ehled metod molekulární biologie využívaných v patofyziologii
Molekulárn biologická diagnostika • Molekulárn biologická diagnostika proteomu, genomu a transkriptomu • Co umož uje diagnostika na úrovni nukleových kyselin • Principy základních metodik • Praktické poznámky
Molekulárn biologická diagnostika • Diagnostika na úrovni DNA, RNA a protein • Analýza genomu, transkriptomu, proteomu, p íp. metabolomu • Analýza kvalitativní i kvantitativní
Proteomika
Proteom – poprvé zaveden v roce 1994 Marcem R. Wilkinsem
pro ozna ení všech protein kódovaných genomem
Vnit ní parametry Genetické dispozice
Vn jší parametry
Stárnutí
Onemocn ní
Lé iva
Životní prost edí
Bu ka
Geny
Genová analýza • SNP •Mutace •Sekvenace
mRNA
Proteiny
Analýza exprese
Analýza interakcí
•mRNA •Protein
• ProteinProtein-protein •AntigenAntigen-protilátka •EnzymEnzym-substrát •ProteinProtein-DNA •LigandLigand-receptor
Studium p ítomnosti protein v bu kách (analýza proteomu) Metody pro stanovení fyzické p ítomnosti protein : • • • • • •
polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) westernový p enos imunoprecipitace imunohistochemie izoelektrická fokusace dvourozm rná elektroforéza v polyakrylamidovém gelu • chromatografie • fluorescen ní a elektronová mikroskopie • pr toková cytometrie
Nejpoužívan jší techniky - proteiny • • • • • • •
Dvoudimenzionální ELFO Rentgenová krystalografie NMR Hmotnostní spektroskopie PAGE Chromatografie (HPLC) ELISA
Metody využívané sou asnou proteomikou pro studium protein 1. Dvoudimenzionální elektroforéza
Nejd íve je vzorek protein rozd len izoelektrickou fokusací zleva doprava a pak elektroforézou podle své hmotnosti shora dol .
2. Rentgenová krystalografie
Rentgenové zá ení, stejn jako sv tlo, je druh elektromagnetického zá ení o velmi malé vlnové délce. Jestliže zam íme svazek paralelních rentgenových paprsk na dob e vyvinutý krystal istého proteinu, n které paprsky budou rozptýleny ur itým zp sobem atomy v krystalu a projeví se jakour itý obrazec difrak ních skvrn na vhodném detektoru. Poloha a intenzita skvrn v obrazci obsahuje informaci o poloze atom v krystalu proteinu, ze kterého obrazec vznikl.
3. NMR - spektroskopie
Roztok proteinu se umístí do silného magnetického pole, kde je vystaven pulz m rádiové frekvence. Signály, v tomto p ípad z atomových jader vodíku v r zných aminokyselinách lze identifikovat a ur it tak vzdálenosti mezi r znými ástmi proteinové molekuly. V ásti (A) je nazna eno dvourozm rné NMR-spektrum odvozené z karboxylového konce enzymu celulázy . Skvrny p edstavují interakce mezi sousedními atomy H. Výsledná struktura odpovídající rozmíst ní skvrn je v ásti (B).
4. Hmotnostní spektroskopie
1 5 6 1 .6 1 5 6 0 .6 1 5 5 9 .6
100
Intensity [%]
80
1 5 5 8 .6 1 5 6 2 .6
60 40
1 5 5 7 .7 1 5 6 3 .8
20 0 1550
1555
1560
1565
1570
M a s s /C h a rg e
Hmotnostní spektroskopie je fyzikáln -chemická metoda pro ur ování hmotnosti molekul a jejich ástí. Hmotností spektrometr je iontov optické za ízení, které ze sm si molekul a iont separuje nabité ástice podle jejich efektivní hmotnosti m/z (m je hmotnost, z je náboj) a umož uje je stanovit. Dále poskytuje údaje o relativním zastoupení iont stejné hmotnosti v celkovém množství iont ve sm si. Záznam molekulárních a fragmentových iont je charakteristický pro danou látku a dává cenné informace o její struktu e a na jeho základ lze v tšinou strukturu látky odvodit nebo potvrdit. Hmotností spektrometrie je metoda citlivá a umož uje analyzovat látky v množství kolem 10 9 g.
