Suplementasi Bakteri Asam Laktat Sebagai Tindakan Preventif Inflammatory Bowel Disease (IBD) Pada Kolon Tikus (Rattus norvegicus) Hasil Induksi Indometasin Lactic Acid Bacteria Supplementation on Rat (Rattus norvegicus) Inflammatory Bowel Disease Model Induced by Indomethacin Ghariza F. El Gani, Masdiana C. Padaga, Aulanni’am Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
[email protected] ABSTRAK Indometasin merupakan obat anti inflamasi non-steroid yang digunakan dalam pengobatan rheumathoid arthritis. Efek samping penggunaan indometasin yaitu munculnya penyakit inflammatory bowel disease (IBD) pada kolon. IBD menyebabkan kerusakan kolon dan penurunan jumlah mikroflora. Suplementasi bakteri asam laktat (BAL) bisa digunakan sebagai tindakan pencegahan IBD. Tujuan dari penelitian ini yaitu mengetahui aktivitas protease, jumlah mikroflora dan histologi kolon tikus (Rattus norvegicus) yang mengalami inflammatory bowel disease (IBD) hasil induksi indometasin dan mendapat suplementasi BAL. Tikus dibagi menjadi 4 perlakuan, yaitu tikus kontrol, tikus yang diinduksi indometasin, tikus yang diberi suplementasi sebagai preventif, dan tikus yang hanya diberi suplementasi BAL. Dosis indometasin 15mg/kg BB. Hasil dari penelitian yaitu aktivitas protease kolon tikus yang diberi suplementasi BAL mengalami penurunan menjadi 9,62±2,94 nmol/ml.menit dibandingkan dengan yang diinduksi indometasin 25,57±2,00 nmol/ml.menit. Jumlah mikroflora pada tikus yang diberi suplementasi BAL meningkat menjadi 3,6x106 CFU/ml (enterobacter) dan 3,6x106 CFU/ml (BAL) dibandingkan yang diinduksi indometasin 1,9x104 CFU/ml (enterobacter) dan 2,0x103 CFU/ml (BAL). Pengamatan histologi kolon tikus yang diberi suplementasi BAL tidak tampak kerusakan lapisan mukosa, meliputi tidak ada infiltrasi sel radang dan ulcer. Kata kunci : Kolon, BAL, IBD, Indometasin, Protease, Mikroflora, Histologi. ABSTRACT Indomethacin is Non-Steroidal Anti Inflammatory Drug (NSAID) for rheumathoid arthritis treatment. Indomethacin stimulate colonic inflammatory bowel disease (IBD). Colonic IBD can damage colon environment and decrease colonic microflora. Lactic acid bacteria (LAB) suplementation is solution to prevent colonic IBD. The reasearch aim is to study protease activity, total microflora and histology of rat (Rattus norvegicus) inflammatory bowel disease (IBD) model induced by indomethacin and LAB supplementation. The experiment used male rats (Rattus norvegicus) aged 8-12 weeks, weigh 150-200 grams. Rats were divided into 4 groups that were control, indomethacin induction, LAB supplementation as preventif treatment, and LAB suplementation only. Dosage of indomethacin was 15mg/kg weight. The experiment result concluded than the protease activity was decrease 9.62±2.94 nmol/ml.minute as a result of LAB suplementation, while in indomethacin group incrase up to 25.57±2.00 nmol/ml.minute. Total colonic microflora was incrase 3,6x106 CFU/ml (Enterobacter) and 3,6x106 CFU/ml (LAB) as a result of LAB suplementation, while in indomethacin group decrease to 1,9x104 CFU/ml (Enterobacter) and 2,0x103 CFU/ml (LAB). Result of colonic histologi observation is LAB suplementation can inhibit mucosal damage, such as prevent infiltration of inflammation cells and ulcers. Keywords: Colon, LAB, IBD, Indomethacin, Protease, Microflora, Histology.
