LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
PĜehled výsledkĤ z Referenþní laboratoĜe 1,3Hajdúch
M, 1,3Trojanec R, 2,3KoláĜ Z, 1,3Bouchalová K, 2,3Sedláková E.
1 LaboratoĜ
experimentální medicíny pĜi DČtské klinice LF UP a FN Olomouc 2 LaboratoĜ molekulární patologie pĜi Ústavu patologie LF UP a FN Olomouc 3 Referenþní laboratoĜ pro c-erbB-2, LF UP v Olomouci
LABORATOě EXPERIMENTÁLNÍ MEDICÍNY
PĜehled dosavadních zkušeností a problémĤ Detekované neshody mezi RL a LLs >1 nebo >2 IHC stupnČ, v prĤbČhu existence RL
Neshod a RL vs.LLs.
0-6 mČs. (%)
7-12 mČs. (%)
13-18 mČs. (%)
19-24 mČs. (%)
25-30 mČs. (%)
31-36 mČs. (%)
37-42 mČs. (%)
43-47 mČs. (%)
0-47 mČs. (%)
>2 IHC
14,08
19,51
12,59
19,33
31,52
30,28
22,10
35,29
21,76
>1 IHC
28,17
43,90
37,04
40,34
50,00
44,95
40,00
52,94
41,06
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE MČsíce þinnosti
FISH
0-6
7-12
13-18
19-24
25-30
31-36
Shoda mezi centrální IHC a centrální FISH
FISH + FISH -
3+ 40/42 (95,2%) 2/42 (4,8%)
IMMUNOHISTOCHEMIE 2+ 1+ 3/9 (33,3%) 3/14 (21,4%) 6/9 (66,6%) 11/14 (78,6%)
0 2/8 (25%) 6/8 (75%)
POLYSOMIE
1/42 (2,3%)
0
1/14 (7,14%)
0
SHODA FISH + FISH -
95,52% 49/49 (100%) 0
33,3% 5/12 (41,7%) 7/12 (58,3%)
78,6% 4/17 (23,5%) 13/17 (76,4%)
75% 2/30 (6,7%) 28/30 (93,3%)
POLYSOMIE
0
1/12 (8,3%)
2/17 (11,76%)
0
SHODA FISH + FISH -
100% 88/90 (97,8%) 2/90 (2,22%)
41,7% 14/14 (100%) 0
76,4% 8/34 (23,5%) 26/34 (76,5%)
93,3% 3/28 (10,7%) 25/28 (89,3%)
POLYSOMIE
3/90 (3,3%)
0
1/34 (2,9%)
0
SHODA FISH +
97,8% 77/78 (98,7%)
100% 10/12 (83,3%)
76,5% 9/28 (32,1%)
89,3% 5/40 (12,5%)
FISH -
1/78 (1,3%)
2/12 (16,6%)
19/28 (67,9%)
35/40 (87,5%)
POLYSOMIE
11/78 (14,1%)
2/12 (16,6%)
1/28 (3,6%)
1/40 (2,5%)
SHODA FISH + FISH POLYSOMIE
98,7% 55/55 (100%) 0 6/55 (10,9%)
83,3% 7/7 (100%) 0 2/7 (28,6%)
67,9% 4/10 (40%) 6/10 (60%) 2/10 (20%)
87,5% 2/42 (4,76%) 40/42 (95,2%) 7/42 (16,6%)
SHODA FISH + FISH POLYSOMIE
100% 63/67 (94,0%) 4/67 (6,0%) 4/67 (6,0%)
100% 5/13 (92,3%) 1/13 (7,7%) 2/13 (15,4%)
60,0% 4/10 (40,0%) 6/10 (60,0%) 2/10 (20,0%)
95,2% 9/49 (18,4%) 40/49 (81,6%) 5/49 (10,2%)
94,0%
92,3%
60,0%
81,4%
SHODA
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
MČsíce þinnosti
FISH
37-42
2+
1+
0
FISH +
62/62 (100%)
5/5 (100%)
6/14 (42,9%)
5/39 (12,8%)
FISH -
0/62 (0%)
0/5 (0%)
8/14 (57,1%)
34/39 (87,2%)
POLYSOMIE
10/62 (16,1%)
1/5 (20%)
1/14 (7,1%)
3/39 (7,7%)
100%
100%
57,1%
87,2%
FISH +
36/36 (100%)
6/9 (66,6%)
1/4 (25,0%)
5/29 (17,24%)
FISH -
0/36 (0%)
3/9 (33,3%)
3/4 (75,0%)
24/29 (82,8%)
POLYSOMIE
1/36 (2,8%)
0/9 (0%)
0/4 (0%)
0/29 (0%)
SHODA 0-47
IMMUNOHISTOCHEMIE 3+
SHODA 43-47
Shoda mezi centrální IHC a centrální FISH: SOUHRN
100%
66,6%
75,0%
82,8%
FISH +
476/40 (98,1%)
61/81 (75,3%)
42/133 (31,6%)
31/260 (11,9%)
FISH -
9/485 (1,9%)
20/81(24,7%)
91/133 (68,4%)
229/260 (88,1%)
POLYSOMIE
52/485 (10,7%)
13/81 (16,1%)
23/133 (17,3%)
21/260 (8,1%)
SHODA
98,1%
75,3%
68,4%
88,1%
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Shoda FISH mezi lokálními (LL) a referenþní (RL) laboratoĜí (data ze 3-4 laboratoĜí).
