GAMBARAN HISTOPATOLOGI DAN JUMLAH MIKROFLORA JEJUNUM TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus) YANG TERPAPAR INDOMETASIN DAN MENDAPAT SUPLEMENTASI BAKTERI ASAM LAKTAT (BAL) HISTOPATHOLOGY AND THE AMOUNT OF MICROFLORA IN WHITE RAT JEJUNUM (Rattus norvegicus) EXPOSED TO INDOMETHACIN AND LACTID ACID BACTERIA (LAB) Awang Yoga Pratama, Aulanni’am, Masdiana C. Padaga, Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya Email :
[email protected] ABSTRAK Inflamasi pada saluran pencernaan atau khususnya organ jejunum dapat disebabkan oleh bakteri patogen dan efek penggunaan obat-obatan khususnya golongan Non Steroidal Anti Inflamatory Drugs (NSAIDs) seperti indometasin. Suplementasi BAL menjadi pengobatan alternatif untuk mengobati inflamasi pada saluran pencernaan. Tujuan penelitian ini yaitu untuk melihat gambaran histopatologi dan jumlah mikroflora pada jejenum tikus (Rattus norvegicus). Tikus dibagi menjadi 5 perlakuan, yaitu tikus kontrol, tikus yang di induksi indometasin, tikus yang hanya diberi suplementasi BAL, tikus yang diberi suplementasi BAL sebagai preventif, dan tikus indometasin + BAL sebagai kuratif. Hasil pengamatan histopatologi pada organ jejunum menunjukkan tikus yang mendapat perlakuan suplementasi BAL dan preventif tidak mengalami kerusakan vili dan tidak terjadi deskuamasi epitel. Pada kelompok yang mendapat perlakuan induksi indometasin dan kuratif, dimana pada kelompok tersebut terjadi kerusakan epitel pada vili dan deskuamasi epitel. Hasil perhitungan jumlah mikroflora pada organ jejunum menunjukkan peningkatan jumlah pada kelompok yang mendapat suplementasi BAL menjadi 2,03x106 CFU/ml (BAL) dan 3,65x106 CFU/ml (enterobacter) dibandingkan yang diinduksi indometasin 1,63x106 CFU/ml (BAL) dan 1,95x106 CFU/ml. Suplementasi BAL yang diberikan dapat memperbaiki struktur vili jejunum tikus dan meningkatkan jumlah mikroflora pada jejunum tikus yang mendapat induksi indometasin. Kata kunci : Jejunum, Indometasin, BAL, Histologi, Mikroflora. ABSTRACT Inflammation in gastrointestinal tract (GIT) especially jejunum is caused by bacterial pathogens and the use of drugs NSAID such as indomethacin. This study aims to observe the histopathology and total count of microflora in rat jejunum. Rats were divided into 5 grups, i.e. control, indomethacin, LAB supplementation, preventive, and curative. Histophatological observation of jejunum showed that there were a damage of epithelial villi and epithelial desquamation. It showed that there were differences with the indomethacin and curative group which showed the epithelial damaging and desquamation. The LAB supplementation yielded the rat jejunum microflora to be 2.03 x106 CFU / ml of LAB and 3.65 x106 CFU / ml of enterobacter higher than indomethacin group were 1.63 x106 CFU / ml of LAB and 1, 95x10 CFU / ml of enterobacter. LAB supplementation could fix the structure of villi in the rat jejunum and increase total count microflora in rat jejunum that had inductions indomethacin. Keywords: Jejunum, Indomethacin, LAB, Histolopatology, Microflora.
