KITA Indonesia (Kedelai Inovasi Terbaru Anak Indonesia) : sebagai Solusi Pemenuhan Swasembada Pangan

Konferensi Ilmuwan Muda Indonesia (KIMI MUN ke-5) 22-24 Maret 2016,Depok, Indonesia

KITA Indonesia (Kedelai Inovasi Terbaru Anak Indonesia) : sebagai Solusi Pemenuhan Swasembada Pangan Larasati Amaranggana*, Nurani Istiqamah, dan Rina S. Chen Fakultas Farmasi dan FMIPA, Universitas Padjadjaran E-mail : [email protected] Abstrak Dalam 5 tahun terakhir, sekitar 3,9 % peningkatan perekonomian nasional berasal dari kontribusi sektor pertanian. Secara bertahap, pemerintah menargetkan pembangunan sektor pertanian untuk mewujudkan kedaulatan pangan dengan cara swasembada. Kedelai merupakan salah satu komoditas yang diunggulkan. Sasaran pencapaian produksi kedelai di Indonesia untuk tahun 2019 sebesar 2.920.000 ton. Ironisnya, tingginya kebutuhan kedelai di Indonesia belum diimbangi dengan produksi kedelai yang mencukupi. Dampaknya, Indonesia terpaksa mengimpor kedelai padahal Indonesia disebut dengan “Negeri Tempe”. Hal ini dibuktikan dengan angka perkiraan produksi kedelai tahun 2015 yang hanya sekitar 982.967 ton. Diperlukan sebuah gagasan yang dapat membantu mewujudkan swasembada pangan. Metode yang digunakan adalah teknik transformasi menggunakan Agrobacterium tumefaciens yang meliputi empat tahap, yaitu konstruksi plasmid GmNAC20, konfirmasi plasmid, Inokulasi Agrobacterium tumefaciens dalam kedelai dan Analisis molekular dengan menggunakan PCR. Gen yang dikonstruksikan ke dalam plasmid A. tumefaciens adalah gen GmNAC20 dari tanaman kedelai kultivar NanNong1138-2 yang sudah diberi perlakuan stres dan gen SPS (Sucrose Phosphat Synthase) dari tanaman tebu. Dari gagasan tertulis ini, diharapkan dapat membantu pemerintah untuk mencapai target swasembada pangan, khususnya kedelai yang memiliki produktifitas tinggi yang tahan terhadap stres abiotik serta memiliki laju pertumbuhan dan perkembangan yang baik. Kata Kunci : Kedelai unggul, A. tumefaciens, GmNAC20, SPS.

PENDAHULUAN Kedelai merupakan salah satu komoditas yang diunggulkan dan merupakan salah satu sumber protein penting yang dibutuhkan manusia [1]. Tidak hanya tingginya kandungan protein, kedelai juga mengandung lemak, karbohidrat, dan vitamin seperti karoten, nikotenik, ribiflavin, B kompleks, mineral, serta asam amino [2]. Satu gram asam amino kedelai mengandung 340mgr Isoleusin, 480 mgr Leusin. 400 mgr Lisin, 310 mgr Fenilalanin. 200 mgr Tirosin, dan 330 mgr Valin. Oleh karena itu, kedelai disebut sebagai “Gold from the soil” dan “The world’s miracle” [3]. Kebutuhan kedelai di dalam negeri sangat besar. Hal ini disebabkan karena kedelai digunakan sebagai bahan baku berbagai industri seperti tahu, tempe, tauco, susu, kecap, serta pakan ternak. Namun, jumlah produksi kedelai dalam negeri masih belum mencukupi. Sehingga setiap tahunnya angka impor kedelai semakin

