Kromatográfiás módszerfejlesztés 2-[18F]fluoroetiltozilát tisztaságának ellenőrzésére
Oktatási segédanyag a Jelzett vegyületek elválasztástechnikája (TKML0431) gyakorlathoz radiokémikus szakirányú vegyész MSc hallgatók számára
Összeállította:
Szikra Dezső
Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Nukleáris Medicina Intézet
Debrecen 2013
Tartalomjegyzék
1. A gyakorlat célja ................................................................................................................3 2. Elméleti áttekintés ..............................................................................................................3 2.1. Kromatográfiás módszerfejlesztés/optimalizálás ......................................................................... 3 2.1.1. A felbontás optimalizálása .................................................................................................... 4 2.2. Fordított fázisú módszerfejlesztés ................................................................................................ 5 2.2.1. Retenció és eluens erősség ................................................................................................... 5 2.2.2. Szelektivitás........................................................................................................................... 6 2.2.3. Gradiens elúció ...................................................................................................................... 7 2.3. Módszerfejlesztés ajánlott menete kis molekulákra (100-1000Da)............................................ 11 2.4. Műszerezettség ........................................................................................................................... 12
3. A gyakorlaton alkalmazott HPLC rendszer leírása ...........................................................14 3.1 Hardver ........................................................................................................................................ 14 3.2. Szoftver ...................................................................................................................................... 15 3.3. 2-[18F]fluoretil-tozilát előállítása .............................................................................................. 19
4. A gyakorlaton elvégzendő feladatok ..................................................................................21 5. Kérdések önálló felkészüléshez .........................................................................................22 6. Felhasznált és ajánlott irodalom .......................................................................................22
2
1. A gyakorlat célja 2-[18F]fluoroetil-tozilát manuális előállítása. A termék kémiai és radiokémiai tisztaságának ellenőrzésére alkalmas HPLC módszer kidolgozása.
2. Elméleti áttekintés 2.1. Kromatográfiás módszerfejlesztés/optimalizálás A kromatográfiás módszerfejlesztés célja olyan mérési körülmények meghatározása, melyek alkalmazásával
a
minta
komponensei
elválaszthatóak
egymástól
és
függetlenül
meghatározhatóak a kolonna után kötött detektorban. A kromatográfiás csúcsok elválását a felbontással (resolution, Rs) jellemezzük. Rs =
2[t R ( 2) − t R (1) ] W1 + W2
Ennek elvárt értéke függ a csúcsok alakjától, és egymáshoz viszonyított nagyságuktól.
1. ábra: a felbontás (Rs) változása különböző csúcsterület arányoknál
3
2.1.1. A felbontás optimalizálása A felbontást befolyásoló tényezők: Rs =
1 α − 1 k2 N⋅ ⋅ 4 α k2 + 1
A felbontás függ: csúcsok szélessége, elválaszthatósága, retenciója Effektív tányérszám (N) A vizsgált csúcs esetén számított elméleti tányérszám a csúcs szélesedését adja meg az adott kolonnán, az adott kísérleti körülmények között. Szelektivitás (α) A kromatográfiás rendszer (állófázis, eluens, hőmérséklet) képessége két komponens megkülönbözetésére. Két csúcs retenciós idejének különbségét jelenti: ha van különbség, a két komponens elválasztható. Retenciós faktor (k) Egy adott komponens kölcsönhatásának mértéke az adott kromatográfiás rendszerrel. Azt adja meg, hogy mennyivel tovább marad az adott anyag az állófázison, mint az eluens. A kolonna méreteitől vagy az áramlási sebességtől független, csak az állófázis tulajdonságai, az eluens és a hőmérséklet befolyásolja. Legegyszerűbben az eluens szerves oldószer tartalmával befolyásolható. Általában az elvárás 1 ≤ k ≤ 10 feltétel teljesülése az összes meghatározandó csúcsra. Hogyan javítsuk a felbontást? A legnagyobb hatása a szelektivitásnak van, azonban ezt a legnehezebb növelni.