1
terganggu (Strus et al., 2009). Jumlah mikroflora kolon yang tidak seimbang dapat memudahkan bakteri patogen menempel pada mukosa kolon sehingga dapat memperparah kondisi inflamasi (O’Hara & Shanahan, 2007). Oleh sebab itu perlu dilakukan tindakan untuk menjaga keseimbangan mikroflora kolon dan mencegah penyakit IBD pada kolon. Sampai saat ini penggunaan BAL sebagai tindakan preventif untuk menjaga keseimbangan mikroflora dan mencegah IBD pada kolon belum banyak diteliti, padahal jika dilihat salah satu fungsi BAL sebagai probiotik yaitu menjaga keseimbangan mikroflora dan mencegah IBD pada kolon (Peran et al., 2005). Oleh karena itu pada penelitian ini akan dilakukan pengujian untuk membuktikan bahwa suplementasi BAL dapat digunakan sebagai tindakan preventif pada kasus IBD kolon hasil induksi indometasin ditinjau dari aktivitas protease, jumlah mikroflora dan histologi kolon.
PENDAHULUAN Probiotik pertama kali dikenalkan oleh Lilly dan Stillwell pada tahun 1963 (FAO, 2001). Probiotik yang dipakai dalam industri pangan berasal dari bakteri asam laktat (BAL). BAL yang sering dipakai yaitu yang berasal dari saluran cerna normal yaitu dari golongan Lactobacillus dan Bifidobacteriae (Sujaya dkk, 2008). Diyakini dengan mengkonsumsi BAL dengan jumlah yang tepat dapat menjaga kesehatan saluran pencernaan (O’Hara & Shanahan, 2007). Selain suplementasi BAL dipercaya dapat mencegah kerusakan lingkungan kolon yang disebabkan oleh penyakit inflammatory bowel disease (IBD) (Dotan & Rachmilewitz, 2005; Bures et al., 2011). Inflammatory bowel disease (IBD) merupakan salah satu jenis penyakit saluran pencernaan. IBD lebih sering menyerang kolon dari pada organ saluran pencernaan lainnya. Sejauh ini IBD pada kolon dikaitkan pada dua penyakit yaitu colitis ulcerative dan Crohn’s disease (Peran et al., 2005). Penyakit ini akan menimbulkan kerusakan pada mukosa kolon sehingga akan mengganggu keseimbangan mikroflora kolon. Secara umum penyebab dari IBD yaitu virus dan bakteri patogen yang menginfeksi kolon, akan tetapi beberapa penelitian menyebutkan bahwa IBD bisa disebabkan karena efek samping penggunaan obat anti inflamasi non-steroid yaitu indometasin (Podolsky, 2002). Indometasin merupakan obat anti inflamasi non-steroid yang dipakai dalam terapi rheumatoid arthritis. Penggunaan indometasin memiliki efek samping yaitu menurunkan sintesa prostaglandin sehingga akan mengurangi jumlah produksi mukus di kolon yang berfungsi sebagai proteksi terhadap virus dan bakteri patogen (Takeuchi et al., 2003). Indometasin menyebabkan produksi ROS (Reactive Oxygen Species) meningkat sehingga menyebabkan kerusakan kolon. Rusaknya kolon akan mengakibatkan keseimbangan mikroflora kolon akan
MATERI DAN METODE Perlakuan Hewan Coba Hewan coba yang dipakai yaitu tikus (Rattus norvegicus) jantan, strain Wistar berumur 8-12 minggu. Berat badan tikus antara 150-200 gram, yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta dan telah mendapatkan sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No. 99-KEP-UB. Tatalaksana Pemberian Bakteri Asam Laktat Isolat bakteri asam laktat (BAL) yang dipakai merupakan hasil dari penelitian Prasthani (2012). BAL ditumbuhkan pada media MRSB (de Man Rogosa Sharp broth) (Merck) pada suhu 37o C selama 15 jam. Jumlah bakteri yang dipanen 109 CFU/ml. Kemudian disentrifugasi untuk mendapat pellet. Pellet dicampur NaCl fisiologis sampai 1ml dan diberikan pada hewan coba. Suplementasi BAL diberikan pada hari 1
2
sampai 9. Pembarian pada hewan coba dilakukan dengan cara disonde.
tumbuh BAL dan media VRB-G sebagai media tumbuh Enterobactericeae dengan metode double layer, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48-72 jam. Setelah diinkubasi dilakukan penghitungan koloni bakteri dengan metode Total Plate Count (TPC) (Nair & Surendran, 2005).
