Laboratoř analýzy biologických materiálů

VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Ústav biochemie a mikrobiologie

Laboratoř analýzy biologických materiálů Ing. Jan Lipov, Ph.D., Ing. Zdenek Knejzlík, Ph.D., Ing. Eva Jablonská

Vysokoškolský učební text pro posluchače Vysoké školy chemicko-technologické v Praze

PRAHA 2014

Poděkování. Tvorba studijního textu „Laboratoř analýzy biologických materiálů“ byla podpořena projektem CZ.2.17/3.1.00/36021 Implementace nových metod ve výuce biochemie a forenzní analýzy. kolektiv autorů, Praha 2014

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti

OBSAH

1.

ÚVOD

1

2.

BEZPEČNOST PRÁCE

2

3.

ISOLACE DNA A JEJÍ ANALÝZA

4

3.1. Metodika isolace DNA ve forenzní analýze 3.1.1 Isolace DNA pomocí nosiče Chelex® 100 3.1.2. Isolace DNA pomocí silikátového nosiče

4

3.1.3.

4 6

Isolace DNA fenolchloroformovou extrakční metodou 7

3.1.4

Isolace DNA technologií FTA®

3.2. Isolace DNA z náročných biologických vzorků 3.2.1. Isolace DNA ze spermatu

8 8

3.2.2.

Isolace DNA z vlasů

8

3.2.3.

Isolace DNA ze zubů a kostí

9

3.3.

Elektroforesa DNA

10

3.4.

Kvantifikace DNA

16

3.5.

Polymerasová řetězová reakce

17

3.6. 4.

7

3.5.1.

Složky PCR směsi

17

3.5.2.

Průběh PCR reakce

18

3.5.3.

Kvantitativní PCR

20

Forensní analýza DNA

PROTOKOLY

24 33

PROTOKOL 1: ISOLACE GENOMOVÉ DNA FENOLCHLOROFORMOVOU EXTRAKCÍ

PROTOKOL 2: ISOLACE GENOMOVÉ DNA S POUŽITÍM ® NOSIČE CHELEX 100 PROTOKOL 3: ISOLACE DNA POMOCÍ KOMERČNÍ ® SOURAVY „QIAAMP DNA ISOLATION MINIKIT“

33

37

40

PROTOKOL 4: DEMONSTRACE ANALÝZY RFLP VZORKŮ Z MÍSTA ČINU A PODEZŘELÝCH OSOB.

45

PROTOKOL 5: ELEKTROFORESA DNA V AGAROSOVÉM GELU

PROTOKOL 6: ZJIŠTĚNÍ DÉLKY LOKUSU APOB V CHROMOSOMÁLNÍ DNA

47

50

PROTOKOL 7: DEMONSTRACE ANALÝZY VNTR VZORKŮ Z MÍSTA ČINU A PODEZŘELÝCH OSOB.

53

PROTOKOL 8: DEMONSTRACE VLIVU KONCENTRACE NA VÝSLEDNÉM CT PŘI KVANTITATIVNÍM PCR

PROTOKOL 9: KVANTIFIKACE AUTOSOMÁLNÍ A YCHROMOSOMÁLNÍ DNA POMOCÍ KOMERČNÍ SOUPRAVY PLEXOR HY

56

60

PROTOKOL 10: MULTIPLEX AMPLIFIKACE STR LOKUSŮ Z ISOLOVANÉ CHROMOSOMÁLNÍ DNA POMOCÍ KOMERČNÍ SOUPRAVY POWERPLEX 16.

63

1. ÚVOD Forensní biologii lze definovat jako aplikaci biologických věd při prosazování zákona. V mnoha případech je zjednodušována na analýzu DNA, ale ve skutečnosti v sobě zahrnuje i kategorie jako např. forensní botanika, entomologie, antropologie, ornitologie a řadu dalších. Z hlediska frekvence využití se v průběhu času toto odvětví rovněž vyvíjelo, ještě v 70. letech byla forensní biologií míněna především sérologie, tedy identifikace a individualizace na základě určení krevní skupiny. V současnosti je primárním odvětvím biologické identifikace analýza a profilace DNA, i když nelze zapomínat ani na analýzu krve, slin, moči a dalších tělních tekutin. Cílem praktika "Laboratoř analýzy biologických materiálů" je z časových důvodů výhradně seznámení frekventantů s analýzou DNA, tj. s její isolací, kvantifikací a konečně tvorbou DNA profilu.

-1-

2. BEZPEČNOST PRÁCE Dodržování zásad správné laboratorní praxe je v dnešní době klíčovou součástí standardních laboratorních postupů. Hlavními složkami správné laboratorní praxe jsou dodržování veškerých laboratorních postupů a jejich monitoring: Ty také významně zohledňují dodržování zásad bezpečné práce z důvodu ochrany zdraví pracovníka a ostatních osob na pracovišti a současně také dopad vykonávané práce na životní prostředí. často i zákonem postulovaných postupů a norem pro bezpečnou práci. Postupy jsou založeny na neustálém hierarchickém systému kontroly a zodpovědnosti jednotlivých osob. Cílem je snižovat veškerá rizika při práci v laboratoři na minimum. Existuje celá řada doporučení a zásad jak těmto rizikům předcházet, dále pak, pokud dojde k nehodě, jak je řešit. V následujícím odstavci je zjednodušeně uvedeny zásady bezpečné práce v laboratoři a postupy pro řešení mimořádných událostí: Základní povinnosti posluchače:        

Podrobit se úvodnímu školení bezpečnosti práce a požární ochrany. V laboratoři se pohybovat takovým způsobem, aby se zamezilo možným poškozením zařízení nebo zranění přítomných osob. Dodržovat určené postupy určené pedagogickým pracovníkem. Při práci používat určené (doporučené) ochranné pracovní pomůcky (pláště, rukavice, brýle, štítky...) a ochranná zařízení. Dodržovat stanovené pracovní postupy a používat při práci určené ochranné pracovní prostředky a ochranná zařízení. Respektovat zákaz kouření, pití a konzumace potravin v laboratoři. Pedagogům neodkladně oznámit poranění nebo úraz, a pokud to zdravotní stav dovolí, účastnit se vyšetření příčiny a okolností vzniku školního úrazu. Neodkladně nahlásit závady na přístrojích, a to zejména ty, které by mohly ohrozit bezpečnost práce.

Základní zásady bezpečné práce v laboratoři:  

   

Vlasy si upravit tak, aby bylo zabráněno jejich kontaktu s chemickými látkami, biologickým materiálem, otevřeným ohněm nebo pohybujícími se přístrojovými prvky V případě znečištění povrchu těla (ruce atd..) je nutno místo rychle opláchnout tekoucí vodou a pak důkladně omýt mýdlem a teplou vodou. Z očí je nutné vymývat chemikálii proudem tekoucí studené vody, okamžitě odstranit všechny zasažené části oděvu. Vyvarovat se neodborného zásahu. V případě manipulace s látkami skladovaných v otevřených nádobách je nutno udržovat ústí nádob odvrácené od sebe i jiných osob. Látky, které jsou zdraví škodlivé nebo těkavé se nesmí pipetovat ústy a jejich odpad musí skladován ve speciálních označených nádobách. Poškozené skleněné a porcelánové nádobí ihned likvidovat do zvláštních nádob. Odpadní rozpouštědla, kyseliny a zásady je nutno dávat do zvláštních nádob. Nevylévat je do výlevky. -2-

Stručné základy první pomoci První pomoc je nutné poskytnout rychle, všechny školní úrazy je nutno hlásit příslušnému pedagogovi, který poskytne první pomoc a podle potřeby zařídí lékařské ošetření.  V případě pořezání se přiloží sterilní obvaz nebo náplast, při silném krvácení tlakový nebo škrticí obvaz a následně zajistit lékařské ošetření.  Při popálení je nutné místo chladit tekoucí vodou nebo ledem přes krycí obraz (popřípadě čistou folii) a zajistit lékařské ošetření.  Při poleptání roztoky kyselin nebo louhů je nutné poškozené místo chladnou tekoucí vodou. V případě potřeby neutralizovat kyselinu 2% NaHCO3 a zásadu 2% CH3COOH. 

Při požití toxické látky - NEvyvolávat zvracení v PŘÍPADĚ bezvědomí, po požití kyselin nebo zásad. - zvracení má smysl vyvolávat, pokud je postižená osoba při vědomí a k požití látky došlo maximálně před dvěma hodinami u kapalin nebo čtyřmi u látek pevných. Následně obsah žaludku zředit suspensí s aktivním uhlím a následný transport k lékaři,¨.



Při nadýchání toxických látek je nutné vynést postiženou osobu na čerstvý vzduch, rychle odstranit zamořený oděva a okamžitě zajistit lékařskou pomoc.



Při vniknutí agresivní látky do oka je nutné zahájit jeho intenzivní výplach vodou (přibližně 15 min.), následně pak zajistit lékařské ošetření. Pozor, postižené oko se nesmí mnout. Při poranění elektrickým proudem je nutné vyprostit postiženého z dosahu el. proudu (vypnutím přívodu el.proudu, odsunutím vodiče, odtažením postiženého z dosahu el.proudu isolovaným předmětem). V případě. že postižený nedýchá provést kontrolu průchodnosti dýchacích cest (zvratky, zapadlý jazyk) popř. zavést ihned umělé dýchání a případně nepřímou masáž srdce. Je-li postižená osoba při vědomí, je nutné dopravit k lékaři, protože při úrazu el. proudem může dojít k šoku popřípadě i poruše srdečního rytmu i několik hodin po úrazu.



kontakty hasičský záchranný sbor Policie ČR – tísňové volání Zdravotní záchranná služba

150 nebo 112 158 155

-3-

3. ISOLACE DNA A JEJÍ ANALÝZA

Metodika isolace DNA ve forensní analýze

3.1.

Isolace DNA je klíčovým krokem v přiřazení specifického profilu přítomné DNA, v obecné rovině lze isolaci DNA ve forensních oborech přiřadit dva klíčové cíle. V první řadě jde o to isolovat DNA v dostatečném množství umožňující její plánovanou analýzu, tento cíl je obzvláště aktuální, jestliže dostupnost nebo množství konkrétního vzorku jsou limitující. Druhým, neméně důležitým cílem, je isolovat DNA v dostatečně čistém stavu. Uvědomíme-li si, jaká může být reálná povaha vzorku (např. krevní stopy v půdě, na zdi, na textilii apod.), je zřejmé, že k dosažení tohoto cíle musí být použito specifických postupů. V praxi je dostupných mnoho metod pro isolaci DNA. V zásadě nelze uvést nějakou universální metodu, to jakou si zvolíme, závisí na mnoha okolnostech, jako jsou např. množství a povaha vzorku, požadovaný čas isolace DNA, akceptovatelná cena isolace DNA a v některých případech i použitelnost metody pro její automatizaci. Je nutné opět upozornit, že čistě z analytického hlediska jsou nejpodstatnější výše zmíněné dva faktory, tj. množství a čistota DNA. Svou významnou úlohu hraje také fakt, že současným trendem v rutinních laboratořích je opouštění postupů využívajících toxické sloučeniny (např. fenol, chloroform). Důležitým faktorem je také technická vybavenost laboratoře a zejména zkušenost odborného personálu. Isolaci DNA lze obecně rozdělit na následující tři kroky: i. ii. iii.

Porušení buněčné membrány, což vede k buněčné lysi. Denaturace proteinů, která je v některých případech částečnou precipitací. Separace DNA od denaturovaných proteinů a dalších buněčných složek

3.1.1. Isolace DNA pomocí nosiče Chelex® 100 Isolace DNA s použitím nosiče byla první metodou užívanou pro isolaci DNA ve forensní analýze. Podstatou tohoto nosiče je matrice složená z kopolymeru styrenu a divinylbenzenu, na kterou je kovalentně imobilizována kyselina iminodioctová. Disociovaná kyselina iminodioctová má vysokou afinitu pro polyvalentní ionty (např. Ca2+, Mg2+, Cd2+, Ni2+…), jejichž přítomnost ve vzorku DNA může v některých případech negativně interferovat s výsledkem PCR. Isolace DNA pomocí Chelex® 100 je velmi jednoduchá, buněčná suspense je resuspendována v 5 % roztoku Chelex® 100 v přítomnosti proteinasy K a inkubována 30 – 120 min při 56 °C, kdy je tato proteasa ještě vysoce aktivní. Proteinasa K ve vzorku DNA nespecificky štěpí nežádoucí kontaminující proteiny, které mohou vytvářet vysoce stabilní komplexy s DNA nebo mnoha dalšími různými způsoby inhibovat PCR. Je nutno zmínit, že odstranění hořečnatých iontů ze vzorku DNA nosičem Chelex® 100 vede ke zvýšení její stability, neboť ionty Mg2+ jsou nutným faktorem pro aktivitu přítomných nukleas.

-4-

Po skončení inkubace vzorku při 56 °C následuje jeho povaření po dobu 8 – 10 min, což zaručí, že jsou všechny buňky kompletně desintegrovány (lysovány). Při teplotě 100 °C dochází také u většiny proteinů k jejich denaturaci, která je často doprovázena tvorbou precipitátu, který je následně odstraněn centrifugací na dno mikrozkumavky. Výsledný čirý supernatant obsahuje genomovou a mitochondriální DNA, které mohou být použity pro většinu aplikací PCR. Vzhledem k tomu, že je vodná suspense Chelex® 100 alkalická s hodnotou pH v rozmezí 9 – 11, je při těchto podmínkách obdržena jednořetězcová DNA. Hlavní výhodou této metody je její rychlost, při jejím rutinním provedení netrvá isolace DNA déle než hodinu. Je taktéž velmi jednoduchá a podstatné je, že je isolace DNA po celou dobu prováděna pouze v jedné mikrozkumavce. Tento fakt výrazně snižuje riziko kontaminace vzorku cizorodou DNA, ke které může dojít v případě transferu supernatantu do nových mikrozkumavek. Tento způsob isolace je levnou alternativou k ostaním metodám, přičemž je použitelná pro extrakci DNA z vetšiny vzorků, se kterými se setkáme ve forensní laboratoři. Na druhou stranu je nutné podoktnout, že DNA obdržená touto metodou obsahuje relativně vysoké množství nečistot, přesto je však její čistota dostačujcí pro většinu následných aplikací. V současnosti se od isolace DNA pomocí nosiče Chelex® 100 již upouští, ale tato metoda je výbornou technikou levné „nevalidované“ isolace DNA.

Schematické znázornění isolace chromosomální DNA pomocí nosiče Chelex 100

-5-

3.1.2. Isolace DNA pomocí silikátového nosiče V prvním kroku této metody je prováděna desintegrace buněčného materiálu v roztoku obsahujícím detergent současně s proteinasou K. Nejpoužívanějšími detergenty jsou dodecylsíran sodný (SDS), Tween 20, Triton X-100 a Nonidet P-40, které solubilizují některé části buněčných membrán. Po takto provedené buněčné desintegraci následuje přídavek tzv. chaotropních solí jako jsou guanidin thiokyanát nebo chlorid sodný do výsledné koncentrace 6 M. Při vysoké koncentraci chaotropních činidel dochází k porušení terciární a sekundární struktury proteinů v důsledku oslabení interakcí zprostředkovaných vodíkovými můstky, Van der Waalsovými a hydrofobními interakcemi v rámci molekuly proteinu. Výsledkem je snížení rozpustnosti proteinů, jejich precipitát může být odstraněn centrifugací nebo filtrací. Nízká rozpustnost proteinů v přítomnosti koncentrovaných roztoků chaotropních činidel je způsobena zejména jejich dehydratací v důsledku nízké aktivity molekul vody. Současné komerční isolační soupravy (kity) využívají právě tento princip tzv. vysolování. Další podstatná role chaotropních činidel spočívá v jejich positivním efektu vazby DNA na silikátové nebo skleněné nosiče. Po odmytí (eluci) kontaminujících buněčných složek je DNA eluována z povrchu silikátového nosiče vodou nebo pufrem s mírně alkalickým pH. Tato metoda je velmi robustní vůči povaze většiny vzorků ve forensní analýze, výhodou je také možnost její plné automatizace. Isolovaná DNA je méně fragmentována než v případě použití nosiče Chelex® 100, isolovaná DNA je dvouřetězcová a obdržené vzorky isolované DNA také vykazují mnohem vyšší čistotu.