PENDAHULUAN Inflamasi pada saluran pencernaan atau gastrointestinal tract (GIT) khususnya organ jejunum sering terjadi karena bakteri patogen dan efek penggunaan obat-obatan khususnya golongan Non Steroidal Anti Inflamatory Drugs (NSAIDs) seperti indometasin (Surono, 2004). Penggunaan indometasin memiliki efek samping yaitu menurunkan sintesa prostaglandin sehingga akan mengurangi jumlah produksi mucus yang berfungsi sebagai proteksi terhadap bakteri patogen (Takeuchi, 2003). Penggunaan probiotik seperti kelompok bakteri asam laktat (BAL) dapat meningkatkan kesehatan dengan cara mendukung perkembangan mikroba yang menguntungkan dan menekan pertumbuhan bakteri patogen dalam saluran pencernaan. Hal ini diantaranya adalah organ jejunum (Tamime, 2000). Salminen (2001) menambahkan, bahwa peningkatan jumlah dan aktivitas bakteri asam laktat dalam jejunum juga berhubungan erat dengan peningkatan kondisi kesehatan karena bakteri asam laktat yang bertindak sebagai probiotik mampu melakukan kolonisasi, multiplikasi, dan membangun sistem imun. Penelitian ini dilakukan untuk menguji apakah pemberian suplementasi BAL dapat mencegah terjadinya inflamasi ditinjau dari gambaran histopatologi dan jumlah mikroflora pada jejunum pada tikus yang mengalami inflammatory bowel disease (IBW). MATERI DAN METODE Perlakuan Hewan Coba Hewan coba yang dipakai yaitu tikus (Rattus norvegicus) jantan, strain Wistar berumur 8-12 minggu. Berat badan tikus antara 150-200 gram, yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta dan telah mendapatkan sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No. 99-KEP-UB. Tikus dibagi dalam 5 kelompok perlakuan yaitu kontrol, indometasin, suplementasi BAL, preventif, dan kuratif. Sebelum mendapatkan perlakuan, semua tikus diadaptasikan dengan kondisi kandang dan pakan selama tiga hari. Pemberian pakan yang sama dilanjutkan hingga hari ke-10. Sebelum percobaan, semua kelompok tikus diberi ransum standar ad
libitum. Komposisi ransum pakan disusun berdasarkan standar AOAC (2005) yaitu mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral, vitamin, dan air. Tikus dikandangkan dalam kandang yang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm, dengan jumlah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan. Kandang terbuat dari stainless steel. Kandang tikus berlokasi pada tempat yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari asap industri serta polutan lainnya. Lantai kandang mudah dibersihkan dan disanitasi. Suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24 oC dan kelembaban udara 50-60% dengan ventilasi yang cukup (namun tidak ada jendela terbuka). Persiapan Isolat Bakteri Asam Laktat Isolat bakteri asam laktat (BAL) didapatkan dari feses orangutan (Pongo pygmeus). Dilakukan uji karakterisasi pada BAL yang diisolasi dari feses orangutan, kemudian dilakukan uji potensi BAL untuk menentukan isolat yang akan dipakai dalam penelitian ini. Dugaan isolat BAL yang digunakan adalah genus Enterococcus dan Lactobacillus (Prasthani, 2012). Persiapan Indometasin Untuk membuat tikus menderita enteritis, dosis indometasin yang digunakan adalah 15mg/kgBB tikus. Pemberian BAL dan Indometasin Pemberian BAL dan indometasin diberikan peroral. Pada kelompok perlakuan C dan E, Indometasin diberikan dengan dosis 15 mg/kg BB pada hari ke-1. Sedangkan kelompok B BAL diberikan selama 10 hari sejak hari ke-1. Pada kelompok D, BAL diberikan sejak hari ke1 sampai dengan hari ke-7 sedangkan pada kelompok E, BAL yang diberikan sejak hari ke2 sampai dengan hari ke 10. Volume BAL yang diberikan pada tikus sebanyak 2ml. Pembuatan Preparat Jejunum Evaluasi histopatologi dilakukan dengan pembuatan preparat histologi organ jejunum dengan pewarnaan Hematoxylin Eosin (HE) pada semua perlakuan.