5. SDS-PAGE elektroforéza
SDS-PAGE
(= sodium dodecylsulphatepolyacrylamide gel electrophoresis) -metoda pro separaci protein dle jejich velikosti
SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) CH3 CH2 CH2 CH2
•SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) aniontový detergent
CH2 CH2 CH2
–solubilizuje a denaturuje proteiny
CH2
–dodává protein m negativní náboj
CH2
tšina protein váže SDS ve stejném pom ru, asi 1,4 g SDS/g proteinu
CH2
CH2 O S
-
O
O
O
•Zvýšená teplota denaturuje proteiny
CH2
SDS
-proteiny jsou tepeln denaturovány ve vzorkovém pufru obsahujícím dodecyl sulfát sodný (SDS)- zachována je tak pouze jejich primární struktura -denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj daný vazbou SDS – migrace tedy závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti
Pohyb takto upravených protein v elektrickém poli: -proteiny mající negativní náboj se pohybují sm rem ke kladn nabité elektrod
Jak funguje SDS-PAGE? •Negativn nabité proteiny se pohybují ke kladné elektrod
s-s SDS, zah átí Proteiny s SDS
•Menší proteiny se pohybují rychleji •Proteiny se rozd lují podle velikosti (molekulové hmotnosti)
-
+
Pro používat akrylamidový gel k separaci protein ? • Akrylamidový gel: pevná a inertní matrix • Ideální pro separaci protein • Menší velikost pór než u agarosy • Proteiny jsou menší než intaktní chromoz. DNA Gel je vytvo en polymerací aktylamidu a N´,N´methylenbisakrylamidu zahájenou volnýmí radikály vzniklými p i rozkladu persíranu amonného.
Akrylamidový gel
akrylamid
N,N‘ - methylenbisakrylamid
Akrylamidový gel
Separace protein v akrylamidovém gelu
íprava gelu
Denaturované vzorky jsou naneseny na gel
Podmínky pro elektroforézu: •15 min, 50 V •15 min, 100 V •1 – 1,5 hod 150 V
Zviditeln ní protein separovaných PAGE - nespecificky: obarvení všech protein ve vzorku proteinovými barvivy - specificky: westernový p enos (detekce specifických protein protilátkami) Nespecifické barvení protein v gelech: - st íbro, „coomassie brilliant blue“ Specifické barvení protein p i westernovém p enosu: - p enos rozd lených protein z gelu na pevný filtr (elektroblotting) - navázání protilátky na p íslušný antigen p i promývání filtru v roztoku specifické primární protilátky (protilátka musí rozeznat lineární epitop – protein je denaturován) - zviditeln ní protilátky na filtru nap . radioaktivní sondou nebo sekundární protilátkou konjugovanou s ur itým enzymem
K vizualizaci protein dochází v roztoku Coomasie blue.
Zviditeln ní protein westernovým p enosem
Blotting protein a nukleových kyselin Pro další charakterizaci nebo p i mikropreparaci je nutné extrahovat proteiny i nukleové kyseliny z gelu, kteý je nevhodný pro manipulaci i pro provád ní detek ních chemických reakcí. Je p itom nutné zabránit smísení separovaných biomakromolekul. Nej ast ji se používají techniky tzv. blottingu (angl. blot = skvrna, ka ka, esky p enos) . P i blottingu se pásy separované elektroforézou p enášejí na ur itou membránu, kde jsou uchyceny adsorpcí nebo kovalentní vazbou. Po vazb na membránu je pak možné provád t analýzu znými zp soby. DNA analýza (Southern blotting, Southern 1975) RNA analýza (Northern blotting, Alwine et al., 1977) PROT analýza (Western blotting, Towbin et al., 1979)
Southern blotting DNA je z gelu p enesena na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu. ítomnost ur ité jedno et zcové DNA je pak potvrzena hybridizací vazbou komplementárního DNA et zce (sonda i proba), který je zna en radioaktivn , biotinylací nebo vazbou antigenu pro imunodetekci. Použití nap . pro azení fragment restrik ního št pení genomové DNA jednotlivým gen m. Northern blotting Separovaná RNA je p enesena na membránu. Specifická detekce se d je hybridizací s komplementární DNA sondou, která je zna ena. Ob metody mají velký význam pro molekulární biologii, ale v sou asné dob jsou ast ji zastupovány PCR technikami.