Tatalaksana Pemberian Indometasin Indometasin diberikan sekali pada hari ke 10 dengan dosis 15mg/kg BB untuk mendapatkan kolon yang mengalami inflammatory bowel disease (IBD) akut (Bures et al., 2011).
Pengamatan Histologi Kolon tikus dibuat preparat dengan metode parafin dan pewarnaan hematoksilin eosin (HE). Gambaran kolon diamati secara kualitatif menggunakan mikroskop Olympus BX51 dengan perbesaran 100x dan 400x.
Pengukuran Aktivitas Protease Langkah awal yaitu larutan kasein 500 ppm sebanyak 200 µL, 300 µL larutan bufer fosfat pH 7 dan 100 µL enzim protease dicampurkan lalu didiamkan selama 60 menit pada suhu 37˚C di atas penangas air. Kemudian ditambahkan dengan 400 µL larutan TCA 4% dan didiamkan selama 30 menit pada suhu 27˚C (suhu kamar). Selanjutnya disentrifugasi pada 4000 rpm selama 10 menit dan supernatan yang dihasilkan diambil 100 µL dan diencerkan sebanyak 5 kali volume sampel dengan buffer fosfat kemudian diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang 275nm. Selanjutnya dihitung secara kuantitatif dengan metode Bergmeyer (Bergmeyer et al., 1983).
Dimana : v q fp p
Analisis Statistika Analisis data aktivitas protease dan jumlah mikroflora kolon menggunakan ANOVA (Analysis Of Variance) dan uji Turkey menggunakan software SPSS for Windows version 16.0. HASIL DAN PEMBAHASAN Adanya inflamasi pada kolon dapat ditandai dengan meningkatnya aktivitas protease, turunnya jumlah mikroflora dan adanya infiltrasi sel radang. Hasil penelitian pada Tabel 1, menunjukan terjadi peningkatan yang nyata aktivitas protease pada kolon tikus yang diinduksi indometasin menjadi 25,57±2,00 nmol/ml.menit jika dibandingkan tikus yang tidak diberi perlakuan (kontrol) 3,21±1,90 nmol/ml.menit. Selain itu juga terjadi penurunan jumlah mikroflora yaitu 1,9x104 CFU/ml untuk jumlah enterobacter dan 2,0 x 103 CFU/ml untuk jumlah BAL sedangkan pada kondisi normal jumlah enterobacter kolon 3,7 x 106 CFU/ml dan BAL 1,5 x 106 CFU/ml (Tabel 2). Jika dilakukan pengamatan histologi dengan perbesaran 100x akan tampak adanya ulcer (Gambar 1) dan jika diperbesar menjadi 400x tampak adanya infiltrasi sel radang (Gambar 2) pada kolon yang diinduksi indometasin. Dari data ini mengindikasikan induksi
= volume total sampel (ml) = waktu inkubasi (menit) = faktor pengenceran = jumlah enzim (ml)
Penghitungan Jumlah Mikroflora Organ kolon dipotong kecil (lebih kurang 1cm), dimasukkan ke dalam larutan (Buffer Pepton Water) BPW 1 % (Oxoid) kemudian dilakukan pengenceran sampai dengan 10-5. Selanjutnya dilakukan penanaman menggunakan teknik pour plate ke dalam media selektif MRSA (de Mann, Rogosa, Sharpe Agar) (Merck) sebagai media 3
indometasin dengan dosis 15 mg/kg BB menyebabkan inflamasi akut pada kolon tikus. Induksi indometasin akan meningkatkan aktivitas dan produksi ROS (Reactive Oxygen Species) di dalam sel. ROS yang berlebih akan mengaktivasi NF-κB (Nuclear Factor κB) dan fosforilasi IκB (Inhibitor NF-κB). NF-κB menginisiasi munculnya sitokin pro inflamasi dan kemokin (TNFα). Produksi TNFα berlebih pada sel akan menyebabkan agregasi dan aktivasi neutrofil (Gambar 2b) serta pelepasan enzim protease (Sharony et al., 2010). Sitokin pro inflamasi yang dikeluarkan oleh NF-κB menyebabkan terjadinya inflamasi. Adanya inflamasi menyebabkan kerusakan pada kolon, ditandai dengan adanya ulcer pada lapisan mukosa kolon (Gambar 1b). Kerusakan mukosa kolon menyebabkan penurunan jumlah mukus. Kondisi ini diperparah dengan penurunan jumlah mukus
