KURZ ZÁKLADNÍCH METOD MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

EKOTECH

KURZ ZÁKLADNÍCH METOD MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Biologické centrum AV ČR, České Budějovice

Lektoři: Radmila Čapková Frydrychová Miroslava Sýkorová Jindra Šíchová Václav Brož

OBSAH STR. PŘÍPRAVA ROZTOKŮ ………………………………………………………………………………………………………. 1 ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE DNA ………………………….………………………………………………….. 4 SPEKTROFOTOMETRICKÉ VYHODNOCENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN …………………………………… 7 IZOLACE NUKLEOVÝCH KYSELIN ………………………………………………………………………………………. 8 PRECIPITACE A ZAHUŠŤOVÁNÍ DNA ………………………………………………………………………………. 14 ŠTĚPEDNÍ DNA: RESTRIKTÁZY ………………………………………………………………………………………… 15 SYNTÉZA cDNA ……………………………………………………………………………………………………………… 17 KLONOVÁNÍ …………………………………………………………………………………………………………………… 19 PCR ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 27 SOUTHERNOVA HYBRIDIZACE ……………………………………………………………………………………….. 33 WESTERN BLOT ………………….………………………………………………………………………………………… 39 SEZNAM A PŘÍPRAVA CHEMIKÁLIÍ ………………………………………………………………………………… 41

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Příprava roztoků

PŘÍPRAVA ROZTOKŮ Příprava roztoků patří k nejzákladnější činnosti v laboratoři, od které se odvíjí všechny následné experimenty. Z toho důvodu je třeba přípravě roztoků věnovat velkou pozornost a preciznost. Při přípravě roztoků dbáme na několik základních kroků: 1. Výpočet: stanovení množství látky a vody 2. Rozpuštění látky: Pro přípravu roztoků zpravidla využíváme destilovanou vodu, pro speciální roztoky tzv. miliQ vodu. Rozpouštění urychlujeme magnetickými míchadélky. Pro zdárné rozpuštění některých roztoků je nutné zásadité pH, takže např. EDTA se rozpouští za přítomnosti NaOH. 3. Úprava pH: pH je upravováno jen u některých roztoků. Pro úpravu pH používáme nejčastěji pH metr, případně pH papírky. pH upravujeme pomocí 1M NaOH nebo 1M HCl. pH se upravuje v přibližně 80 procentech výsledného objemu. Tzn., pokud máme připravit 1l roztoku, chemikálii nejprve rozpustíme v takovém množství vody, aby objem měl 0,8l. Upravíme pH na požadovanou hodnotu a roztok doplníme na 1l. 3. Filtrace: ve většině případů se neprovádí 4. Sterilizace: Sterilizaci nejčastěji provádíme autoklávováním a výjimečně filtrací (např. roztok BSA by se autoklávováním zničil). Láhev s roztokem může být opatřena sterilizační páskou, která indikuje, že roztok byl vysterilizován autoklávem. 5. Štítek: Láhev s roztokem se řádně označí štítkem, který uvádí název roztoku, koncentraci, datum a případně jméno toho, kdo roztok připravil.

Množství látky v roztoku může být charakterizováno:

1. Molaritou (např. 1M NaCl) Využíváme údaj o molární hmotnosti, který zpravidla bývá uveden na obalu chemikálie. Příklad 1: molární hmotnost (Mr) NaCl je 58.44. 1M roztok NaCl tedy získáme rozpuštěním 58.44 g v 1l výsledného objemu. Tzn., 58.44 g NaCl doplníme vodou tak, aby výsledný objem roztoku i s naváženou solí byl 1l. Příklad 2: 5M roztok NaCl získáme rozpuštěním 292g NaCl v takovém objemu vody, aby výsledný roztok měl 1l. Příklad 3: Roztoky většinou připravujeme v menších objemech než 1l. Většinou se jedná o 100ml. Tedy 100ml 1M roztok NaCl připravíme z 5,8 g NaCl, které doplníme vodou na 100ml.

1

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Příprava roztoků Příklad 4: Máme připravit 100 ml roztok, který obsahuje 0,5M NaOH a 1M NaCl. Mr NaOH je 40, Mr NaCl je 58.44. Použijeme tedy 2g NaOH a 5,8 g NaCl. Soli smícháme a doplníme do 100 ml.

2. Procentuelním zastoupením (10% SDS) Jako 1% roztok je udáván roztok, který vznikne rozpuštěním 1g dané chemikálie ve vodě, tak aby výsledný objem roztoku byl 100ml.

3. Hmotností látky rozpuštěné v určitém objemu (např. mg/ml) Tento způsob se většinou využívá u enzymů, např. Proteinázy K.

4. Počtem jednotek (U) v určitém objemu (v případě enzymů)

Zásobní roztoky Z praktického hlediska je v laboratoři výhodné mít sérii základních tzv. zásobních roztoků. K těmto roztokům patří především 1M HCl, 1M NaOH, 1M (příp. 5M) NaCl, 1M Tris-HCl (pH7), 1M Tris-HCl (pH8), 0,5M EDTA (pH8), 3M Na-acetát, 100xTE pufr, 50xTAE pufr, 20xSSC. Zásobní roztoky se využívají k přípravě jiných (tzv. pracovních) roztoků či roztoků o daleko nižší koncentraci. Příklad 1: Máme připravit 10ml roztoku (100mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 50mM EDTA) a přitom máme k dispozici tyto zásobní roztoky 2,5M NaCl, 1M Tris-HCl, 0,5M EDTA. Pro náš roztok tedy použijeme 0,4ml 1M NaCl, 0,1ml Tris-HCl a 1ml 0,5M EDTA. Příklad 2: Máme 50xTAE zásobního (velice koncentrovaného) roztoku, ze kterého máme vyrobit 2l 1xTAE roztoku. Smícháme tedy 40 ml 50X TAE s 1960 ml vody.

Uchovávání chemikálií Zakoupené chemikálie je třeba uchovávat dle pokynů uvedených na obalu. Většina chemikálií (organické a anorganické látky) a většina připravených roztoky se uchovávají v pokojové teplotě (v angličtině označováno jako RT –„room temperature“). Některé roztoky či chemikálie vyžadují teplotu okolo 4oC, tedy uskladnění v ledničce, velká část chemikálií a roztoků (většinou enzymy, protilátky)se skladuje v -20 oC, tedy mrazničce. Ve speciálních případech, jako jsou kompetentní buňky či dlouhodobé skladování RNA, se vyžaduje teplota okolo -80 oC. Při uchovávání chemikálií je rovněž třeba brát zřetel na bezpečnost, tj. nikdy neskladovat např. žíravé či jinak nebezpečné chemikálie nad výškou našich očí, ale preferenčně vždy co nejníže.

2

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Příprava roztoků

Sterilita a čistota prostředí U velké části experimentů je vyžadováno sterilní prostředí, čehož je získáváno používáním jednorázového laboratorního plastu, jako např. pipetovacích špiček a zkumavek. Laboratorní plast je vždy sterilizován autoklávováním. V některých případech se sterilizuje i laboratorní sklo. Při experimentech se zásadně nosí laboratorní rukavice, vhodný je i laboratorní oděv, nejlépe plášť. Nošením rukavic a laboratorního oděvu nechráníme jen naše experimenty, ale v mnoha případech také naše zdraví! V laboratoři zachováváme čistotu a řád laboratoře, pravidelně laboratoř uklízíme a stíráme laboratorní stoly. Zanedbaná a špinavá laboratoř představuje výrazné ohrožení jak našich experimentů , tak našeho zdraví. Přednostně vždy dbáme na naší vlastní bezpečnost a bezpečnost našich kolegů.

3

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: elektroforéza

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN POMOCÍ HORIZONTÁLNÍ ELEKTROFORÉZY Elektroforéza je soubor separačních metod, které využívají k dělení látek jejich odlišnou pohyblivost ve stejnosměrném elektrickém poli. Na principu rozdílných elektroforetických mobilit se při ní dělí nabité molekuly (ionty). DNA nese díky záporně nabitým fosfátů záporný náboj, proto se pohybuje od záporného pólu ke kladnému. Při elektroforéze se separují molekuly nukleových kyselin na základě své délky. Dlouhé fragmenty migrují pomaleji než kratší, stejně tak jako cirkulární DNA než lineární. Při horizontální elektroforéze se molekuly DNA a RNA separují v agarózovém gelu, který je ponořen do elektroforetického pufru. Koncentrace agarozy je důležitým faktorem pro mobilitu DNA. Čím koncentrovanější je agarozový gel, tím separace je pomalejší, z čehož vyplývá, že vyšší koncentrace agarozy zajistí lepší separaci krátkých fragmenů.

Pro přípravu elektroforetického gelu a samotnou separaci se používají ve většině případů TBE pufr nebo (častěji) TAE pufr. Tyto pufry se uchovávají jako 50x koncentrované a pro elektroforetickou separaci (ELFO) se ředí na pracovní roztoky o koncentraci 1x. Vzhledem k vysoké spotřebě ELFO pufru v laboratoři je výhodné si připravit do zásoby větší množství pracovního roztoku. Tedy např. připravujeme 2l 1xTAE pufru smícháním 1960ml vody s 40 ml 50xTAE pufru. Příprava gelu a elektroforetické vaničky Množství připravovaného gelu závisí na počtu vzorků a tedy velikosti ELFO vaničky. Nejčastěji se používá 40ml vanička, a to pro separaci 8 nebo 12 (v závislosti na velikosti hřebene) vzorků. Koncentrace gelu závisí na typu fragmentů DNA, které chceme separovat. Vyšší koncentrace agarozy zajistí lepší separaci krátkých fragmentů. Koncentrovanější gely umožňují jemnější rozlišení velikosti kratších fragmentů. Pro dlouhé fragmenty okolo 1000bp postačí gely s koncentrací nižší než 1%. Pro krátké fragmenty můžeme při použití speciální agarózy o nízkém bodu tání připravit až 4% gel, který umožní rozlišení fragmentů o velikosti okolo 200bp, lišící se 15 páry bází. Pokud vyžadujeme ještě jemnější rozlišení, musíme použít polyakrylamidový gel a vertikální elektroforézu. Takže např. pro 40 ml 1% agarozového gelu použijeme 40 ml 1X TAE pufru a 0,4g agarozy. Agarozu smícháme s pufrem nejlépe v lahvi se šroubovacím víčkem, lahev uzavřeme tak, že je víčko částečně povolené. Agarozu rozpustíme v mikrovlnné troubě, obvykle stačí 1-1,5 min. V průběhu rozehřívání můžeme 1-2x roztokem zamíchat. Agaroza musí být dokonale rozpuštěna, tzn. nesmí být patrná

4


žádná zrnka tající agarózy. Připravený gel necháme zchladnout tak, aby již nebyl vařící, ale přesto dostatečně horký na to, aby nezačal tuhnout. Pokud nám gel nedopatřením ztuhne, můžeme ho opětovně rozpustit. Připravíme si ELFO vaničku, jejíž čela jsme předtím důkladně oblepili lepící páskou či izolepou (v některých případech jsou vaničky dodávány s kovovými pásky, kterými vaničku utěsníme).Do vaničky vložíme ELFO hřeben a vlijeme agarozový gel , který poté necháme dokonale ztuhnout. Pozn. V některých laboratořích se přidává do gelu etidium bromid, který nám v závěrečné fázi umožní vizualizaci DNA či RNA. Nicméně jelikož je etidium bromid silný mutagen, z bezpečnostního hlediska (kvůli odpařování a kontaminaci laboratorního prostředí) je doporučováno gel barvit až po elektroforéze.Rovněž etidium bromid nepatrně ovlivňuje mobilitu DNA, což v některých případech experimentů není žádoucí. Příprava vzorků Ke vzorkům přidáme 10xnanášecí pufr („loading buffer“). Nanášecí pufr obsahuje bromfenol ovou modř, která roztok s DNA obarví, což umožní lepší nanášení vzorku na gel a sledování vzorku při separaci. Nanášecí pufr také obsahuje glycerol, který způsobí usazení vzorku na dno jamky gelu. Někdy nanášecí pufr obsahuje i EDTA, která umožní zastavení případné např. restrikční reakce. Nanášecí pufr je obvykle v koncentraci 10x, tzn., pufr s roztokem DNA mícháme v poměru 1:9. Kapacita jamky závisí na velikosti hřebene. U hřebenů s jemnými zuby je objem jamky cca 10 µl, u středních zubů to je cca 20 µl.