Pengamatan Histologi Pengamatan histopatologi jaringan jejunum dilakukan menggunakan mikroskop cahaya (Olympus BX-51). Pengamatan meliputi perubahan pada lapisan mukosa, vili, dan deskumasi epitel dengan pembesaran 100x dan 400x. Analisis Mikrobiologi Organ jejunum dipotong kecil (lebih kurang 1cm3), dimasukkan ke dalam larutan Buffer Pepton Water (BPW) 1 % kemudian dilakukan pengenceran sampai dengan 10-5. Selanjutnya dilakukan penanaman menggunakan teknik pour plate ke dalam media selektif de Mann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) sebagai media tumbuh BAL dan media VRB-G sebagai media tumbuh Enterobacter, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48-72 jam (Nair & Surendran, 2005). Analisis Data Pada percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang mana tikus diberi 4 perlakuan dengan 5 kali pengulangan. Analisa data aktivitas mikroflora jejunum menggunakan Analysis Of Variance (ANOVA). Jika ada perbedaan maka akan diuji menggunakan uji Turkey menggunakan software SPSS for windows version 16.0.
mengurangi produksi sitokin proinflamasi sehingga memperkuat barier mukosa jejenum (Markwick, 2004).
A
B
C
D
E
HASIL DAN PEMBAHASAN Efek Suplementasi BAL Terhadap Gambaran Histopatologi Jejunum Tikus (Rattus norvegicus) Hasil Induksi Indometasin. Pengaruh induksi indometasin dan terapi BAL terhadap histopatologi jejunum (Gambar 1) menunjukkan bahwa pemberian BAL sebagai terapi pada tikus yang terpapar indometasin dapat memperbaiki struktur vili. Perbaikan struktur vili pada kelompok suplementasi BAL (Gambar 1C) terjadi karena bakteri asam laktat mampu menstimulasi sistem imunitas melalui ikatan terhadap sel intestinal dan interaksi dengan GALT (Gut associated-lymphoid tissue) yang merupakan organ limfoid yang terdapat dalam saluran pencernaan. Probiotik ini akan memicu produksi sitokin anti inflamasi dan
Gambar 1 Perbandingan bentuk vili pada gambaran histopatologi jejunum tikus (Rattus norvegicus) (HE, 100x). Keterangan : a. Kontrol b. Induksi indometasin, terjadi kerusakan bentuk vili (panah merah), c. Suplementasi BAL d. Preventif e. Kuratif
Gambar histopatologi yang diinduksi indometasin (1.B) mengalami kerusakan pada vili dan lapisan mukosa. Hal ini disebabkan pemberian obat-obatan NSAIDs seperti indometasin dapat menyebakan kerusakan vili dan mukosa di usus (Lanas & Scarpignato, 2006). Pemberian suplementasi BAL pada tikus yang terpapar indometasin (Gambar 1D)
mampu mengurangi terjadinya inflamasi, ditandai dengan tidak ditemukannya kerusakan vili, infiltrasi sel inflamasi dan edema. Hal itu dikarenakan BAL sebagai probiotik membantu proses pencernaan pada usus dengan cara memecah protein menjadi asam amino, dimana asam amino yang diserap oleh usus akan membantu mmemperbaiki lapisan mukosa yang rusak (Muchtadi, 1997; Siregar, 2004). Perbaikan pada kelompok tikus yang diberi terapi BAL (Gambar 1 E) ini terjadi karena terapi dilakukan setelah pemberian indometasin dan dilakukan secara berulang. Sehingga bentuk vili terlihat rapi kembali, dan terlihat berbeda jika dibandingkan dengan kelompok tikus yang diinduksi indometasin (Gambar 5.1 B). Pada kelompok tikus yang terpapar indometasin ( Gambar 2B) yang memperlihatkan adanya deskuamasi epitel. Deskuamasi epitel ditandai dengan susunan epitel yang berantakan akibat meningkatnya permeabilitas. Akibat paparan indometasin pada tikus menyebabkan terjadinya kerusakan epitel yang ditunjukkan dengan adanya deskuamasi epitel. Degenerasi hidrofilik juga dapat ditemukan pada kelompok indometasin (Gambar 2B). Degenerasi hidrofilik tersebut ditandai dengan terjadinya pembengkakan/ edematosa pada vili jejunum. Paparan indometasin dapat menyebabkan inflamasi, Inflamasi tersebut menyebabkan meningkatnya permeabilitas pembuluh darah sehingga protein mudah lolos masuk ke jaringan melalui celah-celah yang muncul diantara sel-sel endotel (Takeuchi, 2007). Pada kelompok suplementasi BAL (Gambar 2C) terlihar bentukan vili terlihat seperti kelompok kontrol (Gambar 2A). Yoon (2011) dan Ohland (2009) mengatakan bahwa pemberian probiotik pada kondisi tersebut dapat membantu kestabilan tight junctions (TJs) dan meningkatkan fungsi barier dari sel epitel usus dengan menurunkan permeabilitas epitel sehingga deskuamasi epitel tidak terjadi. Perbaikan vili pada kelompok tikus kuratif (Gambar 2E) ini terjadi karena terapi dilakukan
setelah pemberian indometasin dan dilakukan secara berulang.
