WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK

WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK

EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I.

31. 8. – 5. 9. 2014

OPVK - WORSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE, září 2014

WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK

BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. 31. 8. – 5. 9. 2014

V RÁMCI PROJEKTU

ROZVOJ MODERNÍCH TRENDŮ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII: VÝZNAM BIOMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ PRO FUNKCI BUNĚČNÝCH STRUKTUR

OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/30.0019

-3-


WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE sborník editoval: Václav Brázda autoři: Václav Brázda, Miroslav Fojta, Michaela Vorlíčková, Ctirad Hofr, Petr Pečinka, Iva Kejnovská Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2014 Česká Republika První vydání ISBN: 978-80-87541-09-8

-4-


Obsah Program workshopu 31. 8. - 5. 9. 2014, Brno ............................................................. 6 Umístění.................................................................................................................. 8 Přednášky................................................................................................................... 9 Elektrochemie biopolymerů ..................................................................................... 9 Spektroskopie DNA ............................................................................................... 10 Fluorescenční metody studia biomolekul .............................................................. 11 Metody studia interakce proteinů s DNA ............................................................... 12 Praktická cvičení ....................................................................................................... 14 Spektroskopie DNA - stanovení struktury a koncentrace ...................................... 14 Enzymatická syntéza značené DNA, magnetická separace a elektrochemická detekce ................................................................................................................. 18 Sledování změn struktury DNA pomocí elektrochemických metod na rtuťových elektrodách - AC voltametrie ................................................................................. 21 Fluorescenční značení proteinu ............................................................................ 23 Stanovení koncentrace DNA pomocí mikrofluorometru ........................................ 27 Imunolokalizace modifikovaných histonů H3metK4 a H3metK9 ........................... 28 Izolace rostlinných buněčných jader .................................................................. 28 Imunodetekce .................................................................................................... 29 Imunodetekce 5-metylcytozinu .............................................................................. 30 Praktické úlohy firmy Biotech.................................................................................... 32 Real-time PCR (qPCR) ......................................................................................... 32 Izolace plazmidové DNA ....................................................................................... 34 Prezentace firem ...................................................................................................... 37

-5-


Program workshopu 31. 8. - 5. 9. 2014, Brno

Neděle 31. srpna 2014 15:00 - 19:00

Registrace a ubytování

od 19:00

Slavnostní zahájení workshopu s večeří

Pondělí 1. září 2014 9:00 - 9:15

Úvodní slovo organizátorů workshopu (M. Fojta)

9:15 - 10:15

Elektrochemie biomolekul (M. Fojta)

10:15 - 10:30

Přestávka s občerstvením

10:30 - 11:30

Spektroskopie DNA (M. Vorlíčková)

12:00 - 14:00

Oběd

14:00 - 15:00

Interaktivní škola pipetování (Eppendorf)

15:00 - 15:30


15:30 - 17:00

Interaktivní škola pipetování (Eppendorf)

19:00

Večeře

Úterý 2. září 2014 9:00 - 10:00

Fluorescenční metody studia biomolekul (C. Hofr)

10:00 - 10:30


10:30 - 11:30

Metody studia interakce proteinů s DNA (V. Brázda)

12:00 - 14:00

Oběd a přesun do laboratoří

14:00 - 18:00

Rozdělení na skupiny, které budou řešit praktické úlohy na 2 stanovištích v UKB MU a 3 stanovištích na BFÚ AVČR

19:00

Večeře

-6-


Středa 3. září 2014 9:00 - 10:00

Prezentace firem (Biotech)

10:00 - 10:15


10:15 - 11:00

Prezentace firem (Eppendorf)

11:00 - 12:00

Prezentace firem (Biotech)

12:00 - 14:00

Oběd a přesun do laboratoří

14:00 - 18:00

Rozdělení na skupiny, které budou řešit praktické úlohy na 2 stanovištích v UKB MU a 3 stanovištích na BFÚ AVČR

19:00

Večeře

Čtvrtek 4. září 2014 9:00 - 12:00

Exkurze do významných pracovišť MU

12:00 - 14:00

Oběd a přesun do Mendelova muzea

14:00 - 16:00

Prohlídka Mendelova muzea

19:00 – 21:00

Slavnostní večeře a zakončení workshopu

Pátek 5. září 2014 9:00 - 11:00

Závěrečná diskuze účastníků s pořadateli a evaluace workshopu

-7-


Umístění Workshop (ubytování, stravování a dopolední přednášky) probíhá v hotelu Santon, Přístavní 38, Brno

Praktická cvičení probíhají na Biofyzikálním ústavu AV ČR, Královopolská 135, Brno

a v kampusu Masarykovy univerzity v Brně, Kamenice 5, Brno

-8-


Přednášky

Elektrochemie biopolymerů Doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc. Nukleové kyseliny a proteiny jsou elektroaktivní látky poskytující analyticky využitelné elektrochemické signály na různých typech pracovních elektrod. Tyto signály mají původ v redukci a oxidaci složek biopolymerů (nukleobází, aminokyselin), adsorpčně-desorpčních a v případě bílkovin rovněž elektrokatalytických procesech. Elektrochemické chování nukleových kyselin i bílkovin je závislé na jejich struktuře. Kromě vlastní elektrochemické aktivity biopolymerů se často využívá rovněž jejich značení různými elektroaktivními skupinami, které pomáhají zvýšit citlivost a selektivitu daného měření. V rámci této přednášky budou vysvětleny základní principy, jimiž se řídí chování přírodních a chemicky modifikovaných biopolymerů na elektrodách, a budou uvedeny příklady využití elektrochemických metod ve studiu nukleových kyselin, proteinů a v praktických bioanalytických aplikacích. Literatura: M. Fojta, Detecting DNA damage with electrodes. in: E. Palecek, F. Scheller, and J. Wang, (Eds.), Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics, Elsevier, Amsterdam, 2005, pp. 386-430. Hocek M, Fojta M, 2011. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chemical Society Reviews 40, 5802-14. Paleček E, Bartošík M, 2012. Electrochemistry of nucleic acids. Chem. Rev. 112 3427-3481 E. Palecek, Electroactivity of proteins and its possibilities in biomedicine and protemics. in: E. Palecek, F. Scheller, and J. Wang, (Eds.), Electrochemistry of nucleic acids and proteins. Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics., Elsevier, Amsterdam, 2005, pp. 690-750. -9-


Spektroskopie DNA prof. RNDr. Michaela Vorlíčková, DrSc. Přednáška bude věnována elektronické spektroskopii absorpční a cirkulárně dichroické (CD), jejich principům a využití pro studium DNA. Absorpční spektroskopie slouží k základní charakterizaci nukleových kyselin, tj. ke stanovení koncentrace a čistoty studovaných preparátů a stability jejich uspořádání. CD spektroskopie je užitečným, extrémně citlivým a relativně finančně nenáročným nástrojem pro stanovení globální struktury nukleových kyselin. Může být použita pro nízké i vysoké koncentrace studovaného materiálu, pro krátké i dlouhé molekuly, přičemž studované preparáty mohou být titrovány různými agens vyvolávajícími strukturní izomerizace. Průběh spektrálních změn umožňuje rozlišit konformační změny v rámci jedné struktury a kooperativní přechody mezi diskrétními strukturními stavy. CD lze použít k měření kinetiky vzniku jednotlivých konformérů a stanovení jejich termodynamických parametrů. Umožňuje zmapování strukturních vlastností vybraných nukleotidových sekvenčních motivů, které zahrnují konformační třídu B-, A- a Z- forem, triplexy, cytosinové a guaninové tetraplexy, které jsou v současné době intenzívně studovány, a

další méně

definované

struktury DNA.

Jednotlivá

uspořádání

poskytují

charakteristická CD spektra. Díky svým četným přednostem se CD spektroskopie významně podílela na zásadních objevech uspořádání DNA, které budou v přednášce zmíněny.

- 10 -


Fluorescenční metody studia biomolekul Ctirad Hofr, Ph.D. Budou shrnuty základy jevu fluorescence, podstata fluorescenčních spekter a možnosti fluorescenčního značení proteinů a nukleových kyselin. Bude představena fluorescence jako nástroj pro analýzu struktury a interakcí biologických molekul. Výklad bude zaměřen na způsoby fluorescenčního značení biomolekul za účelem jejich vizualizace a využití fluorescence pro kvantitativní analýzu proteinů a nukleových kyselin. Navíc bude prezentováno využití fluorescenčních přístupů pro přímé sledování vzájemné vazby DNA a proteinů. Během přednášky budou posluchači seznámeni mimo jiné se souvislostí mezi sklenicí vína a objevem změny energie světla dopadajícího na roztok fluoroforu a světla následně roztokem fluoroforu emitovaného; dozví se, které oblíbené nápoje přirozeně fluoreskují a také bude objasněna záhada neomylné navigace Vikingů za sychravého počasí.

- 11 -


Metody studia interakce proteinů s DNA Václav Brázda, Ph.D. Interakce proteinů s DNA hrají klíčovou úlohu v základních biologických procesech a jsou esenciální pro všechny živé organismy. Vazba proteinů s DNA je nutnou podmínkou při expresi genů, transportu a translaci RNA, při organizaci chromatinu, genetické rekombinaci, replikaci, při opravách DNA atd. Proteiny interagují s DNA pomocí elektrostatické interakce, dipolární interakce, hydrofobických interakcí a disperzních sil. Interakci proteinů s DNA můžeme rozdělit podle specifity na sekvenčně specifickou, strukturně specifickou a nespecifickou vazbu. Ke studiu interakcí proteinů s DNA lze využít celou řada experimentálních metodik jako jsou chromatinová immunoprecipitace, elektroforetická retardační analýza, reportérové metody, DNA footprinting, fluorescenční annisotropie, atomová silová mikroskopie aj. Elektroforéza patří k separačním metodám, které pro rozdělení látek ve směsi využívají elektrické pole. V oblasti molekulární biologie se elektroforéza využívá především pro rozdělení elektricky nabitých biomakromolekul – nukleových kyselin a proteinů. Elektroforéza nukleových kyselin je umožněna tím, že nukleové kyseliny ve svých molekulách obsahují pravidelně se opakující zbytek kyseliny fosforečné, která je v slabě kyselém, neutrálním a zásaditém protředí plně disociována – je nositelkou záporného náboje. Protože počet zbytků kyseliny fosforečné v nukleových kyselinách roste přímo úměrně molekulové hmotnosti (počtu nukleotidů), je hustota náboje konstantní a při použití stejnosměrného elektrického pole dochází ve vhodném nosiči k dělení molekul nukleových kyselin podle jejich velikosti, případně topologického tvaru. Jako nosiče při elektroforetickém dělení nukleových kyselin se používají agarosové nebo polyakrylamidové gely. Polyakrylamidové gely se obecně používají pro kratší fragmenty DNA (velmi efektivně separují fragmenty v rozmezí 5-500 bp). Nespornou výhodou polyakrylamidových gelů ve srovnání s agarosovými je jejich separační schopnost: dokážou rozdělit fragmenty DNA, které se liší o 0.2 % hmotnosti (tj. fragment dlouhý 500 bp od fragmentu dlouhého 501 bp). Agarosové gely nemají takovou rozlišovací schopnost jako gely polyakrylamidové, zato mají větší rozmezí separace. Při použití stejnosměrného napětí můžeme v agarosových gelech účinně dělit fragmenty DNA v rozmezí 50 bp až 50 000 bp. Větší molekuly DNA (až několik Mbp) lze - 12 -


v agarosovém gelu separovat pomocí pulsní elektroforézy, při které je periodicky měněn směr elektrického pole. Větší molekuly, které při stejnosměrném napětí migrují stejnou rychlostí, jsou pulsní elektroforézou děleny na základě rozdílného času potřebného k reorientaci. Čím větší molekula, tím delší čas vyžaduje k zaujetí orientace potřebné pro putování gelem. V rámci přednášky budou diskutovány různé metody studia interakcí DNA a proteinů s prezentací výsledků získaných na oddělení Biofyzikální chemie a molekulární onkologie Biofyzikálního ústavu Akademie Věd České republiky. Literatura: Coufal, J., Jagelska, E.B., Liao, J.C., and Brazda, V. (2013). Preferential binding of p53 tumor suppressor to p21 promoter sites that contain inverted repeats capable of forming cruciform structure. Biochem Bioph Res Co 441, 83-88. Brazda, V., Coufal, J., Liao, J.C., and Arrowsmith, C.H. (2012). Preferential binding of IFI16 protein to cruciform structure and superhelical DNA. Biochem Bioph Res Co 422, 716-720. Brazda, V., Cechova, J., Coufal, J., Rumpel, S., and Jagelska, E.B. (2012). Superhelical DNA as a preferential binding target of 14-3-3gamma protein. J Biomol Struct Dyn 30, 371-378. Brazda, V., Laister, R.C., Jagelska, E.B., and Arrowsmith, C. (2011). Cruciform structures are a common DNA feature important for regulating biological processes. BMC Mol Biol 12, 33. Brazda, V., Jagelska, E.B., Liao, J.C., and Arrowsmith, C.H. (2009). The Central Region of BRCA1 Binds Preferentially to Supercoiled DNA. J Biomol Struct Dyn 27, 97-104.

- 13 -


Praktická cvičení

Spektroskopie DNA - stanovení struktury a koncentrace Princip metody Ke stanovení struktury DNA v roztoku se s výhodou používá spektroskopická metoda cirkulárního dichroismu (CD). Je velmi citlivá ke vzájemné orientaci bazí ležících nad sebou ve šroubovici nukleových kyselin. Jednotlivé struktury poskytují charakteristická spektra CD. V poslední době jsou studovány kvadruplexy, tedy čtyřřetězcová uspořádání DNA, která mohou vznikat v oblastech bohatých na guanin. Základní jednotku tvoří guaninová tetráda (viz. obr 1). Podle vzájemné orientace řetězců rozdělujeme kvadruplexy na paralelní a antiparalelní. CD spektrum paralelního kvadruplexu je charakterizováno pozitivním pásem při 260 nm, antiparalelního pak pozitivním pásem při 295 nm a negativním pásem při 260 nm (obr. 2). Koncentrace nukleových kyselin se stanovuje na základě absorpce záření v ultrafialové oblasti spektra bázemi; maximum se nachází okolo 260 nm. Pomocí Lambert-Beerova zákona se z naměřené absorbance (A) vypočítá koncentrace (c): A = c..l, kde  je absorpční koeficient, charakterizující danou sekvenci bazí, a l je tloušťka absorbující vrstvy. Absorpční spektrofotometrie se dále používá ke sledování termálních denaturací, ze kterých na základě teploty tání lze usuzovat na pevnost vazeb mezi řetězci DNA. Pro guaninové kvadruplexy je typické, že během denaturace dochází k výraznému poklesu absorpce okolo 295 nm, kdežto zvýšení okolo 260 nm odpovídá denaturaci jakékoliv uspořádané struktury.

