HPLC II Indah Solihah
Teknik Elusi Isokratik: - teknik elusi menggunakan komposisi fase gerak tetap (polaritas tetap) selama proses kromatografi berlangsung
Gradien: - teknik elusi menggunakan komposisi fase gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah) selama proses kromatografi berlangsung 2
HPLC-2011
Teknik Isokratik
3
HPLC-2011
Eluen= campuran A + B 50 % B
40 % B
4
HPLC-2011
30 % B
35 % B
5
HPLC-2011
Teknik Gradien Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas, kemudian dilakukan
teknik elusi gradien
6
HPLC-2011
Hasilnya
7
HPLC-2011
Normal-Phase HPLC [ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ] Senyawa polar: - terelusi belakangan (tR panjang) - semakin non-polar fase gerak, tR senyawa polar makin panjang Solven: - campuran metilen klorid, dietileter, kloroform Eluent strength: - dimodifikasi dengan n-heksan 8
HPLC-2011
Reversed-Phase HPLC Reversed-Phase HPLC [ Fase diam lebih nonpolar dibanding fase gerak ] Senyawa polar: - terelusi lebih dahulu Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar lebih kuat tertahan Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetrahidrofuran Eluent strength: - dimodifikasi dengan air (Kellner dkk., 1998) 9
HPLC-2011
Perkirakan urutan elusi, dari pertama sampai terakhir, pada steroid-steroid berikut ini dari kolom ODS dg fase gerak metanol/air (70:30)
Nandrolone Methyltestosterone
Detektor Bagaimana Memilih detektor dan Apa pertimbangannya
???
Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Detektor HPLC Bulk property detector (BPD) : - mengukur sifat solute dan fase gerak contoh : detektor indeks bias ( RI ) Solute property detector (SPD) : - hanya mengukur sifat solute - 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD Contoh : detektor UV
Syarat Detektor : • • • •
Cukup sensitif Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi Respon linear terhadap solut Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung flow rate (kec.alir) • Mudah digunakan • Tidak merusak sampel
Detektor UV • •
• •
Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut sedangkan sampel menyerap dengan kuat. Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor dengan λ yg dapat diubah-ubah antara 200-700 nm Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar Detektor ini hanya bekerja jika senyawa mempunyai kromofor
Kromofor UV-HPLC
Kromofor UV-HPLC
Detektor UV Untuk keperluan analisis komponen utama dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan minimal nilai senyawa harus ≥ 10 M-1. cm-1 pada ≥ 185 nm. Untuk keperluan trace analisis secara HPLCUV diperlukan minimal nilai senyawa harus ≥ 1000 M-1. cm-1 Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV, senyawa dengan nilai senyawa 100 M-1. cm-1 tidak mungkin dilakukan
UV / Visible detector Advantages
Disadvantages
• High sensitivity & small sample volume required • Can be used with gradient elution • Is relatively cheap and not sensitive to temperature • Sensitive to large number of organic compounds
• Does not work with compounds that do not absorb light at this wavelength region • Cannot be used with the solvents having large absorption in the UV region • Cannot be used for the sample components which cannot be absorbed in the UV region
21
Detektor PDA • Mampu memberikan kumpulan kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yg berbeda dlm sekali proses (single run) • Pada kromatogram dapat pula ditampilkan spektrum UV shg dpt digunakan untuk memilih λmaks utk sistem HPLC • Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi, panjang gelombang, dan waktu)
Detektor Fluoresensi • Merupakan detektor yg paling peka, tetapi hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa berfluorisensi, karena itu kadang2 solut diubah menjadi turunan senyawa yg berfluorisensi sebelum dikromatografi
Detektor UV vs Fluorescen
UV
Fluorescen
26
HPLC-2011
Luminescence Bagaimana terjadinya fluorescensi ???
Fluorescensi
27
HPLC-2011
Fluorescene detection • Compared to UV-VIS detectors fluorescence detectors offer a higher sensitivity and selectivity that allows to quantify and identify compounds and impurities in complex matrices to extremely low concentration levels (trace level analysis) • Fluorescence detectors sense only those substances that fluoresce suwedo hadiwiyoto
excitation
basic principles of HPLC - 1
emission
Mobile phase
28
Derivatisasi Apa arti derivatisasi … ? Apa tujuannya … ? Bagaimana caranya … ? Derivatisasi Post-/Pre-column … ?
HPLC-2011
29
Tujuan Derivatisasi Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa nonkromofor senyawa berkromofor) Meningkatkan daya berkromofor UV fluorescensi)
deteksinya (senyawa senyawa berkromofor
30
HPLC-2011
Syarat reaksi derivatisasi 1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; 2. Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); 3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; 4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi.