Western blotting Proteiny jsou separovány SDS-PAGE a následn p eneseny na nitrocelulózovou nebo polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu. Barvení na membrán se provádí pomocí Ponceau S, Fast Green nebo Amido erni10 B. Specifická detekce protein se provádí použitím primárních protilátek; vzniklý imunokomplex se visualizuje vazbou zna ené sekundární protilátky nebo zna eného proteinu A i G (zna ení nej ast ji vazbou enzymu - nap . alkalické fosfatasy a peroxidasy, ale i koloidním zlatem, radioaktivn , luminiscen i fluorescen . Detekce glykoprotein se d je modifikovanou Schiffovou reakcí, alcianovou mod í, vazbou lektin . N které enzymy lze prokázat b žnou reak ní sm sí nebo p i blottingu asto dochází k renaturaci již denaturovaných bílkovin.
Blokování Vzhledem k tomu, že v tšina používaných detek ních systém po blottingu obsahuje jako indika ní složky proteiny, je nutné po vlastním p enosu blokovat zbývající vazebná místa na membrán , aby zde nedocházelo k nespecifické vazb t chto bílkovin. Nesmí však dojít k vyt sn ní vzorku, jeho modifikaci nebo k interferenci s detek ní reakcí. Používají se: inertní proteiny BSA, kasein, hemoglobin, želatina p íp. nízkotu né mléko. Nespecifické vazb protein na membránu p i detekci brání v n kterých aplikacích použití neionogenních detergent . Obdobn je nutné inaktivovat volné reaktivní skupiny diazotovaných membrán a membrán aktivovaných CNBr. To se d lá použitím 10% roztoku ethanolaminu.
Rozd lení metod blottingu podle provedení Difuzní blotting - prostá difuze v tanku s p enosovým pufrem, dlouhá doba 36-48 hodin, velkou nevýhodou difuze do stran zhoršení rozlišení vlastní elektroforetické separace. Kapilární blotting - blotovací membrána umíst na na povrchu gelu, který leží na porézní podložce v nádob s p enosovým pufrem, na ní pak vrstva vlhkého filtra ního papíru a ada vrstev suchých filtra ních papír . Celá jednotka je zatížena. Suchý papír nasává kapilárními silami pufr, vzorek je tak tažen z gelu na membránu. Trvá zhruba 12 hodin. Vakuový blotting - obdobné uspo ádání jako u kapilárního blottingu, místo kapilárních sil vzorek tažen vakuem. Podstatn rychlejší (30 min). Výhodou též ost ejší pásy (potla ení difuze).
Rozd lení metod blottingu podle provedení Elektroblotting - nejrychlejší a nejú inn jší metoda. Hnací silou je v tomto p ípad síla elektrického pole. Podle provedení se rozlišuje tzv. „tankový (tank, wet)“ blotting a „polosuchý (semidry)“ blotting. Jediný pro vysokomolekulární biopolymery. Hlavními výhodami polosuchého blottingu v porovnání s tankovým jsou: 1) homogenní elektrické pole, 2) možnost vyššího nap ového gradientu , 3) menší spot eba p enosového pufru, 4) možnost simultánního p enosu z n kolika gel Volba p enosového pufru je podmínkou pro úsp šný blotting. ležitý pro výb r složení je zejména typ použité membrány, u elektroblottingu p istupuje ješt pH pufru a iontová síla.