- 14 -


Cíl úlohy Indukce guaninového kvadruplexu přidáním sodných nebo draselných iontů k neuspořádanému jednořetězci a následná termální denaturace kvadruplexů. Pracovní postup: 1. do 1 cm kyvety napipetujeme 1,3 ml 1 mM Na-fosfátového pufru, pH 7 a změříme na dichrografu baselinu kyvety 2. přidáme 10 l zásobního roztoku oligonukleotidu G3AG3AG3AG3 pro závislost v draselných iontech a G4T4G4 pro závislost v sodných iontech (objem je 1,310 ml), změříme orientačně UV absorpční spektrum při pokojové teplotě, aby optimální absorbance v maximu byla cca 0,8 a změříme CD spectrum před denaturací 3. kyvety omotáme kolem špuntů parafilmem, aby se roztok neodpařil, zahřejeme v absorpčním spektrofotometru na 90°C a změříme UV absorpční spektrum. Odečtenou absorbanci při 260 nm denaturovaného vzorku použijeme pro výpočet koncentrace DNA podle vztahu c = A/l.  je molární extinkční koeficient - veličina charakteristická pro danou sekvenci bazí:  = 11 301 M-1cm-1 pro G3AG3AG3AG3 a  = 10 075 M-1cm-1 pro G4T4G4 4. změříme CD spektrum vychladlého oligonukleotidu po denaturaci 5. zvýšíme iontovou sílu přidáním soli ze zásobního roztoku: pro draselnou závislost na 10 mM K-fosfátový pufr přidáním 35 l ze zásobního roztoku 0,4 M K-fosf. pufru pH 7 (objem je 1,345 ml, koncentraci vypočítáme podle V1c1 = V2c2); pro sodnou závislost na 150 mM NaCl přidáním 45 l ze zásobního roztoku 3M NaCl (objem je 1,345 ml) 6. změříme CD spektrum ve vyšší iontové síle 7. vzorky přepitujeme do zúžených kyvet 1 cm a spustíme teplotní závislost na UV absorpčním spektrofotometru 8. navržení struktury kvadruplexu

- 15 -


Seznam potřebného vybavení a chemikálií: oligonukleotidy křemenné kyvety s 1 cm optickou dráhou pufr – 1 mM Na-fosfát, pH 7 roztoky K-fosfátový pufr, pH 7; NaCl pipety a špičky

H N

N

N N

N O

H ....... N

... H ....... O ...

H N N N

N H

H N

N

N N H H

H O .......H

... N ....... H ...

N

O N

N N

N

H

Obrázek 1. Schéma guaninové tetrády.

- 16 -


T

T

T

T

20  [M cm-1] -1

15 T T

10

T

T

5

0

-5

-10 200

240

280

320

220

260

300

wavelength [nm]

Obrázek 2. Spektra cirkulárního dichroismu při vzniku guaninového kvadruplexu: paralelního a antiparalelního.

- 17 -


Enzymatická syntéza značené DNA, magnetická separace a elektrochemická detekce Přirozená DNA je elektrochemicky aktivní především díky tomu, že některé z nukleobází jsou redukovatelné na rtuťových elektrodách a oxidovatelné na uhlíkových elektrodách. Avšak tzv. label-free detekce DNA má svá omezení, např. při snaze analyzovat malé změny struktury v dlouhé sekvenci DNA, nebo rozlišit dva řetězce DNA mezi sebou (při hybridizaci DNA), apod. Proto je často DNA modifikována různými molekulami, které umožňují „zviditelnění“ hledaného jevu. Detekována pak není vlastní DNA, ale tato molekula-značka, která je volena společně s podmínkami stanovení tak, aby bylo dosaženo co nejvyšší citlivosti a specificity měření. Jednou z možností značení DNA je inkorporace značených nukleotidů pomocí DNA polymeráz. Elektrochemické stanovení DNA značené antrachinonem DNA s inkorporovanými chemicky modifikovanými nukleotidy je možné připravit metodou prodlužování primeru (primer extension, PEX). Při této metodě je pomocí různých DNA polymeráz prodlužován řetězec DNA od 5´ konce ke 3´ konci. Syntéza probíhá podle templátu – komplementárního řetězce DNA. DNA polymerázy dokáží inkorporovat jak přirozené, tak i některé chemicky modifikované nukleotidy. Pro elektrochemické stanovení se nukleotidy modifikují navázáním funkčních skupin, které je možné elektrochemicky snadno redukovat nebo oxidovat, jako jsou například antrachinon, aromatické nitroderiváty, benzofurazan a další. V této práci bude připraven oligonukleotid značený antrachinonem. Oligonukleotid bude připravený metodou PEX s využitím templátu modifikovaného biotinem a výsledný produkt bude separovaný pomocí magnetických mikročástic pokrytých streptavidinem. Připravený oligonukleotid bude elektrochemicky detekován pomocí cyklické voltametrie (CV) na visící rtuťové kapková elektrodě (HMDE). Postup: - připravit 4 vzorky o celkovém objemu 30 μl podle tabulky (A-AQ a C-AQ jsou vzorky značené antrachinonem, neznačený je přirozený oligonukleotid a bez E je kontrola bez enzymu): - 18 -


voda thermo buffer 4basII-bio (100 g/ml) Primer (100 g/ml) dATP (1 mM) dCTP (1 mM) dGTP (1 mM) dTTP (1 mM)

neznačený 10,9

A-AQ 3

C-AQ bez E 10.9 10.9 3 3

6

6

6

6

3.5 1.4 1.4 1.4 1.4

3.5

3.5 1.4

3.5

1.4 1.4 1.4

dAAQTP (1 mM)

1.4 1.4

1.4

AQ

dC TP (1 mM) vent(exo)DNA polymeráza

11.9 3

1.4 1.4 1.4 1.4

1.4 1

1

1

- vzorky nechat reagovat 40 minut při 60°C a 300 rpm - promýt 15 μl DBStr (Dynabeads M-280 Streptavidin) pomocí magnetického koncentrátoru 3x 100 μl 0,3 M NaCl / 10 mM TRIS, roztok odebrat - k DBStr přidat vzorky - DBStr se vzorky třepat 20 min při 20°C a 1200 rpm, pak pomocí magnetického koncentrátoru vzorky od DBStr odebrat - DBStr promýt 3x 100 μl PBST (fosfátový pufr s 0,05% Tween), pak ještě 3x 100 μl 0,3M NaCl / 10mM TRIS, roztok odebrat - k DBStr dát 30 μl H2O (Sigma), třepat při 75°C, 2 min a 900 rpm - roztok od DBStr přenést do čisté eppendorfky, přidat 3 μl 2 M NaCl - změřit Měření: - metoda CV (cyclic voltammetry) (Ei = 0 V, Esw = -1,85 V nebo -0,8 V, scan rate 1 V/s) - základní elektrolyt: mf (0,3 M mravenčan amonný, 50 mM fosforečnan sodný) - pracovní elektroda: HMDE

- 19 -


- měření pomocí adsorpční přenosové techniky: Do 5 μl vzorku připraveného pomocí DBStr ponořit HMDE , nechat 1 min adsorbovat, opláchnout v dest. H2O, vložit do zákl. elektrolytu, změřit

primer 5‘ 3‘

biotin template

DNA polymerase dNAQTP (+dNTP)

DBstv

washing heat or NaOH

measurement

- 20 -


Sledování změn struktury DNA pomocí elektrochemických metod na rtuťových elektrodách - AC voltametrie Princip metody AC voltametrie (ACV) patří mezi voltametrické metody se střídavou složkou potenciálu. U této metody se na elektrodu vkládá lineárně se měnící potenciál. Na tento potenciál je superponováno střídavé napětím sinusového průběhu o malé amplitudě (10 mV) a nízké frekvenci (desítky až stovky Hz). Měří se závislost střídavého proudu procházejícího elektrodou na jejím potenciálu. DNA dává v ACV řadu signálů. Některé z nich jsou citlivé ke změnám struktury DNA. Dvouřetězcová (ds) a jednořetězcová (ss) DNA poskytují pík 1, který je způsoben adsorpcí/desorpcí cukrfosfátové kostry. Ds DNA dále poskytuje pík 2 v důsledku adsorpce/desorpce zdeformovaných ds úseků. Ss DNA poskytuje pík 3, který je způsoben adsorpcí/desorpcí zbytků bází v jednořetězcových úsecích. Kovalentně uzavřená (superhelikální) DNA (scDNA) poskytuje pouze pík 1. 0.9 0.8 ssb

0.7

I [A]

0.6 sc DNA

0.5 0.4

oc DNA

ss DNA

3 1

0.3

e

0.2 0.1 -1.4

-1.2

E [V]

-1.0

-0.8

ACV záznamy scDNA, otevřené kružnicové DNA (ocDNA) a ssDNA na visící rtuťové kapkové elektrodě.

Pracovní postup -

Připravíme tří vzorky scDNA o výsledné koncentraci 30 g/ml.

- 21 -


-

Vzorek 1 přímo naředíme 0,2M NaCl, ostatní vzorky (2,3) inkubujeme s DNasou I (30min. 37oC), vzorek 3 po naštěpení tepelně denaturujeme (6 minut na 99oC)

-

Do vzorků 2 a 3 pro elektrochemické měření přidáme NaCl tak, aby jeho výsledná koncentrace byla 0,2M.

-

Měření AC voltametrie – do měřící nádobky nalijeme 3 – 5 ml základního elektrolytu (roztok 0,3 M NaCl a 50 mM Na2HPO4). Provedeme voltametrické měření v potenciálovám rozsahu -0,6 až -1,6 V. Jako pracovní elektrodu používáme visící rtuťovou kapkovou elektrodu. Měříme nejdříve základní elektrolyt a potom postupně vzorky DNA. Měření DNA probíhá pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrie (AdTSV).

Materiál a pomůcky -

potenciostat (Autolab)

-

elektrodový systém (663 VA-stand)

-

tlaková láhev s argonem

-

DNasa I

-

pufr 0,3 M NaCl, 50 mM Na2HPO4

-

roztok 0,2 M NaCl

-

DNA

- 22 -


Fluorescenční značení proteinu Materiál        

Fluorescenční barvička Mikrozkumavka s magnetickým míchadlem Roztok proteinu ve fosfátovém pufru (TRF2, MW = 59 135, extinkční koeficient ε = 50545 M-1cm-1, zásobní koncentrace 4 mg/ml) 1M roztok hydrogenuhličitanu sodného (NaHCO3, MW = 84), 1ml Fosfátový pufr (50 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný) Kolona s náplní Sephadex G-25 (GE Healthcare) Kyvety Spektrofotometr (Beckmann)

Příprava proteinu Pro optimální efektivitu značení by měl být protein ve fosfátovém pufru bez amonných inontů a primárních aminů. V případě, že protein je v jiném pufru (Trisový, glycinový), je možno dialýzou pufr změnit. Výsledná koncentrace roztoku proteinu na značení by neměla být menší než 2 mg/mL. Značení proteinu 1. Do mikrokyvety napipetujte roztok proteinu (roztok nařeďte přidáním fosfátového pufru na výslednou koncentraci 2 mg/ml). 2. Zkumavky s fluorescenční značkou nechte zahřát na laboratorní teplotu. Do této zkumavky přidejte 1M NaHCO3 a to v množství 1/10 objemu roztoku naředěného proteinu a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. Odpipetujte do mikrozkumavky s proteinem a promíchejte pipetováním nahoru a dolů. 3. Vše nechte míchat v mikrozkumavce s magnetickým míchadlem po dobu 30 minut při laboratorní teplotě. 4. 5-10 minut před koncem inkubace připravte kolonu pro separaci proteinu a nenavázané fluorescenční značky.

- 23 -


Purifikace proteinu Náplň kolony Sephadex G-25 umožňuje gelovou filtrací oddělit nenavázanou fluorescenční značku od proteinu podle rozdílné velikosti a molekulové hmotnosti. 1. Kolonu umístěte do stojánku, odstraňte víčko a zátku a nechte obsah kolony vykapat. 2. Promyjte kolonu 5 ml fofátového pufru. 3. Opatrně naneste reakční směs proteinu a značky pipetou do středu kolony. Použijte 100 µl fosfátového pufru k vypláchnutí mikrozkumavky s reakční směsí a opět naneste na kolonu. Roztok nechte zaputovat do kolony. 4. Po 1 ml přidávejte fosfátový pufr. Postupně jímejte frakce vytékající z kolony do mikrozkumavek po 1 ml. Po cca 2-3 ml začíná vytékat značený protein. Zachyťte značený protein do jedné frakce. 5. Vzorek (frakci se zachyceným značeným proteinem) proměřte na spektrofotometru. Vzorek po změření nevylijte, přeměřte objem frakce. Zároveň proměřte frakci se samotnou značkou. Na základě absorpčního spektra odečtěte a dopočítejte odpovědi na soutěžní otázky. Nastavení spektrofotometru: Functions – Wave scan – interval vlnových délek (260-600 nm) – vložte kyvetu s blankem – Blank – vložte kyvetu se vzorkem – Sample Options – Graph scale – upravit rozsah osy y, aby byly píky viditelné Určení koncentrace protein v mg/ mL Aprotein = A280 – Amax *CF A

CF = A 280 volné značky ; CF je korekční factor udávající příspěvek značky k absorpčnímu max volné značky

spektru

- 24 -


Výpočet stupně značení

stupeň značení =

Amax x MWprotein Cprotein x εmax

Amax koncentrace značky molární množství značky εmax = = st. značení = Cprotein koncentrace proteinu molární množství proteinu MWprotein kde εmax je molární extinkční koeficient značky v excitačním maximu, C koncentrace proteinu v mg/mL a MW je molekulová hmotnost proteinu

Alexa Fluor® dye

Abso

Emissi

rptio

on

Emission

n

max

color

max.

(nm)

- 25 -

Extinction coefficient (cm-1M-1)


(nm) Alexa Fluor® 350

346

442

Blue

19,000

Alexa Fluor® 405

401

421

Blue

34,000

Alexa Fluor® 430

433

541

Green/Yellow

16,000

Alexa Fluor® 488

496

519

Green

71,000

Alexa Fluor® 532

532

553

Yellow

81,000

Alexa Fluor® 546

556

573

Orange

104,000

Alexa Fluor® 555

555

565

Orange

150,000

Alexa Fluor® 568

578

603

Orange/Red

91,000

Alexa Fluor® 594

590

617

Red

73,000

Alexa Fluor® 610

612

628

Red

138,000

- 26 -


Stanovení koncentrace DNA pomocí mikrofluorometru Materiál     

Mikrofluorometr Qubit™ (Invitrogen) Quant-iT™ dsDNA BR Assay Kit Standardy dsDNA Vzorek DNA o neznámé koncentraci Qubit™ assay tubes

Postup      

Připravit cca 1 ml Quant iT™ working solution smícháním Quant-iT™ dsDNA BR reagent a Quant-iT™ dsDNA BR buffer v poměru 1:200 Standardy: 190 µl Quant-iT™ working solution + 10 µl dsDNA standardu #1 #2 Vzorek o neznámé koncentraci 2x : 195 µl Quant-iT™ working solution + 5 µl vzorku Standardy i vzorky krátce promíchat na vortexu (2-3 sec), pozn.: ve vzorku nesmí být bublinky!! Inkubace 5-10 minut při laboratorní teplotě Zapnout Qbit™ fluorometr, vybrat příslušnou metodu, nová kalibrace (standardy), poté změřit neznámý vzorek (2 x 2 měření)

Pozn.: Měření by mělo probíhat za laboratorní teploty (22- 28°C). Intenzita fluorescence je závislá na teplotě. Teplota vzorků by proto měla být stejná. Nedržte zkumavku se vzorkem před měřením dlouho v rukou, po každém měření zkumavku ihned vyjměte z přístroje a mezi jednotlivými měřeními ji ponechte inkubovat alespoň 30 sec při laboratorní teplotě. Soutěžní otázka Jaká je koncentrace neznámého vzorku DNA?

- 27 -


Imunolokalizace modifikovaných histonů H3metK4 a H3metK9 Cílem tohoto experimentu je naučit se 

připravovat preparáty z buněčných jader vhodných pro imunodetekci



poznat dobré preparáty



interpretovat fluorescenční signály

Izolace rostlinných buněčných jader Buněčná jádra určená pro detekci chromatinových proteinů musejí být okamžitě po izolaci fixována ve formaldehydu, čímž se zabrání poškození epitopů nezbytných pro navázání protilátek.