Captopril HS
CH3 O N
COOH
Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC dengan detektor UV ? 32
HPLC-2011
Derivatisasi dg p-Br fenacylbromide HS
CH3 O O N
Captopril
COOH
Br
+
E t i l a m i n 33
C-CH2-Br
p -Br fenacylbromide
HPLC-2011
Hasil derivatisasi : Captopril + p -Br Fenacylbromide HS
CH3 O O N
O
C-O-CH2-C
Br
Dapat dideteksi secara UV 34
HPLC-2011
Gabapentin O H2N
C OH
R-NH2
Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau Fluorescen ? 35
HPLC-2011
Derivatisasi dg Dansilklorid H3 C
CH3
H3C
N
CH3 N
+ R-NH2 - HCl O=S=O
O=S=O
Cl
NH R
Dansil klorid
HPLC-2011
Fluorescent derivative
36
Contoh Senyawa Asli Yang
Berfluorescensi
Kunang-kunang
38
HPLC-2011
Fluorescensi
39
HPLC-2011
Asam Salisilat O C
O
OH H
As.Salisilat - Fluorescensi
O C
O
OH H
Papaverin HCl H3CO N
H3CO CH2
OCH3 .HCl OCH3
Riboflavin OH OH OH CH2-CH-CH-CH-CH2OH H 3C
H3 C
N
N
O NH
N O
44
HPLC-2011
Detektor Indeks Bias • Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda • Detektor mengukur perbedaan antara indeks bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan oleh adanya solut. • Detektor ini tidak dapat dipakai untuk elusi bergradien karena indeks bias sistem berubah selama kromatografi • Sangat sensitif terhadap perubahan suhu
Refractive index (RI) detection • The ability of a compound or solvent to deflect light provides a way to detect it • The RI is a measure of molecule’s ability to deflect light in a flowing mobile phase in a flow cell relative to a static mobile phase contained in a reference flow cell • The amount of deflection is proportional to concentration • The RI detector is considered to be a universal detector but it is not very sensitive
basic principles of HPLC - 1
46
Detektor Elektrokimia • Detektor ini menggunakan sifat redoks solut untuk mengukur kehadiran solut tersebut. • Memiliki kepekaan yg tinggi • Fase gerak harus polar dan mengandung elektrolit pendukung
Detektor Spektrometri Massa • • • •
Untuk identifikasi senyawa murni GC-MS : terjadi pola fragmentasi LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi Data berupa berat molekul, terkadang ditambah berat molekul pelarut
Bentuk Kromatogram Bentuk kromatogram (peak) ada bermacam-macam, a.l: - tailing, fronting (leading) - asimetri, simetri - pecah - lainnya
49
HPLC-2011
Peak Tailing
Possible cause:
Possible solution:
Dead volume in flow path
Check all fittings, especially postcolumn and at the column head
Mobile phase too weak
Remake mobile phase or increase acid concentration
Peak Fronting Possible cause:
Possible solution:
Overloading of column
Dilute sample 1:10 and rerun or use a larger capicity column
Column is poorly packed
Run high organic through column, then equilibrate and retry, or replace column
Peak asymmetry - tailing
USP
HPLC-2011
51
Peak Asymmetry vs Tailing
Baca: Snyder dkk., 1997 HPLC-2011
52
Kriteria Peak
HPLC-2011
54
Pengatasan Peak Tailing Tambahkan 30 mM: - Trietilamin (utk seny. basa) - Amonium asetat (utk seny. asam) Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietilamin dengan: 10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktilamin asetat Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g Bagaimana mekanisme kerja TEA mencegah tailing ? 55
HPLC-2011
Tailing Senyawa Basa Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat dengan senyawa basa [ R-NH2 ] yang melewati kolom tersebut. Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin modifier ke dalam campuran fase gerak, misal: trietilamin [ TEA ]. TEA akan me-masking residu Si-OH, sehingga saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat memperkecil terjadinya tailing. 56
HPLC-2011
Penggunaan TEA Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak. Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi residu silanol pada kolom RP-18. Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !
Perhatikan: pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan
fase gerak yang mengandung TEA 57
HPLC-2011
Broad Peaks Possible cause:
Possible solution:
Overloading of column
Dilute sample 1:10 and rerun
Retention time too long
Modify gradient so that peaks elute earlier
Extra-column volume too large
Reduce tubing diameters and lengths where possible, particularly postcolumn
"Dead" volume
Check all connections for proper fit
Detector time too slow
Increase detector Hz rate
Peak Doubling Possible cause:
Possible solution:
Overloading of column
Dilute sample 1:10 and rerun or use a higher capacity column
Sample volume too large
Inject less than 1/6 of the column volume, or increase sample concentration
Dead volume in flow path
Check all fittings, in particular post-column and at the column head
Problems internal to column
Run high organic through column, equilibrate and retry, or replace column
Clogged sample filter
Replace filter
Jenis-Jenis HPLC
Kromatografi Adsorpsi • Pemisahan menggunakan fase normal • Sering terjadi tailing • Fase gerak dimodif dengan penambahan pelarut polar (air, metanol, etanol) • Detektor UV lazim digunakan
Kromatografi Partisi • Pemisahan menggunakan fase terbalik • Pemisahan dilakukan untuk senyawa2 yg bersifat asam lemah atau basa lemah • Fase gerak harus dijaga pH-nya dengan buffer agar analit tidak terionisasi
Kromatografi Penukar Ion • Fase diam dapat menukar kation atau anion dg fase gerak • Fase gerak mengandung air untuk proses ionisasi • Retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak
Kromatografi Eksklusi Ukuran • Prinsip pemisahan berdasarkan ukuran molekul fase gerak • Digunakan untuk memisahkan senyawa dg BM>2000 dalton • Fase diam berupa silika atau polimer yg bersifat porus
