KROMATOGRÁFIA Előadás BSc. hallgatóknak
Dr. Balla József 2016. őszi félév
1
A kromatográfia felfedezője és névadója
Mihail Szemjonovics Cvet (1872-1919)
2
Kromatográfia
3
Karotinoidok Richard Kuhn (1900-1967)
1938 Nobel-díj abszorpciós kromatográfia
Zechmeiter László (1889-1972)
Edgar Lederer (1908-1988)
Cholnoky László (1899-1967)
Die chromatographische Adsorptionsmethode. Grundlagen, Methodik, Anwendungen, Wien, 1937 4
Archer John Porter Martin
Richard Laurence Millington Synge
A megoszlási kromatográfia terén végzett munkásságukért 1952-ben Nobel-díj kaptak.
A GC KEZDETE 5
Kováts Ervin,
Horváth Csaba
6
Történet • 1897 D.T.Day fullerföld, nyersolaj • 1906 M.Zwett. A kromatográfia felfedezője és névadója. Chroma graphien, crm gro
• • • • • • • • •
1937 Zechmeister és Cholnoky (első könyv, angolul) 1937 Tiselius: Elektroforézis 1940 Ioncserélő kromatográfia Izmailov, Schreiber 1941 A.P.Matin és Synge. Megoszlási folyamatok 1944 Consden, Gordon, Martin: Papírkromatográfia 1952-58 E.Stahl: Rétegkromatográfia 1952 James, Martin: Gázkromatográfia 1957 E.Kováts: Retenciós index 1958 Golay: kapilláris GC 7
• 1961 G.Schay: A gázkromatográfia alapjai, Akadémiai Kiadó, 1961. • 1963-66 Giddings: Egységes elmélet lehetősége • 1965-68 Horváth, Huber, Snyder, Kirkland, Halász, SCOTT: HPLC • 1978-79 Dandenau: kvarcüveg kapilláris • 1976-80 Regnier, Horváth, Karger: biopolimerek elválasztása • 1981-83 Jorgenson, Lukács: kapilláris elektroforézis (CE) • 1982-85 Novotny, Lee: SCF – GC-MS, HPLC-MS 8
Mozgófázis
Állófázis szilárd
GÁZKROMATOGRÁFIA (GC) SZUPERKRITIKUS FLUID KROMATOGRÁFIA (SFC) FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (LC)
gáz
szuperkritikus fluidum
folyadék
GSzK (GSC) gáz-szilárd kromatográfia
folyadék GFK (GLC) gáz-folyadék kromatográfia
SFK (SFC)
FSzk (LSC) VRK (TLC) vékonyréteg kromatográfia IK (IC) ionkromatográfia GK (Gél) gélkromatográfia
FFK (LLC) PK (PC) Papír kromatográfia
9
c cB A A,B állandó mintaáram
B
A állófázis
Detektor jel
A+B
D , A
idő
10
Detektor jel
c A c c K B A,B diszkrét minta
K
B A
K
D
K
állófázis
A idő
11
Detektor jel
c E
E
c A cB D
B A A
integrális
állófázis idő Detektor jel differenciális
idő
12
2
300
600
109
2000
GC SFC IC
Gél
HPLC LC
13
a
rossz elválasztás: nem szelektív nem hatékony
mV
idő b
szelektív nem hatékony
mV
idő c nem szelektív hatékony
mV idő d
szelektív hatékony
mV idő
14
GC
15
A gázkromatográfiás elválasztás leírásának alapkérdései
• -a mozgófázis áramlásával összefüggő problémák (áramlás szemcsés tölteten és üres csőben), • -az anyagátmenetet leíró gázkromatográfiás elméleti megközelítések, • -a jellemző molekulakölcsönhatások, • -a koncentrációeloszlás, csúcsalak és az elválasztás jellemzésére vonatkozó legfontosabb ismeretek. 16
Retenció tR, C tR, B tR, A
• Retenciós idők • Retenciós térfogatok • Relatív retenció
mV B
A
C
idő
a mintabemérés pillanata
1
2
mintabemérő vivőgáz
detektor kolonna
tR tM 17
Kromatográfiás alapösszefüggések I. • • • • • •
Bruttó retenciós idő Holtidő Redukált retenciós idő Kolonnahossz Lineáris áramlási sebesség Megoszlási hányados
•
Retenciós tényező
• • • •
Csúcsszélesség Relatív csúcsszélesség Tányérszám Elméleti tányérmagasság
tR tM t’R= tR - tM L u
cs cm n t t k R M s tM nm K
w w/ tR N HETP=L/N
18
Gázkromatográfiás alapfogalmak
tR
w =4
c max 2
=w
h
0,607 h
h1/2
c(t)
<
• • • •
Megoszlási hányados Szelektivitás Hatékonyság Felbontóképesség
Rs 2
t R ,2 t R ,1 w2 w1
1,5
<
A = h c max =
w
mV
ln 2 = 2 2 ln 2 2
tR2 tR1
N 2
>
tR
><
m VR
>
alapvonal <
w1
>
<
w2
>
idő
Rs
N 1 k 4 1 k 19
Kromatográfiás alapösszefüggések II. 1. A szükséges, de elégséges felbotóképesség. Általában:
Rs 2 hatékonyság
t R , 2 t R ,1 w2 w1
t R,2 N 16 w
1,5
2
L (H ) N
N max illetve H min
szelektivitás
N 1 k Rs 4 1 k
t R , 2 t R , 2 t M k2 1 t R,1 t R,1 t M k1
retenció
k
tR tM tM
2. Érzékenység: detektálás! 3. Elemzési idő
t R,n
NH 1 k n 16 Rs2 t o 1 k n u 1
2
k n 13 H k n2
u 20
K p dp dx
u
L , tM dx dp
pi , u i , Fi
p,u,F
x po u o pu
p o u o dx K p
K p dp dx
o
po u o L u
L tM
u =?