1kb ladder plus Nanášení vzorků Vaničku usadíme do elektroforetické vany , tak aby jamky byly u záporného pólu. Gel s vaničkou zalijeme 1x ELFO roztokem. Hladina ELFO roztoku by měla být těsně (1-2 mm) nad gelem. S vyšší vrstvou pufru nad gelem stoupá při elektroforéze odpor a separace je pomalejší. Vzorky naneseme do jamek, díky přítomnosti glycerolu, vzorky klesnou na dno jamky. Pro nanášení používáme 1-20µl pipetu. Do jedné z jamek rovněž naneseme hmotnostní marker („size marker“ nebo také „ladder“), obvykle kolem 5µl. Marker obsahuje soubor velikostně definovaných fragmentů, které nám po separaci umožní identifikaci velikostí molekul testované DNA (viz. obr.). Separace vzorků

5


ELFO vanu přikryjeme víkem a zapneme ELFO zdroj. Nastavíme napětí, tak aby bylo 5-8V/cm mezi elektrodami. Tzn. u malé až střední elektroforetické vany to je 60-90V. Vyšší napětí nám umožní rychlejší separaci vzorku, ale pokud je příliš vysoké, dochází k přehřívání, deformaci gelu a nestejnoměrné separaci vzorků. Elektroforézu necháme běžet maximálně tak dlouho až je bromfenolová modř ve 2/3 až ¾ délky vaničky. Barvení vzorků Gel vyjmeme z vaničky a ponoříme ho na 10-20 min do vodného roztoku etidium bromidu *(20µl 1%EtBr/100ml H2O), případně GelRed či případně SyberGreenu. Jsou to látky, které se váží na DNA a v UV spektru září modrým fluorescenčním zářením. To nám tedy umožní vizualizaci nukleové kyseliny. Během barvení roztokem protřepáváme. Po obarvení opatrně gel y barvícího roztoku vyjmeme, opláchneme vodou a vizualizujeme pod UV světlem. *Zásobní roztok etidium bromidu bývá 1%, tj. 10mg/ml. Pracovní roztok skladujeme ve tmě a lze jej využívat opakovaně,

EXTRAKCE DNA Z GELU K určitým účelům můžeme DNA z gelu extrahovat, např. pro klonování. Z gelu pod UV světlem vyřízneme daný proužek DNA. Pro excizi používáme skalpel případně kopistku a dbáme na dvě věci: jednak máme ochranný štít či brýle proti UV (zánět spojivek by byl jinak jistý) a za druhé pracujeme urychleně, protože UV na DNA vytváří tyminové dimery, které by mohly způsobovat problémy v následných experimentech. DNA z vyříznutého gelu následně extrahujeme pomocí komerčně dostupných kitů (firma Qiagen, Macherez Nagel, Invitrogen, Promega, aj.).

6

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Spektrofotometrické vyhodnocení nukleových kyselin

SPEKTROFOTOMETRICKÉ VYHODNOCENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN Roztok DNA se spektrofotometricky vyhodnocuje při vlnové délce 260nm a 280nm. Absorbance při 260 nm odráží koncentraci DNA, absorbance při 280 nm odráží čistotu DNA, tj. míru přítomnosti proteinů. Pro výpočet koncentrace se vychází z následujících vztahů: Při vlnové délce 260 nm je absorbance roztoku rovna 1, pokud je v měřeném roztoku: - dvouřetězcová DNA o koncentraci 50 µg/ml - jednořetězcové DNA o koncentraci 37 µg/ml při 260nm DNA je rovna 1 - RNA o koncentraci 40 µg/ml při 260nm DNA je rovna 1 Obvyklý postup při spektrofotometrickém vyhodnocení dsDNA: 1. Roztok DNA se naředí. Obvykle je to buď 50x nebo 100x nebo 1000x. Protože přesnější měření získáme při vyšší koncentraci DNA, je ředění DNA kompromisem mezi přesností měření a množstvím DNA, které kvůli měření ztratíme. Směrodatným faktorem je rovněž typ a velikost spektrofotometrické kyvety a typ spektrofotometru (tj. především výška probíhajícího paprsku). Roztok DNA tedy naředíme např. 100x, tj. 1:100. Roztok důkladně promícháme. 2. Nejprve spektrofotometr vynulujeme oproti slepému vzorku („blank“), kterým je obvykle voda, která byla použita pro ředění roztoku DNA. 3. Změříme absorbanci roztoku DNA při 260 nm a poté při 280nm. Výsledná hodnota je např. A260=0,02, A280=0,009. 4. Vypočteme poměr A260/A280, který nám poskytuje informaci o čistotě DNA. Ćistá DNA obvykle vykazuje hodnotu tohoto poměru okolo 1,8, u RNA je to okolo2. Pokud hodnota poměru je výrazně nižší, je DNA kontaminována proteiny či fenolem. V našem případě je A260/A280=2,2. 5. Vypočteme koncentraci DNA dle A260 a vztahu uvedeného v textu výše a míře naředění roztoku DNA. V našem případě tedy 50 x 0,02 x 100 = 100 µg/ml = 100ng/µl Obecně pro ds DNA: 50 x A x ředění = ng/µl

Obr. Spektrofotometrické kyvety

Obecně pro ss DNA: 37 x A x ředění = ng/µl Obecně pro RNA:

40 x A x ředění = ng/µl

Při měření více vzorků a také po skončení měření dbáme na důkladné vypláchnutí spektrofotometrické kyvety.

7

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Izolace nukleových kyselin

Izolace DNA V současné době existuje několik různých způsobů jak izolovat DNA. 1. Klasickým způsobem je izolace pomocí fenol-chloroformu. Tato izolace je poměrně pracná a zdlouhavá, ale poskytuje velké množství velmi čisté DNA. 2. Druhým způsobem je izolace pomocí kolonek (např. od firem Qiagen, Invitroge nebo, Macherey Nagel). Izolace pomocí kolonek je rychlá, elegantní a většinou odpadá práce s tekutým dusíkem. Tkáň pomocí tloučku rozdrtíme v extrakčním pufru. Tento roztok naneseme do speciální kolonky, kterou centrifugujeme. V kolonce je přítomna matrix, na kterou se DNA navazuje. DNA se promyje centrifugací se speciálními roztoky. Po promytí se DNA vyváže centrifugací s vodou, která DNA z matrix odplaví. Při tomto způsobu ovšem není možné získat velké množství DNA a DNA není prý tak čistá. 3. Kompromisním řešením mezi fenolovou extrakcí a kolonkami jsou nejrůznější produkty dostupné od řady firem (např. DNazol od firmy MRC), které pracují na podobné bázi jako je izolace fenolem, ale poskytují daleko větší jednoduchost a rychlost. 4. Speciální izolací DNA je izolace pomocí Chelexu. Chelex poskytuje extrakci DNA z velmi malého množství materiálu, jakým je např. lidský vlas. Čistota DNA je velmi nízká, ale je dostatečná pro PCR. Tato metoda se využívá ve forenzní genetice. Izolace kolonkami a způsobem popsaným v bodě 2 se vždy striktně odvíjí od návodu výrobce. Proto si zde uvádíme podrobný popis izolace DNA pouze fenol-chloroformovou extrakcí a Chelexem.

Izolace DNA fenol-chloroformem Přípravné práce: 1. Sterilizace keramických třecích misek, tloučků a kopistek (zabalit do alobalu) v autoklávu. 2. Předchlazení keramických třecích misek, tloučků a kopistek uložením do mrazáku 3. Příprava 10 ml extrakčního pufru: Finální koncentrace

Základní roztok

100 mM NaCl

1 M NaCl (14,61 g ve 100 ml s miliQ H2O)

10 mM Tris-HCl, pH 8,0

1 M Tris-HCl, pH 8,0

50 mM EDTA, pH 8,0*

0,5 M EDTA (18,61 g ve 100 ml s mQ H2O)

0,5% Sarkosyl

10% (1g sarkosylu + 9 ml miliQ H2O)

0,5 ml

100 µg/ml Proteináza K**

20 mg/ml (-20°C)

50 µl

miliQ H2O

Množství 1 ml 100 µl 1 ml

7,35 ml

8


* Koncentrace EDTA závisí na množství endogenních nukleáz ve vzorku či tkáni (používané finální koncentrace: 25-100 mM EDTA). Základní roztok: 18,61 g + 80 ml H2O + 2 g NaOH, po rozpouštìní dotitrovat na pH 8,0 (NaOH/HCl) a doplnit na 100 ml. ** Proteinázu přidat ze základního roztoku do extrakčního pufru až před použitím!

Vlastní izolace genomové DNA Uvedený protocol je pro izolaci většího množství tkáně v 10 ml extrakčního pufru. Množství tkáně a extrakčního pufru lze snížit a izolaci provádět v 1,5ml zkumavkách. Rozmělnění tkáně v extrakčním pufru a inkubace v extrakčním pufru 1. Zchlazení třecích misek a tloučků pomocí tekutého N2: dusík nalejme do misky a postupně ho přiléváme až do řádného zchlazení misky, při kterém již nebude docházet k výraznému odpařování dusíku. 2. K dusíku v misce přidáme studovanou tkáň a pomocí tloučku ji rozmělníme na jemný prášek. Přidáme několik kapek extrakčního pufru a znovu rozmělníme. Získaný prášek kopistkou přeneseme do zkumavky s extrakčním pufrem (0,1-0,2 g tkáně na 10ml extrakčního pufru).

3. Přidáme proteinázu K (pokud není již v extrakčním pufru) a zkumavku, jejíž uzávěr jsme předtím utěsnili parafilmem, vložíme v horizontální poloze do vodní lázně a zvolna promícháváme (37°C, 3-12 hod.). Fenolová extrakce 4. Roztok necháme zchladnout na pokojovou teplotu, přidáme stejný objem fenolu (bez vrchní krycí vrstvy TE pufru!) a zvolna promícháváme na třepačce (RT, 30 min.). Přidáním fenolu se vytvoří dvě faze. Horní je roztok s DNA, spodní je vrstva fenolu. Po 30 minutách přeneseme obě faze do 15 ml Corex zkumavky. pH použitého fenolu musí být 8. Fenol vhodný určený pro izolaci DNA lze již přím koupit nebo si ho lze v laboratoři připravit. Způsob přípravy je uveden dale v textu. 5. Centrifugací (5000 g, 15 min., RT) oddělíme tři vrstvy - DNA, bílkoviny a fenol. Vrchní viskózní vodnou fázi, jež obsahuje DNA, opatrně a velmi zvolna odsajeme a přeneseme do nové falconky. Pro nasávání DNA používáme vždy špičky s ustřihlým koncem (průměr otvoru 3 mm)! Při centrifugaci dbáme na nízkou akceleraci a deceleraci centrifugy! 6. Fenolovou extrakci, tj. body 4,5, opakujeme 1-2x. Mezitím si připravíme směs fenol-chloroformizoamylalkohol (25:24:1). Směs musí být průhledná, pokud není - centrifugace (5000 g, 6 min., RT).

9


Fenol-chloroformová extrakce 7. Přidáme stejný objem fenol-chloroform-izoamylalkoholu a v horizontálním směru zvolna promícháváme na třepačce (RT, 15 min.). 8. Přeneseme do 15 ml Corex zkumavky a centrifugujeme (5000 g, 15 min., RT) a horní fázi přeneseme do nové falconky (velice opatrně a zvolna). Chloroformová extrakce 9. Přidáme stejný objem chloroform-izoamylalkoholu (24:1) a horizontálně zvolna promícháváme na třepačce (RT, 15 min.). 10. Centrifugujeme (5000 g, 15 min., RT), horní fázi přeneseme do zkumavky. Precipitace DNA a její rozpuštění 11. Přidáme 0,1 objemu 3M Na-acetátu (pH 5,2) a promícháme jemným pohybováním falconky v horizontálním směru, dokud obsah není homogenní. Přidáme 2x objem 100% etanolu a opět opatrně promícháme: - pokud se DNA zformuje v klubko vláken, vytáhneme ji háčkem vyrobeným ohnutím špičky sterilní pasterky a přeneseme do falconky se 70% etanolem (na 2 min.); - pokud nejsou DNA vlákna dostatečně zformována, shlukneme je centrifugací zkumavce (3000 g, 10 min., RT). Opatrněodlejeme etanol. Klubko či pellet DNA 2x promyjeme přidáním 70% etanolu a zcentrifugováním (3000 g, 10 min., RT). Etanol odlejeme, krátce (5 min.) necháme vyschnout (kapky etanolu usazené po stěnách můžeme případnězcentrifugovat a odsát pipetou). DNA nesmí úplně vyschnout, jinak se špatně rozpustí!