Vazba DNA na silikátový nosič v přítomnosti chaotropních činidel

-6-

3.1.3. Isolace DNA fenol-chloroformovou extrakční metodou Isolace DNA s použitím chloroformu a bazického roztoku fenolu byla v minulosti používána zejména v oblasti molekulární biologie. Její rozšíření do oblasti forensní analýzy započalo až v polovině 90 let minulého století, a to zejména z důvodu toxicity fenolu. V současnosti je tato metoda používána ve forensních laboratořích pro isolaci DNA ze vzorků půdy a kostí. Buněčná lyse je prováděna podobným způsobem jako u předcházejícího postupu. K buněčnému lyzátu je následně přidána směs fenolu a chloroformu. Celá směs je pak intensivně protřepána a centrifugována, což vede k oddělení dvou fází: spodní organickou a horní vodnou. Na přechodu fází se po jejich oddělení nachází blanka (povlak) precipitovaných proteinů. Ve spodní organické fázi (obsahující směs fenolu a chloroformu) jsou extrahovány látky hydrofobního charakteru, jako jsou například lipidy. V horní vodní fázi se nachází DNA se zbytkovými proteiny. Po odebrání horní vodné fáze se v některých případech provádí opětovná extrakce zbytkového fenolu samotným chloroformem. DNA je z vodné fáze dále nejčastěji precipitována 70% ethanolem a isolována v tomto stavu precipitátu pomocí centrifugace nebo filtrace. Tato metoda poskytuje DNA o relativně vysoké čistotě, ale má několik nedostatků. V průběhu isolace DNA je její roztok v některých krocích přemisťován do nových mikrozkumavek, což zvyšuje riziko její kontaminace cizorodou DNA. Jedná se také o metodu náročnou na množství jednotkových operací.

3.1.4. Isolace DNA technologií FTA® Postup FTA® je patentově chráněnou technologií skladování a rychlé isolace DNA (angl. Fast Technology for Analysis of nucleic acids), která byla vyvinuta v 80. letech minulého století za účelem dlouhodobého skladování vzorků DNA při laboratorní teplotě. Podstatou této metody je aplikace slabé base, jemného detergentu nebo kyseliny močové (její soli) na celulosovou membránu, nejčastěji o průměru 2 – 3 mm. Na takto ošetřenou celulosovou membránu (filtr, terčík) se aplikuje vzorek obsahující DNA. Tato metoda je vhodná zejména pro isolaci DNA ze slin (resp. suspense epithelu) nebo krve. Buňky z těchto preparátů jsou přirozeně zadrženy na filtru, na jehož povrchu a vnitřku současně dochází k jejich lysi. Terčíky se následně intensivně promyjí za účelem odstranění buněčných kontaminant. Jestliže je membrána po této operaci náležitě vysušena a v suchu skladována, potom je vzorek extrahované DNA dlouhodobě stabilní a vykazuje vysokou odolnost vůči poškození UV světlem nebo potenciální mikrobiální kontaminaci. Výhodou tohoto způsobu imobilizace DNA je také to, že pro skladování vzorků není zapotřebí mrazicí box, a také isolace v jedné zkumavce. Terčíky s obsahem DNA o velikosti cca 2 mm lze pak přímo dodat do PCR směsi.

-7-

3.2.

Isolace DNA z náročných biologických vzorků

V některých případech se ve forensní analýze můžeme setkat s biologickými vzorky, jejichž fyzikálně chemické vlastnosti mohou výrazně komplikovat isolaci DNA. V takových případech je nutné rutinní metody isolace DNA z běžných vzorků (např. krev, sliny) částečně modifikovat.

3.2.1. Isolace DNA ze spermatu Určení DNA profilu jedince původce spermatu je ve forensní analýze velice častým případem. Spermie má relativně komplikovanou strukturu, přičemž chromosomální DNA se nachází v její hlavičce. Hlavička spermie obsahuje na svém obvodu relativně silnou ochrannou vrstvu, tzv. akrosom, která je bohatá na bílkoviny obsahující vysoké množství cysteinových zbytků. Ty jsou zodpovědné za tvorbu mezimolekulárních disulfidových vazeb mezi proteiny. Proteinasa K, která je velice často používána pro deproteinaci vzorků, není schopna takto prokřížené proteiny účinně štěpit. Na druhou stranu její schopnost štěpit tyto akrosomální proteiny se výrazně zvýší v přítomnosti vysokého obsahu redukčních látek (např. dithiotreitol – DTT). Velice častým případem a současně komplikací vzorků spermatu je nežádoucí přítomnost epitheliálních buněk jiné další osoby (např. vaginální výtěr). Směsný vzorek DNA s sebou nese podstatně vyšší nároky na analýzu, proto je účelné kontaminující zdroj DNA odstranit. V tomto případě je naopak vyšší resistence spermií k působení proteinasy K výhodou, lze jí využít při tzv. diferenciální lysi, při které jsou epitheliální buňky lysovány detergentem v přítomnosti proteinasy K za podmínek, při kterých ještě nedochází k lysi spermií. Intaktní spermie jsou v následných krocích intenzivně promyty a dále použity pro isolaci DNA za redukujících podmínek.

3.2.2. Isolace DNA z vlasů Jestliže vzorek vlasu obsahuje vlasový kořínek, který je bohatým zdrojem DNA, může být z něho DNA isolována standardními postupy. Jeden vlasový kořínek může obsahovat až 500 ng DNA, která může být za použití vhodných postupů téměř kvantitativně isolována. Vlas bez vlasového kořínku neobsahuje téměř žádný buněčný materiál na jeho povrchu. Je složen zejména z keratinu, který vytváří jeho základní matrici. V této keratinové matrici se pak nachází vzduch, stopy kovů a pigmentové komponenty, které jsou odvozeny z částí buněk. Vlas bez kořínku tedy obsahuje dostatečné množství DNA, ale ta je zakomponována v jeho poměrně rezistentní keratinové struktuře. Isolovat DNA z vlasu je velmi obtížné a v mnoha případech poskytují dostupné postupy pouze vzorky pro analýzu mitochondriální DNA, která má ve srovnání s chromosomální DNA mnohem menší velikost. Keratinová matrice je velmi bohatá na disulfidové můstky a v prvním kroku je nutné vlas mechanicky desintegrovat (rozmělnit) a disulfidové můstky v keratinové matrici odstranit pomocí redukčních činidel pro následné použití proteinasy K. Uvolněná DNA z vlasu pak může být snadno purifikována s použitím chaotropních činidel (přes silikátový nosič) nebo -8-

fenol-chloroformové extrakce. V některých případech se po aplikaci proteinasy K ke vzorku vlasu část hrubého extraktu používá přímo pro PCR analýzu. Vzorek vlasu lze také solubilizovat v hydroxidu sodném, ten způsobuje částečnou hydrolysu keratinu a jeho denaturaci. Po neutralizaci lze tento vzorek použít přímo pro analýzu DNA pomocí PCR nebo pro tyto účely může být ještě koncentrace DNA navýšena ultrafiltrační centrifugací. Protože je obsah DNA ve vlasu (bez kořínku) relativně nízký, jsou z něho obdržené vzorky DNA náchylné k markantní kontaminaci cizorodou DNA, jejíž zdroj se ve většině případů nachází na jeho povrchu. Proto se často před vlastní isolací se povrch vlasu dekontaminuje od těchto možných zdrojů. V praxi se používá více postupů, od nejjednoduššího oplachu destilovanou vodou nebo koncentrovaným ethanolem po diferenciální lysi v mírných detergentech (viz isolace DNA ze spermií).

3.2.3. Isolace DNA ze zubů a kostí V některých případech úmrtí (teroristický útok, válka, nehoda, vražda) může mezi dobou smrti a nálezem neidentifikovaného těla uplynout relativně dlouhá doba, v průběhu které může dojít k rozkladu měkkých tkání. Ty pak většinou nemohou být použity jako zdroj genomové DNA z důvodu její fragmentace, která může být způsobena intracelulárními nukleasami nebo bakteriální kontaminací. V těchto případech se přistupuje k isolaci DNA ze tkání, které jsou více odolné k výše zmíněným pochodům. Jde zejména o kostní a zubní tkáň. V kostní tkáni jsou přítomny osteocyty obsahující buněčné jádro (tedy i DNA), které jsou zakomponovány v pevné kostní matrici. U zubu se v jeho dřeňové části nachází odontoblasty. Pevná matrice těchto tkání dostatečně chrání DNA před nepříznivými vlivy a ta po dlouhou dobu zůstává intaktní. Tento stabilizační jev není způsoben pouze prostou fyzikální bariérou matrice, ale přispívá k němu i chemická podstata zubní matrice, která je charakteristická vysokým obsahem hydroxyapatitu (Ca5(PO4)3OH). Tento minerál s positivním povrchovým nábojem velmi ochotně váže molekuly DNA a zvyšuje jejich resistenci vůči působení nukleas. Významnou výhodou pevných tkání je i to, že je lze velmi účinně očistit agresivními činidly nebo mechanickým obroušením pro zabránění možné kontaminace cizorodou DNA. Pro odstranění nežádoucích zdrojů kontaminace z jejich povrchu se používá roztok chlornanu sodného, trypsinu nebo dlouhá exposice při vysoké intensitě UV záření. Po očištění (dekontaminaci) vzorku tvrdé tkáně je provedena jeho mechanická desintegrace drcením či mletím. Obdržený namletý materiál je dekalcifikován s použitím roztoku 0,5M EDTA (účinné chelatační činidlo), a to před vlastní buněčnou lysí nebo v jejím průběhu. Velmi často se u těchto vzorků používá isolace DNA pomocí silikátového nosiče nebo fenol-chloroformová extrakce.

-9-

3.3.

Elektroforesa DNA

Molekula DNA obsahuje ionizovatelné funkční skupiny, které ji v závislosti na pH udávají specifické nábojové vlastnosti. V tomto ohledu je nejvýznamnější hydroxylový zbytek na atomu fosforu v rámci fosfodiesterové vazby, která formálně představuje poslední OH skupinu zbytku kyseliny fosforečné (H3PO4, zbylé dvě se podílí na tvorbě fosfodiesterové vazby). Záporný náboj molekul DNA v okolí neutrálního pH je využíván pro jejich separaci pomocí elektroforesy v agarosovém gelu. Podstatou je fakt, že hodnota záporného náboje na jednotku délky (např. na jeden pár báze) je u různě dlouhých molekul stejná. Elektroforetická mobilita lineárních fragmentů DNA (rychlost putování) je tedy funkcí pouze jejich délky a hustoty agarosového gelu. Agarosa je lineární kopolymer D-galaktosy a 3,6-anhydro-L-galaktosy. Jejím zdrojem jsou mořské řasy, přičemž komerčně dostupná agarosa pro molekulární biologii může dále obsahovat polysacharidy, soli nebo proteiny. Množství těchto kontaminant se často může lišit i mezi jednotlivými šaržemi v rámci jednoho dodavatele a samozřejmě i mezi dodavateli. Tyto odlišnosti mohou negativně ovlivňovat separaci DNA v průběhu elektroforesy. V současnosti již dodavatelé (výrobci) jednotlivé parametry, které mohou ovlivnit průběh elektroforézy, validují. Na trhu jsou dostupné také různě modifikované formy agarosy (např. acetylovaná agarosa), které gelovatí při nižší teplotě bez výrazného ovlivnění pevnosti výsledného gelu (pevnost, tuhost). Tyto druhy agaros jsou používány zejména pro preparativní aplikace molekul DNA a pro štěpení molekul DNA přímo v gelu (in situ). V současnosti jsou dostupné také agarosy gelovatějící při nízké teplotě, které jsou určeny pro separaci krátkých fragmentů DNA (10 – 500 bp), stále však tyto gely nedosahují kvality rozlišení elektroforézy v polyakrylamidovém gelu. Standardně se agarosový gel připravuje následovně: odvážená agarosa se rozpustí ve vroucím elektroforetickém pufru a po jejím rozpuštění je roztok nalit do příslušné elektroforetické nádoby se hřebínkem pro tvorbu jamek a ponechán ztuhnout. Ztuhnutá agarosa vytváří matrici gelu jehož výsledná hustota je závislá na koncentraci agarosy. Molekuly agarosy ve vroucím roztoku mají náhodné prostorové uspořádání, při jejich ochlazování dochází ke vzájemné dimerizaci molekul, která je doprovázena tvorbou helikálního uspořádání v místech jejich kontaktu. Při dalším poklesu teploty dochází k agregaci dimerů s dalšími dimery prostřednictvím těchto helikálních oblastí. Výsledkem je pak tvorba trojrozměrné sítě s velikostí pórů odpovídající množství přítomné agarosy. Pro maximální rozlišení agarosového gelu je v některých případech praktické dát inkubovat gel po jeho ztuhnutí ještě nejméně 30 min při 4 °C. DNA se v tomto gelu při neutrálním až slabě alkalickém pH v přítomnosti elektrického pole pohybuje směrem k anodě (kladná elektroda). Rychlost její migrace je pak klíčovým elektroforetickým parametrem a je závislá na celé řadě faktorů.

- 10 -

Složení a struktura agarosového gelu, elektroforéza DNA

- 11 -

Faktory ovlivňující elektroforetickou mobilitu DNA v agarosovém gelu Elektroforetická pohyblivost molekul DNA v agarosových gelech (na rozdíl od polyakrylamidového gelu) není významně ovlivněna složením DNA (zastoupením jednotlivých bází) nebo teplotou v rozmezí 4 – 30 °C. Nejčastěji se elektroforéza provádí při pokojové teplotě, ale pokud jsou používány gely s obsahem agarosy nižší než 0,5 %, je vhodné provádět elektroforézu při 4 °C pro uchování jejích dělících schopností. Je však celá řada faktorů, které na mobilitu vliv mají: Velikost molekuly DNA a hustota gelu. Lineární molekuly dvouřetězcové DNA v neutrálním až slabě alkalickém prostředí migrují ve stejnoměrném elektrickém poli skrz gelovou matrici rychlostí, jejíž hodnota je v nepřímé úměře k logaritmu jejich délky (počtu páru basí tj. molekulové hmotnosti). Tato závislost však neplatí v neomezeném intervalu, od určité velikosti dochází k intensivnějšímu zpomalení (migraci) v důsledku jejich intensivního frikčního brždění a dále z důvodu, že se také méně snadno „proplétají“ jednotlivými póry gelu.

Závislost elektroforetické pohyblivosti DNA na její délce a na hustotě agarosového gelu

- 12 -

Mobilita DNA je závislá na hustotě gelu, tj. je závislá také na koncentraci agarosy. Tuto závislost lze popsat následujícím vztahem:

Hodnota retardačního koeficientu Kr je závislá na vlastnostech gelu, velikosti a tvaru molekuly. Z této závislosti by mělo být patrné, že je možné účinně elektroforeticky rozlišit fragmenty DNA o různé délce vhodnou volbou hustoty gelu. V následující tabulce jsou ukázány dělící schopnosti různě koncentrovaných agarosových gelů. koncentrace agarosy [%(w/v)] 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 2,0

rozsah délek lineárních fragmentů DNA, které lze účinně separovat [kbp] 5-60 1-20 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,2-3

Konformace DNA. Kružnicová dvouřetězcová DNA může zaujmout různé konformační stavy, které jsou výsledkem vnitřního pnutí dvojhelixu (počet závitů), složení roztoku a také tvorbou multimerních forem v původním organismu. Vzhledem k tomu, že každá konformace DNA má jiné hydrodynamické vlastnosti a různé stupně volnosti, jejich mobilita se na agarosové elektroforéze liší. Jejich relativní mobilita (ve vzájemném srovnání) je zejména závislá na koncentraci agarosy v gelu, ale je také ovlivněna použitým napětím a iontovou silou elektroforetického pufru. Ve forensní praxi není analýza kružnicové DNA příliš běžná, je ale nutno mít na mysli, že za určitých podmínek může různé konformační stavy zaujímat i lineární DNA.

