Kiterjedt-spektrumú -laktamázt (ESBL) termelő Enterobacteriaceae törzsek genetikai vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés Tóth Ákos Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Füzi Miklós, Dokt. Habil., egyetemi docens Hivatalos bírálók: Dr. Borsodi Andrea, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Ongrádi József, egyetemi docens, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Ludwig Endre, egyetemi tanár, Ph.D. Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Rókusz László, osztályvezető főorvos, Ph.D. Prof. Dr. Pénzes István, egyetemi tanár, MTA doktora
Budapest 2010
1. TARTALOMJEGYZÉK 1. TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 2 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ........................................................................................ 5 3. BEVEZETÉS ................................................................................................................. 8 3.1. Történeti áttekintés ................................................................................................. 8 3.2. -laktám antibiotikumok ........................................................................................ 9 3.2.1. Szerkezeti felépítés .......................................................................................... 9 3.2.2. -laktám anitbiotikumok hatásmechanizmusa .............................................. 10 3.2.3. -laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia mechanizmusok ........... 12 3.3. -laktamázok ........................................................................................................ 16 3.3.1. -laktamázok osztályozása ............................................................................ 17 3.3.2. Szerin-típusú -laktamázok előfordulása Enterobacteriaceae törzsekben ... 20 3.3.2.1. AmpC-típusú -laktamázok ................................................................... 22 3.3.2.2. OXA -laktamázok................................................................................. 23 3.4. Kiterjedt-spektrumú -laktamázok (ESBL) ......................................................... 24 3.4.1. Kiterjedt-spektrumú -laktamázok definíciója.............................................. 24 3.4.2. SHV-típusú ESBL-k ...................................................................................... 26 3.4.3. TEM-típusú ESBL-k...................................................................................... 27 3.4.4. CTX-M-típusú ESBL-k ................................................................................. 28 3.4.5. Ritka ESBL-ek ............................................................................................... 32 3.5. Kiterjedt-spektrumú -laktamáz termelésének kimutatása .................................. 32 3.5.1. ESBL-termelés kimutatása fenotípusos módszerekkel.................................. 33 3.5.2. ESBL-kódoló gének kimutatása molekuláris módszerekkel ......................... 39 3.6. ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek első hazai leírásai ............................ 40 3.7. ESBL-termelő törzsek más antibiotikum csoportokkal szembeni rezisztenciája . 42 3.7.1. Fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia ................................................... 42 3.7.2. Aminoglikozidokkal szembeni rezisztencia .................................................. 43 4. CÉLKITŰZÉSEK ........................................................................................................ 45 5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .................................................................................. 47 5.1. Baktérium törzsek ................................................................................................. 47 5.2. Baktériumtörzsek fenotípusos vizsgálata ............................................................. 49 2
5.2.1. Törzsek identifikálása és szerotípus meghatározás ....................................... 49 5.2.2. Antibiotikum rezisztencia vizsgálatok .......................................................... 50 5.2.2.1. Szűrő vizsgálatok.................................................................................... 50 5.2.2.2. Korongdiffúziós vizsgálatok................................................................... 50 5.2.2.3. Minimális inhibitor koncentráció (MIC) meghatározása ....................... 51 5.3. Molekuláris vizsgálatok........................................................................................ 51 5.3.1. Polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction – PCR) .......................... 51 5.3.2. PCR-RFLP (Restrikciós fragment hossz polimorfizmus) vizsgálat .............. 55 5.3.3. Escherichia coli törzsek filogenetikai csoportjának meghatározása multiplex PCR-el ..................................................................................................................... 56 5.3.4. ESBL-termelő Escherichia coli ST131 törzsek kimutatása multiplex PCR-el56 5.3.5. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek kinolon rezisztenciát meghatározó régióinak (QRDR) vizsgálata .................................................................................. 57 5.3.6. Enterobacteriaceae törzsek makrorestrikciós profiljának meghatározása PFGE módszerrel ..................................................................................................... 57 5.3.7. CTX-M-termelő Klebsiella pneumoniae törzsek szekvencia típus meghatározása MLST módszerrel ........................................................................... 58 5.3.8. Plazmid profil analízis, konjugációs és elektroporációs kísérletek ............... 59 6. EREDMÉNYEK.......................................................................................................... 61 6.1. SHV-típusú kiterjedt-spektrumú -laktamázok elterjedtsége és földrajzi megoszlása Magyarországon, 2002-2003.................................................................... 61 6.2. Perinatális intenzív centrumokban járványokat okozó SHV-típusú ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsek vizsgálata ................................................................................ 64 6.3. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata ............................................. 69 6.4. ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata, 2000-2004 ..................... 78 6.5. 2006-2007-ben humán és állati mintákból izolált ESBL-termelő Escherichia coli törzsek molekuláris epidemiológiai jellemzése ........................................................... 82 6.6. ESBL-termelő Gram-negatív baktériumok okozta nozokómiális járvány kivizsgálása koraszülött osztályon epidemiológiai és mikrobiológiai módszerekkel . 89 7. MEGBESZÉLÉS ......................................................................................................... 93 7.1. SHV-típusú ESBL-gének előfordulása Magyarországon ..................................... 94 7.1.1. SHV-típusú ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok vizsgálata ..... 95
3
7.2. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata ............................................. 97 7.3. ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata, 2000-2004. .................. 102 7.4. ESBL-termelő Escherichia coli törzsek vizsgálata, 2006-2007 ......................... 104 7.5. Molekuláris genetikai módszerek alkalmazása egy járvány epidemiológiai kivizsgálásában .......................................................................................................... 111 8. ZÁRÓKÖVETKEZTÉSEK, ÚJ EREDMÉNYEK ................................................... 112 8.1. SHV-típusú ESBL gének előfordulása Magyarországon, 2002-2003 ................ 113 8.2. ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok jellemzése.............................. 113 8.3. ESBL-termelő S. enterica törzsek vizsgálata, 2000-2004 .................................. 114 8.4. ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata, 2006-2007......................................... 114 9. ÖSSZEFOGLALÁS .................................................................................................. 115 10. SUMMARY ............................................................................................................ 117 11. IRODALOMJEGYZÉK .......................................................................................... 119 12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE .................................................................... 142 12.1. A disszertációval kapcsolatos publikációk jegyzéke ........................................ 142 12.2. A disszertáció témájához kapcsolodó előadások jegyzéke............................... 143 12.3. A disszertáció témájához nem kapcsolodó publikációk jegyzéke .................... 146 12.4. A disszertáció témájához nem kapcsolodó előadások jegyzéke ....................... 150 13. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS ................................................................................. 155
4
2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AAC
Aminoglikozid-acil-transzferáz
ANT
Aminoglikozid nukleitidil-transzferáz
APH
Aminoglikozid foszfotranszferáz
AP-PCR
Arbitrary primed PCR (Tetszőleges primerrel végzett PCR)
bp
Bázispár
CDM
Combined disk method (Kombinált korong módszer)
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
DDST
Double disk synergy test (Kétkorong szinergizmus teszt)
DPS
Dipikolinsav European Antimicrobial Resistance Surveillance System (Európai Antibiotikum Rezisztencia Surveillance Rendszer) Etilén-diamin-tetraecetsav
EARSS EDTA ESBL ESBL-NRL
Extended-spectrum -lactamase (Kiterjedt-spektrumú -laktamáz) ESBL-termelő Gram-negatív kórokozók Nemzeti Referencia Laboratóriuma
EP
Elektroporáns törzs
HEC
Hungarian Epidemic Clone (Magyar epidémiás klón)
IR-L
Inverted Repeat - Left
IR-R
Inverted Repeat - Right
ITO
Intenzív Terápiás Osztály
MALDI
Matrix assisted laser desorption ionization (Mátrixasszisztált lézerdeszorpció-ionizációs - tömegspektrométer
MBL
Metallo- -laktamáz
Mda
Megadalton
MLST
Multi-lókusz szekvencia tipizálás
NAG
N-acetil-glukózamin
NAM
N-acetil-muraminsav
NBS
Nemzeti Bakteriológiai Surveillance
NCCLS
National Committee for Clinical Laboratory Standards
OEK
Országos Epidemiológiai Központ
Omp
Outer membrane protein (külső membrán protein)
ORF
Open Reading Frame (nyitott leolvasási keret)
5
PBP
Penicillin binding protein (Penicillin-kötő fehérje)
PCR
Polimerase chain reaction (Polimeráz láncreakció)
PFGE
Pulsed field gel electrophoresis (pulzáltatott mezejű gélelektroforézis)
PIC
Perinatális Intenzív Centrum
PT
Pulzotípus
QRDR
Quinolone resistance determining region (kinolon rezisztenciát meghatározó régió)
RFLP
Restriction fragment length polymorphism (restrikciós fragmenthossz polimorfizmus)
SSCP
Single strand conformation polymorphism (egyszálú konformációs polimorfizmus)
ST
Szekvencia típus
tnpA
Transzpozáz gén
UPGMA
Unweighted pair group method with arithmetic averages
-laktamázok: BEL
Belgium ESBL
BES
Brazil ESBL
BIL
Bilal nevű betegről
CMY
Cefamicinnel szemben aktív
CTX-M
Cefotaximáz-München (első izolálás)
GES
Guyana ESBL
KLUA
Kluyvera ascorbata -laktamáz
KLUC
Kluyvera cryocrescens -laktamáz
KLUG
Kluyvera georgiana -laktamáz
LAT
Beteg neve után
MIR
Miriam kórházban írták le
OXA
Oxacillinnel szemben aktív
PER
Pseudomonas Extended Resistant
SFO
Serratia fonticola -laktamáz
SHV
Sulphydryl Reagent Variable
TEM
Temoniera beteg neve után
TLA
Tlahuicas (Indiai törzs neve)
VEB
Vietnam ESBL 6
Aminosavak rövidítése: Ala
alanin
Arg
arginin
Asn
aszparagin
Asp
aszparaginsav
Cys
cisztein
Gln
glutamin
Glu
glutaminsav
Gly
glicin
His
hisztidin
Ile
izoleucin
Leu
leucin
Lys
lizin
Met
metionin
Phe
fenilalanin
Pro
prolin
Ser
szerin
Thr
treonin
Trp
triptofán
Tyr
tirozin
Val
valin
7
3. BEVEZETÉS 3.1. Történeti áttekintés A penicillin felfedezése Sir Alexander Fleming nevéhez kötődik, aki 1928-ban mutatta ki, hogy a Penicillium notatum penészgombából származó anyag in vitro gátolja számos baktérium növekedését, és egerekre, nyulakra nézve nincs toxikus hatása (Fleming 1929). Mivel terápiás szerepét nem vizsgálta állatkísérletekben, az in vivo kísérletek hiányában a felfedezés nem kapott nagy visszhangot, köszönhetően annak is, hogy nagyobb mennyiségben még nem tudták előállítani (Rolinson 1998). 1940-ben azonban
Florey
és
Chaid
bizonyították
sikeresen
az
antibiotikum
terápiás
hatékonyságát, mikor egereknél az addig egyébként halálos streptococcus fertőzést a bőr alá injekciózott penicillinnel meggyógyították (Chaid és mtsai 1940). Ez a felfedezés, valamint a penicillin bevezetése a humán medicinába hatalmas lökést adott a további antibiotikumok utáni kutatásoknak. A
-laktám antibiotikumok számának
növekedése csak a 1960-s évek elején indult meg a félszintetikus penicillinek kifejlesztésével, amit a félszintetikus cefalosporinok és más követtek (Rolinson 1998). A
-laktám antibiotikumok
-laktám antibiotikumok manapság nemcsak a
leggyakrabban alkalmazott, hanem a legsokoldalúbb antibiotikum csoport is tekintve változatos kémiai tulajdonságait és széles antibakteriális hatásukat (Cornaglia és mtsai 2008). Előnyei közé tartozik, hogy viszonylag alacsony költségűek, nagy mennyiségben állnak rendelkezésre és kevés mellékhatásuk van, ami a széleskörű és kontrollálatlan túlhasználatukhoz vezetett az elmúlt 60 évben. A -laktámok különböző generációinak széles körű felhasználása azonban a rezisztens baktériumok megjelenéséhez és elterjedéséhez vezetett (Walsh és Wright 2005).
8
3.2. -laktám antibiotikumok 3.2.1. Szerkezeti felépítés A -laktám antibiotikumokat négy nagy csoportra oszthatjuk: i, penicillinek; ii, cefalosporinok; iii, monobaktámok; iv, karbapenemek. Ezen belül is az egyes csoportok különböző generációkba, alcsoportokba sorolhatók a felfedezés ideje, és a molekulaszerkezeti sajátosságok alapján. A
-laktámok egy 4 tagú
-laktám (2-
azetidinon) gyűrűt tartalmaznak, és a monobaktámok kivételével biciklusos vegyületek (1. ábra). Az egyes csoportok antibakteriális spektruma általában különbözik, és a generációk előrehaladtával szélesedik: pl. a cefalosporinok között az 1. generációs cefalosporinok (pl. cefazolin) elsősorban Gram-pozitív baktériumok ellen hatékonyak (staphylococcusok és streptococcusok); a 2. generációs cefalosporinok (pl. cefuroxim) már jól hatnak a legtöbb Enterobacteriaceae törzsre is; a 3. generációs cefalosporinok (pl. ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon) elsősorban a Gram-negatív baktériumok ellen hatékonyak, de még használhatóak egyes Gram-pozitívok által okozott fertőzések terápiájában is. A ceftazidimet ki kell emelni, mivel az egyetlen 3. generációs cefalosporin, amely jól hat a Pseudomonas spp. és Acinetobacter spp. törzsekre is. A 4. generációs
cefalosporinok
(pl.
cefepim)
spektruma
és
farmakokinetikája
a
ceftazidimhez hasonló. A 3. és 4. generációs cefalosporinokat széles-spektrumú cefalosporinoknak is nevezik.
9
-laktám gyűrű
thiazolidin gyűrű
dihidrotiazin gyűrű
Penicillinek
Cefalosporinok
Monobaktámok
Karbapenemek
1. ábra. -laktám antibiotikumok kémiai szerkezete A R-csoportok megváltoztatása módosítja a különböző -laktám antibiotikumok antibakteriális hatásspektrumát, illetve farmakokinetikáját. A
-laktamáz inhibitorok
(klavulánsav, tazobaktám, sulbaktám) szintén rendelkeznek -laktám gyűrűvel, azonban nincs antibakteriális hatásuk.
3.2.2. -laktám anitbiotikumok hatásmechanizmusa A -laktám antibiotikumok gátolják a bakteriális sejtfal felépítésében szerepet játszó, citoplazma membránhoz kötött enzimek működését. A Gram-pozitív és Gramnegatív baktériumok sejtfalszerkezete alapvetően eltér egymástól: a Gram-pozitívaknál a citoplazmamembránt egy vastagabb peptidoglikán réteg (20-80 nm), míg a Gramnegatívoknál egy vékonyabb peptidoglikán réteg (7-8 nm) veszi körül, és ez utóbbiaknál ezen kívül még egy külső membrán is található. A két membrán közötti teret periplazmatikus térnek nevezik.
10
A peptidoglikán szénhidrát részének alapvető komponensei az N-acetilglukózamin (NAG) és az N-acetil-muraminsav (NAM). A NAG és a NAM β(1→4) kötéssel kapcsolódnak diszachariddá, és ezek az egységek ugyancsak β(1→4) glikozidos kötéssel poliszacharid láncot alkotnak. A peptidoglikán úgy alakul ki, hogy a muraminsavhoz kötődő tejsav szabad karboxilcsoportja rövid oligopeptidet köt meg. A peptid oldalláncok aminosavai közül egyesek nem természetben szokásos L, hanem D konfigurációjúak, ami a prokarióták kizárólagos tulajdonsága. E pentapeptid általános összetétele az alábbi: L-alanin - D-glutaminsav - diaminosav - D-alanin - D-alanin. Gram-negatív baktériumokban általánosan egy hét szénatomos diaminosav, a mezodiamino-pimelinsav fordul elő. A NAM-ról lelógó peptidnek szabad karboxil vége más láncok diaminosavával peptidkötést tud kialakítani, és ezzel háromdimenziós hálózatot képes létrehozni (Tipper és Strominger 1965). Ennek a térhálós rétegnek a kialakulása elengedhetetlen a baktériumok életben maradásához. A sejtfalszintézis kezdeti lépéseiben NAG-NAM-pentapeptid prekurzorok képződnek, melyek a már meglévő mureinláncokhoz kapcsolódnak a transzglikozilációs lépés során. A kialakuló láncok között a transzpeptidációs lépés során alakulnak ki a pentapeptid hidak. Utóbbi két reakciót az úgynevezett penicillin-kötő fehérjék (Penicillin Binding Protein - PBP) katalizálják. Mint nevükből is kiderül, ezek a PBP enzimek - transzpeptidázok és karboxipeptidázok - a
-laktám antibiotikumok célpontjai. A PBP-k a peptid
oldalláncok acil-D-alanil-D-alanin végéhez kapcsolódnak, és a terminális D-alanin lehasítása közben egy acil-D-alanil-enzim komplexet képeznek, és katalizálják a diaminosavval történő peptidkötés kialakulását. A -laktám antibiotikumok szerkezeti analógként működnek, és egy igen stabil -laktám-enzim komplex képződik, ami a PBP további működését gátolja (2. ábra)(Ghuysen 1988). Ezzel a -laktám antibiotikumok gátolják a sejtfalszintézis befejező lépését, a térhálós szerkezet kialakítását, ami végül a sejt pusztulásához vezet. A különböző baktérium fajokban eltérő PBP-k fordulnak elő, mely polipeptidek molekulasúlya 40 -120 kDa lehet. A különböző fajokból származó, de azonos számmal (ill. betűvel) jelölt molekulák nem jelentik azt, hogy a PBP-k között hasonlóság lenne. Általában az Enterobacteriaceae fajokban a PBP-típusok száma 6-8, az Escherichia coli esetében ezek száma hét, a Klebsiella. pneumoniae esetében hat (Georgopapadakou és Lin 1980). A PBP-k lehetnek ún. nagy molekulasúlyúak és kis molekulasúlyúak,
11
előbbiek általában bifunkcionálisak, (transzglikoziláz és transzpeptidáz) míg utóbbiak általában csak karboxipeptidáz funkcióval rendelkeznek. A kis molekulasúlyú PBP-k inaktiválása nem letális a baktériumokra nézve. Az E. coli PBP1A, PBP1B, PBP2-6 penicillin-kötő fehérjékkel rendelkezik, és ezek közül a nagy molekulatömegű formák (PBP1A, PBP1B, PBP2 és a PBP3) bifunkcionálisak és a
-laktám antibiotikumok
elsődleges célpontjai (Spratt 1983).
2. Ábra: -laktám antibiotikum hatásmechanizmusa TPase: transzpeptidáz alegység, TGase: Transzglikozidáz alegység A PBP-khez hasonlóan a -laktamázok egyes csoportjainál (az ún. szerin-típusú -laktamázoknál) szintén szerin található az aktív centrumban, mely a kötésért felelős (Ambler 1980, Majiduddin és mtsai 2002). Azonban a
-laktamázok és a kis
molekulasúlyú PBP-knél a szerin-tartalmú aktív hely az N-terminális vég közelében található, míg a nagy molekulasúlyú PBP-k esetében a fehérje középső területén, és ez a szerkezeti különbség jelentős szerepet játszik a
-laktám – enzim kölcsönhatásban
(Ghuysen 1988).
3.2.3. -laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia mechanizmusok
A
-laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia az antibiotikumok
bevezetése óta növekvő problémát jelent. A penicillin klinikai használatra való bevezetésekor már leírták az első penicillináz termelő baktériumot (Abraham és Chain 1988).
A
félszintetikus
penicillineket
12
1950-60-as
években,
a
félszintetikus
cefalosporinokat és más -laktám antibiotikumokat az 1970-80-as években vezették be, hogy szélesítsék az antibiotikumok hatásspektrumát, illetve megoldást találjanak a terjedő antibiotikum rezisztenciára. Az addig érzékeny baktériumok folyamatosan alkalmazkodtak az újabb, szélesebb hatásspektrumú antibiotikumokhoz mutációk kialakulásával, genetikai információk cseréjével és természetes szelekció segítségével (Jacoby és Archer 1991). Ezek a konvergens evolúciós folyamatok vezettek ahhoz, hogy jelenleg négy eltérő
-laktámokkal szembeni rezisztencia mechanizmus is ismert, melyek azonban
együttesen is megjelenhetnek. Az első mechanizmus a célpont molekula megváltozásán alapul, mely általában alacsony szintű rezisztenciát okoz. A második a külső membrán permeábilitásának megváltozásán alapul, és mérsékelt rezisztenciát tud általában kialakítani. A harmadik mechanizmus efflux pumpák termelésén alapul, melynek során a sejt a periplazmatikus térből a környezetébe pumpálja az antibiotikumot. Ez is mérsékelt szintű rezisztenciát okoz. A negyedik mechanizmus pedig az antibiotikum enzimatikus módosításán alapszik, mely a leghatékonyabb és legmagasabb szintű rezisztenciát alakítja ki.
3.2.3.1. PBP módosulása A PBP módosulásán alapuló rezisztenciát mind Gram-pozitív, mind Gramnegatív baktériumoknál leírták, azonban az előbbi csoportnál sokkal elterjedtebb. A PBP módosuláson alapuló rezisztenciák különböző típusai egy-egy Gram-pozitív baktériumcsoporton keresztül kerülnek bemutatásra. A vad típusú staphylococcusok négy PBP-vel (PBP1, PBP2, PBP3 és PBP4) rendelkeznek, melyből az első három, nagy molekulatömegű PBP esszenciális a sejtfal felépítéséhez, és ezek a -laktámok támadásának célpontjai is. A magas szintű -laktám rezisztenciát egy ötödik, szerzett PBP, a PBP2a (vagy PBP2’) okozza. Az összes laktám antibiotikum alacsony affinitással kötődik a PBP2a-hoz, ezért termelése rezisztenciát biztosít mindegyikkel szemben. A PBP2a-t kódoló mecA gén csak a methicillin rezisztens staphylococcusokban található meg, és az ún. „staphylococcal chromosome mec” (SCCmec) mobilis genetikai elemen helyezkedik el, mely
13
valószínűleg a Staphylococcus sciuri-ból került át a többi fajba (Alekshun és Levy 2007, Woodford 2005). A Streptococcus pneumoniae esetében a -laktám rezisztencia kialakulása egy komplex folyamat, amelyben több PBP-jének többféle aminosav változása is szerepet játszik. Az S. pneumoniae hatféle PBP-vel rendelkezik: három a nagy molekulatömegű PBP-k „A” osztályába (PBP1a, PBP1b, PBP2a), kettő a „B” osztályába (PBP2x és PBP2b), illetve egy a kis molekulatömegű PBP-khez (PBP3) tartozik. A rezisztencia kialakulásában mind a hat PBP érintett, azonban csak a nagy molekulatömegű PBP-k a -laktámok elsődleges célpontjai. Magas szintű
-laktám rezisztencia eléréséhez
általában több PBP változására is szükség van. A klinikai mintákból izolált penicillin nem-érzékeny törzsek vizsgálatai azt mutatták, hogy a mutációkat hordozó PBP gének mozaikos felépítésűek. Ez azt jelenti, hogy a megváltozott PBP-t kódoló gének mutációt hordozó részei más streptococcus fajoktól származnak (pl. S. mitis), és ezek a génszakaszok transzformációval kerültek felvételre a sejtekbe, majd homológ rekombinációval épültek be a kromoszómába (Alekshun és Levy 2007, Woodford 2005). A enterococcusok természetes módon alacsony szintű érzékenységet mutatnak a -laktám antibiotikumokkal szemben, mivel az általuk termelt PBP-k alacsony affinitással kötődnek a
-laktámokhoz. Az Enterococcus faecium esetében a PBP5
túltermelése magas szintű rezisztenciát eredményez minden -laktám antibiotikummal szemben (Alekshun és Levy 2007, Woodford 2005). Egyes Gram-negatív baktériumok esetében is leírtak PBP változáson alapuló rezisztenciát. Így például a Haemophilus influenzae esetében az ampicillin rezisztens törzsek 1-5%-ánál nem
-laktamáz termelése, hanem PBP-k (elsősorban a ftsI gén
kódolta PBP3) módosulása áll a rezisztencia hátterében (BLNAR törzsek – -laktamáz negatív ampicillin rezisztens). A -laktamáz termelő törzsekkel szemben, ezek a törzsek már a
-laktám inhibitoros kombinációkra és akár 2. generációs cefalosporinokra is
rezisztensek lehetnek (Alekshun és Levy 2007, Lambert 2005).
3.2.3.2. Sejtfal permeabilitás változáson alapuló rezisztencia
14
Az antibiotikum rezisztenciában fontos szerepet betöltő porinok külső membrán proteinek (Outer Mebrane Protein –Omp), melyek hidrofil csatornákat képeznek a Gram–negatív baktériumokban a külső membránon keresztül, és keresztülengedik a kisebb poláris molekulákat (pl.
-laktám antibiotikumokat), aminosavakat és
tápanyagokat. Egyes porinok elvesztése megakadályozza a
-laktám antibiotikumok
periplazmatikus térbe jutását, és ezzel csökkent érzékenység vagy rezisztencia alakul ki. A
-laktám rezisztenciában főszerepet játszó porinok az E. coli, és az
Enterobacter cloacae esetében OmpC és OmpF, a K. pneumoniae, és az Enterobacter aerogenes törzsekben Omp35 és Omp36. Az E. coli és a K. pneumoniae törzsekben ezeknek a porinoknak az elvesztése elsősorban cefoxitin (2. generációs, cefamicinekhez tartozó, sok -laktamázzal szemben ellenálló antibiotikum) rezisztenciát okoz. Az E. coli, a K. pneumoniae, az E. cloacae és az E. aerogenes esetében ezeknek a porinoknak az elvesztése -laktamáz (ESBL, AmpC) termeléssel kombinálódva különböző szintű karbapenem rezisztenciát tud kialakítani (Alekshun és Levy 2007).
3.2.3.3. Efflux pumpák termelésén alapuló rezisztencia Az efflux rendszerek a baktériumokban az oldott anyagok kipumpálására szolgálnak. Az efflux pumpák génjei, ill. fehérjéi jelen vannak mind az antibiotikum érzékeny, mind a rezisztens törzsekben. Az antibiotikum rezisztencia az efflux pumpa mutáns törzsekben kétféle úton jöhet létre: i, az efflux pumpa fehérjéinek túltermelése, ii, a fehérjében egy vagy néhány aminosav cseréje miatt hatékonyabban működő export következtében. Az efflux hatására a sejten belül az adott antibiotikum koncentrációja csökken, és ezzel csökken a sejt érzékenysége is. Az efflux pumpák lehetnek specifikusak egy szubsztrátra, de szállíthatják eltérő szerkezetű molekulák széles skáláját is (pl. többféle antibiotikum csoportot), ez utóbbi pumpák a multirezisztencia kialakításában vehetnek részt. Az efflux pumpa közvetítette, általában alacsony szintű rezisztencia elősegítheti a baktérium hosszabb túlélését antibiotikum tartalmú környezetben, és ennek során egyéb más, magasabb szintű rezisztenciát biztosító mechanizmusok kialakulására, ill. beszerzésére ad lehetőséget. A Pseudomonas aeruginosa számos természetes és szerzett rezisztencia mechanizmussal rendelkezik sokféle szerkezetileg és hatásmechanizmusban eltérő
15
antibiotikummal szemben. A multirezisztencia fenotípust főleg a külső membrán alacsony permeábilitása és efflux pumpák termelése okozza. Háromféle efflux pumpát írtak le a P. aeruginosa-ban: MexAB-OprM, MexCD-OprJ éa MexEF-OprN pumpák. A vad típusú törzs csak a MexAB-OprM pumpát expresszálja állandó szinten, a másik kettő indukálható. Utóbbiak kinolonok, tetraciklinek és bizonyos
-laktámok mellett
szerves oldószereket, ethidium-bromidot is kipumpálnak. A MexAB-OprM pumpa defektusa számos antibiotikummal szemben teszi túlérzékennyé a baktériumot. Az E. coli-ban leírt AcrAB-TolC rendszer nagyfokú homológiát mutat a P. aeruginosa MexAB-OprM pumpájával, és hasonló multirezisztencia kialakításában van szerepe (Alekshun és Levy 2007, Butaye és mtsai 2003, Piddock 2006).
3.2.3.4. Enzimatikus módosítás A
negyedik
és
legfontosabb
rezisztencia
mechanizmus
a
-laktám
antibiotikumokat szerkezetileg módosító enzimek termelésén alapul. Ezek az enzimek három fő csoportba sorolhatók: az észterázok, melyek a cefalosporinok dihidrotiazin gyűrűjének egyik acetilcsoportját hidrolizálják, és így csökkent aktivitású antibiotikum molekulát alakítanak ki; az acilázok, melyek a penicillinek és cefalosporinok amid kötését módosítják. Azonban a félszintetikus penicillinek alkalmazása óta ez utóbbiak in vivo szerepe már nem jelentős (Sykes és Matthew 1976); a harmadik csoportot a laktamázok alkotják, melyek irreverzibilisen módosítják a
-laktámokat úgy, hogy
hidrolizálják a -laktám gyűrű amid kötését. A -laktamáz termelés a legfontosabb laktám antibiotikumokkal szembeni rezisztencia mechanizmus (Livermore 1995).
3.3. -laktamázok
16
Az első
-laktamázt termelő baktériumot 1940-ben írták le, még a penicillin
terápiában való széleskörű bevezetése előtt. Ezzel világossá vált, hogy a baktériumokban már régóta jelen van ez a rezisztencia mechanizmus (Abraham és Chain 1988). 1965-ben írták le az első mobilis genetikai elemen elhelyezkedő
-
laktamázt, melyet az esethez kapcsolódó beteg neve után (Temoniera) TEM-nek neveztek el (Livermore 1995).
3.3.1. -laktamázok osztályozása Az első átfogó csoportosítást Bush készítette el 1989-ben, melyben megpróbálta egyesíteni a szubsztrát és inhibitor alapú csoportosítást a molekuláris szerkezeten alapuló osztályozással (Bush 1989a, Bush 1989b, Bush 1989c). A
-laktamázok
jelenleg is használt csoportosítását 1995-ben publikálták Bush és mtsai, melyben az ún. Bush-Jacoby-Medeiros féle funkcionális osztályozást egyesítik az Ambler-féle szerkezeti felépítésen alapuló csoportosítással. A funkcionális és molekuláris tulajdonságokat is magába foglaló rendszer négy csoportba foglalta az akkor ismert laktamázokat (Bush és mtsai 1995) (1. táblázat): -
Csoport 1: Ambler-féle C molekuláris osztályba tartozó kromoszómálisan kódolt cefalosporinázok, melyek általában nem gátolhatók klavulánsavval. Az utóbbi évtizedben
plazmidon
kódolt
változatai
is
egyre
inkább
terjednek.
Leggyakrabban AmpC-típusú -laktamázoknak hívják a csoport tagjait (Bush és mtsai 1995, Jacoby 2009, Livermore 1995). -
Csoport 2: Ambler-féle A és D molekuláris osztályba tartozó különböző
szubsztrát
specifitással.
Általában
gátolhatók
-laktamázok -laktamáz
inhibitorokkal. -
Csoport 3: Metallo- -laktamázok, melyek hidrolizálják a penicillineket, cefalosporinokat és karbapenemeket is. Az aktív centrumban kétértékű kationt tartalmaznak (pl. Zn2+), és működésüket kelátképző vegyületekkel lehet gátolni (EDTA, dipikolinsav) (Shin és mtsai 2008, Yong és mtsai 2002)
-
Csoport 4: penicillinázok, melyek nem gátolhatók klavulánsavval.
17
A -laktamázokat lehet az aktív centrumukban található, a hidrolízist katalizáló molekula alapján is osztályozni. Ennek alapján elkülöníthetőek szerin-típusú
-
laktamázok (A, C és D molekuláris osztály), ahol a -laktám gyűrű hidrolíziséért egy szerin-csoport felelős az enzim aktív centrumában, míg a MBL-knál (B molekuláris osztály) cink vagy más nehézfém-ion katalizálja a folyamatot (Livermore 1995).
18
1. táblázat: Bakteriális -laktamázok osztályozása (Forrás: Bush és mtsai 1995, Livermore 1995) Bush-JacobyMedeiros csoportok
Molekuláris osztály
1
C
cefalosporinok
2a 2b
A A
penicillinek penicillinek, cefalosporinok
2be
A
penicillinek, szűk spektrumú és széles-spektrumú cefalosporinok, monobaktámok penicillinek
2br
A
Gátlószerekb
Elsődleges szubsztrát
Jellegzetes enzimek a csoportban Klavulánsav EDTA
2c 2d 2e
A D A
penicillinek, carbenicillin penicillinek, cloxacillin cefalosporinok
2f
A
3a 3b
B B
penicillinek, cefalosporinok, karbapenemek legtöbb -laktám antibiotikum (kivéve monobaktámok)
-
-
+
-
+
-
+
-
±
-
± ±
-
+
-
+
-
-
+
Gram-negatív baktériumok AmpC-típusú -laktamázai Gram-pozitív baktériumok penicillinázai Széles-spektrumú -laktamázok: SHV-1, TEM-1, TEM-2 Kiterjedt spektrumú -laktamázok: TEM-3181, SHV-2-134, CTX-M csoport (96 féle), K. oxytoca K1 Inhibitor rezisztens TEM (IRT) (TEM-3136), inhibitor rezisztens SHV (IRS) (SHV10, SHV-26, SHV-49) PSE-típusok OXA-típusok Proteus vulgaris indukálható cefalosporináza NMC (E. cloacae), Sme-1 (Serratia marcescens) IMP, VIM metallo- -laktamázok Stenotrophomonas maltophilia L1 laktamázam, Bacteroides fragilis CcrA
3c B 4 NMa penicillinek ? Burkholderia cepacia penicilllináza a NM: nincs meghatározva. b +: jó gátlószer; ±: a csoport egyes tagjai gátolhatóak, más tagjai nem; -: a csoport nem gátolható az adott gátlószerrel
19
3.3.2. Szerin-típusú -laktamázok előfordulása Enterobacteriaceae törzsekben
A
-laktamázok génjei előfordulhatnak kromoszómálisan, plazmidon illetve
transzpozonon kódolva. Expressziójuk lehet állandó szintű vagy indukálható (Livermore 1995). Az
Enterobacteriaceae
fajokban
–a
Salmonella
genus
kivételével-
a
kromoszómális -laktamázok általánosan elterjedtek. Az egyes kromoszómálisan kódolt laktamázok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájának mértékét befolyásolja, hogy a sejt milyen mennyiségben állítja azokat elő (2. táblázat). A kromoszómálisan kódolt laktamázok
átkerülhetnek
különböző
mobilis
genetikai
elemekre
(pl.
plazmid,
transzpozon), és így terjedhetnek nemcsak klonálisan, hanem horizontálisan is. A jelenleg elterjedt széles-spektrumú
-laktámokat bontó enzimek (pl. ESBL-k, plazmidon kódolt
AmpC) elsősorban mobilis genetikai elemeken találhatóak, és többségük valamely kromoszómálisan kódolt enzimből származtatható. Egyes géntípusok mobilizációjával összefüggésbe hoznak jellemző inszerciós szekvenciákat: pl. SHV-típusú ESBL-k esetében az IS26 elem általánosan megtalálható a gén upstream régiójában (Jones és mtsai 2005), CTX-M-típusú ESBL-k esetében pedig mind upstream, mind downstream irányban lehetnek jellemző inszerciós szekvenciák (Bonnet 2004).
20
2. táblázat. Kromoszómális -laktamázok és expressziójuk Enterobacteriaceae fajokban (Forrás: Livermore 1995) Enzimtermelés módjaa
Baktérium
E. coli Shigellák Enterobacter spp. Citrobacter freundii Morganella morganii Providencia spp. Serratia spp. K. pneumoniae Klebsiella oxytoca Citrobacter diversus Proteus vulgaris Proteus penneri Proteus mirabilis
Molekuláris Bush laktamáz osztály csoport Indukálható neve
Konstitutív Alacsony Közepes Magas
AmpC AmpC
C C
1 1
-
Gy Gy
-
R R
AmpC
C
1
Gy
R
-
Á
AmpC
C
1
Gy
R
-
Á
AmpC
C
1
Gy
-
-
Á
AmpC
C
1
Gy
R
-
R
AmpC
C
1
Gy
-
-
Á
SHV-1
A
2b
-
-
Gy
Rb
K1
A
2be
-
-
Gy
Á
A
2e
Gy
-
-
R
CXáz
A
2e
Gy
-
-
R
CXázc
A
2e
Gy
-
-
R
?
?
-
Gy
-
-
a Gy, A species-re jellemző, vad típusú törzsben fordul elő; Á, Országonként és kórházanként eltérő mértékben fordul elő, általában a törzsek 10-50%-ban alakul ki; R, ritkán alakul ki, a törzsek kevesebb, mint 10%-ában; -, Esetlegesen előfordul vagy nem ismert. Alacsony szintű termelés esetében az enzim detektálható, de nem okoz szignifikáns rezisztenciát; közepes szintű termelés esetében az enzim rezisztenciát biztosít a jó szubsztrátokkal szemben; magas szintű termelés esetében a teljes sejtfehérje tartalom akár 3%-a is lehet, gyenge szubsztrátokkal szemben is rezisztenciát biztosít. bPlazmid-kódolta SHV-1 esetében gyakori. cCXáz, cefuroximáz Bush féle 2e csoportba tartoznak (Bush és mtsai 1995).
21
3.3.2.1. AmpC-típusú -laktamázok A Ambler-féle C molekuláris osztályba tartozó, ún. AmpC-típusú kromoszómális -laktamázok a legelterjedtebbek az Enterobacteriaceae család tagjainál. (Bush és mtsai 1995, Livermore 1995). Az E. coli és a Shigella spp. törzsek vad típusai nem indukálható AmpC-típusú
-laktamázzal rendelkeznek, melyek olyan alacsony szinten termelődnek,
hogy ampicillinnel és szűk spektrumú cefalosporinokkal szemben is érzékenyek maradnak a törzsek. Ritkán az E. coli esetében kialakulhatnak olyan AmpC-túltermelő mutánsok, melyek számos
-laktámmal szemben (kivéve karbapenemek) mutatnak emelkedett
rezisztenciát (Livermore 1995). Az Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Serratia spp., Morganella morganii, Providenica stuartii és P. rettgeri fajok szintén kromoszómálisan kódolt AmpC-típusú laktamázzal rendelkeznek, amelynek expressziója indukálható. Az ampicillin és a szűkspektrumú cefalosporinok jó indukálószerei ezeknek a szemben
labilisak.
A
3.
generációs
-laktamázoknak, de hatásukkal
cefalosporinok,
ureidopenicillinek
és
karboxipenicillinek szintén labilisak az enzimmel szemben, viszont csak gyenge indukálószerek. Ezért utóbbiakkal szemben a vad típusú törzsek nem mutatnak in vitro rezisztenciát. A derepresszált mutáns, konstitutív AmpC-termelő törzsek azonban már magas szintű rezisztenciával rendelkeznek ezekkel az antibiotikumokkal szemben is. A karbapenemek kitűnő indukálószerek, az enzimmel szemben viszont stabilak. A 4. generációs cefalosporinok is stabilak, és ez a tulajdonság használható a derepresszált AmpC mutánsok kiterjedt-spektrumú -laktamáz termelő törzsektől való elkülönítésére. Az első plazmidon kódolt AmpC-típusú -laktamázt 1989-ben írták le. Jelenleg az aminosav változatosság alapján hét enzimcsaládot különbözetnek meg. Eddig 43 CMY allélt, 7 FOX allélt, 4 ACC, LAT és MIR allélt, 3 ACT és MOX, illetve 2 DHA allélt írtak le. Néhány típust kromoszómálisan kódolt génként is leírtak, és az érintett fajokból származhatnak a plazmidon kódolt változatok (pl. CMY-1 Aeromonas hydrophila-ból, vagy a MIR-1 Enterobacter cloacae-ból). A plazmidon kódolt AmpC enzimek általában konstitutívan termelődnek (ritkán indukálhatóak pl. ACT-1, DHA-1, DHA-2), általában 22
rezisztenciát
biztosítanak
penicillinekkel,
széles-spektrumú
cefalosporinokkal,
cefamicinekkel, és változóan aztreonammal szemben, de a törzsek érzékenyek maradnak cefepimre és karbapenemekre. A plazmidon kódolt AmpC-típusú -laktamázok gyakran együtt kódolódnak aminoglikoziddal, kloramfenikollal, kinolonnal, szulfonamiddal, tetraciklinnel, és trimethoprimmel szemben rezisztenciát biztosító génekkel, ill. számos más
-laktamázzal (pl. TEM-1, PSE-1, CTX-M-k, SHV-k, és VIM-1). Világszerte
elterjedt enzimek, bár jóval kevésbé gyakoriak, mint az ESBL-k. A CMY-2 a legszélesebb földrajzi elterjedtségű plazmidon kódolt AmpC, és a nem-tifoid salmonella törzsekben a laktám rezisztencia egyik fontos okozója (Jacoby 2009, Livermore 1995).
