Artikel Penelitian
Pengembangan Metode Ekstraksi dan Analisis Irbesartan dalam Plasma Darah menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Fluorescence Ratih ABSTRACT: A simple extraction and analysis method by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) luorescence has developed for determination of Irbesartan in plasma sample. The chromatography system were luorescence detector at λ ex254nm/em380 nm, low rate 1 mL/min, C-18 150 x 4,6 mm; 5μm column and acetonitrile : 0,5% (v/v) H3PO4 pH 3,0 (77:23) as mobile phase by run time not more than 6 minutes. Reliability of the HPLC method was assessed by the linearity of 9 levels concentration which be found 10.0 – 5,000.0 ng/mL, r = 0.9996 respectively. Chloroform was used as pretreatment solvent to extract Irbesartan dan Candesartan cilexetil (Internal Standard) from protein binding. The chromatogram of Irbesartan dan Candesartan cilexetil peaks were clearly separated without matrix noises, it was showed by resolution factor > 2. Keywords : irbesartan, candesartan, HPLC luorescence, blood plasma. ABSTRAK: Dalam penelitian ini dikembangkan suatu metode yang sederhana untuk ekstraksi dan analisis Irbesartan dalam sampel plasma menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) luorescence. Sistem kromatogra i yang digunakan adalah detektor luorescence pada λ ex254 nm/ em380 nm, low rate 1 mL/menit, kolom C18 150 x 4,6 mm; 5μm, serta acetonitrile : 0,5% (v/v) H3PO4 pH 3,0 (77:23) sebagai fase gerak telah memberikan hasil yang optimal dengan run time kurang dari 6 menit. Reliabilitas dari metode HPLC ditunjukkan dari linearitas 9 titik konsentrasi antara 10,0 - 5.000,0 ng/mL dengan nilai r = 0,9996. Proses ekstraksi menggunakan pelarut chloroform sebagai pretreatment untuk memisahkan Irbesartan dan Candesartan cilexetil (Standar Internal) dari ikatan protein plasma. Hasil kromatogram menunjukkan peak Irbesartan dan Candesartan cilexetil terpisah dengan baik tanpa ada gangguan dari matriks dengan resolusi > 2. Fakultas Farmasi Universitas Surabaya
Kata kunci: irbesartan, candesartan, HPLC luorescence, plasma darah
Korespondensi: Ratih Email:
[email protected] Jurnal Farmasi Indonesia ■ Vol. 7 No. 3 ■ Januari 2015
157
Metode Ekstraksi dan Analisis Irbesartan dalam Plasma Darah
PENDAHULUAN Irbesartan memiliki nama IUPAC 2-butyl3-({4-[2-(2H-1,2,3,4-tetrazol-5-yl) phenyl]phenyl}methyl)-1,3-diazaspiro[4.4]non-1-en-4-one dengan rumus molekul C25H28N6O dan berat molekul 428,53 g/mol. Irbesartan agak sukar larut dalam alkohol dan methylene chloride serta praktis tidak larut dalam air dan merupakan derivat tetrazole dengan nilai pKa 4,24 (1,2). Irbesartan memiliki sediaan tablet 75 mg, 150 mg dan 300 mg dengan waktu paruh 11-15 jam (3).
