High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Indah Solihah
HPLC Merupakan teknik pemisahan senyawa dengan cara melewatkan senyawa melalui fase diam (stationary phase) Senyawa dalam kolom tersebut akan dielusi dengan fase gerak (mobile phase) Senyawa dalam kolom akan keluar dari kolom atas dasar kepolaran yang berbeda, sehingga akan mempengaruhi kekuatan interaksi senyawa dengan fase diam dan fase gerak
HPLC Senyawa yang keluar dari kolom akan dideteksi dengan detektor yang sesuai dan dilaporkan sebagai kromatogram Dari kromatogram dapat diidentifikasi waktu retensi (tR) dan luas area/tinggi puncak Untuk: - analisis kualitatif digunakan informasi tR, - analisis kuantitatif digunakan informasi luas area/tinggi puncak kromatogram
Kualitatif vs Kuantitatif
Kegunaan HPLC : • Pemisahan sejumlah seny.organik, anorganik, maupun seny.biologis • Analisis ketidakmurnian (impurities) • Analisis senyawa tdk mudah menguap (non volatile) • Penentuan molekul2 netral, ionik, maupun zwitter ion • Isolasi dan pemurnian senyawa • Pemisahan seny2 yg strukturnya hampir sama • Pemisahan seny2 dlm jml sekelumit (trace elements) • Menetapkan kadar seny2 tertentu
Kelebihan HPLC • KCKT dapat dipakai untuk senyawa non volatile dan senyawa berbobot molekul tinggi. • KCKT dapat dipakai untuk senyawa anorganik yg sebagian besar non volatile. • KCKT biasanya dilakukan pada suhu kamar sehingga aman bagi senyawa yg tidak tahan panas • Pada KCKT kemungkikan antaraksi antara fase gerak dan linarut besar sekali (mencakup antaraksi ikatan hidrogen dan reaksi ion) proses pemisahan lebih optimal • Fase gerak pada KCKT dapat diubah dengan mencampur pelarut dalam berbagai gradient • Dapat digunakan untuk menganalisis beberapa senyawa sekaligus (secara simultan)
Keterbatasan HPLC • Sulit untuk mengidentifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dg spektrometer massa • Jika sampel yang digunakan sangat kompleks, maka resolusi (pemisahan) yg baik sulit diperoleh
Tujuan Akhir HPLC
HPLC
Pemisahan
Resolusi • Tingkat pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan • Untuk hasil pemisahan yang baik, puncakpuncak dalam kromatogram harus terpisah secara sempurna dari puncak lainnya dengan sedikit tumpang tindih (overlap) atau tidak tumpang tindih
Resolusi
Ukuran Daya Pisah
Resolusi
Instrumentasi HPLC
Komponen instrumen HPLC : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Wadah fase gerak Sistem penghantaran fase gerak = Pompa Alat utk memasukkan sampel Kolom Detektor Wadah penampung buangan fase gerak Tabung penghubung Suatu komputer atau integrator atau perekam
Wadah Fase gerak dan Fase gerak • Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). • Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. • Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. • Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. • Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
• Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. • Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. • Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik. • Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi)
Catatan • Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan degassing (penghilangan gas) • Pelarut yg digunakan harus dg kemurnian tinggi (HPLC grade)
Pelarut
UV cut off (nm)
n-heksana
195
Sikloheksana
200
Tetraklorometan
265
Metilbenzen
285
Triklorometan
245
Diklorometan
230
Tetrahidrofuran
212
Propanon
330
Asetonitril
190
Iso-propanol
205
Etanol
205
Metanol
205
Asam etanoat
255
Air
170
Pompa • Syarat Pompa HPLC: inert terhadap fase gerak. • Bahan yang umum dipakai adalah gelas, baja tahan karat, teflon, dan batu nilam. • Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, 20 mL/menit. • Tujuan penggunaan pompa adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. • Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. • Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Alat untuk memasukkan sampel • Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Rheodyne Loop Injector
Kolom • Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. • Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: 1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit). 2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. 3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.
Parameter
Kolom Konvensional
Kolom Mikrobor
Tabung Kolom
Stanless steel P = 3,10,15,20, dan 25 cm o.d = 0,25 inci i.d = 4,6mm
Stanless steel P = 25 dan 50 cm o.d = 0,25 inci i.d = 1 atau 2 mm
Tek. Operasional 500-3000 psi (35-215 bar)
1000-5000 psi (70-350 bar)
Fase Gerak
NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol . RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer Kec.Alir : 1-3mL/menit
NP : hidrokarbon+pelarut2 terklorinasi atau alkohol . RP : metanol atau asetonitril + air atau buffer Kec.Alir : 10-100µL/menit Modifikasi Instrumen : Aliran < 10µL/menit. Katup injeksi sampel dan sel detektor bervolume kecil
Kinerja
Efisiensi meningkat dg berkurangnya uk.partikel fase diam, akan tetapi umur kolom dg ukuran partikel 3µm lbh pendek
Sangat efisien dan sensitif, akan tetapi lambat. Konsumsi fase gerak hanya ¼ dari kolom konvensional
• Dalam prakteknya, kolom mikrobor tidak setahan kolom kovensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin
Bagaimana memilih kolom??? Untuk memilih kolom (fase diam), perhatikan beberapa sifat senyawa seperti: - kelarutan - kepolaran Dengan memperhatikan sifat-sifat tersebut, kolom dapat dipilih dengan petunjuk berikut ini
Kolom Fase Diam HPLC
Particle Size
Beda Ukuran Partikel
Kolom • Performance kolom menurun seiring dengan lamanya waktu penggunaan, yang ditandai dengan peningkatan “backpressure” dan lebar puncak kromatogram
Pengoperasian Kolom Untuk kolom “Reversed-Phase” [C8, C18, fenil, dll], gunakan petunjuk berikut: - simpan kolom dalam asetonitril atau metanol atau campuran air dan pelarut organik - jangan mengoperasikan kolom melebihi pH yang diperbolehkan (untuk kolom berbasis silika, disarankan pH 2,5 – 8). pH > 8 silika terlarut pH < 2 bonded silika terhidrolisis
Pengoperasian Kolom Selalu flush (aliri) kolom dengan pelarut kuat (strong solvent) seperti metanol sebelum digunakan untuk mengeliminasi setiap anlit yang tertahan kuat Jangan pernah biarkan komponen bufer tertinggal dalam dalam pompa atau kolom, karena komponen bufer dapat mengendap dan menimbulkan kerusakan
Pencucian Kolom Bersihkan kolom dengan solven yang kuat. - Untuk kolom Reversed-phase: gunakan campuran 96% diklorometan dan 4% metanol dengan 0,1% amonium hidroksida - Untuk kolom Normal-phase: gunakan metanol Pada keadaan yang sulit: - lakukan “back-flushing” kolom dengan kecepatan alir rendah [ bila diperbolehkan !!! ]