3.3.2.2. OXA -laktamázok A D molekuláris osztályba tartozó OXA (oxacillin-hidrolizáló) ß-laktamázok, az A és C osztályba tartozó ß-laktamázokhoz hasonlóan, szerin csoportot tartalmaznak az aktív centrumukban. Általában rezisztenciát biztosítanak az amino- és ureidopenicillinekkel szemben. Nagyfokú hidrolitikus aktivitással bírnak a cloxacillinnel, az oxacillinnel és a methicillinnel szemben, az aktivitásukat gyengén gátolja a klavulánsav (Bush és mtsai 1995). Általánosságban véve az OXA-típusú enzimeken belül az aminosav egyezés csak 20-30 %-os, így az OXA család inkább jelent egy funkcionális csoportot, mint egy enzimcsaládot. Az oxacillináz gének többsége plazmidon, transzpozonon vagy integronon lokalizálódik. Főleg a Pseudomonas aeruginosa-ra és Acinetobacter spp. jellemzőek, de az Enterobacteriaceae családban is előfordulnak. Jelenleg több mint 160 típusát írták le, azonban csak 18 típus képes hatékonyan bontani a széles-spektrumú cefalosporinokat (Paterson és Bonomo 2005).
23
3.4. Kiterjedt-spektrumú -laktamázok (ESBL)
3.4.1. Kiterjedt-spektrumú -laktamázok definíciója A kiterjedt spektrumú
-laktamáz kifejezést először 1988-ban használták
plazmidon kódolt, széles-spektrumú cefalosporinokat bontó -laktamázok megnevezésére (Jarlier és mtsai 1988, Philippon és mtsai 1989). Az 1980-s évek végén ez a definíció megfelelő volt az akkor ismert SHV és TEM-típusú ESBL-ek jellemzésére (Philippon és mtsai 1989). Az eltelt két évtized során azonban számos újfajta széles-spektrumú cefalosporint bontó -laktamázt írtak le, ezért a meghatározást többször változtatták, és ma sincs egységes meghatározása. A legelterjedtebb definíció szerint az ESBL enzimek hidrolizálják az oxyimino-cefalosporinokat (ceftazidim, ceftriaxon, cefotaxim, cefepim), monobaktámokat
(aztreonam)
és
a
széles-spektrumú
penicilleneket
(ampicillin,
amoxicillin), nem képesek hidrolizálni a karbapenemeket (imipenem, meropenem) és a cefamicineket (cefoxitin és cefotetan). A -laktamáz inhibitorok (klavulánsav, szulbaktám, tazobaktám) általában gátolják az enzim működését (Paterson és Bonom 2005, Stürenburg és Mack 2003). Livermore 2008-ban a definíció és a nevezéktan átalakítását javasolta. Egyik ajánlott lehetőség, hogy minden az oxyimino-cefalosporinokat jól hidrolizáló, vagy ezeket az adott enzimcsalád klasszikus tagjainál jobban bontó enzimet idesorolnak, és a jobb érthetőségért az ESBL megnevezést kiegészítik az enzimcsalád nevével: pl. TEM ESBL, SHV ESBL, OXA ESBL, CTX-M ESBL, széles-spektrumú AmpC. A másik felvetett megoldás, hogy az ESBL-ek megnevezést csak a Bush-Jacoby-Medeiros féle 2be csoportba tartozó enzimekre alkalmazzák (TEM, SHV, CTX-M, VEB-típusú ESBL-k). (Livermore 2008). A klasszikus definíció szerinti ESBL enzimeknél leírt csoportok a 3. táblázatban láthatóak. A klasszikus SHV, TEM és OXA-típusú ESBL-k mellé az utóbbi évtizedben elterjedtségben felzárkózott, sőt dominánssá vált a CTX-M-típus (Canton és mtsai 2008).
24
3. táblázat. Különböző kiterjedt-spektrumú -laktamáz családok, típusok, és első előfordulásuk (Forrás: Canton és mtsai 2008)
Magas prevalencia SHV TEM
Első előfordulás
-laktamáz progenitor
ESBL-típus
SHV-1 ⁄ LEN (>90%)a TEM-1, -2 (>90%)a
KLUC Kluyvera cryocrescens (85%)a KLUA Kluyvera ascorbata CTX-M-2 csoport (80–100%)a CTX-M-1 csoport
CTX-M-8 csoport
KLUG Kluyvera georgiana (95%)a
Baktérium csoport, amelyikben először írták le az adott enzimet
Németország (1983)b Franciaország (1985)b
Enterobacteriaceae Enterobacteriaceae
Németország (1989)c
E. coli
Japán (1986)c ⁄ Argentina E. coli, Salmonella spp (1989)c Citrobacter amalonaticus, Brazília (1996–1997)c Enterobacter spp.
CTX-M-9 csoport KLUG K. georgiana (80%)a
Spanyolország (1994)c
E. coli
CTX-M-25 csoport OXA PER
Kanada (2000)c
E. coli
VEB Alacsony prevalencia SFO TLA
BES GES-1 IBC BEL
NM OXA-10 (PSE-2) (>90%)
a
c
Törökország (1991) Franciaország (1991)c Franciaország (Vietnamd) (1996)c
PER (39%)a
AmpA Serratia fonticola (96%)a Japán (1988)c CME-1 (50%)a Chryseobacterium Mexikó (1991)c meningosepticum YENT (51%)a Yersinia enterocolitica YENT (36%)a Y. enterocolitica YENT (40%)a Y. enterocolitica GES-1 (50%)a
Brazília (1996)c Franciaország (Francia Guyanad) (1998)c Görögország (1999)c Belgium (2004)c
P. aeruginosa P. aeruginosa E. coli
Enterobacter cloacae E. coli
Serratia marcescens K. pneumoniae E. cloacae P. aeruginosa
NM, nincs meghatározva., a Aminosav szekvencia homológia (%). b Publikálás dátuma, c Izolálás dátuma; d A beteg származása, akiből az adott enzimet hordozó törzset izolálták
25
3.4.2. SHV-típusú ESBL-k Az SHV-típusú (SulpHydryl reagent Variable)
-laktamázok a Bush-Jacoby–
Medeiros osztályozás szerint a 2b és 2be csoportba (előbbiek a penicillinázok, míg utóbbiak az ESBL enzimek), az Ambler-féle osztályozás szerint az A molekuláris osztályba tartoznak. Az SHV-típusú
-laktamázok megtalálhatóak a K. pneumoniae
törzsek legnagyobb részében, mint kromoszómálisan kódolt, konstitutívan termelődő enzimek (Livermore 1995). A leggyakoribb kromoszómális allél variánsok a nemESBL-t kódoló blaSHV-1 és blaSHV-11 (Lee és mtsai 2006). A plazmidon kódolt blaSHV gének valószínűleg ebből a genomból kerültek plazmidokra az IS26 elem közvetítésével (Ford és Avison 2004). Több tanulmányban is leírták az IS26 elem inszercióját különböző plazmidon kódolt SHV-típusoknál (pl. SHV-2a, SHV5, SHV-11, SHV-12) (Gutmann és mtsai 1995, Nüesch-Inderbinen és mtsai 1997, Podbieski és mtsai 1991b). Feltételezik, hogy az IS26 nemcsak a mobilizációban játszik szerepet, hanem megnöveli a promoter erősségét is (Podbieski és mtsai 1991a). Az SHV-típusú -laktamázok esetében a szubsztrát specificitás kiszélesedését néhány kulcsfontosságú pozícióban lévő aminosav szubsztitúció okozza: Asp179, Gly238 és Glu240. A Gly238 és Glu240 pozíciókban bekövetkező változások jelentős szerepet játszanak a széles-spektrumú cefalosporinokkal szembeni rezisztencia kialakulásában. Az SHV-2, SHV-2a és SHV-3 enzimek, amelyekben a Gly238Ser szubsztitúció önmagában van jelen, magasabb szintű rezisztenciát mutatnak cefotaximmal, mint ceftazidimmel szemben (Bradford 2001, Podbieski és mtsai 1991b). A Gly240 pozícióban bekövetkező mutációk az enzim ceftazidimmel szembeni hidrolitikus aktivitását emelik. Pl. SHV-5 és SHV-12 enzimeket -ahol a Gly238Ser mellett Glu240Lys mutáció is jelen van- hordozó törzsek ceftazidimmel szemben is emelkedett szintű rezisztenciát mutatnak (Gutmann és mtsai 1995, Nüesch-Inderbinen és mtsai 1997). Eddig 134 SHV-típust írtak le, azonban csak 44 típus tartozik az ESBL enzimek közé (http://www.lahey.org/). Az SHV-típusú ESBL enzimek világszerte előfordulnak, leggyakrabban az SHV-2, SHV-2a, SHV-5 és SHV-12 típusokat írták le Enterobacteriaceae és Pseudomonas spp. törzsekben. Ilyen törzseket nemcsak kórházi, és területi fertőzésekből izoláltak, hanem különböző állati és ételmintákból is (Paterson
26
és Bonomo 2005). Jelenleg a legelterjedtebb SHV-típus az SHV-12, melyet elsősorban K. pneumoniae törzsekből, valamint egyre gyakrabban területen szerzett húgyúti fertőzésekből izolált E. coli törzsekből mutattak ki. Többször leírták az SHV-12 együttes megjelenését más ESBL enzimekkel (pl. TEM, CTX-M vagy GES típusok) (Canton és mtsai 2008).
3.4.3. TEM-típusú ESBL-k A TEM család a
-laktamázok legváltozatosabb családja. Filogenetikai
vizsgálatok arra utalnak, hogy a TEM és SHV enzimek rokon típusok, és mintegy 300400 millió évvel ezelőtt váltak el egymástól (Hall és Barlow 2004). Jelenleg 182 típusát írták le, és ebből 92 típus ESBL (http://www.lahey.org/), melyek az eredeti TEM-1 és TEM-2 nem-ESBL -laktamázokból alakultak ki. Jellegzetes aminosav szubsztitúciók találhatók az Asp104, Arg164, Ala237, Gly238 és Glu240 pozíciókban. Hasonlóan az SHV-típusú ESBL-enzimekhez az Gly238Ser szubsztitúció a cefotaxim hidrolízisért, a Glu240Lys szubsztitúció a ceftazidim hidrolízisért felelős (Paterson és Bonomo 2005). A legáltalánosabb szubsztitúció az Arg164 pozíciót érinti a TEM enzimeknél. Szerin vagy hisztidin csoportra való aminosavcsere nagyobb flexibilitást ad az enzimnek, és ennek eredményeként a nagyobb cefalosporin molekulák is beférnek az aktív centrumba (Sowek és mtsai 1991). A különböző típusú TEM ESBL-enzimek jellemző geográfiai elterjedtséget mutattak. A TEM-10 ESBL-enzimet termelő törzsek évekig csak az Egyesült Államokban okoztak kórházi járványokat, később Európában is elterjedtek. A TEM-3 ESBL-enzim Franciaországban volt gyakori, míg a TEM-12 és TEM-26 enzimet termelő törzsek Nagy-Britanniában okoztak járványokat. 1990-s évek végén TEM-24 enzimet termelő törzsek okoztak járványt Lengyelországban, míg Koreában TEM-52 enzimet termelő törzsek terjedtek el (Bradford 2001). A TEM-52 Európában is elterjedt és főleg Salmonella törzseknél, illetve húgyúti infekciókból izolált E. coli törzseknél fordult elő (Canton és mtsai 2008).
27
3.4.4. CTX-M-típusú ESBL-k A CTX-M (CefoTaXimáz-München) családba tartozó enzimek az utóbbi évtizedben a legelterjedtebb ESBL-típussá váltak, mind a nozokómiális, mind a közösségi fertőzések esetében (Canton és Coque 2006). Az 1980-as évek második felében írták le az első CTX-M-típusokat, és 1995-től kezdődően elterjedtségük a világ számos részén drámaian megnőtt. A CTX-M-családban eddig leírt enzimtípusok száma meghaladja a 90-et, és mindegyik ESBL-típusú (http://www.lahey.org/). Szekvencia homológia alapján a CTX-M-típusú -laktamázokat 5 fő csoportba lehet osztani: a CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 és CTX-M-25 csoport (4. táblázat). A csoporton belül a szekvencia homológia több mint 94%, az egyes csoportok között kevesebb, mint 90% (Bonnet 2004). A CTX-M-1 csoportba (pl. CTX-M-1, CTX-M-3, CTX-M-15), valamint a CTXM-9 csoportba (pl. CTX-M-9, CTX—14) tartoznak a legelterjedtebb enzimtípusok, míg a CTX-M-2 csoport tagjai (pl. CTX-M-2, CTX-M-4 és CTX-M-6) kevésbé elterjedtek (Canton és Coque 2006). A nagyfokú aminosav homológia alapján valószínű, hogy a CTX-M-1 és CTX-M-2 csoport tagjai a Kluyvera cryocrescens kromoszómális blaKLUC, illetve a K. ascorbata kromoszómális blaKLUA génjéből származnak, más tanulmányok pedig a CTX-M-8 és CTX-M-9 csoportot a K. georgiana kromoszómálisan kódolt blaKLUG génjéből származtatják (Canton és mtsai 2008, Olson és mtsai 2005, Rodriguez és mtsa 2004). A CTX-M enzimet kódoló plazmidok konjugációs kísérletekben általában jól átvihetők recipiens sejtekbe, és ez a képességük magyarázhatja a blaCTX-M hordozó plazmidok gyors terjedését (Baraniak és mtsai 2002b). Abban az esetben, ha a blaCTX-M gén nem átvihető plazmidon helyezkedik el, a plazmid átadása megtörténhet transzformációval vagy a sejtbe jelen lévő másik konjugatív plazmid segítségével (Tassios 1999). A CTX-M-típusú enzimekre jellemző, hogy jóval nagyobb aktivitást mutatnak cefotaximmal és ceftriaxonnal, mint ceftazidimmel szemben. Azonban néhány pontmutáció, ill. az ennek következtében kialakuló aminosavcsere megnöveli a ceftazidimmel szembeni aktivitás mértékét is. Pl. CTX-M-15 a CTX-M-3-tól, valamint a CTX-M-32 a CTX-M-1-től egy aminosavban tér el (Asp240Gly). Azonban ezzel a CTX-M-15 és a CTX-M-32 százszor nagyobb aktivitást mutat ceftazidimmel szemben, mint a CTX-M-3 és a CTX-M-1 (Cartelle és mtsai 2004, Poirel és mtsai 2002). CTX28
M-9 és CTX-M-14 esetében ugyanez az aminosav szubsztitúció alakította ki a CTX-M27 és CTX-M-16 típusokat, és eredményezett hasonló aktivitás növekedést ceftazidimmal szemben (Bonnet és mtsai 2001, Bonnet és mtsai 2003). A CTX-M gének és azok genetikai környezetének nagyfokú hasonlósága egyes Kluyvera sp. kromoszómális
-laktamázaihoz, feltételezte, hogy a gén valamilyen
mobilizációs folyamattal került a kromoszómáról plazmidra. Poirel és mtsainak in vitro kísérletei bizonyították, hogy K. ascorbata kromoszómális
-laktamáza inszerciós
szekvencia segítségével átkerülhet plazmidra, majd ezután konjugációval más fajokba (Lartigue és mtsai 2006). A blaCTX-M gének mobilizációjában szerepet játszó genetikai elemek közül leggyakrabban különböző inszerciós elemeket (IS, pl. ISEcp1, ISEcp1like, ISCR1) mutattak ki a blaCTX-M gének ORF-jétől 5’ és 3’ irányban (Lartigue és mtsai 2004, Perez és mtsai 2007, Poirel és mtsai 2008) (4. ábra). ISEcp1 nemcsak a mobilizációban játszik fontos szerepet, hanem erős promótert is biztosít a gén expressziójához. Kluyvera spp. törzsekben a kromoszómális CTX-M alacsony szinten, míg a plazmidon kódolt gének magas szinten expresszálódnak (Poirel és mtsai 2008). Más
CTX-M
kódoló
gének
(pl.
blaCTX-M-2)
1.
osztályú
integronon
helyezkedhetnek el (Arduino és mtsai 2002), illetve különböző mobilis genetikai elemeket is leírtak a környezetükben: IS10 (blaCTX-M-8) és IS26 (blaCTX-M-1) upstream irányban (Bonnet és mtsai 2000), vagy IS903-like elemet a CTX-M géntől (blaCTX-M-14, blaCTX-M-17) downstream irányban (Cao és mtsai 2002, Saladin és mtsai 2002). A CTX-M enzimek az egész világon elterjedtek, elsősorban CTX-M-15, CTXM-14, CTX-M-3, CTX-M-2 és CTX-M-9 (3. ábra). Dél-Amerikában elsősorban a CTXM-2, a CTX-M-9 és a CTX-M-15 (Bonnet 2004, Pallechi és mtsai 2007) típusok elterjedtek. Távol-Keleten készült felmérések alapján Japánban a CTX-M-2 és a CTXM-3, míg Kínában a CTX-M-3, a CTX-M-13 és a CTX-M-14 enzimek a domináns típusok (Chanawong és mtsai 2002, Yagi és mtsai 2000, Yamasaki és mtsai 2003). Európa nagy részében a CTX-M-15 a domináns típus, míg progenitor típusa a CTX-M3 csak a kelet-európai országokra jellemző. A szintén a CTX-M-1 csoportba tartozó CTX-M-1 és CTX-M-32 eleinte a mediterrán területeken volt elterjedtek, de mára már szinte minden európai országban megjelentek. Franciaországban, Spanyolországban és Angliában emellett a CTX-M-9 csoport tagjai (CTX-M-9 és CTX-M-14) is előfordulnak (Canton és Coque 2006, Canton és mtsai 2008).
29
Európában a CTX-M-15 termelő ST131 E. coli törzs nemzetközi szintű klonális terjedését írták le - elsősorban területen szerzett húgyúti infekcióknál (Coque és mtsai 2008a). A haszonállatokból CTX-M-termelő baktériumok (elsősorban Salmonella enterica és E. coli) izolálása feltételezi, hogy a rezisztens baktériumok rezervoárjaként az állati eredetű termékek a területi fertőzések kiindulópontjai lehetnek (Caratolli 2008, Duan és mtsai 2006, Meunier és mtsai 2006).
endémiás
sporadikus
nincs adat
3. ábra. Domináns és gyakori CTX-M -laktamáz típusok különböző földrajzi régiókban (Forrás: Canton és Coque 2006)
30
4. táblázat. Különböző CTX-M csoportok és blaCTX-M gének eredete (Forrás: Canton és mtsai 2008) CTX-M csoport CTX-M-1
CTX-M-2
CTX-M-8
CTX-M-9
CTX-M-25
Év (enzim, ország)a
1989 (CTX-M-1, Németország)
1986 (FEC-1, Japán)
1996 (CTXM-8, Brazília)
1994 (CTX-M9, Spanyolország)
2000 (CTX-M25, Kanada)
Enzimek
CTX-M-1, -3, -10, -11, -12, -15, -22, 23 -29, -30, -32, 33, -28, -36, -54, UOE-1
CTX-M-2, -4, 5, -6, -7, -20, CTX-M-8, 31, -44 CTX-M-40 (korábban TOHO-1), FEC-1
Eredeti species
K. ascorbata
K. ascorbata
K. georgiana
CTX-M-9, -13, 14, -16, -17, -18, -19, -24, -27, 45 (korábban TOHO-2), -46, - CTX-M, -26, 47, -48, -49, -50, 25, -39, -41 K. georgiana
NMb
a
Az első izolálás, vagy leírás éve (elsőként leírt enzim és az ország, ahol izolálták); CTX-M-14 és CTX-M-18 azonos enzim; bNM: nem meghatározott.
4. ábra. Enterobacteriacae törzsekben kimutatott blaCTX-M gének, valamint a Kluyvera cryocrescens blaKLUC kromoszómális gén genetikai környezetének sematikus ábrái (Forrás: Lartigue és mtsai 2004)
31
3.4.5. Ritka ESBL-ek Az elterjedt ESBL-típusok mellett (SHV, TEM, CTX-M, OXA) további ESBL fenotípust mutató, ritkán előforduló
-laktamázok is ismertek (pl. BES, VEB, PER,
SFO, GES, TLA). Elsősorban egy-egy földrajzi területre jellemzőek (Bradford 2001). A PER enzimek 25-27% hasonlóságot mutatnak a TEM és SHV-típusú enzimekkel (Paterson és Bonomo 2005). A PER-1 enzim, melyet 1991-ben mutatták ki P. aeruginosa törzsből, hatékonyan hidrolizálja a penicillineket és a cefalosporinokat, és a -laktamáz inhibitorok gátolják működését. A PER-1 elsősorban Törökországban és Koreában, míg a PER-2 Dél-Amerikában elterjedt (Naas és mtsai 2008). A VEB-típusú enzimek szintén magas szintű rezisztenciát biztosítanak cefalosporinokkal szemben, és a klavulánsav gátolja működésüket. Első képviselőjüket (VEB-1) 1996-ban mutatták ki egy vietnámi beteg mintájából izolált E. coli törzsből. További VEB-típusokat írtak le Kuwaitban és Kínában (Paterson és Bonomo 2005). A GES-típusú enzimek elsősorban integronban fordulnak elő. Franciaországban írták le először, de néhány országban járványos előfordulásról is beszámoltak: pl Korea, Görögország és Hollandia. A csoport egyes tagjai nemcsak cefalosporinokat, hanem karbapenemeket is képesek hidrolizálni (Naas és mtsai 2008). Az SFO, BEL, TLA, BES enzimek sporadikusan, egy-egy leírásban fordulnak csak elő (Naas és mtsai 2008)
3.5. Kiterjedt-spektrumú -laktamáz termelésének kimutatása A klinikai bakteriológiai diagnosztikában nemcsak a kórokozó identifikálása kulcsfontosságú,
hanem
antibiotikum
rezisztenciájának
és
rezisztencia
mechanizmusainak meghatározása is. Az antibiotikum terápia sikerességét döntően befolyásolja a kórokozó rezisztenciájának lehető leggyorsabb meghatározása, mely alapján az esetleges hatástalan empirikus terápia kiegészíthető vagy módosítható, illetve a szükséges kórházhigiénés intézkedések is elrendelhetőek (Paterson és mtsai 2001, Song és mtsai 2005). Az ESBL-termelő törzsek esetében általában igen beszűkül a terápiásan választható antibiotikumok köre, és az gyakran csak karbapenemekre korlátozódik (Paterson és Bonomo 2005). Számos tanulmányban beszámoltak arról, 32
hogy a nem megfelelően vagy késve kezdett antibiotikum terápia esetében az ESBLtermelő törzsek okozta fertőzések nagyobb mortalitással, hosszabb ápolási idővel és magasabb terápiás költséggel járnak (Melzer és Petersen 2007, Schwaber és mtsai 2006, Schwaber és Carmeli 2007). A klinikai és gazdasági vonatkozások mellett az ESBLtermelés kimutatása számos infekciókontroll és kórházhigiénés intézkedést von maga után: a legalapvetőbb, hogy az érintett betegeket el kell különíteni a többi betegtől a törzs továbbterjedésének megakadályozása érdekében. Az ESBL-termelés gyors és egyértelmű meghatározására, más mechanizmusoktól való elkülönítésére szolgáló módszerek igen nagy jelentőségűek, mivel egyrészt az alkalmazható antibiotikumokról adnak felvilágosítást, másrészt adatot szolgáltatnak az epidemiológiai, infekciókontroll és kórházhigiénés kivizsgálásokhoz is.
3.5.1. ESBL-termelés kimutatása fenotípusos módszerekkel Az ESBL-termelő kórokozók
-laktámokkal szembeni rezisztenciájának
fenotípusos jellemzői a következők: i, rezisztensek az amino-, és karboxipenicillinekkel, valamint a 3. és 4. generációs cefalosporinokkal, és aztreonammal szemben; ii, a laktamáz inhibitorok (pl. klavulánsav) gátolják működésüket (Bradford 2001, Drieux és mtsai 2008, Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). A baktériumok antibiotikum érzékenységének fenotípusos meghatározására többféle módszer alkalmazható. Magyarországon 1997. óta az antibiotikum rezisztencia vizsgálatok standardizált kivitelezését és kiértékelését a CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute) (korábban NCCLS-the National Committee for Clinical Laboratory Standards) ajánlása alapján végzik. Az ajánlott „gold standard” módszer a minimális gátló koncentráció meghatározása (MIC, az a legkisebb antibiotikum koncentráció), mely gátolja a baktérium növekedését). A MIC érték ismeretében a klinikus vagy az infektológus dönthet az adott antibiotikum terápiás alkalmazhatóságáról figyelembe véve annak farmakodinámiás és farmakokinetikai jellemzőit. A MIC érték meghatározására a CLSI agarhigításos, vagy leveshigításos módszert ajánl. Ennek során meghatározott mennyiségű baktérium növekedésének gátlását vizsgálják az antibiotikum felező hígítási sorát tartalmazó szilárd vagy folyékony táptalajoknál. A MIC meghatározás 33
másik formája az ún. E-teszt módszer. Az E-teszt egy tesztcsík, mely az adott antibiotikum koncentráció gradiensével van átitatva. Ez a tesztcsík a hagyományos MIC módszer 15 kettős léptékű hígításának megfelelő koncentráció tartományt biztosít. A másik módszer a korongdiffúziós módszer, melynek során az ajánlásban meghatározott mennyiségű antibitiotikumot tartalmazó korongot helyeznek a felületén egyenletes baktérium-szuszpenzióval bekent táptalajra. A korongból egyenletesen kidiffundáló antibiotikum gátolja az érzékeny baktérium növekedését. A kialakuló gátlási zóna nagyságából lehet az érzékenység mértékére következtetni. A CLSI ajánlásai a lehetséges baktérium és antibiotikum kombinációkra megadja az érzékeny/mérésékelt/ rezisztens határértékeket mind a MIC értékeknél, mind a korongdiffúziós vizsgálatnál. Az ESBL-termelés szűrésére használható a 3. generációs cefalosporin érzékenység: rezisztencia illetve csökkent érzékenység megjelenésekor felmerül az ESBL-termelés gyanúja (5. táblázat). Azonban az ESBL-termelő törzsek esetében a standard módszerekkel végzett és értékelt vizsgálatok egyes esetekben nem mutatnak in vitro rezisztenciát 3. generációs cefalosporinokkal szemben. Ettől függetlenül az ESBL rezisztencia mechanizmussal rendelkező törzseket 3. és 4. generációs cefalosporinok mindegyikére rezisztensnek kell tekinteni (CLSI 2003-2009). A CLSI ajánlásában ezért az ESBL-termelés szűrésére külön határértékeket határoztak meg E. coli, K. pneumoniae és K. oxytoca és P. mirabilis esetében (6. táblázat). A szűrési határértéket meghaladó törzseket lehetséges ESBL-termelőknek kell tekinteni, és további megerősítő vizsgálatokat kell végezni. Az eltérő szubsztrátspecificitású
ESBL-enzimtípusok
miatt
többféle
3.
generációs
cefalosporin
érzékenységét kell vizsgálni egyidejűleg. ESBL-termelés szűrésekor a legjobban alkalmazható -laktám a cefpodoxim, mivel a gátlási zóna alapján az ESBL-termelők és nem termelők egyértelműen elkülöníthetőek, azonban gyakran álpozitív eredményt ad. Mivel egyes típusok a ceftazidimet (pl. SHV-5), más típusok a cefotaximot (SHV-2a) bontják jobban, ezért ajánlott a ceftazidimet és cefotaximot egyszerre vizsgálni (Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003).
34
5. táblázat. Cefalosporinok érzékenységi határértékei Enterobacteriaceae törzsek esetében (CLSI 2003-2009) Zónaátmérő határérték (mm) MIC határérték (mg/L) Mérsékel Mérsékel Érzékeny t Rezisztens Érzékeny t Rezisztens
Antibiotikum
Antibiotiku m tartalom ( g)
cefotaxim
30
≥23
15-22
≤14
≤8
16-32
≥64
ceftriaxon
30
≥21
14-20
≤13
≤8
16-32
≥64
ceftazidim
30
≥18
15-17
≤14
≤8
16
≥32
cefpodoxim
10
≥21
18-20
≤17
≤2
4
≥8
6. táblázat. ESBL-termelés szűrésére alkalmazott antibiotikum érzékenységi értékek Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, E. coli és P. mirabilis esetében.
Antibiotikum
Antibiotikum tartalom ( g)
Zónaátmérő határérték (mm)
MIC határérték (mg/L)
K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli cefotaxim
30
≤27
>1
ceftriaxon
30
≤25
>1
ceftazidim
30
≤22
>1
cefpodoxim
10
≤17
>4
cefotaxim
30
≤27
>1
ceftazidim
30
≤22
>1
P. mirabilis
cefpodoxim 10 ≤22 >1 Bármelyik cefalosporin esetében korongdiffúziós határérték alatti, illetve a MIC határérték feletti értékek esetében ESBL megerősítő vizsgálatok elvégzése szükséges (CLSI 2003-2009)
Más Enterobacteriaceae fajok olyan kromoszómális -laktamázokat termelnek, melyek szintén 3. generációs cefalosporinokkal szembeni rezisztenciát okozhatnak (Pl. AmpC-típus). Ezeknél a specieseknél az ESBL-termelés szűrése nehezebb és a mechanizmus meghatározása bonyolultabb. Az ESBL-termelésre gyanús törzsek fenotípusos megerősítésére többféle módszert dolgoztak ki. Mindegyik alapelve, hogy a
-laktamáz inhibitorok és a 3.
generációs cefalosporinok között szinergizmus mutatható ki. Az elsőnek leírt megerősítő módszer a kétkorong szinergizmus teszt volt (double disk synergy test – DDST) (Jarlier és mtsai 1988). Ennek során a Mueller-Hinton táptalajra kent baktérium szuszpenzióra amoxicillin/klavulánsav tartalmú korongot helyeznek és ettől 30 mm-re 35
(középpontoktól számítva) cefotaxim (30
g) tartalmú korongot. ESBL-termelés
esetében a cefalosporin körüli gátlási zóna a klavulánsav tartalmú korong felé torzul, mivel ez utóbbi gátolja az ESBL-enzim működését, és így a cefalosporin képes kifejteni hatását. Jobb érzékenység érhető el, ha többféle cefalosporint is alkalmaznak (pl. ceftazidimet), illetve ha a korongok távolságát 20 mm-re csökkentik (Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). A módszer továbbfejlesztésével AmpCtermelő törzseknél is vizsgálható az ESBL-termelés (módosított DDST). Ebben az esetben cefepimmel (30 g) egészítik ki a vizsgálatot, amit az AmpC-típusú enzimek nem képesek bontani, azonban az ESBL enzimek igen (Pitout és mtsai 2003) (5. ábra/A)
A
B
C
5. Ábra ESBL-termelést megerősítő fenotípusos módszerek. A: pozitív módosított DDST, B: pozitív kombinált korong teszt, C: pozitív ESBL Eteszt Az AmpC-típusú enzimek hatása specifikus gátlószerekkel (cloxacillin, bórsav származékok) felfüggeszthető, és ekkor már alkalmazhatóak a korábban említett ESBLtermelést megerősítő fenotípusos módszerek (Drieux és mtsai 2008, Coudron 2005). A másik fenotípusos megerősítő módszer az ún. kombinált korong teszt módszer (combined disk method- CDM), amilyen teszek kereskedelmi forgalomban is kaphatóak. K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli és P. mirabilis esetében a CLSI is ajánlja az ESBL-termelés megerősítésére (CLSI 2003-2009). A módszer elve, hogy a cefalosporin tartalmú korongokkal (ceftazidim, cefotaxim és egyes kereskedelmi teszteknél cefpodoxim is) szembeni érzékenységet önmagukban és klavulánsavval
36
kiegészítve is vizsgálják. Ha bármely klavulánsav tartalmú korongnál mért gátlási zóna átmérő ≥5 mm-el nagyobb, mint a klavulánsav mentes cefalosporin esetében, akkor a teszt eredménye pozitív. Kromoszómális AmpC-túltermelő törzseknél a módszer általában nem működik, mivel ezek a törzsek az AmpC miatt is rezisztensek a 3. generációs cefalosporinokkal szemben, és nem megállapítható, hogy emellett termel-e a törzs ESBL enzimet vagy nem. Bár terápiás szempontból nincs lényeges különbség a kromoszómális AmpC-túltermelő illetve az ESBL-termelő törzsek között, azonban infekciókontroll és járványügyi szempontból jelentős az eltérés, mivel az előbbinél klonális terjedés várható, míg utóbbinál ez horizontális terjedéssel is együtt járhat, és az ESBL- géneket hordozó plazmidok általában többféle, más antibiotikummal szembeni rezisztenciát is kódolnak (Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). A harmadik, szintén kereskedelmi forgalomban is kapható módszer az ESBL Eteszt.
Hasonlóan
a
hagyományos
E-teszt
módszeren
alapuló
MIC
érték
meghatározáshoz a tesztcsíkra ebben az esetben is antibiotikum koncentráció gradiens vittek fel. Azonban itt a tesztcsík két részre van osztva: egyik fele cefalosporint (cefotaxim vagy ceftazidim) magában, míg a másik fele cefalosporint klavulánsavval kiegészítve tartalmaz. Pozitív esetben a cefalosporint tartalmazó oldalon kapott MIC érték és a klavulánsav tartalmú oldalon kapott MIC érték hányadosának legalább 8-nak kell lennie, ami azt jelenti, hogy az inhibitor legalább három hígítási fokkal csökkentette a MIC értéket. A módszer nagyon jól alkalmazható a CLSI ajánlásában is tárgyalt fajoknál, azonban, mivel a klavulánsav jó indukálószere az AmpC-típusú enzimeknek, általában már a kromoszómálisan kódolt, vad-típusú AmpC-t termelő törzseknél sem működik megfelelően. A kereskedelmi forgalomban van már olyan ESBL E-teszt is, mely 4. generációs cefalopsorint tartalmaz (cefepim), és ez már használható AmpCtermelő törzsek esetében is, azonban érzékenysége elmarad a 3. generációs cefalosporinokat tartalmazó ESBL E-teszt-ektől. A klinikai mikrobiológiában az antibiotikum vizsgálatokhoz egyre több helyen alkalmaznak különböző automata rendszereket (pl. Phoenix, VITEK 1 és 2, MicroScan). Ezek az automaták is képesek az ESBL-termelés vizsgálatára és a szakértői programjuk segítségével azok interpretálására. Összehasonlítva a DDST, CDM és ESBL E-teszt módszerekkel az automata rendszerek érzékenysége eléri azokat, azonban specificitásuk általában rosszabb (Drieux és mtsai 2008).
37
Az utóbbi években az ESBL-enzimek mellett egyre nagyobb arányban jelennek meg
más,
cefalopsorin
rezisztenciát
okozó,
szerzett
-laktamázt
termelő
Enterobacteriaceae törzsek (pl. plazmidon kódolt AmpC, MBL-k, szerin-típusú karbapenemázok).
A
fenotípusos
módszerek
ezért
egyre
bonyolultabbak
és
összetettebbé válnak. Doi és munkatársai ajánlásukban összefoglalták a legfontosabb laktamázok kimutatásának fenotípusos lehetőségeit azoknál a törzseknél, melyeknél a CLSI ajánlása alapján felmerül az ESBL-termelés lehetősége (Doi és Paterson 2007) (6. ábra).
ESBL-termelés szűrése CLSI ajánlása alapján (cefpodoxim, ceftazidim, aztreonam, cefotaxim, ceftriaxon)
negatív pozitív Nincs széles-spektrumú -laktamáz termelés
Fenotípusos megerősítő tesztek (CLSI ajánlása alapján)
pozitív
negatív
„A” osztályú ESBL-termelés
Karbepenem nem-érzékeny a törzs?
igen „B” osztályú MBL-termelés megerősítése (kelátképző vegyületek: DPS, EDTA)
nem igen nem „B’” osztályú MBL termelő
„C” osztályú -laktamáz termelés megerősítése (bórsav-alapú, cloxacillin-alapú vagy AmpC korong tesztek)
pozitív „C” osztályú -laktamáz termelés
negatív Más rezisztencia mechanizmus: -”D” osztályú -laktamáz termelés (OXA) -porin változás
6. ábra. Különböző 3. generációs cefalosporin rezisztenciát okozó -laktamázok kimutatásának fenotípusos lehetőségei (Forrás: Doi és Paterson 2007)
38
3.5.2. ESBL-kódoló gének kimutatása molekuláris módszerekkel A ESBL-termelésre gyanús törzsek antibiotikum rezisztencia génjeinek molekuláris biológiai módszerekkel való vizsgálata a klasszikus fenotípusos rezisztencia vizsgálat egyik alternatívája. Egyrészt lehetőséget nyújt a tenyésztéses módszereknél gyorsabb eredmény kiadására, ami terápiás szempontból jelentős. Másrészt az ESBL-típusok pontos meghatározása az epidemiológiai vizsgálatokhoz is fontos segítséget nyújt. Az ESBL-gének molekuláris kimutatásával kiküszöbölhető a klasszikus fenotípusos vizsgálatok számos problémája: pl. az ESBL enzimek eltérő szubsztrát specifitása, az enzimek különböző szintű expressziója, számos egyéb zavaró faktor (pl. inokulum hatás, további
-laktamázok együttes termelése, mely az
inhibitorok szinergista hatását elfedheti). A molekuláris módszerek hátránya viszont, hogy a rendkívül nagy változatosságot mutató ESBL-gének rutinszerű molekuláris genetikai meghatározása nagy laboratóriumi felkészültséget igényel. Szemben pl. a methicillin rezisztens Staphylococcus aureus molekuláris módszerekkel történő kimutatásával, ahol a rezisztencia az esetek túlnyomó többségében mecA gén közvetítette, ezért a rezisztencia molekuláris módszerekkel történő kimutatása egyszerű, a több száz ESBL-típus gyors kimutatása és megkülönböztetése már bonyolultabb módszereket és költséges eszközparkot igényel. Másik hátránya, hogy a molekuláris módszerek legnagyobb hányadával csak a korábban leírt gének és típusok mutathatók ki rutinszerűen, és az újonnan megjelenő rezisztenciagének így rejtve maradhatnak. Emellett az egyes enzimcsaládokon belül megtalálhatóak szűk-spektrumú, szélesspektrumú és kiterjedt-spektrumú
-laktamáz változatok is (pl. SHV-1 széles-
spektrumú, míg az SHV-2 ESBL-típus), melyek elkülönítése szintén további kiegészítő molekuláris módszerek elvégzését igényli. Az izoelektromos pont fókuszálás (IEF), mely régóta széles körben alkalmazott módszer a fehérjék szeparálására és meghatározására, korlátozott mértékben alkalmas az ESBL-enzimek jellemzésére is. Lényege, hogy a mintában meglévő fehérjék az elektroforézis során egy pH gradiens mentén vándorolnak az anód vagy a katód felé. A fehérjék az izoelektromos pontjuk (pI) eléréséig vándorolnak a gélben, és a
-
laktamázok specifikusan festhetők (pl. nitrocefinnel, melyet színváltozás kíséretében képesek a
-laktamázok hidrolizálni) (Stürenburg és Mack 2003) Az SHV-enzimek
39
izoelektromos pontja 7,0-8,2 között, a TEM-enzimek izoelektromos pontja 5,2-6,5 között, míg a CTX-M-enzimek izoelektromos pontja 7,6-9,0 között változik (http://www.lahey.org/). A nagyszámú -laktamáz típust korlátozott mértékben képes elkülöníteni, ezért e módszer jelentősége csökkent az utóbbi időben. Az ESBL-gének típusának DNS szintű meghatározásában a „gold standard” módszer mindenképpen a gének specifikus amplifikációja PCR módszerrel, majd a termék nukleotid sorrendjének meghatározása szekvenálással (Cockerill 1999). Az ESBL-típusok kimutatására és tipizálására számos további módszert dolgoztak ki, melyek lehetnek gyorsabbak és/vagy költségtakarékosabbak, azonban a DNS-szekvenáláson alapuló módszer felbontóképességét jelenleg még nem érik el.