A
tányérszám növelése kevésbé hatásos: a kolonnahossz kétszerezése a felbontást 1,4-szeresére növeli. A retenció növelése az eluens erősség csökkentésével még ennél is kevésbé hatásos, és a mérési időt jelentősen növeli.
4
2.2. Fordított fázisú módszerfejlesztés A kromatográfiás elválasztás legegyszerűbb esete semleges anyagok elválasztása fordított fázison. Semleges anyagoknak azokat a molekulákat nevezzük, amelyek töltéssel rendelkező csoportot nem tartalmaznak. Ez nem a savas- vagy bázisos csoportok hiányát jelenti, hanem azt, hogy az alkalmazott eluens pH-n ezek a csoportok ionvisszaszorított formában vannak jelen. Normál fázisú elválasztásról akkor beszélünk, ha az állófázis poláros, és az eluens kevésbé poláros, a kolonnára juttatott anyagok pedig növekvő polaritásuk sorrendjében eluálódnak. Fordított fázisú az elválasztás, ha az állófázis apoláros az eluens pedig polárosabb. Ekkor a minta komponensei növekvő apolaritásuk sorrendjében távoznak. A poláros anyagok erősebb kölcsönhatást alakítanak ki az eluenssel, ezért kevésbé kötődnek az állófázishoz, így kevesebb időt töltenek rajta. A szerves oldószer arányának (B%) növelésével az eluens apolárosabbá, „erősebbé” válik, így minden komponens hamarabb eluálható. A hőmérséklet emelése is csökkenti az állófázis és az eluensben oldott anyagok közötti kölcsönhatást, így ez is a retenció csökkenéséhez vezet. Végül a kolonna hidrofóbicitásának csökkentése (másik állófázis alkalmazásával) is retenciót csökkentő hatású.
2.2.1. Retenció és eluens erősség A retenció függése az eluens szerves oldószer tartalmától közelítőleg az alábbi egyenlettel adható meg: log k = log k w − Sφ ahol k: az adott anyag retenciós faktora kw: a tiszta vízre extrapolált k érték S: az adott anyagra jellemző állandó φ: a szerves oldószer térfogattörtje az eluensben (B%/100) Ha izokratikus körülmények között végezzük a módszerfejlesztést, az eluens erősségének beállítását mindíg magas szerves oldószer tartalomtól kezdjük, és fokozatosan csökentve 5
érjük el a kívánt k értéket (ált.: 1 ≤ k ≤ 10). Az első két mérés eredménye alapján már becsülhető a további mérések eredménye a logk – B% értékek ábrázolásával
2. ábra: logk változása az eluens szerves oldószer tartalmával acetonitril és metanol esetén (tesztvegyület: 4-nitrotoluol, kolonna: Zorbax C8)
2.2.2. Szelektivitás
Oldószer erősség változásából adódó szelektivitás Az ún. reguláris viselkedésű minták esetén B% csökkentésével a felbontás nő, de a csúcsok távolsága nem változik. Ez általában hasonló szerkezetű molekulák keverékére jellemző. A logk – B% függvények ábrázolásánál megfigyelhető, hogy a görbék nagyjából párhuzamosan futnak egymással. Azokat a mintákat, melyekben egyes komponensek relatív retenciója változik a B%-al irregulárisnak nevezzük. Ilyen esetben lehetnek olyan eluens összetételek, ahol egyes csúcsok
6
koelúciója tapasztalható, más összetételnél pedig elválásukat látjuk és sorrendjük megváltozik (logk – B% függvények metszik egymást). Oldószer típusából adódó szelektivitás Előnyös tulajdonságai miatt a módszerfejlesztést leggyakrabban acetonitril-víz eluenssel kezdjük. Ha ez nem ad megfelelő szelektivitást, célszerű az acetonitrilt metanolra cserélni. Ez egyes esetekben korábban együtt eluálódó csúcspárokat felbont, de előfordulhat az is, hogy más csúcsok egymásra csúsznak. Ilyenkor acetonitril és metanol különböző arányú elegyeivel próbálhatjuk elérni az összes csúcs elválasztását. Hőmérséklet szelektivitás A hőmérséklet hatása a retencióra az alábbi egyenlettel adható meg: log k = A +
B T
logk ábrázolása 1/T függvényében egyenest ad. Hasonló szerkezetű anyagok egyenesei nagyjából párhuzamosak, összetett mintáknál számíthatunk arra, hogy az egyenesek metszik egymást, és a hőmérséklet hatására az elúciós sorrend megváltozik. 1oC hőmérséklet emelés általában 1-2%-al csökkenti k értékét. Állófázis szelektivitás Az eluensösszetétel és a hőmérséklet változtatása a szelektivitás folyamatos változtatását teszi lehetővé, az állófázis változtatása ugrásszerű változásokat okoz. Kolonna váltás után újra kell optimalizálni a többi paramétert. A kolonnák jellemzésére az alábbi paramétereket használják: Hidrofóbicitás (H), sztérikus gátlás (S*), szilanol savasság (A), szilanol bázicitás (B), ioncsere kapacitás (C). Ezen jellemzők ismeretében választhatunk a vizsgált kolonnához nagyon hasonlót, vagy attól nagymértékben eltérő szelektivitásút.
2.2.3. Gradiens elúció Izokratikus elválasztásra akkor van lehetőség, ha van olyan eluenserősség, ahol 1≤k≤10 teljesül. A legnagyobb probléma, hogy valós mintáknál nem ismerhetjük az összes komponens mennyiségét és retenciós tulajdonságait. Amíg nincs kifejlesztve a módszer, nem
7
tudhatjuk, hogy látunk-e minden csúcsot. Ezért a módszerfejlesztést célszerű gradiens elválasztással kezdeni. A gradiens retenciós faktor (k*) az alábbi paraméterektől függ: k* =
0,87t G F Vm ∆φS
S: a vizsgált anyagra jellemző állandó tG: gradiens idő F: áramlási sebesség ∆φ: gradiens tartomány (∆B%) Vm: holttérfogat (Vm=t0F) Kolonnaparaméterek hatása Kolonnapramétereknek nevezzük együttesen a kolonna hosszát és átmérőjét, az állófázis szemcseméretét, és az eluens áramlási sebességét. Ezek az elválasztásra jellemző tányérszámot és a mérési időt befolyásoló tényezők. Izokratikus elválasztásnál nem befolyásolják a k értékét és a szelektivitást, így a módszerfejlesztés szokásos menete az, hogy először optimalizáljuk a szelektivitást és a retenciót adott kolonnaparaméterek mellett. Ha még további „finomhangolás” szükséges, a kolonnaparaméterek is megváltoztathatóak, de ezek már nem fogják a szelektivitást befolyásolni. Gradiens elválasztásnál nem ilyen egyszerű a helyzet, ugyanis k* értéke változik a kolonna hosszával és az áramlási sebességgel, ezért ha k* és α értékét állandón szeretnénk tartani a tGF/L hányados értékét tartani kell (L a kolonna hossza, arányos Vm-el, ha a keresztmetszet állandó). Ha például a kolonna hosszát kétszeresére növeljük, a gradiens időt is kétszeresére kell növelnünk. Ha az áramlási sebességet kétszerezzük, a gradiens időt felezni kell. Gradiens változtatása Kezdeti B% Általában azért növeljük meg a kezdeti B%-ot, hogy a futási időt lecsökkentsük a kromatogramm elején lévő üres szakasz eltávolításával.
8
Ha csak a kezdeti B%-ot változtatjuk, k* is változni fog! Ezért a gradiens időt is csökkenteni kell, annak megfelelően, hogy ∆φ/tG ne változzon (lásd ábra). Ha túlságosan megnöveljük a kezdeti B% értékét, a kromatogramm elején található csúcsok távolsága csökkenni fog. Végső B% érték Ha a kromatogramm végén nem kapunk csúcsokat, nincs értelme kivárni a teljes gradiens időt. A véső B% és tG csökkentésével rövidíthetjük a futási időt, azonban ha van olyan csúcs, ami később jön le a kolonnáról, mint a gradiens vége, akkor az már izokratikus körülmények között eluálódik. Ez jelentős csúcsszélesedést, és retenciós idő növekedést okozhat. Ha ráadásul ez a gradiensprogram visszaállási szakaszára esik (mosás a kezdeti összetételű eluenssel), akkor el is veszíthetjük szem elől a csúcsot, mert átkerülhet a következő kromatogrammra, vagy a következő injektálás alatt jön le.
9
Gradiens késés A gradiens kezdete előtt mindíg van egy rövid izokratikus szakasz, ami abból adódik, hogy a kezdeti B% értéktől eltérő összetételű eluensnek át kell haladnia a keverőszeleptől a pumpán és az injektoron a kolonna elejéig (dwell-volume, készülékre jellemző térfogat).
(tD: dwell-time)
10
Ha az első csúcsok a gradiens kezdeténél hagyják el a kolonnát, a gradiens késésnek érzékelhető hatása lehet az elválasztásra. Ez gondot okoz, ha egy adott készüléken kidolgozott elválasztást szeretnénk átvinni egy másikra. Ha az első csúcsokra alacsony alacsony felbontást kapunk, érdemes egy néhány perces izokratikus szakaszt beilleszteni a gradiensprogram
elejére,
mert ez
általában megnöveli
a
felbontást
(azonban a
csúcsszélesedést növeli, és a csúcsmagasságot csökkenti). Ennek főleg akkor van jelentősége, ha 0%B-ről indul a gradiens, ahol a kezdeti B% nem csökkenthető a korai csúcsok felbontásának megnövelésére.
2.3. Módszerfejlesztés ajánlott menete kis molekulákra (100-1000Da) Mielőtt bármilyen új mintát kolonnára injektálnánk, célszerű a rá adott detektorválaszt ellenőrizni. Ez egy kolonna nélküli injektálást jelent, amikor az injektort a detektor(ok)-al összekötve a használni kívánt áramlási sebességet beállítva adott térfogatú mintát injektálunk. Az alábbi információkhoz juthatunk általa: - a detektor ad jelet a mintára - a kapott csúcs belefér-e a detektor dinamikus tartományába - a kapott csúcs területe meg kell egyezzen a később kapott kromatogrammokon látható csúcsok összterületével A módszerfejlesztést ajánlott mindíg gradiens elválasztással kezdeni, hogy a mintában előforduló összes csúcsot lássuk a kromatogrammon. A megfelelően megválasztott gradiens körülmények segítenek megjósolni, hogy lehetséges-e izokratikus elválasztást kidolgozni az adott komponensekre. Felderítő gradiens mérési körülményei: Kolonna: 100 x 4,6mm C8 v. C18, 3um szemcseméret, 8-12nm pórusméret Eluens: acetonitril-víz (ha a mintában sav vagy bázis van: 10-25 mM pH=3 puffer) Áramlási sebesség: 2ml/perc Hőmérséklet: 30-35oC Gradiens: 5-100%B 10 perc alatt Minta: 50 ul alatti térfogatban kevesebb mint 10 ug anyag A kapott kromatogrammról az alábbi paramétereket határozzuk meg: ∆tR: az első és az utolsó csúcs retenciós idejének különbsége (tR)AVG: az első és az utolsó csúcs retenciós idejének átlaga 11
Izokratikus elválasztást akkor célszerű használni, ha ∆tR /tG ≤ 0,25. Gradiens elválasztás szükséges, ha ∆tR /tG ≥ 0,4. Köztes esetekben mindkét megoldás szóba jöhet. Ha izokratikus elválasztást szeretnénk kipróbálni, a megfelelő retenció beállításához szükséges B% értéke közelítőleg számítható az első „felderítő” gradiens adataiból: Izokratikus B% = 9,5[(tR)AVG-tD]-2 Ahol tD = VD/F. Izokratikus elválasztással szemben az az elvárásunk, hogy az első csúcsra k≥1 teljesüljön, mert így elkerülhetjük az oldószerfronttal eluálódó szennyezők zavaró hatását, továbbá hogy k≤10 legyen az utolsó csúcsra, hogy elkerüljük a túlzott csúcsszélesedést. Az izokratikus eluensösszetétel becslésére szolgáló egyenlet csak közelítő eredményt ad. Gyakran szükség van a retenció további beállítására, melyben az ún. “2,5-szeres szabály” segít: az eluenserősség csökkentése 10 %B-vel a k értékeket kb. 2,5-szeresére növeli.
2.4. Műszerezettség A reakció követésére, és a termék tisztaságellenőrzésére radio-HPLC technikát alkalmazunk. A rendelkezésre álló berendezés kisnyomású gradiens rendszer UV és radioaktivitás detektorral. Kisnyomású gradiensképzésről akkor beszélhetünk, ha a HPLC rendszer az oldószereket a pumpa előtt, a kisnyomású oldalon elegyíti. Általában 4 oldószer keverésére van lehetőség. Az oldószereket 1/8 inch külső átmérőjű teflon csövön keresztül szállítjuk a keverőkamrába egy-egy mágnesszelepen keresztül. Az egyes szelepek nyitva tartásának idejével szabályozható, hogy milyen arányban keverjük össze az oldószereket. Gradiens képzésnél ezek az idők változnak, melyet a szelepek kattogási sebességének változásán keresztül észlelhetünk. A kisnyomású gradiensképzés legnagyobb problémája, hogy a szerves oldószerekben oldott levegő buborékokat képez a vízzel való elegyítés hatására, melyek a pumpa működését megzavarják. Ez mindenképpen kerülendő, ezért különféle gázmentesítési eljárásokat használunk: 1. Ultrahangos gázmentesítés (szonikálás). Az ultrahang által mikroszkopikus méretekben keltett, gyorsan váltakozó nagy nyomás és vákuum hatására az oldószerben oldott gázokból 12
makroszkopikus méretű buborékok képződnek, amelyek kibuborékolnak az oldatból. Alapos gázmentesítéshez 10-15 perc szonikálás szükséges, ez vákuum egyidejű alklamazásával 2-3 percre csökkenthető. 2. Héliumos gázmentesítés. A hélium gyakorlatilag elhanyagolható mértékben oldódik az oldószerekben, ezért héliummal alaposan átbuborékoltatva az eluenst vele ki lehet űzni az oldott gázokat. Folyamatos hélium átbuborékoltatás megváltoztatja az eluens szerves oldószertartalmát, így célszerűbb az oldószereket enyhe hélium túlnyomás alatt lezárva használni. 3. Vákuumos gázmentesítés. Megvalósítható akár úgy, hogy az oldószert alacsony nyomáson kevertetve éppen forrásba hozzuk, amikor is az oldott gázok eltávoznak, vagy úgy, hogy az oldószeráramlás útjába (on-line) helyezünk egy folyamatosan működő, vákuumkamrás gázmentesítő egységet, amely mindig csak annyi oldószert gázmentesít, amennyi éppen felhasználásra kerül. Ez a legelterjedtebb, és legmegbízhatóbb módszer, azonban sok hiba forrása lehet ha az on-line degasser elszennyeződik a benne hagyott eluenstől.
Nagynyomású gradiens rendszer
Kisnyomású gradiens rendszer
13
3. A gyakorlaton alkalmazott HPLC rendszer leírása 3.1 Hardver A gyakorlat során Waters LC Module 1 HPLC rendszeren végzünk méréseket, amely UV és radioaktivitás detektorral van ellátva. A készülék vezérlését és a mérési adatok gyűjtését számítógép segítségével végezzük, Waters Millenium programmal.