p u u o o p L
po u o p
po , u o , Fo
Kp 2
L
po
tM
pdp
po2 )
o
pi
L
( pi2
dx u
tM
p2K p
po2 u o2 o
L
pdx
pu o
dp
o
o
Kp 3 p o2 u o2
( pi3 p o3 )
3Lpo2 u o2 1 u 3 Kp ( pi po3 )
u
3Lp u ( p p ) 2 Lpo u o ( p p ) 2 o
2 o
2 i 3 i
2 o 3 o
3 ( pi / po )2 1 u uo uo j 3 2 ( pi / po ) 1
21
F co x t dx
F , co
dco
>
vs=Vs/L és vm=Vm/L
dx <
>
t vs cs vm cm x dx
c F o dx v s cs vm cm dx t x x t
c c c s s m t x cm x t x
co cm cm F K vs vm x t t t x x
K cs cm x állandó cm x t 1 x t c t c m x
c m t x c m F Kv s vm x t x t cm
F 1 Kv s vm KVs Vm uz L
VR KVs Vm
m
u z x t c m uz
FL KV s V m 22
cs a
b
c
cm
Jel c0,1 c0,2 c0,3
c0,3 c0,2 c0,1
tR 23
co
vm
c m (N-1)
c m( N-1 )
vm c mN
vs
vs
cs ( N-1 ) N-1
cmN
vm cm(N+1) vs
cs N
cs (N+1)
N
N+1
( cm( N 1 ) cm,N )dV vm dcm,N vs dcs ,N K
( cm,( N 1 ) cm,N )dV vm dcm,N vs Kdcm,N (vm vs K )dcm, N
dcm ,N cm ,( N 1 ) cm ,N
dV veff
c s ,N c m ,N
vm vs K veff
V veff
yN
cm , N
dy N d y N 1 y N yN
e N N!
100
yN
1 2N
co
( N )2 e 2N 24
A van Deemter egyenlet d 2f 2gDm 2 k H 2d p u 2 u 3 1 k Ds
B H A Cs u u zónaszélesség kezdetben
zónaszélesség egy t idő után
25
HETP-u B H A Cs u u 1 H ( mm )
H-u 0,5 Hmin =0,409
Cs . u
B/ u
A 0 0
5
u =8,7 opt
10
15 u ( cm/s ) 20
v
26
A Golay egyenlet d 2f 2 Dm 1 6k 11k 2 rc2 2 k H u u 2 2 u 3 ( 1 k ) Ds 24( 1 k ) Dm
B H Cmu C s u u
H ( mm ) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 Hmin=0,27 0.2
H B
u Cm . u
/u
0 0
5
10
15
20
25
30
u opt =29,2
35
40
C s. u 45
50
u (cm/s) 27
H min 2 B(Cm Cs ) df (m) 0,25 0,50 1,00 2,00 5,00
uopt
B Cm C s
Cm (%) 98 82 67 45 15
Cs (%) 2 l8 33 55 85
2 Dm 1 6k 11k 2 rc2 H u 2 u 24( 1 k ) Dm
H min 1,91rc d c
u opt 2,1
Dm rc 28
Vékonyfilmes:
df < 1
Cm > Cs
( > 100 )
H (mm) 1,2
-4
2 B = 40 mm/s ; Cm = 3.10 s
B/u
1,0
H min. = 0,22 mm
0,8
u opt. = 36,5 cm/s
Cm >> C s
0,6 0,4
C mu
0,2
Cs u 10
20
30
Vastagfilmes:
40
50
60
70
80
90
df > 1
100 110
u
(cm/s)
Cs > Cm
( < 100 )
H (mm) Cs u
2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0
C s >> Cm
0,8 0,6 0,4 0,2 10 B&B Analitika Kft. Kutatás, Fejlesztés, Tanácsadás, Oktatás
C mu
B/ u 20
30
40
50
60
70
80
90
100
u
(cm/s)
29
[email protected] [email protected]
Relatív retenció:
r2,1
t R ,2 t R ,1
V R ,2 V R ,1
k2 k1
lg t'R
lg t'R
C'
n +1
C
lg t'R x lg t'R
A B
n
Ix
_
B'
lg t'R
_ n +1
lg t'R
n
lg t'R x _ lg t'R n
100 n 100
500
I x 100
600
700
Ix
lg t R , x lg t R , n lg t R , n1 lg t R , n
800
900
1000
I
100 n 30
Az elválasztás jellemzése N k l 1 np ln 1 4 Rs k f 1
1
N req 16 Rs2
t R ,n
2
N 1 k Rs 1,5 4 1 k k2 1 k2
2
SN TZ
NH 1 k n 16Rs2 t o 1 k n u 1
2
t R, n1 t R,n
n1 n
k n 13 k n2
H u
31
1
N
k
N /4
20 103
1,05
5
35,35
40 103
1,05
5
60 103
1,05
80 103
1/
k/(1+k)
Rs
0,05
0,83
1,47
50,00
0,05
0,83
2,08
5
61,23
0,05
0,83
2,54
1,05
5
70,70
0,05
0,83
2,93
20 103
1,10
5
35,35
0,09
0,83
2,64
20 103
1,15
5
35,35
0,13
0,83
3,81
20 103
1,20
5
35,35
0,17
0,83
4,99
20 103
1,05
10
35,35
0,05
0,90
1,60
20 103
1,05
15
35,35
0,05
0,94
1,66
20 103
1,05
20
35,35
0,05
0,95
1,68
32
Rs R s =f( )
5 4 3
R s =f( N )
2 R s =f(k) 1 0
0
1,05
1,10
1,15
20 .10 3
40 .10 3
60 .10 3
5
10
15
1,20
80 .10 3 N 20
k 33
GC-s kolonnák
adszorpciós
makro töltetű Szemcsés töltetű kolonnák
megoszlásos adszorpciós
mikro töltetű ( kapilláris méretű) adszorpciós
megoszlásos
PLOT
Kapilláris kolonnák megoszlásos
WCOT SCOT
34
Kapilláris kolonnák kapilláris cső fala
porózus adszorbens réteg mm
PLOT
WCOT megosztófolyadék,
5-20 mm
megosztófolyadék, 0,01-5 mm
kapilláris 2rc = 0,05 1 mm
SCOT hordozó hordozó, 0,1-3 mm megosztófolyadék, 0,01-5mm
35
belső átmérő, mm 200 400 500 m i NB n t 10 a k a ST p a 100 c i t 1000 á s ng 10 4 4 10 5000
f i l 0,5 m v a s 1,5 t a g s á WB 2,5 g mm 5 3000 1500
hatékonyság 36
Belső átmérő (mm)
Filmvastagság (mm)
Fázisarány ( )
Mintakapacitás (ng)
0,2
0,1 0,2
500 250
10-20 30-40
0,25
0,1 0,25 1
625 250 63
30-40 100-150 400-500
0,32
0,1 0,25 1
800 320 80
50-70 100-200 400-500
0,53
0,1 0,25 1 5
1325 530 133 27
50-100 200-300 1000-1500 8000-10000
37
I F1 I sq ax1 by1 cz1 du1 es1
Rohrschneider
I F2 I sq ax2 by2 cz2 du2 es2 ............................................. ............................................. I F5 I sq ax5 by5 cz5 du5 es5 McReynolds (1970)
I
F i
275 sq OV 275 I I I OV i i i
I iF I isq , 5
I i
.