Přidáme takové množství TE pufru (pH 8,0) nebo autoklávované miliQ H2O, aby přibližná koncentrace DNA byla 500 ng - 1 µg DNA/µl. DNA resuspendujeme jemným pohybováním zkumavky v horizontálním směru a umístíme na noc do 4°C. Genomová DNA je velmi křehká a náchylná k mechanickému poškoyení. Proto s ní musíme nakládat velmi jemně. Nejčastější příčiny degradace vysokomolekulární DNA: 1. Nedostatečná inhbice DNáz

10


2. Prudké míchání či třepání 3. Pipetování 4. Vysoká akcelerace či decelerace centrifugy Izolovanou DNA vyhodnotíme spektrofotometricky a elektroforeticky. Spektrofotometricky vyhodnotíme jak koncentraci DNA pomocí absorbance při 260nm, tak čistotu DNA pomocí poměru A260/A280 (viz. kapitola Spektrofotometrické vyhodnocení nukleových kyselin). Elektrofoteticky vyhodnotíme integritu DNA. DNA by měla být patrná jako celistvý vysokomolekulární proužek.

Úprava pH fenolu: (a) K fenolu přidáme stejný objem 1 M TRIZMA BASE (60,55 g doplnit na 500 ml miliQ H2O; pH 12); protřepáním oddělíme dvěfáze, z nichž vrchní odstraníme. (b) Přidáme stejný objem 1 M Tris-HCl (pH 8,0); protřepáním oddělíme dvě fáze, z nichž vrchní odstraníme. Poté zkontrolujeme pH a případně zopakujeme tento krok. Příprava 500 ml 1 M Tris-HCl: 26,5 g TRIZMA BASE + 44,4 g TRIZMA HCl, rozpustit ve 400 ml miliQ H2O a doplnit na 500 ml. (c) Přidáme 10mM Tris-HCl (pH 8,0), protřepeme, necháme sednout a oddìlíme vrchní fázi. (d) Krok (c) opakujeme 3x kvůli odstranění solí a zkontrolujeme pH pomocí papírku. Po titraci slejeme a zalejeme 1x TE pufrem (pH 8,0). Takto upravený fenol vydrží při 4°C 2-3 mìsíce (skladujeme nejlépe v 50ml falconkách). Pozor !!!

Časem u takto uskladněného fenolu může dojít k jeho znehodnocení oxidací (žlutá barva se mění v červenou).

11


Izolace DNA pomocí Chelexu Extrakce DNA pomocí Chelexu 100 (Bio-Rad Laboratories) je velmi populární metodou ve forenzní genetice, kde se používá k izolaci DNA ze zaschlých krevních vzorků, tkáně, vlasů a kostí. Tato metoda je velmi rychlá a poměrně levná. Velkou výhodou je minimální riziko kontaminace vzorku, díky tomu, že je celý proces extrakce prováděn pouze v jedné zkumavce. Chelex je pryskyřice složená ze styren divinylbenzen kopolyméru (makromolekulární látka, jejíž molekuly jsou tvořeny nejméně ze dvou různých monomérů) s párovými iminodiacetátovými ionty. Tyto ionty působí jako chelátory, které vážou polyvalentní kovové ionty. Za alkalických podmínek zvyšuje Chelex afinitu ke kationtům těžkým kovům (Ca2+, Mn2+, and Mg2+), což má v extrakci velký význam, jelikož tyto dvojmocné ionty mohou při vysoké teplotě (95-100°C) způsobit poškození DNA. Kromě toho chelatace Mg2+ iontů způsobuje inaktivaci nukleáz (např. DNáz degradujících DNA), což je při izolaci DNA nezbytné, jelikož jsou Mg2+ ionty nezbytné pro jejich enzymatickou aktivitu. Principem izolace je fyzická homogenizace a následná destrukce a degradace buněčných membrán, proteinů a denaturace DNA z alkalických podmínek a vysoké teploty (95-100°C). Dále se provede centrifugace suspenze, tak aby se oddělila pryskyřice a zbytky buněčných komponentů od supernatantu obsahujícího DNA. DNA se může přímo používat pro PCR amplifikaci, avšak je třeba zamezit kontaktu pryskyřice s PCR reakcí, jelikož Chelex samotný je inhibitor PCR.

Postup: Potřebujeme: 10% chelex ve sterilní H2O, sterilní H2O, Proteinázu K (c = 20 mg/ml), tloučky, 1,5 ml zkumavky, 2 termobloky, pinzetu, kahan, nůžky, TAE, agarózu, loading buffer

1) Připravíme 10% roztok chelexu (1 g chelexu do 9 ml miliQ H2O), řádně promícháme. 2) Termoblok nahřejeme na 56 °C. 3)

Do označené mikrozkumavky (1,5 ml) odpipetujeme 50μl roztoku. Doplníme 50 μl miliQ H výsledná koncentrace chelexu je tak 5%.

2O,

4) Pinzetou (sterilizovanou nebo předem namočenou do etanolu a opálenou, pak musí na vzduchu trochu vychladnout) vyškubneme asi 3-5 vlasů i s kořínky (kořínky jsou u vlasů nejlepším zdrojem DNA, protože pouze ony obsahují živé buňky) a přeneseme do mikrozkumavky s chelexem. 5)

Zvortexujeme a stočíme, aby se vlasy dostaly do tekutiny. Provedeme homogenizaci zeleným tloučkem.

6) Přidáme 2,5 μl Proteinázy K (koncentrace 20 mg/ml). 7) Znovu zvortexujeme. 8) Inkubujeme 10 min při 56 °C.

12


9) Mezitím nahřejeme druhý termoblok na 95-100 °C. 10) Po inkubaci vzorky vortexujeme 10-15 s. 11) Inkubujeme (respektive povaříme) 10 min. při 95-100 °C. 13) Znovu zvortexujeme 10-15 s. 14 Vzorky zcentrifugujeme 5 min při maximální rychlosti. Poté vzorky vyhodnocujeme pomocí PCR. Do PCR reakce dáme přímo 2 μl supernatantu. PCR přečistíme pomocí komerčně dostupných kolonek na přečišťování PCR produktů (např. Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System od firmy Promega).

IZOLACE RNA Podobně jako u izolace DNA, RNA může být izolovaná několika způsoby - používají se speciální kolonky, jejichž matrix na sebe z roztoku navazuje RNA, dále to je metoda pomocí fenol-chloroformu a konečně je to celá řada různých komerčně dostupných produktů, jako např. velmi používaný Trizol nebo RNazol. Obecná zásada při práci s RNA je dodržování čistoty, striktní používání rukavic, špiček s filtrem, speciálně ošetřené vody (např. tzv. DEPC vody), která neobsahuje RNázy. RNA je velice náchylná na působení RNáz. Kontaminace RNázami vede k degradaci vzorku RNA, což se projeví při elektroforetické separaci v podobě „smearu“. Správně izolovaná totální RNA je se jeví jako dva celistvé proužky (horní proužek je 28S RNA, dolní je tvořen 18S RNA).Nejčastějším způsobem je izolace totální , tj. celkovou RNA. V určitých případech (výroba sond pro array analýzu, detekci extrémně vzácné mRNA nebo konstrukce random-primed cDNA knihoven), kdy by totální RNA byla na obtíž, izolujeme jen poly(A), tj. mRNA, která tvoří 1-5 % totální RNA). Pro izolaci mRNA existují komerčně dostupné kity, jako Oligotex mRNA od firmy Qiagen nebo Poly(A)Purist™ Kit od Ambionu.

13

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Precipitace a zahušťování DNA

PRECIPITACE A ZAHUŠŤOVÁNÍ DNA Nízkou koncentraci DNA můžeme zvýšit v podstatě dvěmi způsoby. Jedním je centrifugace roztoku DNA v komerčně dostupných kolonkách, které po přidání speciálního pufru o určitém objemu k roztoku DNA, vyvazují DNA na speciální matrix. DNA je poté odplavena z této matrix centrifugací vody nebo elučního pufru (obvykle se minimum vody či elučního pufru pohybuje od 30-50 µl, což může být pro náš účel limitujícím faktorem). Druhým způsobem je precipitace DNA pomocí Na-acetátu a etanolu. Pro tento způsob uvádíme přesný postup. K roztoku DNA je přidán 3M Na-acetát(pH 5.2) a to o objemu, který je roven 1/10 finálního objemu. Tedy pokud máme roztok DNA o objemu 300 µl, přidáme 33 µl 3M Na-acetátu. Pokud máme velmi malé množství DNA, k vzorku přidáme glykogen nebo tRNA, které usnadní zviditelnění peletu DNA po centrifugaci. Do roztoku přidáme 2-2,5x objemu 100% etanolu. Precipitace je zvýšena, pokud je etanol vychlazen na -20 oC. Vzorek se řádně promíchá vortexem, v případě že se jedná o genomovou DNA, promícháme vzorek velmi zlehka pipetováním (genomová DNA je citlivá na mechanické poškození). Vzorek uložíme na 30 min do -20 oC (eventuálně přes noc) nebo na 30-60 min do -80 oC. V případě nízkého množství DNA je lepší delší inkubace buď v -20 oC nebo 1 hodinu v -80 oC. Vzorek centrifugujeme v předchlazené centrifuze (4 oC), 13 000 rpm, 20min. DNA formuje pelet na dně zkumavky, supernatant opatrně odstraníme. A přidáme stejný objem 70% etanolu. Vzorek centrifugujeme při 13 000rpm, 10 min, 4 oC. Dokonale odstraníme supernatant. Počkáme až se odpaří všechny zbytky etanolu a přidáme vodu či TE pufr a necháme DNA rozpustit. Pokud DNA není genomová, můžeme rozpouštění usnadnit vertexem či pipetou.

14

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Štěpení DNA: restriktázy

ŠTĚPENÍ DNA: RESTRIKTÁZY DNA lze štěpit mechanicky pomocí sonikace nebo enzymaticky. Sonikace je štěpení DNA pomocí ultrazvuku, který rozkmitá dlouhé molekuly. Ty se pak v místech největšího mechanického namáhání v průběhu kmitání lámou. Velikost získaných fragmentů lze ovlivnit výkonem ultrazvuku a dobou působení - čím větší výkon a delší působení, tím kratší fragmenty. Místa zlomu jsou ovšem zcela nezávislá na konkrétní sekvenci DNA a jsou tedy náhodná.

Restrikční endonukleázy (taky též restriktázy) Štěpení DNA lze provádět pomocí enzymů tzv. nukleáz. Existuje celá řada nukleáz, které štípou DNA svým specifickým způsobem. Nejvýraznějšího uplatnění ale nachází restrikční endonukleázy. Restrikčních endonukleázy II. typu rozpoznávají v molekule DNA krátké specifické sekvence a v místě výskytu této sekvence molekulu štěpí. Štěpená sekvence je plindromická, tzn. identická v obou řetěcích, pokud ji čteme vždy v jednom směru tj. 5’-3’ nebo 3’-5’. Jako příklad můžeme uvést nejznámější restrikční endonukleázu EcoRI (podle zdroje - bakterie Escherichia coli, RI = restriktáza č. 1), která rozpoznává sekvenci 5'-GAATTC-3' a štěpí fosfodiesterovou vazbu v řetězci mezi prvním guanosinem (G) a druhým adenosinem (A). EcoRI patří do podskupiny restrikčních endonukleáz II. typu, které štěpí obráceně opakované sekvence, takže vznikají fragmenty s tzv. kohesivními konci. Jiné restrikční endonukleázy II. typu

štěpí fosfodiesterové vazby na stejném místě v obou řetězcích, takže vznikají tzv. tupé konce (viz. obr.).

Štěpení restrikčními endonukleázami dovoluje, při určitých podmínkách a přítomnosti enzymu tzv. DNA ligázy, rozštěpené molekuly zase spojit dohromady. Snížením teploty dosáhneme mezi štěpenými konci spojení vodíkovými můstky a pomocí enzymu ligázy můžeme obnovit fosfodiesterové vazby mezi řetězci.

15

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Štěpení DNA: restriktázy

Komerčně je dostupná celá řada restrikčních enzymů, viz. firma NEB – New England Biolabs. Restrikční endonukleázy jsou dodávány s pufrem, ve kterém pracují. Aktivita různých restriktáz se s různými pufry může výrazně lišit. Tak např. od firmy NEB enzym EcoR I pracuje se 100%-ní účinností ve všech čtyřech dodávaných pufrech (1,2,3, a 4). EcoR V pracuje v pufrech 1,2,3 a 4 s účinností 50, 75, 100 a 50. Pokud chceme provádět reakci s např. dvěma enzymy současně, vždy musíme zkontrolovat jejich aktivitu v daných pufrech a použít optimální pufr pro oba enzymy. Pokud se aktivita výrazně liší, buď použijeme univerzální pufr nebo provedeme reakci nejprve s jedním enzymem, DNA přečistíme (buď komerčně dostupnou kolonkou nebo precipitací s Na-acetátem) a provedeme reakci s druhým enzymem. Enzymy jsou dodávany v určitém množství jednotek na určité množství. Výrobce vždy uvádí specifikaci, kolik jednotek nám rozštěpí dané množství DNA za daný čas většinou při 370C. Prakticky se restrikční štěpení ale dělá tak, že se k 1µg DNA přidá 0,5µl restriktázy, což je obvykle množství enzymu, které DNA dokonale naštěpí. Pokud děláme reakci s více enzymy, vždy mějme na paměti, že objem dodaných enzymů nesmí přesáhnout desetinu celkového objemu reakce (glycerol, který nese enzymy by v takovém množství inhiboval reakci). Dodávané pufry jsou většinou 10x koncentrované a reakce se u většiny enzymů (ale neplatí to vždy!) provádí při 370C 1-2 hodiny. Reakční podmínky je vždy třeba zkontrolovat pro daný enzym. K inaktivaci reakce se používá EDTA, která vyvazuje dvojmocné ionty, které jsou potřebné k aktivitě restriktázy (po přídavku EDTA jsou dvojmocnoé ionty pro restriktázu nedostupné) nebo se inaktivace dělá vysokou teplotou dle návodu výrobce. Příklad reakce: Komponenta H2O plasmidová DNA (1 µg) 10x pufr –(NEB 3) EcoR I EcoR V Celkem

Množství 10,5 µl 10 µl 2,5 µl 1 µl 1 µl 25 µl

Reakci promícháme a inkubujeme při 370C 1-2 hodiny. Reakci můžeme inaktivovat inkubací při 650C 20 min.