Elektroblotting
Nukleové kyseliny
• Detekce p ítomnosti nukleové kyseliny (detekce p ítomnosti specifické sekvence) • Analýza struktury (sekvence) nukleové kyseliny • Kvantifikace nukleové kyseliny se specifickou sekvencí
Molekulárn biologická diagnostika • Interdisciplinární – Biochemie – Patologie (in situ diagnostika) – Léka ská genetika – Onkologie – Hematologie – Nukleární medicína
Nejpoužívan jší metodologické postupy • Detekce p ítomnosti DNA specifické pro ur itý živo išný druh / bun ný klon • Detekce jednonukleotidových zám n • Detekce inzercí/delecí • Detekce po tu repetitivních sekvencí • Sekvenace
Požadavky na izolaci nukleových kyselin • Prvním krokem p i práci s nukleovými kyselinami je jejich izolace v nativním stavu z p irozeného materiálu, v dostate ném množství a istot . • Nukleové kyseliny je t eba zbavit všech látek, které se po lyzi bun k nebo virových ástic stávají sou ástí hrubých lyzát a jejichž p ítomnost by bránila ú innému a specifickému p sobení enzym používaných k jejich analýze a úpravám.
Materiál pro izolaci nukleových kyselin • Výchozím materiálem mohou být: – Jednotlivé bu ky (nap . prokaryotických organizm nebo kvasinek) • Genomová • Plazmidová
– Tkán a orgány eukaryot, které jsou nejd íve homogenizovány – Virové ástice purifikované centrifuga ními technikami – Nukleové kyseliny v elektroforetických gelech – Produkty PCR reakcí
Metodické principy využívané p i izolaci nukleových kyselin • Rozrušení bun ných st n nebo virových nukleokapsid sobením – Enzym (lysozym a celulázy) – Detergent (dodecylsulfát sodný)
• Enzymatické kroky pro odstran ní kontaminant – Proteináza K – RNáza nebo DNáza
• Kroky využívající r znou rozpustnost – Fenolová extrakce – Adsorpce na pevný podklad
• Centrifugace • Precipitace
Typy metod pro izolaci nukleových kyselin 1. Metody využívající rozdílné rozpustnosti • • •
Zahrnují fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení) Obecn rozší ené, široké aplikace Vhodné pro vysokomolekulární genomové NK
2. Metody adsorp ní • •
DNA se váže na k emi ité sklo v p ítomnosti chaotropní látky Vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmid a malých fragment
3. Centrifugace v hustotním gradientu • • •
Izopyknické centrifugace v gradientu CsCl Vhodné p i velkém množství a pro vysokou istotu Možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech
Typická fenolová extrakce • Promíchání lyzátu bun k s roztokem fenolu, p ípadn se sm sí fenolu a chloroformu. Fenol je organické rozpoušt dlo používané k odd lení protein od nukleových kyselin. Proteiny jsou hydrofobní a z stávají v organické fázi, zatímco NK jsou vysoce nabité a p echázejí do vodné fáze. Chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá odd lení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku. • Centrifugace, p i níž dojde k odd lení spodní organické fáze, tvo ené fenolem (p ípadn sm sí fenolu a chloroformu), mezifáze, tvo ené denaturovanými proteiny a zbytky bun k, a horní vodné fáze, v níž jsou rozpušt ny nukleové kyseliny. • Vysrážení nukleových kyselin etanolem, ípadn izopropanolem. innému vysrážení nukleových kyselin ítomných v nízkých koncentracích se napomáhá snížením teploty a p ídavkem solí. • Shromážd ní precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpušt ní získaného sedimentu ve vhodném roztoku.