Gambar 1. Struktur Irbesartan (2) Irbresartan merupakan kelompok angiotensin II blocker Reseptor Angiotensin II antagonist menunjukkan kelas farmakologi yang relatif baru, utamanya bekerja secara selektif menghambat reseptor AT1 dan mereduksi efek angiotensin II dan merupakan senyawa yang tidak memerlukan aktivasi metabolik untuk aktivitasnya (4). Mekanisme kerja Irbesartan sebagai angiotensin II reseptor tipe I antagonis yang secara luas digunakan untuk treatment hipertensi, gagal jantung, infarct myocardial dan neuropathy diabetic[9] Penelitian yang dilakukan pada hewan coba menunjukkan karakteristik Irbesartan yang diberikan secara oral memiliki volume distribusi yang besar, clearance plasma rendah dan t1/2 yang panjang. Kondisi preklinis tersebut menggambarkan bahwa ikatan antara Irbesartan dalam protein cukup tinggi (4). Studi farmakokinetik menunjukkan Tmax dicapai pada 1,33 jam dengan
158
Cmax 1173,36-9563,18 ng/mL (5). Irbesartan yang memiliki kecenderungan terikat dalam protein plasma dalam jumlah yang besar merupakan tantangan dalam melakukan analisis penetapan kadar. Secara umum analisis Irbesartan dapat dilakukan mengggunakan beberapa metode diantaranya High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC), Spektrofotometri, Spektro luorometri, Voltameri, Capillary Zone Electrophoresis (CZE), HPLC dan LC-MS (6,7,8). High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode dengan prinsip pemisahan yang telah banyak dikenal, akurat dan sederhana. Penelitian terdahulu diantaranya dilakukan oleh Caudron et al., 2004, yang menggabungkan Solid Phase Extraction dan HPLC-DAD (9); Gupta et al., 2011 mengembangkan metode voltametri dengan LOQ 5,33 x 10-7 mol/L (5). Limit deteksi yang dicapai menggunakan metode HPLC dilaporkan sangat bervariasi antara 1 ng10 μg/mL, sedangkan LC-MS mencapai 10 ng/mL (10,8). Dari beberapa metode HPLC yang telah dikembangkan terdapat beberapa bagian yang cukup rumit untuk dilakukan diantaranya menggunakan Solid Phase Extraction maupun melalui tahap pengasaman untuk mencapai pH tertentu dan mendapatkan kondisi ekstraksi yang optimum (5,10). Dengan sejumlah keterbatasan metode analisis Irbesartan dalam plasma yang telah ada, maka penelitian ini ditujukan untuk mengembangkan suatu metode pemisahan yang sederhana melalui pretreatment ekstraksi cair-cair dalam chloroform dan yang digabungkan dengan kemampuan HPLC- lourecence.
METODE PENELITIAN Bahan Penelitian Acetonitrile pro HPLC-Merck®, Methanol pro HPLC-Merck®, Chloroform-Merck®, Aquabidestilata-PT. Ikapharmindo, Plasma darah (Palang Merah Indonesia), H3PO4 Merck®, Triethylamine
Jurnal Farmasi Indonesia ■ Vol. 7 No. 3 ■ Januari 2015
Ratih
p.a. Merck®, standar Irbesartan (Zhuhai Sanxin Fine Chemical Co., Ltd.) p.a, Candesartan Cilexetil (Teva Tech) p.a. Instrumen Instrumen yang digunakan dalam peneltian ini adalah HPLC-FLD Waters® Alliance dengan kolom SunFire-Waters® C18 150 x 4,6 mm; 5μm, λ eksitasi 254 nm dan emisi 380 nm, low rate 1 mL/menit, kolom C18. Prosedur Analisis Pembuatan Baku Induk Irbesartan Baku induk Iebesartan dibuat dalam konsntrasi 1,0 mg/mL dalam pelarut methanol pro HPLC. Pembuatan Baku Kerja Irbesartan Larutan baku kerja Irbesartan dengan konsentrasi 10,0 ng/mL, 50,0 ng/mL, 100,0 ng/mL, 200,0 ng/mL 400,0 ng/mL, 800,0 ng/mL, 1.500,0 ng/mL, 3.000,0 ng/mL, 5.000,0 ng/mL dalam 70% acetonotrile pro HPLC. Pembuatan Baku Kerja Candesartan (IS) Larutan baku kerja Candesartan dengan konsen-
trasi 1μg/mL dalam 70% Acetonotrile pro HPLC. Pembuatan Preparat dalam Plasma Darah Pipet sejumlah plasma masukkan ke dalam microtube, spiking menggunakan internal standar (IS) dan analit Irbesartan dalam berbagai konsentrasi. Tambahkan presipitan kemudian vortex dan sentrifugasi 13000 rpm selama 10 menit. Pisahkan supernatan ke dalam tabung reaksi bertutup, kemudian ekstraksi dan sentrifugasi selama 10 menit. Pisahkan lapisan organik dan evaporasi. Preparat yang telah kering dilarutkan, kemudian dianalisis menggunakan HPLC
HASIL PENELITIAN Metode kromatogra i menggunakan detektor luoresescence pada λ eksitasi 254 nm/ emisi 380 nm, low rate 1 ml/menit, kolom C18, serta fase gerak acetonitrile : 0,5% v/v H3PO4 (77:23). Kondisi HPLC tersebut telah berhasil memisahkan peak Irbesartan dan Candesartan cilexetil (IS) dalam run time kurang dari 6 menit. Respon yang linear ditunjukkan oleh 9 titik konsentrasi antara 10,0-5.000,0 ng/mL dengan r = 0,9996 dan persamaan y = 0,0007x+ 0,0020.