Materiál 

jaderný izolační pufr (NIB), čerstvě připravený a uchovávaný na ledu (10 mM Tris-HCl pH 9.5, 10 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.5 M sacharóza, 4 mM spermidin, 1.0 mM spermin, 0.1% (v/v) 2-merkaptoethanol)



4% paraformaldehyd v PBS (10 mM fosfát sodný pH 7.0, 143 mM NaCl)



nylonové filtry (50 a 20µm)



žiletka



1 µg/mL DAPI ve Vectashieldu

Metoda 1. Odebrat 0.5 -1 g mladých listů do Petriho misky umístěné na ledu. 2. Přidat ~0.5 ml pufru NIB a žiletkou sekat listovou tkáň, dokud nevznikne jemná suspenze (obvykle po 5 – 10 min). 3. Přepipetovat suspenzi pipetou s uřízlou špičkou do zkumavky. 4. Přidat stejný objem 4% paraformaldehydu a fixovat 20 min na ledu. 5. Přefiltrovat suspenzi přes 50 µm nylonový filtr do nové zkumavky. 6. Přefiltrovat suspenzi přes 20 µm nylonový filtr do nové zkumavky. 7. Centrifugovat 3 min, 2500 rpm, 4°C. 8. Odstranit supernatant a rozpustit pelet s jádry v ~40 µL pufru NIB. 9. Připipetovat 2 µL jaderné suspenze k 5 µL DAPI ve Vectashieldu a zkontrolovat kvalitu a hustohu jader pomocí fluorescenčního mikroskopu. 10. Zbylou suspenzi uchovávat na ledu. 11. Napipetovat 2 µL suspenze jader na podložní sklo a nechat zaschnout při 4°C (obvykle 1h).

- 28 -


Imunodetekce Materiál 

pufr PBS (10 mM fosfát sodný pH 7.0, 143 mM NaCl)



protilátka proti H3metK4 (rabbit anti-trimethylated histone H3 at lysine 4)



protilátka proti H3metK9 (mouse anti-trimethylated histone H3 at lysine 9)



1% hovězí sérový albumin (BSA)



pufr 4T (4×SSC pH 7.0, 0.05% (v/v) Tween-20)



pufr TNT (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, with 0.05% (v/v) Tween-20)



pufr TNB (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.5% Boehringer blokovací činidlo)



sekundární protilátky (Alexa 488-conjugated goat-anti-mouse, Alexa 594conjugated donkey-anti-rabbit)



1 µg/mL DAPI ve Vectashieldu

Metoda 1. Postfixovat preparáty ve 4% formaldehydu v PBS, 30 min při pokojové teplotě. 2. Inkubovat preparáty 30min v 1% BSA v PBS (100 µL na podložní sklo, přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x50 mm) ve vlhké komůrce při 37°C. 3. Opláchnout preparáty v PBS 1x5 min. 4. Detekce H3metK4: Připipetovat 1 µL protilátka proti H3metK4 do 100 µL 1% BSA. Inkubovat preparáty 2h ve vlhké komůrce při 37°C. 5. Detekce H3metK9: Připipetovat 1 µL protilátka proti H3metK9 do 50 µL 1% BSA. Inkubovat preparáty přes noc ve vlhké komůrce při pokojové teplotě. 6. Opláchnout preparáty v PBS 3x10 min. 7. Opláchnout preparáty v TNT 1x5 min. 8. Připipetovat 5 µL od každé sekundární protilátky do 1000 µL TNB. 9. Inkubovat 30 min při 37°C 10. Opláchnout preparáty v TNT 3x5 min. 11. Napipetovat na podložní skla 15 µl 1 µg/ml DAPI a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x24 mm. Nenechat preparáty vyschnout!

- 29 -


Imunodetekce 5-metylcytozinu Cílem tohoto experimentu je naučit se 

poznat dobré preparáty



porozumět výhodám a limitům této metody



interpretovat fluorescenční signály

Imunolokalizace metylovaného cytozinu zahrnuje denaturaci templátu, která zvyšuje přístupnost modifikovaných bazí k protitátkám. Předmětem detekce je v tomto případě báze DNA, a proto je možné použít běžné preparáty připravené z rostlinné tkáně fixované v ethanolu/kyselině octové (3:1).

Materiál 

běžné chromozomové preparáty připravené z rostlinné tkáně fixované v ethanolu/kyselině octové (3:1, Carnoy fixáž) nebo preparáty buněčných jader fixované v (para)formaldehydu



1% formaldehyd v PBS



pufr HB50 (2xSSC, 50% formamid, 50 mM fosfát sodný pH 7.0)



pufr PBS



1% BSA v PBS



pufr TNT



pufr TNB



protilátka proti metylcytozinu (mouse-antibody against 5methylcytosine)



sekundární protilátka (rabbit-anti-mouse conjugated with Alexa 488)



1 µg/ml DAPI ve Vectashieldu



Ethanol (70%, 90% a 100%)

Metoda 1. Opláchnout preparáty v PBS 2 x 5 min. 2. Fixovat preparáty v 1% formaldehydu 10 min. 3. Opláchnout preparáty v PBS 2 x 5 min 4. Dehydratovat v 70, 90, 100% ethanolu (každý krok 1 -2 min), nechat uschnout. 5. Na podložní sklo napipetovat 20 µL HB50, přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 22x22 mm a denaturovat 2 min při 80°C. 6. Opláchnout preparáty ve 2xSSC 2x5 min a šetrně odstranit krycí sklíčko.

- 30 -


7. Inkubovat preparáty 30 min v 1% BSA v PBS (100 µL na podložní sklo, přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x50 mm) ve vlhké komůrce při 37°C. 8. Opláchnout preparáty v PBS 3x5 min. 9. Opláchnout preparáty v TNT 1x5 min. 10. Připipetovat 1 µL protilátky proti metylcytozinu do 40 µL TNB. Pufr s protilátkou napipetovat na podložní sklo a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 22x32 mm. Inkubovat preparáty 30 min ve vlhké komůrce při 37°C. 11. Opláchnout preparáty v TNT 3x5 min. 12. Připipetevat 1 µL sekundární protilátky do 500 µL TNB. Pufr s protilátkou napipetovat na podložní sklo a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 22x32 mm. Inkubovat preparáty 30 min ve vlhké komůrce při 37°C. 13. Opláchnout preparáty v TNT 3x5 min. 14. Napipetovat na podložní skla 15 µl 1 µg/ml DAPI a přikrýt krycím sklíčkem o velikosti 24x24 mm. Nenechat preparáty vyschnout!

- 31 -


Praktické úlohy firmy Biotech Real-time PCR (qPCR) na přístroji TOptical Thermocycler od firmy Biometra

-

Nechte všechny reagencie řádně rozmrznout

-

Před samotným použitím každou reagencie opatrně promíchejte 2-3x pomocí pipety

-

Mastermix připravte do připravené mikrozkumavky (200 µl)

-

Při přípravě reakce postupujte podle následujícího rozpisu:

Reagencie

Objem pro 1 reakci

Objem pro 8 reakcí

Mastermix

10 µl

80 µl

Primer F (10µM)

0,8 µl

6,4 µl

Primer R (10µM)

0,8 µl

6,4 µl

DNA

2 µl(až do každého vzorku

2 µl(až do každého vzorku

zvlášť)

zvlášť)

6,4 µl

51,2 µl

Voda

-

Připravte si strip ve kterém bude probíhat reakce

-

Do 7 jamek napipetujte 18 µl směsi, kterou jste si připravili

-

Do jamek 1 a 2 napipetujte 2 µl plazmidu naředěného 10x

-

Do jamek 3 a 4 napipetujte 2 µl plazmidu naředěného 100x

-

Do jamek 5 a 6 napipetujte 2 µl plazmidu naředěného 1 000x

-

Do jamky 7 napipetujte 2 µl vody (negativní kontrola bez templátu)

-

Strip uzavřete a stočte na centrifuze po dobu 10s. Poté strip vložte do cycleru a na stavte na přístroji následující program:

- 32 -


Cykly

Teplota

Čas

Poznámky

1

95°C

2 min

Aktivace polymerázy 2 min pro cDNA a 3 min pro gDNA

40

95°C

5s

Denaturace

60°C

30 s

Anealing/extension - nepřekročte 30 s a nepoužívejte teploty pod 60°C

Analýza

Podle technické

tání

specifikace

60 – 95°C s krokem 1°C

přístroje Vzorek

Hodnota změřené Cq

Plazmid 10x – vzorek 1 Plazmid 10x – vzorek 2 Plazmid 100x – vzorek 1 Plazmid 100x – vzorek 2 Plazmid 1 000x – vzorek 1 Plazmid 1 000x – vzorek 2 Efektivita PCR reakce Slope reakce

- 33 -


Izolace plazmidové DNA kitem NucleoBond Xtra Midi Plus od firmy Macherey Nagel

-

V předstihu jsme provedli tyto přípravné kroky: o Bakteriální kultura byla zaočkována do média rostla přes noc o Bakteriální kultura byla stočena na centrifuze za těchto podmínek: 6000 x g 10 min při 4 °C. Ze vzorku bylo vylito veškeré růstové medium (supernatant) a zbyla jen peleta (usazené buňky)

-

Rozpusťte lyofilizovanou RNázuA v 1 ml RES pufru. Zcela rozpuštěnou RNázu A nalijte zpět do RES pufru a pufr dobře promíchejte zatřepáním

-

Peletu kompletně resuspendujte v 8ml RES pufru

-

Ke vzniklé suspenzi přidejte 8ml LYS pufru. Po přidání LYS pufru směs 5x promíchejte otočením – nevortexujte

-

Směs inkubujte 5min při pokojové teplotě

-

Připravte si kolonku pro izolaci do stojánku a naneste na ni celkem 12 ml EQU pufru, který pipetujte pouze na horní okraj kolonky

-

Po 5 minutách inkubace přidejte k bakteriální směsi 8ml pufru NEU a suspenzi promíchejte otáčením (10-15x). Po promíchání ihned pokračuji následujícím krokem

-

Falkonu se suspenzí 3x otočte, aby byl roztok důkladně homogenizován. Směs naneste na filtr

-

Na filtr naneste 5ml EQU pufru a po promytí filtr odstraňte

-

Kolonku bez filtru promyjte 8ml WASH pufru

-

Eluce plasmidové DNA proveďte pomocí 5ml pufru ELU. Eluát zachycujte do falkony

-

Přidejte 3,5ml isopropanolu o pokojové teplotě. Směs zvortexuju (10-15s na max. rychlost.)a poté nechte směs 2 min odstát a poté směs přečistěte přes filtr

-

Propláchněte filtr 2ml 70% etanolu, vysušte a poté vymyjte DNA 500 µl TRIS pufru

- 34 -


-

Změřte koncentraci a čistotu získané DNA na nanofotometru a data zapište do tabulky Vzorek Koncentrace DNA A 260/280 A 260/230

- 35 -


- 36 -


Prezentace firem

- 37 -


- 38 -


- 39 -

WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE sborník editoval: Václav Brázda autoři: Václav Brázda, Miroslav Fojta, Michaela Vorlíčková, Ctirad Hofr, Petr Pečinka, Iva Kejnovská Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2014 Česká Republika První vydání ISBN: 978-80-87541-09-8

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM

VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. 3. 3. - 7. 3. 2014

OPVK – Praktický kurz, 2014

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL NÁVODY KE CVIČENÍM

BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I.

3. 3. - 7. 3. 2014

ROZVOJ MODERNÍCH TRENDŮ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII: VÝZNAM BIMOLEKULÁRNÍCH INTERAKCÍ PRO FUNKCI BUNĚČNÝCH STRUKTUR

OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/30.0019

-3-


KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením

Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2014 Česká Republika První vydání

ISBN: 978-80-87541-06-7

-4-


Obsah Obsah ......................................................................................................................... 5 Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů ..................................................................................................... 7 Transfekce savčích buněk ...................................................................................... 7 Detekce GFP ........................................................................................................ 10 Mikroskopie ........................................................................................................... 10 ELISA stanovení GFP ........................................................................................... 12 Detekce luciferázy ................................................................................................. 13 Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce.............................................................. 15 Izolace mRNA ....................................................................................................... 15 Reverzní transkripce ............................................................................................. 16 qRT-PCR .............................................................................................................. 17 Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA – restrikční analýza ...................................................................................................... 19 Transformace, selekce a kultivace bakterií ........................................................... 19 Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza ....................................................... 21 Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie ......... 23 I. B-A přechod ....................................................................................................... 23 II. B-Z přechod ...................................................................................................... 24 Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese ..................................................... 26

-5-


-6-


Kapitola 1: Transfekce savčích buněk, detekce genové exprese pomocí reporterových genů Garant: Václav Brázda

Transfekce savčích buněk Princip a cíl: Transfekcí je označován přenos cizorodého genetického materiálu do eukaryotických buněk. Existuje celá řada metodik transfekce, mezi nejstarší a nejčastěji používané patří chemická metodika transfekce fosforečnanem vápenatým. Použitá metodika transfekce fosforečnanem vápenatým je modifikací původní metodiky, která se vyznačuje jednoduchostí a spolehlivostí. Metoda transfekce fosforečnanem vápenatým je velmi efektivní způsob zavedení DNA do buňky v mnoha systémech, nicméně v jiných může být zcela neefektivní. Nejlépe funguje v buněčných liniích, které rostou přisedlé, například u buněk Hela, U2OS, SAOS2, Ada a NPC-KT lze získat transfekční účinnost od 20% do 100% v závislosti na buněčné línii a podmínkách transfekce. Metoda funguje dobře pro vytváření jak tranzientní transformace, tak i pro generování stabilních buněčných linií. Metoda je poměrně citlivá na množství použitého plazmidu. Celkové množství transfekované DNA musí být cca 30μg (pro 100mm misky). Pro efektivní transfekci je vhodné použít jako nosič plazmid bez eukaryotického promotoru (například pBluescript). Pro typické transaktivační pokusy používáme mezi 50- 500 ng transfekovaného plazmidu a cca 29 µg nosičového plazmidu. Nicméně pro funkční tranfekci je někdy nutné poměr upravit až na 5-10 µg příslušného expresního vektoru a 20-25 µg nosičové DNA. Je třeba mít na paměti několik důležitých aspektů. DNA přechází přes jadernou membránu pouze během mitózy. Nedojde tedy k expresi genu dokud buňka neprojde mitózou. Po transfekci dochází k synchronizaci buněk, ty by se měli analyzovat nejméně 24 hodin po transfekci. Cílem je připravit buněčné línie HCT116 a 293F s reporterovými plazmidy: A) s luciferázovým expresním systémem pCNA3wtp3 a pMDM2-ADP2; B) s GFP proteinem pBRCA-GFP360-759.

-7-


Pracovní postup: Pro tranfekci použijeme 6ti jamkové desky. 1. Den před transfekcí naředíme kulturu konfluentních buněk (70-90%) v poměru 1:10 do 1:15 (poměr závisí na buněčných liniích, které jsou transfekovány, rychleji rostoucí buněčné linie ředíme více, velmi pomalu rostoucí buněčné linie mohou být rozředěny méně než 1:10). 2. Druhý den ráno odlejte medium (DMEM (10% FBS, + pen / strep)) a přidejte 2ml čerstvého média. 3. Vlastní transfekce 5μg celkové DNA s různým množstvím efektorového plazmidu dle tabulky (dopočítejte množství plazmidu pro transfekci).