16

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Syntéza cDNA

SYNTÉZA cDNA Syntéza cDNA je syntézou DNA podle templátové RNA molekuly. Syntéza je zprostředkována speciálním enzymem RT transkriptázou (tj. reverzní transkriptázou). Syntéza cDNA umožňuje manipulaci (klonování a další úpravy) s produkty transkripce a tím vlastně s funkčními součástmi genomu. Syntézou cDNA můžeme získat kódující sekvenci celých genů, tj. sekvenci bez intronů. Pro iniciaci syntézy jsou jako primery využívány polydT (komplementární k polA na konci každého genu) nebo se využívá směs náhodných hexanukleotidů, nebo i specifické oligonukleotidy, pokud chceme cDNA jen k nějakému konkrétnímu genu a máme nějakou informaci o sekvenci. Syntéza cDNA probíhá v těchto krocích: 1. denaturace RNA a primeru při 65oC– tj. odstranění případných sekundárních struktur, které se na RNA formují 2. samotná syntéza DNA řetězce podle řetězce RNA prostřednictvím RT transkriptázy 3. odstranění RNA řetězce pomocí RNasy H 4. syntéza druhého vlákna prostřednictvím PCR.

Reakce: 1. Připravte následující směs: Komponenta (koncentrace zásobního roztoku) RNA 10mM dNTP Oligo (dT) - 100 µM H2O

Množství 10 pg-5µg totální RNA nebo 10pg-500 ng mRNA 1 µl 1 µl Doplnit do 20 µl

17

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Syntéza cDNA

2. Pro denaturace inkubujte při 65oC, 5 min. 3. Připravte následující směs, přičemž přidávejte komponenty v určeném pořadí: Komponenta Množství 10X RT pufr 2 µl 25mM MgCl2 4 µl 0,1M DTT 2 µl RNase OUT inhibitor nebo nahraďte vodou 1 µl Dodejte 9 µl této směsi k RNA a primerům, promíchejte, centrifugujte a inkubujte 2 min v 42oC. 4. Ke směsi přidejte 1 µl (50U) SuperScript II RT a inkubujte 50 min při 42oC. 5. Ukončete reakci inkubací v 70oC, 15 min. Zchlaďte na ledu a centrifugujte. 6. Přidejte 1 µl RNasy H a inkubujte v 37oC po 20 min.

PCR S cDNA Nasyntetizované 1. Vlákno cDNA můžete použít pro PCR za standardních podmínek. Při PCR se syntetizuje druhé vlákno cDNA. Poznámky: 1. Jako templát by měla být používaná RNA bez jakékoliv kontaminace genomovou DNA. Při izolaci RNA se proto doporučuje zahrnout krok s působením DNázy. 2. Pro syntézu cDNA zahrňte také negativní kontrolu, tzn. vzorek, do nějž nebudete dodávat RT transkriptázu. Pokud vám po PCR v této kontrole vznikne produkt, je to na základě kontaminace, pravděpodobně genomovou DNA.

18

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Klonování

KLONOVÁNÍ Klon je soubor molekul nebo buněk, které jsou všechny identické s původní molekulou nebo buňkou. Klonování genu znamená vytvoření mnoha jeho kopií např. v populaci baktérií, kvasinek, atd. Technika klonování znamená, že je třeba přimět určité hostitelské buňky, aby kopírovaly cizí vloženou DNA, kterou po namnožení v těchto buňkách z těchto buněk izolujeme. Namnožený úsek lze použít pro různé účely, jako např. pro konstrukci chimérických genů, pro výrobu hybridizační sondy, pro in vitro transkripci, kdy získáváme proteinový produkt kódovaný vloženou molekulou DNA. Kvůli jednoduchosti a levnosti kultivace a velké rychlosti množení se jako hostitelské buňky pro cizí klonovanou DNA používají především bakterie, příp. bakteriofágy. V některých případech, kdy je potřeba množit velké molekuly cizí DNA v celku, se používají také kvasinky. Cizí DNA se vloží do již předem připravené molekuly, která obsahuje všechny sekvence potřebné ke vstupu, přežití a množení v určité hostitelské buňce. Taková molekula, která slouží k přenesení cizí DNA do určité hostitelské buňky, se pak obecně označuje jako vektor. Pokud tento vektor slouží nejen k přenesení do buňky, ale i k zajištění jejího klonování v buňce, jde o tzv. klonovací vektor. Jako klonovací vektory se používají plazmidy, fasmidy, bakteriofágy, kosmidy, umělé bakteriální chromosomy (BAC = bacterial artificial chromosome) a umělé kvasinkové chromosomy (YAC = yeast artificial chromosome). •

plazmidy jsou malé molekuly kruhové DNA, které se vyskytují přirozeně v bakteriálních buňkách. Ve své přirozené podobě obsahují genetickou informaci, která není nutná pro běžný život hostitelské bakterie, ale může být užitečná v některých životních situacích. Ke klonování se používají plazmidy geneticky upravené, které jsou dokonale přizpůsobeny svému účelu. Do plazmidu lze běžně vložit molekulu cizí DNA, jejíž velikost nepřesahuje 10-15 kb, v ideálním případě lze vložit i molekuly kolem 22 kb.

•

fasmidy (angl. phagemid) jsou obecně plazmidy vybavené navíc částí genomu některého bakteriofága. Nejčastěji jsou používány fasmidy vybavené replikačním začátkem vláknitého bakteriofága f1, který umožňuje připravit z fasmidu jednovláknovou DNA pro sekvenování.

•

bakteriofágy jsou viry, napadající bakterie. Po genetické manipulaci je lze použít ke klonování větších molekul DNA (32 - 47 000 párů bází). Infikujeme-li hostitelský kmen bakterie bakteriofágem s vloženou cizí DNA, dojde v průběhu lytického cyklu k namnožení celé fágové DNA včetně cizí DNA.

•

kosmidy jsou plazmidy se zabudovanými částmi sekvence bakteriofága l (tzv. cos-sekvence), která umožňuje efektivní prostorovou organizaci velkých molekul DNA. Výhodně slučují vlastnosti plazmidů a bakteriofágů - bez zaklonované cizí DNA je lze množit jako plazmidy, pak je lze použít k zaklonování mnoha tzv. konkatemerů, ve kterých se střídají různé úseky cizí DNA a kosmidu, tyto částice lze pomnožit v průběhu infekce bakterií podobně jako u bakteriofágů a pak z lyzátu získat DNA.

•

molekuly cizí DNA větší než 47 000 párů bází lze zaklonovat do umělých bakteriálních nebo kvasinkových chromosomů. Obsahují sekvence, které zajistí replikaci celého umělého chromosomu v S-fázi buněčného cyklu hostitelské buňky, a dále sekvence, které plní funkci centromery při dělení hostitelských buněk v mitóze. Umělé kvasinkové chromosomy jsou lineární, takže jejich konce musejí být navíc chráněny před degradací telomerami.

19


PLASMIDY A KLONOVACÍ VEKTORY Plasmidy jsou cirkulární dsDNA přirozeně přítomné v baktériích. Jsou využívány pro experimentální manipulace s geny a jejich klonování jako tzv. klonovací vektory. Plasmidy používané jako klonovací vektory obsahují replikátor (počátek replikace), tj. sekvenci, kterou rozpoznává DNA polymeráza hostitelské buňky. Dále obsahují selekční marker, který zajistí buňkám obsahující vnesený vektor selekční výhodu nad buňkami, které vektor neobsaují. Jako selekční geny se nejčastěji používají geny pro rezistenci k antibiotiku, většinou ampicilinu, méně častěji kanamycinu, tetracyklinu, chloramfenikolu, aj.). Dále je obsaženo klonovací místo (tzv. polylinker nebo MCS- multiple cloning site, tj. místo s velkým množství restrikčních míst, která umožní vložení cizí DNA). Často také obsahují gen LacZ, který umožní tzv. modro-bílou selekci (viz. dále), umožňující rozlišení buněk obsahujících prázdný klonovací vektor od vektoru s vloženým inzertem. Ke klonování je komerčně dostupná celá řada klonovacích vektorů.

Klonování genu se děje v několika krocích: 1. LIGACE: Integrace genu do vektoru 2. TRANSFORMACE: Integrace vektoru do baktérií, tzv. transformací kompetentních buněk 3. KULTIVACE: Namnožení baktérií 4. IDENTIFIKACE KLONŮ:Identifikace klonů, které obsahují naši klonovanou DNA 5. IZOLACE PLASMIDOVÉ DNA: Izolace vektoru s naklonovanou DNA z baktérií 6. OVĚŘENÍ SEKVENCE KLONOVANÉ DNA: Restrikční štěpení a sekvenování

20


INTEGRACE GENU DO VEKTORU Pro vložení cizí DNA (tzv. insertu) do plazmidu nejprve plasmid linearizujeme (tj. rozštěpíme jeho kruhovou molekulu). Pro linearizaci se používají restrikční endonukleázy, které štěpí v polylinkeru vektoru. Tzn., že plasmid rozštěpíme v klonovacím místě některou z restrikčních endonukleáz. Např. na uvedeném obrázku je vektor, jehož klonovací místo obsahuje restrikční místa pro Not I, EcoR I, Bgl II, Kpn I, atd. V závislosti na restriktáze, vzniklé konce mohou být buď tupé („blunt ends“) nebo kohesivní („sticky ends“), viz. obr. dole. Konce takto linearizovaného plasmidu spojíme ligací s konci vkládaného inzertu. Spojované konce musejí být kompatibilní, tzn., že v případě kohesivních konců musí být štěpené stejným restrikčním enzymem. Tupé konce se naproti tomu spojují s jakýmikoliv jinými tupými konci. Pro účinnost integrace (tj.ligace) je ale výhodnější mít kohesivní konce.

Integrace insertu do vektoru se děje tzv. ligací. Ligace se děje prostřednictvím enzymu T4DNA ligázy, která spojuje volné konce. Pro ligační reakci potřebujeme roztok s rozštěpeným klonovacím vektorem, roztok insertu, který nese konce kompatibilní ke štěpeným koncům klonovacího vektoru, ligační pufr, který obsahuje ATP a potřebné soli. Pro úspěšnou ligaci je třeba do reakce dodat vhodný poměr počtu konců vektoru k počtu konců insertu. Tento poměr zjistíme pomocí tohoto vztahu:

Ligaci můžeme provádět v poměru insert : vektor jako 1:1 nebo 2:1 (v tom případě násobíme získanou hodnotu dvěma) nebo jako 3:1 (násobíme získanou hodnotu třema). Ligace se provádí obvykle po dobu 1 hodiny při teplotě 160C nebo přes noc při teplotě 40C. Speciálním, ale hodně používaným postupem ligování je ligování přímo PCR produktů. V současné době se používají dva přístupy, jednak na základě rekombinace jako tzv. Topo cloning (firma

21


Invitrogen, rychlé, účinné, ale drahé) a jednak je to TA cloning, na základě ligace polyT a polyA převisů (např. pGEM od firmy Promega, detailní informace v uvedeném protokolu dále v textu).

INTEGRACE VEKTORU DO BAKTÉRIÍ Vpravování plasmidů do baktérií se označuje jako transformace. Pro transformaci se používají speciálně upravené bakteriální buňky, označované jako kompetentní buňky, tj. buňky, které jsou schopné přijímat cizí DNA. Bakteriální buňky jsou chráněny cytoplasmatickou membránou a buněčnou stěnou. Speciální kultivace kompetentních buněk umožňuje prostupnost jejich buněčné stěny. Prostupnost cytoplasmatické membrány se zajistí při samotné transformaci, a to nejčastěji mírným teplotním šokem (420C). Transformace se provádí jako inkubace plasmidu s kompetentními buňkami na ledu, která je následována krátkým teplotním šokem (30-90s, 420C), kdy se naruší cytoplasmatická membrána a plasmidy se začínají integrovat dovnitř do buněk. Poté se buňky kultivují v tekutém kultivačním médiu při 370C (obvykle 1 hod), v této fázi dochází k regeneraci cytoplasmatické membrány a množení buněk. Buňky se vysejou na pevné kultivační médium v Petriho misce s daným antibiotikem a inkubují přes noc při 370C. Na Petriho miskách z každé kompetentní buňky vyroste jedna kolonie – jeden klon.