A készülék tetején hélium alatt lezárt üvegekben találhatóak az eluensek (A,B,C,D ág). A gradiensképzés a pumpa előtti kisnyomású keverőkamrában történik az egyes eluens ágakra kötött mágnesszelepek nyitvatartási idejének vezérlésével. A beépített Waters 600-as pumpa 0,1-10 ml/perc tartományban 4000 psi nyomásig használható, tipikusan 20-40 psi pulzálás mellett szállítja az eluenst. A minták injektálása a készülék alján lévő 96 férőhelyes tálcából autosampler segítségével történik. A kolonnáról érkező effluens UV, majd radioaktivitás detektoron halad át. 14
3.2. Szoftver A Waters Millenium32 V4.0 (2001) egy gyógyszeripari követelményeknek megfelelő kromatográfiás szoftver. A jelenleg elterjedten használat Empower 3 elődje. Lehetővé teszi a kromatográfiás mérések elvégzése mellett a méréssel kapcsolatos összes információ kezelését, a mérések, a számolások és a jelentéskészítés teljes automatizálását. A gyakorlaton röviden megismerkedünk a szoftver legfontosabb funkcióival: •
Kromatográfiás módszer írása (mérési körülmények megadása)
•
Mintatábla megírása, mérés indítás
•
Kromatogrammok manuális kiértékelése és riport nyomtatás
„Run samples” ablak Az ablak alsó részén láthatók az aktuális nyomás-, áramlási sebesség-, és eluens összetétel értékek. Itt állíthatjuk le a pumpát, illetve itt állíthatjuk be a fenti paramétereket manuálisan. Korábban megírt „Instrument method”-nak megfelelő értékeket is behívhatunk, illetve alapvonalfigyelést indíthatunk. Az ablak közepén lévő táblázat kitöltésével írhatunk mintatáblát, melyet elindítva a program soronként indítja el az egyes minták mérését a megadott módszer szerint. Az ablak jobb oldalán láthatjuk az éppen futó minta valós idejű kromatogrammját, illetve a nyomásgörbét.
15
„Instrument method” ablak Itt állíthatjuk be a mérési körülményeket. A pumpa ikonjára kattintva a „Flow” fülön a nyomáshatárokat, az áramlási sebességet valamint izokratikus módban az eluensek keverési arányát adhatjuk meg. Gradiens módot választva egy táblázatot kell kitöltenünk, ahol soronként egy-egy időponthoz tartozó eluensösszetételt írhatunk be. A detektor ikonjára kattintva a detektálási hullámhossz mellet az adatgyűjtési frekvencia változtatható. Ha keskeny csúcsokra számítunk, érdemes a maximális adatgyűjtési sebességet választani, azonban ekkor az alapvonali zaj is növekedhet (főleg alacsony hullámhosszon).
16
„Project” ablak A kromatogrammokat és a mérési módszereket „project”-ekbe csoportosítva tárolja a program. A korábbi méréseket injektálásonként nézhetjük meg az „Injections” fülön, az egyszerre elindított méréseket „Sample sets”-en belül a mintatábla neve és mérési ideje alapján tekinthetjük át. Ha kijelölünk egy- vagy több injektálást, a hozzá tartozó kromatogrammokat a „Channels” fülön láthatjuk. Minden detektor kromatogrammja külön tárolódik, és rögzíthető a futás során mért nyomás is, melynek a hibaelhárításban van nagy szerepe. Az adott minta egyik csatornájára kattintva új ablakban megjelenik a kromatogramm, melyet egy korábban megírt módszer megnyitása után automatizáltan, vagy kézzel integrálhatunk. A kiintegrált kromatogrammok a „Results” fülön láthatóak, ahonnan egy „Riport method” kiválasztásával nyomtathatók.
17
A „Review” ablakban egy vagy több kromatogramm kiértékelését végezhetjük el. Az integrálás eredménye csak úgy menthető el, ha megnyitunk egy „Processing method”-ot. Ezután akár kézi integrálást is végezhetünk, de a szoftver lényege az automatizált integrálási módszerek minnél hatékonyabb támogatása. Számos paramétert megadhatunk, amelyel a szofter által automatikusan megtalált fölösleges kis csúcsokat kizárhatjuk, illetve a szabálytalan alakú csúcsok pontos integrálását beállíthatjuk. Több kromatogrammot is egymásra hívhatunk, illetve a „2D channels” fülön válthatunk is közöttük. Itt, az ablak alsó részén láthatjuk az integrálási eredményeket is a „Peaks” fülön.