- 13 -

Závislost pohyblivosti DNA v agarosovém gelu na její konformaci

Použité napětí. Při nižších hodnotách napětí je migrace lineárních fragmentů DNA proporcionální k jeho hodnotě. Odlišné chování však vykazují dlouhé fragmenty DNA. Obecně platí, že rozlišení (separace) fragmentů DNA v průběhu elektroforézy v agarosovém gelu klesá se vzrůstajícím napětím. Pro obdržení dobrého rozlišení fragmentů DNA delších než 2 kbp je nutné provádět elektroforézu při napětí nižším než 5 V/cm (vzdálenost protilehlých elektrod). Směr elektrického pole. Molekuly DNA, které jsou delší než 50 – 100 kbp migrují na agarosové elektroforéze s konstantním směrem elektrického pole stejnou rychlostí. Pokud se však orientace elektrického pole v průběhu elektroforézy periodicky mění, dochází ke změně směru migrace také molekul DNA. Vzhledem k tomu, že delší molekuly DNA potřebují delší čas pro změnu směru jejich migrace, lze tento způsob elektroforézy (tzv. PFGE, z angl.. Pulsed Field Gel Electrophoresis) použít pro separaci extrémně dlouhých molekul (do 10 000 kbp). Přítomnost interkalačních činidel. V praxi se často do agarosového gelu přidává ethidium bromid, který je používán pro detekci DNA po ukončení elektroforézy. Tato interkalační látka po vazbě na lineární DNA snižuje její mobilitu přibližně o 15 %. Důvodem - 14 -

je to, že po jeho vmezeření (interkalaci) mezi báze dochází k prodloužení molekuly DNA a zároveň ke zvýšení její rigidity. Je nutné upozornit, že ethidium bromid je silný karcinogen a musí se s ním pracovat velmi opatrně. Všechny jeho roztoky musí být před vylitím náležitě dekontaminovány nejčastěji aktivním uhlím nebo přídavkem chlornanu sodného (aktivní látka přípravku SAVO). Složení elektroforetického pufru. Elektroforetická mobilita DNA je ovlivněna složením a iontovou silou pufru, ve které je prováděna. V nepřítomnosti jakýchkoli solí (např. destilovaná voda) je vodivost příliš nízká a DNA migruje velmi pomalu. Naopak v případě vysoké iontové síly pufru dochází z důvodu vysoké vodivosti k intensivnímu zahřívání, což vede k tání gelu a denaturaci DNA. V praxi se používá více druhů pufrů pro elektroforézu dvouřetězcové DNA za nativních podmínek. Označení pufru TAE (Tris-acetátový pufr) TPE (Tris-fosfátový pufr) TBE (Tris-borátový pufr) alkalický

Pracovní koncentrace 0,04 M Tris-acetát 0,001 M EDTA pH 8,0 0,09 M Tris-fosfát 0,002 M EDTA pH 8,0 0,045 M Tris-borát 0,001 M EDTA pH 8,0 0,05 M NaOH 0,001 M EDTA pH silně basické

Koncentrovaný roztok 50 x

10 x

5x

1x

V 5 x koncentrovaném TBE dochází při dlouhodobém skladování k tvorbě precipitátu, takový pufr není doporučeno používat. Z historických důvodů je TAE pufr stále nejpoužívanějším, přestože jeho pufrační kapacita je nízká. V TAE pufru v průběhu dlouhých časů elektroforézy dochází ke změně složení v jednotlivých elektrodových prostorech. Proto je v případě použití tohoto pufru doporučeno používat elektroforetické aparatury, které mají recirkulační jednotku pro homogenisaci celého objemu pufru v elektroforetické aparatuře. Náklady pro přípravu TPE a TBE pufru jsou ve srovnání s TAE o něco vyšší, ale mají podstatně vyšší pufrační aktivitu. Dvouřetězcové fragmenty DNA mají přibližně o 10 % vyšší mobilitu v přítomnosti TAE pufru ve srovnání s TBE a TPE, ale rozlišení je ve všech případech srovnatelné. Výjimkou je pouze superšroubovicová DNA, která se lépe dělí v TAE pufru. Pro elektroforézu jednořetězcové denaturované DNA se používá nejčastěji alkalický pufr (50 mM NaOH, 1 mM EDTA). V tomto případě nemůže být roztok agarosy připraven jejím varem přímo v tomto alkalickém roztoku z důvodu její hydrolysy. Prakticky se příprava - 15 -

gelu provádí rozpuštěním agarosy v destilované vodě a po ochlazení jejího roztoku se přidá koncentrovaný roztok NaOH a EDTA.

3.4.

Kvantifikace DNA

Po extrakci DNA je důležitým krokem určení koncentrace DNA a též evaluace její kvality. Použití správného množství DNA v následné PCR rekci je kritické pro získání kvalitního DNA profilu. Obzvláště důležité je to v případě forensních vzorků, kdy je často těžko odhadnutelný stupeň zachování biologického materiálu. Množství DNA, které lze extrahovat ze vzorku, velmi závisí na typu materiálu. Každá jaderná buňka obsahuje přibližně 6 pg DNA. Krev obsahuje 5 000-10 000 jaderných buněk (tedy nikoli erythrocytů) v jednom mililitru, sperma cca 65 milionů jaderných buněk na mililitr. 







Relativně rychlou a jednoduchou metodou pro odhad množství i kvality extrahované DNA je její vizualizace v agarosovém gelu po elektroforetické separaci a porovnáním se standardy délek DNA o známém množství. Nevýhodou je subjektivita a relativita kvantifikace, obzvláště v případě částečně degradované DNA, detekuje se celková DNA, tj. včetně např. DNA pocházející z mikrobiální kontaminace vzorku a nelze ji použít pro DNA extrahovanou pomocí metody Chelex, protože ta produkuje jednořetězcovou DNA, na kterou se neváží interkalační fluorescenční barvy, používané pro vizualizaci. Spektrofotometrie v UV světle využívá schopnosti basí DNA absorbovat světlo při 260 nm. Zpravidla se vzorek měří v rozsahu vlnových délek 220 – 300 nm, aby bylo možno odhadnout i případnou kontaminaci cukry (maximální absorbance při 230 nm) a proteiny (280 nm). Pro odhad čistoty slouží kritérium poměru absorbancí při 260 a 280 nm, které je pro čistou DNA v rozsahu 1,8 – 2,0. Nevýhodou je obtížná kvantifikace v případě malých množství DNA (častý případ forensních vzorků), kvantifikace není specifická pro lidskou DNA a existuje mnoho interferujících činidel (např. barviva z oblečení). Pro získání koncentrace není třeba žádné standardní křivky, jedná se o metodu absolutní. Fluorescenční spektroskopie využívá stejných činidel, jaká jsou používána při vizualizaci DNA v agarosovém gelu, čili např. ethidium bromidu nebo DAPI (4´,6-diamidino-2fenylindol). Principu extrémního nárůstu fluorescence po interkalaci s DNA se využívá i pro kvantifikaci velmi malého množství DNA (např. PicoGreen je schopna detekovat 25 pg/ml, navýšení fluorescence po vazbě na DNA je 1000násobné). I u této kvantifikační metody však platí, že není specifická pro lidskou DNA a vyžaduje výhradně dvouřetězcovou DNA. V typickém uspořádání se tedy k roztoku DNA neznámé koncentrace přidá interkalační činidlo a po krátké inkubaci je změřena intensita fluorescence (nejčastěji v mikrotitrační destičce). Změřená hodnota je poté porovnána s hodnotami kalibrační křivky (závislosti intensity fluorescence na známé koncentraci standardní DNA), jedná se tedy opět o relativní kvantifikaci. Kvantifikační techniky založené na hybridizaci se používaly ve forensních vědách hlavně v minulosti. Extrahovaná DNA je aplikována na nylonovou membránu a poté vystavena roztoku oligonukleotidu, který specificky hybridizuje se zvoleným úsekem na cílové - 16 -



3.5.

DNA (často se používala repetice v D17S1). Tento oligonukleotid je možno značit mnoha způsoby (kolorimetricky, chemiluminiscenčně). Výsledek je získán porovnáním se sadou standardů o známé koncentraci. Výhodou této metody je specifita pro lidskou DNA, nevýhodou nízká citlivost a velká pracnost provedení. Kvantitativní PCR (qPCR) je slibnou technikou, umožňující měřit jak relativní, tak absolutní koncentraci DNA měřením fluorescence v průběhu polymerasové amplifikace. Ve forensních aplikacích se často používá, protože umožňuje např. stanovit koncentraci mužské DNA a současně celkové lidské DNA, resp. jejich amplifikovatelné množství (tedy takové, které bude využitelné pro reakce vedoucí k sestavení DNA profilu). Jedná se o metodu relativní, k získání číselného údaje koncentrace je třeba provést reakce i se sériově ředěnými roztoky standardní DNA. Tato technika je relativně rychlá a nenáročná na provedení.

Polymerasová řetězová reakce

Polymerasová řetězová reakce (PCR) je v různých obměnách centrální technikou forensní analýzy DNA. Vyvinutí techniky specifické amplifikace vybrané oblasti DNA, umožňující vycházet i z extrémně malého množství templátové DNA, byla skutečným průlomem. 3.5.1. Složky PCR směsi V každé PCR reakci nesmí chybět následující komponenty: templátová DNA, nejméně dva oligonukleotidy (primery), termostabilní DNA-polymerasa, deoxyribonukleotidtrifosfáty (stavební kameny) a reakční pufr. Templátová, čili zdrojová DNA, jejíž část vymezená primery bude následně amplifikována, musí být do reakce přidána ve vhodném množství. Většina komerčních souprav vyžaduje pro optimální výsledek 0,5 – 2,5 ng extrahované DNA na reakci, což odpovídá 166 – 833 kopiím haploidního lidského genomu (jedna kopie lidského genomu odpovídá cca 3 pg DNA). Většina profilování je ale možná i s menším množstvím templátu (i pod 100 pg), interpretace výsledků je pak ale komplikovanější. Není důležitá jen koncentrace DNA, ale též její čistota (absence složek inhibující enzymovou aktivitu DNApolymerasy) a integrita (z fragmentované DNA není možno amplifikovat potřebně dlouhé úseky, výsledkem je částečný profil, obsahující jen lokusy s menší délkou amplikonu). DNA-polymerasa (DNA-dependentní DNA-polymerasa, EC 2.7.7.7) z termofilních bakterií je schopná uchovat si aktivitu i při teplotách blízkých 100 °C. Dnes existuje mnoho komerčně dostupných polymeras, které se liší svou přesností (množstvím chybně zařazených nukleotidů) i procesivitou (počet inkorporovaných nukleotidů, než polymerasa odpadne od templátu), často se využívá tzv. „hot start“ enzymu, tj. takového, který má v aktivním místě protilátku a jehož enzymatická aktivita je spuštěna až po prvním záhřevu na 95°C, tímto způsobem se brání degradaci primerů a tvorbě nespecifických produktů. Primery jsou krátké oligonukleotidy (obvykle 18-30 bp), které definují amplifikovanou oblast tak, že jsou komplementární k jednomu (každý k jinému) řetězci dvouřetězcové - 17 -

templátové DNA. Ve forensní analýze je důležité, aby se primery párovaly v oblasti konzervovaných úseků DNA a umožnily tak amplifikaci libovolného vzorku lidské DNA a současně aby se nepárovaly s DNA jiných živočišných druhů. V případě multiplex PCR (tedy reakce, ve které je více párů primerů a vzniká tak více specifických produktů z jedné templátové DNA) je třeba při návrhu primerů brát v potaz i velikost produktů PCR reakce tak, aby je bylo možno efektivně oddělit a identifikovat. V závislosti na délce a obsahu G/C a A/T mají primery různou teplotu přisednutí (počítanou jako teplotu, která je v daném prostředí potřeba na přerušení vodíkových můstků a odtržení primeru od jeho templátu), většina primerů je navržena na teplotu přisednutí 50-70°C. Primery mohou být navrženy ručně, nebo s využitím některého z dostupných programů, v případě komerčních identifikačních souprav jsou již primery součástí balení. Deoxyribonukleotid trifosfáty (dNTP) jsou stavební kameny DNA, jejich přítomnost v reakci je nezbytná, aby měla polymerasa co přidávat při extensi primerů dle vzoru templátové DNA. Všechny dNTP jsou v reakci obvykle přítomny ve stejné koncentraci (200 µM). Reakční pufr udržuje optimální pH, iontovou sílu a ionty potřebné pro enzymovou aktivitu (Mg2+).

3.5.2. Průběh PCR reakce Amplifikace DNA probíhá v cyklech, přičemž každý z nich má tři kroky: denaturaci, přisednutí primerů a extensi (prodloužení primerů dle templátu ve směru 5´ → 3´). Při denaturaci je teplota reakční směsi zvýšena na 95°C, což způsobí rozpad dvouřetězcové templátové DNA na dvě jednořetězcové molekuly. Teplota je poté snížena cca na 60°C (v závislosti na teplotě přisednutí přítomných primerů) a primery se párují vodíkovými můstky ke komplementárnímu úseku na templátové DNA (primery jsou v molárním přebytku proti templátu, takže znovusložení dvou jednořetězců zpět je méně pravděpodobné). Po hybridizaci primerů je teplota zvýšena na 72°C (nebo jinou, optimální teplotu použité polymerasy) a začíná přidávání nukleotidů ke 3´konci primeru podle templátu (rychlost přidávání se může dramaticky lišit podle polymerasy, orientačně cca 30 basí za sekundu). Běžně se používá cca 30 cyklů, toto číslo lze zvýšit v případě extrémně malého množství templátové DNA (ovšem se zvýšeným rizikem vzniku nespecifických produktů). Vzhledem k tomu, že v každém kroku se zdvojnásobí počet molekul DNA, vznikne teoreticky z jediné templátové molekuly na konci 32. cyklu (doporučený program pro PowerPlex 16) 1 073 741 824 cílových molekul. Přestože efektivita amplifikace není 100%, jedná se stále o velmi mocnou techniku, která ale stejně dobře dokáže amplifikovat kontaminující DNA, proto je třeba specializovaného vybavení a opatrnosti při přípravě PCR reakce (snížení rizika kontaminace). Ve forensní praxi je třeba brát v potaz též možnost, že na místě činu lze najít (odebrat, purifikovat, amplifikovat a následně profilovat) též DNA, která nemá s kriminálním činem nic společného a výsledky analýzy je tak třeba brát pouze jako jednu z indicií.

- 18 -

Příklad programu teplotního cyklovače

Jedním z nejčastějších problémů ve forensní praxi je inhibice PCR reakce složkou vzorku. Extrakce DNA neodstraní všechny kontaminanty a ty poté mohou inhibovat enzymovou aktivitu použité polymerasy, příkladem může být hem při isolaci z krve, žlučové kyseliny a komplexní polysacharidy při analýze fekálií, huminové kyseliny pocházející z půdy či močovina z moči. Pro běžně se vyskytující kontaminanty byly vyvinuty extrakční techniky, umožňující jejich odstranění, ale např. extrakce Chelexem velké množství inhibitorů neodstraní. Řešením může být buď naředění vzorku (sníží se koncentrace inhibitorů i templátové DNA, ale díky vysoké efektivitě amplifikace to nemusí být problém) nebo přidání hovězího sérového albuminu (BSA), který řadu inhibitorů jednoduše vyváže.

A – schématické znázornění polymerace dvouřetězcové DNA B – závislost míry denaturace DNA (resp. zastoupení ssDNA) na teplotě

- 19 -

3.5.3. Kvantitativní PCR Při tvorbě DNA profilu se analyzují produkty PCR reakce v jejich konečné podobě, tj. po cca 30 amplifikačních cyklech. Je však možno sledovat i tvorbu produktů v reálném čase (kvantitativní či real-time PCR), a to v zásadě dvěma základními technikami. První využívá již diskutovaného jevu zvýšení fluorescence interkalačního barviva v UV světle po navázání na dvouřetězcovou DNA, s tvorbou produktu se tedy zvyšuje fluorescence barvy (např. SYBR Green) přítomné v reakční směsi. Tato varianta qPCR je cenově nejpřijatelnější, umožňuje využití konvenčních primerů (nevyžaduje relativně drahé, fluorescenčně značené sondy) a umožňuje analýzu křivky tání, na druhou stranu se fluorescenční barva váže na jakoukoli dvouřetězcovou DNA (tedy i na kontaminující DNA např. z mikrobiální kontaminace) a nelze provádět porovnání hladiny dvou různých částí templátové DNA.

Vazba fluorescenční barvy na dvouřetězcovou DNA

- 20 -

Druhá metoda (tzv. TaqMan) je založena na schopnosti DNA-polymerasy odbourávat oligonukleotidy od 5´konce. Kromě dvou primerů vymezujících amplifikovaný úsek se do reakce přidává též tzv. sonda, tj. oligonukleotid, specificky hybridizující uvnitř úseku vymezeného primery. Tento oligonukleotid je na 5´konci modifikován fluorescenční molekulou a na 3´konci tzv. zhášečem (existují látky, které potlačují fluorescenci molekul, jsou-li v dostatečné blízkosti, je to způsobeno odlišným způsobem relaxace excitovaného fluoroforu). V průběhu PCR reakce dochází k extensi primerů až k místu, kde polymerase „překáží“ sonda. Polymerasa tuto sondu degraduje svou exonukleasovou aktivitou, čímž dojde k uvolnění fluoroforu a zhášeče do roztoku. Zhášeč se po uvolnění ocitne příliš daleko od fluoroforu (nedrží ho oligonukleotidový řetězec jako v případě nedegradované sondy) a fluorofor začne fluoreskovat – opět tedy dochází s tvorbou produktu k nárůstu fluorescence. Kvantitativní PCR je velmi citlivá, v tomto provedení specifická pro lidskou DNA a není náročná na provedení.

Schéma průběhu jednoho polymeračního cyklu kvantitativního PCR s použitím TaqMan sondy

- 21 -

Během prvních cyklů PCR se množství amplikonů takřka zdvojnásobuje. Množství amplikonů tedy roste exponenciálně úměrně k počátečnímu množství templátu ve vzorku. Následuje lineární fáze amplifikace a v určitém okamžiku se začnou vyčerpávat nukleotidy, primery, a nebo začne být DNA-polymerasa méně aktivní v důsledku opakovaného zahřívání. Růst množství produktů se v tomto okamžiku dále zpomalí, výsledkem je tzv. plató efekt a množství amplikonů vzniklých v každém cyklu již není úměrné množství templátu. Jinými slovy, každý amplikon v reakci dosáhne dříve či později maximální možné koncentrace (vzhledem k citlivosti detektoru pro jeho fluorescenci). Klíčem k určení původního množství templátové DNA ve vzorku je tedy vyhodnocení počáteční fáze qPCR reakce před dosažením oblasti plata. K tomu právě slouží kontinuální monitorování fluorescence v průběhu reakce. Na počátku reakce zůstává signál fluorescence na úrovni pozadí a její vzrůst není detekovatelný (cca cykly 1-18 na obrázku), ačkoli množství PCR produktu vzrůstá exponenciálně. V nějaký okamžik se v reakci nahromadí tolik produktu, že jeho fluorescence je již detekovatelná. Cyklus, ve kterém tento jev nastane, se označuje Cq (quantification cycle) nebo CT.(threshold cycle). Protože tento cyklus nastává vždy v exponenciální fázi, kde není žádná složka reakce limitována, může být použit (na základě standardních křivek) pro výpočet počátečního množství templátové DNA v reakci. Je-li na počátku v reakci mnoho templátové DNA, stačí relativně málo cyklů na to, aby se namnožilo dost produktu, jehož fluorescence vzroste nad stanovenou úroveň pozadí (threshold, obvykle 10x fluorescence pozadí). Naopak u malého množství vstupní DNA musí proběhnout více cyklů k dosažení požadované úrovně fluorescence.