3.6. ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek első hazai leírásai Az első hazai vizsgálatokat 1996-ban végezték, melynek során 170 K. pneumoniae (114 Szegedről, 27 észak-, 10 észak-nyugat-, 8 nyugat-magyarországi régióból és 11 Budapestről származott), valamint 82 E. cloacae és 15 S: marcescens törzset gyűjtöttek össze és vizsgáltak meg ESBL-termelés irányában. Ezek közül 15 K. pneumoniae (9 szegedi, 3 budapesti és 2 észak-magyarországi) és egy S. marcescens törzs bizonyult SHV-típusú ESBL-termelőnek. PCR-RFLP-SSCP módszerrel határozták meg az alléltípusokat, melynek alapján 12 K. pneumoniae és a S. marcescens törzs SHV-2, míg 3 K. pneumoniae SHV-5 termelőnek bizonyult. A SHV-2 termelő törzsek többsége gentamicinnel szemben, egy pedig ciprofloxacinnal szemben bizonyult rezisztensnek. Az SHV-2 termelő S. marcescens esetében in vivo horizontális génátvitelt feltételeztek a szerzők, mivel ugyanabban az időben ugyanabból a betegnek a mintájából izoláltak egy SHV-2-pozitív K. pneumoniae törzset is (Nagy és mtsai 1998, Prágai és mtsai 1998). Az első ESBL-pozitív K. pneumoniae törzs okozta nozokómiális járványt Magyarországon Szabó és mtsai írták le 1999-ben. A szolnoki Hetényi Géza Megyei Kórház PIC részlegén 1998. június 1. és november 30. között 15 betegtől összesen 21 SHV-5-típusú ESBL-termelő K. pneumoniae ill. egy SHV-5 pozitív S. marcescens törzset izoláltak. A környezeti (n=143) és a dolgozói (n=22) szűrések során pedig egy fürdető szappanból származó mintából tenyészett ki SHV-5-termelő K. pneumoniae törzs. Mindegyik törzs rezisztens volt gentamicinnel szemben, és érzékeny volt 40
amikacinra és ciprofloxacinra. Az ESBL-típusokat ebben az esetben is PCR-RFLPSSCP módszerrel azonosították. Egy kivételével a K. pneumoniae klinikai izolátumok, a környezeti mintából izolált K. pneumoniae, ill. a S. marcescens törzs egy nagyon hasonló restrikciós képet mutató, nagyméretű plazmidot hordoztak. Emellett a 15 K. pneumoniae törzs közül 14 valamint a környezeti szűrésből származó törzs klonális rokonságot mutatott AP-PCR módszerrel. Ez bizonyította a törzsek genetikai rokonságát, valamint a S. marcescens esetében a blaSHV-2 gén in vivo horizontális átadását. A hatékony infekciókontroll intézkedéseknek köszönhetően további törzseket nem izoláltak az osztályról (Szabó és mtsai 1999). Magyarországon izolált ESBL-termelő Salmonella Typhimurium törzsek sporadikus előfordulásáról két publikáció jelent meg. Első esetben 1998-ban egy 1 éves jugoszláv beteget kezeltek az Országos Kardiológiai Intézetben Budapesten, akinek székletéből és trachea váladékából is TEM-52-típusú ESBL-termelő S. Typhimurium izolátumokat tenyésztettek ki. A törzsek kétféle antibiotikum rezisztenciával rendelkeztek, és a ribotipizálás eredménye alapján is eltérő klónokhoz tartoztak. A blaTEM-52-hordozó plazmidokkal végzett vizsgálatok a gén in vivo horizontális átvitelét feltételezték a két törzs között. A kórokozókat imipenem és amikacin kombinált terápia hatására sikeresen eradikálták (Vahaboglu és mtsai 2000). Szintén 1998-ban izoláltak Budapesten három, sporadikus esetből származó ESBL-termelő S. Typhimurium törzset, melyek blaCTX-M-4 gént hordoztak. Ezeket a törzseket összehasonlították oroszországi (1 törzs 1996-ban, 6 törzs 1997-ben lezajlott szentpétervári járványokból származott) és görög törzsekkel (2 klonálisan független törzs). A vizsgálatok azt mutatták, hogy az oroszországi és a magyar törzsek egyaránt egy 12 kb nagyságú, blaCTX-M-4 gént hordozó plazmiddal rendelkeztek, bár a restrikciós emésztéses vizsgálatok alapján a magyar törzsek plazmidjából hiányzott egy 0,6 kb nagyságú szakasz. A PFGE vizsgálat eredménye az oroszországi és a magyarországi törzsek klonális rokonságát mutatta (Tassios és mtsai 1999).
41
3.7. ESBL-termelő törzsek más antibiotikum csoportokkal szembeni rezisztenciája Az ESBL-termelő törzsek általában korezisztenciát mutatnak több más antibiotikum család tagjaival szemben is: pl. fluorokinolonok, aminoglikozidok és trimethoprim/sulfamethoxazol, ami hozzájárul a multirezisztens ESBL-termelő törzsek és a géneket hordozó plazmidok szelekciójához és fennmaradásához mind a kórházi környezetben, mind a területen (Canton és mtsai 2008, Coque és mtsai 2008a). A fluorokinolon rezisztens, ESBL-termelő törzsek aránya fokozatosan emelkedik, kezdetekben K. pneumoniae, majd később E. coli törzseknél is (Coque és mtsai 2008a).
3.7.1. Fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia A fluorokinolonoknak igen jó az Enterobacteriaceae családba tartozó baktériumokkal szembeni aktivitása. Baktericid hatásukat a bakteriális DNS-giráz és – topoizomeráz gátlása útján érik el. Az 1980-s években vezették be a klinikai használatba, és azóta széleskörűen alkalmazzák a bakteriális fertőzések kezelésében (Robicsek és mtsai 2006a). Az utóbbi két évtizedben azonban a fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia általánossá vált az Enterobacteriaceae törzsek körében, és egyes tanulmányokban már 50% feletti rezisztencia arányt is leírnak (Robicsek és mtsai 2006a, Robicsek és mtsai 2006b). Az Enterobacteriaceae családban két rezisztenciamechanizmus fordul elő leggyakrabban. A DNS topoizomeráz II-t (DNS-girázt) kódoló gyrA és gyrB, illetve a topoizomeráz IV-t kódoló parC génekben bekövetkező mutációk általában magasszintű rezisztenciát eredményeznek. A rezisztenciáért felelős mutációk a gének bizonyos területeire lokalizálódnak, melyeket kinolon rezisztenciát meghatározó régióknak (QRDRs - quinolone resistance determining regions) neveznek. A másik gyakori mechanizmus az antibiotikum intracelluláris szintjének csökkentése, melyet efflux pumpák (pl. AcrAB-TolC Escherichia coli-ban) expressziójával és/vagy az Ompk csökkent termelésével érnek el (Jacoby 2005, Robicsek és mtsai 2006a, Huang 1996). Ezek általában alacsonyabb szintű rezisztenciát eredményeznek magukban, azonban többféle mechanizmus kombinálódása már magas szintű rezisztenciát okozhat. Az utóbbi években két új, átvihető, szerzett kinolon-rezisztencia determinánst írtak le (Robicsek és mtsai 2006a, Robicsek és mtsai 2006b, Tran és Jacoby 2002). Mindkettő
42
elsősorban kiegészítő, támogató szerepet játszik a rezisztencia kialakításában. Az első rezisztenciát qnr gének közvetítik, melynek terméke a topoizomerázhoz kötődve véd a fluorokinolonok hatásától. Eddig három ilyen gént írtak le: qnrA, qnrB, qnrS. Ezek a rezisztencia determinánsok világszerte elterjedtek az Enterobacteriaceae törzsek között, és gyakran megtalálhatóak kiterjedt-spektrumú
-laktamázt termelő törzsekben
(Robicsek és mtsai 2006a, Tran és Jacoby 2002). A másik mechanizmus a fluorokinolonok inaktiválásán alapul. Az aac(6’)-Ib aminoglikozid acetiltranszferáz egyik változata, az aac(6’)-Ib-cr kódolta fehérje nemcsak az aminoglikozidokat, hanem egyes fluorokinolonokat (pl. ciprofloxacin, norfloxacin) is képes módosítani, és így inaktiválni (Robicsek és mtsai 2006a, Robicsek és mtsai 2006b). E két utóbbi mechanizmust kódoló gének gyakran olyan plazmidokon helyezkednek el, melyek további jelentős rezisztencia determinánsokat hordoznak (pl. ESBL és AmpC-típusú laktamázok, aminoglikozid rezisztencia gének) (Robicsek és mtsai 2006a).
3.7.2. Aminoglikozidokkal szembeni rezisztencia Az aminoglikozidok baktericid antibiotikumok, melyek a bakteriális riboszóma 30S alegységéhez kötődve, a fehérjeszintézis gátlása útján érik el baktériumölő hatásukat. A klinikailag jelentős Gram-negatív baktériumokkal (Enterobacteriaceae fajok, Acinetobacter spp., Pseudomonas spp.) szemben igen jó az in vitro aktivitásuk. Annak ellenére, hogy nefrotoxikus és ototoxikus mellékhatásuk lehet, valamint az aminoglikozid rezisztens törzsek száma is növekszik, az aminoglikozidok értékes és néha elengedhetetlen részét képezik számos fertőzés kezelésének, és egyes esetekben a profilaxisnak. Többféle rezisztencia mechanizmust is leírtak már az aminoglikozidokkal szemben: i, az antibiotikum csökkent felvétele, illetve az intracelluláris szint csökkentése efflux pumpákkal; ii, a célpont molekula (riboszóma) módosítása; iii, az aminoglikozidok enzimatikus módosítása. A Gram-negatív baktériumok esetében az aminoglikozidokat módosító enzimek termelése a rezisztencia fő mechanizmusa. Három enzimcsaládot lehet megkülönböztetni: i, aminoglikozid foszfotranszferázok (APH), ii, aminoglikozid acetiltranszferázok (AAC), iii, aminoglikozid nukleitidil-transzferázok (ANT). Az egyes enzim típusok és azon belül az altípusok különböző specifitással képesek bontani az egyes aminoglikozidok antibiotikumokat. Klinikai izolátumok
43
aminglikozidokkal szembeni rezisztenciája igen változatos, függően a vizsgált antibiotikumtól, az adott kórokozótól, a szerzett rezisztencia mechanizmusoktól. Az aminoglikozid rezisztencia epidemiológiája részben a sokféle aminoglikozid-módosító enzim miatt, melyek különbözőképpen kombinálódhatnak egy-egy törzsben, részben további kiegészítő rezisztencia mechanizmusok megjelenése miatt mára egyre komplexebbé vált. Mivel az aminoglikozid módosító enzimeket kódoló gének gyakran mobilis elemeken helyezkednek el (pl. plazmidok, transzpozonok) más antibiotikum rezisztenciát kódoló génekkel együtt, ezért a nem-aminoglikozid antibiotikumok alkalmazása is jelentősen befolyásolhatja ezek epidemiológiáját. Számos tanulmányban leírták, hogy az aminoglikozid rezisztencia spektruma szélesedik azokban az országokban és kórházakban, ahol ezeket az antibiotikumokat (pl gentamicin, tobramycin,
amikacin,
netilmicin)
széles
körben
alkalmazzák.
Belgiumban,
Franciaországban és Görögországban, ahol az amikacin használat elterjedtebb, mint más európai országokban az AAC(6’)-I enzim –mely amikacin rezisztenciát okozelőfordulása jóval magasabb. Ezzel szemben Németországban az aminoglikozid felhasználás 80%-át a gentamicin teszi ki, a fő rezisztencia gének az ANT(2’’)-I, valamint AAC(3)-IV, melyek a gentamicinnel szemben biztosítanak rezisztenciát. Annak ellenére, hogy már több mint 50-féle aminoglikozid módosító enzimet írtak le, csak néhány terjedt el ezek közül a Gram-negatív baktériumok körében: (ANT(2’’)-I, AAC(6’)-I, valamint AAC(3)-I, AAC(3)-II, AAC(3)-III, AAC(3)-IV és AAC(3)-VI (Vakulenko és Mobashery 2003). Az ESBL-termelő törzsek általában különböző aminoglikozidokkal szemben is rezisztensek (Paterson és Bonomo 2005, Coque és mtsai 2008a). ESBL-termelő K. pneumoniae és E. coli törzsekben leggyakrabban az AAC(3)-II (rezisztenciát biztosít gentamicinnel és tobramycinnel szemben) és AAC(6’)-I ( amikacin és tobramycin rezisztenciát okoz) enzimeket kódoló géneket mutattak ki (Coque és mtsai 2008b, Hawkey és Jones 2009, Karisik és mtsai 2006, Shanonn és mtsai 1998, Seo és mtsai 2010).
44
4. CÉLKITŰZÉSEK Az Országos Epidemiológiai Központban 2003. szeptember 6-án kezdte meg működését
az
ESBL-termelő
Gram-negatív
kórokozók
Nemzeti
Referencia
Laboratóriuma (ESBL-NRL) dr. Füzi Miklós vezetésével. A referencia laboratórium létrehozásának célja volt, hogy az akkor Magyarországon megjelenő és egyre több járványt okozó ESBL-termelő törzsek genetikai hátterét, hazai elterjedtségét vizsgáljuk, bővítsük ismereteinket a leggyakoribb ESBL-típusokról, és jellemezzük a géneket hordozó mobilis genetikai elemeket. Az évek során a hazai klinikai mikrobiológiai laboratóriumok a Referencia Laboratóriumba küldték nemcsak a halmozódásokból, járványokból származó ESBL-termelő, hanem a nehezen meghatározható rezisztencia mechanizmussal rendelkező izolátumokat is, megerősítésre és további vizsgálatokra. Az ESBL-NRL célja továbbá, hogy a megszerzett ismeretekről, eredményekről, illetve a nemzetközi trendekről minél több fórumon tájékoztassa a hazai szakembereket. Reményeink szerint az eredményeink hozzájárulhatnak a hazai antibiotikum rezisztencia
helyzet
alaposabb
ismeretéhez,
és
elvezethetnek
azokhoz
az
intézkedésekhez, melyek javítják a hazai helyzetet. A rutinszerűen végzett megerősítő és tipizáló vizsgálatokon kívül elsősorban nozokómiális fertőzésekben előforduló, járványokat okozó törzseken végeztünk további fenotípusos és molekuláris genetikai vizsgálatokat. Dolgozatom célkitűzései egyben az ESBL-NRL végzett munkám célkitűzéseit is tartalmazzák: 1. A DNS-szekvenálás bevezetése a hazai ESBL-gének jellemzésére, és a módszer segítségével a 2002-2003 között Magyarországon elterjedt ESBL-típusok felmérése, azok földrajzi megoszlásának meghatározása és az eredményeket összevetése a szomszédos országok adataival. 2. A 2002-2003-ban Perinatális Intenzív Centrumokban (PIC) járványokat, illetve halmozódásokat okozó ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsek genetikai rokonságának meghatározása és az általuk hordozott ESBL-gének jellemzése, és összehasonlítása egy 1998-ban hazánkban lezajlott ESBL-termelő K. pneumoniae járvány törzseivel. Ezzel kapcsolatosan egy 1998-ban gyűjtött 3. generációs
cefalosporin
rezisztens
45
E.
cloacae
törzsgyűjteményben
megvizsgáltuk az ESBL-hordozás gyakoriságát és lehetséges kapcsolatát a Klebsiella spp. törzsekkel. 3. A hazánkban 2003-ban megjelent CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek jellemzése. A CTX-M-termelő törzsek terjedésének további monitorozása, és összehasonlítása a 2003-ban izolált törzsekkel. 4. ESBL-termelés gyakoriságának vizsgálata nem-tifoid Salmonella enterica törzsek körében, melyeket az Országos Epidemiológiai Központban gyűjtöttek 2000-2004 között. Az ESBL-termelő törzsek jellemzése, és összehasonlítása a korábban hazánkban leírt ESBL-típusokkal. 5. 2006-2007 között gyűjtött ESBL-termelő, humán és állati eredetű E. coli törzsek
genetikai
hátterének
vizsgálata,
és
a
két
törzsgyűjtemény
összehasonlítása. 6. Az évek során szerzett ismeretanyag alkalmazása járványok prospektív vizsgálatánál, melyet egy budapesti kórházban 2008-ban lezajlott járvány kivizsgálásának példáján mutatunk be.
46
5. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 5.1. Baktérium törzsek Az Országos Epidemiológiai Központba 2002. óta küldik a hazai klinikai mikrobiológiai laboratóriumok az ESBL-termelésre gyanús izolátumokat (7. táblázat). A beküldött törzsek száma 2005-ig folyamatosan emelkedett. 2006-ban az egészségügyi és az ÁNTSZ hálózat átalakításával a beküldött izolátumok száma csökkent, főleg járványokból izoláltak kerültek beküldésre. 7. táblázat. 2002-2008 között az ESBL-NRL-be küldött ESBL-termelő törzsek faj szerinti megoszlása A törzs beérkezésének ideje (év) Faj
2002. 2003. 2004. 2005. 2006. 2007. 2008. ESBL-termelő törzsek száma (db)
Klebsiella pneumoniae
85
197
183
281
102
129
257
Escherichia coli
11
23
59
83
50
63
161
Klebsiella oxytoca
16
23
25
22
6
7
30
Enterobacter cloacae
10
13
19
37
9
9
40
Egyéb
5
6
12
14
23
8
8
131
265
298
491
193
222
503
Összes beküldött ESBL-termelő törzs
A beküldött izolátumokhoz mellékelt beküldőlapok tartalmazzák a legfontosabb epidemiológiai adatokat (beteg adatai, mintatípus, izolálás helye, ideje, laboratóriumi vizsgálati eredmények), ami lehetővé teszik a későbbi retrospektív vizsgálatok elvégzését. Az ESBL-gének hazai megoszlásának vizsgálata: 35 reprezentatív izolátumot választottunk ki a 2002. január és 2003. augusztusa között 25 hazai mikrobiológiai laboratóriumból küldött 252 ESBL-termelő Enterobacteriaceae izolátumból. Az izolátumok kiválasztásakor a szempontjaink voltak: i, a legjelentősebb fajokat vizsgáljunk; ii, az ország minél több megyéjét reprezentáljuk; iii, ebben az időszakban bejelentett járványokból csak 1-1 izolátum szerepeljen a vizsgálatban.
47
SHV-termelő Klebsiella spp. járványtörzsek vizsgálata: 1998-ban, valamint 2002-2003. között 126 olyan ESBL-termelő Klebsiella spp. izolátumot küldtek be az ESBL-NRL-be további vizsgálatra, melyeket 5 megyei illetve oktató kórház PIC osztályán lezajlott járványokból izoláltak. A bejelentett járványok a következőek voltak: i, PIC 1 (Fejér megye): 2002-ben egy elhúzódó járvány után (izolátumok n=35) egy évvel később egy újabb járvány ugyanazon az osztályon (n=26); ii, PIC 2 (Bács-Kiskun megye): két járvány négy év különbséggel (n=24 (1998), n=9 (2002); iii, PIC 3 (Csongrád megye): 2002-ben két hónapig tartó járvány (n=12); iv, PIC 4(Vas megye): K. oxytoca járvány (n=10); v, PIC 5 (Baranya megye): széklet hordozás halmozódása (n=8). A vizsgálatban résztvevő izolátumok 86 beteg klinikai mintáiból származtak: vér (n=17), felső légúti váladék (n=55), alsó légúti váladék (n=3), vizelet (n=18), szemváladék (n=1), fülváladék (n=1), széklet (n=18), sebváladék (n=1), katéter (n=1), köldök (n=1), endotracheális tubus (n=12). Ehhez kapcsolódóan 1998-ban PIC osztályokon izolált 142 db 3. generációs cefalosporin rezisztens E. cloacae törzset vizsgáltunk meg ESBL-termelés irányában, és hasonlítottunk össze a járványokat okozó ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsekkel. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata: 2003-ban az ESBL-NRL-be beküldött ESBL-termelő K. pneumoniae izolátumok közül 17 mutatott addig nem tapasztalt magas szintű ciprofloxacin rezisztenciát, valamint ceftazidimnél magasabb szintű cefotaxim rezisztenciát. Az izolátumok öt megye nyolc különböző kórházának felnőtt beteg ellátó osztályairól (sebészet, urológia, belgyógyászat, nefrológia) származtak, melyeket elsősorban műtéti sebváladékokból (10/17) és vizeletből (3/17) izolálták. Ezek a törzsek voltak az első CTX-M-típusú -laktamáz termelő izolátumok Magyarországon. A 2004-ben beküldött izolátumok között csak 4 volt CTX-M-termelő. Azonban a 2005-ben beérkezett 281 ESBL-termelő K. pneumoniae izolátum közül már 196 volt CTX-M-termelő és magas szinten ciprofloxacin rezisztens. Ezek az izolátumok 13 megye 35 kórházából érkeztek be az ESBL-NRL-be, és hat járványból (n=137) valamint sporadikus esetekből származtak. Elsősorban intenzív terápiás (n=82), belgyógyászati (n=34), traumatológiai (n=18), sebészeti (n=18) és urológiai (n=18)
48
osztályokról izolálták. Az izolátumok 36%-a vizeletből, 18%-a vérből, 15%-a sebből és 9%-a alsólégúti váladékból származott. ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata: Az OEK Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályára 2000-2004 között 13692 nem-tifoid S. enterica törzset küldtek be fágtipizálásra. Az osztályon rutinszerűen végzett korongdiffúziós antibiotikum rezisztencia vizsgálatok alapján 1690 törzs volt ampicillin rezisztens. Az ESBL-termelés további vizsgálatára ezeket a törzseket választottuk ki. ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata: 2006-2007 között 113 humán klinikai mintából izolált ESBL-termelő törzset küldtek be az ESBL-NRL-be további vizsgálatra. Ebben az időszakban nem jelentettek be ESBL-termelő E. coli okozta járványt, ezért az izolátumok sporadikus esetekből származtak. Ezek közül 21 egészségügyi intézetből származó 45 reprezentatív törzs genetikai hátterét vizsgáltuk meg. Az Országos Állategészségügyi Intézetben 2006-2007 között diagnosztikus állati mintákból összesen 2366 E. coli törzset izoláltak, melyből 18 bizonyult ESBLtermelőnek. Ezeknek a törzseknek a genetikai hátterét hasonlítottuk össze a humán mintákból izolált törzsekkel. ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek okozta járvány kivizsgálása: 2008. május 30-án és 31-én egy hazai kórház koraszülött osztályán több ápoltnál véráramfertőzésre utaló szisztémás tünetek jelentkeztek. Ennek kapcsán folytatott mikrobiológiai és epidemiológiai vizsgálatok során 8 hemokultúra és 202 szűrő és környezeti minta került feldolgozásra. A kitenyésztett 68 Enterobacteriaceae törzs további genetikai vizsgálatát végeztük el.
5.2. Baktériumtörzsek fenotípusos vizsgálata 5.2.1. Törzsek identifikálása és szerotípus meghatározás A törzsek identifikálását különböző félautomata identifikáló rendszerekkel végeztük: API20E, ATB ID32E (bioMerieux, Marcy l’Étoile, Franciaország), Micronaut E (Genzyme Virotech GmbH, Ruesselsheim, Németország). Az E. coli törzsek szerotipizálása Orskov és Orskov módszere (Orskov és Orskov 1984), míg a S. enterica szerotipizálása a Kauffman-White séma szerinti standard módszerekkel történt
49
az OEK Bakteriológiai II. osztályán az OEK Savó-és Diagnosztikum Termelő Egységében előállított savókkal.
5.2.2. Antibiotikum rezisztencia vizsgálatok 5.2.2.1. Szűrő vizsgálatok Az ampicillin rezisztens Salmonella enterica törzsek esetében 2 mg/L ceftazidim és 2 mg/L cefotaxim tartalmú Mueller-Hinton agaron vizsgáltuk a 3. generációs cefalosporinokkal szembeni csökkent érzékenységet. A 2008. évi kórházi járvány kivizsgálásakor a környezeti mintákból az ESBLtermelésre gyanús törzsek kitenyésztéséhez 2 mg/L cefotaxim tartalmú Mueller-Hinton agart használtunk.
5.2.2.2. Korongdiffúziós vizsgálatok Az antibiotikum érzékenységi vizsgálatok egy részét korongdiffúziós módszerrel végeztük
a
CLSI
ajánlása
alapján.
Az
ESBL-termelés
megerősítésére
a
kromoszómálisan AmpC-t nem termelő Enterobacteriaceae törzseknél a CDM elvén alapuló ESBL SET (MAST Diagnostics, Reinfeld, Németország) kereskedelmi tesztet alkalmaztuk. A vizsgálat során ceftazidim (30μg) – ceftazidim (30μg)/ klavulánsav (10μg); cefotaxim (30μg) – cefotaxim (30μg)/ klavulánsav (10μg) és cefpodoxim (30μg) – cefpodoxim (30μg)/ klavulánsav (10μg) tartalmú korongokat használtunk. A kromoszómális AmpC-termelő törzsek esetében (pl. E. cloacae és S. marcescens) a megerősítést módosított DDST vizsgálattal végeztük (Pitout és mtsai 2003):
ennél
a
vizsgálatnál
a
Mueller-Hinton
lemez
közepére
helyezett
amoxicillin/klavulánsav (20 g/10 g) korongtól 20-20 mm-re helyezzük el a ceftazidim (30 g), cefotaxim (30 g), cefepim (30 g) és aztreonam (30 g) korongokat (5. ábra/A). Ceftazidim és cefotaxim együttes alkalmazásával a különböző szubsztrát specifitású ESBL enzimek detektálása nagyobb érzékenységgel lehetséges, a cefepim használatával a módszer alkalmas a konstitutív AmpC-termelő törzsek vizsgálatára is. Pozitív esetben a cefalosporinok, illetve a monobaktám körüli gátlási zóna az amoxicillin/klavulánsav
50
korong felé torzul. A jobb érzékenység eléréséhez cloxacillint vagy 3-amino-fenilbórsavat is használtunk (Drieux és mtsai 2008, Coudron 2005).
5.2.2.3. Minimális inhibitor koncentráció (MIC) meghatározása Az ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálatánál a CLSI ajánlása szerint végzett agarhigításos módszerrel határoztuk meg a törzsek ceftazidim, cefotaxim, ciprofloxacin, gentamicin és amikacin MIC értékeit. A további vizsgálatokban kiválasztott törzsek antibiotikum érzékenységi vizsgálatánál a MIC értékek meghatározását E-teszt (AB Biodisk, Solna, Svédország) módszerrel végeztük. A következő antibiotikumokat alkalmaztuk: ceftazidim (0.016–256 mg/L), cefotaxim (0.016–256 mg/L), cefepim (0.016–256 mg/L), gentamicin (0.016–256 mg/L), tobramycin, (0.016–256 mg/L), amikacin (0.016–256 mg/L), netilmicin (0.016–256 mg/L), ciprofloxacin (0.002–32 mg/L), tetraciklin (0.016–256 mg/L), trimethoprim/ sulfamethoxazol (0.002–32 mg/L), imipenem (0.002–32 mg/L) és cefoxitin (0.016–256 mg/L). Egyes vizsgálatoknál ennél kevesebb antibiotikum csoport MIC értékét határoztuk meg. ESBL-termelés megerősítéséhez ESBL E-teszt-t (cefotaxim, ceftazidim és cefepim tartalmú tesztcsíkok) is alkalmaztunk (AB Biodisk). Minden antibiotikum érzékenységi vizsgálatnál az E. coli ATCC 25922, illetve az ESBL-termelő K. pneumoniae ATCC700603 törzset használtuk kontrollként.
5.3. Molekuláris vizsgálatok A leírt molekuláris genetikai vizsgálatokat általánosan használjuk az ESBLNRL-be küldött törzsek esetében. A dolgozatban tárgyalt tanulmányoknál nem minden esetben használtuk az összes módszert.
5.3.1. Polimeráz láncreakció (polymerase chain reaction – PCR) Az ESBL-NRL-ben általánosan használt módszer a különböző antibiotikum rezisztencia gének kimutatására, a szekvenálni kívánt DNS szakaszok specifikus felszaporítására. A különböző antibiotikum rezisztencia gének kimutatására használt primerek listáját a 8. táblázat, az alkalmazott PCR hőprofilokat a 9. táblázat tartalmazza.
51
A PCR vizsgálathoz a baktériumsejtekből a DNS feltárást alkalikus lízissel végeztük. Ennek során 16-18 órás tenyészetből vett 2-3 telepet szuszpendáltunk el 25 l 0,5M
NaOH
(Merck,
Darmstadt,
Németország)
oldatban,
majd
15
perc
szobahőmérsékleten történt inkubáció után hozzáadtunk 25 ml 1M Tris-HCl (pH 8,3) (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Németország) oldatot, és 200
l PCR tisztaságú vizet
(GIBCO, Invitrogen, CA, USA). A mintát további felhasználásig -20°C-on tartottuk. A PCR reakciók összetétele, 25 l végtérfogatra számolva, a következő volt: 12,5 l 2x koncentrációjú ThermoPrime Master Mix (1,5 mM Mg2Cl) (Thermo Scientific, Epsom, Egyesült Királyság), 3
l DNS minta, 0,5
M végkoncentrációjú
primerek (IDT Inc., Coralville, USA) (8. táblázat szerint). A PCR-t követően a termékeket 2% agaróz gélben (Agarose, Type II, Sigma) detektáltuk, és ethidium-bromiddal festettük. A gélelektroforézist 45 percig végeztük, az alábbi képlet alapján számított feszültségen: az anód és katód között mért távolság (cm) x 5 V/cm. Molekulasúly markerként 100bp-as markert (Superladder-Low 100bp Ladder, Thermo Scientific), vagy 500bp-as markert (Superladder-MID 500bp Ladder, Thermo Scientific) használtunk. Az inszerciós elemek (IS26 és ISEcp1) elhelyezkedését „PCR-mapping” módszerrel vizsgáltuk, melynek során az IS elemekre specifikus primereket kombináltuk a -laktamáz génekre tervezett primerekkel. Az ESBL géntípusok meghatározását, és a további antibiotikum rezisztencia gének PCR-val kapott termékeinek vizsgálatát DNS-szekvenálással végeztük el. Ehhez a legtöbb vizsgálatnál az amplifikáló primereket használtuk, a CTX-M gének kivételével. A CTX-M-I és CTX-M-II csoportba tartozó géneknél külön szekvenáló primert alkalmaztunk (8. táblázat). A szekvenciák értékeléséhez a Chromas, a ClustalX és a BioEdit Sequence Alignment Editor freeware programokat használtuk, és BLAST program (http://www.ncbi.nih.gov) segítségével hasonlítottuk össze a GenBank adatbázisában található szekvenciákkal. Egy CTX-M-15-termelő K. pneumoniae és egy CTX-M-5-termelő Salmonella Typhimurium esetében elvégeztük a gén genetikai környezetének vizsgálatát is. A vizsgálat során az ismert ESBL-gén szekvenciára tervezett primerekkel végeztünk direkt
DNS-szekvenálást
a
géntől
52
5’
és
3’
irányban.
8. táblázat. A PCR vizsgálatok során használt primerpárok szekvenciái és a referenciái Célszekvencia
Funkció
blaSHV
-laktamáz
blaTEM
-laktamáz
blaCTX-M
-laktamáz
CTX-M-I csoport
-laktamáz
CTX-M-II csoport
-laktamáz
I. osztályú integron
mobilis genetikai elem
ISEcp1
inszerciós szekvencia
IS26 Ma1
inszerciós szekvencia CTX-M reverse általános
Primer
Oligonukleotid szekvencia (5'-3')a
Referencia
SHV-F
5'-CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC-3'
SHV-R
5'-TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA-3'
Bedenic és mtsai (2001)
TEM-F
5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTG-3'
TEM-R
5'-TTACCAATGCTTAATCAGTGAG-3'
CTX-Mált-F
5'-TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA-3'
CTX-Mált-R
5'-CGATATCGTTGGTGGTGCCATA-3'
CTX-M-I-F
5'-ATGGTTAAAAAATCACTGCG-3'
CTX-M-I-R
5'-CAGCGCTTTTGCCGTCTAAG-3'
CTX-M-II-F
5'-ATGATGACTCAGAGCATTCG-3'
CTX-M-II-R
5'-TTATTGCATCAGAAACCGTG-3'
5'CS
5'-GGCATCCAAGCAGCTTTGAC-3'
3'CS
5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3'
ISEcp1 F
5'-GCAGGTCTTTTTCTGCTCC-3'
ISEcp1 R
5'-ATTTCCGCAGCACCGTTTGC-3'
IS26 F
5'-AGCGGTAAATCGTGGAGTGA-3'
Ma1
5'-ACYTTACTGGTRCTGCACAT-3'
aac-(6')-Ib-F
5'-CATGACTGAGCATGACCTT-3'
aac-(6')-Ib-R
5'-GAAGGGTTAGGCATCACT-3'
aac(3)-II-F
5'-CAATAACGGAGGCAATTCG-3'
aac(3)-II-R
5'-GATTATCATTGTCGACGG-3'
aac-(6')-Ib
aminoglikozid rezisztencia
aac(3)-II
aminoglikozid rezisztencia
OXA-1like
-laktamáz
tet(A)
tetraciklin rezisztencia
tet(B)
tetraciklin rezisztencia
tet(C)
tetraciklin rezisztencia
tet(C) -F
5'-TCTAACAATGCGCTCATCGT-3'
tet(C )-R
5'-GGTTGAAGGCTCTCAAGGGC-3'
qnrA
kinolon rezisztencia
qnrA-F
5'-TCAGCAAGAGGATTTCTCA-3'
qnrA-R
5'-GGCAGCACTATGACTCCCA-3'
qnrB
kinolon rezisztencia
qnrB-F
5'-TCGGCTGTCAGTTCTATGATCG-3'
qnrB-R
5'-TCCATGAGCAACGATGCCT-3'
qnrS
kinolon rezisztencia
qnrS-F
5'-TGATCTCACCTTCACCGCTTG-3'
qnrS-R
5'-GAATCAGTTCTTGCTGCCAGG-3'
gyrA
topoizomeráz II
parC
topoizomeráz IV
OXA-1-like-F
5'-GGATAAAACCCCCAAAGGAA-3'
OXA-1-like-R
5'-TGCACCAGTTTTCCCATACA-3'
tet(A)-F
5'-GTAATTCTGAGCACTGTCGC-3'
tet(A)-R
5'-CTGCCTGGACAACATTGCTT-3'
tet(B)-F
5'-CTCAGTATTCCAAGCCTTTG-3'
tet(B)-R
5'-CTAAGCACTTGTCTCCTGTT-3'
gyrA-F
5'-CGACCTTGCGAGAGAAAT-3'
gyrA-R
5'-GTTCCATCAGCCCTTCAA-3'
parC-F
5'-AATGCCAGCGCCAAATTCAAAAAG-3'
parC-R
5'-CCCCCAGTTTCCCTGACCATCC-3'
a
Vahaboglu és mtsai (2001) Edelstein és mtsai (2003) Baraniak és mtsai (2002a) Chmelnitsky és mtsai (2005) Daly és Fanning (2000) Karim és mtsai (2001) Eckert és mtsai (2004) Eckert és mtsai (2004) Leflon-Guibout és mtsai (2004) Leflon-Guibout és mtsai (2004) Karisik és mtsai (2006) Guardabassi és mtsai (2000) Guardabassi és mtsai (2000) Guardabassi és mtsai (2000) Kehrenberg és mtsai (2006) Kehrenberg és mtsai (2006) Kehrenberg és mtsai (2006) Weigel és mtsai (1998) Gruteke és mtsai (2003)
Kevert bázisok kódjai: M=A+C, R=A+G, W=A+T, S=G+C, Y=C+T, V=A+G+C, H=A+C+T, D=A+G+T, B=G+T+C, N=A+G+C+T, K=G+T
53
9. táblázat. A PCR reakciók hőprofilja
SHV-F
Kezdő denaturáció 95°C
SHV-R
150 s
Primerek
TEM-F
95°C
TEM-R
150 s
CTX-Mált-F
95°C
CTX-Mált-R
150 s
CTX-M-I-F
95°C
CTX-M-I-R
150 s
CTX-M-II-F
95°C
CTX-M-II-R
150 s
5'CS
95°C
3'CS
150 s
ISEcp1 F
95°C
ISEcp1 R
150 s
aac-(6')-Ib-F
95°C
aac-(6')-Ib-R
150 s
aac(3)-II-F
95°C
aac(3)-II-R
150 s
OXA-1-like-F
95°C
OXA-1-like-R
150 s
tet(A)-F
95°C
tet(A)-R
150 s
tet(B)-F
95°C
tet(B)-R
150 s
tet(C) -F
95°C
tet(C )-R
150 s
qnrA-F
95°C
qnrA-R
150 s
qnrB-F
95°C
qnrB-R
150 s
qnrS-F
95°C
qnrS-R
150 s
gyrA-F
95°C
gyrA-R
240 s
parC-F
95°C
parC-R
180 s
Ciklusok száma 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 28 30 30
Denaturáció Anneláció Elongáció Végső elongáció Hűtés 95°C
65°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
50°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
65°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
60°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
60°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
60 s
60 s
420 s
600 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
90 s
300 s
∞
95°C
55°C
72°C
72°C
4°C
30 s
30 s
45 s
300 s
∞
95°C
52°C
72°C
72°C
4°C
30 s
60 s
60 s
480 s
∞
54
5.3.2. PCR-RFLP (Restrikciós fragment hossz polimorfizmus) vizsgálat A PCR-RFLP módszer során a kiválasztott DNS szakaszt amplifikáltuk PCR módszerrel, majd a kapott termékeket specifikus hasítóhellyel rendelkező restrikciós endonukleázokkal emésztettük. Az emésztett termékeket agaróz gélelektroforézissel detektáltuk a PCR-nél leírt paraméterek mellett. Gly238→Ser mutáció kimutatása SHV-típusú -laktamáz génben: A legtöbb és a legelterjedtebb SHV-típusú ESBL-génekben a 238. pozícióban a glicin helyén szerin található, melyet egy guanin→adenin szubsztitúció okoz. A nukleotid szubsztitúció hatására a génben NheI restrikciós endonukleáz hasító hely keletkezik (7. ábra) (Nüesch-Inderbinen és mtsai 1996). PCR-RFLP módszerrel így elkülöníthetők a legelterjedtebb SHV-típusú ESBL gének a nem-ESBL blaSHV génektől.
7. ábra NheI restrikciós endonukleáz felismerő helye és az SHV-génben található nukleotid szubsztitúciós hely Ezt a vizsgálatot rutinszerűen végeztük az ESBL-NRL-ben. A PCR termék tisztításához a Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, CA, USA) kitet használtuk. A restrikciós hasítást NheI (New England Biolabs, MA, USA) restrikciós endonukleázzal végeztük a gyártó ajánlása szerint. CTX-M-csoportok elkülönítése PCR-RFLP módszerrel: A CTX-M-típusú ESBL-gének kimutatására használt általános PCR mindegyik csoportot kimutatja (8. táblázat). Az egyes csoportokat RFLP módszerrel különítettük el, melyhez PstI (New England Biolabs) és PvuII (New England Biolabs) restrikciós endonukleázokat használtunk. Az öt CTX-M-csoport eltérő mintázatot mutat a CTX-M általános PCR termék két enzimmel történő emésztése után (Edelstein és mtsai 2003).
55
5.3.3. Escherichia coli törzsek filogenetikai csoportjának meghatározása multiplex PCR-el Az E. coli a legtöbb állat és az ember normál bélflórájának tagja. Egyes jellegzetes E. coli törzsek többféle intesztinális és extra-intesztinális fertőzést okozhatnak, mint hasmenés, húgyúti fertőzések, véráramfertőzések, újszülöttek meningitise (Orskov és Orskov 1992). Filogenetikai vizsgálatok azt mutatták, hogy az E. coli törzsek négy filogenetikai csoportba sorolhatóak (A, B1, B2, D) (Clermont és mtsai 2000). A virulens extraintesztinális kórokozó törzsek a B2 és D csoportba, míg a kommenzalista törzsek az A és B1 csoportba tartoznak (Clermont és mtsai 2000, Picard és mtsai 1999). Az ESBL-termelő E. coli törzsek filogenetikai besorolását multiplex PCR-el végeztük el (10. táblázat). A PCR reakció összeállítását Clermont és mtsai publikációja alapján végeztük (Clermont és mtsai 2000). 10. táblázat E. coli filogenetikai csoport multiplex PCR primerei Primer ChuA.1 ChuA.2 YjaA.1 YjaA.2 TspE4C2.1 TspE4C2.2
Oligonukleotid szekvencia (5'-3') 5'-GACGAACCAACGGTCAGGAT-3' 5'-TGCCGCCAGTACCAAAGACA-3' 5'-TGAAGTGTCAGGAGACGCTG-3' 5'-ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC-3' 5'-GAGTAATGTCGGGGCATTCA-3' 5'-CGCGCCAACAAAGTATTACG-3'
Referencia
Clermont és mtsai (2000)
5.3.4. ESBL-termelő Escherichia coli ST131 törzsek kimutatása multiplex PCR-el Az utóbbi években számos publikációban beszámoltak a CTX-M-15-termelő E. coli törzsek nemzetközi szintű, klonális terjedéséről. Az ST131 szekvencia típusba tartozó, O25 szerotípusú törzsek magas virulenciájúak, és egyre nagyobb problémát jelentenek világszerte az egészségügyi ellátásban. (Clermont és mtsai 2008, Coque és mtsai 2008b, Lau és mtsai 2008, Nicolas-Chanoine és mtsai 2008). Clermont és mtsai kidolgoztak egy ST131 specifikus PCR módszert (11. táblázat), mellyel megvizsgáltuk a hazai, ESBL-termelő O25 szerotípusú E. coli törzseink klonális hovatartozását (Clermont és mtsai 2009).