A1

A2

A3

B1

B2

B3

Deska číslo 1 (plazmid s GPF) GFP plazmid

Označení

pBluescript

2400μg/ml

A1/B1

0

5 μg

A2/B2

20 ng

5 μg

A3/B3

1000 ng

4 μg

Deska číslo 2 (plazmid s luciferázovým expresním systémem) Označení

pCNA3wtp53

pMDM2-ADP2

857μg/ml

51μg/ml

pBluescript

A1/B1

0

0

5 μg

A2/B2

20 ng

20 ng

5 μg

A3/B3

1000 ng

1000 ng

3 μg

-8-


4. Pro každou transfekci dejte 86 μl 1X HBS do sterilní zkumavky. 5. Přidejte odpovídající množství DNA do každé zkumavky a promíchejte. 6. Přidejte do každé zkumavky 5 μl 2,5M CaCl2 a promíchejte. 7. Inkubujte 20 minut při pokojové teplotě. 8. Přidejte k buňkám transfekční směs po kapkách a mírně míchejte - nemixujte! 9. Vložte do CO2 inkubátoru. 10. Další den vyměňte médium. 11. Pro stadium transientní exprese jsou buňky použity po 48-72 hodinách.

Seznam chemikálií: 1X HBS 1 litr HEPES 5 g NaCl 8 g Dextróza 1 g KCl 3,7 g Na2HPO4 (7H2O) 10 ml zásobního roztoku 1. Přidejte H2O do cca 900 ml. 2. Upravte pH na 7,1 přesně. 3. Přidejte H2O do 1 litru. 4. Přefiltrujte přes sterilní filtr (0.2 μm). 5. Rozdějte na alikvoty do sterilních zkumavek a uložte na -20°C.

Na2HPO4 (7H2O) zásobní roztok = 0,94 g Na2HPO4 (7H2O) v 50 ml H2O 2.5M CaCl2 100ml CaCl2 27,75 g bezvodého CaCl2 nebo CaCl2 36,75 g CaCl2 (2H2O) Rozdělte na alikvoty do sterilních zkumavek 15 ml (10 ml do každé) a uložte v mrazničce.

-9-


Detekce GFP K detekci GFP je možné použít celou řadu metodik. V rámci praktického cvičení se seznámíme s mikroskopickými technikami a ELISA stanovením.

Mikroskopie

Pro studium buněk se dlouhodobě používá mikroskopie. Jednou z nejčastějších metod zobrazení konkrétní molekuly či buněčných organel ve vysokém rozlišení je použití fluorescenčních značek, které umožní jednoznačnou identifikaci a lokalizaci proteinu v buňce. Klasická fluorescenční mikroskopie má tu nevýhodu, že se při zkoumání silnějších vzorků pletiv do roviny zaostření mikroskopu promítne i fluorescence z mimoohniskových částí. Tento rušivý šum způsobí zamlžení a sníženou ostrost snímku, kterou lze eliminovat technikou konfokální mikroskopie. Fluorescenční i konfokální mikroskopie využívají fluorescence, tj. schopnosti atomů a molekul absorbovat určité množství excitační energie a vzápětí ji vydat zpět v podobě emisního záření o vyšší vlnové délce s nižší energií. Princip laserového rastrovacího konfokálního mikroskopu zjednodušeně spočívá v osvětlování pozorovaného objektu bodovým zdrojem světla, který je clonou zaostřen na jeden bod pozorovaného vzorku. Sekundární světlo odražené z tohoto bodu přechází na konfokální clonu. Ta zaostřuje na detektor jen světlo pocházející ze zaostřených bodů, zatímco světlo emitované z osvětlených, ale nezaostřených bodů jde mimo ní. Výstupní digitální obraz celé zaostřené roviny je získáván jejím rastrováním bod po bodu. Konfokální mikroskopie představuje nedestruktivní pozorovací techniku a je proto ideální metodou pro pozorování nejrůznějších struktur v živých buňkách. Při studiu živých buněk se využívají často právě transgenní organismy s fúzními proteiny. Jako první byl izolován zelený fluorescenční protein (GFP) z mořské medúzy Aequoria victoria, u které byl objeven jako součást bioluminiscence. Tento protein s molekulovou mnotností 28 kDa má maximum excitační vlnové délky cca 489 nm a maximum emisní vlnové délky 509 nm.

- 10 -


V současné době je dostupná celá řada dalších mutací GFP s odlišnými spektrálními vlastnostmi. Díky široké škále fluorescenčních barviv můžeme s využitím laserů různých vlnových délek a správných bariérových filtrů pozorovat více buněčných struktur v živých buňkách. Výstupem konfokálního mikroskopu je digitální obraz, který můžeme dále kvalitativně i kvantitativně analyzovat, sestavovat trojrozměrný obraz studovaného objektu nebo pomocí časosběrného snímkování studovat dynamiku buněčných struktur. V rámkci praktického cvičení se seznámíme s prací na konfokálním mikroskopu Leica SP5.

- 11 -


ELISA stanovení GFP Pro stanovení účinnosti transfekce je možné využít citlivé měření na ELISA readeru. Fluorescence GFP je ale rychle zhášena, proto se pro citlivé stanovení používá zpravidla fluorescenčně značená monoklonální protilátka proti GFP. V našem případě se pokusíme změřit přímo fluorescenci buněk při 509 nm a srovnáme intenzity signálu se stanovením transformantů s luciferázovým expresním systémem.

Pracovní postup: 1. Odstraň médium z kultury buněk. 2. Omyj buňky 1x PBS. 3. Přidej k buňkám 1x Trypsin – 200 μl na jednu jamku v 6-ti jamkové desce, (900 μl na 100 mm misku 20 μl na jamku v 96-ti jamkove desce) – a nech působit cca 5 minut. 4. Odsaj buňky s 1 ml média do zkumavky a stoč (mikrocentrifuga - 2000rpm 5min.). 5. Resuspenduj buňky ve 100 μl média a dej na 96-ti jamkovou ELISA desku. 6. Připrav blank (100 μl média). 7. Změř fluorescenci na ELISA readeru.

Seznam chemikálií a potřeb: PBS Trypsin Centrifuga ELISA reader s možností měření fluorescence

- 12 -


Detekce luciferázy

Pro studium procesů spojených s genovou expresí se často používájí reporterové systémy. Dají se použít ke studiu expresní aktivity receptoru, intracelulární signální transdukce, skládání proteinů a studium interakcí. Luciferázový systém je používán zejména z následujích důvodů: • Aktivita transfekovaného genu je k dispozici ihned po překladu do proteinu a nevyžaduje její posttranslační zpracování. • Test je velmi citlivý a použité systémy nemají žádnou vnitřní luminiscenci. • Test je rychlý, vyžaduje pouze několik sekund na vzorek. Světlo je produkováno přeměnou chemické energie oxidací luciferinu prostřednictvím elektronového přechodu při tvorbě oxyluciferinu. Luciferáza katalyzuje oxidaci luciferinu pomocí ATP a Mg2+. Promega systém pro detekci luciferázy obsahuje koenzym A pro zlepšení kinetiky, což umožňuje větší enzymatickou výtěžnost a zvýšení světlelné intenzity a stability signálu po dobu nejméně jedné minuty. Při optimálních podmínkách je možné detekovat okolo 10-20 molů luciferázy.

Cílem je změřit chemiluminiscenci u pokusných vzorků připravených transformací plazmidů s luciferázovým expresním systémem.

- 13 -


Pracovní postup: 1.

Odstraň médium z kultury buněk.

2.

Omyj buňky 1x PBS (2ml).

3.

Nalej na buňky 1x lysis reagent – 200 μl na jednu jamku v 6-ti jamkové desce (900 μl na 100 mm misku 20 μl na jamku v 96jamkove desce).

4.

Seskřábni bunky z misky, přenes buňky do mikrozkumavky a odstraň debris (zbytky buněk na dně zkumavky) jemnou centrifugací (15s short spin).

5.

Přenes 20μl supernatantu na ELISA desku.

6.

Připrav blank (20μl 1x lysis reagent).

7.

Přidej 100μl Luciferase Assay Reagent.

8.

Změř intenzitu chemiluminiscence na ELISA readeru.

Seznam chemikálií a potřeb: Promega E1500 Luciferase Assay Systém PBS Škrabka Centrifuga ELISA reader s možností měření chemiluminiscence

- 14 -


Kapitola 2: Polymerázová řetězová reakce Garant: Václav Brázda

Princip a cíl úlohy Polymerázová řetězová reakce (PCR, Polymerase Chain Reaction) je enzymatická metoda umožňující zmnožení úseku DNA její replikací. PCR slouží k vytvoření až mnoha milionů kopií fragmentu DNA, což umožňuje provést analýzu DNA i z velmi malého vzorku. PCR probíhá v termocykleru, který dokáze během několika sekund zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia. Výsledkem PCR je obrovské množství kopií původní sekvence DNA. Metoda je tak citlivá, že dokáže v ideálním případě odhalit i jedinou molekulu DNA ve vzorku. Reverzní transkripční PCR (RT-PCR) se používá pro zmnožení DNA z RNA. Reverzní transkriptáza přepíše sekvenci RNA do cDNA. Tato metoda je používaná pro stanovení exprese genů. Pokud je známa genomová sekvence, může se tato metoda použít také pro mapování exonů a intronů. Kvantitativní PCR (qPCR) slouží k měření množství cílové sekvence. Zpravidla se využívají fluorescenčně značené sondy nebo značení DNA fluorescenční barvou, například SYBR Green pro měření signalu DNA v reálném čase.

Pracovní postup – qPCR:

Izolace mRNA MagMAX-96 total RNA isolation kit AM1830 AB-Ambion Homogenizce vzorku 1. Připrav Lysis/Binding Solution -140 μl na reakci - vždy čerstvý. Poměr LysisBinding Solution Concentrate: 100% izopropanolu 11:9). 2. Odstraň z buněk (2,5x102 – 2x106) médium a přidej 140 μl Lysis/Binding Solution. 3. Míchej 1 minutu a poté dej zlyzované buňky do ELISA desky na izolaci. Purifikace nukleových kyselin 1. Připrav „Bead mix“ – smíchej 10 μl RNA Binding Beads s 10 μl Lysis/Binding Enhancer (množství na 1 reakci).

- 15 -


2. Přidej 20 μl Mag-Bead Mix ke vzorku, míchej 5 min. 3. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté odstraň opatrně supernatant. 4. Promyj 150 μl Wash Solution 1, 1 minutu za míchání. 5. Vlož do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 2-3 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Promyj 150 μl Wash Solution 2 a dej míchat. 7. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 8. Připrav ředění TURBO DNase – 49 μl MagMAX TURBO DNase Buffer + 1 μl TURBO DNase (množství na 1 reakci).

Štepení DNA a čištění RNA 1. Přidej 50 μl TURBO DNasy a míchej 10-15 min. při pokojové teplotě (bez magnetu!). 2. Přidej 100 μl RNA Rebinding Solution, míchej 3 minuty. 3. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 4. Omyj 2x 150 μl Wash solution 2 a dej míchat. 5. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté opatrně odstraň supernatant. 6. Vysuš Beads mícháním 2 minuty. 7. Přidej 50 μl Elution buffer a míchej 3 minuty. 8. Dej do magnetu a nech dokud se magnetické partikule s RNA neusadí (cca 23 minuty), poté supernatant s mRNA přepipetuj do zkumavky pro další použití. 9. Změř vyizolovanou RNA na nanodropu.

Reverzní transkripce High Capacity RNA-to-cDNA Kit (PN 4387406) Použij až 2 μg celkové RNA do 20 μl reakce Nech kit rozmrznout na ledu, na reakci :

- 16 -


2x RT buffer

10 μl

20x RT Enzyme mix

1 μl

Nuclease free H20

do 20 μl

Vzorek

až 9 μl

1. Rozpipetuj reakční směs do zkumavek. 2. Uzavři zkumavky. 3. Stoč a dej na led. 4. Naprogramuj thermal cycler: a. Krok 1 – 37°C 60min. b. Krok 2 – 95°C 5min. c. Krok 3 – 4°C do nekonečna 5. Nastav objem reakce na 20 μl. 6. Vlož stripy do cykleru. 7. Spusť. 8. Po ukončení reverzní transkripce přečistíme cDNA pomocí QIAquick Nucleotide Removal Kitu (Quiagene, 28306). 9. Změříme koncentraci cDNA na nanodropu.

Uložení – do 24hod. 2-8°C, dlouhodobě -15 až -25°C

qRT-PCR na AB 7300 Příprava PCR reakce – SYBR Select Master Mix

Připrav cDNA, pro optimální q-PCR použij množství cDNA do 100ng na 20μl vzorek. Promýchej SYBR Select Master Mix před použitím. Pro optimální výsledky je doporučeno provést reakci ve čtyřech opakováních.

Reakce pro 96-ti jamkovou desku: SYBR Select Master Mix

10 μl

Primery (150-400nM)

- 17 -


cDNA template (10 a 100ng) 20 μl

Celkem

Zamíchejte a opatrně stočte, aby byl vzorek bez bublin. Přeneste na PCR desku a uzavřete PCR vršky, lehce stočte, aby ve vzorcích nebyly bublinky (vlastní PCR by se měla jet do 72 hodin, vzorky uchovávejte ve tmě). Dejte do termocykleru AB 7300. Nastavte PCR reakci dle teploty tání (Tm) vašich primerů. 1. Aktivace

-

Hold 50°C 2 min.

2. Aktivace polymerázy

Hold 95°C 2 min.

3. 40 cyklů

Denaturace

95°C 15 sec.

4.

Anneal/Extend

60°C 1 min.

Nastavte dissociační krok. Nastavte objem reakce na 20 μl. Spusťte „run“.

- 18 -


Kapitola 3: Transformace, selekce a kultivace bakterií, izolace plazmidové DNA – restrikční analýza Garant: Petr Šebest

Transformace, selekce a kultivace bakterií

Princip úlohy: Transformace je přenos DNA (v našem případě se jedná o plazmidovou DNA) do hostitelských bakteriálních buněk. Bakteriální buňky musejí být nejprve uvedeny do stavu kompetence, ve kterém jsou schopny cizorodou DNA přijmout. Stav kompetence lze u buněk Escherichia coli navodit působením chloridu vápenatého za nízké teploty (0 °C). Po přidání DNA a zahřátí na 42 °C a následném ochlazení na 0 °C (teplotní šok) přechází transformující DNA do buněk. Transformované buňky se selektují na agarových plotnách obsahujících příslušné antibiotikum. Vyselektované buňky se přeočkují do média s antibiotikem a inkubují se přes noc při teplotě 37 °C. Úspešnost transformace je udávaná 1x109 cfu/µg superhelikální DNA. Pracovní postup: 1. den: 50 min. - 3 hod. přestavka – 10 min. 2. den: 15 min. Po celou dobu pracujte sterilně a se sterilním materiálem (špičky, hokejky, ependorfky). 1. Kompetentní buňky E. coli TOP10 udržujte na ledu a napipetujte do ependorfky 10 µl. 2. Přidejte příslušnou DNA (500 ng) – pBSK nebo pPGM1. 3. Nechejte 30 min. na ledu. 4. Rozehřejte termoblok na 42°C. 5. Transformace teplotním šokem: 45 sec. na 42°C a poté 5 min. na ledu. 6. Nechejte termoblok zchladnout na 37°C. 7. Přidejte 50 µl SOC média a nechejte kultivovat na termobloku 3 hod. při 37°C a 400 rpm.

