Guyot S, Somarriba S, Bisch D. An improved anion-exchange HPLC method for the detection and purification of adenoviral particles. Gene therapy 2000;7(12):1055-62. Kuhn I, Larsen B, Gross C, Hermiston T. Highperformance liquid chromatography method for rapid assessment of viral particle number in crude adenoviral lysates of mixed serotype. Gene therapy 2006;14(2):180-84. Zhang S, Clarke P. Chromatographic Methods For Assessing Adenovirus Purity: U.S. Patent Application 12/043,557, 2008. Huyghe BG, Liu X, Sutjipto S, Sugarman BJ, Horn MT, Shepard HM, Scandella CJ, Shabram P. Purification of a type 5 recombinant adenovirus encoding human p53 by column chromatography. Human gene therapy 1995;6(11):1403-16. Flint SJ. Adenoviruses. eLS 2002. Bioinformatics SIo. ExPASy ProtParam

Shabram P, Vellekamp G, Scandella C. Purification of adenovirus Adenoviral

Berkala Ilmiah Kimia Farmasi, Vol.3 No. 1 Juni 2014