56
11. táblázat E. coli ST131 multiplex PCR primerei Célszekvencia
Funkció
Primer
Oligonukleotid szekvencia (5'-3')
pabB
ST131 specifikus
O25pabBspe.F
5'-TCCAGCAGGTGCTGGATCGT-3'
O25pabBspe.R
5'-GCGAAATTTTTCGCCGTACTGT-3'
belső kontroll ST131 PCRhez
trpA.F
5'-GCTACGAATCTCTGTTTGCC-3'
trpA
trpA2.R
5'-GCAACGCGGCCTGGCGGAAG-3'
Referencia Clermont és mtsai (2009)
5.3.5. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek kinolon rezisztenciát meghatározó régióinak (QRDR) vizsgálata A CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek magas szintű ciprofloxacin rezisztenciáját a QRDR-k DNS-szekvenálásával vizsgáltuk. A gyrA és parC QRDR-ban bekövetkezett változásokat 10 kiválasztott törzsön határoztuk meg. A szekvenáláshoz a PCR-nél használt (8. táblázat) primereket használtuk (Weigel és mtsai 1998, Gruteke és mtsai 2003). Az aminosav változásokat okozó nukleotid szubsztitúciókat korábbi publikációk alapján azonosítottuk (Weigel és mtsai 1998, Gruteke és mtsai 2003).
5.3.6. Enterobacteriaceae törzsek makrorestrikciós profiljának meghatározása PFGE módszerrel A pulzáltatott-mezejű gélelektroforézissel (PFGE) vizsgáltuk a törzsek genetikai rokonságát. Enterobacteriaceae törzsek esetében a CDC (Centers for Disease Control and Prevention) strandardizált PFGE protokollját használtuk (CDC 2000), és a vizsgálatokat Chef-DR II rendszeren végeztük el (BioRad, Kalifornia, CA, USA). Ez alól csak a salmonella volt kivétel, ahol CDC PulseNet Salmonella protokollját alkalmaztuk (Swaminathan és mtsai 2001). A géleket Fingerprinting II Informatix Software (BioRad, Ventura, CA, USA) segítségével értékeltük ki. A PFGE mintázatok hasonlóságát Dice koefficienssel jellemeztük, a cluster analízis és a dendrogram UPGMA („unweighted pair group method with arithmetic averages”) módszerrel készült. Egy pulzotípusba (PT) tartozónak tekintettük azokat a makrorestrikciós mintázatokat, melyek legalább 85%-s hasonlóságot mutattak. Az egyes PT-ket a Tenover kritériumok alapján jelöltük betűkkel (Tenover és mtsai 1995). Az azonos PTba való tartozás a törzsek genetikai rokonságát és valószínű klonális kapcsolatát jelenti. 57
A PFGE vizsgálatokat az OEK Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályán végezték.
5.3.7. CTX-M-termelő Klebsiella pneumoniae törzsek szekvencia típus meghatározása MLST módszerrel A multi-lókusz szekvencia tipizálás (MLST) során a K. pneumoniae 7 háztartási génjének specifikus szakaszát hasonlítják össze DNS-szekvenálással. A különböző allél variánsok együttesen ún. szekvencia típusokat (ST) határoznak meg (12. táblázat). Az MLST vizsgálatot Diancourt és mtsai publikációja alapján végeztük (Diancourt és mtsai 2005). 12. táblázat Klebsiella pneumoniae MLST-hez használt primerei Gén
Funkció
Primer
Oligonukleotid szekvencia (5'-3')a
rpoB
RNS polimeráz B b-alegység
rpoB-F
5'-GGCGAAATGGCWGAGAACCA-3'
rpoB-R
5'-GAGTCTTCGAAGTTGTAACC-3'
gapA-F
5'-TGAAATATGACTCCACTCACGG-3'
gapA
Glicerinaldehid3-foszfát dehidrogenáz
gapA-R
5'-CTTCAGAAGCGGCTTTGATGGCTT-3'
mdh
Almasavdehidrogenáz
mdh-F
5'-CCCAACTCGCTTCAGGTTCAG-3'
mdh-R
5'-CCGTTTTTCCCCAGCAGCAG-3'
phoE
Foszforin E
phoE-F
5'-ACCTACCGCAACACCGACTTCTTCGG-3'
phoE-R
5'-TGATCAGAACTGGTAGGTGAT-3'
tonB-1F
5'-CTTTATACCTCGGTACATCAGGTT-3'
tonB
Periplazmatikus energia transzducer
tonB-2R
5'-ATTCGCCGGCTGRGCRGAGAG-3'
pgi
Foszfoglükózizomeráz
pgi-F
5'-GAGAAAAACCTGCCTGTACTGCTGGC-3'
pgi-R
5'-CGCGCCACGCTTTATAGCGGTTAAT-3'
infB
Transzláció iniciáló faktor 2
infB-F
5'-CTCGCTGCTGGACTATATTCG-3'
infB-R
5'-CGCTTTCAGCTCAAGAACTTC-3'
Referencia
Diancourt és mtsai (2005)
a
Kevert bázisok kódjai: M=A+C, R=A+G, W=A+T, S=G+C, Y=C+T, V=A+G+C, H=A+C+T, D=A+G+T, B=G+T+C, N=A+G+C+T, K=G+T
Habár a PFGE vizsgálat jó eszköz a baktérium izolátumok epidemiológiai tipizálására, azonban általában nem alkalmas a térben és időben nem-összefüggő izolátumok összehasonlítására. Ezzel ellentétben, az MLST módszer, mely a háztartási gének genetikai változatosságán alapul, jól alkalmazható időben és térben hosszabb
58
távot felölelő epidemiológiai összehasonlító vizsgálatok elvégzésére (Maiden és mtsai 1998).
5.3.8. Plazmid profil analízis, konjugációs és elektroporációs kísérletek A plazmid DNS kivonását és a vertikális gélelektroforézist Kado és Liu módszerével végezték az OEK Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályán (Kado és Liu 1981). Molekulasúly markerként az E. coli 517 törzset használták (Macrina és mtsai 1978). Az ESBL-gének átvihetőségét recipiens törzsbe konjugációs kísérletekkel vizsgáltuk. A vizsgálat során 4 ml táplevesben (OEK, Táptalajkészítő Egység) 0,5 McFarland sűrűségű szuszpenziót készítettünk az E. coli K12 J5-3Rif törzsből. A donor törzsből is 0,5 McFarland sűrűségű szuszpenziót készítettünk 2 mg/L cefotaxim vagy ceftazidim tartalmú táplevesben. 37°C-on rázatva inkubáltuk, amíg a szuszpenziók sűrűsége elérte a 3 McFarlandot. Centrifugáltuk 3000 rpm-en 5 percig a recipiens teljes térfogatát, a donor szuszpenzióból pedig 1 ml-t. Majd átmértük a recipiens pelletét a donor pelletéhez, és szuszpendáltuk. Felengedtük 1 ml táplevessel és egy éjszakán át növesztettük 35-37 0C-on, rázatás nélkül. Másnap szelektív táptalajra (cefotaxim 4 mg/L és rifampicin 300 mg/L) kikentünk 50 µl-t, és a kinőtt telepeket vizsgáltuk tovább. Azoknál a donor törzseknél, amelyek rezisztensebbek voltak ceftazidimmel szemben, mint cefotaximmal szemben, ceftazidimet is használtunk antibiotikumként, az előzőekkel megegyező arányokban. Abban az esetben, ha egy vizsgált törzsnél a konjugációs kísérletek negatív eredménnyel zárultak, elektroporációval próbáltuk DH5-
E. coli recipens törzsbe
átvinni az ESBL-gént kódoló mobilis genetikai elemet. Az elektroporációt Gene Pulser Xcell elektroporátor rendszerrel (BioRad) végeztük. A recipiens sejtek előkészítését és a vizsgálatot a Gene Pusler Xcell E. coli-ra vonatkozó ajánlása szerint végeztük. Az elektroporánsokat cefotaxim 2 mg/L vagy ceftazidim 2 mg/L tartalmú táptalajon növesztettük.
59
Ha a konjugációs vagy elektroporációs kísérletek pozitív eredménnyel zárultak, akkor vizsgálatonként 10-10 telepből plazmid profil analízist végeztük Kado és Liu módszerével. Azokat a transzkonjugánsokat (TK)/ elektroporánsokat (EP) vizsgáltuk tovább, melybe csak egy plazmid került át. A TK/EP törzsekből QIAprep Spin Miniprep Kit-tel (Qiagen, Hilden, Németország) nyertük ki a plazmid DNS-t. Ezután plazmid-RFLP vizsgálatot végeztünk: PstI (New England BioLabs) enzimes emésztés után 0,7%-s agaróz gélben (SIGMA) futtattuk 5V/cm feszültségen 90 percig. A plazmid-RFLP során kapott restrikciós mintázatokat szemmel értékeltük ki és hasonlítottuk össze.
60
6. EREDMÉNYEK
6.1. SHV-típusú kiterjedt-spektrumú -laktamázok elterjedtsége és földrajzi megoszlása Magyarországon, 2002-2003 2002. január és 2003. augusztusa között 25 hazai mikrobiológiai laboratórium 252 ESBL-termelő Enterobacteriaceae izolátumot küldött be megerősítésre és további vizsgálatokra az ESBL-NRL-be. A beküldött törzsek túlnyomó többsége a Klebsiella genusba tartozott (K. pneumoniae (65,9%), K. oxytoca (12,7%). A törzskollekcióban megtalálható további fajok: E. coli (11,5%), E. cloacae (5,2%), S. marcescens (2,8%), C. freundii (1,2%), és 1-1 Serratia liquefaciens és E. aerogenes. Az izolátumok 92,1%-
M
T1047
T991
T890
T886
T823
T112
T111
T107
T1047
T991
T890
T886
T112
T111
T107
elhasított (8. ábra)
T823
a hordozott olyan SHV-típusú géneket, melyeket az NheI restrikciós endonukleáz
M
1000bp 900 bp 800bp 700 bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp
SHV PCR
SHV RFLP
8. ábra SHV és SHV PCR-RFLP pozitív eredmények (M: molekulasúly marker, 100bp) Az SHV-típusú ESBL-géneket hordozó izolátumok közül 35-t választottunk ki további vizsgálatokhoz, melyek 14 megyéből és Budapestről származtak (megyénként 1-3 törzs). Két K. pneumoniae izolátum kivételével a vizsgálat idejében lezajlott minden járványból csak egy-egy törzset tartalmazott a kollekció. A kiválasztott izolátumok a következők voltak: K. pneumoniae (n=21), K. oxytoca (n=6), S. marcescens (n=3), E. coli (n=3) és E. cloacae (n=2). Mind a 35 törzs esetében meghatároztuk az SHV gén
61
típusát DNS-szekvenálással. A SHV-gének típusai, az izolátumok földrajzi megoszlása és a vizsgált antibiotikumok MIC értékei a 13. táblázatban és a 9. ábrán láthatóak. Két domináns ESBL-típust azonosítottunk: 28 törzsben a SHV-5 típust, 6 törzsben pedig a SHV-2a típust. Továbbá egy E. cloacae törzs SHV-12 gént hordozott. Mindegyik SHV-5-termelő és az SHV-12-termelő törzs ceftazidimmel szemben magasabb szintű rezisztenciát mutatott, mint cefotaximmal szemben, az SHV-2a termelő törzseknél ez fordítva volt. Korondiffúziós vizsgálat alapján minden törzs érzékeny volt ciprofloxacinra.
9. ábra SHV-típusú ESBL gének földrajzi megoszlása Magyarországon 2002-2003-ban A kórház helyzete, ahol az ESBL-termelő korokozót izolálták
62
13. táblázat A 35 SHV-típusú ESBL-termelő törzs izolálásának helye, a minta típusa és antibiotikum érzékenysége Törzs száma
Faj
Mintaa
Osztály
42 190 312 84 236
Ba´ cs Ba´ cs Ba´ cs Baranya Borsod-Abau´ jZemple´ n
K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae
HK Seb FL Széklet HK
Újszülött Sebészet PIC Gyermek Gyermek
SHV-5 SHV-2a SHV-2a SHV-5 SHV-5
367
Borsod-Abau´ jZemple´ n Budapest Budapest Csongra´ d Csongra´ d Csongra´ d Csongra´ d Feje´ r Feje´ r Feje´ r Feje´ r Feje´ r Feje´ r Hajdu´ Heves Heves Ja´ sz-NagykunSzolnok
K. oxytoca
HK
Gyermek
SHV-5
E. coli K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae S. marcescens K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae E. cloacae K. pneumoniae K. oxytoca S. marcescens
CSF HK Vizelet Vizelet Seb Egyéb FL FL FL FL FL HK FL Vizelet Egyéb Seb
Gyermek Gyermek Gyermek Gyermek Újszülött Újszülött PIC PIC PIC PIC PIC PIC Sebészet Újszülött Gyermek Sebészet
SHV-5 SHV-5 SHV-2a SHV-5 SHV-2a SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-12 SHV-5 SHV-5 SHV-5
Ja´ sz-NagykunSzolnok
K. oxytoca
Seb
ITO
SHV-5
321
Ja´ sz-NagykunSzolnok
K. pneumoniae
Vagina
Gyermek
SHV-5
484 352 103 341 192
Koma´ rom Pest Somogy Somogy SzabolcsSzatma´ r-Bereg
K. pneumoniae K. oxytoca E. cloacae K. pneumoniae E. coli
HK Vizelet HK Vizelet Vizelet
ITO Háziorvos ITO Fertőző Gyermek
SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-2a
193
SzabolcsSzatma´ r-Bereg
K. pneumoniae
Vizelet
Fertőző
SHV-2a
23 88 135 358 411
Vas Vas Vas Zala Zala
K. oxytoca K. oxytoca K. pneumoniae E. coli S. marcescens
AL Vizelet AL Vizelet AL
PIC Újszülött ITO PIC PIC
SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5
107 201 215 216 218 388 60 63 65 167 205 399 530 160 356 99 319
a
CTX
MIC (mg/l)b AMC GEN NET
AK
128 6 8 128
24 8 8 16
4 8 12 3
4 0.5 48 4
48 0.5 8 64
16 1.5 1.5 24
256
12
3
4
64
24
64
12
3
2
12
4
NM 96 6 256 4 96 96 96 128 192 96 128 24 256 64
NM 8 6 4 4 32 8 16 12 8 8 16 4 32 12
NM 4 8 3 16 96 4 4 4 6 6 8 128 4 3
NM 3 4 2 32 6 4 4 4 3 0.5 3 32 3 6
NM 64 0.5 24 8 48 32 64 32 32 0.5 48 16 32 6
NM 16 1.5 6 1.5 24 16 32 16 12 1.5 8 8 16 24
48
24
96
4
48
32
48
8
3
4
64
16
8
8
4
0.5
0.5
1.5
32 96 256 128
4 8 32 16
4 2 24 2
0.5 4 6 4
0.38 48 256 48
1.5 16 24 24
8
24
8
0.5
0.5
1.5
1.5
4
6
0.5
0.5
1.5
256 96 64 32
32 24 16 12
2 3 3 12
3 6 0.38 8
12 64 0.5 64
4 16 1.5 48
128
32
48
6
64
48
ESBLtípus CAZ
Megye
HK, hemokultúra; CSF, cerebrospinális folyadék; FL, felsőlégúti; AL, alsólégúti; ITO, intenzív terápiás osztály; PIC, perinatális intenzív osztály; b CAZ, ceftazidim; CTX, cefotaxim; AMC, amoxicillin/klavulánsav; GEN, gentamicin; NET, netilmicin; AK, amikacin; NM, nincs meghatározva
63
6.2. Perinatális intenzív centrumokban járványokat okozó SHV-típusú ESBL-termelő Klebsiella spp. törzsek vizsgálata 1998-2003 között a hazai PIC osztályokon a legtöbb járványt Klebsiella spp. okozta (19/25, OEK-be bejelentett járványok alapján). Ezek közül hétben ESBLtermelő törzsek voltak a kórokozók. Az érintett 5 PIC osztályról származó (10. ábra) 126 törzs fenotípusos és molekuláris vizsgálatait végeztük el (14. táblázat). Mindegyik törzs SHV-típusú ESBL-gént hordozott az NheI enzimmel történt PCR-RFLP vizsgálat alapján. Az összes izolátum rezisztens volt ceftazidimmel és cefotaximmal szemben, 74% netilmicinnel és 71% trimethoprim/sulfamethoxazollal szemben is rezisztensnek bizonyult, azonban ciprofloxacin rezisztens törzset nem izoláltak a járványok során. Az azonos PIC-okban azonos járványidőszakban izolált törzsek sem mutattak teljesen egyforma antibiotikum rezisztencia mintázatot (14. táblázat).
10. ábra ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok Magyarországon, 1998-2003 (Az OEK-be bejelentett járványok). NICU=PIC
64
14. táblázat SHV-termelő Klebsiella spp. okozta járványok helye és időtartama, a résztvevő izolátumok plazmid profilja, antibiogramja és pulzotípusa Faj/származás K. pneumoniae, PIC 1
Izolálás hónapja (járvány időtartama 2002. júniusjúlius
(Fejér megye)
Plazmid profil (kb) (n)
CAZ
CTX
FEP
NET
SXT
CIP
Pulzotípus
181, 94, 80 (9)a2
R
R
É
R
É
É
E
203, 94 (2)
R
R
É
R
É
É
E
181, 94 (3)a2
R
R
É
R
É
É
E
181, 94, 50 (8)
R
R
É
R
É
É
D
R
R
É
R
É
É
D
203, 94 (3)
R
R
É
R
É
É
D
112 (1)
R
R
É
É
É
É
K
181, 94 (4)
217, 58 (1)
R
R
R
R
R
É
L
R
R
É
R
É
É
E
203, 94 (2)
R
R
É
R
É
É
E
94, 2.7 (26)a3
R
R
É
R
R
É
J
R
R
É
R
R
É
F
94, 2.2 (24)a2
R
R
É
É
R
É
G
162, 94 (3)a2
R
R
É
É
R
É
C
203, 94 (1) 94, 50, 5.4, 4.3, 3.7, 2.3 (1) 116, 18 (2)
R
R
É
R
R
É
C1
R
R
É
R
R
É
B2
R
R
É
É
R
É
A
R
R
É
R
R
É
B
R
R
R
R
R
É
B
R
R
R
É
R
É
B1
R
R
R
É
É
É
C2
2002. április
94, 5.5 (1) 228, 130, 94, 4.6 (1) 94, 6.0 (10)a1
R
R
É
R
R
É
I
2002. július
170, 94 (1)
R
R
É
R
R
É
94 (7)
R
R
É
R
R
É
2003. július
K. pneumoniae, PIC 3 (Csongrád county)
a1
181, 94 (4)a1
2002. november
K. pneumoniae, PIC 2 (Bács-Kiskun county)
2002. július 1998. szeptember 2002. novemberdecember
137, 94 (9)a3
228, 94, 5.5 (1) 228, 94, 5.5, 5.2, 2.9 (2)
K. oxytoca, PIC 4
Antibiogramb
(Vas megye) K. pneumoniae, PIC 5 (Baranya county)
H
CAZ, ceftazidim; CTX, cefotaxim; FEP, cefepim; NET, netilmicin; SXT, trimethoprim/sulfamethoxazol; CIP, ciprofloxacin. a1,2,3 Hemokultúrából származó törzsek száma b Antibiogram:Korongdiffúziós vizsgálat eredménye ( É, érzékeny; R, rezisztens)
65
A PFGE vizsgálat alapján a 126 törzs 12 különböző PT-ba tartozott (14. táblázat, 11. ábra). A cluster analízis azt mutatta, hogy 5 különböző kórház PIC osztályán a hét járványt 10 különböző klón okozta.
Izolátum Pulzotípus
Származás Minta
PIC 1 PIC 1 PIC 1 PIC 3 PIC 1 PIC1 PIC 1 PIC 4 PIC 4 PIC 2 PIC 2 PIC 5 PIC 2 PIC 2 PIC 3 PIC 3 PIC 3
ESBL-típus
vér vér torok vizelet vér torok torok katéter vér vér vér széklet vér torok vér seb vizelet
11. ábra ESBL-termelő K. pneumoniae és K. oxytoca izolátumok makrorestrikciós profiljának cluster analízise A további vizsgálatokhoz 13 törzset választottunk ki további vizsgálatokra a faj, az antibiogram, a pulzotípus, a plazmid tartalom, az izolálás éve és a kórházi osztály figyelembevételével. Nyolc K. pneumoniae és 2 K. oxytoca törzs hordozott SHV-5 gént, három K. pneumoniae törzs hordozott SHV-2a-t, és mindegyik esetében a gén átvihető volt konjugációval a recipiens törzsbe. Mindegyik SHV géntől 5’ irányban IS26 inszerciós elemet mutattunk ki PCR módszerrel. A TK-k cefalosporin és aminoglikozid MIC értékei legalább 5 hígítási fokkal a recipiens törzs MIC értékei felett voltak (15. táblázat). 10 K. pneumoniae és 2 K. oxytoca törzsnél a TK-okba egy kb. 90 kb nagyságú plazmid jutott át, egy K. pneumoniae törzsnél (K70/02) az átjutott plazmid mérete kb. 120 kb volt. Utóbbi törzs TK-ából a blaSHV gén mellett blaTEM-1 gént is kimutattunk. A plazmid RFLP vizsgálatot PstI enzimmel végeztük el. Nagyon hasonló vagy azonos emésztési mintázat volt látható az összes blaSHV-5 gént hordozó plazmidnál. Továbbá két blaSHV-2a plazmidot hordozó plazmid is (TK105/98, PIC2, 1998; TK75/02, PIC3, 2002) teljesen azonos emésztési mintázatot mutatott egymással (12. ábra). 66
M 1
2 3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 M
12. ábra Transzkonjugánsokból izolált plazmidok PstI emésztési mintázata. M, molekulasúly marker; Futtatási sorrend: 1. TK36/02 (pulzotípus D, SHV-5, PIC 1); 2. TK39/02 (pulzotípus E, SHV-5, PIC 1) 3. TK85/02 (pulzotípus E, SHV-5, PIC 1) 4. TK109/03 (pulzotípus J, SHV-5, PIC 1) 5. TK26/02 (pulzotípus F, SHV-5, PIC 2) 6. TK71/02 (pulzotípus B, SHV-5, PIC 3) 7. TK2/03 (pulzotípus I, SHV-5, PIC 4) 8. TK5/03 (pulzotípus I, SHV-5, PIC 4) 9. TK20/03 (pulzotípus H, SHV-5, PIC 5) 10. TC105/98 (pulzotípus G, SHV2a, PIC 2) 11. TC70/02 (pulzotípus A, SHV-2a, PIC 3) 12. TC75/02 (pulzotípus C, SHV-2a, PIC 3)
Ehhez a tanulmányhoz kapcsolódóan vizsgáltunk meg egy 3. generációs cefalosporin rezisztens E. cloacae törzskollekciót (n=142). A kollekcióban lévő törzseket 1998-ban izolálták az ország különböző PIC osztályairól. A törzsek közül hét bizonyult SHV-típusú ESBL-termelőnek, melyeket 1998. április-májusban izoláltak egy PIC osztályról. Mindegyik törzs egy kb. 90 kb nagyságú konjugatív plazmidon hordozta a blaSHV-2a gént, és emésztési mintázatuk megegyezett az 1998-ban izolált blaSHV-2ahordozó plazmidéval. A PFGE vizsgálat alapján a hét törzs azonos PT-ba tartozott.
67
15. táblázat Reprezentatív ESBL-termelő K. pneumoniae és K. oxytoca izolátumok és azok transzkonjugánsainak jellemzői Törzs száma/ Izolálás éve K36/02 TK36/02 K39/02 TK39/02 K41/02 TK41/02 K85/02 TK85/02 K109/03 TK109/03 K26/02 TK26/02 K105/98 TK105/98 K70/02 TK70/02 K71/02
TK71/02 K75/02 TK75/02 K20/03 TK20/03 K2/03 TK2/03 K5/03 TK5/03 J-5-3 ATCC 700603
Származás/Mintaa I/T I/T I/T I/T I/HK II/HK II/T III/V III/V
III/S V/Sz IV/K IV/V
Plazmid profil (kb) 181, 94, 50 94 181, 94, 80 94 181, 94, 80 94 181, 94 94 94, 2.7 94 137, 94 94 94 94 116, 18 116 228, 94, 5.5, 5.2, 2.9 94 162, 94 94 170, 94 94 94, 6.0 94 94, 6.0 94 —
Pulzotípus
MIC (mg/L) SHV-típus CAZ
D — E — E — E1 — J — F — G — A — B
— C — H — I — I — — —
SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-5 SHV-2a SHV-2a SHV-5
SHV-2a SHV-5 SHV-5 SHV-5 — SHV-18
CTX
CRO
FEP
FOX
IMP
AMC
GEN
96 3 96 3 128 3 192 4 128 3 128 8 8 0.5 6 0.38 256
8 0.38 16 0.25 12 0.25 8 1.5 16 0.38 24 0.5 8 1.5 6 0.5 4
8 0.5 12 0.5 12 0.38 8 1.5 24 0.25 12 0.38 8 1.5 6 0.5 12
1 0.047 2 0.047 1.5 0.047 1 0.125 2 0.064 2 0.047 2 0.25 1.5 0.094 0.75
3 NM 4 NM 3 NM 3 NM 32 3 3 NM 8 1.5 2 NM 3
0.125 NM 0.25 NM 0.19 NM 0.25 NM 0.19 NM 0.19 NM 0.25 NM 0.25 NM 0.125
4 2 4 1.5 4 2 6 1.5 8 1.5 4 2 12 3 8 3 3
4 0.5 4 0.5 4 0.5 3 0.75 3 0.5 4 0.38 48 6 4 0.75 2
3 4 0.5 128 6 256 3 96 4 0.09 32
0.25 4 0.75 16 0.5 32 0.5 24 0.38 0.03 4
0.25 8 0.5 8 0.75 24 0.5 24 0.25 0.02 8
0.047 1 0.125 2 0.047 1.5 0.047 1 0.047 0.023 1
NM 2 NM 3 NM 2 NM 3 NM 1.5 32
NM 0.19 NM 0.19 NM 0.25 NM 0.25 NM 0.09 0.19
1.5 16 6 3 2 2 2 3 2 1.5 4
0.38 32 3 4 0.5 3 0.25 6 0.5 0.06 6
TOB 12
NET
2 8 2 4 1 6
32 4 64 4 32 4 32 4 48 3 48 2 8 2 0.5 0.047 24
2 6 1 16 2 4 1.5 12 2 0.13 4
4 8 1.5 64 3 12 1.5 64 4 0.047 0.75
2 12 2 12 2 12 2 12 2 16
AMK 16 1 32 1 16 1 12 2 8 1 16 0.75 1.5 0.25 1.5 1 6
1 15 0.25 24 1 4 0.5 16 1 0.09 2
MIC, minimális inhibitor koncentráció; CAZ, ceftazidim; CTX, cefotaxim; CRO, ceftriaxon; FEP, cefepim; FOX, cefoxitin; IPM, imipenem; AMC, amoxicillin/klavulánsav; GEN, gentamicin; TOB, tobramycin; NET, netilmicin; AMK, amikacin; CIP, ciprofloxacin; NM, Nem vizsgált. a Származás: I = PIC 1; II = PIC 2; III = PIC 3; IV = PIC 4; V = PIC 5. Minta: T = torok; HK = hemokultúra; V = vizelet; S = seb; Sz = széklet; K = katéter.
68
CIP 0.023 0.006 0.064 0.006 0.023 0.006 0.032 0.004 0.125 0.006 0.047 0,006 0.064 NM 0.032 0.006 0.064
0.006 0.023 0.006 0.047 0.006 0.016 0.006 0.016 0.006 0.006 NM
6.3. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata 2003-ban érkeztek be először az ESBL-NRL-be magas szinten ciprofloxacin rezisztens, ESBL-termelő K. pneumoniae izolátumok megerősítő vizsgálatra. Mind a 17 izolátum blaCTX-M-15 ESBL-gént hordozott. Az antibiotikum rezisztencia alapján a törzsek magas szintű cefotaxim, tetraciklin, ciprofloxacin és egy kivételével (K16/03) gentamicin rezisztenciát mutattak. Mérsékeltebb szintű volt a rezisztenciájuk ceftazidimmel, amoxicillin/klavulánsavval és cefepimmel szemben (16. táblázat). A TK-okba egy nagyméretű, kb. 140 kb nagyságú plazmid jutott át, mely hordozta a CTXM-15 kódoló gént, valamint a gentamicin érzékeny törzs kivételével az aac(3)-IIa aminoglikozid rezisztencia gént is. PstI enzimmel végzett plazmid RFLP nagyon hasonló mintázatot adott mindegyik plazmidnál. Az ISEcp1 inszerciós elem meglétét PCR mapping módszerrel vizsgáltuk, és mindegyik TK-nál negatív eredményt kaptunk. Ezért egy kiválasztott törzsnél meghatároztuk a blaCTX-M-15 gén genetikai környezetét a plazmid direkt szekvenálásával (13. ábra). A megszekvenált 3389 bázis hosszúságú plazmidrész a blaCTX-M-15 gén kódoló régiójától 5’ irányban 924 bázis, és 3’ irányban 1589 bázis nagyságú szakaszt foglalt magába. A blaCTX-M-15 géntől 5’ irányban két különböző inszerciós elem szekvenciáit is megtaláltuk. Az IS26 elem transzpozázt kódoló génje után (tnpA IS26) az ISEcp1 3’ nem-kódoló régiójára jellemző elemek következtek: a -35 és -10 szignálok a blaCTX-M-15 géntől 153 és 129 bázis távolságban, míg az ISEcp1 IR-R szekvenciája 76 bázis távolságban. A -35 és -10 szignálok az ISEcp1 biztosította promóter régiót, míg az IR-R a genetikai elem inszerciójának 3’ felismerő helyét jelöli. A blaCTX-M-15 géntől 3’ irányban egy ISEcp1 elem lehetséges IRR szekvenciáját és egy valószínűsíthetően ISEcp1 transzpozáz gén részleges szekvenciáját azonosítottuk (tnpA). A PFGE vizsgálatok alapján a 17 törzs makrorestrikciós profiljai 89%-os hasonlósági szinten mutattak klonális kapcsolatot, és az N PT-ba tartoztak (HECHungarian Epidemic Clone). Összehasonlít egyértelműen különböztek a korábban leírt SHV-típusú ESBL-termelő K. pneumoniae törzsektől.
69
-35
IS26 IR-R
ISEcp1 IR-R
Lehetséges IR-R
blaCTX-M-15
tnpA
0 80 160 240 320 400 480 560 640 720 800 880 960 1040 1120 1200 1280 1360 1440 1520 1600 1680 1760 1840 1920 2000 2080 2160 2160 2240 2320 2400 2480 2560 2640 2720 2800 2880 2960 3040 3120 3200 3280 3360
tnpA IS26
-10
bp
13. ábra blaCTX-M-15 gén genetikai környezete K. pneumoniae HEC törzsben (GenBank: EU556755.1)
70
16. táblázat CTX-M-15-termelő K. pneumoniae (K) izolátumok és a transzkonjugánsok (TK) jellemzői Izolátum
Kórház elhelyezkedése
Izolálás dátuma
Kórházi osztályb
Minta
Pulzotípus
K34/03 TK34/03 K46/03 K54/03 TK54/03 K55/03 K83/03 K85/03 K86/03 TK86/03 K168/03 K171/03 TK171/03 K153/03 K154/03 TK154/03 K158/03 TK158/03 K233/03 TK233/03 K152/03 K150/03 TK150/03 K165/03 TK165/03 K262/03 TK262/03 J 5-3 ATCC 700603 a
Pest megye
2003.01.06
ITO
Hasűri váladék
N1
Pest megye Pest megye
2003.02.10 2003.02.11
Sebészet Sebészet
Seb Seb
N1 N1
Pest megye Pest megye Nógrád megye Nógrád megye
2003.02.28 2003.03.31 2003.03.31 2003.04.08
Sebészet Sebészet Sebészet ITO
Seb Seb Seb Hasűri váladék
N1 N1 N1 N1
Nógrád megye Budapest I
2003.06.10 2003.06.11
Sebészet Urológia
Seb Vizelet
N1 N2
Budapest I Budapest I
2003.06.11 2003.06.12
Traumatológia Nefrológia
Orrváladék Vizelet
N2 N2
Budapest II
2003.06.16
Sebészet
Seb
N2
Tolna megye I
2003.06.16
Belgyógyászat
Vizelet
N1
Pest megye Budapest III
2003.07.16 2003.07.16
Sebészet Belgyógyászat
Seb Vér
N1 N1
Baranya megye
2003.09.16
Sebészet
Seb
N1
Tolna megye II
2003.10.03
Sebészet
Seb
N1
MIC (mg/L)a FOX IMP 4 0.25 2 0.125
CTX 256 256
CAZ 64 1.5
AMC 48 16
FEP 32 1
GEN 128 6
AMK 8 0.75
TET 256 64
CIP 32 0.016
256 24
96 3
256 3
32 2
16 1.5
0.19 0.125
32 3
3 1
256 64
32 0.032
256 256
64 2
48 32
32 0.5
4 1
0.25 0.125
128 4
8 0.5
256 96
32 0.016
256 16
96 3
48 8
32 2
8 1.5
0.19 0.125
24 4
2 1
256 96
32 0.023
256 24 256 256 256 128
96 3 48 3 64 4
96 3 48 32 48 24
32 2 32 1.5 32 2
16 1.5 32 1.5 16 0.75
0.19 0.125 0.25 0.125 0.19 0.125
32 3 128 4 96 4
3 0.75 6 0.5 6 0.75
256 64 156 96 156 96
32 0.032 32 0.023 32 0.016
256 256 256 256 256 256 0.03 4
48 4 64 4 64 2 0.09 32
16 3 24 6 48 24 1.5 2
32 1 24 0.75 32 6 0.023 1
4 1
0.25 0.125 0.25 0.125 0.19 0.125 0.09 0.19
48 4 0.5 0.125 96 6 0.06 6
3 0.25 3 1 8 0.5 0.19 2
256 96 156 96 156 64 NM NM
24 0.006 32 0.016 32 0.023 0.006 NM
0.75 16 1.5 1.5 32
CTX: cefotaxim, CAZ: ceftazidim, AMC: amoxicillin/klavulánsav, FEP: cefepim, FOX: cefoxitin, IMP: imipenem, GEN: gentamicin, AMK: amikacin, TET: Tetraciklin, CIP:
ciprofloxacin. b ITO: intenzív terápiás osztály
71
A magas szintű multirezisztenciát mutató új klón megjelenése után folyamatosan figyeltük a CTX-M-termelő K. pneumoniae előfordulását az ESBL-NRL-be beküldött izolátumok között. 2004-ben csak 4 ilyen izolátum érkezett megerősítésre, azonban 2005-ben a CTX-M-15 termelő, ciprofloxacin rezisztens K. pneumoniae izolátumok számának robbanásszerű növekedését tapasztaltuk. Köszönhető volt ez annak is, hogy ebben az évben 6 nozokómiális járványt okoztak. A beérkezett és megvizsgált 196 CTX-M-15 termelő, ciprofloxacin rezisztens K. pneumoniae izolátum 13 megye 35 kórházából származott (14. ábra). A 196 izolátum mindegyike hordozta a blaSHV, blaOXA és blaCTX-M géneket. 21 izolátum blaTEM pozitívnak is bizonyult. Az összes izolátum magas szintű rezisztenciát mutatott ceftazidimmel, cefotaximmal és ciprofloxacinnal szemben, valamint a törzsek 76%-a gentamicinnel, 72%-a tetraciklinnel szemben volt in vitro rezisztens. A PFGE vizsgálat 3 PT-ra különítette el a 196 izolátumot: az N PT-ba (HEC) 129 törzs, R PT-ba 46 törzs, míg az S PT-ba 21 törzs tartozott (15. ábra). A plazmid profil analízis alapján a törzsek 2 kb-230 kb közötti, különböző méretű és számú plazmidot hordoztak. Az N PT-ra (HEC) két különböző nagyméretű plazmid volt jellemző: az FJ2 centrumban lezajlott járványból származó 45 izolátum mindegyike egy kb. 140 kb nagyságú plazmidot hordozott, hasonlóan a 2003-ban izolált HEC törzshöz, míg a BP18 centrumból származó 15 izolátumra és a BR1-ből származó 10 izolátumra egy kb. 90 kb nagyságú plazmid volt jellemző. Az R PT-ba tartozó izolátumokra szintén egy kb. 90 kb nagyságú plazmid, míg az S PT-ba tartozó izolátumokra egy 50 kb nagyságú plazmid volt jellemző. 19 izolátumot választottunk ki további vizsgálatokra: 3 HEC izolátumot a 140 kb plazmiddal, 9 HEC izolátumot a 90 kb plazmiddal, 4 R PT-ú és 3 S PT-ú izolátumot. Az S PT izolátumokból származó 50 kb nagyságú plazmidon kívül mindegyik konjugálható volt E. coli J53 recipiens törzsbe. A negatív eredménnyel zárult konjugációs kísérlet után az 50kb plazmidot elektroporációval jutattuk be az E. coli DH5 recipiens törzsbe. Az egyes PT-ból származó plazmidok restrikciós mintázata azonos vagy nagyon hasonló volt egymáshoz a PT-n belül, azonban különböztek a többi PT-ba tartozó törzsek ESBL-gént hordozó plazmidjától (16. ábra).
72
A TK- és EP-okban a cefotaxim és a tetraciklin MIC értékek hasonlóak voltak, mint a donor törzsekben, a ciprofloxacin MIC értéke pedig enyhe emelkedést mutatott a recipiens törzsekhez képest (17. táblázat). Mind a három PT-ból származó plazmid hordozta a blaCTX-M-15, blaOXA-1, aac(6’)-Ib-cr és aac(3)-IIa géneket. Utóbbi hiányzott a gentamicin érzékeny HEC izolátumokból létrehozott TK-knál. Kizárólag a S PT-hoz tartózó izolátumok 50 kb plazmidja hordozta a blaTEM-1 -laktamáz gént is és csak itt lehetett ISEcp1 elemet kimutatni a blaCTX-M-15 géntől 5’ irányban. A HEC izolátumokból származó összes TK-ban kimutatható volt a tet(A) és a tet(C) tetraciklin rezisztenciát okozó gén is. A magas szintű kinolon rezisztencia vizsgálatához 10 kiválasztott eredeti izolátum gyrA és parC QRDR-ét szekvenáltuk meg. A HEC és az S PT törzsek GyrA QRDR-ében két aminosav cserét (Ser83Phe és Asp87Ala), valamint a ParC-ben egy aminosavcserét (Ser80Ile) mutattunk ki. Az R PT-ba tartozó izolátumoknál mindkét génnél egy-egy aminosavszintű változást okozó mutációt határoztunk meg (GyrA Ser83Ile, ParC Ser80Ile). A kiegészítő kinolon rezisztenciát okozó gének közül qnr gének (qnrA, qnrB és qnrS) nem voltak az izolátumokban, azonban az aac(6’)-Ib-cr mindegyik vizsgált plazmidon megtalálható volt. Az MLST vizsgálatokat 10 izolátumon és a 2003-ban izolált HEC törzs prototípusán végeztük el. Három különböző szekvencia típusba tartozott a három vizsgált PT: HEC (N PT) a ST15 (allélprofil: 1-1-1-1-1-1-1), a S PT a ST11 (allél profil: 1-3-1-1-1-3-4), a R PT pedig a ST147 (allél profil: 4-3-6-1-7-4-38).
73
14. ábra A 35 érintett egészségügyi intézmény elhelyezkedése Magyarországon. Zárójelben az egyes centrumokban azonosított pulzotípusok.
74
15. ábra. A 35 centrumból származó 196 K. pneumoniae törzs makrorestrikciós profiljának cluster analízise. * HEC prototípusa 2003-ból. ** FJ2-ben lezajlott járványból származó törzsek (2005. április és október). *** B18 centrumban lezajlott járványból származó törzsek (2005. áprilisból ás augusztusból)
75
Centrum/ izolátumok száma Pulzotípus/ST Törzs szám
16. ábra Különböző epidémiás klónok transzkonjugánsaiból és elektroporánsaiból származó plazmidok PstI-emésztett restrikciós mintázatai. M, molekulasúly marker; Futtatási sorrend: 1, TK79 (HEC, PT N/ST 15); 2, TK242 (HEC, PT N/ST 15); 3, TK411 (HEC, PT N/ST 15); 4, TK401 (HEC, PT N/ST 15); lane 5, TK12 (HEC, PT N/ST 15); 6, TK280 (HEC, PT N/ST 15); 7, TK366 (HEC, PT N/ST 15); 8, TK93 (EC II, PT R/ST 147); 9, TK159 (EC II, PT R/ST 147); 10, TK107 (EC II, PT R/ST 147); 11, EP260 (EC III, PT S/ST 11); 12, EP294 (EC III, PT S/ST 11).