Amplifikační křivka qPCR, tedy závislost fluorescence vzorku na amplifikačním cyklu

- 22 -

Typické provedení qPCR zahrnuje amplifikaci sériového ředění vzorku (někdy v multiplikátech). To umožňuje i u vzorku s neznámou koncentrací DNA určit efektivitu amplifikace. K určení koncentrace (absolutní kvantifikace) je nutno použít standardní přímku. Zpravidla je vytvořena tak, že je provedeno sériové naředění vzorku o známé koncentraci a s těmito vzorky je provedeno qPCR. Standardní přímka je poté závislost získaného CT na logaritmu startovacího množství templátu. Je-li tato křivka lineární (korelační koeficient R2 > 0.985), lze přistoupit k hodnocení efektivity amplifikace. Ideálně použijeme-li např. desítkové ředění, měly by se hodnoty CT z takto ředěných templátů lišit o 3,32 (protože je-li 2n=10, pak n=3,32). Jsou-li všechny křivky posunuty o stejnou hodnotu, standardní křivka bude lineární a její směrnice bude -3,32. Efektivita je pak počítána jako , akceptovatelné hodnoty jsou cca 80-110%. Existuje i kvantifikace relativní, používaná např. při sledování genové exprese (tedy ne ve forensních vědách), pracuje s tzv. komparativním CT, tedy srovnává CT dvou různých templátů.

Závislost CT na ředění templátu qPCR (desítkové), lineární proložení i efektivita amplifikace jsou blízké ideálu

Analýza křivky tání se zejména u provedení s interkalačním barvivem (SYBR Green) často používá po ukončení amplifikačních cyklů. Spočívá v ochlazení reakční směsi na cca 55 °C a poté její pomalý záhřev na 95°C za současného měření fluorescence. Každá disociace významné subpopulace amplikonů v důsledku teplotou indukovaného odtržení dvou řetězců se projeví poklesem fluorescence reakční směsi (interkalační barva se nemá kam navázat a volně v roztoku má 1000x menší intensitu fluorescence), analýzou křivky tání lze tedy určit - 23 -

počet různých produktů i odhadnout jejich velikost (nejlépe viditelné na závislosti poklesu fluorescence na teplotě). V extrémně přesné variantě tzv. HRM (z angl. High Resolution Melt, tedy tání s vysokým rozlišením) slouží tato analýza k odhalení bodových mutací (teplota tání pro pár A-T je jiná, než pro pár G-C).

600,00

500,00

-d(RFU)/dT

400,00

300,00

vzorek NTC

200,00

100,00

0,00 55,00

65,00

75,00

85,00

95,00

105,00

Teplota (°C)

Křivky tání vzorku s jedním majoritním produktem a netemplátové kontroly

Forensní analýza DNA

3.6.

V lidském genomu je cca 25 000 genů, které tvoří zhruba 25 % genomu, 75 % DNA je tzv. extragenová DNA. Cca 50 % genomu je tvořeno repetitivní DNA. Co se týče diverzity, je důležité si uvědomit, že za 6 milionů let, které uplynuly ve vývoji druhu Homo sapiens a šimpanze (našeho nejbližšího zvířecího příbuzného) od společného předka, divergovaly naše genomy o pouhých cca 5% (jinými slovy 95 % genomu máme totožného jako šimpanzi). Za 150 000 let historie druhu Homo sapiens jako takového došlo jen k drobné diverzifikaci genomu a tak 99,9% genomu mají všichni lidé stejný. Naštěstí existují v lidském genomu dobře charakterizované oblasti, které jsou dostatečně variabilní a staly se cílem forensní genetiky.

Cílem analýzy DNA ve forensních oborech je většinou srovnání vzorků DNA a nalezení vysoce pravděpodobné shody nebo její vyloučení mezi porovnávanými vzorky. Lidský genom obsahuje proměnlivé oblasti, v takovém případě hovoříme o tzv. polymorfismu. Charakter těchto polymorfismů, stejně tak i jeho rozšíření, může být různý. Může se jednat malé sekvenční rozdíly (např. substituce nebo delece na úrovni několika nukleotidů) nebo - 24 -

o rozsáhlejší strukturní změny. Polymorfismy se mohou nacházet kdekoliv v genomu tj. v genových, tak i mimogenových oblastech. Je nutné upozornit, že se pojem alela, která je definována jako forma genu, v posledních letech s intensivním rozvojem molekulárních metod analýzy a bioinformatiky mění (to platí i o definici pojmu „genu“). Alelu lze tedy dnes definovat jako formu dané oblasti DNA, kterou sdílí aspoň jedno procento populace. Z výše řečeného, bychom neměli pojem alela pro mimogenové oblasti vůbec používat, což však není dodržováno. Lépe je hovořit o polymorfismu v lokusu (lokus je přesná pozice na chromosomu, ve které se vyskytuje příslušný gen nebo daná oblast DNA). Z hlediska výskytu polymorfismů dělíme lokusy následovně: i. ii.

iii.

Nepolymorfní lokusy – jsou to nevariabilní oblasti DNA. Podstatou jejich konzervativnosti je silný selekční tlak jejich správné (precizní) biologické funkce. Nízce až středně polymorfní lokusy – v určité populaci (tj. geograficky vymezená skupina jedinců téhož druhu, např. Homo sapiens) se daný lokus nachází pouze v několika sekvenčních variantách. To je charakteristické především pro geny. Vysoce polymorfní, nebo-li také multialelické lokusy se v populaci vyskytují v mnoha variantách (až řádově desítky forem). Tento jev je charakteristický zejména pro mimogenové oblasti DNA.

Ve forensní praxi analýze se nejčastěji k identifikaci DNA využívají následující polymorfismy: i.

ii.

VNTR minisatelity – tandemové repetice s typickou délkou základního motivu 6100 párů nukleotidů (z angl. Variable Number of Tandem Repeats). Počet potenciálních alel je velmi vysoký, např. lokus MS1 má relativně krátkou repetici 9bp, ale vyskytuje se v rozsahu 100-2000 repeticí, tzn., existuje cca 2000 různých možných alel tohoto lokusu. VNTR se v minulosti hojně využívaly pro forensní práci, ale byly překonány. Hlavním důvodem je zejména požadavek na relativně velké množství nefragmentované DNA nutné k analýze, navíc interpretace VNTR profilů může být problematická. STR mikrosatelity – krátké tandemové repetice (z angl. Short Tandem Repeats) s typickou délkou základního motivu 2-7 nukleotidů, tento motiv se opakuje v určitém místě DNA a je obklopen nevariabilní sekvencí, na kterou je možno navrhnout primery (celková délka motivu je potom typicky 50-300 bp). Pro profilování lidské DNA (HID – Human IDentification) se využívá víceméně výhradně pouze STR s tetra- nebo nově pentanukleotidovou repeticí. Jednotlivé alely se označují číslem, vyjadřujícím počet opakování základního motivu. Některé alely nejsou tvořeny celým počtem opakování, tzn. existuje X úplných opakování a poté část X+1 opakování, takové alely označujeme jako tzv. mikrovarianty, značíme je počtem úplných opakování, následuje tečka a počet nukleotidů z následujícího neúplného motivu. Do forensní praxe byly zavedeny v polovině 90. let a jistě v ní ještě nějakou dobu setrvají, neboť dobře splňují základní požadavky forensního markeru: jejich amplifikace je robustní, lze je získat ze široké škály biologického materiálu, výsledky získané v různých - 25 -

iii.

laboratořích je možno snadno porovnat, vykazují vysoký stupeň diskriminace (zejména využívá-li se multiplex analýzy, čili současné analýzy několika lokusů), jsou citlivé, pro úspěšnou analýzu stačí jen několik buněk, je relativně levné STR profil získat, v genomu je mnoho STR a vypadá to, že nejsou pod selekčním tlakem (tj. zřejmě se nebudou v důsledku vývoje měnit). SNP – jednonukleotidové polymorfismy (z angl. Single Nucleotide Polymorphism), spočívající ve změně jediného nukleotidu na přesné pozici sekvence. Z principu tedy vyplývá, že u každého SNP lokusu mohou být maximálně čtyři alely (A, C, G, T), většina SNP lokusů má však pouze dvě varianty výskytu v celé populaci (bialelický lokus). Výsledkem je daleko větší pravděpodobnost náhodné shody, pro dosažení potřebného stupně spolehlivosti je třeba testovat více SNP lokusů (pro dosažení stejného stupně spolehlivosti jako při analýze 10 STR je potřeba analyzovat 50-80 SNP). SNP vznikají nejčastěji v důsledku mutace během buněčného dělení a jsou velmi časté (ačkoli existují rozdíly i mezi chromosomy – chromosom 1 má jednu SNP průměrně každých 1450 bp, zatímco chromosom 19 každých 2180bp). Ve forensní praxi se SNP využívají takřka výhradně pro analýzu mitochondriální DNA, mají však velký potenciál v jiných aplikacích.

Pro forensní identifikaci se používají vysoce polymorfní lokusy (v populaci existuje několik variant – alel), pokud možno s vyváženou frekvencí výskytu (jedna z alel není v populace extrémně rozšířená v porovnání s ostatními). Krom vhodné délky základního motivu je též podmínkou, aby testované lokusy nebyly ve vazbě, ideálně tedy lokalizovány na různých chromosomech. Z etických důvodů je dále podmínkou, aby testovaný lokus (resp. nějaká z jeho alel) nevypovídal něco o možném onemocnění profilované osoby. Obecně je samozřejmě praktické, používá-li se na světě stejná sada lokusů a výsledky lze potom mezi sebou porovnávat (v praxi asi 4 nejpoužívanější sady, které se v mnoha zařazených lokusech shodují: CODIS (13 autozomálních lokusů), The Expanded US Core Loci (+5), The European Standard Set (7), The Extended European Standard Set (+5)). Genotyp STR pak může vypadat:   

u každého lokusu na nepohlavním chromosomu má každý konkrétní jedinec dvě alely (buď shodné, pak se jedná o homozygota, nebo rozdílné u heterozygota) u lokusu na X chromosomu má muž vždy jen jednu alelu, žena má dvě alely u lokusu na Y chromosomu má muž jedinou alelu, žena žádnou (některé Y-STR lokusy jsou zdvojeny na Y chromosomu, každá kopie může mít jiný počet opakování)

- 26 -

Identifiler® Amelogenin D2S1338 vWA D16S359 D8S1179 D21S11 D18S51 TH01 FGA D13S317 CSF1PO D7S820 TPOX D5S818 D2S1338 D19S433

PowerPlex® 16 Amelogenin D2S1338 vWA D16S359 D8S1179 D21S11 D18S51 TH01 FGA D13S317 CSF1PO D7S820 TPOX D5S818 Penta D Penta E

Porovnání lokusů ve dvou nejběžněji používaných komerčních soupravách firem Applied Biosystems a Promega

Struktura tří různých typů běžně používaných lokusů

Součástí standardní sady je rovněž lokus pro amelogenin. Lokus je přítomen jak na X, tak na Y chromosomu, přičemž verze genu na chromosomu X má 6bp deleci, která umožňuje určení pohlaví osoby, jejíž DNA je profilována (u ženy detekujeme jediný fragment ze dvou - 27 -

totožných X chromosomů, u muže detekujeme dva různé fragmenty, lišící se o 6bp, z X a Y chromosomu). Po amplifikaci STR polymorfismů je třeba velmi přesného určení délky produktu, některé STR alely se liší o jediný pár bazí. K tomuto účelu se dá použít gelová elektroforéza, separující za denaturačních podmínek v rozsahu 20- 500 nukleotidů s potřebným rozlišením. Produkty se ale nesmějí velikostí překrývat, což limituje počet multiplexovatelných lokusů. Proto byla zavedena technika značení primerů pomocí fluorescenčních barev. Nejnovější komerční soupravy používají až šest různých barev, připojených kovalentně na 5´konec primerů, tvořících multiplex, což umožňuje odlišit podobné délky produktů různými barvami, vyžadována je samozřejmě příslušná instrumentace, tj. nejčastěji kapilární analyzátor, využívající elektroforetické separace v kapiláře naplněné lineárním polymerem polyakrylamidu s následnou detekcí fluorescenčních barev pomocí laseru. Cca 1 µl produktu PCR reakce je smíchán s 10-20 µl deionizovaného formamidu a je přidán interní standard. Formamid spolu se zahřátím vzorku na 95 °C zajistí denaturaci DNA, tj. převedení PCR produktů do jednořetězcové podoby. Vzorek je elektrokineticky nasán do tenké kapiláry a je vloženo napětí. Všechny nabité molekuly včetně amplifikovaných DNA fragmentů a molekul standardu migrují kapilárou k anodě, přičemž se pohybují polymerem uvnitř kapiláry a dělí se podle velikosti. Tvorbě sekundárních struktur v průběhu dělení je zabráněno použitím močoviny a 2-pyrrolidinonu v polymeru a též udržováním konstantní teploty cca 60 °C. Na konci kapiláry je malé skleněné okno, kterým svítí argonový laser a excituje procházející PCR produkty, značené fluorescenční barvou. Emitované světlo je poté zachyceno CCD kamerou a zaznamenáno ovládacím softwarem.

Alelický rozsah systému PowerPlex 16 firmy Promega, použití 3 fluorescenčních barev pro odlišení podobně velkých PCR produktů a srovnání s interním standardem

Tzv. raw data jsou poté zpracována softwarem s použitím mobility interního standardu (tj. komerční směsi fragmentů o známé délce), tím je kompenzován i případný rozdíl mezi jednotlivými experimenty, způsobený drobnými odchylkami v migraci v důsledku např. odlišné teploty. Výsledkem je elektroforeogram se sadou píků, reprezentující různé zkoumané - 28 -

alely (software měří rovněž výšku a plochu píku). Další pomocí při finálním vyhodnocení je analýza tzv. alelického žebříku, což je komerčně dostupná směs všech možných alel, vztahujících se ke konkrétní komerční soupravě, tato směs nemůže být na rozdíl od interního standardu přidávána přímo do vzorku, zpravidla tvoří samostatně analyzovaný vzorek v souboru vzorků. K jednotlivým píkům se pak přiřadí alely, případně se z analýzy vyloučí (nespadají-li do rozmezí +/- 0,5 bp v alelickém žebříku). Konečným výstupem je tedy profil, ve kterém byly všechny alely přiřazeny. STR profil jedné osoby je identický nezávisle na metodologických odchylkách při jeho získání, rovněž stejné lokusy musí vyjít stejně, ač jsou v různých komerčních sadách.

Příklad části alelického žebříku systému PowerPlex 16

Vyhodnocení vzniklého profilu vyžaduje jistou úroveň zkušenosti, obzvláště v komplikovanějších případech jako je velmi malé množství vstupní DNA, degradovaná DNA nebo směsný vzorek ze dvou a více jedinců. - 29 -

Koktavý pík. Vznik tzv. koktavého píku (z angl. stutter peak) je specifickou chybou při amplifikaci STR lokusů (zejména těch kratších), podstatou je prokluz polymerasy. Polymerasa běžně během replikační aktivity odpadá od templátu a zase se na něj navazuje. V určitém procentu případů po odpadnutí přisedne na templát o jeden motiv dále, než odpadla, takže výsledný produkt je o jeden motiv kratší (z toho též vyplývá, že nejnáchylnější jsou k této chybě lokusy s jednoduchými repeticemi). V elektroforeogramu se tento jev projeví jako menší pík, předsazený před vlastní alelu o délku jednoho motivu. U standardního množství nepoškozené templátové DNA netvoří toto tzv. zadrhávání významnější problém, protože k němu dochází maximálně v 15 % případů a lze ho tak snadno odlišit (menší pík), u degradovaného nebo směsného vzorku však může významně zkomplikovat výslednou interpretaci.