Tabel 1. Baku Kerja Irbesartan (10-5.000 ng/mL) Konsentrasi (ng/mL)
Area Irbesartan
10,0 50,0 100,0 200,0 400,0 800,0 1.500,0 3.000,0 5.000,0
Jurnal Farmasi Indonesia ■ Vol. 7 No. 3 ■ Januari 2015
Area Candesartan
Peak Ratio
30.050.491
3.606.325.244
0,01
32.964.298
3.592.962.740
0,01
119.513.775
3.637.651.940
0,03
122.831.061 267.404.014 267.704.025
3.613.868.001 3.618.672.584 3.652.632.106
0,03 0,07 0,07
553.744.815
3.638.440.746
0,15
602.724.115
3.863.082.507
0,16
1.078.849.603
3.545.370.435
0,30
1.082.753.368
3.591.573.115
0,30
2.201.992.076
3.786.723.730
0,58
2.187.544.987
3.670.612.330
0,60
3.514.503.801
3.581.504.055
0,98
3.628.292.789
3.596.386.437
1,01
7.149.534.203
3.575.761.738
2,00
7.774.194.467
3.768.925.436
2,06
11.918.050.864
3.405.706.681
3,50
12.065.551.761
3.406.649.039
3,54
159
Metode Ekstraksi dan Analisis Irbesartan dalam Plasma Darah
Gambar 2. Kurva Linearitas Irbesartan (10,0-5.000,0 ng/mL) Proses penambahan presipitan bertujuan untuk mengendapkan sejumlah protein, sebelum masuk pada fase ekstraksi. Dalam tahap selanjutnya, ekstraksi cair-cair dalam pelarut chloroform digunakan sebagai pretreatment untuk melepaskan Irbesartan dan Candesartan dari ikatan protein plasma. Hasil dari penelitian ini menunjukkan senyawa analit maupun internal standar
telah terlarut dalam fase chloroform dan terpisah dari protein maupun pengotor lain yang tertahan dalam fase air. Dalam proses ekstraksi ini tidak perlu diakukan penyesuaian pH sehingga tahap pretreatment akan menjadi lebih pendek. Proses ekstraksi hanya dilakukan 1 kali tanpa pengulangan sehingga dapat mengurangi penggunaaan pelarut dan mempersingkat waktu preparasi.
Gambar 3. Kromatogram dari Blanko Plasma Darah
Gambar 4. Kromatogram Hasil Eksatrasi Irbesartan 400,0 ng/mL + 1,0 μg/mL Candesartan dalam Plasma Darah.
160
Jurnal Farmasi Indonesia ■ Vol. 7 No. 3 ■ Januari 2015
Ratih
Gambar 5. Kromatogram Hasil Eksatrasi Irbesartan 5.000,0 ng/mL + 1,0 μg/mL Candesartan dalam Plasma Darah.