76
17. táblázat. Multirezisztens CTX-M-15-termelő K. pneumoniae izolátumok (K), transzkonjugánsok (TK) és elektroporánsok (EP) jellemzői MIC (mg/L)c Törzs Izolálás Kórházi Mintab Pulzotípus száma helye osztálya CAZ CTX FEP GEN TOB AMK CIP TET SXT IPM FOX K83/5 BP18 belgyógy. vizelet N 64 >256 128 128 64 8 >32 >256 0.125 0.25 4 TK83/5 2 64 2 4 8 1 0.016 64 0.032 0.125 2 K79/5 BP18 ITO HK N 64 >256 64 32 64 8 >32 >256 1 0.25 16 TK79/5 2 >256 16 8 4 1 0.032 64 0.032 0.25 2 K106/5 BP18 ITO HK N 64 >256 32 128 64 4 >32 >256 0.5 0.25 16 TK106/5 2 >256 1 4 8 2 0.016 32 0.032 0.25 2 K109/5 BP18 ITO HK N 64 >256 32 64 64 4 >32 >256 1 0.25 16 TK109/5 2 >256 2 8 8 1 0.032 32 0.032 0.25 2 K114/5 BP18 ITO HK N 64 >256 32 64 64 4 >32 >256 0.5 0.25 16 TK114/5 2 >256 16 8 8 1 0.032 32 0.032 0.25 2 K113/5 BP18 sebészet HK N 128 >256 32 64 64 4 >32 >256 1 0.25 16 TK113/5 4 >256 32 8 8 1 0.016 32 0.032 0.125 2 K242/5 BK2 ICU vizelet N 64 >256 32 64 32 4 >32 256 32 0.25 8 TK242/5 2 64 1 8 8 2 0.032 32 0.032 0.125 2 K401/5 NG1 urológia vizelet N 64 >256 32 64 64 4 >32 >256 0.5 0.125 32 TK401/5 2 >256 1 8 8 2 0.032 32 0.032 0.125 2 K411/5 BP18 ITO HK N 128 >256 64 64 32 4 >32 >256 0.5 0.125 32 TK411/5 2 >256 8 8 4 1 0.032 32 0.032 0.25 2 K40518 ZL1 ITO vizelet N 64 >256 32 64 64 4 >32 >256 0.5 0.125 32 TK12/6 2 128 2 8 8 2 0.032 32 0.032 0.125 2 K70/5 FJ2 stroke vizelet N 64 >256 64 1 32 4 >32 >256 0.5 0.25 16 TK70/5 4 >256 4 0.125 8 1 0.016 64 0.032 0.125 2 K280/5 FJ2 ITO AL N 64 >256 32 1 32 4 >32 >256 0.5 0.25 32 TK280/5 4 >256 2 0.5 8 1 0.032 32 0.032 0.125 2 K366/5 FJ2 belgyógy. HK N 64 >256 32 0.5 32 4 >32 >256 1 0.25 32 TK366/5 4 >256 1 0.125 4 1 0.032 32 0.032 0.25 2 K93/5 BP14 HK R 128 >256 >256 64 64 8 >32 8 0.125 0.25 8 TK93/5 2 32 1 4 4 2 0.016 1 0.032 0.125 2 K107/5 BP6 tüdőgyógy. vizelet R 256 >256 64 64 32 8 >32 8 32 0.125 4 TK107/5 2 64 2 8 8 2 0.032 1 0.032 0.125 2 K159/5 BP11 ITO HK R 64 >256 128 128 64 8 >32 8 32 0.25 4 TK159/5 4 >256 8 4 4 1 0.032 1 0.032 0.25 4 K260/5 BP14 belgyógy. HK S 64 >256 32 64 32 4 >32 1 32 0.25 8 EP260/5 8 32 2 8 4 2 0.032 0.5 0.016 0.125 4 K294/5 BP3 stroke HK S 32 >256 16 64 32 4 >32 1 0.125 0.25 4 EP294/5 8 64 4 8 4 2 0.032 0.5 0.016 0.125 4 J53 — — — — 0.125 0.032 0.032 0.064 0.125 0.25 0.008 0.5 0.032 0.125 2 — — — — 0.125 0.032 0.032 0.25 0.5 1 0.016 0.5 0.016 0.125 4 DH5 a ITO, Intenzív terápiás osztály; b HK, Hemokultúra;AL, Alsólégúti váladék; cCAZ, ceftazidim; CTX, cefotaxim; FEP, cefepim; GEN, gentamicin; TOB, tobramycin; AMK, amikacin; CIP, Ciprofloxacin; TET, tetraciklin; SXT, trimethoprim/sulfamethoxazol; IPM, imipenem; FOX, cefoxitin.
77
6.4. ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata, 2000-2004 Az OEK Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályára beérkezett, 2000-2004 között gyűjtött 13962 nem-tifoid Salmonella enterica izolátumból 14 S. Typhimurium és 1 S. Enteritidis izolátum bizonyult ESBL-termelőnek. A többi vizsgált szerotípusban nem volt ESBL-termelő izolátum (S. Infantis, S. Hadar, S. Saintpaul, S. Blockey és S. Panama). Két izolátum kivételével (vér és hemokultúra minta), mindegyik ESBL-termelő izolátumot székletmintából izolálták. Az izolálás idejét, a szerotípust, a korongdiffúziós antibiotikum érzékenységi vizsgálat eredményét, a hordozott ESBLgéntípusokat és az izolátumok származási helyét a 18. táblázatban foglaltuk össze. Az egyetlen S. Enteritidis izolátum SHV-5-típusú ESBL-termelőnek bizonyult. A 14 S. Typhimurium törzsből 3 blaSHV-5 (és mellette blaTEM-1), 8 blaCTX-M-5, és 3 blaCTX-M-15 (ebből kettő blaTEM-1 is) gént hordozott. Az S. Enteritidis törzs esetében nem sikerült konjugációval átvinni a kb. 90 kb nagyságú plazmidot a recipiens törzsbe (a donor törzsben csak ez az egy plazmid volt plazmidprofil alapján). A többi SHV-5 pozitív törzs esetében egy kb. 160 kb nagyságú konjugatív plazmid kódolta a gént. Mindegyik CTX-M-termelő izolátumnál az ESBL gén előtt kimutatható volt az ISEcp1 elem. A blaCTX-M-5 gént egy kb. 7 kb nagyságú, konjugatív plazmid, míg a blaCTX-M-15 gént egy kb. 90 kb nagyságú, konjugatív plazmid hordozta. Direkt szekvenálással meghatároztuk a blaCTX-M-5 gén környezetét (összesen 4328 bp), hogy összehasonlíthassuk
más
kisméretű
blaCTX-M-5
hordozó
plazmidok
ismert
szekvenciájával (17. ábra). Az ESBL géntől 5’ irányban helyezkedtek el az ISEcp1 elemei: az ISEcp1 IR-L szakasza 1676 bázis, az ISEcp1 tnpA 1490 bázis, a -35 és -10 szignálok 122 és 99 bázis, és az ISEcp1 IR-R 50 bázis távolságban volt a CTX-M-gént kódoló régiótól. A blaCTX-M-5 géntől 3’ irányban, 374 bázis távolságban kezdődött a mobA operon, mely a plazmid mobilizációját segítő fehérjéket kódol.
78
?
ISEcp1
CTX-M-5
mobD mobB
mobA
4328 bp 17. ábra. Kb. 7 kb nagyságú plazmidon kódolt blaCTX-M-5 gén genetikai környezete. „?” szakasz: A Genbank AB117929.1 szekvenciával összehasonlítva 81%-os szekvencia homológia A 90 kb nagyságú, blaCTX-M-15-pozitív, és blaTEM-1 negatív plazmid PstI restrikciós mintázatát összehasonlítottuk a K. pneumoniae törzsekből származó 90kb nagyságú, blaCTX-M-15 gént hordozó plazmidokkal. A restrikciós mintázat különbözött a hasonló méretű CTX-M-15-pozitív plazmidok emésztési képétől (18. ábra). M
1
2
3
4
5
M
18. ábra. CTX-M-15 hordozó plazmidok PstI-emésztett restrikciós mintázatai M: molekulasúly marker, Futtatási sorrend: 1. CTX-M-15 pozitív S. Typhimurium; 2. TK12 (K. pneumoniae HEC, ST15); 3. TK280 (K. pneumoniae HEC, ST15); 4. TK93 (K. pneumoniae PT R, ST147); 5. TK159 (K. pneumoniae PT R, ST147)
79
A törzsek PFGE vizsgálata azt mutatta, hogy a Romániából származó, SHV-5termelő S. Typhimurium törzsek különböztek a CTX-M-termelő S. Typhimurium törzsektől. Utóbbiak azonban 83%-s hasonlósági szinten egy clusterbe tartoztak (19. ábra).
19. ábra. ESBL-termelő S. Typhimurium törzsek makrorestrikciós profil analízise
80
18. táblázat Magyarországon izolált ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek jellemzői Év
Szerotípusa
2000 (n= 3133)
S. Typhimurium (6)
2001 (n=2678)
2002 (n = 2855) 2003 (n = 2411) 2004 (n = 2885) a
MIC (mg/L) cefotaxim ceftazidim
bla gének
Antibiogramd
Betegek lakhelye
>256
8
CTX-M-5
CHL, GEN, KAN, STR, SXT, TET
Ukrajna
>256b
8
CTX-M-5
CHL, GEN, KAN, STR, SXT, TET
Magyarország
>256
8
CTX-M-5
CHL, KAN, SXT, TET
Magyarország
>256
4
CTX-M-5
CHL, GEN, KAN, STR, SXT, TET
Magyarország
>256
8
CTX-M-5
CHL, GEN, KAN, STR, TET
Magyarország
16
128
SHV-5, TEM-1
CHL, GEN, KAN, NAL, SXT, TET
NI
>256
8
CTX-M-5
CHL, GEN, KAN, STR, SXT, TET
Ukrajna
8c
128
SHV-5, TEM-1
CHL, KAN, STR, SXT, TET
Románia
16
64
SHV-5, TEM-1
CHL, GEN, KAN, NAL, STR, SXT, TET
Románia
>256
8
CTX-M-5
CHL, KAN, STR, SXT, TET
Ukrajna
>256
8
CTX-M-5
CHL, GEN, KAN, STR, TET
Magyarország
S. Typhimurium (1)
>256
8
CTX-M-5
CHL, GEN, KAN, STR, TET
Magyarország
S. Typhimurium (2)
>256
>256
CTX-M-15, TEM-1
CHL, KAN, STR
Magyarország
>256
128
CTX-M-15, TEM-1
CHL, KAN, STR, SXT
Magyarország
S. Typhimurium (1)
>256
128
CTX-M-15
STR, SXT
Magyarország
S. Enteritidis (1)
48
256
SHV-5
KAN, NAL, STR, TET
Magyarország
S. Typhimurium (4)
b
c
Zárójelben az adott évben adott szerotípusból kimutatott ESBL-termelő törzsek száma. Vizeletből származó izolátum; Hemokultúrából származó izolátum. d CHL,
kloramfenikol; GEN, gentamicin; KAN, kanamycin; NAL, nalidixsav; STR, streptomycin; SXT, trimethoprim/sulfamethoxazol; TET, tetraciklin; NI, Nem ismert.
81
6.5. 2006-2007-ben humán és állati mintákból izolált ESBL-termelő Escherichia coli törzsek molekuláris epidemiológiai jellemzése A vizsgálat során 2006-2007-ben izolált, humán mintákból származó 45 ESBLtermelő és 18 állati mintából izolált ESBL-termelő E. coli izolátumot jellemeztünk, és hasonlítottuk össze genetikai hátterüket (19. A és B táblázat). A humán izolátumok 84,4%-a (38/45) volt rezisztens legalább két antibiotikum csoport valamelyik tagjára, míg az állati izolátumoknak csak 30%-a (6/18). Emellett a humán izolátumok ceftazidim MIC50 értéke 4 hígítási fokkal, míg a ciprofloxacin MIC50 értéke 8 hígítási fokkal volt magasabb az állati izolátumoknál. A humán izolátumoknál a leggyakoribb ESBL-gén a blaCTX-M-15 volt, emellett előfordult még: blaSHV-2, blaSHV-5, blaSHV-12 és blaCTX-M-1. A állati izolátumoknál 11 törzs blaCTX-M-1, 5 izolátum blaCTX-M-32 és két izolátum blaSHV-2 ESBL-gént hordozott. Az állati izolátumokból meghatározott ESBL gének földrajzi megoszlását a 20. ábra mutatja. Két jellegzetes szerotípus volt a humán izolátumoknál: 12 egészségügyi intézetből izolált 21 izolátum tartozott az O25 szerotípusba, és 7 centrumból izolált 9 izolátum tartozott az O15 szerotípusba. A 18 állati izolátumból 16 nem tipizálható volt. A maradék kettő, borjúkból származó izolátum O162 és O8 szerotípusba tartozott. A PCR alapú filogenetikai vizsgálatok eredményei azt mutatták (21. ábra), hogy a humán izolátumok többsége (36/45) a B2 és D csoportba tartozott, melyekbe a magas virulenciájú, extraintesztinális fertőzéseket okozó törzseket sorolják. Kilenc izolátum tartozott az A (6/45) és B1 (3/45) csoportokba. Ezzel ellentétben az állati izolátumok többsége a kommenzalista A (9/18) és B1 (6/18) csoportba tartozott. A PFGE vizsgálatok alapján a 45 humán izolátumot 22 PT-ba, míg a 18 állati izolátumot 11 különböző PT-ba lehetett sorolni (22. ábra). Nem volt olyan PT, ami humán és állati eredetű izolátumokat is tartalmazott. A humán izolátumoknál volt egy fő cluster (EC003), amibe 18 O25 szerotípusú izolátum, valamint két egymással közeli közel rokonságot mutató cluster (EC026, EC027), amibe 8 O15 szerotípusú, humán izolátum tartozott. A nemzetközileg elterjedt, igen virulens ST131 klónhoz valótartozást is vizsgáltuk az O25 szerotípusú izolátumok esetében. A PCR eredménye azt mutatta,
82
hogy az EC003 PT-ba tartozó törzsek (n=18), és egy különálló O25 szerotípusú törzs tartozott az ST131 klónhoz.
20. ábra ESBL-termelő állati E. coli törzsek előfordulása Magyarországon (2006-2007)
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
21. ábra Multiplex PCR E. coli filogenetikai csoportjainak kimutatására M: molekulasúly marker (100 bp); Futtatási sorrend: 1. D filogenetikai csoport; 2., 4., 5., 6., A filogenetikai csoport; 3., 7.; 8., 9.; B2 filogenetikai csoport; 10. Pozitív kontroll; 11. Negatív kontroll
83
19.A táblázat. Humán klinikai mintákból izolált ESBL-termelő E. coli izolátumok genetikai háttere és antibiotikum érzékenysége Törzsek
Izolálás éve
Minta*
O antigén**
Filogenetikai csoport
PCR szűrés és szekvenálás eredménye
MIC (mg/L)***
SHV
TEM
CTX-M
CAZ
CTX
FEP
CIP
GEN
AK
5025
2006
HK
NT
A
-
-
CTX-M-1
8
128
32
>0,064
0,5
1
5195
2007
V
NT
A
-
-
+
2
32
8
>0,064
0,5
1
5058
2006
V
NT
A
SHV-5
TEM-1
-
128
16
4
>32
16
32
5144
2006
Sz
O142
A
-
TEM-1
CTX-M-1
4
16
8
>32
1
8
5138
2006
Sz
O8
A
SHV-2
-
-
16
16
8
>0,064
1
1
5267
2007
Sz
O9
A
SHV-12
-
-
64
8
1
>32
0,5
2
5217
2007
CVK
NT
B1
-
+
+
1
8
4
>0,064
1
1
5216
2007
Sz
O8
B1
-
-
CTX-M-15
32
128
16
>32
64
8
5101
2007
Sz
O9
B1
-
TEM-1
CTX-M-1
8
64
16
>32
0,5
2
5209
2006
Sz
NT
B2
-
-
CTX-M-15
32
256
64
>16
64
4
5168
2007
S
NT
B2
-
-
+
32
128
16
>0,064
1
8
5185
2007
Sz
NT
B2
-
-
CTX-M-15
2
32
2
>32
1
16
5203
2007
H
NT
B2
-
TEM-1
CTX-M-15
32
256
32
>1
128
8
5233
2007
Sz
NT
B2
SHV-5
TEM-1
-
256
64
16
>32
0,5
2
5271
2007
V
NT
B2
-
-
CTX-M-15
2
8
4
>32
1
8
5011
2006
HK
O25
B2
-
TEM-1
CTX-M-15
32
128
32
>0,064
128
8
5041
2006
HK
O25
B2
-
-
CTX-M-15
4
8
2
>32
1
8
5145
2006
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
2
8
2
>32
1
2
5149
2006
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
2
8
2
>32
1
16
5150
2006
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
2
16
2
>32
1
16
84
Törzsek
Izolálás éve
Minta*
O antigén**
Filogenetikai csoport
PCR szűrés és szekvenálás eredménye
MIC (mg/L)***
SHV
TEM
CTX-M
CAZ
CTX
FEP
CIP
GEN
AK
5179
2006
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
128
256
64
>32
128
8
5182
2006
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
32
128
32
>32
64
8
5183
2006
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
64
128
32
>32
64
4
5191
2006
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
32
256
32
>8
64
8
5020
2007
Sz
O25
B2
-
-
CTX-M-15
32
128
16
>32
64
4
5052
2007
Sz
O25
B2
-
TEM-1
CTX-M-15
64
256
128
>32
1
16
5066
2007
V
O25
B2
-
+
+
8
256
128
>0,064
0,5
1
5116
2007
S
O25
B2
-
-
+
1
4
1
>32
1
8
5136
2007
V
O25
B2
-
-
CTX-M-15
64
128
32
>32
1
16
5138
2007
Sz
O25
B2
-
-
+
16
128
8
>32
1
8
5153
2006
Sz
O6
B2
-
-
CTX-M-15
32
128
16
>0,064
1
8
5125
2007
Sz
Sp
B2
-
-
CTX-M-15
8
32
2
>32
1
2
5033
2007
Sz
NT
D
-
-
CTX-M-15
64
256
32
>32
1
8
5176
2007
Sz
NT
D
-
TEM-1
CTX-M-15
64
256
32
>32
128
4
5184
2007
Sz
NT
D
-
TEM-1
CTX-M-15
32
256
32
>32
128
8
5121
2007
HK
NT
D
-
TEM-1
CTX-M-15
32
256
32
>32
1
8
5181
2006
Sz
O1
D
-
-
CTX-M-15
32
256
32
>32
128
8
5023
2006
V
O15
D
-
TEM-1
CTX-M-15
64
128
32
>32
128
8
5107
2006
HK
O15
D
-
-
CTX-M-15
32
128
16
>32
1
4
5152
2006
Sz
O15
D
-
-
CTX-M-15
8
128
8
>32
0,5
4
5155
2006
Sz
O15
D
-
-
CTX-M-15
8
128
8
>32
0,5
4
85
Törzsek
Izolálás éve
Minta*
O antigén**
Filogenetikai csoport
PCR szűrés és szekvenálás eredménye
MIC (mg/L)***
SHV
TEM
CTX-M
CAZ
CTX
FEP
CIP
GEN
AK
5184
2006
Sz
O15
D
-
TEM-1
CTX-M-15
32
128
16
>0,064
64
4
5185
2006
Sz
O15
D
-
TEM-1
CTX-M-15
128
256
64
>32
64
4
5034
2007
Sz
O15
D
-
TEM-1
CTX-M-15
64
256
32
>32
1
8
5117
2007
V
O15
D
-
TEM-1
CTX-M-15
32
256
32
>32
64
4
* HK: hemokultúra, V: vizelet, Sz: széklet, H: hasűri, S: seb, CVK: centális vénás kanül. ** NT: nem tipizálható, Sp: spontán agglutináció *** CAZ: ceftazidim; CTX: cefotaxim; FEP: Cefepim; GEN: Gentamicin; AK: Amikacin; CIP: Ciprofloxacin
86
19.B táblázat. Állati mintákból izolált ESBL-termelő E. coli izolátumok genetikai háttere és antibiotikum érzékenysége Törzsek
Izolálás éve
Állatfaj/minta
Állat származása
O antigén*
Filogenetikai csoport
PCR szűrés és szekvenálás eredménye SHV TEM CTX-M
MIC (mg/L)** CTX
FEP
CIP
GEN
AK
Á/23 2006 sertés (növendék) Böhönye NT A SHV-2 TEM-1 32 16 Á/24 2006 sertés (szopós) Töltéstava NT A SHV-2 32 32 Á/1 2007 sertés (növendék) Tarnaméra NT A CTX-M-1 2 8 Á/17 2007 szarvasmarha (szopós) Pélpuszta NT A TEM-1 CTX-M-32 32 128 Á/19 2007 szarvasmarha (szopós) Lajoskomárom 162 A TEM-1 CTX-M-32 64 256 Á/2 2007 tej Bogyoszló NT A TEM-1 CTX-M-1 2 8 Á/3 2007 naposcsibe Ócsa NT A CTX-M-1 2 32 Á/4 2007 naposcsibe Ócsa NT A TEM-1 CTX-M-1 2 32 Á/6 2007 naposcsibe Ócsa NT A CTX-M-1 2 64 Á/16 2006 szarvasmarha (szopós) Dabas NT B1 CTX-M-1 2 64 Á/21 2006 szarvasmarha (szopós) Jászladány O8 B1 TEM-1 CTX-M-1 1 8 Á/10 2007 sertés (felnőtt, tenyész) Küngős NT B1 CTX-M-32 8 128 Á/18 2007 itatásos borjú Szügy NT B1 TEM-1 CTX-M-1 2 128 Á/7 2007 szarvasmarha (szopós) Ságvár NT B1 TEM-1 CTX-M-32 16 128 Á/8 2007 növendék pulyka Jánoshalma NT B1 CTX-M-32 8 128 Á/11 2007 szarvasmarha (szopós) Bugyi NT D CTX-M-1 2 32 Á/12 2007 naposcsibe Rém NT D TEM-1 CTX-M-1 2 32 Á/13 2007 növendék csibe Székesfehérvár NT D CTX-M-1 2 64 * NT: nem tipizálható. ** CAZ: ceftazidim; CTX: cefotaxim; FEP: Cefepim; GEN: Gentamicin; AK: Amikacin; CIP: Ciprofloxacin
8 8 4 16 32 4 8 8 8 8 8 8 32 8 8 16 8 8
<0,064 <0,064 1 <0,064 32 <0,064 <0,064 <0,064 <0,064 <0,064 8 32 8 32 32 1 1 0,125
1 0,5 2 64 2 0,5 1 0,5 1 1 0,5 0,5 64 0,5 0,5 64 32 0,5
1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 2 2 2 4 2 4 4 4
87
CAZ
Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
100
95
90
85
80
75
70
klebsiepi
65
60
klebsiepi
22. ábra. ESBL-termelő humán és állati E. coli izolátumok makrorestrikciós profilon alapuló cluster analízise. Sárga keretben az állati izolátumok láthatóak.
Ec5058/06
EC024
2006/HV1
NT
SHV,TEM
urine
A
12
Ec5066/07
EC052
2006/BP15
O25
TEM,CTX-M
urine
B2
8
EcA4/07
EC039
2007/Ócsa
NT
TEM-1,CTX-M-1
chicken one-day old
A
2
EcA6/07
EC039
2007/Ócsa
NT
CTX-M-1
chicken one-day old
A
2
EcA1/07
EC039
2007/Tarnaméra
NT
CTX-M-1
swine
A
2
EcA2/07
EC039
2007/Bogyiszló
NT
TEM-1,CTX-M-1
milk
A
2
EcA3/07
EC039
2007/Ócsa
NT
CTX-M-1
chicken one-day old
A
2
EcA18/07
EC045
2007/Szügy
NT
TEM-1,CTX-M-1
calf
B1
2
EcA19/07
EC046
2007/Lajoskomárom
O162
TEM-1,CTX-M-32
calf
A
64
EcA13/07
EC042
2007/Székesfehérvár
NT
CTX-M-1
broiler 6w. old
D
2
Ec5101/07
EC050
2007/BP10
O9
TEM-1,CTX-M-1
stool
B1
8
Ec5267/07
EC051
2007/BP10
O9
SHV-12
stool
A
64
Ec5011/06
EC055/ST131
2006/BP7
O25
TEM-1,CTX-M-15
blood
B2
32
EcA21/06
EC047
2007/Jászladány
O8
TEM-1,CTX-M-1
calf
B1
1
EcA11/07
EC041
2007/Bugyi
NT
CTX-M-1
calf
D
2
EcA12/07
EC041
2007/Rém
NT
TEM-1,CTX-M-1
chicken one-day old
D
2
Ec5138/06
EC014
2006/BP3
O8
SHV-2
stool
A
16
Ec5203/07
EC015
2007/BP8
NT
TEM,CTX-M
abdomen
B2
32
Ec5184/06
EC017
2006/BP2
O15
TEM,CTX-M
stool
D
32
Ec5216/07
EC054
2007/BP6
O8
CTX-M-15
stool
B1
32
Ec5195/07
EC019
2007/BP12
-
CTX-M
urine
A
2
EcA17/07
EC044
2007/Pélpuszta
NT
TEM-1,CTX-M-32
calf
A
32
EcA23/06
EC048
2006/Böhönye
NT
SHV-2,TEM-1
swine
A
32
EcA24/06
EC048
2006/Töltéstava
NT
SHV-2,TEM
pigglet
A
32
EcA10/07
EC040
2007/Küngős
NT
TEM,CTX-M-32
swine
B1
8
EcA7/07
EC040
2007/Ságvár
NT
TEM-1,CTX-M-32
calf
B1
16
EcA8/07
EC040
2007/Jánoshalma
NT
TEM,CTX-M-32
turkey
B1
8
Ec5217/07
EC018
2007/BP6
NT
TEM,CTX-M
CVC
B1
1
Ec5025/06
EC016
2006/BAZ1
O25
CTX-M-1
blood
A
8
Ec5144/06
EC053
2006/BP6
O142
TEM-1,CTX-M-1
stool
A
4
Ec5233/07
EC003/ST131
2007/GP1/Pest
NT
SHV,TEM-1
stool
B2
25
Ec5271/07
EC003/ST131
2007/ BP1
NT
CTX-M
urine
B2
2
Ec5183/06
EC003
2006/BP2
O25
CTX-M
stool
B2
64
Ec5191/06
EC003/ST131
2006/BP2
O25
CTX-M-15
stool
B2
32
Ec5020/07
EC003
2007/BP2
O25
CTX-M
stool
B2
32
Ec5182/06
EC003
2006/BP2
O25
CTX-M
stool
B2
32
Ec5145/06
EC003
2006/BP3
O25
CTX-M
stool
B2
2
Ec5209/06
EC003/ST131
2006/BP2
-
CTX-M
stool
B2
32
O25-ST131/ B2; CTX-M-15 (CIP >32mg/L; GE 0,5-128 mg/L; AK 4-8 mg/L) Ec5179/06
EC003/ST131
2006/BP2
O25
CTX-M-15
stool
B2
12
Ec5041/06
EC003
2006/BP4
O25
CTX-M-15
blood
B2
4
Ec5138/07
EC003
2007/PT1
O25
CTX-M
stool
B2
16
Ec5185/07
EC003/ST131
2007/BP5
-
CTX-M
stool
B2
2
Ec5149/06
EC003
2006/BP3
O25
CTX-M
stool
B2
2
Ec5125/07
EC003/ST131
2007/BP6
Sp
CTX-M-15
stool
B2
8
Ec5150/06
EC003
2006/BP3
O25
CTX-M
stool
B2
2
Ec5116/07
EC003/ST131
2007/BP3
O25
CTX-M
wound
B2
1
Ec5136/07
EC003
2007/BP4
O25
CTX-M-15
urine
B2
64
Ec5052/07
EC003/ST131
2007/BP6
O25
TEM-1,CTX-M-15
urine
B2
64
EcA16/06
EC043
2006/Dabas
NT
CTX-M-1
calf
B1
2
Ec5176/07
EC021
2007/BP11
-
TEM,CTX-M
stool
D
64
Ec5184/07
EC022
2007/BP10
-
TEM,CTX-M
stool
D
32
Ec5033/07
EC023
2007/BP9
O25
CTX-M
stool
D
64
Ec5181/06
EC049
2006/BP2
O1
CTX-M
stool
D
32
Ec5153/06
EC025
2006/BP13
O6
CTX-M-15
stool
B2
32
Ec5168/07
EC020
2007/GP2/Pest
-
CTX-M
wound
B2
32
Ec5152/06
EC027
2006/BP13
O15
CTX-M
stool
D
8
Ec5155/06
EC027
2006/BP13
O15
CTX-M-15
stool
D
8
Ec5107/06
EC027
2006/BAZ2
O15
CTX-M-15
blood
D
32
O15/ D; CTX-M-15 (CIP 8->32mg/L; GE 0,5-128 mg/L; AK 2-16 mg/L) Ec5034/07
EC026
2007/BP4
O15
TEM,CTX-M
stool
D
64
Ec5185/06
EC026
2006/BP14
O15
TEM-1,CTX-M-15
stool
D
12
Ec5121/07
EC026
2007/BP3
O15
TEM,CTX-M
blood
D
32
Ec5023/06
EC026
2006/BP4
O15
TEM,CTX-M
urine
D
64
Ec5117/07
EC026
2007/BP3
O15
TEM-1,CTX-M-15
urine
D
32
88
6.6. ESBL-termelő Gram-negatív baktériumok okozta nozokómiális járvány kivizsgálása koraszülött osztályon epidemiológiai és mikrobiológiai módszerekkel 2008. május 30-án és 31-én egy hazai kórház (Budapest I) koraszülött osztályán több ápoltnál véráramfertőzésre utaló szisztémás tünetek jelentkeztek, közülük egy koraszülött exitált. Az osztály saját hatáskörben elkülönítést és felvételi zárlatot rendelt el, azonnali intézkedésként a használatos infúziókat – mint lehetséges terjesztőket – zárolták. Június 1-ét követően újabb, szisztémás fertőzés gyanúját felvető megbetegedés nem fordult elő. Az Állami Népegészségügyi és Tisztiorvosi Szolgálat Közép-magyarországi Regionális Intézete, az Országos Tisztifőorvosi Hivatal, az OEK Kórházi járványügyi-, Bakteriológiai-, valamint Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztályainak munkatársai, valamint az érintett kórházi osztály és a higiénés szolgálat munkatársainak részvételével átfogó járványügyi vizsgálatra került sor. A fertőző forrás, és a járványban résztvevő törzsek azonosítására 2008. május 31. és június 3. között az egészségügyi hatóság több alkalommal helyszíni szemlét és higiénés vizsgálatot végzett az érintett osztályon, epidemiológiai adatgyűjtéssel és környezetbakteriológiai mintavételezésekkel kiegészítve. Kétszázkét szűrő (széklet-, végbéltörlés-, orr-, torok-), környezeti (felületminták, bontott és bontatlan infúziós palackok, infúziós szerelékek), valamint 8 hemokultúra minta bakteriológiai vizsgálata után a 68 izolált baktériumtörzs genetikai hátterét pulzáltatott-mezejű gél elektroforézis (PFGE) módszerrel (23. ábra), az ESBL-gének szekvenálásval és az ESBL-hordozó plazmidok összehasonlításával (24. ábra) vizsgáltuk. Az epidemiológiai és statisztikai vizsgálatok a fertőzés forrásaként egy 500 ml kiszerelésű Rindex infúziós palackot azonosítottak. A mikrobiológiai vizsgálatok nyolc eset hemokultúrájában SHV-5-típusú ESBLtermelő [+] és/vagy nem termelő [–] K. pneumoniae és/vagy C. freundii [+] és/vagy E. cloacae [+/–] törzseket mutattak ki. A 202 szűrő és környezeti mintából összesen 22 olyan törzset izoláltunk, melyek genetikailag azonosak voltak a hemokultúrákból
89
kitenyésztett törzsekkel. Ezek közül négy törzset egy május 29-én felbontott, több egyéni infúzióhoz felhasznált, 500 ml-es Rindex 10 infúziós palackból is izoláltunk (23. ábra). Egy eset hemokultúrájából izolált genetikai klónt (ESBL-termelő P PT K. pneumoniae) a mikrobiológiai vizsgálatok nem mutatták ki a beküldött, 2008. május 29. és 31. között felbontott és felhasznált infúziós palackokban. A P PT gyakoribb volt a szisztémás fertőzés tüneteit mutató koraszülöttek körében, valamint izolálásra került az 1-es sz. intenzív box kézmosó lefolyójából, valamint egy dolgozó munka közben levett kézmintájából is. Kiegészítő epidemiológiai elemzést végeztek abból a célból, hogy a „P” típusú klón akvirációjával összefüggésbe hozható kockázati tényezőket azonosítsák. Az osztályon fekvő 22 koraszülött körében összesen nyolc ilyen esetet azonosítottunk (2 koraszülött hemokultúrájából és 6 koraszülött székletmintájából izoláltunk ESBLtermelő, P PT K. pneumoniae-t). Az elemző epidemiológiai vizsgálat alapján a 2008. május 27-én alkalmazott tápszeres és/vagy anyatejes szondatáplálás és a 2008. május 27-én alkalmazott infúziós terápia mutatott összefüggést „P” klón hordozásával. Az blaSHV-5 hordozó plazmidok vizsgálatakor kiderült, hogy az infúziós palackból kitenyésztett fajok ugyanazt az ESBL plazmidot hordozták, ami nagyfokú hasonlóságot mutatott a 2002-2003-ban, PIC osztályokról izolált SHV-5 termelő Klebsiella spp. plazmidjaival (24. ábra). Azt is kimutattuk, hogy a P PT-ba tartozó K. pneumoniae törzsben eltérő plazmid hordozta az SHV-5 gént.
90
85%
Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%100.0%]
23. ábra. A klinikai-, szűrő-, és környezeti mintákból izolált Klebsiella pneumoniae (KP), Klebsiella oxytoca (KO), Enterobacter cloacae (EbC) és Citrobacter freundii (CF) törzsek (n=68) makrorestrikciós profiljának cluster analízise.
klebsie pi
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
klebsie pi
9 0
9 5
Törzs Származás
10 0
Váladé k
CF00 1 CF00
Rindex 10 I.jel M.
8 Cf7/0 8 Cf8/0
1 CF00 1 CF00
K. K. L. B.T
8 E11/0 8 Cf2/0
1 EbC0 06 CF00
.L.S z. F.Á
8 Cf3/0 8 Cf9/0
3 CF00 3 CF00
.I. Int.box fürdető Rindex 10
8 Cf4/0 8 Cf5/0
5 CF00 2 CF00
I.jel A.N. D. A.N.
F
8 E21/0 8 E19/0
2 EbC0 10 EbC0
D. B-né K.A. Rindex 10
F
8 E27/0 8 E10/0
04 EbC0 04 EbC0
I.jel A.N. D. L.S
H C F
8 E1/0 8 E15/0
04 EbC0 02 EbC0
z. J.T.Z s. J.T.Z
F
8 E3/0 8 E14/0
02 EbC0 02 EbC0
s. J.L .J.L
8 E20/0 8 K144/
02 EbC0 09 KO00
.F.Z s. A.
08 K145/ 08 K169/
4 KO00 4 KP00
H. A. H. Sz.G-
08 E16/0 8 E17/0
9 EbC0 07 EbC0
né F-né Á.E. V.
8 K164/ 08 K198/
08 KO00 3 KO00
V. S.S z. B.Z
08 K175/ 08 K158/
3 KO00 3 KP01
s. I. Int.box kézmosó Sz.
08 E12/0 8 E13/0
1 EbC0 05 EbC0
A. V. Á. K.
F
8 K159/ 08 K176/
05 KP00 6 KP01
K. F.Zné K.G-
F
08 E2/0 8 E18/0
3 EbC0 01 EbC0
né Sz. V. Rindex 10
8 E25/0 8 E26/0
03 EbC0 03 EbC0
I.jel Rindex 10 I.jel A.N.
8 E28/0 8 E4/0
03 EbC0 03 EbC0
D. A. H. R.L
8 E5/0 8 E8/0
03 EbC0 03 EbC0
.D. D. K.
8 K143/ 08 K162/
03 KO00 2 KO00
L. J.L .R.L
08 K151/ 08 K168/
2 KP00 1 KP00
.L.H .V.
08 K163/0 8/ K156/
1 KO00 6 P
V. B. B. R.L
08 K160/ 08 K177/
P
.F.Á .K.G-
08 K197/ 08 K147/
P
08 K149/ 08 K154/
P
08 K148/ 08 K150/
P
08 K167/ 08 K174/
P
08 K180/ 08 Cf1/0
P
8 K170/ 08 K157/ 08 K161/ 08 K181/ 08 K182/ 08 K152/ 08 K153/ 08 K155/ 08 K166/ 08
91
PFGE típus
Cf10/0 8 Cf6/0
P P P P P CF00 4 KP00 8 KP00 7 KP00 2 KP00 2 KP00 2 KP00 2 KP00 2 KP00 2 KP00 2
né B.Z s. J.T.Z s. Sz. V. R.L .J.L .B.T .F.Á. T. I.Int box, kézmosó V. M. L.S z. O.I .D.B-
H C H
CF001
-Rindex,
3 HK
C H C F F
F
toro k F
EbC004 Rindex, 1 HK
toro k F F F F F végb él F rectum váladék F F kéz munka közben toro k
H C H C H C H C H C F
EbC003Rindex, 5 HK
toro k H C végb él F natív vér F kéz munka közben rectum váladék F F H C F H C végb
KP P boncanyag, klón 2 HK, dolgozó keze, kézmosó, F
él F F F F
né I.Int box, fürdető Rindex 10 I.jelzésű A. H. M.
H C H
K. D. D. Rindex 10
C H C
I.jelzésű Rindex 10 I.jelzésű
KP002
-
Rindex, 3 HK
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M
24. ábra SHV-5-termelő Enterobacteriaceae törzsek plazmid PstI-RFLP mintázata. M: molekulasúly marker; Futtatási sorrend: 1. és 9. K. oxytoca törzsből származó SHV-5-pozitív plazmid (Budapest II, Szülészet-Nőgyógyászat, S.Sz., izolálás:2008.06.03., széklet); 2. és 10. K. oxytoca törzsből származó SHV-5-pozitív plazmid (Budapest I, PIC, B.ZS., izolálás: 2008.06.12., perianális törlés); 3. TK2/03 (PIC4, izolálás: 2003, tubus; lásd 12. ábra); 4. TK26/02 (PIC2, izolálás: 2002, hemokultúra; lásd 12. ábra); 5. TK109/03 (PIC1, izolálás: 2003, hemokultúra; lásd 12. ábra); 6. Citrobacter freundii PT CF001, SHV-5-pozitív plazmid (Budapest I, PIC, K.L., izolálás: 2008., hemokultúra), 7. Klebsiella pneumoniae PT P, SHV-5-pozitív plazmid (Budapest I, PIC, R.L., izolálás: 2008., hemokultúra); 8. Enterobacter cloacae PT Eb004, SHV-5-pozitív plazmid (Budapest I, PIC, A.N.D., izolálás: 2008., hemokultúra)
92
7. MEGBESZÉLÉS Az Enterobacteriaceae család tagjai világszerte a nozokómiális és területen szerzett infekciók legfontosabb kórokozói. Ezekben az infekciókban az elsődlegesen alkalmazott antibiotikumok a -laktámok (főleg a széles-spektrumú cefalosporinok és a karbapenemek) és a fluorokinolonok (Coque és mtsai 2008). Azonban az utóbbi években egyre nagyobb arányban jelennek meg ezekkel az antibiotikumokkal szemben rezisztenciát mutató kórokozók (25. ábra) (Livermore és mtsai 2007).
25. ábra Széles-spektrumú cefalosporin rezisztens Escherichia coli törzsek prevalenciája véráramfertőzésekben, EARSS 2001 és 2004 (Forrás: Livermore és mtsai 2007) A cefalosporinokkal szembeni szerzett rezisztenciát elsősorban az ESBL-k közvetítik, melyek a karbapenemeken és a cefamicineken kívül minden más -laktám antibiotikum csoportot képesek hidrolizálni. Az ESBL-termelő kórokozók általában további rezisztencia mechanizmusokkal is rendelkeznek, melyek gyakran érintik a kinolonokat, aminoglikozidokat, tetraciklineket és a folsavszintézist gátlókat, és ez jelentősen korlátozza az ilyen fertőzések antibitotikum terápiás lehetőségeit. (Cornaglia és mtsai 2008). Az epidemiológiai jelentőségüket növeli, hogy az ESBL-gének túlnyomó többsége mobilis genetikai elemeken kódolódik - elsősorban plazmidon, ami lehetőséget ad a horizontális génátvitelre, ezzel a gének széleskörű elterjedésére, 93
valamint
a
multirezisztens
és
egyben
virulens
törzsek
kialakulására
és
kiszelektálódására (Coque és mtsai 2008, Paterson és Bonomo 2005, Stürenburg és Mack 2003). Sőt, ezek a rezisztencia gének gyakran ugyanazon a konjugatív plazmidon találhatók meg, és együtt juthatnak át más törzsekbe, vagy más fajokba (Coque és mtsai 2008, Robicsek és mtsai 2006a). Magyarországon 1996-ban végezték az első vizsgálatokat az ESBL-termelő törzsek elterjedtségének felmérésére, és 1999-ben írták le az első ESBL-termelő K. pneumoniae törzs okozta járványt. Azonban átfogó, az egész országra kiterjedő tanulmányt nem végeztek. Munkánk célja egyrészt az volt, hogy felmérjük ennek a gyorsan fejlődő és terjedő, jelentős egészségügyi problémát okozó rezisztencia mechanizmus hazai helyzetét, majd nyomon kövessük az évek során a változásokat. Munkánk fontos részét képezte, hogy a tendenciákról tájékoztassuk a hazai klinikusokat, infektológus és epidemiológus szakembereket. Célunk volt emellett, hogy megvizsgáljuk, a zoonotikus fertőzésekben is szerepet játszó kórokozók (E. coli, S. enterica) ESBL-hordozását. Valamint, hogy ez utóbbi törzsek lehetnek-e rezervoárjai a Magyaroszágon egyre terjedő, és kórházi járványok kialakításában résztvevő ESBL-géneknek.
7.1. SHV-típusú ESBL-gének előfordulása Magyarországon Az ESBL-gének (SHV-5 és SHV-2a) földrajzi elterjedése meglehetősen világos képet mutatott Magyarországon 2002-2003-ban (9. ábra). Az SHV-5 az ország nyugati és középső területén egyedüliként, míg a déli megyékben SHV-2a-val együtt volt jelen. Ezzel szemben az SHV-2a egyedüliként csak az ország déli és keleti régióiban volt kimutatható. Korábban Magyarország két régiójában írtak le SHV-típusú ESBL-termelő törzseket (SHV-5 és SHV-2) (Prágai és mtsai 1998, Szabó és mtsai 1999). Eredményeink tovább bővítették ismereteinket az SHV-típusú ESBL-gének hazai elterjedtségéről és földrajzi megoszlásáról. SHV-2a és SHV-12-termelő törzseket elsőként írtunk le Magyarországon, és elsőként használtunk nukleotid szekvencia meghatározást a géntípusok azonosítására.
94
Eredményeink alapján elmondható volt, hogy az Európában legelterjedtebb három SHV-típusú ESBL-génből (Baraniak és mtsai 2002, Bedenic és mtsai 2001, Bradford 2001, Gniadkowski és mtsai 1998, Neonakis és mtsai 2003, NüeschInderbinen és mtsai 1997, Perilli és mtsai 2002, Podbielski és mtsai 1991b) kettő (SHV5 és SHV-2a) Magyarországon is igen elterjedt volt a vizsgálat időszakában. Azonban ebben a vizsgálatban nem találtunk SHV-2-termelő törzseket, amely típust szintén számos európai országban kimutattak (Bedenic és mtsai 2001, Nüesch-Inderbinen és mtsai 1997). A szomszédos országok közül Horvátországban, Szlovéniában, Romániában és Ausztriában is leírtak SHV-5-típusú ESBL-termelő törzseket (Bedenic és mtsai 2001, Jutersek és mtsai 2003, Miriagou és mtsai 2002, Prodinger és mtsai 1996), míg SHV-2a-t Horvátországban és Szlovákiában (Bedenic és mtsai 2001, Zarnayová és mtsai 2005). Magyarország mellett több európai országban is leírtak SHV-12-termelő
törzseket
(Svájc,
Horvátország,
Szlovénia,
Olaszország
és
Görögország) (Bedenic és mtsai 2001, Jutersek és mtsai 2003, Neonakis és mtsai 2003, Nüesch-Inderbinen és mtsai 1997, Perilli és mtsai 2002).
7.1.1. SHV-típusú ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok vizsgálata A vizsgált időszakban (2002-2003) hét járvány zajlott le öt földrajzilag távol fekvő kórház PIC osztályán. A járványokat 10 különböző PT-ba tartozó, ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta. Egyik klón sem jelent meg két különböző kórházban, és egyik kórházban sem tudott ugyanaz a klón különböző időpontokban járványt okozni. Hét epidémiás klón hordozott egy kb. 90 kb nagyságú, blaSHV-5-pozitív plazmidot, melyek restrikciós mintázata azonos vagy nagyon hasonló volt. Az eredmények alapján feltételezhető, hogy egyféle blaSHV-5-hordozó plazmid terjedt el a különböző epidémiás klónokban. Prodinger és mtsai hasonló eredményt publikáltak, mikor egy kb. 80 kb nagyságú, blaSHV-5-hordozó R-plazmid epidémiás terjedését írták le, amely egy időben, három kórházi osztályon okozott járványt Ausztriában (Prodinger és mtsai 1996). Hasonló eredményt publikáltak Görögországból is (Galani és mtsai 2002).
95
Legjobb tudomásunk szerint, ez volt az első leírása egy blaSHV-5-hordozó Rplazmid ilyen gyors és országos szintű elterjedésének, mely nyolc hónap alatt öt megyében számos járványt okozott. Kristóf és mtsai egy budapesti kórház PIC osztályán 2001 és 2005 között vizsgálták a Klebsiella spp. törzsek ESBL hordozását. A vizsgálat során izolált 84 törzsből 39 volt ESBL-termelő (23 K. pneumoniae törzs és 16 K. oxytoca törzs). Eredményeinkhez hasonlóan vizsgálatuk ideje alatt a 6 különböző PT-hoz tartozó törzsek csak néhány hónapig voltak jelen az osztályon. 30 törzs hordozott blaSHV-5 gént és 9 K. oxytoca blaSHV-12 gént, mely utóbbi az általunk vizsgált járványokban nem volt jelen (Kristóf és mtsai 2007). Hasonlóan a nálunk tapasztaltakkal, a törzsek többségében a blaSHV-5 gén egy kb. 90 kb nagyságú plazmidon volt. Az SHV-2a Európában meglehetősen ritka géntípus volt vizsgálatunk idejében (Bedenic és mtsai 2001, Perilli és mtsai 2002, Zarnayová és mtsai 2005), de például Koreában az egyik vezető ESBL-típus volt (Kim és mtsai 2002). Vizsgálataink azt mutatták, hogy 4 év eltéréssel, földrajzilag távol eső PIC osztályokon azonos blaSHV-2a hordozó plazmid jelent meg, és vett részt a járványokban. Összefoglalva az eredményeket elmondható, hogy ebben az időszakban két epidémiás R-plazmid terjedt el hazánkban és jutott be különböző Klebsiella klónokba, melyek járványokat okoztak. Azonban sikeres, több járványban is résztvevő epidémiás klón nem jelent meg. A plazmidok eredetére nem találtunk bizonyítékot, azonban az 1998-ban PIC osztályokról gyűjtött E. cloacae törzsekkel végzett vizsgálatok szolgálhatnak további információval ezzel kapcsolatban. A vizsgált 142 törzsből hétben volt egy kb. 90 kb nagyságú, blaSHV-2a-pozitív plazmid, amelynek emésztési képe hasonló volt a K. pneumoniae-ból származó plazmidhoz. Az E. cloacae törzsek szerepe azért lehet jelentős, mert képes ellenállni bizonyos fertőtlenítőszereknek (Herson és mtsai 1987), és tovább marad életben (átlagosan 17,5 nap) intenzív terápiás osztályon a környezetben, mint a K. pneumoniae (átlagosan 7,5 nap) vagy az E. coli (áltagosan 2 nap) (Gastmeier és mtsai 2006). Így az R-plazmidok rezervoárja lehet a kórházi környezetben, és azt át tudja adni virulensebb, de antibiotikumokkal szemben érzékeny törzseknek.
96
7.2. CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek vizsgálata 2003-ban 17 magas szintű ciprofloxacin rezisztenciát mutató, CTX-M-15termelő K. pneumoniae izolátumot azonosítottunk az ESBL-NRL-be küldött izolátumok között, melyek egy PT-ba tartoztak: N PT (HEC). A CTX-M-15 termelő K. pneumoniae törzs megjelenése nem volt meglepő, mivel ezt az ESBL-típust Kelet-Európában több Enterobacteriaceae fajból is leírták már akkor (Baraniak és mtsai 2002a, Edelstein és mtsai 2003), és később Európa vezető ESBL-típusává vált (Livermore és mtsai 2007, Coque és mtsai 2008). Azonban a törzsek klonális megjelenése és országos szintű elterjedése már különleges volt, főleg az abban az időben izolált SHV-termelő K. pneumoniae törzsek molekuláris epidemiológiájával összevetve. Másik érdekesség volt, hogy a CTX-M-15-hordozó plazmidnál PCR módszerrel nem sikerült az ISEcp1 genetikai elemet kimutatni, mely a CTX-M-gének mobilizációjában játszik fontos szerepet, és erős promótert biztosít a CTX-M gén kifejeződéséhez (Lartigue és mtsai 2004, Perez és mtsai 2007, Poirel és mtsai 2008). A blaCTX-M-15 gén genetikai környezetének szekvenálása megmutatta, hogy az ISEcp1 elembe inszertálódó IS26 elem miatt nem működött a PCR. Woodford és mtsai által leírt, Anglia-szerte elterjedt, CTX-M-15-termelő E. coli A törzsnél az IS26 elem az ISEcp1 IR-R régiójába inszertálódott, és ez a promóter régióját is érintette. Ezzel volt magyarázható a törzseik viszonylag alacsony cefalosporin MIC értéke (Woodford és mtsai 2004). Esetünkben az IS26 elem nem érintette a promóter régiót (26. ábra), és ezért a cefalosporin MIC értékek is magasak maradtak. A szekvenciánk – egy 29 bp hosszú szekvenciarész kivételével – megegyezett egy 90 kb nagyságú plazmidon hordozott blaCTX-M-15 gén genetikai környezetével, melyet egy Kamerunból származó E. coli törzsben találtak (Gangoue-Pieboji és mtsai 2005). 2003. év után 2004-ben csak négy hasonló tulajdonságú törzset küldtek be az ESBL-NRL-ba, azonban 2005-ben a törzsek számának robbanásszerű emelkedését tapasztaltuk. A 196 beküldött CTX-M-15 termelő és magas szintű ciprofloxacin rezisztenciát mutató K. pneumoniae törzs 13 megye 35 egészségügyi intézményéből érkezett. A PFGE vizsgálatok eredménye alapján a törzseket három PT-ba sorolhattuk: N (HEC), R, S. A három PT reprezentatív törzseinek MLST vizsgálata is igazolta, hogy 97
a törzsek három különböző epidémiás klónhoz tartoznak: ST11 (S PT), ST15 (N PT), ST147 (R PT). Az ST11 és ST15 típust akkor már leírták Európában (http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Kpneumoniae.html, Diancourt és mtsai 2005), azonban az ST147 szekvenciatípust elsőként írtuk le.
I.
IS26 IR-R
-35 -10
Lehetséges IR-R
ISEcp1 IR-R
II.
3280 3360
3120 3200
2960 3040
2800 2880
2640 2720
2480 2560
2320 2400
2160 2240
2080 2160
1920 2000
tnpA
1760 1840
1600 1680
1440 1520
1280 1360
1120 1200
960 1040
800 880
blaCTX-M-15
640 720
480 560
320 400
0 80
160 240
tnpA IS26
bp
A pYC-14-hez képest 29 bp (ISEcp1 tnpA∆) hiányzik. A pYC-14 egy 90 kb merétű plazmid volt.
26. ábra blaCTX-M-15 gének genetikai környezetének sematikus ábrája. I, Kamerunból származó E. coli törzsek (YC-5b és YC-14) plazmidjain kódolt blaCTX-M-15 gén környezete (Forrás: Gangoue-Pieboji és mtsai 2005); II, HEC plazmidon kódolt blaCTX-M-15 gén környezete.
Az izolátumok többsége legalább négy antibiotikum csoporttal szemben mutatott rezisztenciát. Mindhárom epidémiás klón ESBL-gént kódoló plazmidja hordozta a blaCTX-M-15, blaOXA-1, aac(6’)-Ib-cr és aac(3)-II géneket. Utóbbi hiányzott a gentamicin érzékeny HEC törzsekből. A tet(A) és tet(C) tetraciklin rezisztencia gének csak a HEC törzsekben voltak kimutathatóak. Hasonló rezisztencia gén kombinációt mutattak ki az Angliában elterjedt CTX-M-15 termelő E. coli A és D törzsek plazmidjainál (Karisik és mtsai 2006), valamint további multirezisztenciát közvetítő plazmidoknál, melyek CTXM-15 termelő, klonálisan terjedő E. coli törzsekből írtak le Kanadából, Indiából, Kuwaitból, Franciaországból, Svájcból, Portugáliából és Spanyolországból (Coque és mtsai 2008b).
98
A magas szintű kinolon rezisztencia hátterében mindegyik klónnál kimutattuk a gyrA és parC QRDR-eit érintő mutációkat. A fluorokinolonokkal szembeni rezisztencia több lépésben alakul ki mutációk sorozatával (Woodford és Ellington 2007), és Gramnegatívoknál a magasabb szintű rezisztencia eléréséhez szükséges, hogy mindkét génben bekövetkezzenek változások (Brisse és mtsai 1999, Deguchi és mtsai 1997). A ciprofloxacin MIC értéket csak kismértékben befolyásoló aac(6’)-Ib-cr mindegyik vizsgált plazmidon megtalálható volt. Ez a rezisztencia gén változat, mely nemcsak az aminoglikozidokat, hanem egyes fluorokinolonokat (ciprofloxacin, norfloxacin) is képes inaktiválni, egyre elterjedtebb az ESBL-termelő törzsek körében (Hawkey és Jones 2009). A korábban tárgyalt SHV-típusú ESBL-termelő K. pneumoniae törzsek epidemiológiájára az azonos R-plazmidok terjedése volt jellemző, míg a CTX-M-15 termelő K. pneumoniae törzsek az országos szintű elterjedésének hátterében három, igen hasonló rezisztencia eszköztárral rendelkező epidémiás klón állt. Jellemző volt az is, hogy a PIC-okban csak SHV-típusú ESBL-termelő törzsek, míg a felnőtt ápolási osztályokon csak CTX-M-termelő törzsek okoztak járványokat. Szilágyi és mtsai hasonló eredményre jutottak, mikor a 2005-2008. között lezajlott ESBL-termelő K. pneumoniae törzsek okozta járványokat vizsgálták epidemiológiai módszerekkel. Felvetették annak kérdését, hogy a PIC-eken miért csak SHV-típusú ESBL-termelő K. pneumoniae törzsek, és a felnőtt ITO-okon miért csak CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek okoztak nozokómiális fertőzéseket. A jelenség magyarázata lehet, hogy a kétféle osztálytípuson eltérőek az antibiotikum felhasználási szokások, és a betegeknek nincs átjárása a kettő között. Az SHV-típusú törzsekkel ellentétben, a CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek szinte mindig rezisztensek fluorokinolonokkal szemben, így az ITO-n a fluorokinolon használat elősegíti a CTXM-termelő törzsek terjedését. A CTX-M-termelő törzsek megjelenése előtt a ciprofloxacin
érzékeny,
SHV-típusú
ESBL-termelő
K.
pneumoniae
törzsek
sporadikusan előfordultak felnőtt ITO-okon, azonban az itt alkalmazott fluorokinolonok szelekciós előnyt jelentettek a CTX-M-termelő törzsekre. A tanulmány szintén tárgyalja annak kérdését, hogy miért okozhatnak jóval súlyosabb infekciókat a CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek. Egy magyarázat lehet, hogy a felnőtt ITO-okon kezelt ápoltak fogékonyabbak a súlyos, generalizált fertőzések kialakulására, mivel ezeket a betegeket
99
gyakrabban lélegeztetik és gyakrabban alkalmaznak náluk invazív beavatkozásokat, mint a PIC-en ápoltaknál (Szilágyi E és mtsai 2010). Felmerül a kérdés, hogy a bejelentett járványok és az ESBL-NRL-be küldött törzseken végzett vizsgálatok tükrözik-e a hazai helyzetet. Erre a kérdésre a Nemzeti Bakteriológiai Surveillance adatainak elemzésével kaphatunk választ (27. és 28. ábra).
Hemokultúra
3. gen cef. R K. pneumoniae / összes K. pneumoniae izolátum (%)
Fekvő beteg
45
Járó beteg
40 35 30 25 20 15 10 5 0 2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
év
27. ábra K. pneumoniae izolátumok 3. generációs cefalosporin rezisztenciájának aránya, NBS adatai alapján (2003-2009)
100
45%
45% Co-R 3rd gen ceph.+fluoroq.+aminogl.
40%
40% 3rd gen ceph. R
35%
35%
30%
30%
25%
25%
20%
20%
15%
15%
10%
10%
5%
5%
0%
0%
2003 (n=372)
2004 (n=334)
2005 (n=342)
2006 (n=300)
2007 (n=317)
2008 (n=378)
2009 (n=366)
28. ábra 3. gen. cefalosporinok, aminoglikozidok és fluorokinolonok korezisztenciája hemokultúrából származó K. pneumoniae izolátumokban, NBS adatai alapján (20032009) A hazai antibiotikum rezisztenciát monitorozó Nemzeti Bakteriológiai Surveillance (NBS) működése az OEK szervezésében indult el 2001-ben. Fő céljai közé tartozik a bakteriális kórokozók antibiotikum rezisztencia adatainak gyűjtése és feldolgozása. Jelenleg a hazai pozitív tenyésztési eredmények kb. 60-70%-a kerül évente az adatbázisba, és ebből a rendszerből kerültek az adatok az európai antibiotikum rezisztencia surveillance rendszerbe is (EARSS-the European Antimicrobial Resistance Surveillance System). A K. pneumoniae izolátumok széles-spektrumú cefalosporin rezisztenciáját Európában elsősorban ESBL-termelés okozza (EARSS 2008). Az NBS adataiból látható, hogy évről-évre folyamatosan emelkedik a rezisztencia aránya mind a nozokómiális, mind a területen szerzett infekciók esetében. A véráramfertőzésből izolált K. pneumoniae törzsek rezisztencia adatait elemezve kiderül, hogy a növekedést és a görbe változását a multirezisztens (egyszerre 3. generációs cefalosporin, fluorokinolon és aminoglikozid rezisztens) törzsek számának változása határozta meg. 2003-ban ezek a törzsek még 1%-nál kisebb gyakorisággal fordultak elő, majd 2005-re elérték a 15%101
ot a véráramfertőzést okozó K. pneumoniae törzsek között. 2009-ben pedig már az összes K. pneumoniae törzs 29%-t, a 3. generációs cefalosporin rezisztens K. pneumoniae törzseknek pedig több mint 70%-t adták. A mikrobiológiai és epidemiológiai vizsgálatok eredményével összhangban, a surveillance eredményei alapján elmondható, hogy jelenleg a K. pneumoniae cefalosporin rezisztenciáját a multirezisztens, CTX-M-termelő törzsek határozzák meg. Az utóbbi néhány évben nemcsak hazánkban, hanem Európa-szerte egyre nagyobb egészségügyi problémát jelent az ESBL-termelő, multirezisztens törzsek terjedése (EARSS 2008). Az ilyen baktériumok okozta fertőzéseknél sok esetben már csak a karbapenemek az egyedüli választható szerek a terápiában, sőt ezeknek a multirezisztens törzseknek az aránya annyira megemelkedett, hogy az empirikus terápiában az elsődlegesen választott szerekké is egyre inkább a karbapenemek váltak. Mindez azt eredményezte, hogy a multirezisztens, nozokómiális kórokozók között megjelentek a karbapenem rezisztens Gram-negatív baktériumok, melyek már szinte egyetlen
alkalmazható
antibiotikum
csoportra
sem
érzékenyek.
Elsősorban
Pseudomonas sp. és Acinetobacter sp., de ma már a szerzett karbapenem rezisztenciával rendelkező Enterobacteriaceae törzsek is terjednek. Hazánkban 2008-ig sporadikusan fordultak elő karbapenemekkel szemben is rezisztens Enterobacteriaceae izolátumok, azonban 2008-2009-ben már egy több egészségügyi intézményt érintő járványt is okoztak (Tóth és mtsai 2010). Továbbá egy, hazánkban korábban csak ESBLtermelőként leírt K. pneumoniae epidémiás klónban is megjelent szerzett karbapenem rezisztencia (Kristóf és mtsai 2010). Ez előrevetíti annak lehetőségét, hogy a világban, és így Magyarországon is elterjedhetnek olyan multirezisztens Gram-negatív törzsek, melyek semmilyen jelenleg elérhető antibiotikum csoportra nem lesznek érzékenyek.
7.3. ESBL-termelő Salmonella enterica törzsek vizsgálata, 2000-2004. 2000-2004 között gyűjtött 13692 nem-tifoid Salmonella izolátumból 14 S. Typhimurium és 1 S. Enteritidis bizonyult ESBL-termelőnek. A S. Enteritidis blaSHV-5 ESBL-gént, a 14 S. Typhimurium törzsből három hordozott blaSHV-5 és blaTEM-1 gént, nyolc blaCTX-M-5 gént, kettő blaCTX-M-15 és blaTEM-1, valamint egy csak blaCTX-M-15 gént. Mindegyik ESBL-típust először írtuk le Magyarországon Salmonella törzsekben.
102
A S. Typhimurium törzsek közül kettőt romániai állampolgárok, és hármat ukrán állampolgárok mintáiból izoláltak a betegek magyarországi ellátása során. Miriagou és mtsai leírtak olyan ESBL-termelő S. Typhimurium törzset Romániában, mely hasonlóan a romániai eredetű törzseinkhez blaSHV-5 és blaTEM-1 géneket hordozott (Miriagou és mtsai 2002). Nyitott kérdés maradt, vajon izolátumaink klonális rokonságban voltak-e azzal a törzzsel. A plazmid mérete és a blaTEM-1 hordozás miatt azonban az kizárható, hogy ezeknek a plazmidoknak kapcsolata lett volna a klebsiellákban terjedő epidémiás R-plazmidjainkkal. Az összes többi, Magyarországon izolált ESBL-termelő S. Typhimurium törzs az ukrán határ környékéről származott. Három ukrán és öt magyar izolátumban blaCTX-M-5 gén volt kimutatható. A konjugációs kísérletek igazolták, hogy a gén egy kb. 7 kb nagyságú konjugatív plazmid kódolódott. Hasonló mérettartományú CTX-M-5-pozitív plazmidokat hordozó S. Typhimurium törzseket írtak le Lettországban, Oroszországban és Fehéroroszországban (Bradford és mtsai 1998, Edelstein és mtsai 2004). Továbbá a hazai tözsekből izolált blaCTX-M-5 gént hordozó, konjugatív plazmidnál a CTX-M gén genetikai környezete azonos szerkezetű volt (17. ábra), és 99%-os homológiát mutatott a lett (Genbank AF286192) és az orosz (Genbank GQ385329) plazmidokkal. Az azonos szerkezetű kisméretű plazmid és a hazai CTX-M-5-termelő S. Typhimurium törzsek klonalitása alapján lehetséges, hogy törzseink rokonságban voltak az orosz, fehérorosz és lett törzsekkel. Azonban ennek bizonyításához további vizsgálatok lettek volna szükségesek. 2003-ban jelentek meg az első CTX-M-15-termelő S. Typimurium törzsek Magyarországon. Ugyanabban az évben, mint amikor a CTX-M-15-termelő K. pneumoniae epidémiás klón (HEC) kezdett elterjedni hazánkban. A salmonellákból származó CTX-M-15-gént hordozó konjugatív plazmidok azonban eltérő PstI-emésztési képet mutattak, és hordozták az ISEcp1 elemet a CTX-M upstream régiójában. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy nincs kapcsolat a nozokómiális fertőzéseket okozó K. pneumoniae blaCTX-M-15-hordozó plazmidja és a salmonellákban megjelent CTX-M-15 pozitív plazmidok között.
103
7.4. ESBL-termelő Escherichia coli törzsek vizsgálata, 2006-2007 Magyarországon a hemokultúrából izolált E. coli törzsek között a szélesspektrumú cefalosporinokkal szembeni rezisztencia aránya 2006-ra elérte az 5%-t (29. ábra, NBS adatai alapján). Az NBS adatai alapján Magyarországon 2004-ben a hemokultúrából izolált tözsek között még nem voltak 3. generációs cefalosporinokkal, fluorokinolonokkal és aminoglikozidokkal szemben együttes rezisztenciát mutató izolátumok, azonban 2006ra már a 3. generációs cefalosporin rezisztens törzsek 66%-a mutatott ilyen fenotípust. 2007-ben ez az arány nem változott, azonban később a cefalosporin rezisztenciában tapasztalható hirtelen emelkedés ezeknek a multirezisztens törzseknek a további terjedésével volt magyarázható (29. ábra). A változások hátterében valószínűleg az ESBL-termelő E. coli populáció megváltozása állt. Magyaroszágon az ESBL-termelő törzsek epidemiológiáját elsősorban Klebsiella spp. törzsek határozták meg, és az ESBL-termelő E. coli molekuláris genetikájáról kevés információnk volt (lásd. 8.1. szekció eredményei). 16%
16% Co-R 3rd gen ceph.+fluoroq.+aminogl.
14%
14%
3rd gen ceph. R
12%
12%
10%
10%
8%
8%
6%
6%
4%
4%
2%
2%
0%
0%
2003 (n=1042)
2004 (n=961)
2005 (n=1147)
2006 (n=1195)
2007 (n=1224)
2008 (n=1057)
2009 (n=1086)
29. ábra 3. generációs cefalosporinok, aminoglikozidok és fluorokinolonok korezisztenciája hemokultúrából izolált E. coli törzsekben, NBS adatai alapján (20032009) 104
Azért, hogy megismerjük a tapasztalt változás hátterét, egy restrospektív vizsgálat keretében jellemeztük a 2006-2007. között az ESBL-NRL-be beküldött, humán klinikai mintákból izolált ESBL-termelő E. coli törzsek reprezentatív kollekcióját. Ezzel
párhuzamosan
az
Országos
Állategészségügyi
Intézettel
együttműködésben vizsgáltuk az ebben az időszakban, állati diagnosztikus mintákból izolált ESBL-termelő E. coli törzseket. Az Országos Állategészségügyi Intézetben már 2004. óta szűrik az állatokból származó Enterobacteriaceae törzseket ESBL-termelés irányában, azonban 2006-ig nem izoláltak egyetlen törzset sem. A kiválasztott 45 humán izolátum 21 egészségügyi intézetből származott. Több mint 70%-uk blaCTX-M-15 gént hordozott, emellett előfordult még: blaSHV-2, blaSHV-5, blaSHV-12 és blaCTX-M-1. A törzsek 80%-a az extraintesztinális fertőzésekkel összefüggésbe hozható B2 és D filogenetikai csoportokba volt besorolható. A B2 csoportba tartozó törzsek többsége (n=21) O25 szerotípusba, míg a D filogenetikai csoportba tartozó törzsek többsége (n=9) O15 szerotípusba tartozott. Mindkét csoportra (O25 és O15) jellemző volt, hogy a cefalosporinok mellett ciprofloxacinnal szemben is rezisztensek voltak. A PFGE vizsgálat alapján 18 O25 szerotípusba tartozó törzs mutatott klonális kapcsolatot és tartozott az ST131 nemzetközi klónhoz, valamint az O15 szerotípusú törzsek közül 8 két közel rokon clusterhez tartozott. Mindkét
szerotípus
képviselőit
elsősorban
húgyúti,
illetve
egyéb
extraintesztinális fertőzésekből izolálják (Cagnacci és mtsai 2008). Cagnacci és mtsai tanulmányában 148 ciprofloxacin rezisztens, nem-komplikált cystitisből izolált E. coli izolátumot vizsgáltak. Az izolátumok nyolc európai országból származtak. A fluorokinolon rezisztens E. coli törzsek megjelenésének és elterjedésének hátterében kétféle mechanizmus állhat: i, az antibiotikum használat hatására mutáns törzsek alakulnak ki érzékeny törzsekből, ii, vagy rezisztens klónok terjednek el. Vizsgálataik azt mutatták, hogy Európában két ciprofloxacin rezisztens klón terjedése figyelhető meg: az O25:H4, ST131 szekvencia típusba tartozott a vizsgált törzsek 23,6%-a, és az O15:H1 típusba tartozott a törzsek 10,8%-a. Mindösszesen 12 törzs (8,1%) volt ESBLtermelő, melyből 10 blaCTX-M-15 gént hordozott (Cagnacci és mtsai 2008).
105
Ezek a klónok stabil virulencia profillal rendelkeznek, és területen szerzett infekciók széles skáláját okozhatják. Az O15:H1 klonális csoportot először 1988-ban írták le egy 1 évig tartó (1986-1987) területi járványból Dél-Londonban. Elsősorban húgyúti infekciókat okozott, de véráramfertőzésekből, pneumoniából és meningitisből is izolálták a járvány során. Később Európa más országaiban is leírták a törzseket (Olesen és mtsai 2009). Virulenciájuk mellett növekvő antibiotikum rezisztenciájuk is egyre nagyobb problémát jelent. Az antibiotikum rezisztenciák közül valószínűleg elsőként a fluorokinolon rezisztenciát szerezték meg ezek a klónok, és így terjedtek el. Ezután tettek szert további antibiotikum rezisztenciákra, mint a plazmidon kódolt blaCTX-M-15 (Cagnacci és mtsai 2008, Peirano és Pitout 2010) A multirezisztens CTX-M-15-termelő E. coli törzsek területen szerzett és nozokómiális fertőzések egyre jelentősebb kórokozója (Peirano és Pitout 2010). Minden földrészen leírták megjelenését, így Európa legtöbb országában, Ázsia, Afrika, Északés Dél-Amerika több országában és Ausztráliában (Hawkey 2008, Lewis és mtsai 2007, Livermore és mtsai 2007, Mulvey és mtsai 2004, Villegas és mtsai 2008, Zong és mtsai 2008). A törzsek epidemiológáját tekintve ki kell emelni a világszerte elterjedt, magas virulenciájú, ciprofloxacin rezisztens, CTX-M-15-termelő E. coli O25:H4-ST131 klónt, mely elsősorban húgyúti infekciókat okoz, és területi és nozokómiális fertőzésekből is egyre nagyobb arányban izolálják (Coque és mtsai 2008a, Coque és mtsai 2008b, Woodford és mtsai 2004). Eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy a hazai humán klinikai mintákból izolált ESBL-termelő E. coli törzsekre, hasonlóan az európai trendhez, a klonalitás jellemző. Magyarországon is megjelentek és elterjedtek a CTX-M-15-termelő, ciprofloxacin rezisztens O25-ST131/B2 és O15/D E. coli klónok. 2006-2007-ben az állati mintákból izolált 2366 E. coli törzsből 18 bizonyult ESBL-termelőnek az Országos Állategészségügyi Intézet vizsgálatai alapján. Az ESBLtermelő E. coli izolátumok az ország egész területéről különböző fajú és korú állatokból (szarvasmarha, sertés, tyúk, pulyka), valamint egy tejmintából származtak. 16 törzs CTX-M-típusú -laktamázt hordozott: 11 blaCTX-M-1 és 5 blaCTX-M-32. Míg a blaCTX-M-1 csak gyengén hidrolizálja a ceftazidimet, annak egy aminosav szubsztitúcióval kialakuló változata, a blaCTX-M-32 azonban már ceftazidimmel szemben
106
is magasabb MIC értéket biztosít (Cartelle és mtsai 2004). A vizsgált állati izolátumok közül a CTX-M-32-termelők többsége magas szintű kinolon rezisztenciát is mutatott. Egy 1999-ben készült felmérés szerint az Európai Unióban egy év alatt felhasznált 13288 tonna antibiotikum 29%-át az állatgyógyászatban, míg 9%-át hozamfokozóként az állattenyésztésben alkalmazták (Ternak 2005). A széles-spektrumú cefalosporinok használata nemcsak a humán, hanem az állatgyógyászatban is igen jelentős Európában (Coque és mtsai 2008b, Goossens és mtsai 2005), emellett jelentős a kinolon felhasználás nemcsak gyógyszerként, hanem mint hozamfokozó is (Turnidge 2004). Bár pontos adatok nem állnak rendelkezésre Magyarországon, azonban feltételezhető, hogy nálunk sem csak a humán területen jelentős az antibiotikum felhasználás. Hasonlóan a humán medicinában tapasztaltakkal, a korlátozás nélküli és felelőtlen antibiotikum alkalmazás a multirezisztens törzsek kiszelektálódásához és elterjedéséhez vezet. A vizsgált izolátumainknál tapasztalt kinolon rezisztencia felhívja a figyelmet arra, hogy –hasonlóan a humán törzsekhez- a kinolon használat a CTX-Mtermelő törzsek fennmaradásához és terjedéséhez járul hozzá. Egy felmérés szerint a cefalosporin (ceftiofur) kezelés elősegíti az ESBLtermelő E. coli fennmaradását az állati bélflórában, sőt a kezelés után több mint 20 nappal is kimutatható az állatból. Ez a hosszú ideig tartó hordozás felveti a kérdést, hogy egy állat hasznosítása előtt mennyivel kell abbahagyni az antibiotikumos kezelést, hogy a multirezisztens törzsek távozzanak, vagy szintjük minimálisra csökkenjen (Cavaco és mtsai 2008). A törzsek többsége (15/18) a kommenzalista, alacsony virulenciájú törzsekre jellemző A és B1 filogenetikai csoportba tartozott, azonban jellemző PT nem volt. Nem volt olyan állati törzs sem, ami valamelyik humán törzzsel azonos PT-ba tartozott volna. Ez azt jelenti, hogy a vizsgált törzskollekciókban nem volt klonális kapcsolat a humán és állati törzsek között. Az ESBL-termelő E. coli és Salmonella fertőzések, hasonlóan a humán megbetegedésekhez, magasabb morbiditást és mortalitást mutatnak, mint az érzékenytörzsekkel történő fertőzések (Caratolli 2008). Jelenleg még nem gyakori az ESBL-termelő törzsek előfordulása állatokban, azonban arányuk egyre nő (Caratolli 2008). ESBL-termelő E. coli állati előfordulását tárgyaló nemzetközi publikációkban elérhető adatok valószínűleg alulreprezentáltak, és
107
nem tükrözik az ESBL-termelő E. coli törzsek valóságos előfordulását (Caratolli 2008). Franciaországban Madec és mtsai egészséges és beteg szarvasmarhák bélsarában vizsgálták az ESBL-termelő törzsek előfordulását, ami előbbieknél 5,8%, utóbbiaknál 6,2% volt (Madec és mtsai 2008). Rómában Caratolli és mtsai kutyák és macskák bélsarában vizsgálta ESBL-termelő törzsek előfordulását, és mindkettőnél 7% hordozási arányt mutatott ki (Caratolli és mtsai 2005). Dél-Franciaországban Bonnedahl és mtsai mérték ESBL-termelő törzsek bélsárban való előfordulását sárgalábú sirályok esetében. Az izolált E. coli törzsek 9,4%-a volt pozitív (főleg CTX-M-1, és egy E. coli törzsnél CTX-M-15). Azonban a törzsek nem mutattak klonális rokonságot egymással (Bonnedahl és mtsai 2009). Felmérésünkben az E. coli törzseknek 0,7%-a volt ESBL-termelő. Ez valószínűleg annak köszönhető, hogy ezekben az években kezdtek hazánkban megjelenni az első ESBL-termelő törzsek, elsősorban sporadikusan (2006-ban 3, 2007ben 15 törzs). Eredményeinkhez hasonlóan több felmérésben is klonális rokonságot nem mutató ESBL-termelő törzsek előfordulását írták le állatokban (Caratolli 2008). Az állati E. coli törzseknél inkább jellemző az ESBL-gének horizontális átvitele, mint az azt hordozó törzsek klonális terjedése (Caratolli 2008). Az állatokból kimutatott leggyakoribb ESBL-típusok: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-32, SHV-2, SHV-12, TEM-52 (20 táblázat) (Caratolli 2008). Eredményeink megegyeztek a nemzetközi publikációkban leírt trendekkel. Néhány tanulmány beszámol esetekről, mikor emberekben és állatokban ugyanaz a klón, vagy ugyanaz a rezisztencia plazmid fordult elő. A korábban már említett sárgalábú sirályok körében végzett vizsgálatnál találtak humán mintákból és madarakból származó törzseket, melyek genetikai rokonságot mutattak, és mind blaCTXM-1
gént hordoztak. A szerzők feltételezték a kétirányú terjedés lehetőségét (Bonnedahl
és mtsai 2009). Egy dán tanulmányban leírtak sertések és a farmon dolgozók között CTX-M-1-típusú ESBL-hordozó plazmidok átvitelét (Moodley és Guardabassi 2009). Az állatokban és állati eredetű termékekben előforduló ESBL-termelő kórokozók egészségügyi és epidemiológiai jelentősége azonban nem egyértelmű. (Caratolli 2008). Ezt a megállapítást alátámasztja az is, hogy a humán területen elterjedt klónok, plazmidok és ESBL-géntípusok általában eltérnek az állatokból izoláltaktól (Coque és mtsai 2008b).
108
Vizsgálatunk megmutatta, hogy a humán ás állati eredetű hazai törzsek genetikai háttere eltérő, és a fő ESBL típusok sem egyeznek meg. Azonban néhány humán mintából izolált törzs az állatokban is megtalálható ESBL-géneket hordozott (blaCTX-M-1, blaSHV-2). Ezek lehetséges kapcsolatának vizsgálatát most tervezzük elvégezni az ESBLNRL-ben.