Elektroforeogram s koktavým píkem po amplifikaci lokusu s 2bp motivem

Zdvojení píku. Některé polymerasy (např. Taq polymerasa) přidávají na konec nově syntetizovaného řetězce DNA jeden nukleotid navíc, který není řízen templátem, zhruba v 85 % případů se jedná o adenin. Je tedy důležité si uvědomit, že většina PCR produktů bude mít tento nukleotid navíc. Pokud však polymerasa nevykazuje optimální aktivitu nebo je ve směsi příliš mnoho templátové DNA, budou existovat dvě významné populace DNA, z nichž jedna bude o jeden nukleotid delší, to se na elektroforeogramu projeví jako zdvojení píku. To může být problém u analýzy alel, které se liší pouze o jediný nukleotid, většinou lze ale tento jev potlačit prodlouženou finální inkubací PCR směsi (aby měla polymerasa čas všude nukleotid přidat). Další častější problematické jevy. Dvě alely heterozygotního lokusu by měly v profilu mít stejně vysoké píky pro obě různé alely. Může ale nastat případ tzv. nerovnováhy píků, kdy jeden z píků je významně nižší než druhý. V extrémním případě se výška jednoho z píků přiblíží úrovni šumu a v profilu zmizí úplně, pak hovoříme o ztrátě alely (tzv. drop-out). Dojde-li ke ztrátě obou alel nějakého lokusu, hovoříme o ztrátě lokusu (locus drop-out). K těmto případům dochází zejména v případech extrémně malého nebo extrémně velkého množství DNA ve vzorku. Sluší se zmínit i případ tzv. drop-in, čili přítomnosti píků navíc, to - 30 -

je způsobeno amplifikací kontaminace zejména u degradovaných vzorků. Degradace vzorku je ve forensní analýze častý jev, mnoho míst činu je objeveno až po dnech, týdnech i letech a vnější vlivy mohou způsobit degradaci DNA. To vede k charakteristickému profilu, ve kterém jsou dobře amplifikovány krátké lokusy, zatímco lokusy s velkou délkou se nedaří namnožit (degradovaná DNA je fragmentována a úsek, obsahující jak lokus, tak konzervativní okolí, na jehož sekvenci jsou navrženy komplementární primery, se ve vzorku vyskytuje málo). Pro účely analýzy degradovaných vzorků DNA byly vyvinuty speciální multiplexy, ve kterých jsou primery navrženy co nejblíže k repeticím STR, čímž se sníží velikost amplikonu. Statistická interpretace STR profilu. Chce-li analytik tvrdit, že dva získané DNA profily jsou velmi pravděpodobně totožné, musí určit pravděpodobnost, neboli stupeň důvěry v takové tvrzení či hypotézu. K tomu mu slouží znalosti populační genetiky a statistická analýza dat. Frekvence alel pro určitý lokus jsou jiné pro různé populace, jak dokumentuje následující graf. U europoidů (též kavkazoidní populace, tzv. „běloši“) je v lokusu TH01 nejpravděpodobnější alelou 9.3 nebo 6, zatímco alela 10 je výjimkou.

Frekvence alel lokusu TH01 u různých populací

Příklad: Mějme podezřelého bělocha, analyzujme nejprve lokus D3S1358. Podezřelý má jednu alelu 16 (alelická frekvence u bělochů 0,253) a jednu alelu 17 (frekvence u bělochů 0,215) (identifikaci alel jsme zjistili pomocí PCR s použitím primerů specifických pro lokus D3S1358 a elektroforetickou separací vzniklých produktů). V tomto lokusu je tedy tato - 31 -

kombinace alel u bělochů velmi častá, frekvence takové kombinace je 2 x (0,253) × (0,215) = 0,109. Jinými slovy, zhruba jeden z 10 bělochů má tuto kombinaci alel a tento lokus tedy příliš ve vyloučení podezřelých nepomohl. Přidejme lokus TH01 a řekněme, že v tomto lokusu je podezřelý homozygotem se dvěma alelami 10 (frekvence u bělochů pouhých 0,008), alelická frekvence je tedy (0,008) × (0,008) = 0,000064. Jinými slovy pouze jeden z asi 15 600 bělochů má tuto frekvenci alel v lokusu TH01. Kombinací lokusů D3S1358 a TH01 získáme u podezřelého frekvenci (0,109) × (0,000064) = 0,000007. Jinými slovy pouze jeden ze 150 000 bělochů bude mít tuto kombinaci alel v těchto dvou lokusech. Čím více lokusů vyhodnotíme, tím menší bude potenciální okruh podezřelých, jak ukazuje následující tabulka: Výpočet pravděpodobnosti náhodné shody při analýze 7 lokusů – hypotetický profil STR lokus Identifikova Alelická Frekvence v lokusu u bělochů ná alela frekvence vzorec Frekvence u bělochů v lokusu (z databáze populačních studií) D3S1358 16 p = 0,253 2pq 0,109 17 q = 0,215 TH01 10 p = 0,008 p2 0,000064 10 TPOX 8 p = 0,535 2pq 0,044 12 q = 0,041 FGA 21 p = 0,127 2pq 0,034 23 q = 0,134 CSF1PO 11 p = 0,301 2pq 0,058 13 q = 0,096 D8S51 14 p = 0,137 2pq 0,010 19 q = 0,038 D21S11 28 p = 0,159 2pq 0,062 29 q = 0,195 Kombinovaná frekvence Celkové RMP (Random Match Probability) = 0,109×0,000 3,75×10-13, frekvence konkrétní kombinace alel v lokusu D3S1358 064 neboli jeden x frekvence alel v lokusu TH01 x frekvence alel ×0,044 atd. z bilionu (tisíc v lokusu TPOX atd. miliard)

- 32 -

4.

PROTOKOLY

PROTOKOL 1: ISOLACE GENOMOVÉ DNA FENOL-CHLOROFORMOVOU EXTRAKCÍ

Chemikálie a roztoky:                  

sterilní destilovaná voda 30% peroxid vodíku 1M Tris-HCl (roztok), pH 8,0 1M Tris-HCl (roztok), pH 9,0 0,5M EDTA dvojsodná sůl (roztok), pH 8,0 6,5M chlorid sodný (roztok) 100% ethanol 70% ethanol Proteinasa K, zásobní roztok 20 mg/ml (rozpusťte 100 mg proteinasy K v ml sterilní deionisované vody, skladujte rozdělené po 1 ml mikrozkumavkách při -20 °C) 1M dithiothreitol (DTT) (roztok). Fenol (roztok) (+ lahev s ekvilibračním pufrem o pH 8,0) Chloroform:isoamylalkohol, směs v poměru 24:1 3M acetát sodný, pH 5,2 10% dodecylsíran sodný – SDS (roztok) 1M chlorid vápenatý (roztok) Extrakční pufr (EB): 10mM Tris-HCl, pH 8,0; 10mM EDTA disodná sůl,pH 8,0; 100mM chlorid sodný; 2% dodecylsíran sodný. Extrakční pufr pro vzorky vlasů (EBH): 10mM Tris-HCl, pH 8,0; 10mM CaCl2; 100mM chlorid sodný; 2% dodecysíran sodný Sterilní Petriho misky

Pozn. Všechny druhy extrakcí DNA ze vzorku musí být prováděny ve šroubovacích 1,5ml ;mikrozkumavkách (společnost Sarstedt)

Při práci s roztoky fenolu používejte ochranné brýle a rukavice, jedná se o žíravou látku s potenciálním karcinogenním potenciálem Operace s chloroformem provádějte v zapnuté digestoři. Odpad v obou případech skladujte v označených nádobách

- 33 -

Postup: A. Isolace DNA z typů buněk a znečištěného materiálu mimo vlasů, kostí a spermií. 1. Ke vzorku přidejte 500 l extrakčního pufru a 20 l roztoku proteinasy K (20 mg/ml). 2. Směs intensivně promíchejte na vortexu a inkubujte při teplotě 56 °C za neustálého míchání (30 – 120 min). 3. Ke směsi (buněčnému lyzátu) přidejte stejný objem ekvilibrovaného fenolu (pH 8,0), intensivně ji vortexujte (10 – 15 s) a nakonec centrifugujte 10 min při maximálních parametrech × g používané centrifugy. Pozn. Fenol je škodlivá sloučenina. Jedná se o vysoce korozivní látku, která může způsobit popálení kůže nebo poškození oděvu. Při práci s fenolem a jeho směsmi je nutné používat ochranné prostředky, jako jsou rukavice, ochranné brýle a laboratorní plášť. Veškeré operace musí být prováděny v zapnuté digestoři. Veškerý odpad (kapalný i pevný) musí být skladován v označených odpadních nádobách.

4. Odpipetujte horní vodnou fázi do nové 1,5ml mikrozkumavky obsahující 0,5 ml chloroformu a mikrozkumavku uzavřete. Pozn. Je důležité, aby dvě fáze z předchozího kroku (vodní a organická) byly po centrifugaci zcela odděleny. Při jejich separaci je nutné postupovat opatrně, aby nedošlo ke zvíření mezifázové oblasti obsahující precipitované proteiny. Aby nedošlo ke kontaminaci vodné fáze obsahující požadovanou DNA, je doporučeno ponechat trochu vodné fáze nad mezifázovým prostorem.

5. Intensivně směs vortexujte a následně 10 min centrifugujte při maximálních parametrech × g používané centrifugy. 6. Odpipetujte horní vodnou fázi do nové mikrozkumavky a přidejte 50 μl 3M acetátu sodného (pH 5,2). 7. Ke směsi dále napipetujte 800 μl 100% ethanolu, směs intensivně vortexujte a inkubujte nejméně 1,5 h při -20 °C. Pozn. Acetát sodný slouží k okyselení vodné fáze obsahující DNA, to je prováděno za účelem její kompletní protonace. Důvodem je to, že protonovaná DNA snadno precipituje v přítomnosti 70% ethanolu; účinnost precipitace DNA je pak vyšší při teplotě -20 °C, přičemž doba precipitace může být prodloužena pro maximální výtěžek až na dobu 12 h. Na druhou stranu je nutné poznamenat, že kromě DNA mohou precipitovat i anorganické soli, a množství jejich precipitátů se také zvyšuje s rostoucím časem a klesající teplotou.

8. Peletujte precipitát DNA centrifugací 30 min při maximálních parametrech × g používané centrifugy. 9. Opatrně odstraňte supernatant (odpipetováním, vakuovou odsávačkou) a peletu DNA resuspendujte v 1 ml 70% ethanolu. 10. Centrifugujte suspensi precipitátu DNA při maximálních parametrech × g používané centrifugy po dobu 20 min.

- 34 -

11. Opatrně odsajte supernatant a peletu DNA vysušte po dobu 10 min při pokojové v otevřené mikrozkumavce. Pozn. Pokud má používaná mikrozkumavka separovatelné víko, je nutné ho v průběhu sušení pelety DNA skladovat ve sterilní Petriho misce.

12. Rozpusťte peletu DNA v 50 μl pufru 10mM Tris-HCl (pH 9,0). B. Extrakce DNA ze vzorku vlasu. B1. Do 2ml mikrozkumavky se šroubovacím víčkem (Sarstedt) napipetujte 500 μl extračního pufru pro vzorky vlasů (EBH) a vložte do ní odstřižený vlas

B2. Ke vzorku napipetujte 20 μl roztoku proteinasy K (20 mg/ml) a 20 μl 1M roztoku dithiothreitolu. B3. Dále postupujte dle protokolu A od kroku 2.

C. Isolace DNA ze vzorku obsahující směs spermií a epiteliálních buněk. C1. Ke vzorku přidejte 500 l extrakčního pufru a 20 l roztoku proteinasy K (20 mg/ml). C2. Směs intensivně vortexujte (10 – 15 s) a 30 min inkubujte při teplotě 37 °C za neustálého míchání. C3. Vyjměte agregovaný kontaminant pinzetou, která byla vysterilizována 10% peroxidem vodíku a směs centrifugujte při maximálních parametrech g používané centrifugy po dobu 5 min. Pozn. Při uchopení sraženiny pinzetou je nutné ji více stisknout pro vytlačení kapaliny, aby nedocházelo ke ztrátám roztoku obsahující isolovanou DNA.

C4. Po centrifugaci opatrně odeberte supernatant („nespermatická“ frakce obsahující DNA epiteliálních buněk) do nové mikrozkumavky a pokračujte dále dle protokolu A od kroku 2. C5. K peletě spermií přidejte 1 ml sterilní vody a intenzivně vzorek vortexujte (10 – 15 s), následně suspensi 5 min centrifugujte při maximálních hodnotách × g používané centrifugy. C6. Odsajte supernatant a operaci opakujte 2 x.

- 35 -

C7. K peletě promytých spermií přidejte 500 l extrakčního pufru, 20 l roztoku proteinasy K (20 mg/ml) a 20 l 1M roztoku DTT a pokračujte dále dle protokolu A od kroku 2.

- 36 -

PROTOKOL 2: ISOLACE GENOMOVÉ DNA S POUŽITÍM NOSIČE CHELEX® 100 Následující protokol popisuje isolaci DNA ze směsi epiteliálních buněk a spermií. Pro oddělení DNA z těchto typů buněk se používá diferenciální lyse, jejímž principem je to, že epiteliální buňky jsou snadno lysovány v přítomnosti proteinasy K za neredukujících podmínek, zatímco spermie zůstávají intaktní. Povaha vzorku: vzorkem může být vaginální výtěr od ženy, u které je podezření na znásilnění, kontaminovaný kus látky spermatem, atd. Následující protokol je také použitelný pro isolaci DNA ze vzorků obsahující stopy krve nebo epitelů. Chemikálie a roztoky:      

 

20% Chelex® 100 (suspense v destilované vodě) 5% Chelex® 100 (suspense v destilované vodě) 1M DTT (vodný roztok) 0,39M DTT (vodný roztok) Proteinasa K (20 mg/ml ve vodě) Extrakční pufr: 320 μl premix extrakčního pufru (1mM Tris báze, 12mM EDTA, 125mM NaCl, pH 8,0) 40 μl 20% SDS 40 μl 0,39 M DTT TE -4 pufr (10mM Tris-HCl, 0,1mM EDTA, pH 8,0) Destilovaná sterilní voda prostá nukleas

Postup: 1. Vložte vzorek do 1,5ml sterilní mikrozkumavky Pozn. Povaha vzorku může být různá. Může se jednat např. o tkaninu, stěrový tampon nebo část tkáně. V každém případě je nutné použít takové množství výchozího materiálu, aby obsahoval co nejvíce zdroje DNA. Na druhou stranu je nutné mít na paměti, že materiál může být nežádoucím zdrojem inhibičních kontaminant PCR v obdrženém vzorku DNA.

2. Ke vzorku napipetujte 0,8 – 1 ml sterilní deionisované vody a vzorek mírně vortexujte (10 – 12 s). 3. Vzorek inkubujte 30 min při pokojové teplotě za občasného promíchání mírným převrácením nebo vortexováním. 4. Vyjměte nebiologickou matrici testovaného vzorku (např. kus látky nebo stěrového tamponu) a vložte ji do centrifugačního filtru nasazeného na 1,5ml mikrozkumavce 5. Filtr 3 min centrifugujte při 15 000 × g při laboratorní teplotě.

- 37 -

6. Vyjměte centrifugační kolonku se vzorkem a vložte ji do nové mikrozkumavky. Vzorek uschovejte. 7. V proteklé frakci: jestliže je přítomna peleta, dávejte pozor (!), aby nedošlo k jejímu zvíření. Odeberte téměř všechen supernatant tak, aby ho cca 50 l nad buněčnou peletkou zbylo. Odebraný supernatant může být uschován pro případnou budoucí analýzu nebo být vyhozen do příslušného odpadu. 8. Resuspendujte peletu ve zbytkovém supernatantu. V této fázi může být 1 – 4 l vzorku analyzováno pomocí mikroskopie pro zjištění zda obsahuje dostatek biologického materiálu. Pozn. Osahuje-li vzorek málo biologického materiálu (buněk), může být část původního materiálu (např. tkaniny, stěrového tamponu) zpět do buněčné suspense. 9. Ke vzorku přidejte následující roztoky: 500 l extrakčního roztoku (nebo TE pufru) 5 l proteinasy K (20 mg/ml) pozn. Objemy roztoků mohou být podle potřeby proporcionálně zvýšeny

10. Směs opatrně promíchejte a 30 min inkubujte při teplotě 37 °C. Pozn. čas lyse buněk „nespermatického“ původu lze prodloužit až na dobu 2 h. Při delší době může docházet i již k částečné lysi spermií. 11. Centrifugujte směs při 10 000 × g po dobu 5 min při laboratorní teplotě (peletace spermií) 12. Opatrně odpipetujte supernatant do nové sterilní 1,5ml mikrozkumavky. V tomto kroku je nutné zabránit zvíření pelety spermií a nad jejich peletou ponechat cca 50 l supernatantu. 13. Kolektovaný superatant obsahuje lysované epitheliální buňky a budeme ho nadále nazývat F-frakce (Female). 14. Na každých 150 l F-frakce přidejte 50 l 20% suspense Chelex® 100. 15. Peletu spermatických buněk budeme dále nzývat M-frakce (Male) 16. Peletu M frakce (spermií) mírně resuspendujte v 1 ml štěpícího pufru (vortex). 17. Suspensi 5 min centrifugujte při 10 000 × g po dobu 5 min při laboratorní teplotě. 18. Odstraňte supernatant a přibližně 50 l ho ponechte nad peletkou spermií. Pozn. tyto kroky slouží k odstranění zbytkových epiteliálních buněk a v závislosti na jejich počtu je doporučeno tento cyklus opakovat 2 – 3 x.