Penggunaan detektor luorescence memiliki kelebihan dengan memberikan hasil pembacaan yang lebih bersih, sehingga kromatogram analit dapat teramati dengan mudah tanpa adanya gangguan matriks atau pengotor lain. Tidak adanya gangguan dari pengotor dapat dibuktikan dari kromatogram blanko plasma darah yang terlihat bersih tanpa noise (gambar 3). Peak Irbesartan 5.000 ng/mL + Candesartan cilexetil 1 μg/mL dalam plasma terpisah dengan baik demikian pula pada konsentrasi yang lebih rendah yaitu Irbesartan 400,0 ng/mL + Candesartan cilexetil 1 μg/mL. Kromatogram yang terpisah sempurna dengan resolusi > 2 menunjukkan bahwa metode ekstraksi yang digunakan sebagai pretreatment dan kondisi kromatogra i telah dapat memberikan hasil pemisahan yang optimum. Hasil tersebut membuktikan bahwa metode ekstraksi dan kondisi HPLC yang dikem-
bangkan dalam penelitian ini telah sesuai untuk pemisahan analit di dalam plasma dengan baik, tanpa ada gangguan yang signi ikan dari matriks maupun analit lainnya.
KESIMPULAN Penggabungan antara metode ekstraksi melalui pretreatment ekstraksi cair-cair dalam pelarut chloroform dan metode analisis HPLC luorescence pada λ eksitasi 254 nm/emisi 380 nm, low rate 1 mL/menit, kolom C18, serta fase gerak acetonitrile : 0,5% v/v H3PO4 (77:23) dapat diaplikasikan pada Irbesartan dalam sampel plasma darah dengan Candesartan cilexetil sebagai internal standar, dimana peak pada kromatogram menunjukkan keduanya terpisah sempurna tanpa gangguan dari matrik plasma.
DAFTAR PUSTAKA 1.
2. 3. 4.
Husain, A., Mitra, MSAM., and Bhasin, PS., 2011. A Review of Pharmacological and Pharmaceutical Pro ile of Irbesartan, Pharmacopore, Vol 2 (6): 276-286. United State of Pharmacopoeia, the Of icial Compendia of Standards, 2007, 30th edition, p1062. Anderson, PO., Knoben, JE., and Troutman, WG., 2002, Handbook of Clinical Drug Data, 10th edition, McGraw-Hill, New York, p 348. Davi, H., Tronquet, C., Miscoria, G., Perier, L., Du-
Jurnal Farmasi Indonesia ■ Vol. 7 No. 3 ■ Januari 2015
5.
6.
pont, P., Caix, J., Simiand, J., and Berger, Y. 2000. Disposition of Irbesartan an Agiotensin II AT1Receptor Antagonist in Mice, Rats, Rabbits and Macaques. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics. Vol 28 (1) 79-88. Gupta, VK., Jain, R., Radhapyari, K., Jadon, N., and Agarwal, S., 2011, Voltammetric Techniques for the Assay of Pharmaceutical-A Review., Analytical Biochemistry 408:179-196. Alexandre, V., Ladril, S., Maurs, M., and Azerad, R., 2004. Microbial Models of Animal Drug Metabolism part 5. Microbial Preparation of Human Hy-
161
Metode Ekstraksi dan Analisis Irbesartan dalam Plasma Darah
7.
9.
162
droxylated metabolism of Irbesartan. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 29:173-179. Anupama, B., Kurumaddali A., Bhargav, SN., and Surendra, A., 2012. UV Spectrophotometric Method for Irbesartan. International Journal of Research in Pharmacy and Chemistry 2 (1) 20-21. Caudron, E., Larent, S., Billaud, EM., and Prognon, P., 2004. Simultaneous Determination of the Acid/
Base Antihypertensive Drugs Celiprolol, Bisoprolol and Irbesartan in Human Plasma by Liquid Chromatography. Journal of Chromatography B, 801:339–345. 10. Shakya, AK., Al-Hiari, YM., and Alhamami, OMO., 2007, Liquid Chromatographic Determination of Irbesartan in Human Plasma, Journal of Chromatography B 848:245-250.
Jurnal Farmasi Indonesia ■ Vol. 7 No. 3 ■ Januari 2015