yang disebabkan induksi indometasin (Aulanni’am, 2012). Kondisi ini mengakibatkan mikroflora kolon tidak dapat menempel sehingga dapat mengganggu jumlah mikroflora. Jumlah mikroflora yang berkurang akan memperparah kondisi inflamasi (O’Hara & Shanahan, 2007). Respon inflamasi yang terjadi di kolon melibatkan faktor vaskuler dan seluler. Inflamasi pada kolon akan merusak lapisan mukosa kolon menyebabkan ulcer pada sebagian mukosa kolon. Selain itu adanya inflamasi akan direspon oleh tubuh dengan mengeluarkan sel-sel radang yaitu neutrofil, basofil, eosinofil dan limosit (Robbins & Kumar, 1995). Sel radang yang lebih dahulu muncul yaitu neutrofil, oleh sebab itu pada kasus inflamasi akut, banyak ditemukan infiltrasi neutrofil (Butterfield et al, 2006).
Tabel 1. Taraf perbedaan rataan aktivitas protease kolon tikus (p<0,05) Rataan aktivitas Protease Kelompok (nmol/ml.menit) Kontrol 3,21 ±1,90a Induksi indometasin 25,57 ±2,00c Preventif (BAL+indometasin) 9,62 ±2,94b Suplementasi BAL 8,06 ±3,25b Tabel 2. Jumlah enterobacter dan bakteri asam laktat (BAL) pada lumen kolon (p<0,05) Enterobacter Bakteri Asam Laktat Kelompok (CFU/ml) (CFU/ml) Kontrol 3,7 x 106 b 1,5 x 106 b Induksi indometasin 1,9 x 104 a 2,0 x 103 a Preventif (BAL+indometasin) 3,6 x 106 b 3,6 x 106 c Suplementasi BAL 4,0 x 106 b 3,1 x 106 c Pada penelitian ini pemberian suplementasi bakteri asam laktat (BAL) diharapkan dapat mengurangi tingkat keparahan inflamasi ditinjau dari aktivitas protease, jumlah mikroflora dan histologi. Data pada tabel 1 menunjukan bahwa telah terjadi penurunan yang nyata pada aktivitas protease kolon tikus yang diberi suplementasi BAL sebagai tindakan preventif menjadi
9,62±2,94 nmol/ml.menit jika dibandingkan dengan tikus yang diinduksi indometasin. Penurunan aktivitas protease mengindikasikan bahwa tidak terjadi inflamasi pada kolon yang telah diberi suplementasi BAL selama 9 hari sebagai tindakan preventif. Mekanisme BAL dalam menurunkan aktivitas protease pada kolon tikus yaitu dengan cara mengaktivasi IκB (Inhibitor NF4
enterobacter dan 3,6 x 106 CFU/ml untuk jumlah BAL. Analisis statistika dengan p<0,05 menunjukan bahwa jumlah mikroflora pada perlakuan ini sama dengan jumlah mikroflora pada tikus kontrol (normal). Dari hasil ini dapat memperkuat data aktivitas protease (Tabel 1) bahwa suplementasi BAL mampu mencegah terjadinya inflamasi pada kolon. Suplementasi BAL akan mencegah terjadinya kerusakan mukosa kolon dan sel goblet akibat inflamasi. Dengan kondisi lingkungan yang normal, mikroflora mampu menempel dan tumbuh sehingga keseimbangan mikroflora kolon tetap terjaga (Van Tassel & Miller, 2011). Keseimbangan mikroflora merupakan barier mukosa kolon terhadap bakteri patogen atau agen lain yang dapat menyebabkan inflamasi (Fukushima, 1999). Pengamatan histologi dengan perbesaran 100x menunjukan kondisi kolon yang normal, tidak terdapat ulcer pada kolon tikus yang diberi suplementasi BAL (Gambar 1c), selain itu dengan perbesaran 400x juga tidak ditemukan adanya infiltrasi sel radang. Dari hasil ini membuktikan bahwa suplementasi BAL mampu menjaga kondisi kolon dari inflamasi hasil induksi indometasin.