- 19 -


8. Vysejte na misky s Amp (napipetovat na misku a rozetřít hokejkou). 9. Inkubujte přes noc v termostatu při 37°C. 10. Z nejlepší kolonie odebrat špičkou buňky a přeočkovat do tekutého média s Amp, inkubujte na třepačce do druhého dne při 37°C

- 20 -


Izolace plazmidové DNA a restrikční analýza Princip úlohy: Plazmidy jsou mimochromozómové genofory tvořené kružnicovou dsDNA. V bakteriálních buňkách se vyskytují v jedné až několika tisících kopií na buňku a jsou snadno dostupným zdrojem homogenní DNA. V přirozeném stavu v buňce mají plazmidy zpravidla negativní nadšroubovicové vinutí. Pro izolaci plazmidů pBluescript a pPGM1 použijeme metodu alkalické lýze s přídavkem SDS (Invisorb Spin Plazmid Mini Two kit), která vede k uvolnění vnitřního obsahu buněk. Plazmidová DNA, chromozomální DNA a proteiny jsou denaturovány a v dalším kroku dochází k jejich precipitaci kromě plazmidové DNA, která je renaturována a zůstává v roztoku. Následně je zachycena na koloně a nakonec uvolněna elučním pufrem. Pro další analýzy plazmidů použijeme restrikční endonukleázy. Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. restrikčně modifikačních mechanismů bakterií. Tento systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit – metylační a restrikční. Enzymy s metylační aktivitou specificky modifikují (metylují) vlastní buněčnou DNA, čímž ji chrání před degradací restrikčními enzymy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriemi využívány ke štěpení cizorodé DNA, která není v příslušných sekvencích metylována. Restrikční endonukleázy rozpoznávají krátké sekvence dvouřetězcové DNA a štěpí ji ve specifických místech nebo poblíž nich. V našem případě použijeme RE PvuII, která štepí námi izolovanou DNA ve 2 místech, takže získáme 2 fragmenty.

Obr.: Plazmidy použité při transformaci

- 21 -


Pracovní postup: 3. den: 3 hod. 1. 2 ml bakteriální kultury přenést do mikrocentrifugační zkumavky (ependorfky). 2. Centrifugujte v ependorfce 1 min. 13000 rpm a odlijte supernatant. 3. Rozsuspendujte pelet v 250 µl roztoku A vortexováním nebo pipetováním, tak aby nebyly viditelné žádné shluky buněk. 4. Přidejte 250 µl roztoku B, a zamíchejte opatrně otočením ependorfky 5 krát (ne však déle než 5 minut). Nevortexovat! 5. Přidejte 250 µl roztoku C a zamíchejte jemně ale důkladně zatřepáním 4 až 6krát. Centrifugujte 5 minut při otáčkách 13000 rpm. Nevortexovat! 6. V průběhu centrifugace si připravte čisté ependorfky a umístěte do nich vazebnou kolonu. 7. Přelijte supernatant na kolonu a inkubujte 1 min. Centrifugujte 1 min. při 10300 rpm. 8. Vylijte filtrát a přidejte 750 µl promývacího roztoku (wash solution). Centrifugujte 1 min. při 10300 rpm. Vylijte filtrát. 9. Stočte 3 min. při 13000 rpm, aby došlo ke kompletnímu odstranění zbytkového etanolu. 10. Umístěte kolonku do nové ependorfky a přidejte 50-100 µl elučního pufru. Inkubujte 1 min. (až 10 min.) při pokojové teplotě a nechejte centrifugovat 1 min. 10300 rpm. 11. Změřte koncentraci DNA na nanodropu. 12. 1 µg superhelikální DNA napipetujeme do čisté zkumavky. 13. Přidejte 1/10 objemu pufru z celkového výsledného objemu pro danou RE a 2U RE PvuII a vodu do výsledného objemu 20 µl. 14. Promýchejte a dejte na 37 °C/1 hodinu. 15. V mezičase připravte 1,3% agarózový gel s 1x TAE pufrem. 16. Naneste vzorky na agarózový gel 10 µl + 1ul nanášecího pufru. 17. Zapněte elektroforézu na 100 V na 45 minut.

- 22 -


Kapitola 4: Detekce strukturních přechodů v DNA pomocí CD spektroskopie Garant: Iva Kejnovská

Princip a cíl: Spektroskopická metoda cirkulárního dichroismu (CD) je velmi citlivá ke vzájemné orientaci bazí ležících nad sebou ve šroubovici nukleových kyselin. Jednotlivé struktury poskytují charakteristická spektra CD. Postupným přidáváním činidel je možné vyvolat přechod z jedné uspořádané struktury do druhé. Kooperativnost přechodu spočívá v tom, že v úzkém rozmezí měnících se podmínek dojde ke změně natočení bazí a přitom je překonána energetická bariéra mezi lokálními enegetickými minimy. Příkladem kooperativního přechodu je přechod mezi dvoušroubovicí formy B do formy A působením dehydratačního účinku trifluoretanolu (TFE). V závislosti na primárním složení DNA, tedy na obsahu bazí, je možné vyvolat stejným činidlem přechod do jiné stuktury. Ve druhé úloze s DNA složenou z opakující se CG sekvence působením TFE dojde k přechodu do levotočivé formy Z.

I. B-A přechod Pracovní postup: (120 minut)

1.

Do křemenné kyvety s optickou dráhou 1 mm napipetujte 60 μl připraveného heteroduplexu DNA: GCGGCGACTGGTGAGTACGC . GCGTACTCACCAGTCGCCGC a přidejte 90 μl 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum.

2.

V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 200–330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. T1.

- 23 -


3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V1c1 = V2c2 : V1 - přidaný objem TFE, c1 - % koncentrace přidanéhoTFE, V2 - celkový objem v kyvetě c2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Tn.

Přídavek TFE

Suma přidaného

[μl]

TFE [μl]

Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra v kyvetě [μl]

[%]

90 30 30 35 45

Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě A, výchozí formě B.

II. B-Z přechod Pracovní postup: (120 minut)

1. Do křemenné kyvety s optickou dráhou 1 mm napipetujte 56

l zásobního

roztoku oligonukleotidu (CG)4 a přidejte 84 μl 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum.

2. V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 200–330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 3 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. Z1.

- 24 -


3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V1c1 = V2c2 : V1 - přidaný objem TFE, c1 - % koncentrace přidanéhoTFE, V2 - celkový objem v kyvetě c2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Zn.

Přídavek TFE

Suma přidaného

[μl]

TFE [μl]

Celkový objem Koncentrace TFE Název CD spektra v kyvetě [μl]

[%]

84 20 30 40 50

Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě Z, výchozí formě B.

Seznam potřebného vybavení a chemikálií:  dichrograf  křemenné kyvety  oligonukleotidy  trifluoretanol

- 25 -


Kapitola 5: Aplikace elektrochemické analýzy v kombinaci s redox značením pro detekci specifických sekvencí a genové exprese Garant: Jan Špaček

Princip a cíl: Detekce hybridizace DNA (analýza nukleotidových sekvencí) a analýza genové exprese patří mezi důležité úkoly moderní molekulární diagnostiky. Elektrochemické metody mohou hrát významnou roli ve vývoji nových detekčních technik v této oblasti. DNA je elektroaktivní biopolymer poskytující na různých pracovních elektrodách řadu analyticky využitelných signálů. V některých případech se jeví jako výhodnější přístup využití značení DNA elektroaktivnímy značkami, které poskytují vlastní elektrochemické signály. Aplikace těchto značek v analýze nukleotidových sekvencí je zvláště výhodná, neboť umožňuje velmi selektivně detekovat cílovou DNA (specifickou DNA) v nadbytku ostatní (nespecifické DNA). Jednou z metod, jak připravit takto značenou DNA je inkorporace chemicky modifikovaných nukleotid trifosfátů do DNA pomocí Polymerázové řetězové reakce (PCR). Tato úloha bude zaměřena na přípravu DNA obsahující 7-deazaguanin (dG*) a 7-deazaguanin modifikovaný nitrofenylem v poloze 7 (dGNO2) pomocí PCR a jejich následnou elektrochemickou detekci. O

dG*TP HN H2N O O O HO P O P O P O OOO-

dG

NO2

TP HN

N N

O

H2N O O O HO P O P O P O OOO-

OH

N N

O OH

- 26 -

NO2

O


Pro procvičení před začátkem úlohy doplňte obrázek pojmy z tabulky: 5‘

elongace

templát

5‘

polymeráza

dNTP

3‘

annealing

3‘

primer

PCR Každá skupina připraví dvě reakční směsi. 1. Reakční směs: PCR s dGNO2TP Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (bluescript = plazmidová DNA) 3 U Pfu polymerázy 1x Pfu pufr 1 µM primery 0,2 mM dATP, dCTP, dTTP 0,1 mM dGTP a 0,1 mM dGNO2TP nebo 0,2 mM dGTP (kontrolní vzorek)

2. Reakční směs: PCR s dG*TP Reakční směs o celkovém objemu 100 µl bude obsahovat: 1 ng/µl templátové DNA (cDNA připravená v předchozí úloze) 3 U Pfu polymerázy 1x Pfu pufr 1 µM primery

- 27 -


0,2 mM dATP, dCTP, dTTP 0,1 mM dGTP a 0,1 mM dG*TP nebo 0,2 mM dGTP (kontrolní vzorek)

Takto připravené směsi rozdělte do malých, 200 µl, zkumavek po 30 µl. Reakční směsi v 200 µl zkumavkách umístěte do thermocycleru a spusťte program: 30 cyklů: Denaturace: 94°C, 90 s Nasedání primerů: 60°C, 30 s Prodlužování řetězců: 72°C, 180 s

Počítací úloha Spočítejte, kolik kusů dATP je v každé 200 µl zkumavce (NA = 6,022·1023 mol-1) a jakou hmotnostní koncentraci mají oba primery dohromady v 30 µl výše popsané reakční směsi (délka 20 bazí, průměrná hmotnost 330 g·mol-1).

dATP =

koncentrace primerů =

Analýza PCR produktů na agarózovém gelu: Úspěšnost reakce zjistíme pomocí elektroforézy v 1 % agarózovém gelu (100 V / 30 min, 1x TAE pufr), následným obarvením gelu v ethidium bromidu a vyfocením po ozáření UV světlem. Přečištění produktů PCR Produkt PCR je po dokončení reakce stále ve směsi s přebytkem nukleotidů a primerů, které by zhoršily elektrochemickou analýzu. Proto je nutné provést přečištění. To provedeme PCR purification kitem od firmy Qiagen podle standardního protokolu, který je součástí kitu.

- 28 -


Elektrochemické měření 1) PCR produkty značené dG*: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí square wave voltametrie na „tužkové“ uhlíkové elektrodě v 0,2 M acetátovém pufru pH 5. Parametry měření: doba akumulace:

1 min

počáteční potenciál:

0,3 V

konečný potenciál:

1,5 V

frekvence:

200 Hz

2) PCR produkty značené dGNO2: Analýza bude prováděna pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí cyklické voltametrie na visící rtuťové kapkové elektrodě ve 0,3 M fosfátovém pufru s mravenčanem amonným pH 7. Parametry měření: doba akumulace:

1 min

počáteční potenciál:

0V

potenciál bodu obratu:

-1,85 V a -0,75 V

konečný potenciál:

0 V a 0,1 V

rychlost posuvu potenciálu:

1 V/s

- 29 -

KLASICKÉ A ALTERNATIVNÍ METODY STUDIA STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMOLEKUL návody ke cvičením

Václav Brázda Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2014 Česká Republika První vydání

ISBN: 978-80-87541-06-7

Labolatoř molekulárních komplexů chromatinu

CEITEC a Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita

2. praktický

Kurz pokročilých mikroskopických technik 17. - 20. března 2014 Praktické seznámení s pokročilými mikroskopickými technikami, které jsou využitelné v laboratořích se zaměřením na experimentální biologii, biochemii a biofyziku. Budou představeny • Pokročilé mikroskopické techniky FRAP, FLIM, FRET, FCS • Účastníci se seznámí s konfokální mikroskopií a jejím využití pro in vivo experimenty a mikroskopii v reálném čase Místo konání Brno, Univerzitní kampus Bohunice, blok A2, seminární místnost 2.11 praktická výuka bude probíhat v laboratořích UKB Přihlášení Zájemci se přihlásí prostřednictvím e-mailu na [email protected] Ctirad Hofr, Ph.D. Seminář je organizován v rámci projektu OP VK Rozvoj moderních trendů v experimentální biologii: význam biomolekulárních interakcí pro funkci buněčných struktur CZ.1.07/2.3.00/30.0019.

www.modexbio.cz

Kurz pokročilých mikroskopických technik

9-10

Den 1

Den2

Úvodní přednáška metody konfokální mikroskopie a organizace kurzu

Přednáška: Teoretické základy časově rozlišené mikroskopie (FLIM)

Praktické seznámení s konfokálním mikroskopem Tipy a triky pro optimální nastavení

10-12

pozorování vzorků Úvod do analýzy obrazu v programu Photoshop Skupina A (5 osob) Photoshop Skupina B (5 osob) mikroskop Zeiss

Pozorování vzorků in vitro za použití časově rozlišené mikroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob) Vyhodnocení výsledků in vitro měření FLIM Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

oběd

13-15

Základní nastavení pro FCS měření in vitro Příprava vzorků proměření za použití fluorescenční korelační spektroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

Pozorování vzorků in vivo za použití časově rozlišené mikroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

Analýza obrazu v programu Photoshop záměna skupin A a B

Vyhodnocení výsledků in vivo měření FLIM Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Kurz pokročilých mikroskopických technik

9-10

10-12

Den 3

Den 4

Přednáška: Teoretické základy rezonančního přenosu energie a aplikace ve fluorescenční mikroskopii (FRET)

Přednáška: fluorescenční korelační spektroskopie FCS

Pozorování vzorků in vitro za použití rezonančního přenosu energie FRET Skupina A (5 osob) mikroskop Zeiss Skupina B (5 osob) mikroskop Olympus Vyhodnocení výsledků in vitro měření FRET Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Základní nastavení pro FCS měření in vitro Příprava vzorků proměření za použití fluorescenční korelační spektroskopie mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

oběd

13-15

Pozorování vzorků in vivo za použití kombinace FLIM a FRET Skupina A (5 osob) mikroskop Zeiss

Pozorování vzorků živých buněk metodou FCS mikroskop Zeiss Skupina A (5 osob)

Vyhodnocení výsledků in vivo měření FRET Výuka software na kvantifikaci doby dohasínání Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Vyhodnocení výsledků měření FCS Výuka software ImageJ Skupina B (5 osob) záměna skupin A a B

Autofluorescence – an intrinsic property of cells arising from endogenous fluorophores (pyridinic and flavin coenzymes, aromatic amino acids, lipopigments) Specific fluorescence - fluorescent signals obtained by adding exogenous markers (fluorescent stains)

Patrycja Klos, PhD



http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/axioobserver/index.html

[email protected]

1

Confocal microscope

Advanced methods in fluorescence microscopy

Patrycja Klos, PhD, Vratislav Peška, PhD Chromatin Molecular Complexes Group

Fluorescence Correlation Spectroscopy • FCCS – a dual color extension of FCS Signals from two spectrally separated dyes labeling two different molecules If there is interaction: synchronous diffusion through confocal volume Correlated fluctuations in fluorescence acquired in two channels Purpose:  measuring protein-protein /protein-DNA interactions

Fluorescence intensity

• Assessing dynamical properties of (fluorescently labeled) particles in:  solutions (water/buffers)  membranes  living cells. • Measuring fluorescence intensity fluctuations of particles. • Fluctuations caused by:  particles leaving and entering the observation volume (translation diffusion)  ligand-macromolecule binding  rotational diffusion  internal molecule dynamics

Fluorescence Correlation Spectroscopy

Time Autocorrelation function 1/N~1/c


t D~1/D

The confocal volume of laser beam ~ 1femto liter

Autocorrelation function G(τ ). The amplitude at G(0) encodes the inverse of the particle number N. The time at point of inflection yields the diffusion time τD of the labeled molecule through the confocal volume. Concentrations c and diffusion coefficients D for free DNA and protein-DNA complex are then calculated from the fit.


• FCS/FCCS in live cells:  Cells – more complicated objects: i. compartmentalization by membranes ii. many organelles, vesicles, macromolecules iii. binding to different structures, transportation  diffusion is disturbed – anomality parameter, or a two-component fit!