Izolace RNA • Izolace RNA fenolovou extrakcí je podobná izolaci DNA s následujícími rozdíly: – Inhibitory RNáz, sterilní boxy, rukavice! – Extrakce v guanidinových solích – Fenolové extrakce p i pH 5-6 – Odstran ní DNA DNázami bez RNáz – Selektivní srážení RNA pomocí LiCl – Afinitní chromatografie na oligo-dT kolonách pro izolaci mRNA
Adsorp ní metody • Využívají schopnost nukleových kyselin adsorbovat se na povrchy z oxidu k emi itého (kolonky do centrifuga ních mikrozkumavek) v p ítomnosti chaotropní soli (Vogelstein and Gillespie, 1979) – jodid sodný (NaI) – guanidin thiokyanát – guanidin hydrochlorid
• Síla vazby závisí na – Typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) – Iontové síle – pH roztoku
• Promývání pro odstran ní protein a dalších kontaminant • Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H2O • Rychlá metoda, vysoký výt žek (malé fragmenty), vysoká istota
Mechanismus interakce DNA s oxidem emi itým
Izolace mRNA • mRNA tvo í pouze malý podíl z celkové RNA, proto je její izolace obtížná • Pro izolaci se využívají – Tradi ní metody, kdy se nejprve izoluje celková RNA, která je následn separovaná na mRNA, rRNA a tRNA – Metody využívající afinitu poly(A) konce u mRNA a biotinem zna ené oligo(dT) sondy • Sonda se v lyzátu selektivn váže na mRNA, aniž by interagovala s DNA nebo jinými RNA • Hybridní molekuly biotinylované dT-A mRNA jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem
Srovnání realizace genetické informace u prokaryot a eukaryot
Analýza a kvantifikace •
•
SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA – Je to vhodná metoda pro m ení vzork , které jsou dostate isté bez významného množství kontaminant. – Nukleové kyseliny absorbují UV zá ení s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm. – Z hodnot optické hustoty lze koncentraci a istotu vzorku stanovit podle empirických vztah . Stupe istoty nukleových kyselin se stanovuje z pom ru absorbance p i 260 a 280 nm. P i zne išt ní vzorku proteiny, jejichž absorp ní maximum leží okolo 280 nm, bude vypo tený pom r výrazn nižší a stanovení koncentrace NK nebude p esné. FLUORESCEN NÍ METODA – Je vhodná u vzork s nízkou koncentrací nukleových kyselin nebo zne išt ných ítomností jiných látek. – Využívá se fluorescence, k níž dochází po ozá ení komplexu etidiumbromidu navázaného na DNA UV sv tlem. Vzniká viditelné ervenooranžové sv tlo o vlnové délce 590 nm, jehož intenzitu lze srovnat s intenzitou standardu o známé koncentraci bu vizuáln , nebo po po ízení fotografického záznamu. Stanovení se provádí na agarózových gelech obsahujících nízkou koncentraci etidiumbromidu, na n ž se testované vzorky bu nakapou, nebo podrobí elektroforéze, která umožní áste nou purifikaci nukleových kyselin.
Nejpoužívan jší techniky - NK • • • • • • • •
Elektroforéza Restrik ní št pení Klonování Sekvenace PCR RFLP Chromatografie (HPLC) Hmotnostní spektroskopie
lící techniky nukleových kyselin • Metody – Centrifuga ní – Elektromigra ní – Chromatografické
• Vlastnosti využívané pro lení biomakromolekul – Molekulová hmotnost – Konformace a tvar – Náboj – Hustota
Metody elektroforetické Elektroforéza pat í v molekulární biologii k nejpoužívan jím separa ním technikám p i izolaci a analýze nukleových kyselin a protein
• Princip – Pohyb nabitých molekul nukleových kyselin v elektrickém poli – Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou záporn nabité fosfátové skupiny
• Cíl – D lení molekul na základ rozdílných elektroforetických pohyblivostí
Gelová elektroforéza • Základ • Z praktických d vod se elektroforéza neprovádí p ímo v roztoku, ale na vhodném nosi i • V p ípad nukleových kyselin bývá nosi em nej ast ji gel • Pro p ípravu gelu jsou výhodné látky, které samy gelují a mají r znou porozitu v závislosti na koncentraci gelu
• Výhody • • • • • •
Elektroforetické metody nahradily ultracentrifugaci Aparatury jsou levné, asto je lze vyráb t svépomocí D lit lze všechny d ležité biomakromolekuly Zm nou podmínek lze d lit podle r zných hledisek Rychlost Lze pracovat s mikrokvanty nebo preparativn v mikrogramových množstvích • Rozd lené molekuly lze snadno prokázat a ve funk ní form izolovat z gelu
Používané nosi e • Elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nej ast ji tvo eny – agarózou – polyakrylamidem
• Vytvá ejí složitou sí ovou strukturu polymerních molekul s póry • Velikost pór lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru • Optimální velikost separovaných molekul – agarózové gely 100 bp až 50 000 bp – polyakrylamidové 10 až 1000 bp
Uspo ádání gelové elektroforézy • Vertikální
• Horizontální
”
”
“ “
Agarózové gely
Separa ní schopnosti gelu v závislosti na koncentraci agarózy Koncentrace agarózy Rozsah d lení ds DNA 0,3 % 5 – 60 kb 0,6 % 1 – 20 kb 0,7 % 0,8 – 10 kb 0,9 % 0,5 – 7 kb 1,2 % 0,4 – 4 kb 1,5 % 0,2 – 3 kb 2,0 % 0,1 – 2 kb
íprava agarózového gelu
Provedení elektroforézy
Test zm ny pohyblivosti v gelu • Gelová elektroforéza je rovn ž vhodným prost edkem pro studium interakcí mezi nukleovými kyselinami a proteiny, zejména t mi, které se vážou na specifické sekvence DNA – transkrip ní faktory – represory
• Metoda se ozna uje jako test zm ny pohyblivosti v gelu. Vychází z poznatku, že po vazb protein na DNA se její elektroforetická pohyblivost obvykle sníží.