CP
F
i 1
5
OV 275
I i
100
i 1
38
A megosztó-folyadék neve
Min. max.hôm.C
Oldószer
Benzol
1-Butanol
2-Pentanon
1-Nitro-propán
Piridin
Summa
CP-index
Apiezon L
50/300
C,T
32
22
15
32
42
143
3
Butándiol-szukcinát
50/225
C
370
571
448
657
611
2657
63
Carbowax 1540
50/175
C
371
639
453
666
641
2770
66
Carbowax 4000
60/200
C
317
545
378
578
521
2339
55
Carbowax 4000 monosztearát
60/200
C
282
496
331
517
467
2093
50
Carbowax 20M
60/225
C
322
536
368
572
510
2308
55
Carbowax 20M-tereftálsav
60/225
C
321
537
367
573
520
2318
55
Dexsil 300
50/450
T
47
80
103
148
96
474
11
Dexsil 400
50/400
T
72
108
118
166
123
587
14
Dexsil 410
50/400
T
72
286
174
249
171
952
23
DEGA
0/200
A
378
603
460
665
658
2764
66
DEGS
20/200
A
496
746
590
837
835
3504
83
Squalan
20/100
T,C
0
0
0
0
0
0
0
EPON 1001
50/225
A,C
284
489
406
539
601
2319
55
Etilénglikol-szukcinát
100/200
C
537
787
643
903
889
3759
89
FFAP
50/250
C
340
580
397
602
627
2546
3960
A megosztófolyadék neve
Min.max.hôm.C
Oldószer
Benzol
1-Butanol
2-Pentanon
1-Nitropropán
Piridin
Summa
CP-index
SE-30
50/300
C
15
53
44
64
41
217
5
SE-52
50/300
C,T
32
72
65
98
67
334
8
SE-54
50/300
C,T
33
72
66
99
67
337
8
XE-60
0/250
A
204
381
340
493
367
1785
42
OV-1
100/350
C,T
16
55
44
65
42
222
5
OV-3
0/350
C,T
44
86
81
124
88
423
10
OV-7
0/350
C,T
69
113
111
171
128
592
14
OV-11
0/350
C,T
102
142
145
219
178
786
19
OV-17
0/375
C,T
119
158
162
243
202
884
21
OV-22
0/350
C
160
188
191
283
253
1075
25
OV-25
0/350
C
178
204
208
305
280
1175
28
OV-73
0/325
T
40
86
76
114
85
401
10
OV-101
0/350
C
17
57
45
67
43
229
5
OV-210
0/275
A
146
238
358
468
310
152
36
OV-275
25/250
A
629
872
763
1106
849
4219
100
OV-1701
0/250
C
67
170
153
228
171
789
4019
41
42
43
SGE
Restek
Quad-rex
JW
HP
Chrom-pack
Allteck
Supel-co
Minõség
BP-1
Rtx-1
007-1
DB-1
HP-1 Ultra-1
CP-Sil 5CB
AT-1
SPB-1
SE-30, OV-1, OV-101, SP-2100
BP-5
Rtx-5
007-2
DB-5
HP-5 Ultra-2
CP-Sil 8CB
AT-5
SPB-5
SE-54, SE-52, OV-73
BP-10
Rtx-1701
007-1701
DB-1701
-
CP-Sil 19CB
AT-1701
SPB-1701
OV-1701
-
Rtx-50
007-17
DB-17
HP-50 HP-17
-
AT-50
SPB-50
OV-17, OV-2250
BP-21
StabilwaxDA
007-FFAP
DB-FFAP
HP-FFAP
CP-Wax 58CB
AT-1000
Nukol
SP-1000, FFAP
-
Rtx-2340
-
-
-
CP-Sil 88
-
SP-2340
SP-2340, OV-275
PONA
-
007-1-500.5F
-
PONA
Squalane
-
Petro col 50.2
Squala-ne
BPX 624
Rtx-624
007-624
DB-624
HP-624
CP-Sil 13CB
AT-624
VOCOL
-
-
Stabil wax-DB
-
CAM
-
CP-Wax 51
-
Carbowax Amin
-
44
GC általános felépítése 4 3 2
minta T,Sz. vivőgáz forrás (2-3 bar)
Ny. Á szeptum purge split
A/D
E
B D
C
segédgázok K
make-up
1
45
Mintabeviteli megoldások
46
Gázminta bemérés a)
b) mintahurok
minta be
mintahurok vivőgáz
vivőgáz
kolonnára
kolonnára
minta be
47
Mintaáram elosztó: splitter elvi vázlata szeptum
áramlás szabályozó vivőgáz
szeptum fűtés
"purge" gáz
változtatható áramlási ellenállások
üveg, kvarc betét (liner)
split mintaáram leosztás kapilláris kolonna
48
Splitless bemérés mikrofecskendő
a)
b) zárva
vivőgáz
nyitva vivőgáz
adszorbens
adszorbens
zárva kapilláris kolonna
nyitva kapilláris kolonna
49
Oldószerhatás Detektorjel
a
idő Detektorjel
b
idő
50
PTV injektor szeptum
áramlás szabályozó
szeptum "purge" gáz
vivőgáz
programozott fűtés
kvarc betét (liner) programozott
változtatható áramlási ellenállások kvarcgyapot split
hűtés
mintaáram leosztás kapilláris kolonna
51
GC-s detektorok • • • •
1. hővezetőképességi detektorok, 2. ionizációs detektorok, 3. fotometriás detektorok 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás detektorok (MSD) • 5. elektromos vezetőképességi detektorok, • 6. oxigén szelektív detektor, • 7. kombinált detektorok, stb. 52
Melyik előnyösebb detektorként? Z
DAH
DFH
linearitási
típus
LOD
LOQ
tartomány 1.
2.
MSD
10-16A
10-15 g
10-10 g
104-105
Univerzális, koncentráció specifikus
FID
10-14 A
10-12 g/s
10-5 g/s
107
szerves
tömegáram érz.
ECD
10-14V
10-13 g
10-9 g
104
specifikus
konc. érz.
FPD P
-
10-12 gP/s
10-7 gP/s
105 (lgA- specifikus lgc)
tömegáram érz.
FPD S
-
10-10 gS/s
10-7 gS/s
103 (lgA- specifikus lgc)
tömegá. ramérz.
PID
10-14 A
10-13 g
10-9 g
104
konc. érz.
specifikus
53
Követelmények a készülékekkel szemben:
2 2 2 A tR VD tR 12 N kol 12F 2 N ex 2
2 telj
2 inj
2 det
2 ex
2 kol
54
Fast GC k
∞
2 Dm rc2 H u u 24 Dm H min 2 BC m C s Hmin= 0,6rc
B uopt Cm C s
Dm uopt 6 ,9 rc 55
56
GC-s detektorok • • • •
1. hővezetőképességi detektorok, 2. ionizációs detektorok, 3. fotometriás detektorok 4. molekulaszelektív, vagy tömegspektrometriás detektorok. • 5. elektromos vezetőképességi detektorok, • 6. oxigén szelektív detektor, • 7. kombinált detektorok, stb. 57
HWD, TCD kapcsolás vivőgáz
a)
M
b)
M
R
R vivőgáz
B
B
K
M
K
R
B
vivőgáz
BB
vivőgáz
K
K
58
mikro-TCD B
B vivőgáz
vivőgáz
mérőszál
mérőszál R
M
X
R
M
X
szabadba
a)
moduláló gázáram
szabadba
b)
moduláló gázáram
59
Az ionizációs detektorok működési elve 10
elektródok
R > 10 o R
U o
V=1V-1kV
vivőgáz
energia 60
FID elvi vázlata
anód (+) láng katód (-) levegő
hidrogén
tömítés
kolonna 61
A lángban lejátszódó folyamatok O2 O2 O2 előmelegítő zóna
2500 K
O2 oxidációs zóna O2 reakció zóna 1500-2000 K
H1 230,3 kJ
HO2 + H. OH + O H + H O
1. H2 + O 2 2. H + O 2 3. O H + H
H2 67,8 kJ H3 -63,2 kJ
2
2
O H + H
4. O + H2
H4
4,4 kJ
Rekombinációs reakciók
(pirolízis)
5. H. + O H + X
H2O + X
H5 -500 kJ
6. H + H + X
H2 + X
H 6 -436,3kJ
7. O + O + X
O2 + X
H7 -498,6 kJ 7
H -1435 kJ 1
1. C nH m
pirolízis
2. n C H . + n O . 3. n C HO .
n C H . + (m-n) H. oxidáció
ionizáció
n C HO .
n CHO+ + n e 62
A FID jellegörbéje, érzékenysége Ri (A)
Ri (A)
tg = a D I0
aD =
Ri dn i dt
-5 10 g/s
dn i
I0 10 -12 g/s
t
dt
aD
hi hi A i c max F mi dmi dt max
4ln 2
aD
12nc gq M Mi
4 ln 2
63
AFID anód (+) RbCl só gyöngy
láng
katód (-)
levegő
hidrogén tömítés
kolonna
64
sugár ionizációs detektorok: Ar, He + 1000-2000 V-os polarizációs feszültség 63
Ni fólia
Ar vivôgáz
kolonna
Ar Ar 2e 15,8eV
Ar Ar e 2 Ar Ar M M e Ar 11,6eV
65
ECD + kollektor elektród öblítő gáz ki
63 Ni fólia
polarizációs - feszültség 1-10V katód
öblítő gáz be ( make-up gáz )
kolonna 66
Az ECD érzékenysége Ri (A)
aD
hi cmax
Ri ,max cmax
gI o i i cmax cmaxM i V
aD
t
1 ms
1 gI o i i Mi 5-150 ms Elektron konc.