1

FCCS confocal/FCCS SPIM

SPIM-FCCS results: HEK293T, no drug

• Confocal FCCS: only single-position measurement (confocal volume ~ 500 nm/1 fL) • SPIM FCCS: fluorescence excited at all pixels of the field of view at the same time; information collected from the whole „sheet of light” Focal volume Cultured cell

Objective

SPIM-FCCS results: HEK293T, 5 uM cisPt

Fluorescence Correlation Spectroscopy • Practical issues:

5 uM cisPt

Fluorescence Correlation Spectroscopy • Summary:  FCS/FCCS: analysis of dynamic properties/interactions of molecules in solutions  measuring fluorescence intensity fluctuations of molecules entering and escaping tiny observation volume  calculation of the autocorrelation function from intensity fluctuations  obtaining parametrs describing molecule dynamics from autocorrelation function (diffusion coeficient, concentration)

 sensitive detectors: PMTs, APDs, GaAsP detector  pinhole objective - high numerical aperture (NA>0.9)  imaging slides – glass, detergent treatment  for FCCS: dyes well separated in spectrum  for live cells imaging: CO2 incubator

Fluorescence Correlation Spectroscopy • Other advanced microscopy techniques used for protein binding/protein interaction studies:  FRET – fluorescence resonance energy transfer  FLIM-FRET – fluorescence lifetime imaging + fluorescence resonance energy transfer FRAP – fluorescence recovery after photobleaching

2

Fluorescence Correlation Spectroscopy • Practical session (today)  Confocal microscopy – tips and tricks  Measuring dynamics of fluorescent particles in solutions –calibration experiment I. dyes: Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 633 II. concentration: 20 nM III. imaging dishes: glass chamber slides IV. equipment: Zeiss LSM780 confocal microscope with GaAsP detector; Ar laser, He-Ne laser • Practical session (tomorrow)  FCCS in HEK293T cells transfected with fluorescent constructs


Attention

3

Manual for a course in advanced microscopic techniques, March 2014: 17. - 18.3.2014 Lectures: 

introduction to confocal microscopy and other advanced microscopy techniques  confocality  differences between wide field and confocal microscopy  advanced microscopy techniques (FRET, FLIM, FRAP, SPIM)  fluorescence correlation and cross-correlation spectroscopy (FCS/FCCS)

Practical session (Zeiss LSM 780 system): 

 

tips and tricks for optimal visualization of a sample  laser power  pinhole size  PMT voltage (gain)  offset  digital offset  averaging z-stack of Zygnema FCS single-color calibration experiment (Alexa Fluor 488 and Alexa Fluo 633, separately)

19. - 20.3.2014 Lectures: 

introduction to FCCS experiment in living cells

Practical session (Zeiss LSM 780 system):    

two-color calibration (Alexa Fluor 488 and Alexa Fluo 633, mixed) FCCS experiment: visualization of telomeric protein interactions (TRF2-TIN2) in living HEK293T cells analysis of autocorrelation and cross-correlation curve interpretation of acquired data (diffusion coefficient and diffusion time, triplet state, structural parameter).

MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/30.0019

Praktický kurz pokročilých metod experimentální biologie

konaný na Katedře biologie a ekologie Přírodovědecké fakulty Ostravské univerzity v Ostravě v termínu 27. 1. – 31. 1. 2014

Program praktického kurzu Pondělí 27. 1. 2014

Úterý 28. 1. 2014

Kvantitativní PCR v reálném čase

Sledování lyze hostitelských buněk v adsorpční směsi

Středa 29. 1. 2014

Čtvrtek 30. 1. 2014

Miniaturizovaný SOS Jednobuněčná gelová chromotest elektroforéza (kometový test)

Pátek 31. 1. 2014

Biochemická analýza proteinů krevního séra pomocí gelové elektroforézy.

Sledování lyze hostitelských buněk v adsorpční směsi Úvod Virulentní a polyvalentní stafylofág 812 se intenzivně množí na hostitelském kmeni S. aureus. Pro adsorpci na hostitelské buňky vyžaduje adsorpční faktor Ca2+ nebo Mg2+ . Pro uskutečnění lyze musí být hostitelsky kmen v exponenciální fázi růstu. Důležité je také použít správný vkladový poměr IR( input ratio), který vyjadřuje poměr vložených virionů ku počtu hostitelských buněk. Nejčastěji se používá IR od 0,1 do 0,01. Při vyšších hodnotách IR může dojít k lyzi buněk ihned po adsorpci aniž by proběhl proces virové reprodukce. Princip Množení virulentního fága na hostitelských buňkách lze dokumentovat sledováním průběhu lyze. Pro sledování rychlosti lyze ( projevuje se projasňováním bakteriální kultury) lze využít automatizované zařízení BIOSCREEN C. lze také sledovat vliv různých podmínek na průběh lyze, např. vhodný vkladový poměr IR nebo vliv pH. Materiál a zařízení Mikroorganizmy a bakteriofág : Kmeny Staphylococcus aureus, lyzát virulentního stafylokového fága φ 812 (titr lyzátu cca 1010 PFU/ml), Chemikálie a roztoky : tryptonový bujón (TB) (pH7 a pH 6), 2% tryptonový agar TA 0,22% CaCl2 0,15 % CaCl2 Přístroje: Bioscreen C, vodní lázeň, multikanálová automatická pipeta Postup Příprava hostitelských buněk. Noční kultrura: Inokula vybraných kmenů S. aureus připravíme naočkováním 20 ml TB cca. 108 buněk z plotny s 2% TA (jedna plná očkovací klička). Kultivujeme staticky 24 h při 37 °C. Buňky v exponenciální fázi: Zaočkujeme 3 ml inokula noční kultury do 200 ml TB Kultivujeme cca. 4 hodiny při 37 °C za intenzivního provzdušňování tak, aby výsledná hustota bakteriální suspenze odpovídala A 620 = 78%. Příprava adsorpční směsi: K 18 ml hostitelských buněk S.aureus (cca 109 CFU/ml) přidáme 2 ml 0,22% CaCl2 . Buňky s adsorpčním kofaktorem vytemperujeme na 30°C ve vodní lázni Poté přidáme 0,2 ml vytemperovaného φ 812 (titr lyzátů cca 10 10 PFU/ml), promícháme a pipetujeme automatickou pipetou po 300µl do jamek sterilní inkubační destičky (5 jamek pro každou adsorpční směs). Podle nastavených parametrů přístroje vzorky inkubujeme při 30°C, zákal vzorků měříme po 30 min při vlnové délce 600 nm. Měření Před odběrem a mezi odběry (po 15 min) jsou vzorky krátce protřepány, aby nedocházelo k usazení buněk. Zákal adsorpčních směsí sledujeme po dobu 24 h. Metodu můžeme modifikovat změnou koncentrace adsorpčního kofaktoru ( použijeme např. 0,15% CaCl2, změnou hodnoty pH kultivačního media TB v rozmezí hodnot 6 - 7,5 nebo volbou nižšího či vyššího vkladového poměru IR (0,1 nebo 0,05- získáme zředěním na ½ původního lyzátu) , či volbou jiných kmenů S.aureus pro přípravu hostitelských buněk. Vyhodnocení a závěr Hodnoty OD600 vytiskneme do tabulky. Vypočteme rychlost lyze hostitelských buněk. Na základě výsledku experimentu stanovíme vhodný hostitelský kmen pro zvolené fágy, popř.

modifikací metody vhodné podmínky pro nastavení parametrů adsorpční směsi. Organizace práce Budou pracovat 3 skupiny 1. Sk. použije IR 0,1 – lyzát bez ředění + TB pH=7 2. Sk. použije IR 0,05- lyzát bez ředění + TB pH=7 3. Sk. IR 0,1 – lyzát bez ředění + TB pH=6 Složení TB média 10g Trypton 4g Yeast extract 3g NaCl Doplnit 1000ml dest. vody ( pro naši potřebu stačí 500ml) Sterilizace 20min

Miniaturizovaný SOS chromotest Úvod Test je možno použít pro hodnocení genotoxicity látek rozpustných ve vodě nebo organických rozpouštědlech. Hodnotí se schopnost látek indukovat SOS reparační mechanismy po vzniku poškození DNA typu lézí. Princip Barevnými změnami je hodnocena aktivita enzymů. PNPP žlutá - charakterizuje konstitutivní tvorbu alkalické fosfatázy – v testu by intenzita zbarvení neměla příliš kolísat. K jejímu zeslabování může docházet v důsledku toxického efektu vyšších koncentrací testované látky. X – GAL modrá - charakterizuje tvorbu β-galaktosidázy po indukci SOS operonu a signalizuje míru mutagenního poškození. Pracovní postup 1. Do Erlenmayerovy baňky připravíme noční kulturu kmene PQ 37.  0,1-0,2 ml kmene (nebo jedna klička)  5 ml LB  10 µl Ampicilinu (ampicilin ze zásobního roztoku) 2. Kultivujeme přes noc asi 15 hodin v termostatu za stálého třepání při 37⁰C. 3. Po 15 hodinové inkubaci naředíme kulturu na E620 = 0,4 (koncentrace 6 – 8 x 106 cfu/ml). 4. Do ependorfek naředíme vzorek na 6 různých koncentrací. (viz. tab) 5. Aplikace 10 µl vzorku a 190 µl kmene. První koncentrace vzorku společně s kmenem se pipetuje do jamek v prvním sloupci 1. a 3. řady (H1 a H3). Následující koncentrace se aplikují až do 6. sloupce vždy do 1. a 3. řádku (G1 a G3, F1 a F3, E1 a E3, D1a D3, C1 a C3). Do jamek v sedmém sloupci v 1. a 3. řadě pipetujeme 200 µl kmene v Lmédiu (B1 a B3). Do jamek v osmém sloupci v 1. a 3. řadě pipetujeme 200 µl Lmédia bez kmene (A1 a A3). Pomocí vícekanálové pipety jamky promíchat. 6. Vytvořit 2 paralelky pomocí vícekanálové pipety odebráním 100 µl směsi z jamek v řadě č. 1 do řady č. 2 a z řady č. 3 do řady č.4. 7. Inkubujeme 3 hodiny při 37 ⁰C za stálého třepání. 8. Destičku centrifugujeme při 3000 g po dobu 20 min při 37 ⁰C. 9. Supernatant odsajeme vícekanálovou pipetou a bakterie resuspendujeme. 

1. a 2. řada směs

100 µl směsi Tris pufru + 100 µl X – GAL lyzogenní

(vícekanálovou pipetou do jamek na destičce)



3. a 4. řada

100 µl směsi Tris pufru + 100 µl PNPP lyzogenní směs

10. Vše dobře promícháváme a inkubujeme v termostatu při 37 ⁰C za stálého třepání. 11. Měření provádíme v ELISA po 60 a 120 minutách. Měření se provádí při 

620 nm = β-galaktosidáza, řada 1 a 2



405 nm = alkalická fosfatáza, řada 3 a 4

12. Vypočítáme IF jako Rcn/R0 (kontrola) R0=β gal/alkal. OSF

Rcn= β gal/alkal. OSF

Rcn…pro danou koncentraci

13. Sestavíme graf závislosti Ic na koncentraci testované látky

Ředění vzorků

a) Zásobní roztok 10 mM Nitrofurantoin Vzorek (µl)

(2,38 mg/1ml DMSO)

Ependorfka č.

H2O (µl)

Koncentrace

Koncentrace na jamku

1

180

20ze zásobního roztoku

238µg/1000 µl

11,9µg/100 µl

2

100

100 z ependorfky č. 1

119µg/1000 µl

5,95 µg/100 µl

3

50


79,3µg/1000 µl

3,965 µg/100 µl

4

50


52,86 µg/1000 µl

2,643 µg/100 µl

5

50


35,2 µg/1000 µl

1,76 µg/100 µl

6

50


23,49 µg/1000 µl

1,175 µg/100 µl

b) Vzorek vody č. 1, 2 a 3 Ependorfka č. H2O (µl) Vzorek vody (µl) 1

0

30

2

3

27

3

6

24

4

9

21

5

12

18

6

15

15

Zásobní roztoky: Ampicilin 30 (10) mg Ampicilinu do 3 (1) ml redestilované H2O - ZAMRAZIT Ze zásobního roztoku ampicilinu se aplikuje 10µl/ 5 ml LB 200 mM Tris pufr na nesuspendování Tris ( hydroxylmethyl aminomethan) molární hmotnost = 282,3339 56,4668 g (5,647 g) Tris do 1000 (100) ml redestilované H2O Ověříme konečné pH Tris pufru = 7,5 Lyzogenní směs (40 % methanol ;0,5% toluen, 10% N,N- dimethylformamid) X-GAL PNPP 0,020 g X- GAL

0,00705 g PNPP

5 ml H2O

5 ml H2O

4 ml methanolu

4 ml methanolu

1 ml N,N – dimetylformamid

1 ml N,N- dimethyl formamid

50 µl toluen

50 µl toluen

Aplikace do řady 1 a 2 vždy 100 µl

Aplikace do řady 3 a 4 vždy 100 µl

Ověříme konečné pH lyzogenní směsí = 7,8 – 7,9 Bezprostředně před použitím zahřejeme na 37 ⁰C a přefiltrujeme přes 0,2 µm filtr. Obrázek č. 1: Postup při pipetování vzorků a médií na destičku

Organizace práce Budou pracovat 3 skupiny 1. Sk. na jedné destičce bude standard + vzorek vody č.1 2. Sk. na jedné destičce bude standard + vzorek vody č.2 3. Sk. na jedné destičce bude standard + vzorek vody č.3

Základy kvantitativní PCR v reálném čase Od svého objevení v roce 1983 a poté, co byla dr. Karymu Mullisovi udělena za tento objev v roce 1993 Nobelova cena za chemii, došla PCR mnoha různých úprav, vylepšení a množství jejich aplikací je nepřeberné. Jedním z největších skokových posunů bylo umožnění sledovat PCR v reálném čase. Tato technologická možnost byla objevena – jako mnoho jiných důležitých objevů – náhodou, shodou okolností ve stejném roce, kdy byla Mullisovi udělena Nobelova cena. Dramatický rozvoj qPCR nastal po roce 1996, kdy byl na trh uveden první komerční real-time PCR cyklér. Kvantitaivní PCR, jak už z názvu vyplývá, slouží ke specifické kvantifikaci DNA. Výhodou oproti standardním spektrofotometrickým metodám je možnost detekovat pouze námi zvolenou DNA (např. virová DNA v buňce) a zároveň obrovská citlivost metody (jsme schopni detekovat jedinou molekulu, kvantifikovat pak řádově desítky molekul). Principem kvantitativní PCR je doplnění standardní PCR reakce o flurofor, který umožní kvantifikovat nově vznikající dvouřetězcové molekuly DNA. Hlavní využití nachází qPCR v analýze genové exprese, kdy umožňuje přesně stanovit změny v expresi genů v závislosti na „vnější události“. Častým příkladem tak je sledování buněčné odpovědi na vystavení různým medikamentům, environmentálním produktům, změněným fyzikálním či kultivačním podmínkám atd. Před samotnou qPCR musíme z buněk izolovat mRNA, její množství, které odpovídá úrovni exprese daného genu, je pak po reverzní transkripci kvantifikováno. Další rozšíření možností qPCR poskytlo tzv. HRM, tedy „high resolution melting“ analýza. Amplifikovaná DNA se nechá renaturovat a pak je při pomalém zahřívání kontinuálně sledována změna fluorescence. Z profilů křivek tání jsme takto schopni detekovat mutace (nejčastěji jednonukleotidové záměny takzvané SNP) a odlišit od sebe homo a heterozygoty (genotypizace). Materiál a metody - špičky, mikrotitrační destičky, mikrozkumavky, destičky pro realtime PCR, mastermix (Roche SYBR green master), primery, cDNA (z kvasinek) - automatické pipety (Eppendorf research), mikrocentrifugy (Eppendorf Minispin+), Real-Time PCR cycler (Roche, LightCycler 480)¨

Postup: 1) Absolutní kvantifikace V této úloze si vyzkoušíme specifickou kvantifikaci DNA. Nejprve připravíme koncentrační řadu cDNA (z kvasinek), která bude sloužit pro přípravu kalibrační křivky. Poté připravíme vzorky „kontaminované“ plasmidovou DNA. Tato úloha pomůže pochopit princip absolutní kvantifikace a pomůže nám seznámit se s obsluhou realtime PCR cykléru a jeho softwaru. A) Připravte koncentrační řadu cDNA v rozsahu 5řádů v objemu cca 50ul B) Připravte PCR mix pro absolutní kvantifikaci (primery pro β-aktin), viz. tabulka C) Jako neznámý vzorek použijte směs cDNA ze středního ředění a pBS (0,5ul cDNA a 0,5ul pBS) a cDNA a pcr vody (0,5ulcDNA a 0,5ul vody). D) Proveďte pcr reakci podle schématu v počítači obsluhujícím cyklér, vyhodnoťte koncentraci neznámého vzorku a posuďte vliv kontaminující DNA

2) Relativní kvantifikace a HRM Pro analýzu genové exprese byla reverzní transkripcí připravena cDNA z kvasinek (Saccharomyces cerevisae), které byly pěstovány v přítomnosti antioxidantu (k. Galová). Kontrolní vzorek byl pěstován pouze v médiu s antioxidantem, u druhého vzorku byla na konci kultivace na 15min přidán peroxid vodíku. V této úloze sledujeme rozdíl v expresi genů, které se podílejí na odpovědi na oxidační stres (dvě izoformy katalázy (CAT a CTT), super oxid dismutáza (SOD) a heat shock protein 26 (HSP)). Pro normalizaci je využit referenční gen, jehož exprese není ovlivněna přítomnosti peroxidu – transkripční elongační faktor (TEF).