Restrik ní analýza
Sekvenování DNA
Klonování DNA
PCR 1983 Kary Mullis 1993 Nobelova cena
PCR – polymerázová et zová reakce
Základní komponenty reakce • • • • •
voda pufr dNTP (dATP+dTTP+dCTP+dGTP) MgCl2 Taq polymeráza
• primers • templát
Princip PCR • Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace. • K opakující se enzymové syntéze komplementárních et zc vybraných úsek dvou et zcové DNA dochází po p ipojení dvou primer vázajících se na protilehlé et zce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce sm ují proti sob . • PCR umož uje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování.
• PCR využívá základních rys replikace (enzymatické syntézy) DNA: – Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární et zec. – K zahájení reakce je zapot ebí primer, který se ipojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zárove vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. – Jako templáty pro syntézu mohou sloužit oba et zce dsDNA, po p edchozí denaturaci.
• Primery se vybírají tak, aby se p ipojovaly k míst m ohrani ujícím z obou stran amplifikovaný úsek. • Teoreticky lze získat 2n et zc (kopií).
Teplotní režim • • • • • •
96ºC Iniciální denaturace 96ºC denaturace 40-72ºC annealing 72ºC elongace 72ºC záv re ná elongace 4ºC zchlazení
30x
Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzym
Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym • Reak ní sm s obsahuje: – Templátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). • Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle posta uje mén než 1 mg genomové DNA, teoreticky posta uje jedna molekula. – Kvalita templátu ovliv uje výsledek PCR. – Velké množství RNA m že vázat ionty Mg2+ – zne išt ný templát m že obsahovat inhibitory PCR
• Zdroj: mikroorganizmy, bu ky z tká ových kultur, t lní tekutiny, bioptické vzorky, st ry, vlasy, atd…
• Primery. Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10 - 30 nukleotid . • dNTP ve form Na+ nebo Li+ solí • Mg2+ ionty tvo í rozpustný komplex s dNTP a vytvá ejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. • Termostabilní DNA polymerázu, která odolává teplotám až 98 °C.
Reak ní podmínky PCR Po áte ní denaturace DNA. D ležitá je kompletní denaturace templátu, obvykle posta uje zah átí sm si na 2 – 5 min / 95 °C. V p ípad , že dojde pouze k áste né denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazb primer („self-priming“) a možným falešným výsledk m. Vlastní et zová reakce: 1.
2.
5.
Denatura ní krok (separace et zc ) : 94 – 95 °C / 20 – 45 s, záleží na objemu reakce, tlouš ce st n zkumavek. Nedostate denaturovaná DNA neumož uje ístup primer m, naopak p íliš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 °C). 3. P ipojení primer (55 - 65 °C / 30 – 90 s) teplota ur uje specifi nost a závisí na Tm primeru a templátu. Pro oba primery by m la být Tm podobná. Ta se optimalizuje v teplotním gradientu nebo se stanovuje empiricky. 4. Prodlužování primeru (polymera ní reakce) p i standardní PCR probíhá p i 72 °C /45 – 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA p i této teplot rychlostí cca 60 bází/s. Nov syntetizované et zce slouží jako templáty pro další cyklus. Cyklické st ídání teplot jednou založené sm si zajiš uje pr h reakce PCR, provádí se v termocyklerech, v tšinou se provádí 25 - 35 cykl .
Záv re ná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C / 5 min) a slouží k dokon ení syntézy a renaturaci jedno et zcových produkt .
Návrh primer pro standardní PCR – 18 – 25 bází dlouhé – neobsahují vnit ní sekundární struktury – obsahují 40 – 60 % G+C – mají rovnom rnou distribuci oblastí bohatých na G/C a A/T páry – nejsou komplementární navzájem na 3’-koncích, takže nevytvá ejí navzájem nebo samy se sebou duplexy – na matricové DNA nemají falešná vazebná místa – mají Tm teplotu 55 – 65 °C
Detekce amplifikovaného produktu PCR 1. Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením a pozorování pod UV sv tlem. 2. Št pení produktu restrik ními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrik ních fragment (PCR-RFLP) 3. Elektroforetická separace produkt za specifických podmínek pro detekci sekven ních polymorfizm – –
DGGE – denatura ní gradientová gelová elektroforéza SSCP – analýza polymorfizmu konformace jedno et zcových forem
íklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní st. 2 - 4 = produkty PCR
4. hybridizací s neradioaktivn zna enou sondou komplementární k ásti sekvence amplifikovaného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitra ní desti ce (PCR-EIA/ELISA), hybridiza ní sonda m že být následn amplifikována (PCR-OLA) 5. imobilizací PCR-produkt na membrán a te kovou hybridizací se zna enými alelov -specifickými oligonukleotidy (ASO) nebo zp tnou te kovou hybridizací s r znými ASO imobilizovanými na membrán , 6. hybridizací na DNA- ipech, 7. stanovením sekvence DNA.
Elektroforéza v agarovém gelu
+
-
PCR-RFLP
• Amplifikace známé sekvence se dv ma specifickými primery – Cílová sekvence (obvykle ur itého genu) o délce 1 až 2 kb je amplifokována p i vysoce stringentních podmínkách. – Výsledkem amplifikace jsou amplikony (PCR produkty o stejné délce) detekované elektroforeticky
• Amplikony jsou št peny restrik ní endonukleázou se 4 bp rozpoznávacím místem a poté op t analyzovány pomocí elektroforézy • Separace fragment DNA v agarózovém nebo polyakralamidovém gelu. • Srovnání restrik ních fragment amplifikované DNA u r zných vzork .
Využití metody PCR 1. Základní výzkum – – – – – –
izolace gen nebo jejich ástí sekvencování DNA mutageneza in vitro modifkace konc DNA analýza (selekce) klon z genových knihoven p íprava zna ených sond
2. Aplikovaný genetický výzkum – – – –
prenatální diagnostika (d di ných chorob) detekce mutací v genech studium polymorfizmu gen (nap . RAPD) popula ní genetika
3. Využití v klinických disciplinách –
– – –
detekce patogenních mikroorganism (baktérií, vir , prvok , hub) identifikace onkogen typizace nádor stanovení pohlaví
4. Využití v praxi – – –
archeologie soudnictví kriminalistika
Praktická ást – detekce I/D polymorfismu v genu pro ACE
Inzer /dele ní polymorfismus v genu pro angiotensin konvertující enzym je d ležitým genetickým markerem vzniku hypertenze a ischemické choroby srde ní. Hypertenze je jedním z nej ast jších onemocn ní, které se nemusí zejména zpo átku projevovat žádnými nápadnými p íznaky. Pozd ji se ale mohou dostavit závažné komplikace:
srde ní selhání, urychlení aterosklerózy, ischemická choroba srde ní (ICHS), cévní mozkové p íhody, postižení ledvin
Jedním z genetických aspekt vzniku hypertenze je polymorfismus angiotensin konvertujícího enzymu (ACE).
ACE je lokalizován v membránách cév hlavn v plicích a št pí angiotensin I na angiotensin II, který zp sobuje zužování cév (vazokonstrikce). Hladina ACE je závislá na p ítomnosti inzerce nebo delece v genu ACE. Genotyp D/D je spojen s vyšší hladinou ACE v séru a rizikem vzniku ischemické choroby srde ní. Indikace k vyšet ení · Vysoký krevní tlak · Srde ní selhání · Cévní mozkové p íhody · Renální selhání
