Kvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie
Leona Leišová
Přírodovědecká fakulta UK, Praha 2009
Metody kvantifikace: Nepřímé metody
odhad míry napadení
HTZ
stanovení obsahu mykotoxinů a dalších sekundárních metabolitů Přímé metody
Kompetitivní PCR
Real-time SYBR Green PCR
Taq Man real-time PCR
Kompetitivní PCR Specifické primery Kompetitor – DNA o známé koncentraci extrahovaná z mycelia pěstovaného in vitro Doohan et al. 1999: Plant Pathol. 48: 209-217. - Stanovení obsahu Fusarium culmorum a Fusarium graminearum v pletivu obilek pšenice Triticum aestivum Výhody: relativně levná metodika Nevýhody: je zatížena velkou chybou odečtu intenzit produktů PCR po elektroforetické separaci
SYBR-Green real-time PCR Specifické primery SYBR-Green = fluorescenční interkalační barvivo Fraaije et al. 2002: Plant Pathol. 51: 45-54. - Stanovení obsahu rzi pšeničné Erysiphe graminis v listových pletivech pšenice Triticum aestivum Výhody: přesnější odečty intenzit fluorescenčního záření produktů (CCD kamera) než u kompetitivní PCR Nevýhody: dražší metodika, problémy se specifičností reakce a s interpretací výsledků
OYDV Disociační křivky Elektroforéza
LYSV
Taq Man real-time PCR Specifické primery Taq Man sonda = specifický oligonukleotid s fluorescenční značkou na 3´konci a se zhášečem fluorescence na 5´konci
Leišová et al. 2004: 7th Conference of EFPP, Aberdeen 2004, 46-47. - Stanovení obsahu patogena Pyrenophora teres v pletivech ječmene Hordeum vulgare
- Stanovení obsahu Fusarium culmorum v pletivu obilek ječmene Hordeum vulgare a pšenice Triticum aestivum
Výhody: nejpřesnější metoda ze všech tří uvedených, s vysokou mírou specifičnosti Nevýhody: nejdražší metoda ze všech tří uvedených
Stanovení obsahu Pyrenophora teres v listových pletivech ječmene Hordeum vulgare Druhově specifické primery a Taq Man sondy – na bázi AFLP, klonování, sekvencování, T-coffee, Primer Express Optimalizace real-time PCR – ABI PRISM 7700, 7900 P.teres f. maculata
P.teres f. maculata
P.teres f.teres
DT340i DT350j
P.tere s f.teres
DT376b P.teres f.maculata
Uspořádání real-time PCR Uniplex – Taq Man sonda-FAM (patogen) Multiplex – Taq Man sonda-FAM (patogen), Taq Man sonda-VIC (housekeepingový gen hostitele)
Uniplexové uspořádání RT PCR s primery a sondou DT376b-FAM; templát: ředicí řada směsi DNA P. teres a ječmene
Multiplexové uspořádání RT PCR s primery a sondami DT376b-FAM a RacB-VIC; templát: ředicí řada směsi DNA P. teres a ječmene
Interpretace výsledků Taq Man real-time PCR Amplifikační plot – DT376b
Obrazová analýza LUCIA
Kalibrační křivka – Ct/ c (ng/ul)
1 0.95
Ct Hv/ Ct Dr
0.9 0.85 0.8 0.75
y = 0.0379x + 0.7348 2
R = 0.7497
0.7 0.65 0.6 0
1
2
3
4 FillArea
5
6
7
Stanovení obsahu Fusarium culmorum v pletivech obilek pšenice Triticum aestivum a ječmene Hordeum vulgare Druhově specifické primery – na bázi druhově specifických amplikonů, PCR, sekvencování, primery a Taq Man sondy Optimalizace real-time PCR Uniplexové uspořádání real-time PCR Testování na přítomnost inhibitorů PCR 32,00 30,00
Ct
28,00 26,00 24,00
y = -1,6179Ln(x) + 32,457 R2 = 0,9731
22,00 20,00
Fu98s1
1,0
10,0
100,0 c
1000,0
Interpretace výsledků real-time PCR Fu98s1
Obilky ječmene napadené Fusarium culmorum
Stanovení obsahu deoxynivalenolu (DON)
Obilky pšenice napadené Fusarium culmorum
Možnosti metody Taq Man Real-Time PCR Kvantitativní detekce jakéhokoliv patogena (viry, bakterie, houby) v pletivech hostitele - odhad míry napadení
použití fungicidu
výběr osiva pro výsev či pro další zpracování
testování odrůd na rezistenci
Studium účinků patogenů na hostitelské rostliny při různých podmínkách napadení Studium intenzity obrany hostitelské rostliny vůči patogenu
Poděkování Ing. Ladislav Kučera Ing. Dagmar Kučerová Ing. Věra Minaříková
Dr. Jana Šárová Mgr. Alena Hanzalová Mgr. Iva Kudlíková
RNDr. Světlana Sýkorová Ing. Jana Chrpová Ing. Václav Šíp
NAZV QC1361
RNDr. Jaroslava Ovesná
GAČR 521/02/0099
Děkuji za pozornost!