A) Připravte 4 PCR mixy pro čtyři vybrané geny (každá skupina jeden PCR mix pro všechny ostatní) B) Připravte PCR reakce tak, že každá skupina provede pro všechny vybrané geny reakci s kontrolní nebo treatovanou cDNA C) Proveďte PCR podle schématu v cykléru D) Vyhodnoťte vliv přítomnosti antioxidantu na expresi sledovaných genů. PCR mix složka 1 reakce 10 reakcí** Master mix 5 ul 50 ul Primery * 1 ul 10 ul Voda 3 ul 30 ul * Pro absolutní kvantifikaci pro každou reakci stejný primer mix. Pro relativní kvantifikaci pro každý gen specifický primer mix (čtyři geny, čtyři různé PCR mixy). ** Počet reakcí počítejte vždy +10% (11 reakcí, když potřebujete 10, 22 když dvacet...). Spočítejte, na kolik reakcí PCR mix připravit.

Jednobuněčná gelová elektroforéza (kometový test) Předmět testu Kometový test je rychlý, pracovně nenáročný postup detekující zlomy a alkalilabilní místa DNA zahrnující syntézu metody alkalického rozplétání, alkalické eluce DNA a elektroforetických technik. Kometový test umožňuje detekovat jednořetězcové zlomy DNA, alkalilabilní polohy, křížové spojení DNA – protein, oxidační a alkalylabilní poškození DNA v eukaryotických buňkách in vitro prostřednictvím fluorescenčního mikroskopu. Princip testu Molekula DNA, která má přirozeně záporný náboj, migruje v elektrickém poli směrem k anodě. Rychlost migrace v elektrickém poli závisí na počtu zlomů a velikosti molekuly DNA. Výstupem zpracování je buněčné jádro, z něhož v závislosti na poškození byla elektroforeticky vytažena DNA do tvaru připomínající kometu. Ocas komety je tvořen rozvolněnými, převážně jednořetězcovými smyčkami DNA. Jejich počet v ocase komety je úměrný počtu zlomů v DNA a může být detekován v mikroskopu na základě měření intenzity fluorescence DNA jako % DNA v ocase komety (%T) nebo délky ocasu komety (TL). Materiál, pomůcky, chemikálie, přístroje Chemikálie: EDTA, Triton X-100, TRIS, Ethidium Bromide, NaOH, NaCl, DMSO, KH2PO4, Na2HPO4, Agarose II for low-gem aaplications, Agarose Type I, low EEO, ethanol Pomůcky: Podložní sklíčka, krycí sklíčka, odměrné baňky, váženky, pipety a špičky, rukavice, papírové utěrky, alobal, barvící nádoby, tác na barvení preparátů, box na preparáty Přístroje: Horizontální elektroforéza, zdroj nízkého napětí pro elektroforézu, termostat, mikrovlnná trouba, analytické váhy, pH metr, inkubátor, fluorescenční mikroskop, kamera, software pro obrazovou analýzu, počítač Pracovní postup Příprava zásobních roztoků Pufrovaný fyziologický roztok PBS – 8g NaCl, 1,44g KCl, 0,24g KH2PO4 , 1,44g Na2HPO4 – přidat 800 ml destilované vody, upravit hodnotu pH na 7,4 a doplnit do 1l. Lyzující roztok – 146,40g NaCl, 37,20g EDTA, 1,2g Tris, 8g NaOH, přidat 800 ml destilované vody, upravit hodnotu pH na 10 a doplnit do 1l. Uchovávat v lednici. Pufr na alkalickou elektroforézu – připraví se těsně před testem z roztoků 60 ml 10M NaOH a 10 ml 200mM EDTA, doplnit destilovanou vodou do 2l. Uchovávat v lednici. Neutralizační pufr – 48,5g Tris, doplnit do 1 litru destilovanou vodou. Upravit na pH 7,5, skladovat při pokojové teplotě. Barvící roztok – 0,1g ethidium bromid rozpustit v 100ml destilované vody, skladovat při pokojové teplotě. LMP (low meeting point) agaróza – 0,15g Agarose II for low – gel applications rozpustit ve 20 ml PBS, rozplnit po 160 µl do eppendorfek. NMP (normal meeting point) agaróza – 0,15g Agarose Type I, low EEO rozpustit ve 20 ml PBS, rozplnit po 250 µl do eppendorfek.

Příprava sklíček (den před testem) Sklíčka se očistí v 96% ethanolu, vyleští a předehřejí v termostatu na 50oC. Připraví se agaróza – 0,6g Agarose type I rozvařit za stálého míchání v 60ml destilované vody, pak pomalu přilít 40ml 96% ethanolu. Předehřátá podložní skla se ponoří do rozehřáté agarózy a umístí se zpět na 30 minut do termostatu a nechají se vychladnout. Potažená sklíčka je možno skladovat v lednici. Příprava lyzujícího roztoku (den testu) Triton X-100 (2ml) se smíchá s 22,6, ml 10% DMSO (3ml DMSO, 27 ml destilované vody). Pak se přidá 200 ml zásobního lyzujícího roztoku. Roztok se uchovává do doby potřeby v ledničce. Odběr krve Odebereme jehlou kapku krve z prstu do eppendorfky vypláchnuté roztokem EDTA. Krev o objemu 30 µl naředíme v 1 ml roztoku RPMI 1640 s 10% FBS. Centrifugujeme při 1300 otáčkách 3 minuty. Na test použijeme 20 µl naředěné krve. Postup testu Práce prováděné v laboratoři při běžné pokojové teplotě: Rozehřejeme NMP agarózu ve zkumavkovém inkubátoru na 100oC. Předem potažená podložní sklíčka umístíme na topnou desku nastavenou na 45oC. Na zahřáté sklíčka kápneme 110µl NMP agarózy a překryjeme krycím sklem. Po nakapání všech skel necháme ztuhnout na ledu (5 minut). Práce prováděné v chladové místnosti za použití žlutého světla: Rozehřejeme LMP agarózu ve zkumavkovém inkubátoru na 100oC, po rozehřátí snížíme teplotu na 38oC. Z připravených sklíček postupně odstraníme krycí sklíčka. 20µl vzorku odebrané krve přidáme do eppendorfky s rozehřátou LMP agarózou. Po promíchání aplikujeme 75 µl agarózy se vzorkem na každé sklo a překryjeme krycím sklem. Necháme zatuhnout na ledu (5 minut). Poté opatrně odstraníme krycí sklo a ponoříme preparáty do vychlazeného lyzujícího roztoku a umístíme do ledničky na 1 hodinu. Po uplynutí stanovené doby preparáty vyjmeme z lyzujícího roztoku a umístíme je na 40 minut do alkalického pufru. Mezitím si připravíme elektroforetickou vanu – naplníme ji elektroforetickým pufrem, nastavíme napětí na 36 V a proud na 300mA. Preparáty umístíme do vany popisem směrem k anodě (záporná elektroda – směr migrace DNA) a necháme je zde po dobu 20 minut. Dále je provedena neutralizace zakápnutím 500 µl Trisu na sklíčko, necháme působit 5 minut, postup opakujeme 3x. Barvení preparátů je prováděno roztokem ethidium bromidu (150 µl ethidium bromidu/3,7ml destilované vody). Roztok je aplikován v množství 100 µl na sklíčka, která překryjeme krycím sklem a necháme barvit po dobu 6 minut. Poté stáhneme krycí sklíčka, promyjeme destilovanou vodou v barvící vaničce a fixujeme 7 minut 50 µl methanolu. Hotové preparáty necháme uschnout v tmavé místnosti nejlépe dva dny. Vyhodnocení testu Preparáty se hodnotí v tmavé místnosti na fluorescenčním mikroskopu při zvětšení 25x nebo 40x. Sklíčko s preparátem zakápneme destilovanou vodou a překryjeme krycím sklíčkem. Při vizuálním hodnocení se analyzuje 100 komet na jeden gel. Komety se zařazují do 5 kategorií podle tvaru komety. Stanovuje se průměrná hodnota poškození (P) P =  (0 x a) + (1 x b) + (2 x c) + (3 x d) + (4 x e) kde:

0 až 4 označení kategorie poškození a = počet buněk kategorie 0 b = počet buněk kategorie 1 c = počet buněk kategorie 2 d = počet buněk kategorie 3 e = počet buněk kategorie 4 Při hodnocení preparátů obrazovou analýzou je potřeba CCD kamera a počítač. Existuje více systémů pro obrazovou analýzu (např. Comet analysis systém, vyvinutý Konetic Imaging, Ltd.). Jako parametr poškození se nejčastěji používá % DNA v ocase komety (% tail DNA). Literatura Gábelová, A., Dušinská M.: Alkalická jednobunková gélová elektroforéza – kométový test. Standardní operační postupy pro biologické monitorování genotoxických účinkl faktorů prostředí. Acta hygienica, epidemiologova et microbiologica číslo 3/2003. SZÚ Praha. ISSN 0862-5956. Ústav experimentální medicíny AVČR Praha - Standardní operační postup – Comet

BIOCHEMICKÁ ANALÝZA PROTEINŮ KREVNÍHO SÉRA Nejrozsáhlejší a nejvýznamnější část laboratorních vyšetření v klinické praxi tvoří analýzy krve, krevního séra nebo plazmy. Krev je poměrně snadno dostupným materiálem a v jejím složení se odráží celá řada biochemických pochodů probíhajících v různých tkáních. Krev pro odběr se může získávat z žil, tepen nebo kapilár. Nejčastěji se odebírá žilní krev (většinou z kubitální žíly), méně často kapilární (např. z prstu, ušního lalůčku nebo z prohřáté patičky u novorozence). Arteriální krev se odebírá pouze výjimečně, hlavně pro analýzy krevních plynů. Krev odebraná bez použití protisrážlivých prostředků se po kratší době sráží, v důsledku přeměny rozpustného fibrinogenu na vláknitou síť fibrinu. Odstředěním sražené krve se získá sérum. Doba srážení musí být dostatečná (při pokojové teplotě po 15–30 min). Předčasné oddělení séra od krevních elementů však může vést k dodatečné tvorbě fibrinu a koagulaci séra. Pro některá klinickobiochemická vyšetření je třeba získat nesrážlivou krev. Krev je odebírána do nádobek s přídavkem antikoagulačních činidel. Odstředěním nesrážlivé krve se získá plazma. Krev je možno odstředit ihned po odběru, čímž lze ušetřit čas u akutních stavů. Plazma nebo sérum mají být odděleny co možná nejdříve, nejpozději však do 2 hodin od odběru. K oddělení krevních elementů od plazmy, resp. krevní sraženiny od séra, se používají centrifugy. K dokonalému odstředění plné či sražené krve se používá přetížení odpovídající přibližně 1000 násobku tíhového zrychlení (1000G). Centrifugace krve se vždy provádí v uzavřených zkumavkách (zamezení vzniku aerosolu, příp. kontaminace vzorku) po dobu asi 10–15 minut při pokojové teplotě nebo při teplotě 4 ºC. Delší doba centrifugace nebo zvýšení centrifugačního přetížení vede často k částečné či úplné hemolýze. Elektroforéza proteinů krevního séra Elektroforéza proteinů krevního séra je laboratorní metoda běžně používaná v klinických laboratořích. Slouží jako screeningová metoda, tj. jako metoda „vyhledávání odchylek od normy“ ve složení spektra proteinů tělních tekutin (séra, moče, likvoru). Separace proteinů se provádí na vhodném nosiči nejčastěji na agarózovém či polyakrylamidovém gelu. Proteiny tvoří velkou skupinu látek přítomných v plazmě (séru), jejich celková koncentrace se pohybuje v rozmezí 60 - 80 g/L. Tyto proteiny plní řadu funkcí, nacházíme zde transportní proteiny, protilátky, inhibitory enzymů, srážecí faktory, aj. Pro vyšetření spektra krevních proteinů je nejvhodnějším sérum: na rozdíl od plazmy neobsahuje fibrinogen (faktor I koagulační kaskády), jehož fyziologická koncentrace je kolem 3 g/L. V případě vyšetření plazmy se fibrinogen nachází v místech, kde se za patologických situací mohou vyskytovat tzv. paraproteiny, proto je sérum na vyšetření vhodnější. Během různých onemocnění se mění relativní zastoupení jednotlivých proteinů v séru a tím i elektroforeogram, který tak může sloužit k orientačnímu zhodnocení zastoupení výše uvedených frakcí proteinů. Elektroforéza proteinů krevního séra se proto rutinně používá v diagnostice patofyziologických stavů.

Principem

elektroforézy

je

separace

látek

v elektrickém

poli

podle

jejich

relativní

elektroforetické mobility (pohyblivosti). Používané nosiče můžeme rozdělit do dvou skupin: 1) nosiče umožňující separaci pouze na základě náboje dělených částic (např. acetylcelulóza, agarózový gel); 2) nosiče vykazující tzv. sítový efekt (např. polyakrylamidový gel): tyto nosiče jsou tvořeny póry o velikosti, která se blíží rozměrům separovaných molekul. Dělení proteinů se tak uskutečňuje nejen na základě velikosti náboje, ale i na základě velikosti molekuly. Výsledkem je více frakcí, než lze získat při separaci na nosičích z první skupiny (25 i více frakcí proteinů krevního séra při analýze na polyakrylamidovém gelu proti šesti frakcím získaným na agaróze). Separace se sítovým efektem tak poskytuje komplexnější obraz, který je však pro klinickou interpretaci obtížnější a v běžných klinických laboratořích se k dělení proteinů krevního séra příliš nepoužívá. Rychlost pohybu jednotlivých proteinů na agarózovém gelu závisí převážně na jejich náboji, který je dán hodnotou pH pufru používaného při analýze. Separace proteinů se běžně provádí při pH kolem 8,6. Tato hodnota pH je vyšší než je hodnota izoelektrického bodu většiny sérových proteinů Pufr používaný při elektroforetické separaci udržuje konstantní pH během analýzy a tím i konstantní záporný náboj jednotlivých proteinů. Rychlost pohybu závisí na celkovém náboji molekuly.