κB) sehingga akan menghambat aktivasi NF-κB. Karena tidak ada aktivitas NF-κB secara otomatis akan mencegah poduksi TNFα berlebih sehingga aktivitas protease akan turun (O’Hara & Shanahan, 2007). Untuk memperkuat hasil ini maka dapat dilihat jumlah mikroflora (Tabel 2). Data pada Tabel 1 menunjukan nilai aktivitas protease pada tikus yang diberi suplementasi BAL masih cukup tinggi jika dibandingkan dengan tikus kontrol. Tingginya aktivitas protease pada kedua perlakuan disebabkan karena pemberian suplementasi BAL. Beberapa isolat BAL diketahui menghasikan protease sebagai hasil metabolisme misalnya Lactobacillus lactis (Bettache et al., 2012), jadi sangat dimungkinkan tingginya aktivitas protease disebabkan karena protease hasil metabolisme BAL juga ikut terhitung. Hasil penghitungan jumlah mikroflora pada kolon tikus yang diberi suplementasi BAL sebagai tindakan preventif menunjukan terdapat perbedaan yang nyata jika dibandingkan dengan tikus yang diinduksi indometasin. Data pada Tabel 1 menunjukan terjadi peningkatan jumlah mikroflora pada kolon tikus yang diberi suplementasi BAL menjadi 3,6 x 106 CFU/ml untuk jumlah
5
a
b
c
d
Gambar 1. Penampang histologi kolon tikus (HE, 100x) a. Kontrol b. Induksi indometasin, terjadi kerusakan lapisan mukosa dan adanya ulcer (panah merah), c. Preventif, kondisi lapisan mukosa mendekati normal. d. Suplementasi BAL
a
b
d
c
Gambar 2.
Histologi kolon tikus (HE, 400x): a. Kontrol b. Indometasin, tanda panah merah menunjukan infliltrasi sel radang (neutrofil). c. Preventif, tidak ditemukan sel radang. (d) Suplementasi BAL.