A
B
C
D
E
Gambar 2 Gambaran jejunum berupa deskuamasi epitel (tanda hitam) dan degenerasi hidrofilik (tanda merah) (Rattus norvegicus) (HE, 400x). Keterangan : (A) kontrol, (B)Indometasin, (C)suplementasi BAL, (D) Preventif, (E)Kuratif.
Efek Pemberian Indometasin dan Suplementasi Bakteri Asam Laktat (BAL) Terhadap Jumlah Mikroflora Jejunum Tikus (Rattus norvegicus) Nilai rata-rata populasi BAL dan enterobacter pada jejunum tikus menunjukkan adanya variasi pada jumlah bakteri antar kelompok tikus. Pengamatan parameter keberhasilan BAL dalam melakukan penempelan terhadap jejunum dapat dilihat dari rata-rata populasi BAL dan enterobacter yang disajikan pada dalam Tabel 1. Tabel 1 Rata – rata jumlah BAL dan Enterobacter jejunum tikus putih (Rattus norvegicus). Kelompok Kontrol (A) Indometasin (B) BAL (C) Preventif (D) Kuratif (E)
Enterobacter (CFU/ml) 1,98 x 106 b 1,95 x 104 a 2,93 x 106 c 3,65 x 106 c 3,43 x 106 c
Pada penelitian ini pemberian suplementasi bakteri asam laktat (BAL) diharapkan dapat mengurangi tingkat keparahan inflamasi ditinjau dari jumlah mikroflora. Hasil penghitungan jumlah mikroflora pada jejunum dengan perlakuan BAL, preventif, dan kuratif menunjukan terdapat perbedaan yang nyata jika dibandingkan dengan tikus yang diinduksi indometasin. Analisis statistika dengan p<0,05 menunjukkan bahwa jumlah mikroflora BAL pada perlakuan C, D, dan E menunjukkan hasil tertingginya berbeda nyata dengan jumlah mikroflora BAL pada tikus kontrol (A) dan berbeda nyata dengan tikus yang diberi perlakuan indometasin (B). Sedangkan pada jumlah mikroflora enterobacter pada perlakuan BAL (C), preventif(D), dan kuratif (E) memberikan hasil tertinggi yang berbeda nyata dengan perlakuan indometasin (B) dan control (A). Hal ini dilihat dari notasi beda nyata pada masing-masing perlakuan (Mattjik, 2000). Jumlah Enterobacter pada jejunum tikus putih yang diberi perlakuan induksi indometasin menjadi 1,95 x 104 CFU/ml jika dibandingkan dengan tikus kontrol sejumlah 1,98 x 106 CFU/ml. Sedangkan pada tikus yang diberi suplementasi BAL mengalami peningkatan jika dibandingkan dengan tikus kontrol dan tikus yang diberi indometasin. Pada tindakan terapi preventif mengalami peningkatan jumlah
BAL (CFU/ml) 1,55 x 106 b 1,63 x 104 a 2,18 x 106 b 2,03 x 106 b 2,00 x 106 b
enterobacter menjadi 3,65 x 106 CFU/ml dan tindakan kuratif juga mengalami peningkatan menjadi 3,43 x 106 CFU/ml. Sedangkan pada tikus yang hanya diberikan suplementasi BAL jumlah enterobacter sejumlah 2,93 x 106 CFU/ml. Ketidakseimbangan mikroflora ini terjadi karena menurunnya prostaglandin dan cairan mukus yang diikuti dengan terjadinya inflamasi dan kerusakan mukosa. Cairan mukus yang menurun menyebabkan menurunnya kemampuan mikroflora untuk menempel dan bertahan hidup. O’Hara (2004) mengatakan bahwa pada kondisi usus yang mengalami inflamasi akan menyebabkan terjadinya penurunan jumlah mikroflora. Hasil uji lanjutan Tukey test menunjukkan adanya perbedaan antara kelompok kontrol, kelompok BAL dan kelompok treatmen terhadap kelompok indometasin. Jumlah BAL pada jejunum tikus putih pada Tabel 1 menunjukkan terjadinya penurunan pada perlakuan induksi indometasin menjadi 1,63 x 104 CFU/ml jika dibandingkan dengan tikus kontrol sejumlah 1,55 x 106 CFU/ml. Sedangkan pada tindakan preventif mengalami peningkatan sejumlah 2,03 x 106 CFU/ml dan tindakan kuratif 2,00 x 106 CFU/ml jika dibandingkan dengan tikus yang diinduksi indometasin.. Sedangkan tikus yang hanya diberikan suplementasi BAL sejumlah 2,18 x
