VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ABSTRAK RAHMA JUWITA ZAMRI. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI. Apigenin merupakan senyawa aktif yang berasal dari seledri (Apium graveolens) dan telah digunakan secara luas untuk pengobatan penyakit asam urat. Validasi metode penentuan kadar apigenin yang dilakukan pada penelitian adalah metode yang dikemukakan oleh Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005). Analisis kadar apigenin dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Untuk meyakinkan bahwa metode analisis KCKT dapat digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan maka metode tersebut divalidasi. Parameter-parameter validasi yang diuji meliputi linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Semua parameter yang ditetapkan memenuhi kriteria penerimaan yang telah ditetapkan oleh Association of Official Analytical Chemist. Linearitas pada konsentrasi 3,8; 5,7; dan 7,6 mg/l memiliki koefisien korelasi berkisar antara 0,9900 dan 0,9998. Limit deteksi metode ini adalah sebesar 2,7222 mg/l dan limit kuantifikasi sebesar 8,2500 mg/l. Ketelitian dilakukan pada hari yang sama sebanyak lima kali ulangan menunjukkan ketelitian yang cukup baik dengan simpangan baku relatif sebesar 3,85%. Ketepatan ditentukan dengan metode penambahan standar dengan nilai persen perolehan kembali berkisar antara 95,00 dan 118,77%. Rerata kadar apigenin yang diperoleh adalah sebesar 0,0052% (b/b).
ABSTRACT RAHMA JUWITA ZAMRI. Validation Method for Determination of Apigenin in Extract Celery with High Performance Liquid Chromatography. Under the direction of LATIFAH KOSIM DARUSMAN and MOHAMAD RAFI. Apigenin is an active substance derived from celery (Apium graveolens) and widely used for the treatment of gout. Determination method of apigenin which have been validated was introduced by Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005). Apigenin analysis was done by high performance liquid chromatography (HPLC). To make sure that HPLC analysis method can be used for the intended purpose then the method was validated. Parameters determined on method validation were linearity, limit of detection, limit of quantification, precision, and accuracy. All parameters were in accordance with the acceptance criteria of Association of Official Analytical Chemist. The linearity in the concentration of 3,8; 5,7; and 7,6 mg/l had correlation coefficent of 0,9900–0,9998. limit of detection in this method was 2,7222 mg/l and limit of quantification was 8,2500 mg/l. Interday precision in five restating showed good precision with relative standard deviation of 3,85%. Accuracy was determined by standard addition method with recovery percentage of 95,00–118,77%. Average concentration of apigenin is 0,0052% (w/w).
VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
RAHMA JUWITA ZAMRI
Skripsi Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul Skripsi : Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Nama : Rahma Juwita Zamri NIM : G44203012
Disetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS NIP 13053668
Mohamad Rafi, S.Si NIP 132321454
Diketahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131578806
Tanggal lulus:
PRAKATA Bismillahirrohamanirrohim. Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2007 sampai Maret 2008. Tema yang diambil adalah validasi metode, dengan judul Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu selama kegiatan penelitian dan penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Pusat Studi Biofarmaka atas bantuan sebagian dana penelitian, alm Dra.Tuti Setiawati Sudjana, MS yang sempat menjadi pembimbing I, Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS selaku pembimbing I, M. Rafi, S.Si selaku pembimbing II, Rudi Heryanto, S.Si, M.Si atas literatur dan saran yang telah diberikan. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak Eman dan seluruh staf kimia analitik, M. Agung Zaim, S.Si beserta seluruh staf pusat studi biofarmaka yang telah membantu selama penelitian, Budi Arifin, S.Si, dan teman-teman kimia angkatan 40 yang senantiasa memberikan semangat dan tempat untuk berdiskusi khususnya Niken, Wina, Farah, Noerhayati, Erika, Ratna, dan Lita. Terima kasih juga disampaikan kepada Aby, Umi, Idris, Hasby, Amel, Ruly, Mas Irawan, dan Mbak Muji atas segala doa, kasih sayang, dan dorongan semangat yang telah diberikan. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, April 2008
Rahma Juwita Zamri