- 38 -

19. Promyjte následovně spermatické buňky: a. Mírně resuspendujte peletované spermie v 1 ml sterilní deionisované vody (vortex). b. Suspensi spermií 5 min centrifugujte při 10 000 × g při laboratorní teplotě. c. Opatrně odstraňte supernatant a přibližně 50 l ho opět ponechte nad peletkou spermií. Pozn. tento krok slouží k odstranění zbytku štěpícího pufru obsahující SDS, které může inhibovat PCR. 20. Resuspendujte peletu spermií v 50 l supernatantu a přidejte následující roztoky: 150 l 5% suspense Chelex® 100 1 l Proteinasy K (20 mg/ml) 7 l 1M roztoku DTT 21. Směs F a M frakce intenzivně vortexujte po dobu 15 s. 22. Vzorky 10 s centrifugujte. 23. Inkubujte vzorky (F a M frakci) při teplotě 37 – 56 °C po dobu 30 – 60 min. 24. Inkubujte vzorky 8 min při teplotě 100 °C (vroucí lázeň nebo teplotní box). 25. Vzorky intenzivně vortexujte po dobu 10 s., následně 3 min centrifugujte při 500 × g při laboratorní teplotě. 26. Přepipetujte supernatant do nové sterilní 1,5 mikrozkumavky Tento vzorek představuje roztok isolované DNA, u kterého lze v případě potřeby její koncentraci zvýšit pomocí centrifugačních ultrafiltrů. Isolovaná DNA může být do doby její analýzy skladována při teplotě 4 °C. Pro dlouhodobé skladování je nutné ji zamrazit nebo lyofilizovat.

- 39 -

PROTOKOL 3: ISOLACE DNA

POMOCÍ KOMERČNÍ SOURAVY

„QIAAMP® DNA

ISOLATION MINIKIT“

Následující protokol je určen pro purifikaci celkové DNA (genomové, mitochondriální a virové) z bukálního stěru za pomocí komerční souopravy QIAamp® DNA isolation minikit (výrobce QIAGEN, katalogové číslo: 51104). Tato komerční souprava je standardem v isolaci DNA v laboratoři zabývající se identifikací DNA ze vzorků lidských tkání. Isolovaná DNA je vhodná pro následnou analýzu kvantitativního PCR a STR s vysokým poměrem signálu k šumu. Výhodou této komerční soupravy je relativně jednoduché zpracování velkého množství vzorků současně ve velmi krátkém čase (20 – 30 min). Isolovaná genomová DNA je tomto způsobu isolace fragmentována na úseky DNA o délce 20 – 30 kbp. Fragmenty DNA o této délce pak velmi snadno denaturují v průběhu tepelného cyklu, což je důležité pro efektivní průběh PCR. Metoda pro isolaci DNA využívá silikátový nosič. Materiál, chemikálie, přístroje:              

nastavitelné pipety v rozsahu 2 – 20 l a 20 - 200 l špičky k automatickým pipetám sterilní 2 a 1,5ml mikrozkumavky stojánek na 1,5ml mikrozkumavky permanentní fixa odpadní sáček laboratorní páska ochranné rukavice mikrocentrifuga Vortex vodní lázeň stojánek na 1,5ml mikrozkumavky PBS 96% ethanol (čistota pro UV spektroskopii)

o Jednotlivé položky v komerční soupravě (kitu) DNA isolation Blood Minikit (kat. č. 51104) Původní název

překlad

množst ví

QIAamp Mini Spin Ionexová centrifugační Column kolonka nebo jen kolonka Collection Tubes (2 ml) 2ml mikrozkumavka Buffer AL* Pufr AL Buffer AW1* Pufr AW1 (concentrate) Buffer AW2** PufrAW2 - 40 -

50 ks 150 ks 12 ml 19 ml 13 ml

(concentrate) Buffer AE QIAGEN® Protease

Pufr AE Proteasa (K)

Protease Solvent Pufr pro proteasu Pozor: *) obsahuje chaotropní látky **) obsahuje azid sodný (jed!) jakožto konzervační látku.

15 ml 1 lahvička 1,2 ml

Před započetím isolace DNA musí být připraveno následující: o Vzorek pro isolaci chromosomální DNA musí být odebrán následovně: nejméně 6x otřete stěrový tampón (swab) silně na každé straně vnitřní líce v ústech. Pokud nebude bezprostředně prováděna isolace DNA, musí být stěr nejméně 2 h vysušen na vzduchu pro zabránění bakteriální degradace vzorku. Je nutné, aby osoba, u které je výtěr prováděn, nejméně 30 min před stěrem nejedla ani nepila. o Připravte vodní lázeň o teplotě 56 °C o Ohřejte pufr AE nebo destilovanou vodu na laboratorní teplotu (15 - 25 °C) pro eluci DNA v posledním kroku. o Zkontrolujte, zda byly pufry AW1, AW2 a vzorek proteasy připraveny dle instrukcí daných výrobcem. o Jestliže je v pufru AL přítomen precipitát, zahřejte ho na teplotu 56 °C, aby se precipitát rozpustil. Postup:

Upozornění: po celou dobu isolace DNA používejte rukavice a dbejte na to, aby nedošlo ke kontaminaci vašeho vzorku cizorodou DNA. 1. Vložte stěrový tampón se stěrem do 2 ml mikrozkumavky a napipetujte k němu 550 l pufru PBS. Pozn. Ve většině případů je manipulační tyčka v blízkosti stěrového tampónu zúžena, takže lze tampon v mikrozkumavce uvolnit mírným tlakem na tyčku, čímž dojde k jejímu přelomení.

- 41 -

2. Ke vzorku přidejte 37 l (alternativně 20 μl) roztoku proteasy (proteinasa K) a 550 l pufru AL. Bezprostředně po té vzorek intensivně promíchejte 15 s na vortexu. Pozn. V žádném případě nepřidávejte roztok proteasy přímo k pufu AL. Pro účinnou buněčnou lysi a výtěžek DNA je nezbytné přidat pufr AL ke vzorku co nejdříve.

3. Vzorek inkubujte 20 min (alternativně 30 min) při teplotě 56 °C, následně ho mírně centrifugujte, aby došlo k odstranění kondenzačních kapek na víčku mikrozkumavky. 4. Přidejte ke vzorku 550 l ethanolu a intenzivně ho vortexujte (10 s). Nakonec vzorek mírně centrifugujte (odstranění roztoku z víčka mikrozkumavky). 5. Vyjměte mikrocentrifugační ionexovou kolonku z obalu a vložte do 2 ml mikrozkumavky. Víčko kolonky je nutné označit.

6. Opatrně převeďte 600 l směsi do ionexové centrifugační kolonky. Pozor, dávejte pozor, aby při této operaci nedošlo ke kontaminaci okrajů kolonky. Zavřete víčko a 1 min centrifugujte kolonku při 6000 × g. Po skončení centrifugace přendejte kolonku do nové 2 ml centrifugační mikrozkumavky a použitou mikrozkumavku s filtrátem přesuňte do odpadního pytlíku. Pozn. Aby se zabránilo tvorbě aerosolu, je nutné, aby víčko na kolonce bylo při centrifugaci zavřené.

- 42 -

7. Opakujte 2 x předcházející krok pro zbytek směsi (dalších 600 l a následně zbytek). Po skončení třetí centrifugace přendejte kolonku do nové 2 ml mikrozkumavky. Mikrozkumavku se swabem vhoďte do odpadního pytlíku. 8. Opatrně otevřete kolonku (víčko) a přidejte 600 l pufru AW1 (pozor: opět dbejte na to, aby nedošlo ke kontaminaci okrajů kolonky). Zavřete víčko a 1 min centrifugujte kolonku při 6 000 × g. Po této operaci přendejte kolonku do nové 2 ml mikrozkumavky a použitou mikrozkumavku i s filtrátem opět vyhoďte do odpadního pytle. 9. Opatrně otevřete víčko na kolonce a napipetujte 600 l pufru AW2 (pozor: opět dbejte na to, aby nedošlo ke kontaminaci okrajů kolonky). Zavřete víčko a 3 min centrifugujte kolonku při maximálních hodnotách × g používané centrifugy.

10. Vložte kolonku do nové 1,5 ml mikrozkumavky, opatrně otevřete víčko na kolonce a přidejte 200 l pufru AE (nebo destilované vody). Dále 1 min inkubujte kolonku při laboratorní teplotě a následně centrifugujte 2 min při 6000 × g. 11. Po skončení centrifugace kolonku vyhoďte do odpadního pytlíčku a 1,5ml mikrozkumavku s eluovanou DNA dobře uzavřete. Ihned zkontrolujte, zda je vzorek DNA náležitě označen. Pozn. Eluce DNA z kolonky nižším objemem pufru AE může významně zvýšit její koncentraci v eluátu. Na druhou stranu může dojít ke snížení jejího celkového množství. V některých případech, kdy je žádoucí dosáhnout co nejvyššího výtěžku DNA, je její eluce z kolonky prováděna opětovně 150 l pufru AE. Tento krok však není doporučován, jestliže je DNA používána jako templát při PCR. Pro dlouhodobé skladování DNA je vhodné provést eluci DNA pufrem AE (tedy nikoli vodou) a skladovat ji při teplotě – 20 °C. - 43 -

Do protokolu:    

Stručně popište princip izolace DNA pomocí silikátového nosiče (co se děje v jednotlivých krocích) Připojte řádně popsaný elektroforeogram Uveďte naměřenou koncentraci izolované DNA V závěru diskutujte naměřenou koncentraci a čistotu DNA a také výsledek elektroforesy. Čím může být případně způsobena malá koncentrace získané DNA?

- 44 -

PROTOKOL 4: DEMONSTRACE

ANALÝZY

RFLP

VZORKŮ

Z MÍSTA

ČINU

A PODEZŘELÝCH OSOB.

Metoda RFLP (z angl. Restriction Fragment Length Polymorphism) je založena na principu detekce délky fragmentů DNA po působení specifické restrikční endonukleasy. Tato metoda již v současné době není při identifikaci osob používána, neboť je časově náročná a je také náročnější na vyhodnocení. U této metody je nutné isolovat celkovou genomovou DNA nebo její specifický úsek pomocí PCR. DNA je následně kompletně štěpena vhodnými restrikčními endonukleasami a délka generovaných fragmentů DNA je následně určena pomocí agarosové elektroforézy. Tím získáváme tzv. charakteristický profil původní DNA, neboli „otisk jejího palce“ (angl. DNA-fingerprint). Obecně lze metodu RFLP používat při identifikaci jedinců v rámci jednoho druhu nebo identifikaci rodů resp. jednotlivých druhů. Přestože je v současnosti tato technika metodicky překonána, stále nachází své místo tam, kde je o sekvenci DNA daného druhu málo informací. Materiál, pomůcky a chemikálie (na stole):  nastavitelné pipety v rozsahu 2 – 20 l a 20 - 200 l  špičky k automatickým pipetám  barevné centrifugační mikrozkumavky (zelená, modrá, oranžová, fialová, růžová, žlutá)  stojánek na 1,5ml mikrozkumavky  permanentní fixa  odpadní sáček  laboratorní páska  ochranné rukavice (latexové, nitrilové) ----------------------------------------------------Vzorky DNA (společné pro čtveřici): DNA z místa činu (označeno CS - crime scene) DNA izolovaná z podezřelých osob (ozn. S - suspect DNA), celkem 5 vzorků (S1-5) Směs enzymů EcoRI a PstI (1 mikrozkumavka označená ENZ do dvojice) -----------------------------------------------------Dále na pro všechny studenty o inkubátor (37 °C) o mikrocentrifuga Postup: 1. Pracujte ve dvojicích 2. Barevné mikrozkumavky na víčku označte (číslo skupiny) a ponechte je ve stojánku. 3. Vždy novou špičkou napipetujte 10 l odpovídající DNA do mikrozkumavky příslušné barvy:

- 45 -

Označení DNA

Barva zkumavky zelená

CS

modrá

S1

oranžová

S2

fialová

S3

růžová

S4

žlutá

S5

Dbejte na to, aby se vzorek DNA nacházel na dně zkumavky. 4. Do každé barevné mikrozkumavky napipetujte vždy novou špičkou 10 l směsi restrikčních endonukleas (ENZ). Opatrně promíchejte s DNA jemným propipetováním (cca 3 x). 5. Mikrozkumavku pevně uzavřete a jemným poklepáním prstem její obsah promíchejte. Použijte mikrocentrifugu pro přenesení restrikční směsi ze stěn mikrozkumavky na její dno (500 × g, 30 s). 6. Mikrozkumavky inkubujte 45 min při teplotě 37 °C v inkubátoru. Alternativně lze restrikční směs inkubovat přes noc při laboratorní teplotě. 7. Po ukončení inkubace (restrikčního štěpení) vložte mikrozkumavky do lednice. 8. Proveďte analýzu pomocí 1% agarosové elektroforesy (smíchejte 20 μl vzorku s 10 μl vzorkového pufru a naneste 15 μl této směsi).

Do protokolu:   

Stručně popište princip RFLP. Jaké polymorfismy jsou využívány? Jakého původu jsou enzymy využívané při této metodě? Proč se tato metoda pro identifikace jedince již příliš nepoužívá? Připojte řádně popsaný elektroforeogram Identifikujte pachatele

- 46 -

PROTOKOL 5: ELEKTROFORESA DNA V AGAROSOVÉM GELU Materiál, pomůcky a chemikálie (na stole):                 

Elektroforetická aparatura (elektroforetická vana) Hřebínek Stojánek na nalévání gelu (díl B) nosič na agarosový gel (díl A) zdroj stejnosměrného proudu plošný zdroj UV záření (transluminátor, detekční vlnová délka 250 – 360 nm)·s příslušným dokumentačním zařízením elektroforetický pufr (10× koncentrovaný TBE pufr o složení na 1 litr: 54 g Tris, 27,5 g kyseliny borité, 20 ml 0,5M EDTA a pH upraveným na hodnotu pH 8,0) agarosa pro molekulární biologii ethidium bromid - EtBr (10 mg/ml ve vodě) Automatická pipeta v rozsahu 2 - 20 l marker délek DNA ve vzorkovém pufru (1 g/5 l) destilovaná voda ochranné rukavice odpadní sáček odměrný válec 500 ml kádinka Vzorkový pufr (pro nanášku vzorku DNA) – (složení na 1 ml: 800 l formamid, 100 l deionizované vody, 100 l koncentrátu směsi bromfenolové a xylencyanolové modři)

Postup: 1. Vložte nosič na agarosový gel do stojánku pro jeho nalévání a pevně utáhněte fixační šrouby. 2. Do příslušné polohy nosiče agarosového gelu vložte vhodný formát hřebínku pro tvorbu nanášecích jamek pro vzorky DNA. 3. Pomocí vodováhy a aretačních šroubů upravte polohu stojánku do horizontální polohy.

4. Následovně připravte 1% agarosový gel: a. Navažte 0,3 g agarosy do 250 ml Erlenamayerovy baňky a přidejte 30 ml 1 x koncentrovaného pufru TBE. b. Zahřejte suspensi k bodu varu a udržujte ji v tomto stavu, dokud nedojde k úplnému rozpuštění krystalků agarosy (cca 1 – 2 min). - 47 -

Pozn. Pro záhřev lze použít mikrovlnou troubu nebo plynový kahan.

Pozor: je nutné dodržovat následující bezpečnostní opatření, aby nedošlo k Vašemu popálení. Horké roztoky agarosy velmi snadno pění a mohou tak vykypět vně baňky nebo intensivně vystříknout. Z tohoto důvodu se při promíchávání suspense agarosy v průběhu jejího rozpouštění nesmí nikdy mířit hrdlem baňky směrem k Vašemu obličeji nebo vašich spolupracovníků. Při promíchávání suspense agarosy během jejího rozpouštění obtočte papírový ubrousek okolo hrdla baňky nebo použijte ochranné rukavice. c. V průběhu rozpouštění agarosy dochází k vypařování vody, čímž se mění koncentrace složek pufru a agarosy. V případě, že provádíme přípravu malého množství agarosového gelu mohou být tyto změny významné a proto je nutné po navážce agarosy na předvážkách celou suspensi s baňkou zvážit a po jejím rozpuštění doplníme destilovanou do původní hmotnosti. Pozn. Roztok agarosy lze skladovat při teplotě 55 °C ve vodní lázni po delší dobu, čehož se využívá pro usnadnění práce v případě, že je agarosová elektroforesa prováděna ve více opakováních v průběhu dne(í). d. Do ochlazeného roztoku agarosy na teplotu 55 – 75 °C přidejte 3 l roztoku ethidum bromidu (10 mg/ml).