t állandó feszültségű üzemmód esetén
t
67
Az ECD relatív érzékenysége Vegyület
Relatív érzékenység
Vegyület
Relatív érzékenység
benzol
0,06
oktafluor-propán
1,0
aceton
0,50
trifluor-klór-metán
3,3
di-n-butiléter
0,60
trifluor-klór-etén
100
metil-butirát
0,90
pentafluor-klór-etán
170
1-butanol
1,00
1,1-difluor-2,2-diklór-etén
670
1-klór-bután
1,00
difluor-diklór-metán
3*104
1,4-diklórbután
15,00
kloroform
3,3*104
klór-benzol
75,00
1,1,2-triklór-etén
6,7*104
1,1-diklórbután
111,00
bróm-trifluor-metán
8,7*104
1-bróm-bután
280,00
1,1,2-trifluor-1,2,2-triklór-etán
1,6*105
bróm-benzol
450,00
1,1,1-trifluor-2-bróm-2-klóretán
4,0*105
kloroform
6*104
1,1,1,2,2,3,3-heptafluor-3-jódpropán
6,0*105
1-jód-bután
6*104
1,1,2,2-tetrafluor-1,2-dibrómetán
7,7*105
széntetraklorid
6*104
fluor-triklór-metán
1,2*106
68
PID
DID
Xe lámpa
szikrakisülés He
(-)
kvarc ablak
(-)
(+)
(+)
kolonna He vivőgáz
kolonna
69
gyújtó
FPD
levegő P,S szűrő PM H2 + levegő
a
b
FID monitor elektród
FID monitor elektród hűtő
+
+
PM
PM
-
levegő H
kolonna
H interferencia szűrő
2
2 interferencia szűrő
levegő levegő H2
kolonna kolonna
70
AED diódasor detektor
hűtővíz
diffrakciós rács
Ar make-up gáz
N
174,2 nm
P
178,1 nm
S
180,7 nm
Br
478,6 nm
energia
Cl 479,6 nm
fókuszáló rés kolonna
plazma
tükör kvarc ablak
H
486,1 nm
C
495,7 nm
F
685,6 nm
O
777,2 nm 71
Fontosabb detektorok jellemzői Z
DAH
DFH
aD
Linearitási tartomány
Típus 1.
Típus 2.
TCD
-
10-6 g
10-1 g
106 mVcm3/m g
104-105
univ.
konc.
FID
10-14 A
10-12 g/s
10-5 g/s
-
107
szerves
tömegára m érz.
ECD
5-6 V
10-13 g
10-9 g
-
104
spec.
konc.
FPD P
-
10-12 gP/s
10-7 gP/s
-
105
spec.
tömegára m érz.
FPD S
-
10-10 gS/s
10-7 gS/s
-
103
spec.
tömegára m érz.
PID
10-14 A
10-13 g
10-9 g
-
104
spec.
konc.
MS
10-6 V
10-15g
10-9g
104-106
univ. szelektív 72
Mindennapi feladataink: 1. az irodalom követése, 2. a mintavétel, mintaelőkészítés problémáinak áttekintése, 3. a gázkromatográfiás elválasztás, 4. a minőségi azonosítás, mennyiségi elemzés kérdéseinek eldöntése, 5. az eredmények megadása és dokumentálása, valamint 6. az eredmények hihetőségének a bizonyítása, 7. gyakori feladat a készülék hibáinak felismerése és elhárítása. 73
Gyakorlati alkalmazások • • • • •
Permanens gázok mennyiségi elemzése Szénhidrogénipari elemzések Környezetvédelmi analízis Gyógyszeripari elemzések Élelmiszerek, mezőgazdasági termékek gázkromatográfiás vizsgálata, stb.
74
HPLC
75
A HPLC-s elválasztás • Célja: minden termikusan érzékeny nemionos, ionos és ionizálható szerves és szervetlen alkotók eredményes elválasztása és a identifikálása, azaz a szükséges és elégséges felbontóképesség biztosítása:
Rs 2
t R , 2 t R ,1 w2 w1
1,5
N 1 k Rs 4 1 k 76
Hatékonyság Szelektivitás Kapacitás
77
A szorpciót eredményező kölcsönhatások:
• • • • • • •
1. diszperziós: apoláris-apoláris (hidrofób) 2. indukciós: apoláris-poláris 3. orientációs: poláris-poláris 4. H-hidas: donor-akceptor 5. ionos 6. biospecifikus 7. molekulaméret MINTA »S » (álló)
M (mozgó) 78
Szelektivitás: állófázis megválasztása eluens összetétel megválasztása izokratikus gradiens elúció hőmérséklet szerepe
79
Az elválasztás hatékonysága I. van Deemter egyenlet:
2gDm 2 k HETP 2d p u 2 u 3 1 k Ds d 2p
B H A Cm u u • • • • • • •
: töltési tényező dp: a kolonnatöltet átlagos szemcseátmérője Dm: az alkotó lineáris diffúziós állandója a mozgó fázisban g : a töltet zeg-zugosságát kifejező tényező u : az eluens lineáris áramlási sebessége k : a retenciós tényező Ds : az alkotó lineáris diffúziós állandója az álló fázisban
80
Az elválasztás hatékonysága II. • A : az áramlási egyenetlenségekből származó csúcsszélesedés – („eddy-diffusion”)
• B : a diffúzió csúcsszélesítő hatása • Cs : az anyagátadás csúcsszélesítő hatása • Knox-egyenlet:
h A
1/ 3
B
C s
H h dp
ud p Dm 81
Az elválasztás hatékonysága III.
•
Cs= H
anyagátadás=
Háramlásidiff+ Hfilmellenállás + Hpórusdiff+ Hkinetikai
dp k2 H áramlási ca u 2 ( 1 k ) Dm
H pórusdiff
2 (k0 k k0 k ) 2 d pórus u
30(1 k0 ) 2 (1 k ) 2 Dm k0
2k 2k 2 H kin 2 (1 k0 )(1 k ) kd (1 k0 )(1 k ) 2 ka 82
H ( mm ) 0,020
0,015
0,010 H-u
0,005 A 0 0
Hmin =0,0065 mm
B/u uopt =1,7 2 1 0,3
Cs . u 3 0,9
4 u ( cm/s ) 1,1 cm3/min 83
Áramlás szemcsés tölteten
• : az eluens viszkozitása • : a kolonna áramlási ellenállása
Lu p d 2p
84
HPLC-s elválasztások: • • • • • • • • • • • •
1. Normál fázisú (NP) 2. Fordított fázisú (RP) 3. RP ionpár kromatográfia 4. Ioncserés kromatográfia 5. HILIC 6. UHPLC 7. Méretkizárásos 8. Affinitás kromatográfia 9. Hidrofób kölcsönhatáson alapuló 10. Konvergens kromatográfia 11. Folyadék-folyadék megoszlásos 12. Elektrokromatográfiás módszerek 85
Oszlopos megoldású HPLC módszerek LC módszer
Állófázis minősége
Mozgófázis minősége
NP-HPLC, normálfázisú kr.