106 CFU/ml. Peningkatan pada total BAL ini terjadi karena suplementasi BAL yang diberikan pada tikus mampu melakukan penempelan pada mukosa jejunum (Zubillaga, 2001). Mekanisme BAL dalam menurunkan aktivitas mikroflora pada jejunum tikus yaitu dengan cara mengaktivasi IκB (Inhibitor NF-5 κB) sehingga akan menghambat aktivasi NF-κB. Karena tidak ada aktivitas NF-κB secara otomatis akan mencegah poduksi TNFα berlebih sehingga aktivitas mikroflora akan turun (O’Hara and Shanahan, 2007). Penurunan jumlah mikroflora BAL dan enterobacter yang diberi induksi indometasin tersebut terjadi karena adanya kerusakan jejunum akibat paparan indometasin. Kerusakan jejunum disebabkan karena menurunnya prostaglandin dan cairan mucus pada mukosa jejunum. Cairan mucus membantu bakteri menempel pada mukosa jejunum. Jumlah cairan mukus yang menurun menyebabkan mikroflora tidak dapat untuk menempel dan bertahan hidup. Pernyataan ini didukung oleh Fukushima (2009) bahwa pada kondisi usus yang mengalami inflamasi akan menyebabkan terjadinya penurunan jumlah mikroflora. Pengujian kemampuan BAL sebagai tindakan kuratif menunjukkan adanya peningkatan pada total BAL dan total enterobacter jika dibandingkan dengan kelompok indometasin. Jumlah enterobacter yang lebih tinggi dari kelompok kontrol pada kelompok tikus yang diberi suplementasi BAL (C) terjadi karena adanya upaya oleh enterobacter untuk mencapai keseimbangan jumlah mikroflora pada jejunum dengan jumlah BAL. Pada tindakan preventif jumlah BAL dan enterobacter mengalami peningkatan jika dibandingkan dengan hasil induksi indometasin. Dikarenakan BAL diinduksi terlebih dahulu dari pada indometasin. Pemberian suplementasi BAL sebagai probiotik pada kondisi usus yang terpapar indometasin (enteritis) dapat membantu meningkatkan jumlah mukus pada permukaan jejunum. Dengan meningkatnya mukus maka proses kerusakan jaringan usus menjadi terhambat (Hadioetomo, 2003). Pemberian suplementasi BAL sebagai probiotik pada kondisi usus yang terpapar indometasin dapat membantu meningkatkan jumlah cairan mukus pada permukaan usus, sehingga proses
kerusakan jaringan usus menjadi terhambat (Ewaschuk, 2006). Berdasarkan pembahasan pada hasil analisis gambaran histopatologi dan hasil aktivitas mikroflora yang mana keduanya memberikan hasil yang saling mendukung dan membuktikan bahwa suplementasi menggunakan isolat BAL dapat digunakan untuk mencegah efek inflamasi yang disebabkan oleh induksi indometasin di jejunum. KESIMPULAN Suplementasi BAL yang diberikan dapat memperbaiki struktur vili jejunum tikus (Rattus norvegicus). Suplementasi BAL dapat meningkatkan jumlah mikroflora pada jejunum tikus (Rattus norvegicus) yang mendapat induksi indometasin. SARAN Perlu dilakukan variasi penelitian dengan memperkecil dosis pemberian indometasin menjadi 10mg/kg BB dan memperlama jangka waktu pemberian suplementasi bakteri asam laktat (BAL) menjadi 14 hari, agar mendapatkan perbedaan hasil yang signifikan. UCAPAN TERIMAKASIH Peneliti mengucapkan terimakasih kepada staff, teknisi, dan laboran Laboratorium Biokimia FMIPA dan Laboratorium Sentral Ilmu Hayati (LSIH) Universitas Brawijaya, serta dosen - dosen pembimbing yang membantu dalam penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Aulanni’am; A. Roosdiana and NL. Rahmah. 2012. The Potency of Sargassum duplicatum Bory Extract on Inflammatory Bowel Disease Therapy in Rattus norvegicus. Journal of Life Sciences 6 : 144-154. Chow, 2002. Probiotics in human medicine. Gut 32, 439-442. Ewaschuk J., B. and A., D Levinus. 2006. Probiotics and prebiotic in chronic inflammatory bowel diseases. World J Gastroenterology ; 12(37).