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 05 Maret 1985 dari ayah KH Aby Muhammad Zamri dan ibu Jusmaniar. Penulis merupakan putri pertama dari lima bersaudara. Tahun 2003 penulis lulus dari SMUN 1 Cikarang Utara dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia TPB pada tahun ajaran 2006/2007, 2007/2008, Kimia Analitik pada tahun ajaran 2006/2007, Kimia Lingkungan pada tahun 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 pada tahun ajaran 2006/2007, Kimia Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Spektroskopi I D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Makanan D3 pada tahun ajaran 2007/2008, dan Anorganik Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008. Penulis pernah aktif di kegiatan organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai salah satu staf Departemen Kimia Pangan, Ikatan Mahasiswa Kimia, dan sebagai salah satu staf Departemen Kajian dan Jurnalistik Islam DKM Al-Ghifari pada tahun 2006. Penulis mengikuti Program Kreativitas Mahasiswa Bidang Penelitian (PKMP) dan dibiayai oleh Dikti dengan judul Daya Antioksidan Ekstrak Tumbuhan Meniran (Phyllanthus niruri Linn), Daun Sendok (Plantago major Linn) dan Som Jawa (Talinum paniculatum (jack) Gaertn) dengan Metode Tiosianat dan DPPH pada tahun 2005. Penulis menyelesaikan praktik lapangan di bagian Non-Soap Detergent PT Unilever Indonesia, Tbk pada tahun 2006 dengan judul Penentuan Bulk Density Powder Detergen dan Pengaruhnya Terhadap Proses Pengemasan.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ..................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. viii PENDAHULUAN ....................................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Seledri (Apium graveolens L.) ......................................................................... Flavonoid ........................................................................................................ Apigenin ......................................................................................................... Validasi ........................................................................................................... Linearitas ........................................................................................................ Limit Deteksi .................................................................................................. Limit Kuantifikasi ........................................................................................... Ketelitian ........................................................................................................ Ketepatan ........................................................................................................ Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ....................................................................
1 1 2 2 2 3 3 3 3 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat................................................................................................. Metode Penelitian ............................................................................................
4 4
HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Pendahuluan .............................................................................................. Ekstraksi Apigenin .......................................................................................... Analisis dengan KLT ....................................................................................... Linearitas ........................................................................................................ Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi ............................................................... Ketelitian ........................................................................................................ Ketepatan ........................................................................................................
6 6 7 7 8 9 9
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ......................................................................................................... Saran ...............................................................................................................
9 9
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................
9
LAMPIRAN ............................................................................................................. 11
DAFTAR TABEL Halaman 1 Data rendemen ekstrak seledri ................................................................................
6
2 Hasil analisis dengan KLT ......................................................................................
7
3 Persamaan regresi linear dan koefisien korelasi kurva standar ................................
7
4 Parameter statistika kurva standar rerata (n=3) ........................................................
8
5 Penentuan kadar apigenin .......................................................................................
8
6 Rerata persen perolehan kembali ............................................................................
9
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Struktur umum senyawa flavonoid .........................................................................