6
Nissle 1917. J. Human and Experimental Toxicology 30(12): 1955-1962. Butterfield, TA.; TM. Best and MA. Merrick. 2006. The Dual Roles of Neutrophils and Macrophages in Inflammation: A Critical Balance Between Tissue Damage and Repair. Journal of Athletic Training 41(4): 457–465. Dotan, I and D. Rachmilewitz. 2005. Probiotics in Inflammatory Bowel Disease: Possible Mechanisms of Action. Curr. Opin. Gastroenterol 2005(21): 426-430. Food and Agriculture Organization (FAO). 2001. Health and Nutritional Properties Of Probiotic In Food Including Powder Milk With Live Lactic Bacteria. Nair, PS. and PK. Surendran. (2005). Biochemical Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated From Fish and Prawn. J. of Culture Collections, 4(02): 48-52. O’Hara, AM. and F. Shanahan. 2007. Mechanisms of Action of Probiotics in Intestinal Diseases. TheScientificWorld Journal 7(7): 31-46. Peran, L.; D. Camuesco; M. Comalada; A. Nieto; A. Concha; M. Paz Diaz-Ropero; M. Olivares; J. Xaus; A. Zarzuelo and J. Galvez. 2005. Preventative Effects of a Probiotic, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, in the TNBS Model of Rat Colitis. World J Gastroenterol 11(33): 5185-5192. Podolsky, DK. 2002. Inflammatory Bowel Disease. N. Engl. J. Med. 347 (6): 417429. Prasthani, IHP. 2012. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat Asal Feses Orangutan (Pongo pygmaeus) Sebagai Kandidat Probiotik. [Skripsi]. Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya. Malang. Robbins, SL. and V. Kumar. 1995. Buku Ajar Patologi I. 4th ed. Staf pengajar
KESIMPULAN Suplementasi bakteri asam laktat (BAL) dapat mencegah terjadinya inflammatory bowel disease (IBD) pada kolon tikus (Rattus norvegicus) hasil induksi indometasin, dibuktikan dengan penurunan aktivitas protease, keseimbangan jumlah mikroflora dan tidak adanya kerusakan struktur lapisan mukosa yang meliputi tidak ada ulcer dan infiltrasi sel radang. UCAPAN TERIMAKASIH Peneliti mengucapkan terimakasih kepada drh. Masdiana C, Padaga, M. App. Sc. Sebagai ketua dalam payung penelitian dan Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES. atas bimbingan dan fasilitas Laboratorium Biokimia FMIPA dan Laboratorium Sentral Ilmu Hayati (LSIH) Universitas Brawijaya, serta staf laboratorium yang membantu dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Aulanni’am; A. Roosdiana and NL. Rahmah. 2012. The Potency of Sargassum duplicatum Bory Extract on Inflammatory Bowel Disease Therapy in Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6 : 144-154. Bergmeyer, HU. and M. Grassl. 1983. Methode of Enzymatic Analysis. Vol II. Verlag Chemie. Wenhein. Bettache, G.; A. Fatma; H. Miloud and K. Mebrouk. 2012. Isolation and Identification of Lactic Acid Bacteria from Dhan, a Traditional Butter and Their Major Technological Traits. World Applied Sciences Journal 17 (4): 480-488. Bures, J.; J. Pejchal; J. Kvetina; A. Tichy; S. Rejchrt; M. Kunes and M. Kopacova. 2011. Morphometric Analysis of The Porcine Gastrointestinal Tract in a 10Day High-dose Indomethacin Administration with or Without Probiotic Bacteria Escherichia coli 7
laboratorium patologi anatomik FK UI. EGC, 1995 : 35-83 . Sharony, R.; PJ. Yu; J. Park; AC. Galloway; P. Mignatti and G. Pintucci. 2010. Protein Targets of Inflammatory Serine Proteases and Cardiovascular Disease. Journal of Inflammation 7: 45. Strus, M.; T. Gosiewski; K. Fyderek; A. Wedrychowicz; K. Kowalska-duplaga; P. Kochan; P. Adamski and PB. Heczko. 2009. a Role of Hydrogen Peroxide Producing Commensal Bacteria Present in Colon of Adolescents with Inflammatory Bowel Disease in Perpetuation of The Inflammatory Process. Journal Of Physiology and Pharmacology 60 (6): 49-54. Sujaya, IN.; Y. Ramona; NP. Widarini; NP. Suariani; NM. Dwipayanti; KA. Nocianitri dan NW. Nursini. 2008. Isolasi dan Karakteristik Bakteri Asam Laktat dari Susu Kuda Sumbawa. J. Vet. 9 (2) : 52-59. Takeuchi, K.; A. Tanaka; R. Ohno and A. Yokota. 2003. Role of COX Inhibition in Pathogenesis of NSAID-Induced Small Intestinal Damage, Kyoto Pharmaceutical University, Kyoto. Van Tassel, M. and MJ. Miller. 2011. Lactobacillus Adhesion to Mucus. J. Nutrients 2011 3: 613-636.
8