109
20. táblázat E. coli és nem-tifoid Salmonella törzsek ESBL-hordozása állatokban illetve állati eredetű élelmiszerekben (Forrás: Caratolli 2008) -laktamáz FEC-1 CTX-M-1
CTX-M-2
CTX-M-3 CTX-M-9
CTX-M-13 CTX-M-14
CTX-M-15 CTX-M-24 CTX-M-32 SHV-12
SHV-5 TEM-52
a
Törzsek Organizmusa Escherichia coli száma 1 E. coli 1 E. coli 31 E. coli 19 E. coli 20 E. coli 2 E. coli 13 S. Virchow 1 S. Virchow 1 S. Virchow 6 E. coli 4 S. Virchow 8 S. Virchow 3 S. Virchow 2 S Enteriditis 1 E. coli 13 E. coli 2 E. coli 41 E. coli 2 E. coli 114 E. coli 1 E. coli 1 S. Virchow 2 E. coli 3 S 35:c:1,2 1 S Newport 1 S Typhimurium 1 S Rissen 1 E. coli 1 E. coli 19 E. coli 3 E. coli 5 S Agona 3 S Blockley 6 S Derby 1 S Infantis 1 S Paratyphi B 1 S. Paratyphi B 1 S. Virchow 1 S. Typhimurium 3 S. Typhimurium 3 E. coli 3 E. coli 3 E. coli 1
Ország Japán Portugália Spanyolország Franciaország Olaszország Dánia Japán Hollandia Írország Belgium Hong Kong Franciaország Dánia Spanyolország Spanyolország Spanyolország Hong Kong Spanyolország Japán Anglia Franciaország Hong Kong Görögország Spanyolország Szenegál USA Hollandia Spanyolország Spanyolország Spanyolország Olaszország Spanyolország Belgium Hollandia Belgium Belgium Hollandia Belgium Hollandia Hollandia Belgium Portugália Spanyolország Dánia
S., Salmonella enterica
110
Állatfaj Kutya Kutya Szarvasmarha, sertés, baromfi Szarvasmarha, sertés, baromfi Hobbiállat Sertés Szarvasmarha, broiler csirke Broiler csirke Baromfi Baromfi Sertés Baromfi Fürj Baromfi Tyúk Baromfi Szarvasmarha Nyúl, baromfi, sertés Broiler csirke Szarvasmarha Baromfi Sertés Baromfi Baromfi, sertés Baromfi Ló Baromfi Sertés Kutya Baromfi Kutya Baromfi, sertés Baromfi Baromfi Baromfi Baromfi Baromfi Baromfi Baromfi Baromfi Baromfi Kutya Nyúl, baromfi Marhahús
7.5. Molekuláris genetikai módszerek alkalmazása egy járvány epidemiológiai kivizsgálásában Az évek során az OEK-ban bevezetett molekuláris genetikai módszerek és az elvégzett vizsgálatok olyan módszer- és tudásbázist biztosítanak, amivel több szempontból is kivizsgálhatóak a multirezisztens kórokozók okozta járványok. Olyan részletek felderítésére adnak lehetőséget, amelyek nagyban előremozdíthatják a hazai epidemiológiai kivizsgálásokat. Ezt egy 2008-ban lezajlott járvány kapcsán mutattuk be. Az epidemiológiai és mikrobiológiai vizsgálatok egybehangzó eredményei alapján a járvány terjesztője egy extrinsic módon, számos ESBL-termelő és ESBL-t nem-termelő Gram-negatív kórokozóval kontaminált infúziós oldat volt. A klinikai és kórházhigiénés mintákból kitenyésztett baktériumok átfogó molekuláris genetikai jellemzése (PFGE vizsgálat, ESBL-típusok meghatározása szekvenálással, az ESBL-t kódoló plazmidok összevetése RFLP módszerrel) azonban rávilágított egy, az osztályon párhuzamosan zajló, kisebb esetszámú, ESBL-termelő K. pneumoniae okozta járványra is. A P PT-ba tartozó K. pneumoniae törzs volt az egyedüli véráramfertőzésből izolált törzs, melyet nem sikerült a Rindex infúziós palacból kitenyészetni, azonban a leggyakoribb típusként izoláltuk az újszülöttek székletéből. Hasonlóan a vizsgálat során izolált többi ESBLtermelő törzshöz, a P PT-ba tartozó törzsek is blaSHV-5 ESBL-gént hordoztak, azonban az ESBL-t kódoló plazmid PstI-emésztési képe az eltérő eredetet támasztotta alá. Mikrobiológiai vizsgálatok eredménye alapján kiegészítő epidemiológiai vizsgálatot végeztek. Ez
igazolta
a párhuzamosan
futó másik
járványt,
mely korábbi
beavatkozásokkal (szondás táplálás, korábbi infúziós ellátás) volt összefüggésbe hozható. A plazmidokkal végzett RFLP vizsgálat arra is rávilágított, hogy az eredeti járványban résztvevő különböző fajok ugyanazt a plazmidot hordozták, és az emésztési mintázatuk nagyon hasonló volt a 2002-2003-ban kimutatott, országosan elterjedt SHV-5hordozó R-plazmidéhoz.
111
8. ZÁRÓKÖVETKEZTÉSEK, ÚJ EREDMÉNYEK A
-laktám antibiotikumok felfedezésük óta a legfontosabb terápiás szerek a
bakteriális kórokozók okozta fertőzések kezelésében. Azonban már a kezdetekben beszámoltak arról, hogy a baktériumok egyes csoportjai természetes rezisztenciát mutatnak ennek az antibiotikum csoportnak egyes tagjaival szemben. Mára már többféle -laktámokkal szembeni rezisztencia mechanizmust leírtak, azonban a legjelentősebb és leghatékonyabb mód a -laktamázok termelése. A kromoszómálisan kódolt, természetes rezisztenciát okozó -laktamázok mellett már 1960-as években írták le az első mobilis genetikai elemen kódolt változatot. Az antibiotikumok újabb és újabb csoportjait és a laktámok mind több változatát vezették be a terápiában, azonban a klinikai mintákból izolált baktériumokban is újabb és újabb rezisztencia mechanizmusok és különböző laktamázok jelentek meg. Az 1980-as években írták le az első ESBL-termelő törzseket. Ezek az enzimek már képesek hidrolizálni a széles-spektrumú cefalosporinokat is, amely az utóbbi évtizedekben a leginkább használt anitbiotikum csoport volt a súlyos fertőzések kezelésére. Az ESBL-k klinikai és járványügyi szempontból is jelentősek: i, általában mobilis genetikai elemek kódolják, és ez lehetővé teszi nemcsak klonális, hanem horizontális terjedésüket is; ii, gyakran fordulnak elő más antibiotikum rezisztenciákkal együtt (pl. aminoglikozidok, fluorokinolonok), ami jelentősen korlátozza a terápiás lehetőségeket; iii, a 1990-es évek óta arányuk folyamatosan nő, és világszerte okoznak súlyos járványokat, amelyekben sikeres, virulens klónok megjelenését írják le. Az ESBL enzimeknek több típusát ismerjük. Ezek közül a leggyakoribbak az SHV, TEM és CTX-M. A 1990-es évek végéig világszerte az SHV és a TEM-típusú ESBL-ek voltak az elterjedtek, azonban az utóbbi évtizedben a CTX-M-típusok váltak dominánssá. Az ESBL-gének hazai előfordulásáról az 1990-es évek végén kevés ismerettel rendelkeztünk. 1996-ban, az első hazai felmérésben az SHV-típusú ESBL-termelő K. pneumoniae törzsek megjelenését írták le. 1998-ban már beszámoltak az első PIC-ban lezajlott, SHV-5–termelő K. pneumoniae törzs okozta járványról. Emellett sporadikus esetekből írtak le ESBL-termelő (TEM-52 illetve CTX-M-4) S. Typhimurium törzseket.
112
A dolgozatban leírtuk a hazai ESBL-típusok előfordulását nozokómiális és zoonotikus bélbaktériumok körében, bemutattuk az SHV és CTX-M enzimek hazai epidemiológiájának különbségeit, jellemeztük a hazai járványokban előforduló Klebsiella törzseket. Vizsgálataink során Magyarországon először alkalmaztunk DNS-szekvenálást az ESBL-típusok meghatározására, és világviszonylatban is először használtunk MLST módszert ESBL-termelő K. pneumoniae klónok azonosítására.
8.1. SHV-típusú ESBL gének előfordulása Magyarországon, 2002-2003 Az ESBL-gének jellemzésére először alkalmaztunk DNS-szekvenálást, ami lehetővé tette, hogy az ESBL-típusokat pontosan meghatározhassuk. Két domináns SHV-típust írtunk le Magyarországon: SHV-2a és SHV-5. Vizsgálatunk hasonló eredménnyel zárult, mint a környező országokban készült, hasonló témájú tanulmányok.
8.2. ESBL-termelő Klebsiella spp. okozta járványok jellemzése 2002-2003 között PIC-kban lezajlott hét járványt 10 Klebsiella spp. epidémiás klón okozta. Vizsgálataink azt mutatták, hogy egyik klón sem jelent meg két különböző kórházban, és egyik kórházban sem tudott ugyanaz a klón különböző időpontokban járványt okozni. Azonban az ESBL-gének (SHV-5 és SHV-2a) epidémiás Rplazmidokon terjedtek el az országban. A 2003-ban megjelent CTX-M-15-termelő K. pneumoniae epidemiológiája már egészen más képet mutatott. Az ország több kórházában ugyanaz az epidémiás klón okozott fertőzéseket (HEC). 2005-ben már a CTX-M-15-termelő K. pneumoniae robbanásszerű terjedését tapasztaltuk, aminek hátterében három, igen hasonló rezisztencia eszköztárral rendelkező multirezisztens epidémiás klón állt (N/ST15, S/ST11 és R/ST147). Hasonlóan Európa más országaihoz, Magyarországon is dominánnsá váltak a multirezisztens, CTX-M-termelő K. pneumoniae törzsek.
113
8.3. ESBL-termelő S. enterica törzsek vizsgálata, 2000-2004 ESBL-termelő
S.
enterica
törzsek
sporadikus
előfordulását
írtuk
le
Magyarországon. A kimutatott blaSHV-5 és blaCTX-M-15 hordozó plazmidok különböztek az abban az időben elterjedt nozokómiális járványokat okozó Klebsiella spp. törzsek ESBL-gént hordozó plazmidjaitól. A molekuláris vizsgálatok eredményei, és azok összevetése más tanulmányok megállapításaival felvetette lehetőségét, hogy Közép-Kelet-Európában egy CTX-Mtermelő S. Typhimurium klón terjedt el.
8.4. ESBL-termelő E. coli törzsek vizsgálata, 2006-2007 ESBL-termelő E. coli törzsek átfogó vizsgálatát, valamint humán és állati törzsek összehasonlítását először végeztük el Magyarországon. A humán E. coli törzsek elsősorban blaCTX-M-15 gént hordoztak, és 58%-a két virulens klónba tartozott (O25ST131/B2, O15/D). Ezek a szerotípusok és klónok jelentős extraintesztinális kórokozók. Világszerte elterjedtek, és nemcsak a nozokómiális, hanem a területen szerzett fertőzéseket (elsősorban húgyúti) is okoznak. Az állati E. coli törzseknél meghatározott ESBL típusok (CTX-M-1, CTX-M-32 és SHV-2) megegyeztek a szakirodalomban leírt leggyakoribb típusokkal, ám eltértek a humán mintákból leggyakrabban azonosítottól (CTX-M-15). Az állati törzsek nem mutattak genetikai rokonságot a humán E. coli törzsekkel, így vizsgálataink alapján jelenleg hazánkban az állatok által hordozott ESBL-termelő törzsek nem okozói a humán infekcióknak.
114
9. ÖSSZEFOGLALÁS Az Enterobacteriaceae család tagjai világszerte a nozokómiális és területen szerzett infekciók egyik legfontosabb kórokozói. Ezekben az infekciókban az elsődlegesen alkalmazott antibiotikumok a
-laktámok (főleg a széles-spektrumú
cefalosporinok és a karbapenemek) és a fluorokinolonok. Azonban az utóbbi években egyre nagyobb arányban jelennek meg ezekkel az antibiotikumokkal szemben rezisztenciát mutató kórokozók. A széles-spektrumú cefalosporinokkal szembeni szerzett rezisztenciát elsősorban az
kiterjedt-spektrumú
-laktamázok (ESBL-k) közvetítik. Az ESBL-termelő
kórokozók általában további rezisztencia mechanizmusokkal is rendelkeznek, és ez jelentősen korlátozza a terápiás lehetőségeket. Az ESBL-termelő izolátumok számának emelkedéséért és különösen a TEM-52, SHV-12 és CTX-M-15 típusok terjedéséért a mobilis genetikai elemek, elsősorban konjugatív plazmidok, és bizonyos klónok (pl. E. coli O25-ST131/B2) terjedése felelős. Munkánk célja volt, hogy a Magyarországon megjelenő ESBL-termelő Enterobacteriaceae törzsek genetikai hátterét, hazai elterjedtségét vizsgáljuk, és tanulmányozzuk a törzsek genetikai hátterét és molekuláris epidemiológiáját. Eredményeink alapján elmondható, hogy elsősorban két SHV-gén (SHV-5 és SHV-2a) volt felelős az SHV-típusú ESBL-termelő patogének okozta nozokómiális fertőzések számának emelkedéséért Magyarországon 2002-2003-ban. A járványokat okozó, ESBL-termelő K. pneumoniae törzsek esetében két eltérő helyzetet írtunk le: i, a PIC-okban lezajlott hét járványt 10 különböző Klebsiella klón okozta, melyek SHV-típusú (-5, -2a) ESBL géneket kódoló, közeli rokonságot mutató R-plazmidokat hordoztak; ii, míg a CTX-M-15-termelő törzsek országos szintű elterjedésének hátterében mindösszesen három ciprofloxacin rezisztens, CTX-M-15termelő K. pneumoniae epidémiás klón állt. Leírtuk az ESBL-termelő S. enterica törzsek hazai elterjedtségét és incidenciáját. A vizsgált SHV-5 és CTX-M-15 hordozó plazmidok nem mutattak rokonságot a nozokómiális járványokat okozó, ESBL-termelő K. pneumoniae törzsekből származó plazmidokkal. A molekuláris vizsgálatok eredményei felvetették annak lehetőségét,
115
hogy Közép-Kelet-Európában egy CTX-M-(-5, -15) termelő S. Typhimurium klón terjedt el. A humán mintákból izolált, ciprofloxacin rezisztens, CTX-M-15-termelő E. coli O25-ST131/B2 és O15/D klónok széleskörű elterjedését igazoltuk a magyar egészségügyi intézményekben. A többi európai ország eredményeihez hasonlóan az állati eredetű ESBL-termelő törzsekben blaCTX-M-1, blaCTX-M-32 és blaSHV-2 gének előfordulását írtuk le. A PFGE vizsgálatok alapján klonális kapcsolat az állati és humán törzsek között nem volt bizonyítható.
116
10. SUMMARY Enterobacteriaceae have become one of the most important causes of nosocomial and community acquired infections. Beta-lactams (mainly expandedspectrum cephalosporins and carbapenems) and fluoroquinolones constitute the main therapeutic choices to treat infections caused by these microorganisms. However, resistance to these compounds has been reported more and more frequently in the past years. Acquired resistance to expanded-spectrum cephalosporins is mainly mediated by extended-spectrum
-lactamases (ESBLs). Since the ESBL-producing organisms
frequently also carry genes encoding resistance to other antibiotic classes, the therapeutic options are seriously reduced in these cases. The spread of mobile genetic elements, mainly conjugative plasmids, and the dispersion of specific clones (e.g. E. coli O25-ST131/B2) have been responsible for the increase in ESBL-producing isolates and for the spread of TEM-52, SHV-12 and CTX-M-15 in particular. The main objectives of our study were survey of occurence and geographical distribution of different ESBLs among Enterobacteriaceae strains in Hungary, and to investigate the genetic background and molecular epidemiology of these strains. It was found that primarily two SHV genes (SHV-5 and SHV-2a) have been responsible for the increasing number of nosocomial infections caused by SHV-type ESBL-producing pathogens in Hungary between 2002-2003. In case of outbreak-causing ESBL-producing K. pneumoiae strains two different situations were observed: i, the seven investigated outbreaks in Neonatal Intensive Care Units were caused by 10 epidemiologically unrelated epidemic clones carrying closely related epidemic R-plasmids encoded blaSHV-5 or blaSHV-2a; ii, the nationwide dissemination of CTX-M-15 in adult hospital wards was the consequence of expansion of only three cirpofloxacin resistant, ESBL-producing K. pneumoniae epidemic clones. We described the occurence and incidence of ESBL-producing S. enterica strains in Hungary. No similarity was found between SHV-5 and CTX-M-15 harbouring plasmids from S. enterica and those isolated from ESBL-producing K. pneumoniae strains involved in investigated nosocomial outbreaks. Molecular typing results suggest
117
the possibility that a CTX-M (-5, -15)-producing S. Typhimurium clone was disseminated across Eastern and Central Europe. The ciprofloxacin-resistant CTX-M-15-producing E. coli O25-ST131/B2 and O15/D strains of human origin proved to be widespread among Hungarian healthcare facilities. CTX-M-1, CTX-M-32 and SHV-2 ESBL genes were found in the ESBLproducing E. coli strains of animal origin, which are present in animal strains in the other European countries as well. According to results of PFGE no clonal relationship was found between human and animal strains.
118
11. IRODALOMJEGYZÉK 1.
Abraham EP, Chain E. (1988) An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. 1940. Rev Infect Dis, 10: 677−678.
2.
Alekshun MN, Levy SB. (2007) Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell, 128: 1037-1050.
3.
Ambler RP. (1980) The structure of beta-lactamases. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 289: 321−331.
4.
Arduino SM, Roy PH, Jacoby GA, Orman BE, Pineiro SA, Centron D. (2002) blaCTX-M-2 is located in an unusual class 1 integron (In35) which includes Orf513. Antimicrob Agents Chemother, 46: 2303−2306.
5.
Baraniak A, Fiett J, Hryniewicz W, Nordmann P, and Gniadkowski M. (2002a) Ceftazidime-hydrolysing CTX-M-15 extended-spectrum ß-lactamase (ESBL) in Poland. J Antimicrob Chemother, 50: 393-396.
6.
Baraniak A, Fiett J, Sulikowska A, Hryniewicz W, Gniadkowski M. (2002b) Countrywide spread of CTX-M-3 extended-spectrum beta-lactamase producing microorganisms of the family Enterobacteriaceae in Poland. Antimicrob Agents Chemother, 46: 151−159.
7.
Baraniak A, Sadowy E, Hryniewicz W, Gniadkowski M. (2002) Two different extended-spectrum
-lactamases (ESBLs) one of the first ESBL-producing
Salmonella isolates in Poland. J Clin Microbiol, 40:1095–1097.
8.
Bedenic B, Randegger CC, Stobberingh E, Hachler H. (2001) Molecular epidemiology of extended-spectrum β-lactamases from Klebsiella pneumoniae strains isolated in Zagreb, Croatia. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 20: 505–508.
119
9.
Bonnedahl J, Drobni M, Gauthier-Clerc M, Hernandez J, Granholm S, Kayser Y, Melhus A, Kahlmeter G, Waldenström J, Johansson A, Olsen B. (2009) Dissemination of Escherichia coli with CTX-M type ESBL between humans and yellow-legged gulls in the south of France. PLoS One, 4: e5958.
10.
Bonnet R. (2004) Growing group of extended-spectrum β-lactamases: the CTX-M enzymes. Antimicrob Agents Chemother, 48: 1−14.
11.
Bonnet R, Dutour C, Sampaio JLM, Chanal C, Sirot D, Labia R, De Champs C, Sirot J. (2001) Novel cefotaximase (CTX-M-16) with increased catalytic efficiency due to substitution Asp-240->Gly. Antimicrob Agents Chemother, 45: 2269−2275.
12.
Bonnet R, Recule C, Baraduc R, Chanal C, Sirot D, De Champs C, Sirot J. (2003) Effect of D240G substitution in a novel ESBL CTX-M-27. J Antimicrob Chemother, 52: 29−35.
13.
Bonnet R, Sampaio JLM, Labia R, De Champs C, Sirot D, Chanal C, Sirot J. (2000) A novel CTX-M β-lactamase (CTX-M-8) in cefotaxime-resistant Enterobacteriaceae isolated in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, 44: 1936−1942.
14.
Bradford PA. (2001) Extended-spectrum ß-lactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev. 14: 933-951.
15.
Bradford PA, Yang Y, Sahm D, Grope I, Gardovska D, Storch G. (1998) CTX-M5, a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase from an outbreak of Salmonella Typhimurium in Latvia. Antimicrob Agents Chemother, 42: 1980-1984.
16.
Brisse S; Milatovic D; Fluit AC; Verhoef J; Martin N; Scheuring S; Köhrer K; Schmitz FJ. (1999) Comparative in vitro activities of ciprofloxacin, clinafloxacin,
120
gatifloxacin, levofloxacin, moxifloxacin, and trovafloxacin against Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, and Enterobacter aerogenes clinical isolates with alterations in GyrA and ParC proteins. Antimicrob Agents Chemother, 43: 2051-2055.
17.
Bush K. (1989a) Characterization of β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother, 33: 259−263.
18.
Bush K. (1989b) Characterization of β-lactamases: groups 1, 2a, 2b, and 2b’. Antimicrob Agents Chemother, 33: 264−270.
19.
Bush K. (1989c) Characterization of β-lactamases: groups 2c, 2d, 2e, 3, and 4. Antimicrob Agents Chemother, 33: 271−276.
20.
Bush K, Jacoby GA, Medeiros AA. (1995) A functional classification scheme for β-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother, 39: 1211−1233.
21.
Butaye P, Cloeckaert A, Schwarz S.(2003) Mobile genes coding for effluxmediated antimicrobial resistance in Gram-positive and Gram-negative bacteria. Int J Anitmicrobial Agent, 22: 205-210.
22.
Cagnacci S, Gualco L, Debbia E, Schito GC, Marchese A. (2008) European Emergence of Ciprofloxacin-Resistant Escherichia coli Clonal Groups O25:H4ST 131 and O15:K52:H1 Causing Community-Acquired Uncomplicated Cystitis. J Clin Microbiol, 46: 2605-2612.
23.
Cao V, Lambert T, Courvalin P. (2002) ColE1-like plasmid pIP843 of Klebsiella pneumoniae encoding extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-17. Antimicrob Agents Chemother, 46: 1212−1217.
121
24.
Caratolli A. (2008) Animal reservoirs for extended spectrum
-lactamase
producers. Clin Microbiol Infect, 14 (Suppl. 1): 117–123.
25.
Carattoli A, Lovari S, Franco A, Cordaro G, Di Matteo P, Battisti A. (2005) Extended-spectrum ß-lactamases in Escherichia coli isolated from dogs and cats in Rome, Italy, from 2001 to 2003. Antimicrob Agents Chemother, 49: 833-835.
26.
Cartelle M, del Mar TM, Molina F, Moure R, Villanueva R, Bou G (2004) Highlevel resistance to ceftazidime conferred by a novel enzyme, CTX-M-32, derived from CTX-M-1 through a single Asp240-Gly substitution. Antimicrob Agents Chemother, 48: 2308−2313.
27.
Cavaco LM, Abatih E, Aarestrup FM, Guardabassi L. (2008) Selection and persistence of CTX-M-producing Escherichia coli in the intestinal flora of pigs treated with amoxicillin, ceftiofur, or cefquinome. Antimicrob Agents Chemother, 52: 3612–3616.
28.
Centers for Disease Control and Prevention. (2000) Standardized molecular subtyping of foodborne bacterial pathogens by pulsed-field gel electrophoresis: training manual. Atlanta, GA: CDC
29.
Chain E, Florey HW, Gardner AD, Heatly NG, Jennings MA, Orr-Ewing J, Sanders AG. (1940) Penicillin as a chemotherapeutic agent. Lancetti, 226-228.
30.
Chanawong A, M'Zali FH, Heritage J, Lulitanond A, Hawkey PM. (2000) Characterisation of extended-spectrum beta-lactamases of the SHV family using a combination of PCR-single strand conformational polymorphism (PCR-SSCP) and PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). Fems Microbiology Letters, 184: 85-89.
31.
Chanawong A, M’Zali FH, Heritage J, Xiong JH, Hawkey PM. (2002) Three cefotaximases,
CTX-M-9,
CTX-M-13,
122
and
CTX-M-14,
among
Enterobacteriaceae in the People’s Republic of China. Antimicrob Agents Chemother, 46: 630−637.
32.
Chmelnitsky I, Carmeli Y, Leavitt A, Schwaber MJ, Navon-Venezia S. (2005) CTX-M-2 and a new CTX-M-39 enzyme are the major extended-spectrum betalactamases in multiple Escherichia coli clones isolated in Tel Aviv, Israel. Antimicrob Agents Chemother, 49: 4745-4750.
33.
Clermont O, Bonacorsi S, Bingen E. (2000) Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Microbiol, 66: 4555–4558.
34.
Clermont O, Dhanji H, Upton M, Gibreel T, Fox A, Boyd D, Mulvey MR, Nordmann P, Ruppé E, Sarthou JL, Frank T, Vimont S, Arlet G, Branger C, Woodford N, Denamur E. (2009) Rapid detection of the O25b-ST131 clone of Escherichia coli encompassing the CTX-M-15-producing strains. J Antimicrob Chemother, 64: 274-7.
35.
Clermont O, Lavollay M, Vimont S, Deschamps C, Forestier C, Branger C, Denamur E, Arlet G. (2008) The CTX-M-15-producing Escherichia coli diffusing clone belongs to a highly virulent B2 phylogenetic subgroup. J Antimicrob Chemother. 61: 1024-1028.
36.
Cockerill FR III. (1999) Genetic methods for assessing antimicrobial resistance. Antimicrob Agents Chemother, 43: 199-212.
37.
Cornaglia G, Garau J, Livermore DM. (2008) Living with ESBLs. Introduction. Clin Microbiol Infect, 14 (Suppl 1): 1-2.
38.
Coque TM, Baquero F, Canton R. (2008a) Increasing prevalence of ESBLproducing Enterobacteriaceae in Europe. Eurosurv, 47.
123
39.
Coque TM, Novais A, Carattoli A, Poirel L, Pitout J, Peixe L, Baquero F, Cantón R, Nordmann P. (2008b) Dissemination of clonally related Escherichia coli strains expressing extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-15. Emerg Infect Dis, 14: 195-200.
40.
Coudron PE. (2005) Inhibitor-based methods for detection of plasmid-mediated AmpC β-lactamases in Klebsiella spp., Escherichia coli, and Proteus mirabilis. J Clin Microbiol, 43: 4163–4167.
41.
Daly M, Fanning S. (2000) Characterization and chromosomal mapping of antimicrobial resistance genes in Salmonella enterica serotype Typhimurium. Appl Environ Microbiol, 66: 4842-4848.
42.
Deguchi T, Fukuoka A, Yasuda M, Nakano M, Ozeki S, Kanematsu E, Nishino Y, Ishihara S, Ban Y, Kawada Y. (1997) Alterations in the GyrA subunit of DNA gyrase and the ParC subunit of topoisomerase IV in quinolone-resistant clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 41: 699–701.
43.
Diancourt L, Passet V, Verhoef J, Grimont PA, Brisse S. (2005) Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J Clin Microbiol, 43: 4178-4182.
44.
Doi Y, Paterson DL. (2007) Detection of plasmid-mediated class C betalactamases. Int J Infect Dis, 11: 191-197.
45.
Duan RS, Sit TH, Wong SS, Wong RC, Chow KH, Mak GC, Yam WC, Ng LT, Yuen KY, Ho PL. (2006) Escherichia coli producing CTX-M beta-lactamases in food animals in Hong Kong. Microb Drug Resist, 12: 145−148.
46.
EARSS
Management
Team.
http://www.rivm.nl/earss/
124
(2008)
Annual
report
2008.
47.
Eckert C, Gautier V, Saladin-Allard M, Hidri N, Verdet C, Ould-Hocine Z, Barnaud G, Delisle F, Rossier A, Lambert T, Philippon A, Arlet G. (2004) Dissemination of CTX-M-type
-lactamases among clinical isolates of
Enterobacteriaceae in Paris, France. Antimicrob Agents Chemother, 48: 12491255.
48.
Edelstein MM, Pimkin I, Palagin I, Edelstein I, Stratchounski L. (2003) Prevalence and Molecular Epidemiology of CTX-M Extended-Spectrum βLactamase-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian Hospitals. Antimicrob Agents Chemother, 47: 3724-3732.
49.
Edelstein M, Pimkin M, Dmitrachenko T, Semenov V, Kozlova N, Gladin D, Baraniak A, Stratchounski L. (2004) Multiple outbreaks of nosocomial salmonellosis in Russia and Belarus caused by a single clone of Salmonella enterica serovar Typhimurium producing an extended-spectrum
-lactamase.
Antimicrob Agents Chemother, 48: 2808-2815.
50.
Fleming A. (1929) On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. British J of Experiment Pathol, 10: 226-236.
51.
Ford PJ, Avison MB. (2004) Evolutionary mapping of the SHV β-lactamase and evidence for two separate IS26-dependent blaSHV mobilization events from Klebsiella pneumoniae chromosome. J Antimicrob Chemother, 54: 69−75.
52.
Galani I, Xirouchaki, Kanellakopoulou K, Petrikkos G, Giamarellou H. (2002) Transferable plasmid mediating resistance to multiple antimicrobial agents in Klebsiella pneumoniae isolates in Greece. Clin Microbiol Infect, 8: 579-588.
53.
Gangoue-Pieboji J, Miriagou V, Vourli S, Tzelepi E, Ngassam P, Tzouvelekis LS. (2005) Emergence of CTX-M-15-producing enterobacteria in Cameroon and
125
characterization of a blaCTX-M-15-carrying element. Antimicrob Agents Chemother, 49: 441-443.
54.
Gastmeier P, Schwab F, Barwolff S, Rüden H, Grundmann H. (2006) Correlation between the genetic diversity of nosocomial pathogens nad their survival time in intensive care units. J Hosp Infect, 62: 181-186.
55.
Georgopapadakou NH, Lin FY (1980) Penicillin-binding proteins in bacteria. Antimicrob Agents Chemother, 18: 148−157.
56.
Ghuysen JM. (1988) Bacterial active-site serine penicillin-interactive proteins and domains: mechanism, structure, and evolution. Rev Infect Dis, 10: 726−732.
57.
Gniadkowsky M. (2001) Evolution and epidemiology of extended-spectrum ßlactamases (ESBL-s) and ESBL-producing microorganisms. Clin Microbiol Infect, 7: 597-608.
58.
Gniadkowski M, Palucha A, Grzesiowski P, Hryniewicz W. (1998) Outbreak of ceftazidime-resistant Klebsiella pneumoniae in pediatric hospital in Warsaw, Poland: clonal spread of the TEM-47 extended-spectrum producing strain
and
-lactamase (ESBL)-
transfer of a plasmid carrying the SHV-5 like ESBL-
encoding gene. Antimicrob Agents Chemother, 42: 3079–3085.
59. Goossens H, Ferech M, Vander Stichele R, Elseviers M; ESAC Project Group. (2005) Outpatient antibiotic use in Europe and association with resistance: a cross-national database study. Lancet. 365: 579-587.
60.
Gruteke P, Goessens W, Van Gils J, Peerbooms P, Lemmens-Den Toom N, Van Santen-Verheuvel M, Van Belkum A, Verbrugh H. (2003) Patterns of resistance associated with integrons, the extended-spectrum -lactamase SHV-5 gene, and a
126
multidrug efflux pump of Klebsiella pneumoniae causing a nosocomial outbreak. J Clin Microbiol, 41: 1161-1166.
61.
Guardabassi L, Dijkshoorn L, Collard Jm, Olsen Je, Dalsgaard A. (2000) Distribution and in-vitro transfer of tetracycline resistance determinants in clinical and aquatic Acinetobacter strains. J Med Microbiol, 49: 929-936.
62.
Gutmann L, Ferre B, Goldstein FW, Rizk N, Pinto-Schuster E, Acar JF, Collatz E. (1995) SHV-5, a novel SHV-type beta-lactamase that hydrolyzes broad-spectrum cephalosporins and monobactams. Antimicrob Agents Chemother, 33: 951−956.
63.
Hall BG, Barlow M. (2004) Evolution of the serine β-lactamases: past, present and future. Drug Resist Updat, 7: 111−123.
64.
Hawkey PM. (2008) Prevalence and clonality of extended-spectrum -lactamases in Asia. Clin Microbiol Infect, 14 (Suppl. 1): 159–165.
65.
Hawkey PM, Jones AM. (2009) The changing epidemiology of resistance. J Antimicrob Chemother, 64 (Suppl 1): i3-i10.
66.
Herson DS, McGonigle B, Payer MA, Baker KH. (1987) Attachment as a factor in the protection of Enterobacter cloacae from chlorination. Appl Environ Microbiol, 53: 1178–1180.
67.
Huang WM. (1996) Bacterial diversity based on type II DNA topoisomerase genes. Annu Rev Genet, 30: 79-107.
68.
Jacoby GA. (2009) AmpC -lactamases. Clin Microbiol Rev, 22: 161-182.
69.
Jacoby GA. (2005) Mechanisms of resistance to quinolones. Clin Infect Dis, 41: 120-126. 127
70.
Jacoby GA, Archer GL. (1991) New mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agents. N Engl J Med, 324: 601−612.
71.
Jarlier V, Nicolas MH, Fournier G, Phillippon A. (1988) Extended broadspectrum -lactamases conferring transferable resistance to newer -lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Rev Infect Dis, 10: 867-878.
72.
Ji J, Manak M. (2002) Genotyping of single nucleotide polymorphisms for epidemiological studies: A review of current methods. Journal of Clinical Ligand Assay, 25: 199-210.
73.
Jones LA,. McIver CJ, Kim MJ,. Rawlinson WD, White PA. (2005) The aadB gene cassette is associated with blaSHV genes in Klebsiella species producing extended-spectrum ß-lactamases. Antimicrobial Agents Chemother, 49: 794-797.
74.
Jutersek B, Baraniak A, Zohar-Cretnik T, Storman A, Sadowy E, Gniadkowski M. (2003) Complex endemic situation regarding extended-spectrum
-lactamase-
producing Klebsiella pneumoniae in a hospital in Slovenia. Microb Drug Resist, 9(Suppl 1): 25–33.
75.
Kado CI, Liu ST. (1981) Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol, 145: 1365–1373.
76.
Karim A, Poirel L, Nagarajan S, Nordmann P. (2001) Plasmid-mediated extended-spectrum ß-lactamase (CTX-M-3 like) from India and gene association with insertion sequence ISEcp1. FEMS Microbiol Lett, 201: 237–241.
77.
Karisik E, Ellington MJ, Pike R, Warren RE, Livermore DM, Woodford N. 2006 Molecular characterization of plasmids encoding CTX-M-15 beta-lactamases
128
from Escherichia coli strains in the United Kingdom. J Antimicrob Chemother, 58: 665-668.
78.
Kim J, Shin HS, Seol SY, Cho DT. (2002) Relationship between blaSHV-12 and blaSHV-2a in Korea, J Antimicrob Chemother, 49: 261-267.
79.
Kristóf K, Szabó D, Marsh JW, Cser V, Janik L, Rozgonyi F, Nobilis A, Nagy K, Paterson DL. (2007) Extended-spectrum -lactamase-producing Klebsiella spp. in a neonatal intensive care unit: risk factors for the infection and the dynamics of the molecular epidemiology. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 26: 563-570.
80.
Lambert PA. (2005) Bacterial resistance to antibiotics: modified target sites. Adv Drug Deliver Rev, 57: 1471-1485.
81.
Lartigue MF, Poirel L, Aubert D, Nordmann P. (2006) in vitro analysis of ISEcp1B-mediated mobilization of naturally occurring β-Lactamase gene blaCTX-M of Kluyvera ascorbata. Antimicrob Agents Chemother, 50: 1282–1286.
82.
Lartigue MF, Poirel L, Nordmann. (2004) Diversity of genetic environment of blaCTX-M genes. FEMS Microbiol Letter, 234: 201-207.
83.
Lau SH, Kaufmann ME, Livermore DM, Woodford N, Willshaw GA, Cheasty T, Stamper K, Reddy S, Cheesbrough J, Bolton FJ, Fox AJ, Upton M. (2008) UK epidemic Escherichia coli strains A-E, with CTX-M-15 -lactamase, all belong to the international O25:H4-ST131 clone. J Antimicrob Chemother, 62: 1241-1244.
84.
Lee YH, Cho B, Bae K, Chang CL, Jeong SH. (2006) Klebsiella pneumoniae strains carrying the chromosomal SHV-11 β-lactamase gene produce the plasmidmediated SHV-12 extended-spectrum β-lactamase more frequently than those
129
carrying the chromosomal SHV-1 β-lactamase gene. J Antimicrob Chemother, 57: 1259−1261.
85.
Leflon-Guibout V, Jurand C, Bonacorsi S, Espinasse F, Guelfi MC, Duportail F, Heym B, Bingen E, Nicolas-Chanoine MH. (2004) Emergence and spread of three clonally related virulent isolates of CTX-M-15-Producing Escherichia coli with variable resistance to aminoglycosides and tetracycline in a French Geriatric Hospital. Antimicrob Agents Chemother, 48: 3736-3742.
86.
Lewis 2nd JS, Herrera M, Wickes B, Patterson JE, Jorgensen JH. (2007) First report of the emergence of CTX-M-type extended-spectrum
-lactamases
(ESBLs) as the predominant ESBL isolated in a U.S. health care system. Antimicrob Agents Chemother, 51: 4015–4021.
87.
Livermore DM. (1995)
-lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin
Microbiol Rev, 8: 557-584.
88.
Livermore DM. (2008) Defining an extended-spectrum
-lactamase. Clin
Microbiol Infect, 14 (Suppl 1): 3–10.
89.
Livermore DM, Canton R, Gniadkowski M, Nordmann P, Rossolini GM, Arlet G, Ayala J, Coque TM, Kern-Zdanowicz I, Luzzaro F, Poirel L, Woodford N. (2007) CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe. J Antimicrob Chemother. 59: 165-174.
90.
Mabilat C, Courvalin P. (1990) Development of "oligotyping" for characterization and molecular epidemiology of TEM beta-lactamases in members of the family Enterobacteriaceae. Antimicrob. Agents Chemother, 34: 2210-2216.
130
91.
Macrina FL, Kopecko DJ, Jones KR, Ayers DJ, McCowen SM. (1978) A multiple plasmidcontaining Escherichia coli strain: convenient source of size reference plasmid molecules. Plasmid, 1: 417–420.
92.
Madec JY, Lazizzera C, Châtre P, Meunier D, Martin S, Lepage G, Ménard MF, Lebreton P, and Rambaud T. (2008) Prevalence of fecal carriage of acquired expanded-spectrum cephalosporin resistance in Enterobacteriaceae strains from cattle in France. J Clin Microbiol, 46: 1566-1567.
93.
Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, Morelli G, Russell JE, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant DA, Feavers IM, Achtman M, Spratt BG. (1998) Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 3140–3145.
94.
Majiduddin FK, Materon IC, Palzkill TG. (2002) Molecular analysis of betalactamase structure and function. Int J Med Microbiol. 292: 127-37.
95.
Melzer M, Petersen I. (2007) Mortality following bacteraemic infection caused by extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing E. coli compared to nonESBL producing E. coli. J. Infect, 55: 254-259.
96.
Meunier D, Jouy E, Lazizzera C, Kobisch M, Madec JY. (2006) CTX-M-1- and CTX-M-15-type beta-lactamases in clinical Escherichia coli isolates recovered from foodproducing animals in France. Int J Antimicrob Agents, 28: 402−407.
97.
Miriagou V, Filip R, Coman G, Tzouvelekis LS. (2002) Expanded-spectrum cephalosporin-resistant Salmonella strains in Romania. J Clin Microbiol, 40: 4334–4336.
131
98.
MoodleyA, Guardabassi L. (2009) Transmission of IncN plasmids carrying blaCTX-M-1 between commensal Escherichia coli in pigs and farm workers. Antimicrob Agents Chemother, 53: 1709-1711.
99.
Mulvey MR, Bryce E, Boyd D, Ofner-Agostini M, Christianson S, Simor AE. (2004) Ambler class A extended-spectrum
-lactamase-producing Escherichia
coli and Klebsiella spp. in Canadian hospitals. Antimicrob Agents Chemother, 48: 1204–1214.
100. M'Zali FH, Heritage J, Gascoyne-Binzi DM, Snelling AM, Hawkey PM. (1998) PCR single strand conformational polymorphism can be used to detect the gene encoding SHV-7 extended-spectrum beta-lactamase and to identify different SHV genes within the same strain. J Antimicrob Chemother, 41: 123-125. 101. Nagy E, Prágai Z, Koczián Z, Hajdú E, Fodor E. (1998) Investigation of the presence of different broad-spectrum beta-lactamases among clinical isolates of Enterobacteriaceae. Acta Microbiol. Immunol. Hung, 45: 433–446. 102. Naas T, Poirel L, Nordmann P. (2008) Minor extended-spectrum β-lactamases. Clin Microbiol Infect, 14: 42−52.
103. Neonakis IK, Scoulica EV, Dimitriou SK, Gikas AI, Tselentis YJ. (2003) Molecular
epidemiology of extended-spectrum
clinical isolates in a
-lactamases produced by
university hospital in Greece: detection of SHV-5 in
Pseudomonas aeruginosa and prevalence of SHV-12. Microb Drug Resist, 9: 161–165.
104. Nicolas-Chanoine MH, Blanco J, Leflon-Guibout V, Demarty R, Alonso MP, Caniça MM, Park YJ, Lavigne JP, Pitout J, Johnson JR. (2008) Intercontinental emergence of Escherichia coli clone O25:H4-ST131 producing CTX-M-15. J Antimicrob Chemother, 61: 273-281.
132
105. Nüesch-Inderbinen MT, Hächler H, Kayser FH. (1996) Detection of genes coding for extended-spectrum SHV beta-lactamases in clinical isolates by a molecular genetic method, and comparison with the Etest. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 15: 398-402. 106. Nüesch-Inderbinen MT, Kayser FH, Hächler H. (1997) Survey and molecular genetics of SHV β-lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland: two novel enzymes, SHV-11 and SHV-12. Antimicrob Agents Chemother, 41: 943−949.
107. Olesen B, Scheutz F, Menard M, Skov MN, Kolmos HJ, Kuskowski MA, Johnson JR. (2009) Three-decade epidemiological analysis of Escherichia coli O15:K52:H1. J Clin Microbiol, 47: 1857-1862.
108. Olson AB, Silverman M, Boyd DA, McGeer A, Willey BM, Pong-Porter V, Daneman N, Mulvey MR. (2005) Identification of a progenitor of the CTX-M-9 group of extend-spectrum β-lactamases from Kluyvera georgiana isolated in Guyana. Antimicrob Agents Chemother, 49: 2112−2115.
109. Orskov F, Orskov I. (1984) Serotyping of Escherichia coli. In: Bergan T. (Ed.), Meth Microbiol, 14: 43–112.
110. Orskov, F, Orskov I. (1992) Escherichia coli serotyping and disease in man and animals. Can. J. Microbiol. 38: 699–704.