1
2 Struktur apigenin ....................................................................................................
2
3 Kromatogram hasil KLT standar apigenin dengan ekstrak ......................................
7
4 Kurva standar rerata ...............................................................................................
7
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alir penelitian ............................................................................................. 12 2 Hasil analisis kadar air seledri .............................................................................. 13 3 Data rendemen hasil ekstraksi seledri .................................................................... 14 4 Nilai Rf dan warna bercak hasil KLT ..................................................................... 15 5 Linearitas ulangan 1 .............................................................................................. 16 6 Linearitas ulangan 2 .............................................................................................. 18 7 Linearitas ulangan 3 .............................................................................................. 20 8 Parameter statistika kurva standar rerata ............................................................... 22 9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi ........................................................ 24 10 Penentuan ketelitian ............................................................................................. 25 11 Penentuan persen perolehan kembali .................................................................... 28
PENDAHULUAN Seledri merupakan salah satu tanaman obat yang berperan dalam mengatasi penyakit rematik dan asam urat. Komponen metabolit sekunder yang berhasil diisolasi dari seledri di antaranya glikosida, apiin, apiol, dan flavonoid yang bermanfaat sebagai obat peluruh keringat, penurun demam, rematik sukar tidur, dan darah tinggi. Selain itu pada seledri juga ditemukan apigenin, manit, inositol, asparigina, glutamina, kolina, dan linamarosa (Soedibyo 1998). Apigenin merupakan salah satu senyawa yang terdapat dalam seledri dan dapat digunakan sebagai obat asam urat (Duke 1999). Metode yang digunakan untuk penentuan kadar apigenin adalah metode yang dikemukakan oleh Frankee et al. (2005). Analisis kadar apigenin pada penelitian ini menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) karena metode tersebut memiliki sensitivitas yang tinggi dan memerlukan jumlah contoh yang sedikit (beberapa µl). Hasil analisis yang akurat dan absah akan diperoleh apabila metode yang digunakan telah divalidasi terlebih dahulu. Validasi adalah sebuah evaluasi mengenai ketepatan dan ketelitian dari suatu prosedur analisis yang layak digunakan untuk menyelesaikan masalah. Validasi menjamin bahwa prosedur yang sama mendapatkan hasil yang dapat dibandingkan. Nisbah analisis ini dapat digunakan untuk mengevaluasi ketelitian dan ketepatan. Untuk meyakinkan bahwa metode analisis dapat digunakan dan menjamin mutu produk yang dihasilkan sesuai persyaratan, maka metode tersebut harus divalidasi. Parameter yang diuji dalam penelitian ini meliputi linearitas, limit deteksi, limit kuantifikasi, ketelitian, dan ketepatan. Penelitian ini bertujuan mengetahui keabsahan data yang dihasilkan dari metode Frankee et al. (2005).
TINJAUAN PUSTAKA
bergerigi dan panjang 10–25 cm. Dalam keadaan kering daun seledri menggulung, berwarna hijau kecoklatan, berbau aroma kuat, rasa manis sedikit pahit (Djumidi et al. 1998). Menurut Soedibyo (1998), kandungan kimia seledri adalah apiin, apigenin, manit, inositol, asparagina, glutamina, kolina, dan linamarosa. Kandungan seledri daun tiap 100 g ialah 89 g air, 2,20 g protein, 0,60 g lemak, 4,60 g karbohidrat, 1,40 g serat, 1,70 g abu, 2685 IU vitamin A, 0,08 mg vitamin B1, 0,12 mg vitamin B2, 0,60 mg niasin, 49 mg vitamin C, 326 mg Ca, 51 mg P, 15,30 mg Fe, 151 mg Na, 318 mg K (Susiarti 2000). Tanaman seledri juga dimanfaatkan untuk pengobatan tradisional, misalnya untuk obat tekanan darah tinggi, diuretik, emenagog (memperlancar haid), dengeu (demam disertai lini pada sendi-sendi dan otot), dan rematik. Tanaman ini juga dapat digunakan untuk melangsingkan tubuh. Di pedesaan Jawa Barat, daun seledri dimanfaatkan untuk menyuburkan rambut, selain lidah buaya dan daun dadap (Susiarti 2000).
Flavonoid Flavonoid merupakan golongan terbesar senyawa fenolik di samping fenol sederhana, fenilpropanoid, dan kuinonfenolik (Harborne 1986). Sebanyak 2% dari seluruh karbon yang difotosintesis oleh tanaman diubah menjadi flavonoid atau senyawa yang berhubungan erat dengannya (Markham 1988). Dalam tumbuhan, aglikon flavonoid terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Semuanya mengandung 15 atom C dalam inti dasarnya yang tersusun dalam konfigurasi C 6-C3-C6, yaitu dua cincin aromatik dihubungkan oleh 3 karbon yang dapat atau tidak dapat membentuk cincin ketiga. Cincin diberi nama A, B, dan C, atom karbon dinomori menurut sistem penomoran yang menggunakan angka untuk cincin A dan C serta angka beraksen untuk cincin B. Struktur umum flavonoid dapat dilihat pada Gambar 1.
Seledri (Apium graveolens) Apium graveolens adalah daun seledri dari famili Apiaceae atau Umbelliflorae. Ciri makroskopis simplisia daun seledri berupa daun tunggal atau majemuk semu, tangkai silindris beralur, panjang tangkai 5–15 cm. Daun seledri berbentuk segi tiga, dengan ujung runcing, pangkal berlekuk, tepi
B A
C
Gambar 1 Struktur umum senyawa flavonoid (Markham 1988).