SELEKCE Selekce klonů, které obsahují klonovací vektor od klonů, které vektor nenesou: Klonovací vektory, tj. plasmidy nesou gen pro rezistenci k danému antibiotiku. Takže na médiu, které obsahuje dané antibiotikum, rostou pouze ty buňky, které tento vektor obsahují. Selekce klonů, které obsahují klonovací vektor s inzertem od klonů, které obsahují prázdný klonovací vektor: Používá se tzv. modro-bílá selekce, kdy se využívá gen LacZ kódující enzym β galaktosidázu. β-galaktosidáza metabolizuje bezbarvou galaktozu X-Gal na 5-bromo-4-chloro-indoxyl, který dále spontánně oxiduje na modře zbarvený 5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo. V klonovacím vektoru, uvnitř genu LacZ je umístěno klonovací místo. Přítomnost klonovacího místa nenarušuje funkčnost genu, nicméně funkčnost genu je narušena integrací insertu do tohoto místa, kdy dochází k porušení čtecího rámce genu LacZ. Pokud tedy pěstujeme bakterie na médiu obsahující X-Gal, modře zbarvené kolonie jsou kolonie buněk, jejich plasmid neobsahuje insert, na rozdíl od bílých kolonií, jejichž plasmid insert obsahuje. Tento systém je ovšem jenom pomocný, protože do určité míry selhává. Pomáhá nám ale zúžit soubor kolonií, které velmi pravděpodobně obsahují plasmid s vloženou DNA. Pro skutečné ověření, že klony obsahují náš inzert, používáme PCR nebo restrikční štěpení (viz. dále).

OVĚŘENÍ KLONŮ NESOUCÍCH INZERTNÍ DNA To, jestli klon je specifický, tzn., jestli obsahuje naši DNA, můžeme ověřit třemi způsoby: 1. Nejjednodušším způsobem jí tzv. Clontest, což je PCR s primery, které jsou specifické pro klonovaný úsek DNA. Jako templátovou DNA používáme nepatrné množství testované kolonie, které

22


se nabere špičkou a přenese přímo do PCR reakce. Pomocí tohoto testu můžeme poměrně rychle a levně identifikovat specifické kolonie, aniž bychom předtím museli pracně izolovat plasmidovou DNA pomocí „miniprepů“ (viz. níže). 2. Pokud již máme izolovanou plasmidovou DNA, specificitu ověřujeme pomocí restrikčního štěpení s vhodnou kombinací restriktáz, které nám po elektroforetické separaci umožní dle velikosti klonovacího vektoru a velikosti inzertu identifikovat, jestli klon obsahuje inzert či nikoliv. 3. Sekvenování: je nejbezpečnějším způsobem ověření identity klonů. V praxi se používají všechny tři způsoby. 1) Pro prvotní identifikaci se na několika koloniích provede Clontest, což nám umožní určit alespoň několik specifických kolonií. 2) U několika z těchto specifických kolonií se izoluje plasmidová DNA pomoci tzv. miniprepu. U této DNA se provede restrikční štěpení. 3) DNA se osekvenuje, a to buď s primery, které jsou specifické k sekvenci klonovacího vektoru, jako např. T3, T7, SP6 nebo s primery, které jsou specifické k inzertní DNA. Sekvenování nám jednak prokáže správnou orientaci insertu (v některých experimentech je nutné mít inzert zaklonovaný v určité orientaci) a také ověří bezchybnou správnost sekvence zaklonovaného inzertu, což je důležité především v případech, kdy klonujeme PCR produkt, v jehož sekvenci vlivem nepřesnosti PCR mohou být záměny nukleotidů.

PROTOKOLY LIGACE Budeme využívat pGEM vektor od firmy Promega. Tento vektor obsahuje poly-T přesahy v klonovacím místě. Tyto přesahy jsou kompatibilní vůči Apřesahům, které vytváří většina termostabilních polymeráz během PCR. Zvyšuje se tak účinnost ligace PCR produktu do plazmidu a je umožněno klonování PCR produktů. Vlastní pGEMT vektor nese i gen rezistence vůči ampicilinu (Amp) a rovněž umožňuje modro-bílou selekci.

Postup: Výpočet: pGEM je dodáván v koncentraci 50ng/µl, ale pro úsporu je vhodné si naředit tento vektor 10x tj. na koncentraci 5 ng/µl, která je bohatě dostačující. Množství vektoru a inzertu si vypočítáme ze vztahu:

23


Velikost pGEM je 3kb o námi připravené koncentraci 5 ng/µl. Koncentrace inzertu je např. 8 ng/µl a jeho velikost je 800bp tedy 0,8kb. Z uvedeného vzorce vyplývá, že v našich podmínkách, pokud použijeme 1µl vektoru a připravujeme 10µl reakci, musíme použít 1,3 ng inzertu (při poměru 1:1) nebo 4 (při poměru 1:3). Např. se rozhodneme dělat ligaci v poměru 1:3. Reakce : Komponenta Množství H2O 2,5 µl Insert (8 ng/µl) 0,5 µl Vektor (5 ng/µl) 1 µl 2X ligační pufr 5 µl T4 DNA ligáza 1 µl Celkem 10 µl Směs promícháme a zcentrifugujeme. Inkubujeme buď přes noc při 40C nebo hodinu při 160C.

TRANSFORMACE Transformace může být protřednictvím teplotního šoku nebo elektroporací. My uvedeme protokol pro transformaci buněk DH5α teplotním šokem. 1. Kompetentní buňky vyndáme z -800C. Rozehřejeme buď umístěním na led nebo opatrně v ruce. Buňky se ale nesmí zahřát příliš! Rovněž s buňkami, protože mají poškozenou buněčnou stěnu, zacházíme velmi opatrně – netřeseme s nimi, nevortexujeme, necentrifugujeme. Pokud promícháváme, tak špičkou jejím opatrným kroužením. 2. K 50 µl buněk přidáme 2 µl ligační směsi, jemně promícháme (až 25 ng DNA na 50 μl buněk, objem DNA nesmí přesáhnout 5% objemu kompetentních buněk) 4. Inkubujeme 30 minut na ledu 5. Provedeme teplotní šok („heat shock“) umístěním zkumavky s buňkami na 90 sekund do 42 °C 6. Zkumavku rychle přemístíme na led a inkubujeme 1-2 minuty. 7. K buňkám přidáme 800-900 μl SOC media nebo LB medium 8. Inkubujeme na třepačce 45-60 minut v 37°C 9. Připravíme kultivační misky s LB/Amp/IPTG/X-Gal: K rozehřátému pevnému LB médiu, jehož teplota není vyšší než 65°C (jinak by degradoval ampicilin), přidáme ze zásobního roztoku ampicilin do finální koncentrace 100 µg/ml kultivačního média. Pokud máme 0,1g/ml zásobní roztok ampicilinu, na jeden mililitr média přidáváme 1 µl ampicilinu. Médium rozlijeme do misek (cca 25 ml do Petriho misky o průměru 8cm).

24


V 1,5 ml sterilní zkumavce smísíme 64 ul X-Gal (12,5 mg/ml) a 3,5 µl IPTG (240 mg/ml) ze zásobního roztoku, promícháme a naneseme na povrch pevného média a pomocí sterilní skleněné kultivační kličky rovnoměrně rozetřeme po povrchu média. Sterilitu získáme namočením kličky do etanolu a jejím krátkým vypálením nad plamenem. 10. 100 μl buněk rozetřeme sterilní skleněnou kličkou na povrch media. 11. Zbytek buněk centrifugujeme, většinu supernatantu tj. horní fáze odstraníme a ve zbytku supernatantu (cca 100µl) resuspendujeme buňky. V této fázi, buňky již mají obnovenou buněčnou stěnu, takže nejsou náchylné k mechanickému poškození. Buňky naneseme na médium. 12. Inkubujeme misky s buňkami přes noc v 370C. Obvykle je inkubační doba 12-16 hodin, ne výrazně více, jinak baktérie přerostou.

IDENTIFIKACE KLONŮ Bílé kolonie, které nám narostly, přeneseme „přečárkujeme“ na misku s čerstvým médiem a necháme růst alespoň několik hodin nebo lépe přes noc. Provedeme Clontest pro identifikaci specifických kolonií. Tzn. malé, téměř nepatrné množství kolonie přeneseme špičkou do PCR reakce, která obsahuje primery specifické pro náš zaklonovaný fragment. Provedeme PCR za standardních podmínek a vyhodnotíme elektroforeticky. Tento test nám určí, které z bílých kolonií skutečně nesou náš klonovaný fragment.

IZOLACE PLASMIDOVÉ DNA Izolaci plasmidové DNA označujeme jako izolaci miniprepů (pokud je izolováno jen malé množství plasmidové DNA), midiprepů (střední množství), maxiprepů (velké množství) a megaprepů (enormně velké množství). V počáteční fázi ale vždy používáme miniprepů, protože větší množství plasmidu izolujeme až ve chvíli, kdy máme bezpečně ověřenou sekvenci zaklonovaného fragmentu a potřebujeme velké množství plasmidu pro uskladnění či další experimenty. Plasmidovou DNA, kterou skladujeme v -200C můžeme kdykoliv použít pro zpětnou transformaci a izolaci nové plasmidové DNA. Pro izolaci plasmidové DNA používáme komerční kity, kterých je na trhu celá řada. Např. firma Qiagen, Macherey Nagel, Invitrogen. Protože je třeba u těchto kitů dodržovat přesný návod dodávaný výrobcem, nebudeme zde uvádět žádný podrobný protokol.

RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ PLASMIDU Restrikční štěpení plasmidové DNA se provádí za standardních podmínek. Pomocí restrikčního štěpení můžeme jednak identifikovat specifické klony nesoucí zaklonovaný inzert, jednak ho používáme pro vyštěpování určitých úseků v zaklonované DNA či vkládání nových úseků do zaklonované DNA, tj. pro konstrukci chimérické DNA.

SEKVENOVÁNÍ ZAKLONOVANÉHO ÚSEKU DNA

25


Pro sekvenování se často používají primery, které jsou specifické k sekvencím ohraničujícím klonovací místo. U velké části klonovacích vektorů to jsou primery T3, T7 nebo SP6. Sekvence těchto primerů jsou: SP6: ATTTAGGTGACACTATAG, T3: GCAATTAACCCTCACTAAAGG, T7: TAATACGACTCACTATAGGG

26

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: PCR

PCR Polymerázová řetězová reakce (PCR, z anglického Polymerase Chain Reaction) je metoda snadného zmnožení úseku DNA. Množený (amplifikovaný) úsek DNA je na obou svých koncích ohraničen tzv. primery, tj. cca 20-25 nt oligonukleotidy. K syntéze nového vlákna DNA se používá termostabilní DNA polymeráza nejčastěji bakterie Thermus aquaticus, odtud označení Taq polymeráza. PCR probíhá v zařízení zvaném termocykler, které je zkonstruováno tak, aby dokázalo během několika sekund zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia. PCR se sestává z několika kroků: 1. Denaturace - DNA se po dobu 20-30 sekund zahřívá na teplotu 94-98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v molekule DNA a k rozvolnění dvoušroubovice. Vzniká tak jednovláknová DNA, na kterou mohou v dalším kroku nasednout primery. 2. Nasednutí primerů - teplota se sníží na 50-65 °C, což umožňuje nasednutí primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA-primer se váže DNA polymeráza. 3. Syntéza DNA - teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymeráze. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity na 72-80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5' konce ke 3' konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA.

Tyto kroky se cyklicky opakují, pro dostatečnou amplifikaci původní molekuly DNA obvykle postačuje 30 cyklů. V případě, že na začátku byla ve vzorku pouze jediná molekula DNA, po 32 cyklech teoreticky dostaneme až 1 miliardu nasyntetizovaných molekul DNA.

PRIMERY Navržení primerů: Navržení primerů je jedním z klíčových okamžiků pro správný výsledek PCR. Pro standardní PCR navrhujeme primery v párech – tzv. „forward“ primer a „reverse“ primer (viz. dále). Primery můžete navrhnout pomocí některého ze softwarů volně dostupných na internetu nebo je můžete navrhnout „ručně“.