MČsíce þinnosti RL 0-6 7-12 13-18 19-24 25-30 31-36 37-42 43-47 0-47
Poþet pacientek 1 14 13 9 10 9 8 5 63
Shoda (%) / poþet 100,00 (1/1) 71,40 (10/14) 100,00 (13/13) 100,00 (9/9) 90,00 (9/10) 100,00 (9/9) 87,50 (7/8) 100,00 (5/5) 93,61 (63/69)
Poþty vyšetĜených pacientek v RL
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE 50
45 45
40
38 35
34
35
32 29
30
28
26
26
22 20
21
12
12
3
5
22
21
19
19 19 17
15 15
24
21
19
18
26
25 23
22
29
28
27
25
24
25
32
31
19
18 16
16
13
17 15
12
11
11
10 7 5
9 10 11 12 1 2
45
43
8
41
7
39
5 6
37
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4
35
33
31
29
27
25
23
21
19
17
15
13
11
8 9 10 11 12 1 2
9
7
1
0
3 4 5
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
ProvyšetĜenost a vyšetĜitelnost vzorkĤ v LL a RL
výsledky z LL mČsíce poþet vzorkĤ IHC vyšetĜeno (%) IHC nevyšetĜeno (%) FISH vyšetĜeno (%) FISH nevyšetĜeno (%) 90 79 21 1,11 98,89 0-6 113 73 27 12,40 87,60 7-12 172 78 22 7,56 92,44 13-18 166 72 28 5,42 94,58 19-24 121 76 24 8,20 91,80 25-30 147 74 26 6,12 93,88 31-36 129 74 26 6,20 93,80 37-42 88 77 23 5,68 94,32 43-47 6,59 93,41 0-47 1026 75 25 vyšetĜitelnost IHC/FISH v RL mČsíce poþet vzorkĤ nelze IHC (%) nelze FISH (%) 90 16 2 0-6 113 0 2 7-12 172 1 3 13-18 166 1 4 19-24 121 2 5 25-30 147 2 5 31-36 129 4 5 37-42 88 0 10 43-47 0-47 1026 3 4
Detekce amplifikace her2/neu genu metodou RQ-PCR Berkovcová J., Trojanec R., Radová L., Hajdúch M.
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
RQ-PCR s TaqMan sondou R
forward primer
sonda
Q 3'
5' 3'
5' 3' 5'
5'
reverse primer
R
1. zahájení syntézy nového ĜetČzce
Q 3'
5' 3'
5' 3' 5'
5'
2. 5´exonukleázová aktivita Taq polymerásy
R Q 3'
5' 3'
5' 3' 5'
5'
R
3. odštČpení sondy
R = reporter dye Q = quencher dye
Q
5' 3'
5'
5' 3'
3' 5'
4. syntéza kompletní
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Referenþní geny Chromozom 2
Chromozom 17
Chromozom 4
Glucosidase I (2p13-p12)
Deoxycytidine kinase (4q13.3-q21.1)
Epsin 2 (17p11.2) her2/neu (17q21.1)
• Duplexní RQ-PCR … detekce referenþního genu v 1 reakci s genem her2/neu • Referenþní geny … gsc1 – na chromozomu 2 dck – na chromozomu 4 epn2 – na chromozomu 17
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Mapování poþtu kopií CH17 s použitím dalších
7.5
index
5.0
2.5
/T P5 3 H
/1 7p 11 .2 H /1 7p 12
H
H
/C
EP 17
TP 53
17 p1 2
0.0
17 p1 1. 2
EP 17
4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
C
signals/nucleus
sond u nádorĤ polyzomických v CEP17
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Duplexní RQ-PCR Rotor Gene 3000 (Corbett-Research) … rozlišení fluorescence o rĤzných vlnových délkách ¾ Proba her2/neu … BHQ1-FAM ¾ Proba referenþního genu … BHQ1-HEX RQ-PCR her/neu2
RQ-PCR epn2
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Teoretické stanovení citlivosti metody n . ln2 K > ln 2x
… K ~ poþet nádorových bunČk … n ~ celkový poþet bunČk v reakci … x ~ poþet kopií her2 genu v buĖce
VýslednČ: 3 kopie her2 genu 30% pozitivní DNA 20 kopií her2 genu 20% pozitivní DNA