Flavonoid umumnya secara alami terbentuk di bawah pengaruh bioflavonoid (vitamin D) yang selalu ada dalam tanaman dan memiliki efek yang bermanfaat terhadap lebih dari 50 penyakit (Heldt 1997). Flavonoid akan berubah warnanya jika ditambah basa atau amonia sehingga mudah dideteksi pada kromatogram atau pada larutan (Harborne 1986). Flavonoid, tanin, lignan, dan lignin merupakan turunan fenilalanina dan pada beberapa tanaman ada yang berasal dari tirosina. Fenilalanina dan tirosina terbentuk dari jalur sikimat. Karena senyawa fenolik berasal dari dua asam amino yang memiliki cincin fenil dengan C3 sebagai rantai samping, mereka dinamai fenilpropanoid. Flavonoid yang meliputi flavon, isoflavon, dan antosianidin, sebagaimana struktur fenilpropana, mengandung sebuah cincin kedua yang terbentuk dari tiga molekul asetil koenzim A (Heldt 1997). Flavon merupakan prekursor untuk beberapa flavonoid
Apigenin Apigenin merupakan komponen flavonoid utama dari seledri yang termasuk ke dalam golongan flavon (Harborne 1986). Gambar 2 menunjukkan struktur kimia apigenin. Rumus molekulnya adalah C15H10O5 dengan bobot molekul 270,23 g/mol. Nama Intenational Union of Pure and Applied Chemistry dari apigenin adalah 5,7-dihidroksi-2-(4hidroksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on. Titik leleh apigenin 345–350 C. Apigenin memiliki banyak kegunaan, salah satunya dalam bidang farmasi. Senyawa ini dapat digunakan sebagai obat asam urat (Duke 1999).
Gambar 2 Struktur apigenin (Markham 1988). Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Hertog et al. (1992) mengemukakan bahwa kadar apigenin pada seledri yang direfluks dengan metanol 50% adalah 1787 mg/kg bobot kering seledri. Kemudian, Crozier et al. (1997) mengemukakan bahwa kadar apigenin dalam seledri bervariasi
bergantung dari jenis seledri yang dianalisis, kadar apigenin dalam seledri bervariasi antara 17 dan 191 µg/g bobot segar seledri. Barubaru ini, Laura (2007) mengemukakan bahwa kadar apigenin dalam seledri berkisar antara 2 dan 17 ppm bergantung pada masa tanam seledri.
Validasi Validasi menurut Harmita (2004) merupakan suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya. Validasi menurut SK Menkes RI No. 43/Menkes/SK/II/1988 tentang cara pembuatan obat yang baik (CPOB) merupakan suatu tindakan pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem, perlengkapan, atau mekanisme yang digunakan dalam produksi dan pengawasan akan senantiasa mencapai hasil yang diinginkan (Depkes RI 2001). Association of South East Asian Nation Good Manufacturing Practice (ASEAN GMP) menyatakan bahwa validasi adalah kegiatan membuktikan dengan pasti bahwa material, proses, prosedur, aktivitas, sistem, peralatan, atau mekanisme yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil yang diharapkan pada standar yang konsisten (ASEAN 1996). Validasi metode menurut Association of Official Analytical Chemist (AOAC) (2002) adalah suatu proses yang menetapkan bahwa karakteristik suatu metode yang ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk aplikasi analisis yang diharapkan dengan cara studi laboratorium. Validasi menurut Levin (2002) dibagi menjadi empat kelas, yaitu kelas A, B, C, dan D. Kelas A digunakan untuk identifikasi suatu senyawa. Kelas B digunakan untuk mendeteksi dan menentukan adanya pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa secara kuantitatif dan kelas D untuk mencari ciri suatu senyawa. Linearitas Linearitas menunjukkan kemampuan suatu metode analisis untuk memperoleh hasil pengujian yang sesuai dengan konsentrasi analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi tertentu (AOAC 2002). Linearitas suatu metode analisis adalah ukuran yang menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi
