Tudományos Diákköri Dolgozat
RÁCZ GERGELY
Koleszterinszint szabályzó gyógyszerhatóanyagok és Triton X-100 nemionos detergens lebontása ionizáló sugárzással
a
Dr. Csay Tamása Dr. Takács Erzsébeta Dr. Homonnay Zoltánb – MTA Energiatudományi Kutatóközpont b
– Analitikai Kémia Tanszék
Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2014
„A természet az általa létrehozott anyagok lebontására ugyanolyan gondot fordít, mint előállításukra. A termelés örömétől elragadtatott ember még nem tart itt!” /Frederic Vester/
Tartalmi összefoglaló A hagyományos szennyvízkezelési eljárások elsődlegesen kémiai-fizikai és biológiai folyamatokra épülnek. Az elterjedt technológiákkal nehezen tudják biológiai úton lebontani az olyan szennyező anyagokat, mint a felületaktív anyagok, vagy gyógyszer maradványok. Ezen szennyeződések viszonylag könnyen visszakerülnek a környezetbe és előre megjósolhatatlan hatásokat válthatnak ki. Ezért a szerves szennyeződések lebontása vagy eltávolítása nagyon fontos feladat mind a kutatók, mind a mérnökök számára, hogy megvédjük értékes vizeink tisztaságát. A víz kezelése ionizáló sugárzással egyike az ún. nagyhatékonyságú oxidációs módszereknek (advanced oxidation process = AOP), melyekkel képesek a szerves molekulákat lebontani. Munkám során a Triton X-100 (TX-100) nemionos detergens és szolubilizált,
vízben
rosszul
oldódó
fibrát
típusú
koleszterinszint
szabályozó
gyógyszerhatóanyagok (bezafibrát, gemfibrozil, és klofibrinsav) radiolízisét tanulmányoztam. A vízben viszonylag jól oldódó klofibrinsav degradációját nem micelláris közegben is lehetőségem nyílt tanulmányozni. A reaktív részecskék (•OH, H• és eaq–) előállítására Co-60 sugárforrást alkalmaztam. A lebomlást UV-látható spektrofotométerrel követtük, a bomlástermékeket LC-MS/MS és GC-MS készülékekkel választottuk el és azonosítottuk, melyek segítségével javaslatot tettünk a TX-100 és a CFA bomlási mechanizmusaira. A mineralizáció, az oxidáltság és a savasodás mértékét kémiai oxigén igény (KOI), teljes szerves széntartalom (TOC) és pH mérésekkel határoztam meg. A detergens kritikus micellaképződési koncentrációjának (CMC) változását dinamikus felületi feszültség mérésekkel követtem. A lebontás hatékonyságát különböző koncentrációkon tanulmányozva az irodalmi CMC érték közelében töréspontot figyeltem meg, mely alapján eltérő bomlási mechanizmust feltételeztem a detergens esetén CMC alatti és fölötti koncentrációkon. Micelláris közegben oldott fibrátok lebontásának hatékonyságában eltéréseket tapasztaltam, melyet a különböző molekulaszerkezetekkel magyaráztam. Kutatási eredményeim igazolják, hogy az ionizáló sugárzás hatékonyan alkalmazható mind a TX-100 detergens, mind pedig a vízben rosszul oldódó, szolubilizált gyógyszerhatóanyagok lebontására vizes közegben, akár detergens jelenlétében is.
Köszönetnyilvánítás Szívből köszönöm Dr. Takács Erzsébetnek és Dr. Csay Tamásnak, hogy szakmai és emberi tanácsaikra mindig számíthattam, biztattak és támogattak, gyakran szétszórt gondolataimat egy mederbe terelték. Köszönetemet fejezem ki Dr. Homonnay Zoltán egyetemi konzulensemnek, amiért időt szakított rám és megosztotta velem az ELTE diplomaszerzés know how-ját.
Köszönetet mondok Dr. Wojnárovits Lászlónak szakmai tanácsaiért, és hogy vicceivel, humoros megjegyzéseivel színesítette a napjaim. Külön köszönettel tartozom Papp Zoltánnak, a számos besugárzási művelet elvégzésében nyújtott munkálataiért.
Megköszönöm Telegdi Lászlónénak (MTA TTK Anyag- és Környezetkémiai Intézet Határfelületek és Felületmódosítás Osztály), hogy lehetővé tette számomra a felületi feszültség méréseket és kollégáinak a mérésekhez nyújtott segítséget.
Köszönöm a MTA EK Sugárkémia Labor minden tagjának, hogy munkámban segítettek, a bent töltött óráimat szebbé varázsolták.
Köszönöm
Édesapámnak,
megboldogult
Édesanyámnak,
Testvéreimnek,
Nagyszüleimnek, páromnak Annának, hogy bíztak bennem, mindvégig mellettem voltak és lesznek.
Rövidítésjegyzék AOPs
=
nagyhatékonyságú oxidációs eljárások
BF
=
bezafibrát
CFA
=
klofibrinsav
CMC
=
kritikus micellaképződési koncentráció
EI
=
elektronütközéses ionforrás
EO
=
etoxilát-csoport (-CH2-CH2-O-)
GC-MS
=
gázkormatográf – tömegspektrométer
GF
=
gemfibrozil
HLB
=
hidrofil-lipofil egyensúly
HPLC-MS/MS=
nagynyomású folyadékkromatográf – tandem tömegspektrométer
IC
=
szervetlen szén
KOI
=
kémiai oxigénigény
MALDI-TOF =
mátrix által segített lézer deszorpció ionizáció - repülési idő analizátor tömegspektrométer
mtsai.
=
munkatársai
NDIR
=
nem diszperzív infravörös detektor
OC
=
szerves szén
PTFE
=
politetrafluoretilén (Teflon®)
RC
=
regenerált cellulóz
TC
=
teljes széntartalom
TOC
=
teljes szerves széntartalom
TX-100
=
Triton® X-100
UV-Vis
=
UV-látható spektrofotométer
Tartalomjegyzék 1 Bevezetés ............................................................................................................................ 1 2
Irodalmi áttekintés .............................................................................................................. 2 2.1
Sugárkémia .................................................................................................................. 2
2.2
Víz radiolízise .............................................................................................................. 3
2.3
Felületaktív anyagok.................................................................................................... 5
2.3.1 CMC- és HLB-értékek ............................................................................................. 6 2.3.2 Szolubilizáció, micellák szerkezete és mérete ......................................................... 8 2.3.3 Triton® X-100 ......................................................................................................... 9 2.4
Fibrátok ...................................................................................................................... 10
2.5
Fibrátok a felszíni vizekben ....................................................................................... 11
2.6
TX-100 és fibrátok lebontása nagyhatékonyságú oxidációs módszerekkel .............. 13
3
Célkitűzések ...................................................................................................................... 16
4
Mérések leírása ................................................................................................................. 17 4.1
Felhasznált vegyszerek .............................................................................................. 17
4.2
Folyamatos γ-besugárzás ........................................................................................... 17
4.3
Spektrofotometria ...................................................................................................... 18
4.4
Végtermékek azonosítása .......................................................................................... 18
4.4.1 HPLC-MS .............................................................................................................. 18 4.4.2 GC-MS ................................................................................................................... 19
5
4.5
Kémiai oxigénigény meghatározása .......................................................................... 19
4.6
Teljes szerves széntartalom mérése ........................................................................... 20
4.7
Felületi feszültség mérése .......................................................................................... 21
Eredmények, értékelések és következtetések.................................................................... 21 5.1
TX-100 UV-látható spektrofotometriai mérések ....................................................... 21
5.2
KOI, TOC és pH mérések.......................................................................................... 23
5.3
Felületi feszültség mérések ........................................................................................ 26
5.4
HPLC-MS mérések eredményei ................................................................................ 28
5.5
GC-MS mérések eredményei ..................................................................................... 32
5.6
CFA lebontása vizes közegben [42] .......................................................................... 34
5.7
Fibrátok lebontása micelláris közegben .................................................................... 36
6
Összefoglalás .................................................................................................................... 38
7
Irodalomjegyzék ............................................................................................................... 39
1
Bevezetés
A növekvő népesség és környezeti szennyezettség miatt napjainkban egyre inkább kitüntetett szerepet kap a tisztított vizek újrahasznosítása. A szennyvízkezelés során a legfontosabb elvárások közzé tartozik, hogy nem bűzlő, nem habzó, úszó iszapfoltoktól, toxikus és egyéb káros szerves anyagoktól mentes tisztított szennyvíz kerüljön ki a környezetbe. Sajnos ezek az igények a hagyományos szennyvízkezelési technológiákkal, minimális anyag- és energiaráfordítások mellet csak részlegesen teljesíthetők. Ennek egyik bizonyítéka, hogy gyakran találkozhatunk habzó vízfolyásokkal (pl. a Rába néhány évvel ezelőtti szennyezése), melyek a kifolyó szennyvízben maradt felületaktív anyagoknak köszönhetők. A felületaktív anyagok tulajdonságukból fakadóan képesek a nem, vagy nehezen oldható anyagok koncentrációját megnövelni a vizes oldatokban, így fokozva a víz szervesanyag tartalmát, esetleg toxicitását. Ezt az oldódási folyamatot nevezzük szolubilizációnak. A tisztítószerekkel, kozmetikumok előállításából és felhasználásából származó tenzidekkel szennyezett szennyvíz megfelelő tisztítása nem egyszerű feladat, speciális eljárást igényel. Ilyen speciális módszerek lehetnek a nagyhatékonyságú oxidációs eljárások (Advanced Oxidation Processes = AOPs). Az eljárások során kezelőanyagok, reaktív vegyületek (pl. hidrogén-peroxid, ózon), illetve egyéb úton (fotolízis, gamma-sugárzás, elektron-sugárzás) előállított reaktív köztitermékek, szabadgyökök ( •OH, H • , HO•2 ) reakcióba lépnek a szerves vegyületekkel, és különböző termékekre bontják azokat. Napjainkban – főképp a könnyebb kezelhetőség miatt – egyre nagyobb mennyiségben használunk folyékony tisztítószereket, melyek nagy mennyiségben tartalmaznak nemionos – és természetesen, ionos – felületaktív anyagokat, detergenseket is. A nemionos detergensek jó szolubilizációs tulajdonsággal rendelkeznek, kisebb koncentráción is oldatban tudják tartani a nem, vagy kevéssé vízoldható szerves molekulákat. Ilyen molekulák lehetnek például a nagy mennyiségben felhasznált, de kis mértékben vízoldható koleszterinszint szabályzók is. Munkám során egy olyan összetett rendszer γ-sugárzással történő lebonthatóságát tanulmányoztam, melyet egy nemionos detergens és különböző szolubilizált fibrát típusú gyógyszerhatóanyagok alkotnak. A rendszer modellezésére a Triton® X-100 (TX-100) nemionos detergenst, valamint a fibrátok csoportjába tartozó bezafibrát (BF), gemfibrozil (GF), és klofibrinsav (CFA) koleszterinszint szabályzókat választottam. A CFA degradációját – viszonylag jó vízoldhatóságának köszönhetően – detergens jelenléte nélkül is vizsgálhattam, így lehetőségem nyílt tanulmányozni a szolubilizáció hatását a lebonthatóságra.