poláris töltet
apoláris
RP-HPLC, fordított fázisú kr.
apoláris töltet
poláris
-ionpár kromatográfia
apoláris töltet
poláris eluens+ionpárképző
-ioncserés kromatográfia (HPIC)
töltéssel rendelkező töltet puffer oldat
-ionkizárásos kromatográfia
kationcserélő töltet
puffer oldat
SEC, méretkizárásos kromatográfia
pórusos töltet
víz, vagy szerves oldószer
HIC, hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfia
hidrofób felületű töltet
sótartalmú oldat: csökkenő sókoncentráció
IC ionkromatográfia
HILIC, hidrofil kölcsönhatáson erősen poláris töltet alapuló kromatográfia
apoláris, majd növekvő polaritású 86
A szilikagél mint állófázis alapanyag: polikovasavak halmaza
a leggyakrabban használt állófázis
• • • • •
Fajlagos felülete: 200-400 m2/g Pórusmérete: 20-100A (2-10nm) Pórustérfogat: 0,1-3 cm3/g Szemcseméretek: 1,3; 1,7; 3; 5 µm Módosított szilikagél carbon telítettsége: 5-20%
87
88
89
90
91
92
93
94
Méretkizárásos kromatográfia
95
96
Rétegkromatográfia
toluene - ethyl acetate (93:7 v/v), next sprayed with vanillin in H2SO4 and heated. From left to right oils from: bergamot, cedar, eucalyptus, syzygium, malaleuca, lavandula, mint, orange, pine, spruce. Identified components: B1 and L1 - linalol, B2 and L2 - linalyl acetate, E1 - cinneol, G1 - eugenol, G2 carryophyllene. Doubtfully identified components - C1 - cedrol, M3 - menthol, P1 - limonene.
97
HPLC Töltetek fejlődése Őskor: (-1966)
Szabálytalan, 100 -300 µm, gravitáció
Kőkor: (1965-1969)
Szabálytalan, 30 -100 µm (40 -70 µm) Száraz töltés, kényszeráramlás (pumpa)
Első generáció: (1970-)
Szabálytalan, 10 -15 µm Porózus felületű, Iszapfázisú töltés, hatásosság Kémiailag kötött ( fordított) fázisok Polimer gélek
Második generáció: (1980-)
Gömbalakú, 3 -5 µm Endcapping Tágpórusú (WP) töltetek (30 -400 nm) Poláris (Diol, NH2, CN) fázisok Hatásosság + szelektivitás Polimer töltetek Királis töltetek 98
Harmadik generáció: (1990-)
Szintézis szilánokból, nagy tisztaság 3 -5 µm, Endcapping, védett (stabil) fázisok (SB) Hatásosság + szelektivitás + stabilitás + reprodukálhatóság Nemporózus töltetek, 1-2 µm, Gyorsaság Monolit töltetek
Héjszerkezetű töltetek
99
Töltetek anyaga Szervetlen oxidok: szilika gél alumínium-oxid TiO2, ZrO2 hidroxil-apatit (Ca3(PO4)2) Szerves polimerek: sztirol-divinilbenzol poli-alkilmetakrilát polivinil-alkohol-észter poliéter alkilált poliakrilamid dextrán-akrilamid Porózus grafitált karbon (PCG) 100
Töltetek aktív részei Adszorbens / normál fázisú:
szilika-gél-SiOH Alumínium-oxid Al2O3 Florisil Mg2SiO3 Diol -(CH2)3-OCH2-CHOH-CHOH Amino -(CH2)3-NH2 Ciano -(CH2)3-CN
Fordított fázisú:
Oktadecil -(CH2) 17-CH3 Oktil -(CH2)7-CH3 Etil -CH2CH3 Ciklohexil -CH2CH2-C6H11 Fenil -CH2CH2CH2-C6H6 Endcapping Embedding -CH2-CH2-CH2-CF3 101
Ioncserélő: anioncserélő:
kationcserélő:
Amino -(CH2)3-NH2 Kvaterner amin -(CH2)3-N+- (CH3)3 Karbonsav -(CH2)2COOH Propil szulfonsav -(CH2)3SO2OH Benzol szulfonsav -(CH2)3- -SO2OH
Királis fázisok:
a,AGP, (R) Urea, (R)DBF ciklodextrin
Affinitási töltetek:
Fenilboronát Biospecifikus ligandok
SEC töltetek:
Silica Polimer
HIC töltetek:
Silica Polimer 102
NP-HPLC mozgó fázisokkal szembeni elvárások – polaritás – viszkozitás – UV áteresztés – tisztaság – toxicitás mentesség – forráspont – oxigén oldódás – víztartalom – elegyíthetőség – ár
103
NP-HPLC mozgó fázisok • Alap oldószerek: • n-hexán • n-heptán • izooktán • Oldhatóság növelők: • diklór-metán • diklór-etán • kloroform • Modifikátorok: észterek, éterek, alkoholok, stb.