27


Délka a sekvence primerů: Primery jsou obvykle 20-25 nt dlouhé, primery v daném páru musí mít srovnatelný počet GC:AT párů. Upřednostňujeme primery s 50-60% obsahem GC nebo AT párů. Sekvence mezi oběmi primery nesmí být výrazně komplementární, protože by se primery v reakci párovaly mezi sebou a méně by nasedaly ke komplementární sekvenci v templátové DNA (vznik tzv. dimerů). Rovněž nesmí vzniknout komplementarita v rámci sekvence u jednoho z primeru, kdy by došlo ke vzniku vlásenky (viz. obr.) či jiných sekundárních struktur a primer by tak nefungoval. Vždy je bezpodmínečně nutné, aby nasedání primerů bylo bezchybné alespoň v 3’ oblasti primeru. Primery se vždy navrhují podle sekvence horního vlákna, tj. sekvence, která se při běžném zápisu DNA používá. Sekvence forward primeru je totožná se sekvencí horního vlákna. Forward primer umožňuje syntézu horního vlákna podle templátového spodního vlákna. Reverse primer se navrhuje jako komplementární sekvence k hornímu vláknu, která je navíc v reverzní orientaci. Reverse primer umožňuje syntézu dolního vlákna podle templátového horního vlákna.

Teplota nasedání primerů (teplota „annealingu“): Od délky primerů a počtu GC párů se odvíjí teplota nasedání primerů. Čím větší délka a vyšší obsah GC párů, tím je teplota nasedání vyšší (viz. přiložená tabulka). Teplota nasedání primerů musí být dostatečně vysoká, aby nedošlo k nespecifickému nasedání primerů k templátové DNA, pokud by ale byla příliš vysoká, primery by nenasedaly vůbec. Z toho důvodu je třeba, aby teplota nasedání byla optimální pro oba primery a obsah GC párů v obou primerech byl srovnatelný, tzn. aby byla srovnatelná teplota nasedání obou primerů. Pro výpočet teploty primerů můžete použít některý ze softwarů volně dostupný na internetu nebo můžete použít níže přiloženou tabulku. Ředění primerů: Primery přicházejí od výrobce v lyofilizovaném (vysušeném) stavu. Zkumavku s primerem nejprve krátce centrifugujeme a poté primer naředíme na koncentraci 100pmol/µl (tj. 0,1mM). Pro ředění používáme sterilní miliQ vodu, zásadně používáme špičky s filtrem. Množství vody se odvíjí od množství primeru, které bylo nasyntetizováno a které je definováno množstvím molů v protokolu, který výrobce zasílá spolu s primerem. Např. pokud je výtěžek 21,9 nmol, toto množství rozpustíme v 219µl vody a získáme tak 0,1mM roztok. Při ředění primeru postupujeme tak, že do zkumavky s primerem napipetujeme dané množství vody, zkumavku uzavřeme a důkladně zvortexujeme. Získáme tak 0,1mM (100 pmol/µl) zásobní roztok primeru. Tento roztok dále ředíme 10x, tj. do 99 µl vody přidáme 1µl zásobního roztoku. Získáme tak 10µM (10pmol/µl) pracovního roztoku. Roztoky s primery jsou skladovány v -200C.

28


bp 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

6 39 43 45 47 49 51 53 55 57 59

7 41 45 47 49 51 53 55 57 59 61

Teplota nasedání primerů pro daný počet bazí a GC párů Počet GC párů 8 9 10 11 12 13 14 15 43 25 47 49 51 53 55 57 47 49 51 53 55 57 59 61 49 51 53 55 57 59 61 63 51 53 55 57 59 61 63 65 53 55 57 59 61 63 65 67 55 57 59 61 63 65 67 69 57 59 61 63 65 67 69 71 59 61 63 65 67 69 71 73 61 63 65 67 69 71 73 75 63 65 67 69 71 73 75 77

16 59 63 65 67 69 71 73 75 77 79

17

18

65 67 69 71 73 75 77 79 81

67 71 73 75 77 79 81 83

OBJEM A SLOŽENÍ REAKCE Objem reakce: ve většině případů se reakce připravuje v 25µl, ale může se připravovat i v jiných objemech jako 50µl nebo 100µl. V některých případech, jako je třeba Clontest, kdy testujeme velké množství vzorků a chceme šetřit Taq polymerázou a postačuje menší množství produktu, můžeme reakci provádět i v 12 µl. Složení reakce: Reakci tvoří tyto komponenty: Templátová DNA: množství templátové DNA může být nepatrné, příliš velké množství DNA naopak způsobuje v reakci problémy, jako např. nespecifické nasedání primerů. Primery: obvyklá koncentrace každého z primerů v reakci je 0,1-1 µM (tj. 0,1-1pmol/µl). Tzn., pokud máme připravený pracovní roztok 10pmol/µl (tj. 10µM) (viz. část o ředění primerů), pro 25µl reakci použijeme 0,25-2,5µl z obou primerů. Množství primerů musí být optimální. Příliš vysoká koncentrace vede k nespecifickému nasedání primerů na templátovou DNA nebo párování primerů navzájem. Příliš nízká koncentrace primerů může vést k nedostatečnému množství produktu. dNTP směs: obvyklá koncentrace každého dNTP v reakci je 200µM (0.2mM). Množství použité dNTP směsi se odvíjí od koncentrace zásobního roztoku. Většinou je zásobní roztok dNTP směsi o koncentraci 10mM pro každý dNTP. Tedy pokud připravujeme 100 µl PCR reakci, použijeme 2 µl 10mM dNTP, u 25µl reakce použijeme 0,5µl dNTP. MgCl2 : obvyklá koncentrace je 1,5mM. MgCl2 je nutná pro procesivitu a přesnost Taq polymerázy. Koncentrace MgCl2 se odvíjí od koncentrace dNTP a platí, že pro specificitu reakce koncentrace MgCl2 musí převyšovat koncentraci dNTP. Pokud máme koncentraci jednotlivých dNTP 200, 400, 600 nebo 800 µl, koncentrace MgCl2 musí být 1.5, 2, 3, 4 nebo 5mM. Nicméně poměr MgCl2 /dNTP lze v určitých případech pozměňovat (viz. odstavec o reakčních problémech), kdy pro zvýšení specificity reakce zvyšujeme koncentraci MgCl2 a to až k 5mM přičemž koncentraci dNTP držíme stále na např. 1,5mM. Někteří výrobci Taq polymerázy dodávají MgCl2 zahrnuté do reakčního pufru. Reakční pufr: obvyklé složení je 50 mM KCl and 10 mM Tris-HCl, pH 8.3. Reakční pufry jsou dodávány spolu s Taq polymerázou jako 10x koncentrované. Tzn. pro 25µl reakci použijeme 2,5µl dodaného pufru. Reakční pufr dodá reakci potřebnou koncentraci solí a potřebné pH. Koncentrace solí

29


ovlivňuje specificitu reakce, protože ovlivňuje specificitu nasedání primerů. U některých výrobců reakční pufr obsahuje i 1,5mM.MgCl. H2O: voda musí být sterilní, pokud možno miliQ. Vodou doplňujeme reakci na požadovaný objem. Všechny komponenty jsou skladovány v -200C.

SAMOTNÁ REAKCE Reakce se obvykle provádí ve 30 cyklech. Každý cyklus je tvořen denaturací, nasedáním primerů a extensí. Cyklickou reakci předchází úvodní denaturace a ukončuje závěrečná extenze. Obecně: ÚVODNÍ DENATURACE [DENATURACE-NASEDÁNÍ PRIMERŮ-EXTENSE]30X ZÁVĚREČNÁ EXTENSE Úvodní dentaturace: je důležitá především u genomové DNA, kdy tato úvodní denaturace, protože je dostatečně dlouhá, zajistí, že vlákna DNA jsou pro reakci plně rozpletena. Denaturace: 950C, 0,5-1min Nasedání primerů („annealing“) – teplota závisí na sekvenci primerů (viz. přiložená tabulka). Doba nasedání je obvykle 30s, ale může se dle potřeby měnit. Zvýšením doby nasedání primeru můžeme zvýšit výtěžek reakce, ale zároveň také můžeme snížit specificitu nasedání primerů. Extense: 720C, délka závisí na rychlosti polymerázy (informace od výrobce) a délce produktu. Obvykle pokud je délka produktu 100-800 bp, extense je 30s, do 1,5kb extense je 1 min. Závěrečná extense: 4min, 720C. Tato fáze zajistí, že všechny produkty jsou plně dosyntetizovány. Reakce se obvykle zapisuje v tomto zápisu: 950C, 3min[(950C, 30s)-(580C, 30s)-(720C, 60s)]30x720C, 4min

PŘÍPRAVA REAKCE Reakci připravujeme na ledu, tzn. všechny komponenty a reakční směsi máme na ledu, kromě Taq polymerázy. Taq polymerázu máme buď ve speciálním stojánku, který udržuju teplotu okolo -200C nebo ji vyndáme z mrazničky těsně před použitím a umístíme ji na led. Používáme preferenčně špičky s filtrem pro zamezení kontaminace. Používáme negativní a pozitivní kontrolu, pokud je to možné. Pokud připravujeme více vzorků, připravíme si tzv. „master mix“. Tzn., pokud připravujeme 25µl reakcí pro deset různých vzorků DNA, reakční směs si namícháme najednou pro všechny vzorky kromě DNA. Vždy počítáme s jednou reakcí navíc (někdy se stane, že kvůli nepřesnosti pipetováni pro poslední vzorek není dostatek reakční směsi). Takže např. místo 1 µl primeru přidáme 11µl primeru, místo 2µl dNTP směsi přidáme 22µl dNTP směsi, atd. Výslednou směs důkladně zvortexujeme a rozpipetujeme do připravených PCR zkumavek, do kterých poté přidáme testovanou DNA. Reakce máme stále na ledu.

30


Zapneme a naprogramujeme cycler a vložíme vzorky. Příklad přípravy PCR reakce: Komponenta (koncentrace) H2O Templátová DNA 50mM MgCl2 10x PCR pufr Primer 1 (10µM) Primer 2 (10µM) dNTP mix (10mM) Taq DNA polymeráza (5U/µl) CELKEM

Komponenta (finální koncentrace) 18,6 µl 0,5 µl 0,75 µl (1,5mM) 2,5 µl (1x) 1 µl (0,4 µM) 1 µl (0,4 µM) 0,5 µl (0,2 mM) 0,125 µl (0,2U/ µl) 25µl

PROBLÉMY S PCR Produkt v negativní kontrole: Způsobeno kontaminací buď při přípravě reakce nebo kontaminací přímo v některé chemikálii. Žádný nebo slabý produkt: 1. Snižte teplotu nasedání primerů 2. Zvyšte koncentraci primerů nebo množství templátové DNA nebo Taq polymerázy. 3. Změňte koncentraci KCl. Zvyš koncentraci pokud očekávaný produkt je kratší než 1kb nebo koncentraci snižte pokud očekávaný produkt je delší než 1kb. 4. Přidejte BSA na koncentraci 0,1-0,8 µg/µl 5. Zkontrolujte správnost sekvence primerů. 6. Můžete zkusit kombinaci bodů 1-5. Dlouhé nespecifické produkty: 1. Snižte čas nasedání primerů 2. Zvyšte teplotu nasedání primerů 3. Snižte čas extense 4. Snižte teplotu extense na 62-680C. 5. Zvyšte koncentraci KCl 1,2x-2x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5-2mM. 6. Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3-4,5 mM ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou. 7. Použijte méně primerů nebo templát nebo Taq polymerázy

31


8. Kombinujte body 1-7 Krátké nespecifické produkty: 1. Zvyšte čas nasedání primerů 2. Zvyšte teplotu nasedání primerů 3. Zvyšte čas extense 4. Zvyšte teplotu extense na 62-680C. 5. Snižte koncentraci KCl 0,7-0,8x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5-2mM. 6. Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3-4,5 mM ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou. 7. Použijte méně primerů nebo templát nebo Taq polymerázy 8. Kombinujte body 1-7

32

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Southernova hybridizace

SOUTHERNOVA HYBRIDIZACE Southernův přenos (resp. Southern blot či Southern blotting) a Southernova hybridizace je biochemická hybridizační metoda využívaná při práci s DNA. Vyvinul ji Edwin Southern. Umožňuje přenos fragmentů DNA z agarového gelu, v němž probíhala elektroforéza, na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu. Přenesená DNA je na membráně vizualizovaná díky hybridizaci s radioaktivně nebo fluorescenčně značenou sodnou. Obdobou Southernovy hybridizace je Northern hybridizace, kdy přenášeným a hybridizovaným vzorkem je RNA. Celý proces se sestává z těchto kroků: Elektroforetické separace DNA, Příprava DNA k hybridizaci: denaturace a neutralizace DNA Přenos DNA na membránu: kapilárním přenosem je DNA z gelu přenášena na membránu UV crosslinking: Kovalentní uchycení DNA na membránu pomocí UV Příprava sondy: sondy jsou buď značeny přímo např. radioaktivně nebo nepřímo. Nepřímo značené sondy jsou např. sondy s navázaným digoxigeninem, který je pak detekován chemiluminiscenčně. Hybridizace DNA se sondou: hybridizace se provádí nejčastěji v hybridizačních válcích v hybridizační peci Promývání nespecificky navázané sondy Detekce sondy: Radioaktivní sondy či jinak přímo značené sondy jsou detekovány ihned po promytí. U nepřímo značených sond je třeba ještě udělat dodatečnou vizualizaci sondy.