Pozor(!). Ethidium bromid je karcinogenní látka. Při práci s ethidium bromidem používejte rukavice Veškerý odpad musí skladován v nádobách tomu určených. Pozn. Přítomnost ethidium bromidu přímo v agarosovém gelu nám umožní bezprostřední vizualizaci DNA pomocí UV záření po ukončení elektroforézy. Je nutné však upozornit, že ethidiový kation také migruje v průběhu elektroforézy a to opačným směrem než molekula DNA, jmenovitě ke katodě. Výsledkem někdy může být nerovnoměrné probarvení gelu a DNA. e. Nalejte roztok agarosy do prostoru nosiče agarosového gelu. Doba tuhnutí gelu je při laboratorní teplotě přibližně 30 minut. 5. Po ztuhnutí agarosového gelu vytáhněte hřebínek a povolte těsnící šroub stojánku. Vyjměte agarosový gel s nosičem a vložte ho do elektroforetické aparatury tak aby jamky byly blíže katodě (ve většině případů je tato elektroda vyznačena na elektroforetické aparatuře černou barvou). 6. Oba elektrodové prostory opatrně vyplňte 1 x TBE pufrem a dále dolévejte pufr tak aby jeho hladina byla cca 0,5 – 1 cm nad povrchem agarosového gelu. 7. V mikrozkumavce (nebo na parafilmu) smíchejte 20 μl vzorku DNA s 10 μl vzorkového pufru. 8. Pomocí automatické pipety naneste do jamek 15 μl takto připraveného vzorku DNA. - 48 -

Pozn. Nanáška vzorku DNA se provádí následovně: napipetujeme DNA do špičky, kterou umístíme bezprostředně nad ústí jamky a opatrně dávkujeme vzorek. Rychlé pipetování může způsobovat rozvíření vzorku a vložení špičky přímo do jamky její protržení. Pro lepší zřetelnost jamek lze pod elektroforetickou aparaturu (průhlednou) vložit černý papír (desku). 9. Vložte víko na elektroforetickou vanu a kabely vložte do zdroje napětí ve správné orientaci (kladná elektroda je na opačné straně než nanesené vzorky DNA v jamkách) 10. Nastavte vhodnou hodnotu konstantního napětí na zdroji (5 V/cm) a zahajte elektroforézu. Pozn. Příliš vysoké napětí snižuje rozlišovací schopnost elektroforézy a kvalitu elektroforeogramu. 11. Po skončení elektroforézy opatrně vyjměte opatrně nosič s agarosovým gelem na podnos.

Pozor(!). Použijte nitrilové rukavice a zabraňte kontaminaci pracovní plochy pufrem obsahujícím ethidium bromid.

12. Mírným tlakem opatrně z přední strany vysuňte gel na plošný zdroj UV záření (transluminátor) a pomocí příslušného dokumentačního systému udělejte snímek při vhodné časové expozici a elektroforeogram v elektronické formě uložte do paměti počítače.

- 49 -

PROTOKOL 6: ZJIŠTĚNÍ DÉLKY LOKUSU APOB V CHROMOSOMÁLNÍ DNA

Materiál, pomůcky a chemikálie (na stole): pufr pro Taq polymerasu (10 x) koncentrovaný Taq polymerasa (5 U/l) Pmix (2,5 pmol/l každý) Směs deoxynukletidtrifosfátů (1 mM každý) genomová DNA (5 ng/l)

Pozor! Při manipulaci se složkami PCR a zejména se vzorky DNA je nutné postupovat velmi opatrně, aby se zamezilo kontaminaci vzorků DNA (zejména kožním epithelem). Je tedy praktické jednotlivé složky rozdělit nezávisle po malých objemech (tzv. alikvoty), které budou použity pouze jednou.

Vždy používejte laboratorní rukavice (optimální je také používat špičky s filtrem, což zabrání kontaminaci vnitřku pipety vznikajícím aerosolem).

1. Vložte dvě PCR 200 l mikrozkumavky zkumavky do stojánku a náležitě ji označte na vrchu víčka. V jedné mikrozkumavce bude namíchána kompletní směs na PCR (ozn. +), zatímco ve druhé nebude přidána chromosomální DNA. 2. Napipetujte následující složky do PCR mikrozkumavky v uvedeném pořadí. Do kontrolní reakce nepřidávejte DNA.

objem (l)

Složka Směs: 2,5 x konc. pufr pro Taq polymerasu a Taq

Pozn. Pozn. 1

polymerasa (0,1 U/l)

8

Pmix (2,5 pmol/l každý)

4

Pozn. 2

Směs deoxynukletidtrifosfátů (1 mM každý)

4

Pozn. 3

- 50 -

genomová DNA (5 ng/l)

4

Celkový objem

20

Pozn. 4

Pozn. 1. Každý druh termostabilní DNA polymerasy má doporučený pufr, ve kterém je zaručena její maximální aktivita. Nejčastěji se dodávají pufry 10 x koncentrované. V konečné PCR směsi zaručí, že je systém dostatečně pufrován (nejčastěji 10 – 50mM Tris-HCl, pH 8,3 – 9). Často jsou součástí pufru stabilizační látky jako je gelatin nebo BSA, dále pak neionogenní detergenty (Tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100). V praxi je nutné se vždy přesvědčit, zda používaný pufr obsahuje zdroj hořečnatých iontů. Složení 1 x koncentrovaného pufru pro Taq polymerasu je následující: 10 mM Tris-HCl; 50mM KCl; 1,5mM MgCl2, 0,001 % gelatin. Je nutné dodat, že je koncentrace hořečnatých iontů má vliv na specifitu a výtěžek PCR reakce. Kromě přímého vlivu hořečnatých iontů na aktivitu a přesnost DNA polymerasy, také ovlivňují hodnotu hybridizační teploty (Tm). Je nutné mít na paměti, že koncentraci volných hořečnatých iontů (tzv. efektivní koncentrace) ovlivňuje také hodnota koncentrace deoxynukleotidtrifosfátů, templátové DNA nebo chelatační látky (EDTA). Při nízké koncentraci hořečnatých iontů je negativně ovlivněn výtěžek, naopak při jejich vysoké koncentraci může docházet k nespecifické amplifikaci. Mělo by být pravidlem, že pro každý nově používaný pár primerů má být provedeno „optimalizační“ PCR v rozmezí koncentrací hořečnatých iontů 0,5 – 5 mM po kroku 0,5 mM. Pozn. 2. Primery jsou v současnosti dodávány celou řadou firem, většinou v suchém stavu ve formě peletky v mikrozkumavce. Primery je tedy před jejich použitím nutné rozpustit ve vodě prosté nukleas nebo TE pufru (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8) většinou na jejich výslednou koncentraci 100 M. V této formě se nejčastěji skladují v zamraženém stavu při -20 °C. Obecně je doporučováno udělat několik alikvotů primerů, aby se zabránilo jejich kontaminaci. Při tvorbě PCR směsi je nejčastěji připravována tzv. směs primerů, která je 10 50 x koncentrována ve srovnání s jejich výslednou koncentrací v PCR směsi. Pozn. 3. Celková koncentrace deoxynukleotidtrifosfátů (dNTP) by se měla pohybovat v rozmezí 80-800 M (20 – 200 M pro každý, tj.dCTP, dATP. dTTP a dGTP). Pro výtěžek PCR není potřeba zvyšovat koncentraci (tj. i množství) dNTP, je dobré si uvědomit, že např. inkorporací 15 nmol vede k produkci 5 g DNA, což je množství zcela dostačující pro jako analytické účely tak i účely genového inženýrství. Vysoká koncentrace dNTP (nad 800 M) vede k chybné inkorporaci nukleotidů do amplifikované DNA. Pozn. 4. Z určitého pohledu není kvalita DNA tak kritickým parametrem pro správný průběh PCR jako v případě jiných aplikací. V některých případech je však nutné zohlednit jak dlouhý úsek DNA je amplifikován; v případě dlouhých amplikonů může intensivní fragmentace templátové DNA negativně ovlivnit výsledek PCR. Podobně je nutné také zohlednit obsah GC v templátové DNA a v případě jejich vyššího obsahu také prodloužit dobu denaturace při PCR. Je doporučeno používat 107 x více (molárně) primerů než templátové DNA. Obecně platí, že pro úspěšný výsledek PCR dostačuje 50 fM koncentrace templátové DNA, což přibližně odpovídá ~ pg plasmidové DNA, ~ ng bakteriální chromosomální DNA a ~ g lidské chromosomální DNA na 100 l PCR reakce. Za určitých podmínek však může být pro amplifikaci dostačující pouze jediná buňka.

- 51 -

V některých protokolech je doporučováno míchat PCR směs na ledu, to je však nejčastěji prováděno jestliže jsou používány tzv. proofreadingové polymerasy, které vykazují 3´-5´ exonukleasovou aktivitu. 3. Dobře PCR směs promíchejte jejím propipetováním, zkumavku. V případě, že se část PCR směsi nachází na stěnách mikrozkumavky, krátce ji centrifugujte při nízkých hodnotách g. 4. Na termocykléru nastavte následující parametry teplotního programu: 1x

95 °C

4 min

počáteční denaturace

32 x

58 °C

1 min

hybridizace primerů

72°C

1 min

elongace primeru (extenze)

95 °C

40 s

denaturace

Záhřev víka: příkaz „lid ON“. Pozn: Víčka PCR zkumavek je průběhu PCR třeba zahřívat na teplotu vyšší než je teplota denaturace (cca o 5 -10 °C více), aby na nich nedocházelo ke kondensaci vodních par. Jejich kondensace by měla za následek změnu složení reakční směsi, což by negativně ovlivnilo výsledek PCR (její kvantitu a specifitu, tj. citlivost a spolehlivost). Vzhledem k tomu, že v případě použití chromosomální DNA jakožto templátu se používá počáteční denaturace při 94 – 98 °C po dobu 5 – 10 min, je nutné, aby počáteční denaturace započala až po zahřátí víka. Pozn. Dříve, kdy nebyly k disposici termocykléry, se PCR směs převrstvovala parafinovým olejem, aby nedocházelo k nežádoucímu odpařování. 5. Vložte PCR mikrozkumavky s reakční směsí do termocykléru a zahajte teplotní program. 6. V průběhu PCR připravte odpovídající agarosový gel. 7. Po skončení PCR vyjměte mikrozkumavky do stojánku a přidejte k ní 5 l vzorkového pufru pro agarosovou elektroforézu. Směs je nutné homogenizovat propipetováním. 8. 5 – 10 l vzorku analyzujte na agarosové elektroforéze, použijte odpovídající marker délek DNA.

- 52 -

PROTOKOL 7: DEMONSTRACE

ANALÝZY

VNTR

VZORKŮ

Z MÍSTA

ČINU

A PODEZŘELÝCH OSOB.

Analýza VNTR (z angl. Variable Number Tandem Repeat) je metoda založená na specifické amplifikaci variabilního úseku DNA a následném porovnání různých délek těchto amplikonů pomocí elektroforézy. Z historického pohledu jde o překonanou metodou analýzy, zejména kvůli požadavku na relativně velké množství nefragmentované DNA nutné k analýze, ale svého času byla mocným nástrojem forensní identifikace. Demonstrovat ji budeme na identifikaci podezřelého, jehož DNA byla nalezena na místě činu. Směs pro amplifikaci můžete míchat buď z jednotlivých složek, nebo využít tzv. master mix – směs všech složek, potřebných pro úspěšnou amplifikaci, tj. nukleotidů (dNTP), pufru pro udržení pH a iontové síly a MgCl2, Taq polymerasy a barevného roztoku primerů. Směs je třeba udržet v chladu (tj. na ledu) až do okamžiku přídavku DNA, resp. do zahájení amplifikace. Materiál, pomůcky a chemikálie (na stole):  nastavitelné pipety v rozsahu 2 – 20 l a 20 - 200 l  špičky k automatickým pipetám  barevné mikrozkumavky 2 ml (zelená, modrá, oranžová, fialová, růžová žlutá) obsahující DNA  bezbarvé mikrozkumavky s oranžovým roztokem (AL, LD)  stojánek na mikrozkumavky  permanentní fixa  odpadní sáček  laboratorní páska  ochranné rukavice (latexové, nitrilové)  PCR mikrozkumavky (0,2 ml) ----------------------------------------------------DNA z místa činu (označeno CS - crime scene) DNA izolovaná z podezřelých osob (ozn. A, B, C, D - celkem 4 vzorky) Legenda značení mikrozkumavek CS vzorek DNA z místa činu (crime scene) - fialová A vzorek DNA podezřelého A – zelená B vzorek DNA podezřelého B – modrá C vzorek DNA podezřelého C – oranžová D vzorek DNA podezřelého D - růžová MMP směs reakční směsi pro PCR včetně primerů (master mix + primers) žlutá AL alelický žebříček (allelic ladder) LD vzorkový pufr (loading dye) Postup:

- 53 -

1. Prověřte přítomnost šesti barevných mikrozkumavek na ledu a pěti prázdných PCR mikrozkumavek ve stojánku 2. Označte jednotlivé PCR zkumavky CS, A, B, C, D spolu s číslem skupiny 3. S použitím mikropipet a špiček přeneste do příslušně označené PCR mikrozkumavky 20 μl DNA z příslušné barevné zkumavky. Pro každou DNA použijte novou špičku. 4. S použitím mikropipet a špiček přeneste do všech PCR mikrozkumavek 20 μl roztoku MMP (žlutá mikrozkumavka, modrý roztok, vydá vám asistent, do té doby musí být směs na ledu!) a zamíchejte pipetováním. Pro každé pipetování použijte novou špičku. V každé z pěti PCR mikrozkumavek byste po tomto kroku měli mít 40 μl modrého roztoku. 5. Zavřené mikrozkumavky udržujte na ledu až do okamžiku zahájení PCR. Zkontrolujte, že se obsah zkumavky nachází na jejím dně. Pokud tomu tak není, pokuste se ho sklepnout nebo zkumavky krátce centrifugujte. 6. Program pro PCR: iniciační denaturace denaturace

94°C 2min

amplifikace

94°c

denaturace

finální extense

1x

30sek \

hybridizace

52°C 30sek -

extense

72°C 1min /kbp

extense

72°C 10min

uchování před zpracováním

35x

1x

12°C do elektroforézy

7. Zahajte PCR amplifikaci (cca 2 hod). 8. Po dokončení programu vypadá mikrozkumavka stejně, jako před jejím zahájením. Pro analýzu směsi musíte DNA vizualizovat, nejlépe rozdělenou dle velikosti. K tomu slouží elektroforetická separace v agarosovém gelu (viz protokol 5). Spolu s PCR produkty budete na gel nanášet i alelický žebříček (mikrozkumavka AL), který reprezentuje všechny možné alely amplifikovaného lokusu, to bude váš standard, s nímž budete porovnávat mobilitu fragmentů jednotlivých vzorků. Po provedení

- 54 -

elektroforézy a vizualizaci byste v dráze alelického žebříčku měli vidět 8 fragmentů, odpovídající alelám 15, 10, 7, 5, 4, 3, 2 a 1 (řazeno dle mobility shora dolů). 9. Dle protokolu 5 sestavte aparaturu a připravte 3% agarosový gel. 10. Do každé z pěti PCR mikrozkumavek s vašimi vzorky (CS, A-D) přidejte mikropipetou 10 μl vzorkového pufru (oranžový, zkumavka označená LD) a zamíchejte pipetováním. Pro každé pipetování použijte novou špičku. POZOR, nezaměňte za zkumavku AL, která rovněž obsahuje oranžový roztok. 11. Pomocí automatické pipety naneste do jamek 15 μl všech vzorků i alelického žebříčku č. dráhy 1 2 3 4 5 6

vzorek alelický žebříček místo činu podezřelý A podezřelý B podezřelý C podezřelý D

objem 15 μl 15 μl 15 μl 15 μl 15 μl 15 μl

12. Po provedení separace vyhodnoťte mobilitu fragmentů v jednotlivých vzorcích, identifikujte alely jednotlivých podezřelých i alely ze vzorku z místa činu č. dráhy

vzorek

1

alelický žebříček

2

místo činu

3

podezřelý A

4

podezřelý B

5

podezřelý C

6

podezřelý D

počet viditelných proužků na gelu

jaké alely jsou přítomny?

Do protokolu:   

Stručně popište princip VNTR Připojte řádně popsaný elektroforeogram a vyhodnocenou tabulku (počet a typ alel) Identifikujte pachatele

- 55 -

PROTOKOL 8: DEMONSTRACE

VLIVU KONCENTRACE NA VÝSLEDNÉM CT PŘI

KVANTITATIVNÍM PCR

Kvantitativní PCR se v principu ničím neliší od klasické amplifikace během PCR, tzn. je potřeba templátová DNA, primery vymezující amplifikovaný úsek (nebo úseky), deoxyribonukleotidtrifosfáty jako stavební kameny a polymerasa ve vhodném pufru. Průběh reakce a vznik amplikonů je však při qPCR sledován za běhu (real-time), zpravidla pomocí nárůstu (nebo poklesu) fluorescence, který je zpravidla úměrný množství dvouřetězcové DNA v reakci. V této úloze si budeme demonstrovat vliv koncentrace, resp. stupně naředění základního vzorku na posun CT v průběhu reakce, fluorescenčním reagens bude SYBR Green. Materiál, pomůcky a chemikálie (na stole):  nastavitelné pipety v rozsahu 2 – 20 l a 20 - 200 l  špičky k automatickým pipetám  mikrozkumavka se vzorkem DNA (A, B, C nebo D)  mikrozkumavka obsahující barevný roztok SYBR Green premixu a primerů (qMM)  voda prostá nukleas pro ředění  stojánek na mikrozkumavky  permanentní fixa  odpadní sáček  laboratorní páska  ochranné rukavice (latexové, nitrilové)  qPCR mikrozkumavky nebo stripy

Postup: 1. Budete pracovat ve dvojicích. V rámci čtveřice u jednoho stolu si vyberte od asistenta jeden ze vzorků DNA (A, B, C nebo D) 2. Připravte si čtyři mikrozkumavky (1,5 ml), do kterých budete provádět sériové ředění zvoleného vzorku. Zkumavky označte písmenem vzorku a číslem od 1 do 4 3. V rámci čtyřčlenné skupiny si jedna dvojice zvolí ředění 1:10, druhá dvojice ředění 1:2, toto zvolené ředění zachovávejte v celé sérii. 4. Pro ředění 1:10 Do každé z označených zkumavek pipetujte 450 μl vody prosté nukleas. Do zkumavky č. 1 pipeptujte 50 μl koncentrované templátové DNA, promíchejte intenzivním vortexováním. Novou špičkou přeneste 50 μl takto vzniklého roztoku do zkumavky č. 2 a opět promíchejte vortexováním. Novou špičkou přeneste 50 μl takto vzniklého roztoku do zkumavky č. 3 a promíchejte vortexováním. Zkumavka č. 4 obsahuje pouze vodu a slouží jako kontrola bez templátu.