111. Pallecchi L, Bartoloni A, Fiorelli C, Mantella A, Di Maggio T, Gamboa H, Gotuzzo E, Kronvall G, Paradisi F, Rossolini GM. (2007) Rapid dissemination and diversity of CTX-M extended-spectrum beta-lactamase genes in commensal Escherichia coli from healthy children from low-resource settings of Latin America. Antimicrob Agents Chemother, 51: 2720−2725.
133
112. Paterson DL, Bonomo RA. (2005) Extended-spectrum
-lactamases: a clinical
update. Clin Microbiol Rev, 18: 657-686.
113. Paterson DL, Ko WC, Von Gottberg A, Casellas JM, Mulazimoglu L, Klugman KP, Bonomo RA, Rice LB, McCormack JG, Yu VL. (2001) Outcome of cephalosporin treatment for serious infections due to apparently susceptible organisms producing extended-spectrum beta-lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory. J Clin Microbiol, 39: 2206-2212.
114. Peirano G, Pitout JDD. (2010) Molecular epidemiology of Escherichia coli producing CTX-M
-lactamases: the worldwide emergence of clone ST131
O25:H4. Int J Antimicrob Agents, 35: 316-321.
115. Perez F, Endimiani A, Hujer KM, Bonomo RA (2007) The continuing challenge of ESBLs. Curr Opin Pharmacol, 7: 459−469.
116. Perilli M, Dell‘Amico E, Segatore B, de Massis MR, Bianchi C, Luzzaro F, Rossolini GM, Toniolo A, Nicoletti G, Amicosante G. (2002) Molecular characterization of extended- spectrum β-lactamases produced by nosocomial isolates of Enterobacteriaceae from Italian Nationwide Survey. J Clin Microbiol, 40: 611–614.
117. Philippon A, Labia R, Jacoby G. (1989) Extended-spectrum
-lactamases.
Antimicrob Agents Chemother, 33: 1131-6.
118. Picard B, Garcia JS, Gouriou S, Duriez P, Brahimi N, Bingen E, Elion J, Denamur E. (1999) The link between phylogeny and virulence in Escherichia coli extraintestinal infection. Infect Immun, 67: 546–553.
119. Piddock LJV. (2006) Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistance efflux pumps in bacteria. Clin Microbial Rev, 19: 382-402.
134
120. Pitout J D, Reisbig MD, Venter EC, Church DL, Hanson ND. (2003) Modification of double-disk test for detection of enterobacteriaceae producing extended spectrum and AmpC -lactamases. J Clin Microbiol, 41: 3933–3935. 121. Podbielski A, Schönling J, Melzer B, Warnatz K. (1991a) Different promoters of SHV-2 and SHV-2a β-lactamase lead to diverse levels of cefotaxime resistance in their bacterial producers. J Gen Microbiol, 137: 1667−1675. 122. Podbielski A, Schönling J, Melzer B, Warnatz K, Leusch HG. (1991b) Molecular characterization of a new plasmid-encoded SHV-types beta-lactamase (SHV-2 variant) conferring high-level cefotaxime resistance upon Klebsiella pneumoniae. J Gen Microbiol 137: 569−578.
123. Poirel L, Gniadkowski M, Nordmann P. (2002) Biochemical analysis of the ceftazidime hydrolysing extended-spectrum β-lactamase CTX-M-15 and of its structurally related β-lactamase CTX-M-3. J Antimicrob Chemother, 50: 1031−1034.
124. Poirel L, Lartigue MF, Decousser JW, Nordmann P (2005) ISEcp1B-mediated transposition of blaCTX-M in Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother, 49: 447−450.
125. Poirel L, Naas T, Nordmann P. (2008) Genetic support of extended-spectrum lactamases. Clin Microbiol Infect, 14 (Suppl. 1): 75–81. 126. Prágai Z, Koczián Z, and Nagy E. (1998) Characterization of the extendedspectrum
-lactamases and determination of the antibiotic susceptibilities of
Klebsiella pneumoniae isolates in Hungary. J Antimicrob Chemother. 42: 401– 403.
127. Prodinger WM, Fille M, Bauernfeind A, Stemplinger I, Amann S, Pfausler B, Lass-Florl C, Dierich MP. (1996) Molecular epidemiology of Klebsiella
135
pneumoniae producing SHV-5 beta-lactamase: parallel outbreaks due to multiple plasmid transfer. J Clin Microbiol, 34: 564–568.
128. Robicsek A, Jacoby GA, Hooper DC. (2006a) The worldwide emergence of plasmid-mediated quinolone resistance. Lancet Infect Dis, 6: 629-640.
129. Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby GA, Macielag M, Abbanat D, Park CH, Bush K, Hooper DC. (2006b) Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nat Med, 12: 83-88.
130. Rodriguez MM, Power P, Radice M, Vay C, Famiglietti A, Galleni M, Ayala JA, Gutkind G. (2004) Chromosome-encoded CTX-M-3 from Kluyvera ascorbata: a possible origin of plasmid-borne CTX-M-1-derived cefotaximases. Antimicrob Agents Chemother, 48: 4895−4897.
131. Rolinson GN. (1998) Forty years of lactam research. J Antimicrob Chemother, 41, 589–603.
132. Ronaghi M. (2001) Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res,11: 3-11.
133. Saladin M, Cao VT, Lambert T, Donay JL, Herrmann JL, Ould-Hocine Z, Verdet C, Delisle F, Philippon A, Arlet G. (2002) Diversity of CTX-M beta-lactamases and their promoter regions from Enterobacteriaceae isolated in three Parisian hospitals. FEMS Microbiol Lett, 209: 161−168.
134. Schwaber MJ, Carmeli Y. (2007) Mortality and delay in effective therapy associated
with
extended-spectrum
beta-lactamase
production
in
Enterobacteriaceae bacteraemia: a systematic review and meta-analysis. J Antimicrob Chemother, 60: 913-920.
136
135. Schwaber MJ, Navon-Venezia S, Kaye KS, Ben Ami R, Schwartz D, Carmeli Y. (2006) Clinical and economic impact of bacteremia with extended- spectrum betalactamase-producing Enterobacteriaceae. Antimicrob Agents Chemother, 50: 1257-1262.
136.Seo MR, Park YS, Pai H. (2010) Characteristics of plasmid-mediated quinolone resistance genes in extended-spectrum cephalosporin-resistant isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Korea. Chemotherapy, 56: 46-53.
137. Shannon K, Fung K, Stapleton P, Anthony R, Power E, French G. (1998) A hospital outbreak of extended-spectrum
-lactamase-producing Klebsiella
pneumoniae investigated by RAPD typing and analysis of the genetics and mechanisms of resistance. J Hosp Infect, 39: 291-300.
138. Shin KS, Son BR, Hong SB, Kim J .(2008) Dipicolinic acid-based disk methods for detection of metallo-beta-lactamase-producing Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. Diagn Microbiol Infect Dis, 62:102–105
139. Song W, Moland ES, Hanson ND, Lewis JS, Jorgensen JH, Thomson KS. (2005) Failure of cefepime therapy in treatment of Klebsiella pneumoniae bacteremia. J Clin Microbiol, 43: 4891-4894.
140. Sowek JA, Singer SB, Ohringer S, Malley MF, Dougherty TJ, Gougoutas JZ, Bush K. (1991) Substitution of lysine at position 104 and 240 of TEM-1pTZ18R beta-lactamase anhances the effect of serine-164 substitution on hydrolysis or affinity for cephalosporins and the monobactam aztreonam. Biochemistry, 30: 3179−3188. 141. Spratt BG. (1983) Penicillin-binding proteins and the future of β-lactam antibiotics. J Gen Microbiol, 129: 1247−1260.
137
142. Stürenburg E, Mack D. (2003) Extended-spectrum -lactamases: implications for the clinical microbiology laboratory, therapy, and infection control. J Infect, 47: 273-295. 143. Stürenburg E, Storm N, Sobottka I, Horstkotte MA, Scherpe S, Aepfelbacher M, Muller S. (2006) Detection and genotyping of SHV beta-lactamase variants by mass spectrometry after base-specific cleavage of in vitro-generated RNA transcripts. J Clin Microbiol, 44: 909-915.
144. Swaminathan B, Barrett TJ, Hunter SB, Tauxe RV; CDC PulseNet Task Force. (2001) PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance, United States. Emerg Infect Dis, 7: 382-389. 145. Sykes RB, Matthew H. (1976) The β-lactamases of Gram negative bacteria and their role in resistance to β-lactam antibiotics. J Antimicrob Chemother, 2: 115−157. 146. Szabó D, Filelóth Z, Szentandrássy J, Némedi M, Tóth E, Jeney Cs, Kispál Gy, Rozgonyi F. (1999) Molecular epidemiology of a cluster of cases due to Klebsiella pneumoniae producing SHV-5 extended-spectrum β-lactamase in the premature intensive care unit of a Hungarian hospital. J Clin Microbiol, 37: 4167– 4169.
147. Szilágyi E, Füzi M, Damjanova I, Böröcz K, Szőnyi K, Tóth Á, Nagy K. (2010) Investigation
of
extended-spectrum
beta-lactamase-producing
Klebsiella
pneumoniae outbreaks in Hungary between 2005 and 2008. Acta Microbiol Immunol Hung, 57: 43-53.
148. Tassios PT, Gazouli M, Tzelepi E, Milch H, Kozlova N, Sidorenko S, Legakis NJ, Tzouvelekis LS. (1999) Spread of a Salmonella typhimurium clone resistant to
138
expanded-spectrum cephalosporins in three European countries. J Clin Microbiol, 37: 3774-3777.
149. Tenover FC, Arbeit RD, Goering RV, Mickelsen PA, Murray BE, Persing DH, Swaminathan B. (1995) Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 33: 2233—2239.
150. Ternak G. (2005) Antibiotics may act as growth/obesity promoters in humans as an inadvertent result of antibiotic pollution? Medical Hypothesis, 64: 14-16.
151. Tipper DJ, Strominger JL. (1965) Mechanism of action of penicillins: a proposal based on their structural similarity to acyl-D-alanyl-D-alanine. Proc Natl Acad Sci USA, 54: 1133−1141.
152. Tran JH, Jacoby GA. (2002) Mechanism of plasmid-mediated quinolone resistance. Proc Natl Acad Sci USA, 99: 5638-5642.
153. Turnidge J. (2004) Antibiotic use in animals-prejudices, perceptions and realities. J Antimicrob Chemother, 53: 26-27. 154. Vahaboglu H, Füzi M, Cetin S, Gundes S, Ujhelyi E, Coskunkan F, Tansel O. (2001) Characterization of extended-spectrum β-lactamase (TEM-52)-producing strains of Salmonella enterica serovar Typhimurium with diverse resistance phenotypes. J Clin Microbiol, 39: 791-793.
155. Vakulenko SB, Mobashery S. (2003) Versatility of aminoglycosides and prospects for their future. Clin Microbiol Rev, 16: 430–450.
156. Villegas MV, Kattan JN, Quinteros MG, Casellas JM. (2008) Prevalence of extended-spectrum
-lactamases in South America. Clin Microbiol Infect, 14
(Suppl. 1): 154–158. 139
157. Walsh C, Wright G. (2005) Introduction: antibiotic resistance. Chem Rev, 105: 391-394.
158. Weigel LM, Steward CD, Tenover FC. (1998) gyrA mutations associated with fluoroquinolone resistance in eight species of Enterobacteriacea., Antimicrob Agents Chemother October, 42: 2661-2667.
159. Woodford N. (2005) Biological counterstrike: antibiotic resistance mechanisms of Gram-positive cocci. Clin Microbiol Infect, 11 (Suppl 3): 2-21.
160. Woodford N, Ellington MJ. (2007) The emergence of antibiotic resistance by mutation. Clin Microbiol Infect, 13: 5-18.
161. Woodford N, Ward ME, Kaufmann ME, Turton J, Fagan EJ, James D, Johnson AP, Pike R, Warner M, Cheasty T, Pearson A, Harry S, Leach JB, Loughrey A, Lowes JA, Warren RE, Livermore DM. (2004) Community and hospital spread of Escherichia coli producing CTX-M extended-spectrum -lactamases in the UK. J. Antimicrob. Chemother, 54: 735-743.
162. Yagi T, Kurokawa H, Shibata N, Shibayama K, Arakawa Y. (2000) A preliminary survey of extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Japan. FEMS Microbiol Lett, 184: 53−56.
163. Yamasaki K, Komatsu M, Yamashita T, Shimakawa K, Ura T, Nishio H, Satoh K, Washidu R, Kinoshita S, Aihara M. (2003) Production of CTX-M-3 extendedspectrum β-lactamase and IMP-1 metallo β-lactamase by five Gram-negative bacilli: survey of clinical isolates from seven laboratories collected in 1998 and 2000, in the Kinki region of Japan. J Antimicrob Chemother, 51: 631−638.
140
164. Yong D, Lee K, Yum JH, Shin HB, Rossolini GM, Chong Y (2002) ImipenemEDTA disk method for differentiation of metallo-beta-lactamase-producing clinical isolates of Pseudomonas spp. and Acinetobacter spp. J Clin Microbiol, 40: 3798–3801.
165. Zong Z, Partridge SR, Thomas L, Iredell JR. (2008) Dominance of blaCTX-M within an Australian extended-spectrum Agents Chemother, 52: 4198–4202.
141
-lactamase gene pool. Antimicrob
12. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 12.1. A disszertációval kapcsolatos publikációk jegyzéke Damjanova I, Tóth Á. (2004) ESBL-termelő Klebsiella pneumoniae és Klebsiella oxytoca járvány törzsek molekuláris-epidemiológiai tipizálása. Mikrobiológiai Körlevél, 4: 3 sz. Tóth Á, Gacs M, Márialigeti K, Cech G, Füzi M. (2005) Occurence and regional distribution of SHV-type extended-spectrum
-lactamases in Hungary. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis, 24: 284-287 IF: 2,061 Tóth Á, Damjanova I. (2005) CTX-M-típusú kiterjedt-spektrumú -laktamáz (ESBL) termelő Klebsiella pneumoniae törzsek előfordulása Magyarországon. Mikrobiológiai Körlevél, 5: 2 sz. Damjanova I, Tóth Á, Pászti J, Bauerfeind A, Füzi M. (2006) Nationwide spread of clonally related CTX-M-15-producing multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae in Hungary. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 25:75-278. IF: 2,33 Glatz K, Tóth Á, Pászti J. (2007) Emergence of SHV-2a producing Enterobacter cloacae in Hungary. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 54: 151–158. Tóth Á, Nógrády N, Fekete P, Pászti J, Füzi M. (2007) Extended-spectrum -lactamase producing Salmonella enterica strains isolated from humans in Hungary, between 20002004. J Antimicrob Chemother, 59: 579-582. IF: 4,038 Damjanova I, Tóth Á, Pászti J, Jakab M, Milch H, Bauerfeind A, Füzi M. (2007) Epidemiology of SHV-type
-lactamase producing Klebsiella spp. strains from
142
outbreaks in five geographically distant Hungarian Neonatal Intensive Care Units: widespread of epidemic R-plasmids. Int J Antimicrobial Agents, 29: 665-671. IF: 2,338 Damjanova I, Tóth Á, Pászti J, Hajbel-Vékony G, Jakab M, Berta J, Milch H, Füzi M. (2008) Expansion and countrywide dissemination of ST11, ST15 and ST147 ciprofloxacin-resistant CTX-M-15-type -lactamase-producing Klebsiella pneumoniae epidemic clones in Hungary in 2005—the new ‘MRSAs’? J Antimicrob Chemother,. 62: 978-985. IF: 4,328 Hajdu Á, Böröcz K, Dandárné Csabai Cs, Bauer E, Tirczka T, Tóth Á, Damjanova I, Pászti J, Hajbel-Vékony G, Németh I. (2009) ESBL-termelő Gram-negatív baktériumok okozta nozokómiális járvány kivizsgálása koraszülött osztályon epidemiológiai és mikrobiológiai módszerekkel. Infektológia és klinikai mikrobiológia, XVI évf 1-2. szám: 20-23.
12.2. A disszertáció témájához kapcsolodó előadások jegyzéke Tóth Á, Füzi M, Gacs M, Márialigeti K. (2003) Molecular characterization of SHVtype extended-spectrum beta-lactamase genes from Hungarian nosocomial pathogens. 5th European Congress of Chemotherapy and Infection, Rhodosz, Görögország, 2003. október 17-20. (Poszter) Tóth Á, Füzi M, Gacs M, Márialigeti K. (2003) Molecular characterization of SHVtype extended-spectrum β-lactamase genes from Hungarian nosocomial pathogens. 14 th International Congress of the Hungarian Society for Microbiology, Balatonfüred, 2003. október 9-11. Tóth Á, Füzi M, Gacs M, Márialigeti K. (2003) Nozokomiális patogénekből izolált SHV-típusú kiterjedt-spektrumú β-laktamázok fenotípusos és molekuláris vizsgálata. A Magyar Infektológiai Társaság 31. Kongresszusa, Gyula, 2003. október 9-11.
143
Damjanova I, Ozsvár Zs, Tóth Á, Csanádiné I, Szikra L, Pászti J, Simon G. (2005) Epidemiology and infection control of ESBL-producing Klebsiella pneumoniae strains caused 5 outbreaks in a Hungarian neonatal intensive care unit during the years 20012004. 15th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Koppenhága, Dánia, 2005. április 2-5. (Poszter)
Tóth Á, Damjanova I. (2005) CTX-M típusú ESBL termelő Klebsiella pneumoniae törzsek előfordulása Magyarországon. OEK Bakteriológus értekezlet, Budapest, 2005. június 9. Damjanova I, Tóth Á, Hajbel-Vékony G, Pászti J, Berta J, Füzi M. (2005) Epidemiology and genetic features of CTX-M-15-producing Klebsiella pneumoniae epidemic clones in Hungary in 2005. 8th Congress of International Federation of Infection Control, Budapest, október 18-21. (Poszter) Tóth Á, Damjanova I, Gacs M, Pászti J, Füzi M (2005) Klebsiella pneumoniae harbouring
CTX-M-15
extended-spectrum
-lactamase
in
Hungary.
Clinical
Microbiology and Infection, (2005) V 11, S 2 Damjanova I, Tóth Á, Ozsvár Zs, Bauer E, Pászti J, Füzi M. (2006) Rapid dissemination of MDR CTX-M-15-producing Klebsiella pneumoniae epidemic clone in Hungary. 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nizza, Franciaország, 2006. április 1-4. Nógrády N, Tóth Á, Pászti J, Füzi M. (2006). Characterization of ESBL-producing Salmonellae isolated in Hungary in 2000 – 2004. 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Nizza, Franciaország, 2006. április 1-4. (Poszter) Damjanova I, Tóth Á, Pászti J, Füzi M. (2006) Epidémiás és endémiás ESBL-termelő Klebsiella pneumoniae klónok jellemzése molekuláris tipizálási módszerekkel. Infekciókontroll Egyesület, Gyula, 2006. június 6-9.
144
Damjanova I, Tóth Á, Ozsvár Zs, Bauer E, Pászti J, Füzi M. (2006) Multirezisztens CTX-M-15-termelő
Klebsiella
pneumoniae
epidémiás
klón
gyors
terjedése
Magyarországon. Magyar Mikrobiológiai Társaság Nagygyűlése, Keszthely, 2006. október 18-20. Damjanova I, Tóth Á, Hajbel-Vékony G, Pászti J, Berta J, Füzi M.(2007) Epidemiology and genetic features of CTX-M-15-producing Klebsiella pneumoniae epidemic clones in Hungary in 2005. 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. München, Németország, 2007. március 31.-április 4. Damjanova I, Tóth Á, Hajbel-Vékony G, Berta J, Pászti J, Füzi M. (2007) A 2005-ben izolált CTX-M-15 β-laktamáz-termelő Klebsiella pneumoniae epidemiás klónok genetikai
tulajdonságai.
Epidemiológusok
szakmai
továbbképző
értekezlete,
Balatonboglár, 2007. május 16-17. Tóth Á, Damjanova I, Pászti J, Füzi M. (2007) ESBL-termelő Klebsiella pneumoniae epidémiás klónok genetikai sajátosságainak vizsgálata. Országos Epidemiológiai Központ,
Bakteriológiai,
mikológiai,
parazitológiai
és
tipizáló
főosztályának
tudományos ülése, 2007. november 5. Hajdu Á, Dandárné Cs Cs, Bauer E Tirczka T, Tóth Á, Ivelina D, Pászti J, HajbelVékony G, Németh I, Böröcz K. (2008) Kiterjedt-spektrumú
-laktamáz (ESBL)
termelő Gram-negatív baktériumok okozta nozokómiális járvány kivizsgálása koraszülött osztályon epidemiológiai és mikrobiológiai módszerekkel. Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság 36. Kongresszusa, Székesfehérvár, 2008. október 911.
Damjanova I, Tirczka T, Tóth Á, Hajdu Á, Dandárné Cs Cs, Bauer E, Pászti J, HajbelVékony G, Németh I, Böröcz K. (2009) Kitejedt-spektrumú -laktamáz termelő (ESBL) baktériumok molekuláris tipizálása – egy járvány tanulságai Magyar Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság Tudományos Ülése, Budapest, 2009. március 12.
145
Tóth Á, Damjanova I, Juhászné Kaszanyitzky É, Mag T, Hajbel-Vékony G, Füzi M. (2009) 2006-2007-ben humán és állati mintákból izolált kiterjedt-spektrumú
-
laktamázt termelő Escherichia coli törzsek molekuláris epidemiológiai jellemzése. Szent-Iványi - Binder Napok és Rudnai-Kemenes Tudományos Ülés, Tiszafüred 2009. október 14-16.
Damjanova I, Tóth Á, Mag T, Tóth Sz, Hajbel-Vékony G, Pászti J, Füzi M. (2010) Molecular epidemiology and genetic background of extended-spectrum lactamase producing Escherichia coli isolated from human clinical samples in Hungary, 20062007. 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Bécs, Ausztria, 2010. április 10-13. (Poszter)
12.3. A disszertáció témájához nem kapcsolodó publikációk jegyzéke Tóth Á, Füzi M. (2003) A Klebsiella oxytoca törzsek K1 /OXY/ tipusú beta-laktamáz termelése. Mikrobiológiai Körlevél, 3: 2 sz. Füzi M, Tóth Á. (2003) Az entrobacterek és klebsiellák természetes -laktám rezisztenciája. Mikrobiológiai Körlevél, 3: 2.
Tóth Á. (2004) A 2003. évi OEK bakteriológiai surveillance adatok elemzése. E. coli és Klebsiella spp. Mikrobiológiai Körlevél, 4: 3.
Tóth Á. (2004) Néhány újabb szempont az ESBL termelés vizsgálatához. Mikrobiológiai Körlevél, 4: 1 sz.
Gacs M, Tóth Á, Tirczka T, Végh Zs. (2005) Az OEK Bakteriológiai Surveillance 2004. első félévi adatainak elemzése: methicillin rezisztens Staphylococcus aureus. Mikrobiológiai Körlevél, 5: 1 sz
146
Tóth Á, Gacs M. (2005) A makrolid rezisztens Staphylococcus aureus clindamycin rezisztenciája. Mikrobiológiai Körlevél, 5: 1 sz. Nógrády N, Gadó I, Tóth Á, Pászti J. (2005) Antibiotic resistance and class 1 integron patterns of non-typhoidal human Salmonella serotypes isolated in Hungary in 2002 and 2003. Int J Antimicrobial Agents, 26: 126-132. IF: 2,428 Tóth Á, Ungvári E, Gacs M. (2006) Magyarországon izolált közösségben szerzett CAMRSA gyanús izolátumok mikrobiológiai sajátosságai. Mikrobiológiai Körlevél, 6: 1 sz. Tóth Á, Gacs M: (2006) Új terápiás lehetőségek az MRSA-val vívott harcban: Láthatáron egy új széles spektrumú béta-laktám antibiotikum. Mikrobiológiai Körlevél, 6: 3 sz. Tóth Á, Gacs M, Végh Zs. (2006) Klebsiella pneumoniae és Escherichia coli izolátumok antibiotikum érzékenysége az OEK Antibiotikum Rezisztencia Surveillance 2005. évi adatai alapján. Mikrobiológiai Körlevél, 6: 4 sz. Kispál Gy, Tóth Á, Szeberin Z, Violka M, Gacs M, Füzi M. (2007) Fatális kimenetelű szepszist okozó, vancomycinnel szemben mérsékelt szintű heterorezisztenciát mutató Staphylococcus aureus (h-VISA) első izolálása Magyarországon. Mikrobiológiai Körlevél, 7: 4 sz.
Nógrády N, Tóth Á, Kostyák A, Pászti J, Nagy B. (2007) Emergence of multidrugresistant clones of Salmonella Infantis in broiler chickens and humans in Hungary. J Antimicrob Chemoth. 60: 645-648. IF: 4,038 Conceicao T, Aires-de-Sousa M, Füzi M, Tóth Á, Pászti J, Ungvári E, van Leeuwen W, van Belkum A, Grundmann H, de Lencastre H. (2007) Replacement of methicillinresistant Staphylococcus aureus clones in Hungary over time: ten years surveillance study. Clin Microbiol Infect, 13: 971-979. IF: 2,98 147
Gacs M, Tóth Á. (2008) A Staphylococcus aureus vancomycinnel szembeni rezisztenciája. Epinfo, 15: 177-180. Tóth Á, Gacs M, Ungvári E. (2008) Multirezisztens, területen szerzett MRSA (CAMRSA) törzsek gyakoribb előfordulása napjainkban. Epinfo, 15: 153-160. Ungvári E, Tóth Á, Gacs M. (2008) Újabb PVL-pozítív MRSA klónok megjelenése hazánkban. Mikrobiológiai Körlevél, 7: 12-17. Borbás K, Tóth Á, Tóth Sz, Szabó Zs, Herpay M. (2008) ESBL-termelő Shigella sonnei izolálásának és további vizsgálatának tapasztalatai. Mikrobiológiai Körlevél, 8: 3. sz. Tóth Á. (2008) Új szelektív és differenciáló táptalaj az ESBL-termelő Gram-negatív kórokozók szűréséhez. Mikrobiológiai Körlevél, 8: 3. sz. Tóth Á, Kispál Gy, Ungvári E, Violka M, Szeberin Z, Pászti J, Molnár K, Gacs M, Füzi M. (2008) First report of heterogeneously vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (hVISA) causing fatal infection in Hungary. J Chemother, 20: 655-656. IF: 0,843
Kis Z, Treso B, Burian K, Endresz V, Pallinger E, Nagy A, Toth A, Takacs M, Falus A, Gonczol E. (2008) Expresion of bacterial genes and induction of INF- in human myeloid dendritic cells during persistent infection with Chlamydophila pneumoniae. FEMS Immun Medical Microbiol, 52: 324-334. IF: 1,972
Szilágyi E, Füzi M, Böröcz K, Kurcz A, Tóth Á, Nagy K. (2009) Risk factors and outcomes for bloodstream infections with extended-spectrum
-lactamase-producing
Klebsiella pneumoniae; findings of the nosocomial surveillance system in Hungary Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica, 56: 251–262.
148
Tóth Á. (2009) A karbapenem rezisztens Klebsiella pneumoniae: Irodalmi összefoglalás és az első hazai izolálások eredményei. Mikrobiológiai Körlevél, 9: 1. sz. Tóth Á, Gacs M (2009). Az MRSA Referens Laboratórium ajánlása: A methicillin rezisztens
Staphylococcus
aureus
glikopeptid
érzékenységének
vizsgálata.
Mikrobiológiai Körlevél, 9: 1. sz Tóth Á, Damjanova I, Puskás E, Jánvári L, Farkas M, Dobák A, Böröcz K, Pászti J. (2009) KPC-2 karbapenemáz termelő Klebsiella pneumoniae ST258 klón megjelenése Magyaroszágon. Mikrobiológiai Körlevél, 9: 3. sz. Tóth Á, Gacs M, Füzi M, Végh Zs. (2009) A Nemzeti Bakteriológiai Surveillance 2007. évi eredményei. Epinfo 16: 2. különszám: 37-55.
Tóth Á, Gacs M, Végh Zs (2009): A Nemzeti Bakteriológiai Surveillance 2008. évi eredményei, Epinfo 16: 4 különszám: 35-55. Damjanova I, Tóth Á, Hajbel-Vékony G, Tirczka T, Pászti J, Füzi M. (2009) ESBLtermelő Klebsiella pneumoniae Nemzeti PFGE adatbázis. Infektológia és klinikai mikrobiológia, 16: 1-2. szám: 24-28.
Tóth Á, Damjanova I, Puskás E, Jánvári L, Farkas M, Dobák A, Böröcz K, Pászti J. (2010) Emergence of a colistin-resistant KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae ST258 clone in Hungary. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 29: 765–767. IF (2009): 2,605 Kristóf K, Tóth Á, Damjanova I, Jánvári L, Konkoly-Thege M, Kocsis B, Koncan R, Cornaglia G, Szegő E, Nagy K, Szabó D. (2010) Identification of a blaVIM-4 gene in the internationally successful Klebsiella pneumoniae ST11 clone and in a Klebsiella oxytoca strain in Hungary. J Antimicrob Chemother. 65:1303-1305. IF (2009): 4,352
149
Szilágyi E, Füzi M, Damjanova I, Böröcz K, Szőnyi K, Tóth Á, Nagy K. (2010) Investigation of extended-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae outbreaks in Hungary between 2005 and 2008. Acta Microbiol Immunol Hung, 57: 4353.
12.4. A disszertáció témájához nem kapcsolodó előadások jegyzéke Füzi M,. Libisch B, Tóth Á. (2003) Genetic characterization of ESBL and metallo-βlactamase producing Gram-negatív nosocomial pathogens. Bilateral Hungarian-German Workshop on Genom Research on Microorganisms Ministry of Education. Budapest, 2003. november 18-19. Gacs M, Tóth Á, Libisch B. (2005) Az antibiotikumokkal szembeni rezisztencia változásai és újabb rezisztencia mechanizmusok megjelenése Magyarországon az utóbbi években. Magyar Infekciókontroll Egyesület IX. Országos Konferenciája, Lillafüred, 2005. június 2-4. Tóth Á. (2005) Demonstration of the MRSA GenoType®. Frank Diagnosztika szimpózium, Budapest, 2005. február 11. Tóth Á, Ungvári E, Gacs M. (2005) A Nemzeti MRSA Referencia Laboratórium újabban végzett vizsgálatairól. OEK Bakteriológus Konferencia, Budapest, 2005. március 8.
Ungvári E, Tóth Á, Hetzmann I, Vargáné Hunyadi Zs, Pászti J, Füzi M. (2005) Nozokómiális és közösségben szerzett methicillin rezisztens Staphylococcus aureus (MRSA) törzsek molekuláris tipizálási eredményeinek összegzése 2002. és 2005. között. OEK Bakteriológus Konferencia, Budapest, 2005. november 10.
Ungvári E, Tóth Á, Böröcz K, Gacs M, Pászti J, Füzi M. (2005) A magyarországi közösségben-szerzett (CA) MRSA törzsek mikrobiológiai sajátosságai. XI. Országos Antibiotikum Konferencia, Eger, 2005. november 17-19. 150
Tóth Á, Ungvári E, Gacs M, Pászti J, Füzi M. (2005) Emergence of communityacquired MRSA in Hungary. 15th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Koppenhága, Dánia, 2005. április 2-5. (Poszter)
Conceicao T, Aires de Sousa M, Füzi M, Tóth Á, Pászti J, Ungvári E, Grundmann H, de Lencastre H. (2005) Update of the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) clones in Hungary: 2001-2004. Micro ’05-Biotech’05 Congress, Lisszabon, Portugália, 2005. november 30.- december 1. (Poszter) Conceicao T, Aires de Sousa M, Füzi M, Tóth Á, Paszti J, van Leeuwen W, van Belkum A, Grundmann H, de Lencastre H. (2006) Massive spread of the New York/Japan MRSA clone (ST5-SCCmec II) in a European country. 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nizza, Franciaország, 2006. április 1-4. Tóth Á, Ungvári E, Pászti J, Gacs M. (2006) Hazai CA-MRSA törzsek genetikai jellemzése. OEK Bakteriológus Konferencia, Budapest, 2006. április 20. Tóth Á, Ungvári E, Gacs M, Violka M, Pászti J, Füzi M. (2006) 2005-ben hemokultúrából izolált methicillin rezisztens Staphylococcus aureus törzsek jellemzése. XII. Országos Antibiotikum Konferencia, Siófok, 2006. november 17-19. Tóth Á, Ungvári E, Gacs M, Violka M, Pászti J, Füzi M (2006) 2005-ben hemokultúrából izolált methicillin rezisztens Staphylococcus aureus törzsek jellemzése. OEK Bakteriológus Konferencia, Budapest, 2006. november 30. Tóth Á. (2007) Staphylococcus aureus virulencia faktorainak genetikája. Magyar Kemoterápiás Társaság Tudományos Ülése, Budapest, 2007. január 18. Tóth Á. (2007) MRK helyzetkép az OEK mikrobiológiai surveillance alapján. Az OEK Kórházi járványügyi osztályának I. munkaértekezlete, Budapest, 2007. február 13. 151
Tóth Á, Mag T (2007) A Bacillus anthracis molekuláris biológiai laboratóriumi diagnosztikája. Bioterrorizmus-Veszélyes kórokozó baktériumok, Budapest, 2007. október 10-11. Mag T, Tóth Á. (2007) A pestis, a brucellózis, a tularémia és a malleus molekuláris biológiai diagnosztikája. Bioterrorizmus-Veszélyes kórokozó baktériumok, Budapest, 2007. október 10-11. Ungvári E, Tóth Á, Hajbel-Vékony G, Pászti J, Füzi M. (2008) Nosocomialis és területen szerzett MRSA törzsek molekuláris epidemilógiai vizsgálati eredményeinek összegzése (2001 – 2008). Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság 36. Kongresszusa, Székesfehérvár, 2008. október 9-11. (poszter) Tirczka T, Tóth Á, Damjanova I, Szilágyi E, Korom J, Bukovszki. F. (2007).Investigation of outbreaks caused by extended-spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Gramnegative pathogens (GNP) at a large hospital in Budapest. 8th Congress of International Federation of Infection Control, Budapest, 2007. október 18-21. (Poszter) Tóth Á, Szabó J, Damjanova I, Kardos G, Dombrádi Zs, Füzi M, Orosi P. (2007) High prevalence of SHV-5-producing Serratia marcescens strains in a neonatal intensive care unit during one year period. 8th Congress of International Federation of Infection Control, Budapest, 2007. október 18-21. (Poszter) Tóth Á, Ungvári E, Gacs M, Pászti J, Füzi M, (2008) Panton-Valentine Leukocidin toxin gén hordozás előfordulása hazai CA-MRSA gyanús törzsek között 2006-2008-ban. Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság 36. Kongresszusa, Székesfehérvár, 2008. október 9-11. (poszter)
Tóth Á, Végh Zs. (2009) Trends in antibiotic resistance in Hungary. ECDC látogatás, Budapest, 2009. október 27.
152
Gacs M, Tóth Á, Tirczka T (2009) Az OEK által szervezett körvizsgálatok klinikai bakteriológiai témáinak összefüggései a Mikrobiológiai Körlevelekben megjelent írásokkal.
Az
Országos
Epidemiológiai
Központ,
Bakteriológiai,
mikológiai,
parazitológiai, tipizáló Főosztály 2009. II. félévi tudományos ülése, 2009. november 03. Damjanova I, Tóth Á, Kenesei É, Kőhalmi M, Kocsis S, Szántai P, Füzi M, Pászti J (2009) ESBL-termelő Klebsiella pneumoniae epidémiás klón IV megjelenése több kórház felnőtt és csecsemő osztályán. Az Országos Epidemiológiai Központ, Bakteriológiai, mikológiai, parazitológiai, tipizáló Főosztály 2009. II. félévi tudományos ülése, 2009. november 03. Tóth Á (2009) Hazai AMR helyzet a Nemzeti Bakteriológiai Surveillance eredményei alapján. Második Európai Antibiotikum Nap, Budapest, 2009. november 18. Rákóczi É, Tóth Á, Dombrádi Zs, Kárpáti I, Mátyus J, Veress K, Zeher M, Maródi L, Orosi P, Szabó J. (2009) Vancomycinre mérsékelt szinten heterorezisztens Staphylococcus aureus esetek megjelenése. Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság 37. Kongresszusa, Szeged, 2009. október 1-3. Dombrádi Zs, Tóth Á, Ungvári E, Rákóczi É, Kárpáti I, Mátyus J, Veres K, Zeher M, Orosi P, Maródi L, Szabó J (2009) Fatal sepsis caused by heterogeneously vancomycinintermediate sensitive Staphylococcus aureus (HVISA) strains in two Hungarian patients. 2nd Central European Forum for Microbiology CEFORM, Keszthely, 2009. október 7-9. Tóth Á, Damjanova I, Farkas M, Dobák A, Puskás E (2009) Karbapenem rezisztens, KPC-termelő
Klebsiella
pneumoniae
megjelenése
Magyarországon.
Magyar
Infekciókontroll Egyesület XIII.Kongresszusa, Székesfehérvár, 2009. június 4-6.
153
Ungvári E, Tóth Á, Gacs M, Pászti J. (2009) Az angol epidémiás (EMRSA) 15 klón megjelenése és elterjedése Magyarországon. Magyar Infekciókontroll Egyesület XIII.Kongresszusa, Székesfehérvár, 2009. június 4-6. Tóth Á, Damjanova I, Kenesei É, Kőhalmi M, Kocsis S, Szántai P, Füzi M, Pászti J. (2009) Dissemination of ST274 Klebsiella pneumoniae epidemic clone adapted to the newborn and adult hospital settings by producing SHV-2a or CTX-M-15 type extended spectrum beta-lactamases. 19th European Congress of Clinical Microbiolgy and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finnország, 2009. május 16-19. Ungvári E, Tóth Á, Hajbel-Vékony G, Gacs M, Pászti J (2009) Characterization of nosocomial and community-acquired MRSA isolates in Hungary 2001-2008. 1st Congress of the Romanian Association of Medical Laboratories, Marosvásárhely, Románia, 2009. június 24–27.
Ungvári E, Tóth Á. (2009) Tipizáló módszerek alkalmazása methicillin rezisztens S. aureus (MRSA) molekuláris epidemiológiai vizsgálatai során. Magyar Infektológiai és Klinikai Mikrobiológiai Társaság Tudományos Ülése, Budapest, 2009. március 12.
Ungvári E, Tóth Á, Pékné Széles K, Szűcs M, Tombácz Zs. (2009) A zoonotikus MRSA Magyarországon. Szent-Iványi
-
Binder Napok és
Tudományos Ülés, Tiszafüred 2009. október 14-16.
154
Rudnai-Kemenes
13. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Füzi Miklósnak, hogy munkámat támogatta és mindvégig tanácsokkal látott el. Köszönöm dr. Damjanova Ivelinának, hogy együtt dolgozhattunk, és sikeres csapatot alkothattunk az elmúlt években, és hogy mindig számíthattam rá a közös munkánkban. Köszönöm Dr Gacs Máriának, hogy észrevételeivel, tapasztalatával és tanácsaival segítette munkámat. Köszönöm az Országos Epidemiológiai Központnak, hogy biztosította a feltételeket a laboratóriumi munkákhoz, és támogatta tanulmányaimat. Köszönöm az Országos Epidemiológiai Központ Bakteriológiai I. osztály minden dolgozójának, és különösen Topfné Juliának és Torma Andreának, akik asszisztensként segítették munkámat. Nélkülük nem készülhetett volna el ez a dolgozat. Köszönöm Pászti Juditnak, hogy mindig támogatta munkámat, és az együttműködést a Bakteriológiai és a Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztály között. Köszönöm az Országos Epidemiológiai Központ Bakteriológiai II. és a Fágtipizálási és Molekuláris Epidemiológiai Osztály minden munkatársának a munkámhoz nyújtott segítséget, és különösen Ungvári Erikának és dr Nógrády Noéminek, hogy mindig számíthattam rájuk. Köszönöm a hazai klinikai mikrobiológiai laboratóriumokban dolgozó kollégáknak a törzsküldésben való részvételt, hiszen nélkülük nem sikerült volna a hazai ESBL-helyzet nyomonkövetése, és emellett ez a dolgozat sem születhetett volna meg. Köszönöm Laczik Cecíliának az empátiát és kedvességet, amivel az adminisztratív problémákat segített legyőzni. Hálával tartozom szüleimnek, és az egész családomnak, hogy kitartottak mellettem és támogattak végig a tanulmányaim és a munkám során. És végül, de nem utolsó sorban köszönöm páromnak, hogy a legnehezebb helyzetekben is kitartott mellettem, és végigkísért szeretetével ezen az úton.
155