104
RP-HPLC mozgó fázisok • • • • • • •
acetonitril 1,4-dioxán etanol 2-propanol metanol tetrahidrofurán VÍZ
105
Oldószerek jellemző adatai
Oldószer
Refraktív index (20 ºC)
Polaritás [P’]
Viszkozitás [cP, 20ºC]
Forráspont [ºC]
UV Cut off [nm]
Tetrahidrofurán
1.4072
4
0.55
66
212
Dioxán
1.4224
4.8
1.37
101.3
215
Acetonitril
1.3441
5.8
0.38
81.6
190
2-Propanol
1.3772
3.9
2.40
82.3
205
Etanol
1.3614
-
1.20
78
210
Metanol
1.3284
5.1
0.55
64.7
205
Víz
1.333
10.2
1
100
190
106
Oldószerek jellemző adatai Oldószer
Oldószer erősség (εº)
Oldhatósági paraméter (δ)
Polaritási index (P’)
Sűrűség [g/cm3]
Viszkozitás [cP 20ºC]
Forráspont [ºC]
UV Cut off [nm]
n-Pentán
0.00
7.1
0.00
0.626
0.22
36
200
n-Heptán
0.01
7.2
0.20
0.684
0.42
98
200
Izooktán
0.01
7.3
0.10
0.690
0.50
99
200
CCl4
0.14
8.6
1.60
1.594
0.97
77
265
Toluol
0.22
8.9
2.4
0.867
0.59
110
285
Dietiléter
0.29
7.4
2.90
0.708
0.24
35
220
Kloroform
0.31
9.3
4.10
1.483
0.57
61
250
Diklórmetán
0.32
9.7
3.10
1.327
0.44
40
250
Tetrahidrofurán
0.35
9.1
4.00
0.881
0.46
66
220
Metil-etilketon
0.39
9.8
4.70
0.805
0.40
80
330
Etilacetát
0.45
9.6
4.40
0.900
0.45
77
260
Acetonitril
0.50
11.7
5.80
0.786
0.37
82
210
2-Propanol
0.63
11.5
3.90
0.785
2.90
82
200
Etanol
0.68
12.7
4.30
0.791
1.20
79
210
Metanol
0.73
14.4
5.10
0.791
0.60
65
205
Víz
>0.73
23.4
10.20
1.000
0.89
100
-
107
Az oldószerek erőssége 1 eosz=1,1eoalox
2. 3.
Ei . i V i
1
2
H v , i RT Vi
i diszp ind or don acc
4. Snyder-féle polaritási index:
etanol (akceptor), dioxán (donor) nitrometán (orientáció)
P , log K et log K diox log K nitrom 108
RP-HPLC elválasztás optimalizálása • SZELEKTIVITÁS
• Hatékonyság • Kapacitás • Az elválasztások pH függése: – ionos és ionizálható alkotók (savak, bázisok) – nem disszocibilis alkotók elválasztása (nem pH függő) 109
Az ionizálható vegyületek jellemzői: -elektrolitos disszociáció (pKa), - ionizálhatók szerves és vizes fázisok közötti megoszlás (lgD)
pH pKa
lg Dsav lg P lg 1 10
lg Dbázis lg P lg 1 10pK pH a
Nem ionizálható vegyületek - oktanol-víz megoszlási hányadosa (lgP),
cokt lg P lg c víz 110
AB A B
AB org Dsav AB aq A aq
AB org Dbázis AB aq B aq 111
Retenciós idő
A
pKa + 1,5
B
pKa
2
7
pH 112
Retenciós idő
A
pKb + 1,5
B
pKb
2
10
pH 113
pH szerepe: savak, bázisok, sók
114
• pH beállítás – ammónium –formiát
2,8-4,8 pH
– ammónium-acetát
3,8-5,8 pH
– ammónium-hidroxid
8-11 pH
– amm.-hidrogén-karbonát
6-8 pH
115
HILIC
116
HILIC
117
HILIC
118
UHPLC
119
120
121
122
123
Gradiens elúció
124
125
126
IONCSERÉLŐ KROMATOGRÁFIA
127
128
Ioncserélő állófázisok 1. • Kationcserélők – erős –SO3- H+ – gyenge -COO- H+
• Anioncserélők – erős -N+(CH3)3 OH– gyenge -N+H3 OH-
129
Ioncserélő állófázisok 2. • • • •
divinil-benzol gyöngy kopolimer alap módosított szilikagél alap polisztirol alap polimetil-metakrilát alap
• Porózus, pórusméret 2-40 nm • Héjszerkezetű HPIC
130
Eluensek • Kationok meghatározásához – híg HCl (0,01M)
• Anionok méréséhez – híg NaHCO3, Na2CO3, KOH
• VEZETŐKÉPESSÉGI DETEKTÁLÁS!
131
Ioncsere-ionkromatográfia • Döntő az állófázis ioncserélő kapacitása – Teljes ioncsere: nagy ioncserélő kapacitás • 2-10 mgeq/g
– Ionkromatográfia: kis ioncserélő kapacitás • 0,1-0,2 mgeq/g
• Megvalósítás – Kiszorításos módszer – Elúciós módszer 132
• Kétkolonnás elválasztás, ionelnyomó kolonna (supressor): nagy ioncserélő kapacitás! – kémiai – elektrokémiai
• Egykolonnás elválasztás
133
Kationok elválasztása erős kationcserélőn • Állófázis: kis kapacitású szulfonsavas • Mozgófázis: 0,01M HCl • Minta: Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+,…(Cl-) R-SO3- H+ Li+, Na+, K+, Ca2+, Mg2+,…(Cl-) ELVÁLNAK • Supressor: nagy kapacitású anioncserélő kvaterner amin R-N(CH3)3+ OH- + H+ClR-N(CH3)3+ OH- + Li+Cl-
R-N(CH3)3+ Cl- + H2O R-N(CH3)3+ Cl- +Li+OHLi+, Na+, K+, Ca2+, Mg2- (OH-)
134
Anionok elválasztása • Állófázis: kis kapacitású kvaterner amin • Mozgófázis: 0,01M NaHCO3, Na2CO3, KOH • Minta: F-, Cl-, Br-, NO2-, NO3-, HPO42-, SO42- , I-, ClO4-, BrO3-
R-N(CH3)3+ HCO3- + Na++ F-, Cl-, Br-,….
elválnak!