1
2 2.1
Irodalmi áttekintés Sugárkémia
A sugárkémia az anyagban ionizáló sugárzások elnyelésének kémiai következményeivel foglalkozik. Ionizáló sugárzás lehet elektromágneses sugárzás (ultraibolya-, röntgen-, gammasugarak) vagy részecskesugárzás (proton-, elektron-, alfa-sugárzás vagy egyéb töltött részecskék). Az ionizáló kölcsönhatás feltétele, hogy a sugárzás energiája elegendően nagy legyen a molekulák ionizációjához, kisebb energiájú sugárzás még nagyobb fluxus mellett sem képes ionizációra. Az ionizáció során egy elektront teljesen eltávolítunk a külső elektronhéjról, így párosítatlan elektront tartalmazó molekula – más néven szabad gyök – keletkezik. A gyakorlatban azokat a sugárzásokat sorolják az ionizáló sugárzások közé, melyek energiája sokszorosan, általában nagyságrendekkel meghaladja a molekula első ionizációs energiaszintjét. Ezért gyakran a nagyenergiájú ionizáló sugárzások elnevezést alkalmazzák. Elektromágneses sugárzás esetén az E fotonenergia, a ν rezgési frekvencia és a λ hullámhossz között az alábbi összefüggés áll fent: 𝐸 = ℎ𝜈 =
ℎ𝑐 𝜆
Az egyenletben h a Planck-állandó, 6,626 × 10-34 J s, c a fénysebesség vákuumban, 2,998 × 108 m s-1. A különféle elektromágneses sugárzásokat legegyszerűbben a hullámhosszuk (energiájuk) szerint csoportosíthatjuk, azonban az egymáshoz közeli energiatartományok között nem lehet éles határt vonni. Például az ultraibolya sugárzás 4 – 400 nm (310 – 3 eV) tartományban definiálható a röntgen-sugárzás 0,01 – 10 nm (100 keV – 150 eV), a gammasugárzás 50 keV – nél nagyobb energiájú elektromágneses sugárzást nevezzük [1]. Nagyenergiájú sugárzás hatására a molekulában lévő elektronok gerjesztődhetnek (nagyobb energiaszintre kerülhet), kilökődhetnek (ionizáció következhet be). A molekula geometriája is megváltozik az elektron gerjesztésével, torzulnak a kötések és elegendő energia felvétel hatására kötésfelhasadás is bekövetkezhet. Az ionizációt, a közeg jellemzőitől függően, rekombináció követheti, melyben szintén gerjesztett molekula jön létre. Abban az esetben, ha egy molekulában lévő kötés disszociációs energiája kisebb, mint a legkisebb gerjesztési szint, akkor a sugárzás hatására a molekula nagy része elbomlik, ellenkező esetben a bomlás kismértékű. A különböző sugárzások hatását az egységnyi tömegben elnyelődött energiával lehet összehasonlítani. A hatás mennyiségi jellemzője az elnyelt dózis, vagy röviden dózis. 2
𝐷=
𝑑𝐸 𝑑𝑚
Ahol D a dózis, mértékegysége a Gray (Gy), és az 1 kg (m) anyag által elnyelt energiát adja meg, SI egységben a J kg-1 mértékegység használatos. A dózis meghatározására alkalmasak a doziméterek, melyek két csoportba sorolhatóak, a fizikai változások mérésén alapuló fizikai doziméterek, illetve a kémiai változások mérésén alapuló kémiai doziméterek (pl.: etanolklórbenzol doziméter, ld. 4.2 fejezet).
2.2
Víz radiolízise
A mindennapi életből számos példát vehetünk a sugárzásos technológiák alkalmazására (röntgen fotográfia, komputertomográfia, pozitronemissziós tomográfia, stb.). Ilyen például a víz radiolízisén (radiolízis = sugárzás hatására történő vegyi átalakulás) alapuló sugárterápia, az élelmiszerek sugárkezelése, gyógyszerek sterilezése, vagy a szennyvízkezelés is [2]. A víz radiolízisének reaktív köztitermékei, a hidratált elektron (eaq–), a hidroxil gyök (•OH) és a hidrogénatom (H•). Ezek a köztitermékek a vízmolekulák ionizációjával (1), vagy gerjesztésével (2) jönnek létre.
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)
Az (1) reakcióban keletkező H2O+• néhány molekulaméretnek megfelelő elmozdulás után, a (3) reakció szerint nagyon rövid 10-14 s idő alatt protont ad át valamelyik környező molekulának. Szintén az (1) reakcióban keletkező ún. száraz elektron a nagy töltéssűrűség következtében a környező vízmolekulákat maga felé fordítva lokalizálódik a (4) reakció szerint, így jön létre a hidratált elektron (eaq–). A (2) reakcióban keletkező gerjesztett vízmolekulák energiaátadással relaxálódhanak, vagy kötésfelhasadással az (5) reakció szerint hidroxil gyökre (•OH) és hidrogén atomra (H•) bomlanak [3]. Levegővel (vagy oxigénnel) 3
telített oldatban a H• és a eaq– reakciója az oldott O2-nel perhidroxilgyököt (HO2•), illetve szuperoxid gyökaniont (O2–•) eredményez az (6) és (7) reakciók szerint, azonban ezek elhanyagolhatóan kis mennyiségben keletkeznek. A köztitermékek egymás közti reakcióiban végtermékként H2O2 és H2 keletkezik. A reakciókat az 1. ábrán foglalom össze:
1. ábra A víz radiolízésének alapfolyamatai [3]
A sugárkémiai gyakorlatban a hozamok mennyiségi jellemzésére a G érték (mértékegysége: mol J-1) használatos, amely 1 J energiájú besugárzás hatására bomló vagy átalakuló részecskék mólban kifejezett mennyisége: 𝐺𝑖 =
𝑛𝑖 𝐸
ahol ni az anyagmennyiség (mol), E pedig az elnyelt energia (J). Mivel 1 J energia hatására tipikusan μmol J
-1
10-6-10-7 mol
nagyságrendű
reaktív
részecske
képződik,
kedvezőbb
a
mértékegység használata [4, 5]. A víz radiolízise során homogén eloszlásúnak
tekinthetők a eaq–, a •OH, és a H• köztitermékek hozamai γ-, vagy nagyenergiájú elektron besugárzás esetén, semleges, vagy enyhén lúgos oldatokban ezek értékei rendre 0,287, 0,270 illetve 0,061 μmol J-1, míg az egymás között lejátszódó reakciókban képződő H2O2 és H2 hozamai 0,061 és 0,043 μmol J-1. Az egymásba átalakulni képes HO2• és O2–• (pKa = 4,8 ± 0,1) hozamai elhanyagolhatóan kicsik, összesen 0,003 μmol J-1 tesznek ki [6]. A radiolízis során keletkező különböző köztitermékek reaktivitása nagyon eltérő (függ például a rekciópartnertől és a közegtől is), a vízben található szennyeződésekkel végbemenő reakcióik általában kevesebb, mint 1 µs alatt lejátszódnak.
4
2.3
Felületaktív anyagok
A felületaktív anyagok, vagy más néven tenzidek nagy mennyiségben kerülnek felhasználásra emulgeáló-, diszpergáló-, nedvesítő- és tisztítószerként. A világon összesen 12 millió tonna felületaktív anyagot gyártanak évente. Ennek hozzávetőleg 52%-a egyenes szénláncú alkilbenzol-szulfonátok, 18%-a alkohol etoxiszulfátok, 16%-a alkil etoxilátok, és 9%-a alkilfenol-etoxilátok különböző formája [7]. A nagy mennyiségű felhasználás következménye, hogy a tenzidek a kommunális és ipari szennyvizek állandó összetevőinek tekinthetők. A lassú aerob és anoxikus lebonthatóságnak köszönhetően kijutnak a környezetbe és akár komoly károkat is okozhatnak a vízi élővilágban. A vízfelszínen habréteget képezve gátolják az oxigén beoldódását a vízbe, így csökkentik az oldott oxigén mennyiségét. A felületaktív anyagok viszonylag közvetlen káros hatásai nem ismertek az emberre nézve. Azonban fontos megemlíteni, hogy egereken végzett kísérletek során az immunrendszer gyengülését [8] és rákos daganat kialakulását is összefüggésbe lehetett hozni a detergensek jelenlétével [9]. Annak ellenére, hogy a detergensek hatással vannak az oldódásra és diszperziók stabilitására, a vírusok és baktériumok bejutását a szervezetbe nem segítik.
Továbbá
különböző
szerves
vagy
szervetlen
anyagok
felszívódását
az
emésztőrendszeren keresztül csak nagy koncentráció esetén növelik [10]. A tenzid molekulákban általánosan apoláris (hidrofób vagy lipofil) szénhidrogénlánchoz kapcsolódik egy poláris (hidrofil vagy lipofób) rész (2. ábra). Ezt a kettős oldhatósági tulajdonságot amfipatikus (= amfifil) tulajdonságnak is szokták nevezni. A poláris „fejrész” alapján anionos, kationos, amfoter, és nemionos tenzideket különböztethetünk meg (2. ábra). Az anionos felületaktív molekulában egy hosszú szénhidrogénlánchoz kapcsolódik egy negatív töltésű csoport melyhez ellenionként egy kation kötődik, ezek lehetnek karbonsavak (szappanok), szulfátok, szulfonsavak, vagy foszfátok sói. A kationos tenzidekben a szénhidrogén lánc végén pozitív töltésű csoport található, melyhez negatív töltésű ellenion tartozik, ezek lehetnek pl. ammóniumsók, kvaterner ammóniumsók, vagy N-alkil-piridiniumsók. Az amfoter tenzidek pH-tól függően lehetnek anionosak és kationosak vagy akár semlegesek is, mivel az apoláris szénhidrogén lánc ikerionos csoportban végződik, ide sorolhatók a hidroxil-ammin és betain típusú származékok. Nemionos tenzidek esetén a hidrofób részhez nem disszociáló hidrofil rész kapcsolódik, ilyenek lehetnek a többértékű alkoholok zsírsav észterei, vagy az etilén-oxid adduktok. Előnyös tulajdonságuk az ionos tenzidekkel szemben, hogy stabilabbak és kémiai tulajdonságuk
nem
befolyásolható
az
oldat
koncentrációjának változtatásával. 5
kémhatásának
vagy
az
elektrolit
2. ábra Tenzidek általános szerkezete és típusai, példákkal
2.3.1 CMC- és HLB-értékek Az önszerveződő felületaktív anyagok vizes oldatainak fizikai-kémiai tulajdonságai más oldatokétól eltérő koncentrációfüggést mutatnak. Kellően kis koncentráción a felületi feszültség, ekvivalens vezetőképesség, mágneses rezonancia, ozmózisnyomás, stb. a koncentrációval arányos változást mutatnak [11]. A vizsgált tulajdonságokban azonban nagyobb koncentrációknál jelentős eltérések tapasztalhatók. Ha az említett fizikai mennyiségeket a koncentráció függvényében ábrázoljuk, jellegzetesen többé-kevésbé éles töréspontot mutató görbék adódnak, ahol a töréspontok közel azonos koncentrációnál találhatók. Ezt a töréspontot nevezzük kritikus micellaképződési koncentrációnak (critical micellization concentration = CMC), mely az asszociációs kolloidok egyik legfontosabb jellemzője. A CMC alatti koncentráción identikus molekulákat különböztethetünk meg, melyek a CMC környékén ún. micellákat képeznek (3/a ábra). Nem vizes közegben is hasonló önszerveződés figyelhető meg, ebben az esetben inverz micellák képződnek (3/b ábra). 6
Nagyobb koncentráción henger alakú micellák, többrétegű lamellák vagy többrétegű vezikulák is képződhetnek (3/c,d,e ábra). A habok külön kiemelendők (3/f ábra), mivel a tenzid ebben a formában lényegesen nagyobb koncentrációban van jelen.