tinggi [4]. Padahal, Indonesia disebut dengan “Negeri Tempe” [5]. Pada tahun 2015, angka perkiraan produksi kedelai di Indonesia sebesar 982.967 ton [6]. Oleh karena itu, dipilihlah judul Kedelai Inovasi Terbaru Anak Indonesia ini dengan harapan dapat meningkatkan produksi kedelai lokal yang lebih unggul dibandingkan dengan kedelai impor. Kami memberikan gagasan inovasi kedelai dengan metode teknik rekayasa genetika. Metode yang dilakukan adalah dengan melakukan overekspresi gen GmNAC20 yang umumnya terdapat pada kedelai dan insersi gen SoSPS yang berasal dari tebu. Ekspresi gen tanaman banyak diubah oleh lingkungan abiotik. Ekspresi merupakan gambaran dari metabolisme sel dan toleransi terhadap stres abiotik [7]. Over-ekspresi merupakan suatu efek yang dihasilkan oleh peningkatan faktor, contohnya faktor transkripsi pada gen tanaman [8]. Over-ekspresi gen


GmNAC20 dalam penelitian sebelumnya dinyatakan mampu meningkatkan toleransi terhadap stres abiotik seperti tingginya kadar garam, kekeringan, dan suhu dingin pada tanaman transgenik Arabidopsis [9]. Berbeda dengan gen GmNAC20, over-ekspresi gen SoSPS dapat meningkatkan aktivitas enzim SPS dan kandungan sukrosa pada tebu [10]. Enzim SPS adalah enzim yang berperan penting dalam mengkatalis sukrosa dan meningkatkan laju fotosintesis sehingga menunjang pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Oleh karena itu, enzim ini disebut sebagai enzim kunci dalam mensintesis sukrosa [11]. Gen SoSPS ini diinsersikan ke dalam A. tumefaciens untuk membantu mentransfer gen unggul ke dalam sel tanaman [12]. Tujuan dari penulisan ini adalah untuk menyelesaikan permasalahan Indonesia dalam menangani swasembada pangan. Adapun manfaat dari penulisan adalah sebagai informasi kepada para peneliti Indonesia untuk menciptakan bibit kedelai unggul. Konstruksi Plasmid GmNAC20 Fragmen yang mengkode protein gen GmNAC20 diamplifikasi dari DNA genom kedelai kultivar NanNong1138-2 yang sudah diberi perlakuan stres. Oligonukleotida GmNAC20 F (5’TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACAAC TCC-3’) dan GmNAC20 R (5’- GCGTGGAAT TCTCAGAAGGGCCTGGAGAGGTAC-3’) digunakan untuk amplifikasi fragmen gen yang mengandung sekuen pengkode protein gen GmNAC20. Pasangan oligonukleatida tersebut memasukkan situs BamHI dan EcoR1 pada ujung 5’ dan 3’ dari fragmen amplifikasi yang digunakan untuk keperluan ligasi. Fragmen diintroduksi ke vektor pGEM-T easy berdasarkan prosedur dari perusahaan (Promega) dan selanjutnya dipotong dengan BamHI dan EcoR1. Konstruk overekspresi dirakit melalui ligasi multipoin berdasarkan prosedur dari perusahaan BIORAD (no. Katalog 165-2100) menggunakan Micro Pulser dengan sistem kejutan listrik (elektroporasi), dimana masing-masing fragmen (promotor, gen GmNAC20, gen SoSPS, terminator) dengan ujung kohesif yang kompatibel diligasikan bersama-sama ke vektor biner dalam satu reaksi. Konstruk dibuat dalam vektor plasmid pKYS yang telah terdapat gen SoSPS1[13].