Normální králičí sérum rozdělené na polyakrylamidu za nativních podmínek (vlevo) a technikou SDSPAGE. SDS-PAGE vykazuje daleko lepší rozlišovací schopnost. Albumin (MW cca 66000) jako nejhojnější sérový protein tvořený jediným polypeptidovým řetězcem snadno identifikujeme na obou elektroforeogramech. Naopak pro imunoglobulin IgG, což je tetramer složený ze dvou těžkých a dvou lehkých řetězců spojených disulfidovými můstky, se výsledek obou elektrofores dost liší: zatímco za nativních podmínek migruje jako nejpomalejší γ-globulinová frakce, na SDS-PAGE se objevují zvlášť jeho těžké řetězce (MW cca 55000) a lehké řetězce (MW cca 25000). Na obrázku uprostřed SDSPAGE sérových proteinů , v dráze č. 1. normální sérum vepře, v dráze č. 2. normální kuřecí sérum, v dráze č.3 standard proteinů lidského krevního séra. Na obrázku vpravo: dráhy

1.a 6 standard

proteinů lidského krevního séra, 2. lidské krevní sérum, 3. sérum vepře, 4. králičí sérum, 5. kuřecí sérum.

Využití elektroforézy v klinické praxi Elektroforéza proteinů krevního séra je relativně jednoduchá technika užitečná k identifikaci celé řady patofyziologických stavů, např. monoklonálních gamapatií, jaterní cirhózy, renálního selhání, hypogamaglobulinemie, aj. „Typ akutního zánětu (odpovědi akutní fáze)“ se vyznačuje poklesem albuminu. Vyskytuje se při zátěži nebo zánětech způsobených infekcí, zraněním nebo chirurgickým zákrokem. „Typ chronického zánětu“ je spojen s infekcí a vyznačuje se vzrůstem gama globulinové frakce frakce albuminu bývá snížena. „Hypogamaglobulinemie“ se vyznačuje extrémně nízkou intenzitou gama frakce; vyskytuje se při imunosupresivním onemocnění. „Jaterní cirrhóza“ se vyznačuje širokým zvýšením gama globulinů s poklesem albuminu (tzv. polyklonální gamapatie). „Nefrotický syndrom“: v elektroforéze se prezentuje selektivním snížením albuminové frakce a gamaglobulinů.

Cílové proteiny jednotlivých elektroforetických frakcí Albumin Albumin je syntetizován v játrech. Jeho koncentrace v séru je 35 - 50 g/L a biologický poločas činí 20 dní. Albumin je velmi významný transportní protein - váže a přenáší mnohé látky (mastné kyseliny, hormony, bilirubin, léky, kovy). Dále se podílí na udržení vodní rovnováhy mezi intravaskulárním a extravaskulárním prostorem (udržování onkotického tlaku krevní plazmy) a pufruje tělní tekutiny - zvýšení: dehydratace - snížení: poškození jater, chronická infekce, onemocnění ledvin, podvýživa Gamaglobuliny Jsou imunoglobuliny (protilátky) syntetizované plazmatickými buňkami. Kvantitativně je nejvýznamnější IgG. Monoklonální imunoglobuliny se mohou nacházet v různých vzdálenostech od startu. Jedná se o patologické proteiny (paraproteiny), které jsou syntetizovány B-buněčným lymfocytárním klonem při nádorových onemocněních (např. mnohočetný myelom, leukémie). - zvýšení: polyklonální (nebo monoklonální) gamaglobulinemie, jaterní onemocnění, chronické infekce - snížení: fyziologicky u malých dětí, hypoimunitní syndrom Normální hodnoty cílových elektroforetických frakcí: Frakce

%

Albumin

56 - 66

gama globuliny

10 - 18

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS 

polyakrylamidový gel vzniká polymerací volných radikálů vytvořených z: a) akrylamidu CH2=CH-CO-NH2 b) síťovacího monomeru N,N-metylénbisakrylamidu (zkratka Bis) CH2=CH-CO-NHCH2-NH-CO-CH=CH2

Oba monomery jsou neurotoxiny, které se vstřebávají pokožkou. Jejich efekt je kumulativní. Proto vždy používáme gumové rukavice ! Polyakrylamid je považován za netoxický, avšak může obsahovat malé množství nezpolymerovaného akrylamidu ! 

velikost pórů v gelu je nepřímo úměrná koncentraci akrylamidu (v 5-20 % gelech s 5% Bis se velikost pórů pohybuje v rozmezí 4,0-6,0 m)



jako redoxní katalyzátor polymerace se používá TEMED (N,N,N´,N´-tetramethylendiamin)



iniciátorem polymerace je persíranamonný ( (NH4)2S2O8), který poskytuje volné kyslíkové radikály 

pro dělení globulárních bílkovin různé

molekulové hmotnosti se používají různé koncentrace gelu % akrylamidu

molekulová hmotnost bílkovin

15-20

pod 20 000

12

10 000-90 000

7,5

30 000-150 000

4

90 000-1 000 000

Teorie       

 

do vzorku gelů i pufrů se přidá detergent SDS (sodiumdodecylsulfát, dodecylsíran sodný) Dodecylsulfát sodný (SDS) je detergent, který se váže k proteinům a mění jejich tvar do válcovité podoby. Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru, asi 1,4 gSDS / g proteinu (to odpovídá jedné molekule SDS na 2 AA zbytky). Vysoký negativní náboj navázaného SDS překrývá vlastní náboj proteinu, takže proteiny pokryté SDS mají shodné poměry počtu nábojů na jednotku hmoty a podobný tvar. Následkem toho, se při elektroforézev gelech obsahujících SDS proteiny dělí působením gelové filtrace na základě své molekulovéhmotnosti. S přesností 5-10% je možno stanovit pomocí SDS-PAGE molekulovou hmotnost běžně velkých proteinů. Relativní pohyblivost se lineárně mění s logaritmem jejich molekulové hmotnosti.

když se kromě SDS přidá ještě redukující činidlo (2-merkaptoethanol nebo dithiotreitol) rozruší se tím disulfidové vazby molekul a lze takto stanovit podjednotkovou strukturu bílkoviny pro svoji jednoduchost je to dnes nejužívanější metoda pro stanovení molekulové hmotnosti bílkovin

Proteiny se nejčastěji barví ponořením gelu do kyselého roztoku obsahujícího alkohol a barvivo Coomassie brilliant blue. Proteiny jsou v tomto roztoku jednak denaturovány a tím i fixovány, jednak se vytváří komplexy barvivo-protein. Přebytek barviva se odstraní buď omýváním gelu kyselým roztokem, nebo elektroforetickým odbarvením. Lze takto detekovat mikrogramová množství rozdělených proteinů. Proužky gelu obsahující menší množství proteinů je možné obarvit stříbrem (50x citlivější, ale složitější).

PŘÍPRAVA ELEKTRODOVÉHO PUFRU Tris –Glycin SDS pufr, pH 8,3 10X koncentrovaný zásobní roztok: 0,25 M Tris base, 1,92 M Glycin, 1 % SDS (v případě nativní ELFO nepřidáváme) g/l pro 10X konc. roztok      

Navážíme 15,15 g Tris base) Navážíme 72,0 g Glycinu Navážíme 5 g SDS Doplníme na objem 500ml ddH2O pH není nutno upravovat Uchováváme v lednici při 4°C

V 1X koncentrovaném pufru jsou koncentrace následující: 25 mMTris base, 192 mM Glycin, 0,1 % SDS Do ELFO APELEX minigel se vejde cca 400 ml pufru PŘÍPRAVA SEPARAČNÍHO (RESOLVING) GELU PRO ELEKTROFORÉZU Příprava 30

%

Akrylamidového zásobního roztoku (Akrylamid+Bisakrylamid,

AA+Bis,

Akrylamid mix) Navážíme 29 g Akrylamidu Navážíme 1 g Bisakrylamidu Obě složky rozpustíme v 60 ml ddH2O za stálého míchání a mírného ohřevu (cca 37°C nepřekročit 55°C)  Doplníme na výsledný objem 100 ml ddH2O  Uchováváme v dobře uzavřené tmavé lahvi v lednici při 4°C  Stabilní cca 1 měsíc, pokud cítíme unikající amoniak nutno vyměnit Poznámka: výsledná koncentrace obou složek je:Akrylamid  29 %, Bisakrylamid 1 %   

Příprava 1,5 M Trisu pH 8,8     

Navážíme 18,165 g Trisu Navážku rozpustíme v cca 70-80 ml ddH2O pH upravíme pomocí 1M HCl na hodnotu 8.8 Doplníme na výsledný objem 100 ml Vysterilizujeme v autoklávu

Příprava 10 % zásobního roztoku APS (ammoniumpersulfát, persíran amonný)    

Navážíme 1g APS Odvážené množství APS rozpustíme v 9 ml ddH2O Takto získáme 10% zásobní roztok APS Uchováváme při pokojové teplotě = RT

Poznámka: výsledná koncentrace APS v gelu je 0,1 % Příprava 10 % zásobního roztoku SDS (dodecylsulfát sodný)   

Navážíme 1g SDS Odvážené množství SDS rozpustíme v 9 ml ddH2O Takto získáme 10% zásobní roztok APS



Uchováváme při pokojové teplotě (RT) Objemy jednotlivých složek pro přípravu 10 % polyakrylamidového gelu

PŘÍPRAVA ZAOSTŘOVACÍHO (STACKING) GELU PRO ELEKTROFORÉZU

PROVEDENÍ VLASTNÍ ELEKTROFORÉZY 1. Uvolníme plastové šrouby držáku skel. Vložíme držák do stojanu a vložíme do něj skla (vyšší dozadu). 2. Mezi skla umístíme spacery a mírně utáhneme šrouby. Přesvědčíme se, zda jsou spodní hrany skel a spacerů v rovině. 3. Položíme držák se skly na gumovou podložku a zatlačíme jej pod výstupek z plexiskla. Nyní jsou skla připravena k nalití gelu. 4. Připravíme základní roztok pro nalití dělícího gelu a promícháme (viz. barevná tabulka). (Po přidání TEMEDu a persíranu amonného je třeba ihned nalít roztok mezi skla, protože gel začíná polymerovat.) 5. Roztok pro dělící gel naneseme do elfo komůrky, asi 3-4 cm od okraje kratšího skla. 6. Po nanesení roztoku pro dělící gel rychle zarovnáme hladinu přídavkem butanolu (jako horní vrstvu nad gelem). Gel necháme při laboratorníteplotě tuhnout minimálně 45 (30) min. (V tomto stadiulze gel po zalití vodou a zatavení do igelitového sáčku uchovat 1 den v lednici.) 7. Během tuhnutí dělícího gelu připravíme základní roztok pro zaostřovací gel. 8. Z povrchu dělícího gelu odstraníme butanol propláchnutím destilovanou vodou se střičky. Zbytky destilované vody odstraníme filtračním papírem. 9. K namíchanému základnímu roztoku zaostřovacího gelu přidáme TEMED a APS . 10. Zaostřovací gel naneseme do elfo komůrky na povrch dělícího gelu až po okraj horního skla. Pak do roztoku zaostřovacího gelu vsadíme hřeben (pozor na vznik bublin). 11. Gel necháme tuhnout minimálně 45 (60) minut. 12. Pokud je to nutné, z jamek odstraníme nezpolymerovaný podíl proužky filtračního papíru 13. Do 1/3 elfo nádoby nalijeme ELFO pufr. Filtračním papírem odstraníme bubliny na jednu stranu. 14. Prostor mezi elfo komůrkami napnlíme až po okraj ELFO pufrem. V ELFO nádobě doplníme pufr po rysku. 15. Aplikujeme 2-20 μl vzorku (dle koncentrace, velikosti jamek a tloušťky hřebenů a spacerů). 16. Na elfo nádobu nasadíme víko a nastavíme hodnotu napětí na 120 V (cca 30 mA, 15 mA na jeden gel) 17. Ukončení elfo posuzujeme podle doběhnutí barviva na konec dělícího gelu. (Zaostřovací proces probíhá asi 0,5-1 hodinu, dělící 1-1,5 hodiny). 18. Povolíme šrouby držáku skel a opatrně vyjmeme gel (sklo páčíme z boku). Označíme orientaci gelu tím, že odřízneme levý horní roh (spacerem, popř hranou lopatky). 19. Ponoříme gel do roztoku Coomassie blue R-250 a ponecháme barvit cca 10-30 minut. 20. Přelijeme gel odbarvovacím roztokem (Destainfor R-250) a ponecháme třepat za laboratorní teploty (možno přes noc) až do úplného odbarvení pozadí.

NANÁŠECÍ PUFRY Množství proteinů nanášených na gel závisí na jejich čistotě a způsobu následné barevné detekce. U vysoce purifikovaných proteinů stačí v případě minigelů 0,5-5 μg proteinů na dráhu. Buněčné lyzáty a ®

podobné směsi se aplikují v množství cca 50 μg. Detekční limit v případě barvení Coomassie modři představuje detekční limit 100 ng proteinu/na proužek. 2x koncentrovaný Tris-Glycin SDS vzorkový (nanášecí, sample) (126 mMTris-HCl, pH, 20 % glycerol 6,8, 4 % SDS, 0,005 % Bromfenolová modř)  Odměříme 2,5 ml 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8  Přidáme 2 ml glycerolu  Dále přidáme 4 ml 10% SDS  Přidáme 0,5 ml 1% Bromfenolové modři  Doplníme ddH2O do 10 ml  Uchováváme v mrazáku při -20°C V 1X koncentrovaném nanášecím pufru jsou koncentrace následující-63 mMTris-HCl, 10% glycerol, 2%SDS, 0,0025 % Bromfenolová modř, 2,5 % ME Se vzorky pracujeme při teplotě 4 °C. Jestliže připravuje vzorky, které nebudeme na gel ihned aplikovat, je vhodné z nich připravit alikvoty, abychom se vyhnuli opakovanému rozmrazování a zamrazování. Vzorky nenecháváme při pokojové teplotě bez předchozí inaktivace proteáz zahřátím na 95 °C. Vlastní příprava vzorku:  Vzorek s nanášecím pufrem dobře promícháme  Zahřejeme na 95-100 °C ve vařící vodě (na termobloku) po dobu 4-5 minut  Můžeme zamrazit při -20°C nebo přímo nanášíme na gel DETEKCE PROTEINŮ BARVIVEM Coomasie blue R-250 Coomasie blue se váže nespecificky ke většině proteinů. Coomasie blue stain solution 1X pracovní roztok (40 % etanol, 0,125 % Coomasie blue R 250, 10% CH 3COOH)  Odměříme 200 ml etanolu  Do etanolu vsypeme 0,625 g Coomasie blue R 250  Přidáme 250 ml ddH2O  Doplníme 50 ml ledové CH3COOH Poznámka: Nutno zachovávat výše uvedené pořadí při přípravě roztoku Coomasie blue destain solution 1X pracovní roztok (5 % etanol, 7,5 % CH3COOH)  Odměříme 25 ml etanolu  Přidáme 75 ml ledové CH3COOH  Doplníme ddH2O do 500 ml 1. Barvíme cca 20 minut nebo déle dle potřeby (barvící roztok může být i několikrát opakovaně použit) 2. Gel poté opláchneme vodou 3. Gel umístíme do odbarvovacího roztoku (lázně) 4. Lázeň možná bude nutné v některých případech opakovaně vyměnit, aby došlo k úplnému odbarvení gelu (pozadí)

WORKSHOP METOD EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE SBORNÍK

Recommend Documents