3. ábra Asszociációk szemléltető ábrái: (a) micella, (b) inverz micella, (c) henger alakú micella, (d) kettősrétegű lamella, (e) többrétegű vezikula, (f) hab [12]
Minél nagyobb egy tenzid asszociációs hajlama, annál kisebb koncentráción következik be a micellaképződés. A nemionos tezidek CMC-jét legnagyobb mértékben a kémiai szerkezet határozza meg, vagyis az apoláris lánc hossza és szerkezete (pl. kettőskötések, elágazások, aromás gyűrűk), és a poláris rész hossza (pl. etilén-oxid egységek száma). Az asszociációs hajlamot kis mértékben befolyásolhatja a hőmérséklet, a nyomás és a szerves szennyeződések jelenléte is [13]. Ha az amfipatikus molekulákban a hidrofil rész elég nagy, akkor a molekula vízoldhatóvá válik. Ha a lipofil rész dominál, akkor az apoláris rész kiszorul a vizes közegből, vízben nem oldódik. Ezt a kettős egyensúly a HLB-értékkel (hydrophile-lipophile balance = hidrofillipofil egyensúly) szokás jellemezni. A HLB-érték a hidrofil és a lipofil molekularészek hányadával, végső soron a molekula polaritásával kapcsolatos. A gyakorlatban elterjedt az ún. HLB-skála, amelyben minden tenzidet 0 és 20 közötti szám jellemez. Ez alapján különböző alkalmazási területeket különíthetünk el egymástól (1. táblázat). Minél nagyobb a HLB-érték, annál polárisabb a molekula, a kis HLB-érétékű tenzidek nem oldódnak vízben. A gyakorlatban inkább csak a nemionos tenzidek jellemzésére használják a HLB-értékeket [14], azonban létezik egy ionos tenzidekre kiterjesztett 0-tól 60-ig terjedő HLB skála is. 7
1.
táblázat: Különböző HLB-értékű tenzidek alkalmazási területei [15] HLB
Alkalazási terület
1-3
habzásgátló
3–8
víz/olaj emulgeátor
7–9
nedvesítőszer
8 – 16
olaj/víz emulgeátor
13 – 16
mosószer (detergens)
15 <
szolubilizátor
2.3.2 Szolubilizáció, micellák szerkezete és mérete A micellaképződés dinamikus folyamat, ahhoz, hogy egy tenzid molekula kicserélődjön egy micellát alkotó monomerre 1-10 µs idő szükséges [16]. Ennek a gyors kicserélődési folyamatnak köszönhetően, a micellák alakja folyamatosan változik, gömb vagy ellipszoid alakot vesznek fel. Az adott körülményeken képződött micellák szerkezete, alakja nagymértékben függ a tenzidek molekulaszerkezetétől, az oldószertől, a koncentrációtól, a hőmérséklettől, az oldott idegen anyagoktól. Ezek a paraméterek a micella méretére is hatással vannak, vagyis az aggregációsszámára és az átlagos micellatömegre. A detergens koncentrációjának megváltozásával a CMC környékén a micellák mérete és alakja alig változik, szolubilizált szerves anyag jelenléte esetén azonban ezek a tulajdonságok jelentősen megváltozhatnak. A szolubilizáció hajtóereje valójában a hidrofil-lipofil kölcsönhatásokkal magyarázható, vagyis a hidrofób, kevésbé vízoldható molekuláknak a micella hidrofób magjában kisebb a szabadenergiája. A szolubilizáció során a micella nagyobb lesz, a micellát alkotó monomerek száma, tehát az aggregációsszám és az átlagos micellatömeg megnő [18]. Patel és mtsai megfigyelték, hogy az 5%-os TX-100 oldat 10,6 nm hidrodinamikai átmérőjű micellái 50 mmol dm-3 koncentrációjú fehéjsav szolubilizációja során 73,7 nm-re nőttek. Továbbá azt is észrevették, hogy a szolubilizáció után az oldat kémhatása is befolyásolhatja a micella szerkezetét (4. ábra), mely csak abban az esetben lehetséges, ha a szolubilizált anyagból vízoldható sót lehet képezni [19].
8
4. ábra TX-100 micella méretének változása szolubilizáció, majd lúgosítás hatására
2.3.3 Triton® X-100 A TX-100 az alkilfenol-polietoxilát nemionos felületaktív anyagok családjába tartozó polidiszperz vegyület, mely átlagosan 9,5 etilén-oxid egységet (n) tartalmazó hidrofil polietilén-oxid láncból, valamint egy hidrofób p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil csoportból álló molekula (5. ábra).
5. ábra TX-100 molekula szerkezeti képlete (n = 9,5) Jó vízoldható tulajdonsága a hosszú etoxi-láncnak köszönhető. A kevés (n < 5) etilén-oxid egységet tartalmazó vegyületek alig vízoldhatók. A TX-100 különböző etilén-oxid lánchosszúságú molekulák keveréke, átlagos molekulatömege 625 g mol-1, abszorpciós maximuma
270
nm-en
található,
kritikus
micellaképződési
koncentrációja
0,22 – 0,24 mmol dm3, számított HLB-értéke 13,5 [20]. Főbb felhasználási területei:
háztartási és ipari tisztítószerek
textil ipar
agrokémia
fémmegmunkáló folyadék
cellulóz és papírgyártás
influenza vakcina egyik összetevője
laboratóriumi alkalmazás (DNS extrakció része, mikrobiológiai sejttenyésztés, membránprotein szolubilizáció, decellularizáció)
A sokféle felhasználási formája annak köszönhető, hogy kiváló mosóhatással rendelkezik, a víz/olaj rendszerekben jól alkalmazható diszpergáló és emulgeáló szerként, valamint nagyon jó nedvesítő tulajdonságú [21]. 9
Biológiai bonthatóságát Chen és mtsai. vizsgálták 5 különböző Pseudomonas törzzsel különféle körülmények között. A baktériumok növekedését spektrofotometriával, a tenzid koncentrációjának változását HPLC-MS méréssel követték. A kutatás során kiderült, hogy a legtöbb törzs képes a tenzidet oldott szénforrásként hasznosítani, valamint a lebontás a hosszabb etoxilát láncot tartalmazó vegyületekkel kezdődik [22]. Okpokwasili és Olisa különböző tenzidek, köztük a TX-100 biológiai lebomlását is tanulmányozták folyóvízben. Megállapították, hogy a TX-100 jelenlétében egyrészt nagyon alacsony a mikrobiális növekedés, és a lebomlás mértéke is (12 nap után 63%) [23]. Mohan és mtsai. szintén arra az eredményre jutottak, hogy a TX-100 aerob körülmények között csak részlegesen biodegradálható. A kutatásuk során tanulmányozták az anaerob és anoxikus biodegradálhatóságot és megállapították, hogy ilyen körülmények között a TX-100 nem biodegradálható [24]. Városi, ipari, és korházi szennyvízkezelő üzem tisztított vizének oktilfenol típusú tenzidek (OP) és származékainak koncentrációját Rubíban (Spanyolország) Petrovic és mtsai. mérték, és utókezelték. Az egy etoxi-csoportot tartalmazó OP 2,29, a kettőt 1,17, a 3-15 etoxicsoportot tartalmazó oktilfenolok összesen 0,78 µg L-1, valamint az egy és két etoxi-csoportot tartalmazó OP származékok összesen 124,6 µg L-1 koncentrációban voltak jelen. A tisztítási műveletet hatékonyabbá téve a szennyvíz utókezelését nagyenergiájú ionizáló sugárzással végezték. Az 500 keV energiájú gyorsított elektronokkal utókezelt kifolyó víz alkilfenoletoxilátok és származékainak mennyisége 2-3 kGy besugárzás hatására kevesebb, mint 0,1 µg L-1 koncentrációra csökkent [25].
2.4
Fibrátok
Genetikai okok miatt, vagy nem megfelelő étkezésre visszavezethetően egyre több ember küzd magas koleszterinszinttel, mely közvetlen kiváltója lehet infarktusnak, szélütésnek és végtagi trombózisnak is. A betegségek kockázata jelentős mértékben csökkenthető a koleszterinszint normalizálásával. A megfelelő érték különböző koleszterinszint szabályzó gyógyszerekkel és speciális diétával érhető el. A leggyakrabban alkalmazott koleszterinszint szabályzó gyógyszerek a fibrátok és a sztatinok családjába tartozó gyógyszermolekulák. A fibrátok elsősorban a triglicerid értékeket csökkentik, a HDL (’jó’ koleszterin) szintet emelik és mérsékelten csökkentik az LDL (’rossz’ koleszterin) szintet is, továbbá gátolják az érelmeszesedés kialakulását. Azonban a számos mellékhatás miatt ma már inkább a sztatinok alkalmazását ajánlják. A fibrátok csoportjába tartozó gyógyszerhatóanyagok [26]: 10
Bezafibrát (BF)
Ciprofibrát
Szimfibrát
Gemfibrozil (GF)
Klofibrát (CF)
Etofibrát
Fenofibrát
Alumínium klofibrát
Klofibrid
Kolin fenofibrát
Ronifibrát
Klofibrin sav (CFA)
A klofibrát (CF), alumínium klofibrát, rinofibrát, szimfibrát, etofibrát és klofibrid gyógyszermolekulák aktív metabolitja is a klofibrinsav (CFA). A szennyvizekbe és ez által az élővizekbe kizárólag ez a metabolit kerül ki, mivel a szervezetbe jutva az említett molekulák hidrolizálódnak és a hatást kifejtő gyógyszer valójában a CFA lesz. A kutatásaim során a klofibrinsav, a bezafibrát és a gemfibrozil gyógyszerhatóanyagok lebontását tanulmányoztam. A molekulaszerkezeteket és moláris tömegeket a 6. ábrában tüntettem fel.
6. ábra Vizsgált fribrátok molekulaszerkezetei, és moláris tömegei A fibrátok oldhatósága erősen pH-függő, ebből kifolyólag az irodalomban talált adatok meglehetősen eltérőek, azonban elméleti számításokkal közelítőleg megadhatók: a GF elméleti vízoldhatósága 27,8 mg L-1, a BF-é 1,6 mg L-1, míg a CFA-é 583 mg L-1 [27]. A rossz vízoldhatóság ellenére a GF és BF is viszonylag jól detektálható mennyiségben fordul elő a felszíni vizekben.
2.5
Fibrátok a felszíni vizekben
Számos tanulmány számol be gyógyszermolekulák jelenlétéről a környezetben. A nem hasznosított gyógyszermolekulák és aktív metabolitjaik az anyagcseretermékekkel együtt a csatornarendszeren
keresztül
a
szennyvíztisztítóba
jutnak.
A
részleges
eltávolításuk/ártalmatlanításuk után a kezelt szennyvízzel történő öntözéssel, szennyvíziszap mezőgazdasági hasznosításával, a hulladéklerakók csurgalékvizével, vagy a szennyvíztisztító telepek kifolyó vizével juthatnak ki a környezetbe. A vízi élővilágra vagy az emberre egyelőre még nem kimutatható, vagy jelentéktelen hatásuk van, azonban biokoncentrációval, 11
bioakkumulációval és a stabil felhalmozódó vegyületek esetleges biomagnifikációjával előre nem megjósolható következményeket válthatnak ki [28]. Jelenleg az ilyen irányú kutatások száma meglehetősen kevés, viszont Mimeault és mtsai GF esetén a környezetben előforduló koncentráció 113 faktoros biokoncentrációját mutatta ki aranyhal vérplazmában, mely endokrin működési zavart okozott [29]. A szennyvíztisztító telepek a bejövő szennyvíz gyógyszerhatóanyag tartalmát csak részben tudják csökkenteni. Az általam vizsgált vegyületek esetén: a BF 27-50 %-át, a GF 1646 %-át, a CFA 15-34 %-át tudják mindössze eltávolítani [30]. Ennek következményeként a rossz oldhatóság ellenére is a felszíni vizekben világszerte viszonylag magas koncentrációban vannak jelen (2. táblázat). 2. táblázat: Vizsgált gyógyszerhatóanyagok előfordulása a környezetben [31] Szennyvízben /ng L-1 Koncentráció Átlagos konc. 565 0,3-117 68-72 70
Természetes vizekben /ng L-1 Koncentráció Átlagos konc. 847 (tó)
780 (folyó) Bezafibrát (BF)
1050 990 41-76 (folyó) 3100 (folyó) 1,6-12,5 (folyó) 3100 1,6-202,7
4600 4600
Gemfibrozil (GF)
35-55 59-84 319-1200 0,84-4,76
71
250
80-2090 1500 80-478 109 0,5-82 Klofibrinsav (CFA)
680-880 n.d.-680 44-338 1600
51
48
410 510 3,9-35,3 (folyó) 279 (tó) n.d.-60 110 456
5-25 90
550 (folyó) 310 24-35 12
2.6
TX-100 és fibrátok lebontása nagyhatékonyságú oxidációs módszerekkel
A nagyhatékonyságú oxidációs módszerek (AOP) olyan oxidatív reakciók alkalmazásán alapulnak, melyekben reaktív gyökök, főleg •OH gyökök reagálnak a szerves szennyezőkkel (3. táblázat). A kis szelektivitásnak és nagy reakciókészségnek köszönhetően sikeresen alkalmazhatók a szennyvízkezelés során. A módszerek célja a nagyobb hatékonyság elérése és a perzisztens anyagok biodegradálhatóságának javítása. 3. táblázat: Nagyhatékonyságú oxidációs módszerek és a keletkező reaktív részecskék AOP módszer
Reaktív részecskék •
OH, HO2•/O2•–, O3•–
O3, O3/UV, O3/H2O2
•
OH, HO2•/O2•– • OH • OH, H• TiO2* • OH, HO2•/O2•– • OH, H• • OH, HO2•/O2•– (eaq–, H•)
Fenton, H2O2/Fe2+ Foto-Fenton, H2O2/Fe2+/UV UV fotolízis Fotokatalízis, TiO2/hν, illetve TiO2/hν/O2 Elektrokémia Ultrahang Radiolízis
Az AOP technikák alkalmazhatóságát az alkifenol-polietoxilát típusú tenzidek és fibrát típusú koleszterinszint szabályzók lebontására már több tanulmány vizsgálta, a módszerek bomlási mechanizmusában (végtermékekben) azonban lényeges különbségek vannak. Nonilfenol-polietoxilát – TX-100 analóg – nemionos felületaktív anyag lebontásával és bomlástermékeinek azonosításával Karci és mtsai. foglalkoztak részletesebben [32]. A tenzidet H2O2/UV-C és foto-Fenton AOP módszerrel kezelték, a bomlástermékeket HPLC és HPLC-MS
készülékkel
azonosították.
Elsősorban
a
tenzid
polietoxilát
láncának
feldarabolódását, vagyis az átlagos polimerizációs fok csökkenését tapasztalták. Ezen kívül polietiléngliol és monokarboxil-polietilénglikol homológ sorok, formaldehid, ecetsav, hangyasav és oxálsav képződését figyelték meg (7. ábra). A Triton X-45 (átlagos etilénoxid szám: ~5) lebontását S2O82–/UV-C és H2O2/UV-C oxidatív módszerekkel Olmez-Hanci és mtsai. [33] vizsgálták, a bomlástermékeket szilárdfázisú mintaelőkészítés után GC-MS mérésekkel azonosították. Hasonló módon a polietoxilát lánc feldarabolódását és oktilfenol képződését figyelték meg, valamint polietilénglikol, mono- és dikarboxil-polietilénglikol homológsorokat azonosítottak (8. ábra).
13
7. ábra Karci és mtsai. által javasolt bomlási mechnaizmus [32]
Valdés-Díaz és mtsai. [34] a TX-100 bontását gammasugárzással végezték jóval a CMC fölötti koncentráción (16,0 mmol dm-3). Ezt a viszonylag tömény törzsoldatot sugárzással kezelték, majd ebből hígításokkal CMC méréshez megfelelő oldatsorozatot készítettek. Megfigyelték, hogy a CMC besugázás hatására a kezdeti érték ¼-ére csökken. A jelenséget dimerizálódással magyarázták, melyet MALDI-TOF méréssel támasztottak alá. Megfigyelték továbbá az etoxilát-lánc átlagos polimerizációfokának csökkenését is. Fibrátok (BF, CFA, GF) lebontását vizes közegben Razavi és mtsai. részletesen tanulmányozták [35]. Az oldatok pH-ját 5 mol dm-3 foszfát pufferel pH 7-re állították, impulzus radiolízissel a kinetikai méréseket, Cs-137 gamma-sugárforrással a degradációt, LC-MS mérésekkel pedig a keletkező termékek azonosítását végezték. A bomlástermékek között sikeresen azonosítottak ciklizált molekulákat is, azonban a fő termékek az aromás gyűrű egy vagy többszörösen hidroxilezett származékai voltak. A hidroxil gyök fibrátokkal való reakciójának sebességi állandói (k) összevethetőek a lebontások hatékonyságával. A hatékonyság a GF (k = 10,0 ± 0,6 × 109 dm3 mol-1 s-1), BF (k = 8,0 ± 0,22 × 109 dm3 mol-1 s-1), CFA (k = 6,98 ± 0,12 × 109 dm3 mol-1 s-1) sorrendben csökken.
14
8. ábra Olmez-Hanci és mtsai. által javasolt bomlási sor [33]
15
3
Célkitűzések
Munkám során vizsgálni kívántam a kevéssé vízoldható gyógyszerhatóanyagok (fibrát típusú koleszterinszint szabályozók) lebontását Co-60 gammasugárzással, vizes közegben. Az oldódás elősegítése érdekében Triton X-100 nemionos felületaktív anyagot használtam. A TX-100-at széles körben alkalmazzák a háztartásban és az iparban, ezért a szennyvizekben is gyakran és nagy mennyiségben előfordul, segítve ezzel az egyébként a szennyvíziszapban lerakódó szerves anyagok (vissza)oldódását. A TX-100 detergens, BF, CFA, és GF identikus oldatainak lebontásáról több-kevesebb adat található már az irodalomban [34, 35], ám ezek még kiegészítésre szorulnak. Valamint, legjobb tudomásom szerint micelláris közegben még senki nem tanulmányozta az említett gyógyszerhatóanyagok sugárzásos kezelés által indukált degradációját. A szolubilizációs kísérletek előtt célom volt a micelláris rendszer részletesebb tanulmányozása, a detergens lebonthatóságának vizsgálata ionizáló sugárzással. A lebontást TOC
(teljes
szerves
széntartalom),
KOI
(kémiai
oxigénigény),
HPLC-MS/MS
(nagyhatékonyságú folyadékkormatográf – tandem tömegspektrométer), valamint GC-MS (gázkromatográf – tömegspektrométer) mérésekkel kívántam nyomon követni. Ezen felül összehasonlítottam a lebontás hatékonyságát (G-értékeket) a kritikus micellakoncentráció (CMC) alatti és fölötti koncentrációkon, ilyen irányú kutatásra az irodalomban nem találtam példát. Meg kellett határoznom továbbá a CMC változását az elnyelt dózis függvényében, mivel a besugárzás során a micelláris oldat szolubilizációs képessége megváltozhat. A fibrátok lebontását célzó kísérletek elemzésére a HPLC-MS/MS analitikai módszer tűnt a legmegfelelőbbnek. A vízben viszonylag jól oldódó klofibrinsav degradációját nem micelláris közegben is lehet tanulmányozni. Az így kapott eredményeket összevetve a detergensek jelenlétében tapasztaltakkal, lehetőségem nyílhat a két eltérő rendszer közötti hasonlóságok, illetve különbségek megfigyelésére is.
16
4 4.1
Mérések leírása Felhasznált vegyszerek
Az oldatokat ELGA Option 4 típusú készülékkel tisztított vízzel készítettem. A BF, CFA és GF gyógyszerhatóanyagokat és a TX-100 detergenst a Sigma-Aldrich Kft-től vásároltuk. A HPLC-MS/MS mérésekhez eluensként a Fisher Chemicals cég acetonitril és víz (LC-MS tisztaságú) oldószereit használtam, az eluens pH-ját a Sigma-Aldrich Kft-től rendelt LC-MS tisztaságú hangyasavval állítottam be. A pH méréshez alkalmazott kalibráló oldatok Mettler Toledo termékek voltak. A
kémiai
oxigénigény
mérésekhez
szükséges
kálium-hidrogénftalátot,
kálium-
dikromátot, vas(II)-ammónium-szulfátot, 96%-os kénsavat, ferroin indikátor oldatot, higany(II)-szulfátot és ezüst-szulfátot a Molar Chemicals Kft-től szereztem be.
4.2
Folyamatos γ-besugárzás
Az általam készített híg vizes oldatok lebontásához folytonos γ-forrásként 10 kGy h-1 dózisteljesítményű Co-60 sugárforrással rendelkező SSL-01 panoráma típusú besugárzó berendezést használtam, melyet az Izotóp Intézet Kft. működtet. A besugárzótér 4×4 m2 alapterületű, az operátort többszintű biztonsági berendezésen kívül kb. 1 m vastag betonfalból épített alagútrendszer is védi. A sugárforrást használaton kívül vizes tárolóban tartják, melyet elektronikus vezérlőrendszer emel a besugárzótérbe, ahol előzetesen elhelyeztük a kezelni kívánt anyagokat. A berendezés kialakítása és a sugárvédelem 5 × 1015 Bq aktivitás használatát teszi lehetővé. Az aktivitást etanol-klórbenzol doziméterrel (ethanol-chlorobenzene dosimeter = ECB) határoztuk meg. Az ECB besugárzásakor a klórbenzolból lehasadó klóratom sósav formájában stabilizálódik. A képződő sósav mennyisége arányos az elnyelt dózissal, koncentrációja meghatározható titrálással, vas(III)-nitrát és Hg(SCN)2 hozzáadását követően spektrofotometriás módszerrel, vagy az általam használt nagyfrekvenciás vezetőképesség méréssel [36]. A doziméter oldatot 2 cm3 térfogatú leforrasztott üvegampullákban sugároztam be, majd ezt követően az ampulla felnyitása nélkül a vezetőképesség változását oszcillometriás módszerrel mértem. A mérésekhez használt oldatokat a besugárzás során 0,4 L min-1 áramlási sebességgel folyamatosan buborékoltattam levegővel, amit 0,22 µm pórusátmérőjű PTFE-szűrőn vezettem át. 17
4.3 A
Spektrofotometria spektrofotometriás
mérések
során
kétfényutas
JASCO
550
UV-látható
spektrofotométert alkalmaztam szükség szerint 1,0 és 0,1 cm-es fényúttal rendelkező kvarc küvettákkal. A TX-100 abszorpciós maximumai 223 és 276 nm-en találhatók. A 223 nm-en jelentkező sáv az etilén-oxid lánc n → σ* elektronátmenetéhez rendelhető, míg az aromás gyűrű π → π* elektrongerjesztése a 276 nm-es abszorpciós sávot hozza létre [37]. A spektrumokon jelenlévő 190-200 nm-en jelentkező fényelnyelés intenzitásával nem foglalkozom, mivel itt az oldószer n → σ* elektronátmenete értékelhetetlené teszi a spektrumot.
4.4
Végtermékek azonosítása
A TX-100 és a fibrátok bomlástermékeinek azonosítása kromatográf-tömegspektrométer csatolt technikák alkalmazásával történt.
4.4.1 HPLC-MS/MS A TX-100 és nem illékony ionizálható bomlástermékeit HPLC-MS/MS mérésekkel, pozitív ionizációs módban vizsgáltam (negatív módban termékek nem voltak azonosíthatók). A bomlástermékeket 2,1 mm × 100 mm-es Phenomenex Kinetex XB-C18 (2,6 µm szemcseméretű) kapilláris kolonnával ellátott Agilent 1200 folyadék kromatográffal választottam el. A mobil fázis gáztalanított 0,1% hangyasavas acetonitril és 0,1%-os hangyasavas víz volt. Az eluenseket 0,45 µm porozitású regenerált cellulóz (RC) szűrővel szűrtem. Az elválasztást 30 ºC-on 0,3 mL min-1 áramlási sebességgel végeztem gradiens elúcióval. Kezdetben 0%-ról 5 perc alatt 48%-ra vittem fel majd további 11 percig 48%-on tartottam az acetonitril mennyiségét. Eztán 5 perc alatt 75%-ra majd további 4 percen keresztül 90%-ra növeltem a szerves fázist. A kolonnát 10 percen keresztül 90%-os savas acetonitrillel mostam. A gradiens után az egyensúly beállása érdekében egységesen minden injektálás előtt 15 percig mostam a kolonnát. Továbbá, minden hatodik injektálás után azonos térfogatú desztillát vizet injektáltam a kolonna tisztítása és vakmérés elvégzése érdekében. Közvetlen az injektálások előtt három másodpercig metanollal mostam a tű külsejét, hasonlóan tisztítási célból. A komponensek azonosítása elektrospray ionforrással (ESI) felszerelt Agilent 6410B háromszoros kvadrupól tömegspektrométerrel történt. Az ionforrás paraméterei: pozitív ionizációs mód, 300 °C hőmérsékletű, 8 L min-1 áramlási sebességű szárító gáz, 15 psi porlasztó gáznyomás, 3000 V kapilláris feszültség, 90 V fragmentor 18
feszültség. A kvadrupol analizátor 600 ms-os pásztázási idővel 60-1000 m/z tartományt szkennelt. Az injektált mennyiség 0,1 mmol dm-3-es oldatok esetén 10 µL, az 1,0 mmol dm-3 és a szolubilizáláshoz használt 2,4 mmol dm-3 koncentrációjú TX-100 oldatok esetén 1 µL volt. A szolubilizált koleszterinszint szabályozó gyógyszerhatóanyagok vizsgálatára ugyanezt a módszert alkalmaztam, csak az ionizációs módot változtattam meg negatívra. Az injektált térfogat minden esetben 1 µL volt. A fent említett módszer a CFA híg vizes oldatának lebontásakor keletkező bomlástermékek vizsgálatának korábban kidolgozott módszerén alapszik. A kolonna, az eluensek, az áramlási sebesség stb. ugyanazok voltak. A gradiens elválasztás 10% hangyasavas acetonitril mennyiségről indult, mely 30 perc alatt 100%-ra növeltem, majd további 5 percig ezen a szinten tartottam. Végül a szerves fázis mennyiségét visszavittem a kezdeti értékre és az egyensúly beállása érdekében 8 percig mostam a kolonnát, melynek hőmérséklete 25 ºC-ra volt beállítva.
4.4.2 GC-MS A detergens bomlása során keletkező illékonyabb bomlástermékek elválasztására poláris polietilén-glikol állófázisú Phenomenex ZB-WaxPlus kapilláris kolonnával (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) felszerelt Shimadzu GCMS-QP2010Ultra gázkromatográf-tömegspektrométert használtam. A 6.0 tisztaságú hélium vivőgáz áramlási sebessége 1,7 mL min-1 volt. A 150 ºC hőmérsékletű injektorba, 10-es splitt-arány mellet 1 µL mintamennyiséget injektáltam. A megfelelő elválasztás érdekében hőmérséklet programot fejlesztettem ki. A 3 perces temperálást követő injektálás után még egy percig 70 ºC-on tartottam a hőmérsékletet, majd 15 ºC min-1 sebességgel 200 ºC-ra emeltem, melyet további 18 pecig tartottam. Az interfész és az elektronütközéses ionforrás (EI) hőmérsékletét egyaránt 250 ºC-ra állítottam. A kvadrupol analizátor 29-300 m/z tömegtartományt vizsgált 3333 m/z sec-1 sebességgel. Az EI ionforrásban az ionizációt kiváltó gyorsított elektronoknak 70 eV energiája volt. A mérés során minden mintát háromszor injektáltam. Vak mintaként az oldószert, azaz tisztított vizet használtam.
4.5
Kémiai oxigénigény meghatározása
A KOI mérések elvi alapja, hogy savas közegben erős oxidálószerrel majdnem minden szerves anyag oxidálható széndioxiddá, vízzé és ammóniává. A KOI érték azt az oxigén 19
mennyiséget fejezi ki, amely egységnyi térfogatú vízben levő oldott és szuszpendált szerves anyag oxidációjához szükséges. Tetszőleges szerves anyag oxidációját általánosan a (8) egyenlet mutatja be.
a b 3 a 3 Cn H a Ob N c n c O2 nCO2 c H 2 O cNH 3 4 2 4 2 2
(8)
Ha ismerjük a szerves molekula elemi összetételét, az egyenlet alapján elméleti KOI értéket számolhatunk. A munkám során Gerhardt Kjeldatherm típusú fűtőberendezést használtam, a méréseket az MSZ ISO 6060/1989 szabvány szerint végeztem. A módszer 30-700 mg/l KOI értékű minták mérésére megbízhatóan alkalmazható, töményebb minták esetén az oldatok hígítása szükséges. A mintát higany(II)-szulfát, tömény kénsavas oldatában ezüstkatalizátort és ismert mennyiségű kálium-dikromátot tartalmazó eleggyel 110 percig 148 ± 3 ºC-on forraltam, miközben a savas dikromát oldat oxidálta a szerves molekulákat. A visszamaradó káliumdikromátot
1-2
csepp
ferroin-indikátor
jelenlétében
vas(II)-ammónium-szulfáttal
visszatitráltam, az átcsapási pontban kékeszöldből vörösesbarnába ment át az oldat színe. A redukálódott kromát mennyisége alapján a szabvány szerint számoltam a KOI-értéket. Minden méréssorozat előtt meghatároztam a vas(II)-ammónium-szulfát oldat hatóértékét. A mérések során egy vak és egy kálium-hidrogén-ftalát referencia oldat mellet minden mintából két-két párhuzamost vizsgáltam. Ha a referencia oldat 500 mg L-1 KOI értékét minimum 95%-os pontossággal nem sikerült visszakapnom a mérést hibásnak tekintettem.
4.6
Teljes szerves széntartalom mérése
A TOC mérések elvi alapja, hogy a minta szerves (OC) és szervetlen (IC) széntartalma katalizátor segítségével magas hőmérsékleten szén-dioxiddá alakul át melynek mennyisége nem diszperzív infravörös detektorral (NDIR) pontosan meghatározható. A TOC méréseket Shimadzu TOC-L CSH típusú készülékkel végeztem. A TOC analizátor először a teljes széntartalmat (TC) méri, majd ezután a szervetlen széntartalmat, és a kettő különbségéből számolja a TOC értéket (TC - IC = TOC). A mérés bizonytalansága, a relatív standard szórás nem haladta meg az 1%-ot. Amennyiben ez mégis előfordult, a mérést megismételtem. A Pt katalizátorral töltött égetőtér 680 ºC hőmérsékleten alakította át a széntartalmat CO2dá, a vivőgáz (nagy tisztaságú szintetikus levegő) 150 mL min-1 térfogatárammal érkezett az égetőtérbe. Az analizátor minden minta esetén minimum három, maximum öt TC és IC mérés átlagából számolta ki a pontos TOC értéket. Az egyes méréssorozatok előtt az analizátort
20
kalibrálni kellett, mely általam készített ismert koncentrációjú TC és IC standard oldatok segítségével történt.
4.7
Felületi feszültség mérése
A méréseket 25,0 ± 0,5 °C-on végeztem az MTA TTK Anyag- és Környezetkémiai Intézet Határfelületek és Felületmódosítás Osztályán. A mérések előtt légkondicionálóval kb. 12-15 órán keresztül a labor hőmérsékletét is ~25 °C-ra állítottam. Az oldatok hőmérsékletét a mérések megkezdése előtt 20 percen át 25,0 °C-on termosztáttal állítottam be. A felületi feszültség méréseket Nima DST 9005 gyűrűs tenziométerrel végeztem. A platina gyűrű átmérője 20,5 mm, a platina huzal vastagsága 500 µm volt. A platina gyűrűt minden mérés előtt etanollal mostam, majd gázlángban vörös izzásig hevítettem, hogy a szerves szennyeződéseket biztosan eltávolítsam. A készüléket minden méréssorozat előtt 500,00 mg terhelésre és terhelés nélküli állapotára kalibráltam. A programozott bemerülés paraméterei a következők: bemerülési sebesség 10 mm min-1, bemerülési mélység 3 mm, kiemelés magassága 8 mm, bemerülés ismétlése 2-szer. Amennyiben a szoftver által kirajzolt két felületi feszültség - gyűrűmagasság (az oldat felszínéhez képest) görbe nem egyezett meg, addig mértem újra, amíg az egymást követő két görbe azonos nem volt.
5 5.1
Eredmények, értékelések és következtetések TX-100 UV-látható spektrofotometriai mérések
Híg vizes oldatokban a sugárzás hatására elsődlegesen a víz radiolízise következik be és a radiolízis során keletkező reaktív köztitermékek indítják a vízben oldott szerves anyagok lebontását. A nemionos detergensek abszorpciós elnyelésére a pH változás elhanyagolható mértékben hat, ezért ennek mérésére itt nem volt szükség. A 9. ábrán a különböző koncentrációjú, besugárzatlan TX-100 oldatok spektrumait ábrázolom, mely alapján az abszorpciós koefficiens értékeket számoltam ki a Bouguer-Lambert-Beer törtvény segítségével. Látható, hogy az etilén-oxid lánchoz rendelhető abszorpciós sáv intenzívebb, mint az aromás gyűrű fényelnyelése. Az elnyelési sávok moláris abszorpciós együtthatói a 223 nm-en 9900 dm3 mol-1 cm-1, míg 276 nm-en 1350 dm3 mol-1 cm-1.
21
A micellaképződés hatására egyik esetben sem tapasztaltam spektrális változást, az abszorpciós maximumok nem változtak. Kisebb hullámhosszon, töményebb oldatok esetén a fényelnyelés meghaladta a kettes abszorbanciát, azért a spektrum ezen része kissé torzult. Koncentráció -3 /mmol dm
Abszorbancia
3
0,07 0,10 0,15 0,20 0,30 0,50 1,00
2
1
0 200
250
300
350
Hullámhossz /nm 9. ábra Különböző koncentrációjú TX-100 oldatok abszorpciós spektruma 0,1 mmol dm-3 (CMC alatt) és 1,0 mmol dm-3 koncentráción (CMC fölött) is követtem a lebomlást (10. ábra), a hígabb oldat esetén 1,0, míg a töményebbnél 0,1 cm-es küvettát használtam, így egymással közvetlenül összevethető abszorbancia értékekhez jutottam. A diagram-párok összehasonlításával nyomon követhetjük mind a 223, mind a 276 nm-es abszorpciós maximumok változását. A detergens CMC értéke alatt lévő 0,1 mmol dm-3 koncentrációjú oldat lebomlását tanulmányozva megállapíthatjuk, hogy az aromás gyűrű már kis dózis hatására elbomlik. A CMC érték fölötti, 1,0 mmol dm-3 koncentráción az aromás jelleg (276 nm-es abszorpciós sáv) jóval tovább megmarad. Annak ellenére, hogy az elnyelt dózis értékeket a koncentráció növelésével egyenesen arányosan, azaz tízszeresére emeltem. A polietilén-oxid hidrofil oldallánchoz rendelhető abszorpciós sáv intenzitás csökkenésének mértéke szintén eltér a CMC alatti és fölötti koncentrációkon. Hígabb oldat esetén a 223 nm-es (etilén-oxid lánc n → σ* elektronátmenetéhez rendelhető) fényelnyelési sáv lebomlása valamivel hatékonyabb, mint ami az 1,0 mmol dm-3-es oldat esetén volt tapasztalható. Ennek oka feltételezhetően a micellákba rendeződött molekulák felületének nehezebb hozzáférhetőségében keresendő [38, 39].
22
2 Dózis /kGy 0,0 0,5 2,0 5,0 10,0
1
0
Abszorbancia
Abszorbancia
2
200
250
300
1
0
350
Dózis /kGy 0 5 20 50 100
200
Hullámhossz /nm
250
300
350
Hullámhossz /nm
10. ábra Különböző dózisokkal kezelt CMC alatti 0,1 mmol dm-3 (bal) és CMC fölötti 1,0 mmol dm-3 (jobb) koncentrációjú TX-100 oldatok UV-látható spektrumai
5.2
KOI, TOC és pH mérések
A kémiai oxigénigény, a teljes szerves széntartalom és a pH változását az elnyelt dózis függvényében szintén 0,1 és 1,0 mmol dm-3 koncentrációjú TX-100 oldatokon vizsgáltam. Mivel a besugárzás során keletkező hidroxilgyökök száma arányos a dózissal, ezért az összehasonlíthatóság miatt a koncentráció növelésével ebben az esetben is arányosan változtattam a dózist, vagyis tízszeres koncentráció esetén tízszeres dózist alkalmaztam. A KOI mérések eredményét bemutató 11. ábra minden pontja három párhuzamos mérés átlagát jelzi. A két eltérő koncentráción mért lebomlás jól korrelál egymással, azaz a lebontás hatékonysága közel azonosnak tekinthető. 25
Dózis /kGy 50 75
KOI 1,0 mmol dm-3 1000 KOI 0,1 mmol dm-3
KOI /mg dm-3
100
50
0
11.