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Stanovení citlivosti metody RQ-PCR VyšetĜení pozitivní bunČþné linie CALU3 (> 20 kopií genu her2/neu v buĖce)
-
ĜedČní pozitivních bunČk negativními o izolace DNA z 106 bunČk o vyšetĜení z 50ng DNA (~ cca 8400 bunČk/reakci) vzorek kopie her2
pomČr
0
6
7891 7947
0,96 1,06
2
10 6 10 6 10 6 10 6 10
6
6073 8075 10690 34936 331941
0,99 1,35 1,67 4,92 23,04
10 z 10 1 6 10 z 10 10 z 3 10 z 4 10 z 5 10 z 6 10 z
ZávČr: ¾ Hraniþní hodnoty … od 1% pozitivní DNA ¾ Pozitivita … od 10% pozitivní DNA
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Porovnání vyšetĜení tkáĖových preparátĤ metodou FISH a RQ-PCR ¾ celkem paralelnČ vyšetĜeno 125 pacientek ¾ shoda v 91% ¾ v 9% chybnČ zhodnocen pozitivní výsledek FISH jako negativní RQ-PCR (v 50% pĜípadĤ detekovaná polyzomie metodou RQ-PCR)
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Korelace jednotlivých RQ-PCR s FISH
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
RozšíĜení vyšetĜitelnosti vzorkĤ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
FISH nelze nelze nelze nelze nelze nelze nelze nelze nelze nelze nelze
IHC 0 1+ 0 1+ 0 0 0 3+ 0 0 1+
GSC1 1,16
DCK 0,33
0,93
0,29
1,48 1,78 0,81 5,58 1,05
1,43 0,34 0,62 2,6 0,38
1,38
1,15
EPN2 0,68 nelze 0,68 nelze nelze 1,27 0,91 3,34 0,75 nelze nelze
závČr RQ-PCR negativní negativní negativní negativní negativní pozitivní negativní negativní
Možné vyšetĜit dalších témČĜ 75% pacientek, u kterých nelze výsledek amplifikace genu her2/neu stanovit metodou FISH.
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Jak dál v testování Her-2? • chybovost vyšetĜení v IHC zĤstává dlouhodobČ stabilní, pĜes 20% vzorkĤ se liší o více než 2 IHC stupnČ zachování druhého þtení! • riziko falešnČ negativních vzorkĤ v primárním screeningu, tyto pacientky vypadnou z indikaþních kritérií potĜeba zavedení systému externí kontroly kvality! • vysoká shoda ve vyšetĜení FISH - pravdČpodobnČ daná malým poþtem vyšetĜujících center (zkušenost z CAP) • þást vzorkĤ je špatnČ fixovaná a neumožĖují provedení FISH, þásteþnČ Ĝešeno novou technikou RQ-PCR standardizace odbČrových a fixaþních postupĤ
LABORATORY OF EXPERIMENTAL MEDICINE
Jak dál s Referenþní laboratoĜí? •
•
•
•
PĜedpokládané zvýšení indikace trastuzumabu s jeho zavedením do adjuvance je s ohledem na platbu z paušálu málo pravdČpodobné, reálnČ dochází k omezení indikace vyšetĜení až o 40-50% zachování stávajícího stavu do vyĜešení zpĤsobu financování Po reálném zavedení léþiva do adjuvance pĜedpokládáme nárĤst poþtu vyšetĜení 2-3x je tĜeba Ĝešit nárĤst a kvalitu primární i konfirmaþní diagnostiky. Konfirmaþní diagnostika: - Systém dvou akreditovaných referenþních laboratoĜí - Jedna akreditovaná referenþní laboratoĜ provádČjící dohled nad kvalitou vyšetĜení systémem externí kontroly kvality na základČ kterého budou certifikovány lokální pracovištČ ěešení úhrady konfirmaþního vyšetĜení v systému zdravotního pojištČní