V našem případě uvádíme kompletní protokol pro hybridizaci se sondou značenou DIGem. Takto značená sonda je detekována chemiluminiscenčně.

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE FRAGMENTŮ GENOMOVÉ DNA Připravit agarózový gel (asi 15 cm dlouhý) v 1x TAE pufru. Připravit DIG-marker: smíchat 4 µl DIG-markeru + 12 µl NF H 2 O + 4 µl Loading buffer a inkubovat 10 min při 65°C, pak krátce centrifugovat. Nanést vzorky naštěpené DNA (obvykle 1 μg / line) a DIG -marker (10 µl na každou stranu vzorků) do jamek a nechat běžet gel při 5 V/cm v 1x TAE pufru po 2-4 h (až je bromphenolová modř asi 10 cm od startu). Lehce obarvit ethidium bromidem a rychle vyfotit (dlouhá expozice UV záření ničí DNA). Tento krok slouží k tomu, abychom se ujistili, ze DNA je dobře naštěpená a její koncentrace v jednotlivých jamkách je přibližně stejná.

33


SOUTHERN BLOTTING DENATURACE DNA [Varianta s kapilárním přenosem a inkubací s HCl kvůli degradaci dlouhých fragmentů DNA, příliš dlouhých pro kapilární přenos; všechny inkubační kroky provádět za mírného třepání.] 1. Ponořit gel do 0.25 M HCl na 10 min (až se modrá barva bromfenolové modře změní na žlutou). Při tomto kroku se DNA fragmentuje na menší kusy, které jsou schopné přelézt na membránu. 2. Opláchnout gel 2x destilovanou vodou. 3. Ponořit gel do denaturačního roztoku na 2x 15 min při RT. 4. Opláchnout gel 2x destilovanou vodou. 5. Ponořit gel do neutralizačního roztoku na 2x 15 min při RT. Zároveň začít připravovat sendvič Doporučení: používat rukavice bez pudru a membránu přenášet pinzetou za okraje! Pro lepší orientaci po hybridizaci je vhodné odstřihnou jeden z rohů gelu. TRANSFER DNA NA MEMBRÁNU - s použitím 20x SSC zvlhčit filtrační papír, pomocí kterého připravíme můstek. Zvlčený papír položíme na stojánek, kterým může být např. krabička otočená dnem vzhůru. Stojánek s filtračním papírem umístíme do větší misky, tak aby filtrační papír dosahoval po svém obvodu na dno misky. Z pod filtračního papíru odstraníme případné bubliny, např. skleněnou tyčinkou. Na filtrační papír umístíme gel, a to vrchní stranou vzhůru (jamky dnem vzhůru). Odstraníme bubliny, které se případně vytvořily pod gelem. Zalijeme trochou 20xSSC. - obložit (ale nepřekrýt) gel kusy parafilmu či folie (parafilm má zabránit případnému vzlínání pufru mimo gel a membránu) - na gel položíme nylonovou membránu Hybond N+ (předvlhčenou vodou), která přesahuje v obou rozměrech velikost gelu o 1mm a má také ustřižený jeden z rohů, položit na gel tak, aby se oba ustřižené rohy překrývaly. Opět odstraníme bubliny. - Na nylonovou membránu položíme 2x filtrační papír (předvlhčený v 20x SSC) se stejným rozměrem jako gel - poté položíme 6-10cm vrstvu buničiny nastříhané podle rozměru gelu - přiložíme rovnou desku (sklo) a zatížíme přibližně 500g.

34


Do misky nalít 20x SSC tak, aby hladina byla pod horním okrajem stojánku a nechat působit nejméně 6 h, ale je lepší nechat přes noc - více než 15 h).

PROMYTÍ MEMBRÁNY A UV CROSSLINKING Rozebereme sendvič a překlopíme membránu s gelem na suchý filtrační papír (gelem nahoru). Popisovačem či měkkou tužkou propiš jamky na gelu na membránu (to je důležité pro budoucí orientaci membrány – čili kde je nahoře a kde dole). Odstranit gel z membrány a membránu opláchnout 5 min v 6x SSC (kvůli úplnému odplavení zbytků gelu). Membránu necháme okapat a položíme na suchý filtrační papír. Suchou membránu fixujeme ve Stratagene UV crosslinkeru (přednastavená hodnota - 120 mJ) nebo membránu zapéčeme (20 min při 120°C; pokud nitrocelulózová membrána - zapéct 1 hod při 80°C). Pozitivně nabitou nylonovou membránu teoreticky není potřeba fixovat, ale stejně to každý dělá). Opláchnout membránu v 2x SSC. Pokud se nebude hned provádět hybridizace a chemoluminiscenční detekce, nechat membránu uschnout, ještě trochu vlhkou zabalit do folie a skladovat +4°C.

HYBRIDIZACE Vytemperujeme 25 ml DIG Easy Hyb na 42°C. Pro prehybridizaci ponoříme membránu do 18 ml předehřátého DIG Easy Hyb a inkubujemet 30-60 min při 42°C za mírného třepání. Hybridizační roztok: - smíchat 50 ng (1,5 μl) sondy s 50 µl vody a denaturovat 5 minut v 95°C. Pak rychle zchladit na ledu. Sondu napipetovat do 6,5 ml předehřátého DIG Easy Hyb a promíchat (sondu nikdy nepipetovat přímo na membránu, protože by se tím zvýšilo pozadí). Odstraníme beze zbytku prehybridizační roztok (prehybridizační roztok lze používat opakovaně) a ihned zalít membránu hybridizačním roztokem. Inkubujeme nejméně 3 h při 42°C za mírného třepání. Odstraníme hybridizační roztok.

35


Promyjeme membránu dostatečným množstvím “Stringent wash buffer I” 2 x 5 min při RT za mírného třepání. Promyjeme membránu dostatečným množstvím předehřátého “Stringent wash buffer II” po 15-20 min při 68°C ve vodní lázni za mírného třepání.

CHEMILUMINISCENČNÍ DETEKCE Promýváme membránu ve 100 ml čerstvě připraveného “1x Washing buffer” 1-5 min při RT za mírného třepání. Inkubujeme ve 100 ml čerstvě připraveného “1x Blocking solution” 30 min při RT za mírného třepání. Inkubujeme v 50-100 ml pracovního roztoku Anti-DIG-AP 30 min při RT za mírného třepání. Promýváme membránu 2 x 15 min ve 200 ml “1x Washing buffer” při RT za mírného třepání. Inkubujeme ve 100 ml “1x Detection buffer” 2-5 min při RT za mírného třepání. Odstraníme detekční pufr a očistíme membránu od zbytků kapaliny položením na filtrační papír (strana s DNA vzorky nahoře). Membrána nesmí uschnout! Ihned položit vlhkou membránu (strana s DNA vzorky nahoře) na otevřenou spodní stranu hybridizačního sáčku a rychle nanést na membránu 40 kapek (asi 3 ml) roztoku substrátu. Ihned přikrýt svrchní stranu hybridizačního sáčku tak, aby se rovnoměrně a bez bublin rozptýlil substrát. Inkubujeme membránu 5 min až hodinu při RT. Vymačkáme nadbytečný substrát a uzavřít okraje hybridizačního sáčku lepící páskou. Výsledek dokumentujeme pomocí CCD kamery LAS-3000.

CHEMIKÁLIE A ROZTOKY DIG-DNA markery: DNA Molecular Weight Markers, DIG-labeled (Roche) podle potřeby Membrána: Hybond-N+ (Amersham Biosciences) cat. RPN203B Prehybridizační a hybridizační roztok: DIG Easy Hyb (Roche) cat. 11 796 895 001

36


Detekce: DIG Wash and Block Buffer Set (Roche) cat. 11 585 762 001 Protilátka k DIG značené sondě: Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments (Roche) cat. 11 093 274 910 Chemoluminiscenční substrát: CDP-Star ready to use (Roche) cat. 11 759 051 001

PŘÍPRAVA PRACOVNÍCH ROZTOKŮ Solution

Content

Preparation

1x TAE buffer

0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA, ph 8.0. Nařeď z 50x TAE 1:49.

Store RT

Příprava 50x TAE: 242 g Trizma base v 500 ml H2O, přidej 100 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0), doplň na 1 litr. HCl sol.

0.25 M HCl Na 200 cm2 membrány asi 250 ml.

Denaturation sol. 0.5M NaOH, 1.5 M NaCl Na 200 cm2 membrány asi 500 ml. Neutralization sol. 0.5 M Tris-HCl, 3M NaCl, pH 7.5 Na 200 cm2 membrány asi 500 ml. 20x SSC

24 ml 35% HCl (10.7 M) + 1000 ml RT H2O 20 g NaOH + 87.66 g NaCl rozpustit RT v H2O a doplnit na 1000 ml 63.5 g Trizma HCl + 11.8 g Trizma RT Base + 175.33 g NaCl rozpustit v H2O a doplnit na 1000 ml

3 M NaCl, 0.3 M Sodium citrate, pH 7.0

RT

Příprava 20x SSC: 175.32 g NaCl + 88.32 g Tri-Natrium citrate Dihydrate rozpustit v H2O a doplnit na 1000 ml => upravit na pH 6.4 (1 N HCl) - 2x SSC bude mít pH 7.0. 2x SSC

Nařeď dle potřeby z 20x SSC 1:9

RT

Stringent buffer I

wash 2x SSC, 0.1% SDS

Pro 500 ml roztoku: 50 ml 20x SSC RT + 5 ml 10% SDS + 445 ml H2O

Stringent buffer II

wash 0.2x SSC, 0.1% SDS

Pro 500 ml roztoku: 5 ml 20x SSC + RT 5 ml 10% SDS + 490 ml H2O

Washing buffer 1x Maleic acid 1x

Nařeď dle potřeby z 10x Washing RT buffer 1:9 (celkem 300ml) Nařeď dle potřeby z 10x Maleic NE! acid buffer 1:9 (celkem 180 ml)

37


Blocking sol. 1x 1x Anti-DIG-AP working sol. Detection buffer 1x

Nařeď Blocking buffer 1x Maleic RT acid” pufrem 1:9 (t.j. 180ml MA + 20ml Blocking buffer) Naředit přiměřené množství 1x blokovacím roztokem na finální NE! koncentraci 75 mU/ml (tj. 1:10000 t.j. 1µl/10ml). (celkem 50-100ml) Nařeď dle potřeby z 10x Detection RT buffer 1:9 (celkem 100 ml)

38

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Western blot

WESTERN BLOT Western blot je analytická technika používaná k detekci specifického proteinu ve směsi s dalšími proteiny, např. ve vzorku homogenátu tkáně či jiného biologického vzorku. Nejběžněji typem je SDS‐PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis). V přítomnosti SDS dochází k denaturaci proteinů a zároveň SDS dává proteinům záporný náboj. Tímto jsou při elektroforéze proteiny děleny podle své hmotnosti (udává se v kDa). Malé protein cestují sítí akrylamidového gelu rychleji, proteiny o velké molekulové hmotnosti se pohybují směrem k anodě pomaleji. Vzorky jsou nanášeny na gel do jamek, z toho jedna lajna je ponechána pro tzv. ,,Size marker“, neboli řebříček. Jedná se o komerčně dostupnou směs proteinů o známé velikosti, které jsou již značené a tedy viditelné.

39


Aby se proteiny mohly detekovat pomocí protilátky, nejprve se musí přenést z gelu na povrch nitrocelulosové, v dnešní době vice používané polyvinylové (PVDF) membrány. Tato metoda se jmenuje elektroblot. Působením elektrického proudu dochází k přenosu proteinů z gelu na povrch membrány. Protože elektrické pole působí kolmě na rovinu gelu, jsou proteiny přeneseny na membránu ve stejné orientaci. Membrány mají vlastnost, že nespecificky vážou všechny proteiny. Avšak jak protilátky, tak detekované antigeny jsou proteiny, to znamená, že nespecifické vázání protilátky by dávalo falešný výsledek. Z tohoto důvodu se musí zabránit interakci membrány a protilátky. Po elektroblotu se membrána nejprve blotuje v roztoku nějaké komerčně dostupné směsi proteinů. Nejčastěji se používá 3‐5 % Bovine Serum Albumin (BSA) nebo non‐fat dry milk, společně s malým množstvím slabého detergentu (Tween 20 nebo Triton X‐100). Tímto se zaplní volná místa na membráně a protilátka se může vázat pouze na svůj specifický antigen.