100
500
0,0
2,5
5,0 7,5 Dózis /kGy
10,0
KOI /mg dm-3
0
0
ábra 0,1 mmol dm-3 és 1,0 mmol dm-3-es besugárzott TX-100 oldatok KOI értékei
23
A 0,1 mmol dm-3-es oldat kezdeti meredeksége azonban valamivel nagyobb az 1,0 mmol dm-3-es oldatnál tapasztalttal értékkel szemben. A görbék meredeksége, azaz a minta oxidálhatósága kis dózisoknál mindkét esetben nagyobb mértékű. A reakció előrehaladtával a görbék meredeksége, vagyis az oxidálhatóság is csökken. Ez annak tudható be, hogy a hidroxil gyökök hatására keletkező, egyre nagyobb mértékben oxidálódott molekulák (kis molekulájú szerves alkoholok, aldehidek, savak) a besugárzás során a vízből keletkező köztitermékekkel már nehezebben reagálnak tovább. Meg kell említenem, hogy a nagyobb dózisnál mért KOI értékek a hígabb oldat esetén (a mérési módszer szabvány szerinti alsó mérési határa kb. 30 mg dm-3) már némileg pontatlanok lehetnek. A 0,1 és 1,0 mmol dm-3 koncentrációjú sugárzással kezelt és a kezeletlen TX-100 oldatok TOC értékeit a 12. ábra mutatja (három mérés átlaga). Gamma sugárzás hatására a reaktív köztitermékek és a szerves molekulák reakciói során először kis moláris tömegű szerves savak aldehidek keletkeznek, melyek a további besugárzás során széndioxiddá és vízzé alakulnak (mineralizáció). Az alacsony forráspontú, illékony molekulák egy része a buborékoltatás során távozhatnak az oldatból. Mindkét esetben a széntartalom csökkenésével kell számolni.
0
25
Dózis /kGy 50 75
100
40
400 TOC 1,0 mmol dm TOC 0,1 mmol dm-3
30
300
20
200
10
100
0
0,0
2,5
5,0 7,5 Dózis /kGy
10,0
TOC /mg dm-3
TOC /mg dm-3
-3
0
12. ábra 0,1 és 1,0 mmol dm-3-es besugárzott TX-100 oldatok TOC értékei A TOC értékek eltérő koncentrációkon csak kis dózisok esetén korrelálnak, nagyobb dózisnál egyre inkább érvényesül az aggregálódott és nem aggregálódott detergens oldatok eltérő bomlási mechanizmusából fakadó különbség. Az irodalomból ismert, hogy CMC alatti 24
koncentráción a hidroxilgyök az aromás gyűrűvel tízszer gyorsabban reagál, mint az etilénoxid lánccal [40]. Feltételezzük viszont, hogy CMC fölötti koncentráción – ahogy az UV-látható spektrofotometriai mérésekből is látszik – az etilén-oxid lánc bomlásának intenzitása már összemérhető a micella belsejében nehezebben hozzáférhető, apoláris oktilfenol-csoportok degradációjával. A micella felületén lévő, poláris etoxilát-csoportok könnyebben támadhatóak a hidroxil gyökök számára, így az egyenes oldallánc is könnyebben hasad kisebb, illékonyabb darabokra. Ekkor a mineralizáció mértéke kissé növekszik és a TOC értékek meredekebben csökkennek a közölt dózis függvényében.
A KOI és TOC mérésekhez használt oldatok pH-jának változását is nyomon követtem a dózis függvényében (13. ábra). A nagyenergiájú gammasugárzás hatására mindkét vizsgált koncentráció esetén csökken a pH, amely a keletkező oxidált, savasabb jellegű molekuláknak köszönhető. Ezek az eleve nagyobb koncentrációjú 1,0 mmol dm-3-es oldatban nagyobb mennyiségben keletkezhetnek és dúsulhatnak fel, így némileg jobban savasítják az oldatot. Nagy dózison feltehetőleg azért nő a pH, mert az oldatból elbomlanak, esetleg a buborékoltatással elillannak a savas jelleget okozó, kis molekulatömegű molekulák. (Az ábrán a jobb áttekinthetőség miatt nem tűntettem fel, a 15-20 kGy-vel kezelt 0,1 mmol dm-3es oldat pH értékeit, melyek hasonlóan növekvő tendenciát mutatnak.) Ez utóbbi feltevés a TOC eredményekkel is alátámasztható, ahol a nagy dózissal besugárzott 1,0 mmol dm-3-es oldat szénvesztése azonos dózisok esetén nagyobb mértékű, mint a 0,1 mmol dm-3-es oldaté.
25
Dózis /kGy 50 75
pH 1,0 mmol dm-3 pH 0,1 mmol dm-3
5
pH
100
6
5
4
4
3
3 0,0
2,5
5,0 7,5 Dózis /kGy
pH
6
0
10,0
13. ábra 0,1 és 1,0 mmol dm-3-es besugárzott TX-100 oldatok pH értékei
25
5.3
Felületi feszültség mérések
Mivel a szolubilizált fibrátok lebontásának követése is célom volt, ezért meg kellett vizsgálnom, hogy mekkora dózison veszti el a detergens a szolubilizációs képességét. A lebontás során a detergens és a gyógyszerhatóanyag kémiai szerkezete is meg fog változni. Ekkor a detergens szolubilizációs képessége csökkeni fog (a TX-100 HLB-értéke alapján megjósolható, hogy már eleve viszonylag gyenge szolubilizációs képességgel rendelkezik). A nehezen oldódó gyógyszerhatóanyagok várhatóan átalakulnak vízben jobban oldódó, polárisabb bomlástermékekké. A detergens szerkezete is töredezik és már nem, vagy csak kisebb mértékben tud micellákat alkotni. A CMC változásának nyomon követésével a detergens szolubilizációs képességének megváltozásáról lehet információkat kapni. A gyakorlatban általános szokás, hogy a detergens kritikus micellaképződési koncentrációjának minimum négyszeresén végzik a szolubilizációs kísérleteket. Ezért a felületi feszültség mérések elsődleges célja volt, hogy meghatározzam a CMC változását a dózis függvényében. Ehhez különböző koncentrációjú TX-100 oldatok 0, 5, 10 és 20 kGy dózissal kezeltem majd Pt-gyűrűs dinamikus felületi feszültség mérővel követtem a felülteti feszültéségben tapasztalható változásokat. A CMC felett a felületi feszültség eltérő mértékben változik a koncentráció növelésével, mint CMC alatt. Ha a felületi feszültséget a koncentráció logaritmusának függvényében ábrázoljuk, akkor a töréspont előtti és utáni egyenes szakaszra illesztett egyenesek
Felületi feszültség /mN m-1
metszéspontjához tartozó koncentráció a CMC. tiszta víz
70
CMC Dózis -3 /mmol dm /kGy 0,23 0 0,39 5 0,47 10 0,60 20
60 50 40 30 -1,0
-0,5 0,0 0,5 -3 lg(CTX-100 /mmol dm )
1,0
14. ábra Különböző dózisokkal kezelt TX-100 oldatok felületi feszültség görbéi (fekete 0 kGy, piros 5 kGy, kék 10 kGy, zöld 20 kGy), és az egyes dózisokhoz tartozó CMC értékek.
26
A felületi feszültség méréseket egymástól független, két párhuzamos oldatsorozaton végeztem el, a mért értékek átlagai a 14. ábrán vannak feltüntetve. A 20 kGy dózissal kezelt 0,07 és 0,1 mmol dm-3, valamint a 10 kGy-vel besugárzott 0,07 mmol dm-3 koncentrációjú oldatok felületi feszültsége majdnem azonos a tiszta víz felületi feszültségével, mely a TOC és KOI eredményeket alátámasztó nagyfokú mineralizáció következménye. A 14. ábrán szereplő táblázat az illesztett egyenesek metszéspontjaihoz tartozó koncentrációkat jelöli, melyet a 15. ábrán diagram formájában is bemutatok. A TX-100 CMC-je az irodalmi adatok szerint 0,22-0,24 mmol dm-3 [20, 41]. Ezzel jó egyezést mutat az általam mért érték, mely 0,23 mmol dm-3-nak adódott. Kis dózis hatására a CMC nagymértékben változik, 10 kGy dózison kétszeresére, míg 20 kGy-n a kezdeti érték majdnem háromszorosára növekszik. A kezdetben tapasztalható nagyobb mértékű változást a TX-100 oldalláncok könnyebb feldarabolódásának tulajdonítom (kisebb dózisok esetén a TOC csökkenése is nagyobb mértékű). Ennek feltehetően matematikai statisztikai okai vannak, mivel az etilén-oxid láncok kezdetben nagyobb méretűek, ezért több támadási pontot biztosítanak a reaktív részecskékkel szemben. Később a méretük csökken, valamint az oldatban megjelennek a micellát nem képző bomlástermékek is. Ez utóbbi molekulák szintén reagálhatnak a reaktív részecskékkel,
csökkentve ezzel
a micellák lebontásának
hatékonyságát.
CMC /mmol dm-3
0,6 0,5 0,4 0,3 0
5
10 15 Dózis /kGy
20
15. ábra Kritikus micella koncentráció változása a dózis függvényében
Ahogy azt a 2.6 fejezetben már említettem, Valdés és mtsai. besugárzás hatására a CMC csökkenését tapasztalták [34]. Az eltérő tendencia valószínűleg azzal magyarázható, hogy én CMC-hez viszonylag közeli koncentrációjú oldatokat készítettem és azokat külön-külön 27
sugároztam be, míg Valdés és mtsai. egy tömény törzsoldatot készítettek és azt kezelték sugárzással. A micella magja gyakorlatilag nem tartalmaz vizet, ezért az ionizáló sugárzás hatására nem a víz radiolízise során képződő reaktív gyökök (pl. hidroxil gyök) keletkezésével kell számolnunk, hanem az egymáshoz közel lévő apoláris részek ionizálódnak, így dimerizáció léphet fel. Ezzel magyarázható a töményebb oldatok besugárzása esetén tapasztalt kismértékű felületi feszültség csökkenés is, mely a 14. ábrán figyelhető meg (tömény oldatok esetén a kezeletlen oldat felületi feszültség görbéje alatt helyezkednek el a sugárzással kezelt oldatok felületi feszültség értékei).
5.4
HPLC-MS mérések eredményei
A sugárzással kezelt oldatokban a TX-100 detergensből keletkező termékeket nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás elválasztás után tömegspektrométerrel detektáltam és próbáltam azonosítani. Célom volt, hogy az egy homológ sorba tartozó polimerek lehetőleg egy csúcsban eluálódjanak, lehetővé téve a TX-100 mennyiségi és a keletkező, eltérő retenciós időknél megjelenő termékek minőségi analízisét. Az általam használt és kifejlesztett kromatográfiás-tömegspektrometriás módszer paramétereit az 4.3.1 fejezetben tűntettem fel. A módszerfejlesztés során lehetőségem nyílt a TX-100 detergens legkisebb és legnagyobb polimerizációs fokú komponensének a meghatározására. A legrövidebb lánc egy, míg a leghosszabb 23 darab etilén-oxid csoportot tartalmaz (16. ábra).
7
Intenzitás
2x10
7
1x10
0
0
5
10
15
20
EOn
16. ábra Különböző számú etilén-oxid csoportot (EO) tartalmazó komponensek eloszlása a besugárzatlan oktilfenol-polietoxilát homológ sorban
28
A fordított fázisú elválasztás során a hosszabb etilén-oxid láncot tartalmazó molekula elulálódik először, az etilén-oxid homológ sor komponenseinek tömegkülönbségeit a monomer 44 Da tömege adja. A tömegspektrum legintenzívebb csúcsa a molekula nátriumion adduktjához [M+Na]+ rendelhető, kis intenzitással jelen van az egyszeresen protonált molekulaion [M+H]+ is. A 0,1 és 1,0 mmol dm-3-es oldatok teljes ionkromatogramjai a 17. ábrán vannak feltüntetve. A keletkező termékek mindkét esetben azonosak voltak, különbség csak a csúcsok intenzitásában volt tapasztalható. A 21-23 percig eluálódó homlóg sor (csúcsmaximuma 21,33 percnél található) a TX-100-hoz rendelhető, mely különböző polimerizáció fokú oktilfenol-polietoxilát egységeket tartalmaz.