Konfirmasi Plasmid Transformasi genetik menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 dengan konstruk plasmid pKYS-SoSPS1. Kultur Agrobacterium tumefaciens dikonfirmasi keberadaan gen target sebelum melakukan tahapan transformasi. Kultur Agrobacterium dilakukan dengan mengambil 100 μl Agrobacterium tumefaciens LBA4404 pKYSSoSPS1 dari gliserol stok dan ditumbuhkan pada 2 ml media YEP cair yang mengandung antibiotik rifamycin 50 mgL-1, kanamisin 50 mgL-1, dan Streptomicyin 30 mgL-1, kemudian diinkubasi pada shaker dengan suhu 28⁰C pada putaran 150 rpm. Sel disuspensi minimal dengan OD650 = 0,2 dan dibiarkan tumbuh selama 12-14 jam. Sel dipanen dan disuspensikan dalam medium inokulasi cair. Kepadatan populasi sel disesuaikan sehingga OD650 berkisar antara 0,6 - 0,8. Biakan yang telah tumbuh sebagian di tumbuhkan pada media YEP padat selektif dan sebagian digunakan untuk isolasi DNA plasmid. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menggunakan metode Sambrook [11]. DNA hasil isolasi digunakan sebagai cetakan DNA dalam analisis PCR (Polymerase Chain Reaction). Analisis PCR untuk konfirmasi keberadaan konstruk pKYS-SoSPS1 ini menggunakan 2 macam pasangan primer (forward dan reverse) yaitu primer SPS dan NAC20. Primer SPS digunakan untuk konfirmasi gen SoSPS1 dan NAC20 untuk konfirmasi gen penyeleksi GmNAC20. Primer SPS dengan sekuen primer F(5’TTTCGGATCCATGGCCGCAGCAACACA ACTCC-3’) sedangkan primer GmNAC20 dengan sekuen primer forward (PF) (5’-TGA ATG AAC TGC AGG ACG AG-3’) dan reverse (PR) (5’GCGTGGAATTCTCAGAAGGGCCTGGAGAG GTAC -3’). Program yang digunakan meliputi beberapa segmen seperti pre-denaturation 95oC 4 menit, denaturation 95oC 30 detik, annealing 58oC 30 detik, elongation 72oC 2 menit, final elongation 72oC 7 menit, Selanjutnya hasil PCR di elektroforesis dengan menggunakan 1% gel agarose Hasil elektroforesis kemudian divisualisasikan dengan Gel Imaging System untuk dilihat keberadaan pita DNA target dan didokumentasikan.


Inokulasi A. tumefaciens ke dalam Glycine max

Analisis Molekuler dengan Teknik PCR

Semua media mengandung garam-garam dan vitamin-vitamin N6, 1 mg/L 2,4-D, 25 mM prolin, 2% sukrosa, 100 mg/L asam amino. Modifikasi dilakukan sebagai berikut: medium inokulasi dan kokultivasi mengandung setengah konsentrasi dari garam-garam dan vitamin-vitamin yang dilengkapi dengan 1% glukosa, 20 mM MES, dan 200 μM asetosiringon, dengan pH 5,4; medium tunda mengandung 1,7 mg/L AgN03, 50 mg/L

Analisis blot Southern dilakukan terhadap 10 tanaman transgenik putatif R0 dari 5 transforman