Protilátková detekce proteinů se obvykle provádí ve dvou krocích. Při imunizaci zvířete antigenem (protein našeho zájmu) dochází k tvorbě specifických protilátek, které rozeznávají antigen nebo jeho určitou část. Následně se imunitní buňky produkující protilátku kultivují a protilátka se purifikuje. Po vysycení membrány se membrána inkubuje s primární protilátkou. Roztok je vždy složen z 1x PBS opět s přídavkem BSA nebo mléka a detergentu. Po skončení je třeba membránu zbavit nenavázané primární protilátky. V dalším kroku je membrána inkubována v sekundární protilátce. Ta se vyrábí imunizací zvířete jiného druhu, než ve kterém byla připravena primární. Jako antigen se používá část primární protilátky. Například když je primární protilátka králičí, sekundární může být připravena v myši. Sekundární protilátka je označena nějakou značkou (biotin) nebo konjugována s nějakým reportérovým enzymem umožňující vizualizaci ‐ např. peroxidásou (HRP, z angl. horseradish peroxidase) či alkalickou

40


fosfatasou (AP, z angl. alcalic phosphatase). Výhodou tohoto dvou stupňového procesu je amplifikace signálu (na jednu primární protilátku se váže vice sekundárních). Po odstranění volné protilátky můžeme detekovat protein na membráně. Hojně užívaný je chemiluminiscenční způsob: reportérový enzym (peroxidása) přeměňuje chemilumiscenční substrát na nestabilní produkt, který se stabilizuje vyzářením kvanta světla. Množství světla je poté úměrné množství peroxidásy, které je přímo úměrné množství daného proteinů. Uvolňované světlo je pak detekováno použitím CCD‐kamer.

V praxi se však mnohdy setkáváme s dalšími proužky na membráně (tzv. falešná pozitiva). Pro určení správného bandu nám může posloužit marker molekulových vah. Pro kvantifikaci je dobré opakovat blotování membrány za použití protilátky proti strukturnímu proteinu (aktin nebo tubulin). Množství těchto proteinů by mělo být stejné u všech vzorků, pokud byly naneseny rozdílné množství vzorků, nebo u některých došlo k špatnému přenosu z gelu na membránu, můžeme za použití strukturálních proteinů provést normalizaci.

41


PROTOKOL Potřebné roztoky Separating Buffer 1.5 M Tris-HCl, 0.4 % SDS, pH 8.8 Stacking Buffer 0.5 M Tris-HCl, 0.4 % SDS, pH 6.8 Acrylamide / Bis-Acrylamide poměr 29 : 1 APS 10 % 10x PBS 80 g NaCl 2 g KCl 14.4 g Na2HPO4 2.4 g KH2PO4 Rozpusť v 800 ml dH2O, uprav pH na 7.4, doplň do 1000 ml. 1x Ponceau S Ponceau S 2% (w/v) TCA 3% (w/v) (dá se použít vícekráte). 10x Running Buffer 30.3 g (0.25 M) Tris Base 144 g (1.92 M) Glycine 10 g (1%) SDS qs 1000 ml dH2O. 10x Electrotransfer Buffer 30.3 g Tris Base 144 g Glycine qs 1000 ml ddH2O 1x Electrotransfer Buffer 100 ml 10x Electrotransfer Buffer 200 ml methanol 700 dH2O SDS-PAGE Gel a Western Blot. 1. Příprava gelu (10 %) Separační gel Smícháme ddH2O

6.25 ml

42


AA : bisAA 4.99 ml Separating Buffer 3.75 ml Zahřejeme v mikrovlnce, prudce zchladíme na ledu. Přidáme

10 % APS 112 ul Temed 11.25 ul Nalijeme gel (zastavíme 1 cm pod hřebínkem), přelijeme 100% izopropanolem

Stacking gel Smícháme ddH2O 4.5 ml AA : bisAA 1.05 ml Stacking Buffer 1.88 ml Zahřejeme v mikrovlnce, prudce zchladíme na ledu. Zatím vylijeme izopropanol a opláchneme gel dH2O, osušíme filtračním papírem. Přidat

10 % APS Temed Nalijeme gel, vsuneme hřebínky

30 ul 10 ul

2. Naneseme vzorky na gel, 10 ul / jamku (pozor nedávat moc vzorku). 3. Necháme běžet SDS-PAGE dokud modrá barva nebude vespod gelu. Podmínky elektroforézy: 60 V 30 min 90 V cca 2h (modrá barva vespod zastav) 4. Transfer: Přenos z gelu na PVDF membránu. Namočíme membránu v 100% methanolu 20 sec ddH2O 2 min 1x transfer buffer 5 min. Sestavíme aparaturu v následujícím pořadí: svorka (černá strana) houba Whatmanův papír  gel  membrána Whatmanův papír houba svorka (bílá strana) Vložíme do přenosové aparatury, černá strana úchytu sousedí s černou aparatury.

43


Electrotransfer: 35-40 V, přes noc (chladíme pomocí chladícího gelu) 5. Ponoříme do 1x Poncea S po dobu 5 min, poté odbarvíme použitím kyselé dH2O. 6. Blotujeme membránu 1-3 h. v 1x PBS + 5% non-fat dry milk + 0.05% Tween 20, zavaříme do plastického sáčku. Membrána nesmí uschnout!!! 7. Promyjeme 3 x 5 min v 1x PBS + 0.05% Tween 20 8. Inkubujeme s primární protilátkou (ředění 1 : 1000 v 1x PBS + 5% milk + 0.05% Tween 20. Inkubujeme 1 h. při 4ºC). Zavaříme do plastického sáčku. 9. Promyjeme 3 x 5 min v 1x PBS + 0.05% Tween 20 za pokojové teploty 10. Inkubujeme v 1x PBS + 10% milk + 0.05% Tween 20 po dobu 10 min. 11. Inkubujeme se sekundární protilátkou (ředění 1 : 5000, po dobu 30 min za pokojové teploty v 1x PBS + 5% milk + 0.05% Tween 20). Zavaříme do plastického sáčku.

12. Promyjeme 3 x 5 min v 1x PBS + 0.05% Tween 20 za pokojové teploty . 13. Detekujeme proteiny pomocí Thermo Super Signal kit (2 ml / membránu). V čisté falkonce smícháme tmavý a světlý ECL roztok v poměru 1 : 1. Osušíme membránu na filtračním papíru, naneseme ECL roztok a 5 min. inkubujeme zabalený v plastiku, zakryjeme před světlem. Osušíme membránu na filtračním papíru, zabalíme do plastiku a detekujeme pomocí CCD kamery. Membrána nesmí uschnout!

44

Ekotech: Kurz základních metod molekulární biologie: Seznam a příprava chemikálií

SEZNAM A PŘÍPRAVA CHEMIKÁLIÍ Antifade - 0,233g DABCO (1,4-diazobiocyclo (2.2.2.) Octan, Sigma) - 800 μl miliQ H2O - 200 μl 1M Tris-HCl, pH 8,0 - 9 ml glycerol (Merk, No. 1-12011, water-free) store at +4°C Biotinylated antistreptavidin (Vector, No. BA-0500, bought from Camon, Wiesbaden) - reconstitution in 1 ml of miliQ water , add 0,6 ml of glycerol - aliquot and store at –20°C Blocking solution (BSA - Biomol, Albumine, bovine, Fraction V) 2,5% BSA in 4xSSC (5g BSA/40ml 20x SSC + 160 ml miliQ H2O) - incubate for 5 hours in 4oC, then filter by 0,45 m "pore filter" - aliquot and store at –20°C DAPI (Diamidino-2-Phenylindole, Sigma No. D9542) - 1mg/5ml miliQ H2O store in dark at +4°C 50x Denhardt's reagens - 2,5g Ficol (400, Pharmacia) - 2,5g Polyvinylpyrolidon - 2,5g BSA (Pentax fraction V - Gebra BSA H1) - fill to volume 250ml by miliQ H2O - filter by 0,45 m "pore filter" - do not autoclave - aliquot and store at –20°C Dextran sulphate (Serva No.18705) 20% in 4xSSC - 20g Dextran sulphate / 100ml 4xSSC (4xSSC prepare of 20x SSC, pH 7.0) - dilute in 70°C in water bath, vortex and aliquot - aliquot and store at –20°C 0,5M EDTA (pH 8) (100ml) 18,61g Na2EDTA + 2gNaOH, dilute in 80 ml miliQ H2O - adjust to pH 8,0 - fill up with miliQ water to volume 100ml - autoclave and store in room temperatute Ethidium bromide stock solution c=10mg/ml final concentration for gel staining 0,5ug/ml, e.g. 5ul/100ml destiled H2O

45


Loading buffer with EDTA Bromfenol blue (0,05% w/v) Sucrose 40%w/v EDTA 0,1M, pH 8 SDS 0,5w/v Na-acetate (3M) 408,1g Na-acetate dilute in 800ml miliQ H2O, - adjust to pH 5,2 by cold acetic acid - fill up to volume 1 liter 1x PBS buffer miliQ H2O 0,15M NaCl KCl KH2PO4 0,05M Na2HPO4.12H2O

1 liter 8,0g 0,2g 0,2g 2,3g

2 liters 3 liters 16,0g 24,0g 0,4g 0,6g 0,4g 0,6g 4,63g 6,9g

- dilute in 80% of final volume (e.g. in 800 ml or 1600 ml or 2400 ml) - adjust to pH 7,3 - fill up o the final volume (e.g. to 1000 ml or 2000 ml or 3000 ml) - filter (0,45 m "pore filter") and autoclave - store at +4oC or room temperature When PBS buffer is widely used, it is more comfortable to make 10x PBS by simple multiplication of amounts of all components by 10 and dilute them in same volume of water. 10xPBS is then diluted to 1x before use. Rnase A 10 mg/ml in 0,01M Na-acetate or in water - 15 min boil and then slowly cool down to room temperatute - adjust pH by addition of 0,1 volume of Tris HCl (pH 7.4) - aliquote and store at –20°C Note: Rnase A is a small protein, which can survive 100°C, unlike DNAses. This treatment removes the posible traces of DNases from the Rnase solution. Streptavidin conjugted with Cy 3 (Jackson Research Laboratories, No. 016-160-084) - reconstitute in 0.6 ml of miliQ water, add 0.6 ml of glycerol - aliquote and store at –20°C 10% SDS (Sodium dodecyl sulphate) - 100g SDS dilute in 900 ml autoclaved miliQ H2O at 68oC - adjust pH to 7.2 by several drops of concentrated HCl - fill up to volume 1 liter Be carefull during weighing SDS, breathing in the crystals of SDS can be harmfull.

46


20x SSC pufr miliQ H2O 3M NaCl 0,3M sodium citrate (C6H5O7Na3 . 2H2O)

1liter 175,32g 88,23g

2 liters 350,64 176,46g

3 liters 525,96g 264,69g

- dilute in 80% of final volume (e.g. in 800 ml or 1600 ml or 2400 ml) - adjust to pH 7.0 - fill up o the final volume (e.g. to 1000 ml or 2000 ml or 3000 ml) - filter (0,45 m "pore filter") and autoclave - store at +4oC or room temperature 50x TAE buffer for elfectrophoresis 242g Trizma Base + 57,1 ml cold acetic acid + 100ml EDTA (pH 8) - fill up to volume 1 liter. - store at +4°C For eletrophoresis and making electrophoretic gels the TAE buffer has to be diluted to 1x. TE buffer 0,01M Tris HCl, 0,001M EDTA (pH 8,0) Stock: 100x TE buffer: 88,8g Tris HCl 53g Trizma Base 37,2 g EDTA dilute in 800 ml of water, adjust to pH 8.0 and fill up to 1 liter. Store at +4°C. Before use the 100x TE buffer has to be diluted to 1x TE. 1M Tris-HCl (pH 8) (500ml) 44,4g Trizma HCl + 26,5g Trizma Base dilute in 400 ml miliQ H2O - adjust to pH 8,0 (by 1M NaOH or 1M HCl) - fill up by miliQ water to volume 500 ml - autoclave and store at room temperature 0,01M Tris-HCl (pH 8) (500ml) - dilute 1M Tris-HCl 100x 1M Trizma Base (500ml) 60,5g Trizma dilute in miliQ H2O and fill up to volume 500 ml - autoclave - store at room temperature 1M Tris-HCl (pH8) 8,88g Trizma HCl + 5,3g Trizma HCl dilute in 80ml miliQ H2O - adjust to pH8 by 1M HCl - fill up to volume 100ml

47

KURZ ZÁKLADNÍCH METOD MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE

Recommend Documents