- 56 -

Příklad ředění DNA vzorku A 1:10 označení vzorku finální ředění A1 1/10 A2 1/100 A3 1/1 000 A4 kontrola bez templátu

4. Pro ředění 1:2 Do každé z označených zkumavek pipetujte 20 μl vody prosté nukleas. Do zkumavky č. 1 pipeptujte 20 μl koncentrované templátové DNA, promíchejte intenzivním vortexováním. Novou špičkou přeneste 20 μl takto vzniklého roztoku do zkumavky č. 2 a opět promíchejte vortexováním. Novou špičkou přeneste 20 μl takto vzniklého roztoku do zkumavky č. 3 a promíchejte vortexováním. Zkumavka č. 4 obsahuje pouze vodu a slouží jako kontrola bez templátu. Příklad ředění DNA vzorku A 1:2 označení vzorku finální ředění A1 1/2 A2 1/4 A3 1/8 A4 kontrola bez templátu

5. Nyní si připravte qPCR zkumavky (strip, destička), každý ze čtyř vzorků budeme analyzovat v duplikátu pro snížení vlivu chyb při pipetování (celkem tedy 8 jamek). Zkumavky můžete označit číslem skupiny, zásadně ale na stěnu, NIKOLI na víčko. Přes víčko bude v průběhu qPCR probíhat detekce fluorescence. 6. S použitím mikropipet a špiček přeneste do příslušné mikrozkumavky/jamky stripu/destičky 12,5 μl DNA z příslušné vzorkové zkumavky. Pro každý vzorek DNA použijte novou špičku.

Příklad pipetování vzorků A do stripu 7. Nyní si od asistenta nebo z nádoby s ledem vezměte do dvojice mikrozkumavku označenou qMM, obsahující qPCR premix s primery. 8. Pipetujte 12,5 μl roztoku qMM do každé z osmi reakcí a pečlivě promíchejte pipetováním. Snažte se nevytvořit bubliny, mohly by interferovat s optickou detekcí v průběhu qPCR. Pro každé pipetování použijte novou špičku. 9. Zavřete strip víčkem a udržujte na ledu až do okamžiku zahájení qPCR. - 57 -

10. Program pro qPCR: iniciační denaturace

denaturace

94°C 2min

amplifikace

denaturace

94°C 30sek \

hybridizace

52°C 30sek -

extense

72°C 1min /

1x

40x

po každém extensním kroku je zařazen krok sběru dat (změření fluorescence v každé jamce) proměření křivky tání amplikonů55°C - 95°C po 0,5°C, sběr dat každých 10 sec

Rychlejší alternativou, která ale neumožní amplifikaci delších alel, je program: 94 °C

2 min

94 °C

10 s

52 °C

30 s

(1 x)

(40 x) – probíhá annealing a extenze zároveň + sběr dat

11. Spusťte amplifikaci, sledujte v reálném čase. Vzorek DNA nejméně ředěný (např. A1) bude mít nejmenší CT, zatímco nejpozději dosáhne úrovně nad pozadím vzorek bez templátové DNA (který ale bude amplifikovat dimery primerů). Vyhodnoťte rovněž počet poklesů na křivce tání, odpovídající počtu amplikonů. 12. Chcete-li si ověřit, že výsledkem amplifikace je stejná směs amplikonů, jako v protokolu 7, přidejte po skončení qPCR do každé jamky 6 μl vzorkového pufru a analyzujte směs pomocí elektroforesy v agarosovém gelu. Do protokolu:     

Stručně popište princip real-time PCR, čím se liší od „obyčejné“ PCR a k čemu slouží Uveďte, s jakou DNA (A-D) jste pracovali a jaké ředění jste použili (1:10 či 1:2). Uveďte také zdrojová data a příklady výpočtů. Grafy řádně popište (osy, řady i název grafu). Z vašich dat vytvořte amplifikační křivky (závislost intenzity fluorescence na počtu cyklů). Vytvořte křivky tání (závislost první derivace fluorescence na teplotě). Odpovídá počet amplikonů počtu získanému při úloze 7, kde jste amplifikovali a pomocí agarosové elektroforesy vizualizovali stejnou DNA (A-D)? Do dalšího grafu vyneste CT v závislosti na logaritmu ředění (3 ředění). Použijte k tomu průměr CT (v souboru s daty označené „Cq mean“).

- 58 -



R2 a vypočítejte efektivitu amplifikace . O čem tyto hodnoty vypovídají, v jakých rozmezích by se měly pohybovat a jak tomu bylo ve vašem případě? Uveďte

koeficient

- 59 -

PROTOKOL 9: KVANTIFIKACE

AUTOSOMÁLNÍ A

Y-CHROMOSOMÁLNÍ DNA

POMOCÍ KOMERČNÍ SOUPRAVY PLEXOR HY

Kvantifikace Y-chromosomální (tedy mužské) DNA na pozadí autosomální (tedy celkové lidské) DNA umožňuje pomocí qPCR určit přesnou koncentraci amplifikovatelné DNA (tedy DNA použitelné pro STR analýzu) v širokém rozsahu koncentrací až do minima 6,4 pg. Pokud je tedy DNA izolována z forensních vzorků, jako jsou kosti, zuby, či staré vzorky, kde není jisté, zda je po isolaci obsaženo dostatečné množství amplifikovatelné DNA bez kontaminantů, které by mohly amplifikaci inhibovat, je výhodné použít nejprve tuto soupravu a až poté přistoupit k amplifikaci STR lokusů pomocí výrazně dražší soupravy PowerPlex. DNA izolovaná z bukáln+ího stěru má zpravidla požadovanou koncentraci i čistotu a lze tak použít rovnou souprava PowerPlex. Systém Plexor HY je založen na principu zhášení fluoroforu při dokončení amplifikačního cyklu. Jeden z páru primerů je na 5´konci zakončen modifikovaným nukleotidem (iso-dC) a fluorescenční značkou. Reakční směs obsahuje rovněž volný iso-dG, modifikovaný zhášečem fluorescence. Polymerasa může proti templátové iso-dC zařadit pouze iso-dG, zhášeč se tak ocitne v blízkosti fluoroforu a utlumí jeho fluorescenci. Výsledkem amplifikace tak je snížení fluorescence reakční směsi.

Schéma párování standardních nukleotidů a jejich iso- modifikací

V reakční směsi jsou přítomny 3 sady primerů, značené třemi různými fluorescenčními značkami s rozdílnými spektrálními vlastnostmi (FAM pro autosomální DNA, Cal Fluor Orange 560 pro Y-chromosomální DNA, Cal Fluor Red 610 pro interně přidávaný DNA templát – kontrola inhibice amplifikace složkami vzorku), v reakci je ještě fluorofor IC5 jako zdroj normalizačního signálu. Standardní křivka je vytvořena z mužského genomického standardu v rozsahu 3,2 pg/μl až 50 ng/μl. Materiál, pomůcky a chemikálie (na stole):  nastavitelné pipety v rozsahu 2 – 20 l a 20 - 200 l  špičky k automatickým pipetám  mikrozkumavky  TE pufr  stojánek na mikrozkumavky  permanentní fixa - 60 -

    

odpadní sáček laboratorní páska ochranné rukavice (latexové, nitrilové) qPCR stripy nebo destičky vzorek vlastní izolované DNA

Postup: 1. Vzorky pro vytvoření kalibrační křivky jsou připraveny asistentem dle rozpisu Sériové ředění standardní DNA pro kalibrační křivku koncentrace objem DNA objem TE pufru 50 ng/μl neředěný standard 0 μl 10 ng/μl 10 μl neředěné DNA 40 μl 10 μl roztoku 10 2 ng/μl 40 μl ng/μl 0,4 ng/μl 10 μl roztoku 2 ng/μl 40 μl 10 μl roztoku 0,4 0,08 ng/μl 40 μl ng/μl 10 μl roztoku 0,08 0,016 ng/μl 40 μl ng/μl 10 μl roztoku 0,016 0,0032 ng/μl 40 μl ng/μl 2. Reakční směs pro každou reakční jamku je připravována dle rozpisu Rozpis složek reakční směsi na jednu reakci složka objem Plexor HY 2x Master Mix 10 μl voda, amplifikační kvalita 7 μl Plexor HY 20x Primer/IPC mix 1 μl V případě míchání reakční směsi pro více reakcí vždy míchejte cca 2 reakce navíc, abyste kompenzovali odchylky při pipetování. Je absolutně nezbytné, aby všechny reakční směsi pocházely ze stejného premixu. 3. K 18 μl reakční směsi přidávejte buď 2 μl DNA pro vzorky, 2 μl standardní DNA pro kalibrační křivku, nebo 2 μl TE pufru pro netemplátovou kontrolu. Pro kalibrační křivku budou vzorky duplikovány pro snížení vlivu chyby pipetování. 4. Uzavřete mikrotitrační destičku opticky průhlednou fólií. 5. Destičku krátce centrifugujte, abyste zajistili přemístění obsahu jamek na dno.

- 61 -

A B C D E F G H

1 2 50 50 ng/μl ng/μl 10 10 ng/μl ng/μl 2 ng/μl 2 ng/μl 0,4 0,4 ng/μl ng/μl 0,08 0,08 ng/μl ng/μl 0,016 0,016 ng/μl ng/μl 0,0032 0,0032 ng/μl ng/μl TE TE

3

4

5

6

8….

7

….12

vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek vzorek

6. Program pro qPCR: iniciační denaturace amplifikace

denaturace

95°C 30sek

1x

denaturace

95°C 5sek

\

hybridizace + extense

60°C 35sek /

38x

po každém extensním kroku je zařazen krok sběru dat (změření fluorescence v každé jamce) proměření křivky tání amplikonů55°C - 95°C po 0,5°C, sběr dat každých 10 sec 7. Spusťte amplifikaci, sledujte v reálném čase. Vyhodnoťte s použitím software. Vyhodnoťte rovněž počet poklesů na křivce tání, odpovídající počtu amplikonů.

- 62 -

PROTOKOL

10:

MULTIPLEX

AMPLIFIKACE

CHROMOSOMÁLNÍ

DNA

STR POMOCÍ

LOKUSŮ

Z ISOLOVANÉ

KOMERČNÍ

SOUPRAVY

POWERPLEX 16. Multiplex PCR, čili amplifikace šestnácti různých krátkých tandemových repeticí, rozmístěných po genomu lidské DNA, je vyvrcholením forensní analýzy. Výsledkem je DNA profil, jehož diskriminační síla umožňuje jedinečnou a těžko zpochybnitelnou identifikaci osoby. Powerplex 16 je systém, umožňující koamplifikaci 16 lokusů a jejich identifikaci s použitím tří fluorescenčních značek (FL, TMR, JOE). Systém zaručuje rutinní amplifikaci 0.5 – 1 ng templátu v reakčním objemu 25 μl, plného profilu lze dosáhnout i s množstvím 125 pg templátové DNA. Při nižším množství vstupní DNA hrozí jen částečná amplifikace (částečný profil), větší množství způsobuje nerovnoměrnou výšku alelických píků mezi lokusy. Prvním krokem je tedy PCR amplifikace, následuje separace amplikonů v kapilárním analyzátoru (srovnání s vnitřním standardem a alelickým žebříčkem), vyhodnocení je poté provedeno na specializovaném software. Materiál, pomůcky a chemikálie (na stole):  nastavitelné pipety v rozsahu 2 – 20 l a 20 - 200 l  špičky s filtrem k automatickým pipetám  mikrozkumavky  TE pufr  stojánek na mikrozkumavky  permanentní fixa  odpadní sáček  laboratorní páska  ochranné rukavice (latexové, nitrilové)  PCR stripy nebo destičky  vzorek vlastní izolované DNA  voda prostá nukleas  master mix (primery + polymerasa + pufr) připravený asistentem – uchovává se na ledu

Postup: 1. Vlastní DNA izolovanou v jedné z předchozích úloh nařeďte na koncentraci 1 ng/ µl. Vyjděte z koncentrace zjištěné na základě měření absorbance při 260 nm a připravte cca 30 µl takto zředěné DNA (zohledněte vaši výchozí koncentraci a výsledný objem můžete upravit tak, aby se vám vzorek dobře pipetoval, popř. koncentrace dobře počítala). Příklad výpočtu: změřená koncentrace DNA: C1 = 12 ng/ µl C1V1 = C2V2, C2 = 1 ng/ µl. Zvolím si výsledný objem 24 µl 12∙V1 = 1∙24, V1 = 2 µl. Budu tedy pipetovat 2 µl do 22 µl vody. 2. Napipetujte 1 µl vzorku zředěné DNA do stripů (vydá vám asistent). 3. Reakční premix je připraven asistentem dle rozpisu: - 63 -

Rozpis složek reakční směsi na jednu reakci o objemu 12,5 μl složka objem AmpliTaq Gold DNA-polymerasa + 2,5 μl Gold ST★R 10X pufr PowerPlex® 16 10X Primer Pair Mix 1,25 μl voda prostá nukleas 7,75 μl templátová DNA o koncentraci 1 ng/µl 1 µl 2. Asistent rozpipetuje reakční směs do mikrozkumavek (11,5 µl do každé mikrozkumavky). 3. Jako pozitivní amplifikační kontrola slouží 2800M Control DNA (součást komerční soupravy, také v koncentraci 1 ng/ µl). Jako negativní netemplátová kontrola se používá voda nebo TE pufr. 4. Po dokončení pipetování uzavřete zkumavky a krátce centrifugujte. 5. Program pro PCR: 95°C

11min

1x

96°C

2 min

1x

94°C

1min

\

60°C

1min -

10x

70°C

1.5min

/

90°C

1min

\

60°C

1min -

22x

70°C

1.5min

/

60°C

30min

1x

4°C Délka programu je přibližně 3 hodiny. 6. Detekce amplikonů s použitím kapilárního analyzátoru ABI PRISM 310 • 95°C suchý blok • 310 kapiláry, 47cm × 50μm • dělící polymer POP-4 • 10X pufr s EDTA • vzorkové zkumavky a septa • Hi-Di formamide Kvalita formamidu je kritická. Při nesprávném skladování nebo opakovaném zmražování a rozmražování dochází k rozpadu formamidu, vznikající ionty poté kompetují s DNA během elektroinjekce do kapiláry. 7. Rozmražte interní standard ILS600 a smíchejte nanášecí koktejl dle rozpisu [(1,0μl ILS 600) × počet vzorků] + [(24,0μl Hi-Di formamid) × počet vzorků] - 64 -

8. Zamíchejte vortexováním a poté smíchejte 17 μl koktejlu s 0,35 μl amplifikované DNA (nebo alelického žebříčku) 9. Krátce centrifugujte. Těsně před nanášením vzorek denaturujte 3 min při 95 °C, ihned zchlaďte 3 minuty ve vodní lázni. 10. Zkumavky vložte do autosampleru a spusťte analýzu s následujícím programem • injektáž 3 sec • injekční napětí 15 kV • napětí při dělení 15 kV • teplota při dělení 60°C • doba dělení 30 min 11. Analyzujte výsledky pomocí software GeneMapper nebo obdobného, diskutujte.

Do protokolu:      

Stručně popište princip STR (jednotlivé kroky od izolace DNA po analýzu fragmentů) Jak je s použitím soupravy PowerPlex16 zaručeno, že mohou být rozlišeny i fragmenty o velmi podobné délce? Uveďte, jaká byla výchozí koncentrace vaší DNA a jak jste postupovali při jejím ředění. Váš STR profil do protokolu nepřikládejte. Jedná se o potenciálně citlivý osobní údaj. Zhodnoťte úspěšnost analýzy (překryv s alelickým žebříčkem, příp. ztráty alel, přítomnost píků navíc). Na základě znalosti frekvence jednotlivých alel pro danou populaci (buď české populace (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19948313) nebo obecně evropské (dohledatelné na internetu)) vypočítejte pravděpodobnost, že se vyskytne osoba, která bude mít shodný profil s Vaším.

- 65 -