18
Radiokromatogrammok értékelése A kromatogrammon kiintegrált csúcsok területét bomláskorrigálni kell, ha a csúcsok detektálása között eltelt idő nem hanyagolható el a vizsgált izotóp felezési idejéhez képest. A bomláskorrekciónál referenica időre számoljuk vissza a csúcsterületet, és ebből számítunk aktivitás koncentrációt. Referencia idő lehet az injektálás ideje, a szintézis vége, esetleg a besugárzás vége (EOB). A csúcsterület bomláskorrekciójánál az alábbi egyenletet használjuk:
Amért = Akorr . e − λt t1/2 (18F) = 109,8 perc
λ=
ln 2 t1 / 2
3.3. 2-[18F]fluoretil-tozilát előállítása A gyakorlat során 2-[18F]fluoretil-tozilátot (FETos) használunk modellvegyületként a radiokromatográfiás módszerfejlesztés alapjainak elsajátításához. A FETos-t manuálisan állítjuk elő a gyakorlat során az alábbi reakcióegyenletnek megfelelően: 19
A prekurzor [18F]fluorral történő jelölését nukleofil szubsztitúcióval valósítjuk meg. A
[18F]fluorid-ion radionuklid előállítása 18O(p,n) 18F magreakcióval történik a ciklotronban, ahol nagy dúsítási fokú [18O]H2O-t sugárzunk be [18F]FDG (2-fluor-dezoxiglükóz) előállításához. A besugárzott 18F--iont tartalmazó [18O]H2O vizet a ciklotron targetből közvetlenül a felhasználás helyére, az automatizált FDG gyártó panelre juttatjuk 0,8 mm belső átmérőjű PEEK vezetéken keresztül, sűrített levegő segítségével. A besugárzások után a targetben maradt dúsított víz maradékát vizes öblítéssel lehet a szintézispanelre juttatni. Ez általában még jelentős mennyiségű 18
F-at tartalmaz. Kísérleteinkhez a második mosóvizet használjuk fel, amely 1-3 GBq aktivitású.
Az automatizált szintézisek során a 18F--iont anioncserélő oszlop (Waters QMA) segítségével választják el a besugárzott víztől. Erre azért van szükség, mert a target fém alkatrészeiből hosszú felezésiidejű izotópok keletkeznek, melyek nem kerülhetnek át a termékbe, valamint a dúsított víz tisztítás után újradúsítható, ezért visszanyeréséről gondoskodni kell. A QMA oszlopon adszorbeálódott
18 -
F -iont nagytisztaságú hélium gáz segítségével szárítják, és
kálium-karbonát oldattal eluálják. Az eluátum a vízben oldott kálium-karbonáton kívül fázistranszfer katalizátort (kriptofix 2.2.2.) és acetonitrilt tartalmaz. Ezt az elegyet azeotróp bepárlással szárítják, melynek előnye az, hogy a víztartalom alacsonyabb hőmérsékleten és gyorsabban távozik. A fluorid iont felhasználó radiokémiai szintéziseket nukleofil szubsztitúcióval (SN2) végezzük. A szubsztitúciót vízmentes közegben kell végrehajtani a megfelelő hozam eléréséhez. Amennyiben víz marad a reakcióelegyben, úgy a
18 -
F -kriptofix 2.2.2.-K+ komplex nem kellő mennyiségben
alakul ki, következésképpen a szubsztitúció alacsony hatásfokkal játszódik le. A fázistranszfer katalizátor vízmentes acetonitril közegben növeli a [18F]fluorid nukleofilitását, ami kulcsfontosságú az izotópjelzés sikeressége szempontjából. A szubsztitúció kezdetén a vízmentes acetonitrilben oldott prekurzort hozzáadjuk a beszárított komplexhez, majd az elegyet az optimális hőmérsékleten tartjuk a reakció végbemeneteléig. A kapott termékelegyet adszorpciós vagy kromatográfiás módszerrel tisztítjuk.