1,0x105 5,0x104
Intenzitás
1,5x105
0
5
10
15
20
25
Dó z
7,5
is
/kG y
0,0 1,0 2,0 3,0 5,0 10,0 30
1,0x106 5,0x105
Intenzitás
1,5x106
75 0
5
10
15
20
25
30
zis
Dó
50
/kG
y
0,0 10 20 30
100
Idő /min
17. ábra 0,1 (felső) és 1,0 mmol dm-3-es (alsó), különböző dózisokkal kezelt TX-100 oldatok kromatogramjai 29
A besugárzatlan oldat kromatogramjában – a 1,0 mmol dm-3-es oldat esetén szembetűnőbben – nem oktilfenol alapú komponensek is észrevehetők. A 14-16 percig eluálódó homológ sor (csúcsmaximuma 14,85 percnél található) egy és kétszeresen ionizált tömegeket is tartalmaz, feltételezhetően a TX-100 redukált formája, mely a gyártás melléktermékeként van jelen a detergensben. A bomlástermékek legnagyobb hozamban a 0,5 kGy (0,1 mmol dm-3) illetve az 5,0 kGy (1,0 mmol dm-3) dózissal besugárzott oldatok esetén jelentek meg. A 6-8 percig eluálódó homológ sor (csúcsmaximuma 7,48 percnél található) a detergensben is jelenlévő polietilénglikolhoz (bomlástermék jelölése: A) rendelhető. A kromatogramon 6-10 perces intervallumban átfedve eluálódnak a különböző mértékben oxidálódott polietilén-glikol homológ sorok (bomlástermékek jelölése: B, C, D, E) A 17-19 perc retenciós idejű homológ sor (csúcsmaximuma 18,07 percnél található) nátrium-ion adduktjai és az oktilfenol-polietoxilát nátrium-ion adduktjai között 2 Da a tömegkülönbség (bomlástermék jelölése: F). Az etilén-oxid láncvégi szénatomjához hidrogén absztrakció után egy hidroxil gyök kapcsolódik. Az így képződött geminális diol vízkilépéssel stabilizálódik, termékkén aldehid-csoport marad vissza. A besugárzás során az oktilfenol-polietoxilátnál apolárisabb (nagyobb retenciós idejű) termékek is keletkeznek. A homológ sor retenciós ideje 23-25 perc, csúcsmaximuma 24,54 percnél található. Az oktilfenol-potiletoxilát homológ sor nátrium-ion adduktjai és feltételezhetően az oktilfenil-etoxi-etiléter homológ sor (bomlástermék jelölése: G) nátrium-ion adduktjai között 18 Da tömegkülönbség található, mely víz kilépéssel magyarázható. A CMC fölötti koncentráción a termék nagyobb hozammal keletkezik, mely az etoxilánc oldószer irányába mutató orientációjával magyarázható. A termékek feltételezett szerkezeti képletit a 18. ábrán foglaltam össze.
18. ábra HPLC-MS segítségével azonosított bomlástermékek feltételezett szerkezeti képletei
30
A különböző dózissal besugárzott TX-100 oldatok oktilfenol-polietoxilát (21-23 perc) csúcsaihoz köthető területeket integrálva és a 0 kGy dózist 100%-nak véve, a 19. ábrán feltüntetett lebomlási görbét kapjuk. Látható, hogy a 0,1 és 1,0 mmol dm-3-es oldatok lebomlási görbéje nagyon hasonló, azaz a TX-100 lebontásának hatékonysága közel azonos a két koncentráción.
Relatív koncentráció
100
0
25
50
75
100
75 50 0,1 mmol dm-3 1,0 mmol dm-3
25 0 0,0
2,5
5,0
7,5
10,0
Dózis /kGy
19. ábra 0,1 és 1,0 mmol dm-3 koncentrációjú TX-100 oldatok lebomlási görbéje A lebontás hatékonyságát számszerűsíthetjük is. Kellően kis dózison elhanyagolható mennyiségben keletkeznek bomlástermékek így a reaktív részecskék gyakorlatilag csak a feleslegben lévő kiindulási anyag molekuláival reagálnak. Ekkor a dózis függvényében a lebomlás lineárisan változik. Ennek a lineáris szakasznak a meredeksége pedig egységnyi dózis hatására lebomló molekula mennyiségét, azaz a G-értet adja meg (2.2 fejezet). A 20. ábrán a különböző koncentrációkon meghatározott G-értékek, vagyis az 1 Joule hatására lebomló oktilfenol-polietoxilát mennyiségek vannak feltüntetve. Kis koncentráción (CMC alatt) kezdetben 0,1 mmol dm-3-ig nő a G-érték, mivel egyre nagyobb a valószínűsége hogy egy identikus molekula reagáljon a keletkezett hidroxil gyökökkel. A CMC közelében, de még mindig kissé alatta már kismértékű asszociáció figyelhető meg. A koncentrációt növelve egyre jobban érvényesül az ún. „pajzs” hatás, mely a CMC-n a legszembetűnőbb. A CMC fölötti koncentráción, ahol az identikus molekulák micella formájában asszociálódnak a koncentráció növelésével újra nőni kezd az átalakulás hozama. A növekedés a micella „pajzs” hatásának köszönhetően már nem olyan meredeken, mint az a CMC alatti, emelkedő szakaszban volt megfigyelhető. 31
G-érték /mol J-1
0,4
0,3
0,2
0,1
0 0,25
1
2
3
4
Koncentráció /mmol dm-3
20. ábra Különböző koncentráción meghatározott G-értékek A CMC közelében lévő minimum pont két oldalán lévő szakaszra manuálisan egyenest illesztettem. A két egyenes metszéspontjához tartozó koncentráció érték ~0,25 mmol dm-3, mely nagyon jól közelíti a tenziométerrel mért CMC értéket (0,23 mmol dm-3). Az általam megadott 0,25 mmol dm-3 érték a manuális illesztés és a szükségesnél kevesebb adatpont miatt csak tájékoztató jellegű adat. Igazolására további mérések lennének szükségesek.
5.5
GC-MS mérések eredményei
A TX-100 lebontása során keletkező illékonyabb bomlástermékek minőségi analízisét GC-MS méréssel végeztem. A mérések paraméterei a 4.4.2 fejezetben találhatók. A 21. ábrán példaként az 1,0 mmol dm-3 koncentrációjú 10 kGy dózissal kezelt TX-100 oldat kromatogramját – a rosszul látható termékcsúcsokat kinagyítva – mutatom be. Az elválasztás során összesen 18 terméket sikerült detektálni. A mérések valójában 30 percesek voltak azonban a jobb áttekinthetőség kedvéért a kromatogram végét nem ábrázoltam, komponens ebben a tartományban nem eluálódott. Továbbá az első és második csúcs az injektálásból származó zaj miatt csak akkor válik jól láthatóvá, ha a vak mérésből származó kromatogramot kivontam a minta kromatogramjából. Ezzel a művelettel a hőmérsékletnövelésből származó alapvonal emelkedés is eltűnt, az alapvonal a nulla érték közelében maradt.
32
6 10
6,0x105
Intenzitás
9
4,0x105
9,6 9,8
1
2,0x10
11
5
5 2
1,4 1,6
3 4
0,0 0
14
8
5
7
15
16 17 18
10 15 20 Retenciós idő /min
25
1213
21. ábra 1,0 mmol dm-3 koncentrációjú 10 kGy dózissal kezelt TX-100 oldat illékony komponenseinek GC-MS kromatogramja A kolonnatér 200 ºC-os hőmérsékletéhez képest alacsonyabb hőmérsékletű (150 ºC) injektálásnak köszönhetően nem szennyeztem el az oszlopot. A kevésbé illékony komponensek ezért nem kerültek rá az oszlopra, így ezeket nem is láthatjuk a kromatogramon. A 70 eV-os EI ionizációnak köszönhetően a tömegspektrumok visszafejtését a NIST 5.0 adatbázisa alapján végeztem, azonban az esetek nagy részében az adatbázist csak támpontként
tudtam
felhasználni.
A
termékcsúcsokhoz
tartozó
feltételezett
molekulaszerkezeteket a 22. ábrán mutatom be.
22. ábra GC-MS-sel mért bomlástermékek feltételezett szerkezeti képletei
A 8, 12, 13 számú csúcsokhoz nem sikerült molekulaszerkezeteket társítani. Nagyobb dózissal kezelt oldatokban elnyúlt (erősen „tailinges”) csúcsként az ecetsav és a hangyasav is 33
megjelent. Ezeknek, a kisméretű, savas karakterű anyagoknak a megfelelő elválasztására az általam használt kolonna nem alkalmas az állófázissal kialakuló, túlzottan erős kölcsönhatás miatt. Egyes savkomponenseket (pl. oxálsav) valószínűleg azért nem tudtam azonosítani, mivel ezek az alkalmazott hőmérséklettartományban elbomlanak. Származékképzéssel valószínűleg ezeket is azonosítni lehetett volna, azonban erre idő hiányában már nem került sor. A HPLC-MS/MS és GC-MS mérésekkel azonosított bomlástermékek alapján a 23. ábrán mutatom be a TX-100 feltételezet bomlási mechanizmusát. Az aceton, metanol, hangyasav és ecetsav szinte bármely molekula továbbomlásából származhat, ezért ezeket nem tüntettem fel az ábrán.
23. ábra TX-100 nemionos detergens feltételezett bomlási mechanizmusa
5.6
CFA lebontása vizes közegben [42]
CFA radiolitikus lebomlását híg vizes oldatban detergens jelenléte nélkül is tanulmányoztam különböző körülményeken. Mivel az oldhatóság jelentős mértékben függ a kémhatástól, ezért 4-es és 8-as pH-n végzett lebontást részletesen is vizsgáltam. A kémhatás beállítására 1 mol dm-3-es nátrium-hidroxid és sósav oldatokat használtam (puffer használata radiolízis során nem ajánlott, mivel mellékreakciókat okozhat). Azt találtam, hogy a két különböző pH-n közel azonos a lebontás hatékonysága, azonban a bomlástermékek eltérő hozammal keletkeznek (24. ábra).
34
Intenzitás
5
A
5
1,0x10
1,0x10
CFA
B
CFA
P2
4
4
5,0x10
5,0x10
P4 P6
P2 P3 P7
0,0
0
P5 P7 P4
5
P6
10
P1
15
20
P7 P3 P5
0,0 0
5
Idő /min
10
15
20
Idő /min
24. ábra 2 kGy dózissal besugárzott 0,5 mmol dm-3 koncentrációjú CFA oldat HPLC-MS kromatogramja pH 4 (A) és pH 8 (B) A legnagyobb különbség a P3 és P4 termékek esetében tapasztalható. Nagyon valószínű, hogy savas pH-n a HO2• hatására P3 keletkezik, míg nagyobb pH-n az O2–• hatására inkább P4. Látszik továbbá, hogy az oldat kémhatása minden termék keletkezésére kisebb-nagyobb mértékkel hatással van. LC-MS/MS készülékkel végzett méréseim során hasonló bomlástermékeket találtam, mint Razavi és mtsai. [35]. A bomlástermékek szerkezetét és a CFA feltételezett bomlási mechanizmusát a 25. ábrán mutatom be [42].