Fukushima, K. 1999. Colonization of Microflora in Mice: Mucosal Defense Againts Luminal Bacteria. Journal of gastroenterology 34: 54-60 Galdeano, MC & G Perdigon. 2006. The Probiotic Bacterium Lactobacillus casei Induces Activation of the Gut Mucosal Immune System through Innate Immunity. Clin Vac Immun, p. 219-226. Guyton
C Arthur. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Jakarta: EGC, 2000.
Hadioetomo, RS. 2003. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek.Jakarta : Gramedia. Johnston B.C., A Supina, and S. Vohra. 2006. Probiotics for pediatric antibioticassociated diarrhea: a metaanalysis of randomized placebocontrolled trials.CMAJ. 2006;175:377– 383 Lanas A, C Scarpignato.2006.Microbial Flora in NSAID-Induced Intestinal Damage: A Role for Antibiotics? Digestion;73(Suppl.1):136-150 Markwick. 2004. Diet and human immune function. Probiotics and Immunomodulation. New Jersey 327339 Mansjoer, S. 2003. MEKANISME KERJA OBAT ANTIRADANG. Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara. USU digital library Mattjik A.A. 2000. Perancangan Percobaan. IPB Press. Bogor. Muchtadi. 2005. Teknologi Proses Pengolahan Pangan. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Biochemical Characterization of Lactic Acid Bacteria Isolated From Fish and Prawn. J. of Culture Collections, 4(02):48-52. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi. Institut Pertanian Bogor, Bogor
Mitchell R.N. 2003. Acute and chronic inflammation. Dalam S. L. Robbins & V. Kumar, Robbins Basic Pathology (7th ed.)(pp33-59). Philadelphia: Elsevier Saunders. O’Hara and F .Shanahan . 2007. Mechanisms of Action of Probiotics in Intestinal Diseases. TheScientificWorldJOURNAL (2007) 7, 31–46 Petrof. 2004. Probiotics inhibit nuclear factorkappa B and induce heat shock proteins in colonic epithelial cells through proteasome inhibition. J Gastroenterology 127:1474–1487. Salminen. 2001. Lactic acid bacteria in health disease. Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects 2nd Edition. Marcel Dekker Inc., New York. Siregar,
C. T. 2004. Nutrisi. Fakultas Kedokteran. Universitas Sumatera Utara , and Anti-Inflammatory Pathways. Gastroenterology Research and Practice Volume 2011
Takeuchi. 2003. Role of COX Inhibition in Pathogenesis of NSAID-Induced Small Intestinal Damage, Kyoto Pharmaceutical University, Kyoto. Tamime and Robinson. 2000. Yogurt Science and Technology. 2nd Edition. Woodhead Publishing, Cambridge. Yoon, S., and J Sun. 2011. Review Article Probiotics, Nuclear Receptor SignalingSurono, I. 2004. Probiotik : Susu Fermentasi dan Kesehatan. PT Zitri Cipta Karya. Jakarta