20
4. A gyakorlaton elvégzendő feladatok A gyakorlat során védőszemüveg folyamatos használata kötelező! A folyadékok mozgatására elsősorban egyszerhasználatos műanyag fecskendőket és finnpipettákat használunk. A használt tűket és fecskendőket külön, feliratozott gyűjtőedénybe tegyük. A pipettahegyeket rögtön a használat után eltávolítjuk, nedves heggyel a pipettákat nem fektetjük a laborasztalra. A radioaktív oldattal szennyezett fecskendőket, pipettahegyeket ólomvédelem mögött elhelyezett gyűjtőedénybe tegyük. FETos előállítása 5ml-es Eppendorf-csőben ismert aktivitású
18
F oldathoz adjunk 350ul kriptofix/K2CO3
elegyet (80%ACN, 20% víz, 29umol kriptofix, 14umol K2CO3). Az oldatot 85oC-ra előmelegített fűtőblokkban 40 l/h hélium áramban pároljuk szárazra, majd ezt követően 3x1 ml abs. acetonitrillel is pároljuk be. Az acetonitril hozzáadása idejére a hélium bevezető tűt távolítsuk el az edényből az elegy kifröccsenésének elkerülésére. Az utolsó bepárlás után távolítsuk el a gázbevezető tűt, az edénybe tegyünk mágneses keverőbotot, és 1ml abs. acetonitrilben oldott 7,5mg etilénglikol-ditozilátot adjunk a beszárított fluoridhoz. 5 percig kevertessük az elegyet 85oC-on, majd mérjük le aktivitását. Határozzuk meg a reakcióelegy FETos tartalmát HPLC-vel. Mintaelőkészítés: a termékelegy hígítása vízzel 1:1arányban. Kolonna bemosása A mérések felgyorsítására a kolonnák vízzel való bemosását, és acetonitrilre történő visszamosását a radio-HPLC rendszertől független izokratikus pumpákra kötve végezzük. A kolonna egyensúlyba kerüléséhez kb. 20 kolonnatérfogatnyi eluens átpumpálása szükséges. t0 meghatározása KNO3-al vagy uracillal Minden kolonna használatbavételekor határozzuk meg egy visszatartás nélkül eluálódó komponens injektálásával a t0 értékét. Felderítő gradiens felvétele, és izokratikus elválasztás vizsgálata Injektáljuk a termékelegyet a vizsgált kolonnára egy felderítő gradiens lefuttatásával, és határozzuk meg az egyes csúcsok retenciós idejét. Állapítsuk meg, hogy lehetséges-e izokratikus elválasztást alkalmazni, és határozzuk meg az izokratikus B%-ot. 21
Terhelhetőség vizsgálata Teszteljük a kolonna terhelhetőségét az optimálisnak kiválasztott kromatográfiás körülmények mellett növekvő térfogatú minta injektálásával.
5. Kérdések önálló felkészüléshez Csúcsterület bomláskorrekciója A csúcsfelbontást befolyásoló tényezők hogyan befolyásolható egy kromatográfiás elválasztás szelektivitása? Milyen hatása van a kolonnaparaméterek megváltoztatásának?
6. Felhasznált és ajánlott irodalom [1] Bent W. Schoultz, Brian J. Reed, János Marton, Frode Willoch and Gjermund Henriksen, A Fully Automated Radiosynthesis of [18F]Fluoroethyl-Diprenorphine on a Single Module by Use of SPE Cartridges for Preparation of High Quality 2-[18F]Fluoroethyl Tosylate,
Molecules 2013, 18, 7271 [2] L.R.Snyder, J.K.Kirkland, J.W.Dolan: Introduction to modern liquid chromatography, 3rd ed. John Wiley ans Sons 2010
22