25. ábra CFA lebontása során azonosított bomlástermékek molekulaszerkezete, és a feltételezett bomlási mechanizmus
35
5.7
Fibrátok lebontása micelláris közegben
A gyógyszerhatóanyagok oldatba vitele előtt meg kellett határoznom a TX-100 detergens minimális koncentrációját, ahol besugárzás hatására növekvő CMC érték a maximálisan alkalmazott, 20 kGy dózis esetén is a minimális, négyszeres CMC értéken marad. Mivel 20 kGy dózison a CMC 0,60 mmol dm-3, ezért a kezdeti koncentrációt 2,4 mmol dm-3-nek választottam. A szolubilizációs lebontási kísérletek megkezdése előtt megvizsgáltam a mintaelőkészítés szükségességét. A vizsgált gyógyszerhatóanyagok mindegyike karboxilcsoportot tartalmaz, így ESI ionforrással negatív ionizációs módban ionizálhatók. Mivel a TX-100 pozitív ionizációs módban ionizálható, a gyógyszerhatóanyagok lebontása LC-MS méréssel jól követhető. Tehát a gyógyszerhatóanyagok lebontásának vizsgálatához így nem kellett sem külön mintaelőkészítési, sem új mérési módszert kifejlesztenem. A mérésekhez a TX-100 vizsgálatához használt módszert alkalmaztam, csupán az ionizációs módot kellett megváltoztatnom. A BF retenciós ideje 10,26 min, a CFA-é 10,06 min, míg a GF 16,37 min volt. A besugárzáshoz 0,1 mmol dm-3 gyógyszerhatóanyag és 2,4 mmol dm-3 TX-100 koncentrációjú oldatokat készítettem. Az oldódás érdekében minden oldatot 48 órán keresztül fénytől elzárt helyen kevertettem 40 ºC hőmérsékleten. Az oldatok hatóanyag tartalmát egy 0,1 mmol dm-3-es metanolban készített standarddal hasonlítottam össze, az oldódás minden esetben teljes mértékűnek bizonyult. Az így elkészített oldatok gyógyszerhatóanyag tartalmának csökkenését a 26. ábrán mutatom be.
Relatív koncentráció
100 CFA + TX-100 GF + TX-100 BF + TX-100 CFA TX-100
50
0
0
10
20
Dózis /kGy
26. ábra Szolubilizált gyógyszerhatóanyagok, valamint a CFA és TX-100 degradációs görbéi a dózis függvényében 36
A megközelítőleg 5,0 kGy dózissal besugárzott oldatok esetén opálosodást (UV-látható spektrumokban alapvonal emelkedést) figyeltem meg, mely a detergens szolubilizációs képességének az elvesztését jelenti. A narancssárga TX-100 lebomlási görbe alapján megállapíthatjuk, hogy 5,0 kGy dózison a detergens kevesebb, mint 40%-a bomlott el. A megmaradt detergens nem tudja oldatban tartani a keletkező vízben rosszul oldódó bomlástermékek és a gyógyszerhatóanyagokat, ezért a kolloid részecskék mérete megnő, így durva diszperz rendszer alakul ki. Megjegyezném, hogy az oldat zavarosodása nem befolyásolta a lebontás mértékét, mely más AOP módszerek alkalmazása (pl. UV fotolízis) esetén jelentősen megváltoztathatja a lebontás hatékonyságát. A zöld színű CFA lebomlást ábrázoló görbét detergens jelenléte nélkül kaptam, míg a fekete színű görbét detergens jelenlétében. A CFA lebontásának hatékonysága a vizsgált két esetben jelentősen eltér, TX-100 jelenlétben a bomlás mértéke kisebb, mint detergens jelenlét nélkül. Ez a micella „pajzs” hatásának és a TX-100 nagy koncentrációjának köszönhető. Meg kell azonban említenem, hogy a CFA még így is viszonylag hatékonyan bontható, annak ellenére, hogy a detergenst lényegesen nagyobb feleslegben alkalmazam. Ezért feltételezem, hogy a hidroxil gyök a CFA-t hatékonyabban bontja, mint a TX-100-at (Jobb összevethetőségre adott volna módot a reakciósebességi állandók összevetése. Azonban, a TX-100 reakciósebességi állandójáról nem találtam irodalmi adatot. Valószínűleg, ez annak tudható
be,
hogy
a
reakciósebességi
állandó
mérése
a
TX-100
polidiszperz
molekulaszerkezete miatt nehézségekbe ütközne). A detergens jelenlétében vizsgált BF, CFA és GF bomlási görbéi között is eltérések figyelhetők meg. A bomlások hatékonyságai összevethetők a hidroxil gyök fibrátokkal való reakciójának sebességi állandóival (2.6 fejezet) [34]. A GF bomlik a legintenzívebben, feltételezhetően az aromás gyűrűn lévő elektronküldő metil-csoportnak köszönhetően. A BF bomlásának hatékonysága a két aromás gyűrű ellenére kissé alacsonyabb mértékű. Ennek feltételezhetően az oka, hogy a gyűrűhöz elektronszívó klór- és amidkarbonil-csoportok kapcsolódnak. A CFA esetén tapasztaltuk a legkisebb mértékű lebomlást, itt az aromás gyűrűhöz elektronszívó klór-csoport kapcsolódik. Amennyiben detergens is volt az oldatban, úgy gyógyszerhatóanyagokból származtatható termékeket egyik esetben sem sikerült detektálni. Ennek oka valószínűleg abban keresendő, hogy az egyszerre csak kis mennyiségben keletkező és jelenlévő termékek dinamikusan tovább bomlanak, nem tudnak feldúsulni a reakcióelegyben.
37
6
Összefoglalás
Munkám során Triton X-100 nemionos detergens és szolubilizált fibrát típusú koleszterinszint szabályozó gyógyszerhatóanyagok (bezafibrát, klofibrinsav, gemfibrozil) vizes oldatait nagyenergiájú ionizáló sugárzással (Co-60 γ-sugárforrás) bontottam. A klofibrinsav esetén lehetőségem adódott detergens jelenléte nélkül is tanulmányozni a lebontást. A TX-100 lebontását KOI, TOC és pH mérésekkel követtem, HPLC-MS/MS és GC-MS módszerfejlesztések után a keletkező bomlástermékeket molekulaszerkezetére javaslatot tettem. A felületi feszültség változását is nyomon követtem, így megfigyelhettem, hogy a detergens asszociációs hajlama csökken a besugárzás során. Ezt az irodalomtól eltérő eredményt a detergens különböző koncentrációjával (eltérő bomlásmechanizmussal) indokoltam. A degradációs hatékonyság koncentrációtól való függésének vizsgálatakor töréspontot figyeltem meg, mely feltételezhetően a micellaképződéssel hozható összefüggésbe. A töréspont jól közelítette a felületi feszültség mérésekből kapott és az irodalomban leírt CMC értéket. A detergens bomlásából származó bomlástermékek feltételezett molekulaszerkezetei alapján javaslatot tettem a bomlási mechanizmusra. A CFA lebomlását TX-100 jelenléte nélkül részletesen is tanulmányoztam, a termékek molekulaszerkezetei alapján ebben az esetben is javaslatot tettem a bomlási mechanizmusra. A CFA lebontását célzó kísérleti eredményekből tudományos publikáció jelent meg. TX-100 detergenssel szolubilizált fibrátok besugárzása során megállapítottam, hogy lényegesen alacsonyabb a lebontás mértéke, mint detergens jelenléte nélkül, de a lebontás még így is meglehetősen hatékonynak tekinthető. Ezért feltételezhető, hogy a hidroxil gyök lényegesen hatékonyabban bontja a fibrátokat, mint a jóval nagyobb koncentrációban jelenlévő TX-100-at. Ebben az esetben CFA-tól és más gyógyszerhatóanyagoktól származó bomlástermékeket nem találtam. Továbbá megfigyeltem, hogy az oldat zavarosodását követően a lebontás hatékonysága nem változott.
38
7
Irodalomjegyzék
[1]
Wojnárovits L., Sugárkémia, Akadémiai Kiadó, Budapest, 17-18 (2007)
[2]
Le Caer S., Water, 3, 235-253 (2011)
[3]
Wojnárovits L., Sugárkémia, Akadémiai Kiadó, Budapest, 91-94 (2007)
[4]
Wojnárovits L., Sugárkémia, Akadémiai Kiadó, Budapest, 54-55 (2007)
[5]
Swallow A. J., Radiation Chemistry, Longman Goup Limited, London, 40-45 (1973)
[6]
C. von Sonntag, The Chemical Basis of Radiation Biology, Taylor & Francis, London, 31-34 (1987)
[7]
Edser C., Focus on Surfactants, 11, 1-2 (2008)
[8]
Szymaniec J., Zimecki M., Wieczorek Z., International Archives of Allergy and Immunology, 63, 88-96 (1980)
[9]
Swisher R. D., Surfactant effect on Humanns and Other Mammals, The Soap and Detergent Association, New York, 5 (1966)
[10]
Swisher R. D., Surfactant effect on Humanns and Other Mammals, The Soap and Detergent Association, New York, 2-19 (1966)
[11]
Hunter R. J., Foundations of colloid science, Clarendon Press, Oxford, 17-20 (1993)
[12]
Ganguli A. K., Ganguly A., Vaidya S., Chemical Society Reviews, 39, 474-485 (2010)
[13]
Hunter R. J., Foundations of colloid science, Clarendon Press, Oxford, 565-574 (1993)
[14]
Griffin W. C., Journal of the Society of Cosmetic Chemists, 5, 249-256 (1954)
[15]
Szántó F., A kolloidkémia alapjai, Gondolat, Budapest, 268-269 (1987)
[16]
Aniansson E. A. G., Journal of Physical Chemirty, 82, 2805-2808 (1978)
[18]
Paradies H. H., Journal of Physical Chemistry, 84, 599-607 (1980)
[19]
Patel V., Ray D., Aswal K. V., Bahadur P., Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 450, 106-114 (2014)
[20]
Sigma, Product information
[21]
DOW, Product information
[22]
Chen H. J., Tseng D. H., Huang S. L., Bioresource Technology, 96, 1483-1491 (2005)
[23]
Okpokwasili G. C., Olisa A. O., Water Research, 25, 1425-1429 (1991)
[24]
Mohan P. K., Nakhla G., Yanful E. K., Water Research, 40, 533-540 (2006)
[25]
Petrovic M., Gehringer P., Eschweiler H., Barceló D., Chemosphere, 66, 114-122 (2007)
[26]
Anatomical Therapeutic Chemical (ATC) Classification System, ATC C10AB
[27]
ALOGPS 2.1 szoftver
39
[28]
Zenker A., Cicero M. R., Presinaci F., Bottoni P., Carere M., Journal of Encironmental Managment, 133, 378-387 (2014)
[29]
Mimeault C., Woodhause A. J., Miao X.-S., Metcalfe C. D., Moon T. W., Trudeau V. L., Aquatic Toxicology, 73, 44-54 (2005)
[30]
Rosal R., Boltes K., Leganés F., Environmental Science and Pollution Research, 17, 135-144 (2010)
[31]
Hernando M. D., Agüera A., Fernández-Alba A. R., Analytical and Bioanalytical Chemistry, 387, 1269-1285 (2007)
[32]
Karci A., Arsal-Alton I., Bekbolet M., Ozhan G., Alpertunga B., Chemical Engineering Journal, 241, 43-51 (2014)
[33]
Olmez-Hanci T., Arsal-Alton I., Genc B., Chemical Engineering Journal, 239, 332340 (2014)
[34]
Valdés-Díaz G., Rodrígez-Calvao S., Pérez-Gramatges A., Rapado-Paneque M., Fernandez-Lima F. A., Ponciano C. R., da Silveira E. F., Journal of Colloid and Interface Science, 311, 253-261, (2007)
[35]
Razavi B., Song W., Cooper W. J., Greaves J., Jeong J., Journal of Physical Chemistry, 113, 1287-1294 (2009)
[36]
Kovács A., Miller A., Radiation Physics and Chemistry, 36, 709-713 (1990)
[37]
Zhang J., Zhang P., Ma K., Han F., Chen G., Wei X., Science in China Series B: Chemistry, 51, 420-426 (2008)
[38]
Bansal K. M., Patterson L. K., International Journal for Radiation Physics and Chemistry, 3, 321-331 (1971)
[39]
Gebicki J. M., Allen A. O., Journal of Physical Chemistry, 73, 2443-2445 (1969)
[40]
Pelizzetti E., Minero C., Maurino V., Sciafani A., Hidaka H., Serpone N., Environment Science and Technology, 23, 1380-1385 (1989)
[41]
Tiller G. E., Mueller T. J., Docker M. E., Sturve W. G., Analytical Biochemistry, 141, 262-266, (1984)
[42]
Csay T., Rácz G., Salik Á., Takács E., Wojnárovits L., Radiation Physics and Chemistry, 102, 72-78 (2014)
40