• Supressor: nagy kapacitású kationcserélő R-SO3- H+ + Na+ HCO3R-SO3- Na+ + H2CO3 R-SO3- H+ +Na+ F-, Cl-… R-SO3- Na+ + (H+)F-, Cl-, ….. Br-, NO2-, NO3-, HPO42-, SO42- , I-, ClO4-, BrO3-
135
136
137
Ionmozgékonyságok
138
A supressor kolonnát regenerálni kell! • Kationcserélőt tömény kénsavval • Anioncserélőt tömény nátronlúggal
139
Egykolonnás elválasztás
• Eluens: gyenge elektrolitok – benzoesav – citromsav – o-ftálsav – bórsav – glukonsav – stb.
140
Egykolonnás elválasztás
141
Gyenge ioncserélők pH függése • Az ioncserélő kapacitás pH függő! – gyenge kationcserélő – gyenge anioncserélő töltetek esetén
• Erős ioncserélők kapacitása független a pH-tól!
142
Gyakorlati alkalmazások: • Főként anionok elválasztása • Aminosavak savas közegben kationos elválasztása
143
144
Kiszorításos ioncserés elválasztások
145
HPLC készülékek felépítése • • • • •
Eluens szállítás, Mintabevitel Elválasztó kolonna Detektor adatfeldolgozás
146
147
148
149
150
Kolonnák: töltés, csatlakozások
151
Mintabevitel: manuális, automatikus
152
Detektorok Mass LOD HPLC detector
Commercially available
(commercial)
Mass LOD (state of the art)
Absorbance
Yes
100pg-1ng
1pg
Fluorescence
Yes
1-10 pg
10fg
Electrochemical
Yes
10pg-1ng
100fg
Refractive index
Yes
100ng-1µg
10ng
Conductivity
Yes
500pg-1ng
500ng
Mass spectrometry
Yes
100pg-1ng
1pg
FT-IR
Yes
1µg
100ng
Light scattering
Yes
10µg
500ng
Optical activity
No
-
1ng
Element selective
No
-
10ng
Photoionisation
No
-
1pg-1ng
153
154
DAD 155
156
157
158
RI detektor: törésmutató mérés
159
ELSD: evaporating light scattering detector
160
161
CAD: Corona® Charged Aerosol Detector (CAD® )
162
163
wall-jet detektor
•
Elektromos vezetőképességi detektor
•
MS detektorok
164
A HPLC gyakorlati alkalmazásai • Környezeti analízis (víz, talaj, hulladék) • Gyógyszeranalízis – hatóanyagok – metabolitkutatás – Késztermék analízis
• • • •
Élelmiszer elemzés Szermaradvány vizsgálatok Technológiai termékek elemzése Fehérjekutatás és analízis 165
Gyakorlati példák
166
167
Drotaverin HCl illékony szennyezőinek HS-GCMS meghatározása O
HCl N
O
O 1/2 C2H5OH
O
gőztér VG
termosztáló folyadék T=állandó minta, V , m o , c i,L L i
Simaizom görcsoldó tárolás közben etil-klorid képződik
168
Megengedett etil-klorid koncentráció a Drotaverin hatóanyagban: 750 ppm Kapilláris kolonna: DB-624 25mx0,2mmx1,12µm (6% cianopropilfenil- 94% polidimetilsziloxán) Hőprogram: 40oC izoterm 1 percen át, majd 5oC/perc felfűtési sebesség 15 oC-ig Oldószer: DMSO Termosztálási hőmérséklet: 80 oC, idő 20 perc, mintabevitel 1 ml Detektor: MS
10.00
Etilklorid - 2.595
9.00 8.00
pA
7.00 6.00 5.00 4.00 3.00 2.00 0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00 Minutes
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
169
170
Filmtabletta analízise gyulladásgátló, lázcsillapító
171
172
Ibuprofen melléktermékeinek az elválasztása Oszlop: 150×4,6 mm; C18 álló fázis (5 µm) (Ajánlott: BDS Hypersil C18 5µm) Eluens:tisztított víz – acetonitril – ortofoszforsav = 600 : 340 : 0,5; az elegyedési egyensúly beállta után tisztított vízzel 1000 térfogategységre hígítva. Áramlási sebesség: 2,0 ml/min Hullámhossz: 214 nm Hőmérséklet: 25 °C Mérés időtartama: 40 perc Injektált térfogat: 20 µl 173
174
Aceclofenac: gyulladásgátló
Impurity A
Impurity D
Impurity G
Impurity B
Impurity E
Impurity H
Impurity C
Impurity F
Impurity I 175
Log D - pH diagram 6 5 Aceclofenac 4
Impurity A Impurity B
Log D
3
Impurity C Impurity D
2
Impurity E Impurity F
1
gyakorlatilag semleges Imp. B, C, D, E, F
Impurity G Impurity H
0 0
2
4
6
8
-1 -2 pH
10
12
14
16
Impurity I
semleges Imp. I
gyenge sav Aceclofenac, Imp. A, G H
176
Aceclofenak és szennyezéseinek az analízise *VWD1 A, Wavelength=275 nm (ACEC0414\006-0701.D - ACEC0414\091-0901.D) 12.144 - 2
mAU
25
42.674 - 10
40.540 - 9
37.921 - 8
35.799 - 6 32.295
31.176 - 5
19.741 - 4
5
18.664
10.222 - 1
10
16.648 - 3
15
37.217 - 7
20
0
0
10
20
30
40
50
min
1. Impurity A 2. Aceclofenac 3. Impurity G 4. Impurity H 5. Impurity I 6. Impurity D 7. Impurity B 8. Impurity E 9. Impurity C 10. Impurity F 177
A mennyiségi elemzés alapjai Ai
Ai ai mi Ai mi
ai =
tg = a i
Ai ai ci
a i = Ai ci Ai J , 0
KHi
KFH i
m i ci
l. kalibrációs módszer, 2. addíciós módszer 3. belső standard módszer 178
• Ajánlott irodalom: • Dr. Balla József: A gázkromatográfia analitikai alkalmazásai, Edison House Kft., Budapest, 2006. • Dr. Fekete Jenő: Folyadékkromatográfia elmélete és gyakorlata, Edison House Kft., Budapest, 2006.
179