carbenicillin, and 3 mM MES (pH 5.8); Medium seleksi meliputi medium tunda yang dilengkapi dengan 100 mg/l paramomisin. Penambahan 2,4D pada medium tunda dan medium seleksi ditujukan untuk menginduksi kalus embrionik tipe II [15]. Kalus embrionik yang tumbuh pada medium seleksi selama 4 x 14 hari dikatagorikan kalus transgenik putatif. Untuk mendapatkan plantlet transgenik, kalus transgenik dikulturkan pada medium regenerasi untuk maturasi embrio dan pengecambahan. Medium pengecambahan merupakan medium MS tanpa zat pengatur tumbuh. Eksplan embrio muda yang diisolasi dari kacang dikumpulkan dalam cawan petri berisi medium inokulasi cair. Medium inokulasi tersebut kemudian diisap dengan pipet untuk dibuang dan diganti dengan suspensi Agrobacterium. Eksplan direndam dalam suspensi Agrobacterium selama 5 menit yang selanjutnya suspensi dibuang dengan cara diisap menggunakan pipet. Eksplan selanjutnya dikulturkan pada medium ko-kultivasi padat, dengan cara menghadapkan sisi skutelar ke bawah bersentuhan dengan permukaan medium, 25 eksplan per cawan petri. Ko-kultivasi dilakukan dengan cara mengikubasi kultur dalam inkubator 24oC gelap selama 1-2 hari. Kondisi suhu dan cahaya dalam inkubator untuk kokultivasi juga berlaku untuk kultur dalam medium tunda dan medium seleksi. Eksplan kemudian dikulturkan pada medium tunda selama 7-14 hari, dan pada medium seleksi selama 4 x 14 hari. Koleoptil yang memanjang dipotong pada 4-5 HSI. Jaringan mati dibuang pada waktu dilakukan transfer antar-medium atau sub-kultur. Kalus embrionik yang tumbuh pada medium seleksi 4 x 14 hari dipindahkan ke medium regenerasi untuk maturasi dan pengecambahan. Planlet diaklimatisasi dan ditanam di rumah kaca.

yang independen hasil Percobaan IV yang diinokulasi dengan Agrobacterium. DNA genomik total diekstrak dari 1,0-1,5 gram daun muda menggunakan prosedur Dellaporta. DNA (10 μg) didigesti dengan enzim restriksi SstI yang memotong satu tempat di dalam dua batas T-DNA pada ujung 3’ GUS. Hibridisasi menggunakan pelacak (probe) GUS dari plasmid pPTN286 yang dipotong dengan emzim BglII dan ScaI. Pelacak radioaktif diperoleh melalui prosedur random primed synthesis untuk menginkorporasikan 32

dCTP yang mengandung P radioaktif. Hibridisasi dilakukan dalam inkubator bersuhu 65o C dalam larutan 0.5 M Na HPO , pH 7.2, 7% 2

4

(w/v) SDS selama 14 jam. Filter dicuci dua kali dalam larutan 40 mM Na2HPO4, 5% (w/v) SDS, pH 7.2 pada suhu 65o C selama 15 menit. Pencucian ketiga dilakukan dalam larutan 40 mM Na HPO , pH 7.2, 1% (w/v) SDS pada suhu 65o C 2

4

selama 15 menit. Signal radioaktif dari pita DNA pada filter dideteksi dengan cara menginkubasi dengan film sinar X [15]. PEMBAHASAN Analisis terhadap tanaman kedelai transgenik putatif yang kami lakukan dengan meningkatkan ekspresi (over-ekspresi) menggunakan faktor transkripsi sebagai karakterisasi fungsional mendalam bertujuan untuk meningkatkan toleransi stres abiotik pada kedelai. Hasil penelitian menunjukkan bahwa GmNAC20 mengkode 268 asam amino yang memiliki domain gen NAC.


Gbr 1. (a) Tingkat ekspresi respon GmNAC20 terhadap beberapa stres abiotik pada kecambah kedelai menggunakan analisis Northern blot. (b) Ekspresi GmNAC pada beberapa bagian tumbuhan.

Ekspresi GmNAC20 terlihat sangat diinduksi oleh stres abiotik dan hanya terinduksi sedikit oleh ABA, hal ini membuktikan bahwa GmNAC20 sangat responsif terhadap stres abiotik sehingga menginduksi faktor transkripsi NAC untuk meningkatkan toleransi melalui aktivasi jalur DREB/CBF-COR.

Peningkatan jumlah enzim akan meningkatkan laju fotosintesis dan peningkatan jumlah karbohidrat (sukrosa, heksosa dan pati) sehingga meningkatkan energi tanaman transgenik [8]. Oleh karena itu, over-ekspresi gen SPS dapat dikatakan menunjang pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Berdasarkan hasil analisis tersebut dapat diasumsikan bahwa terjadi hubungan sinergis antara gen GmNAC20 pada tanaman kedelai dan gen SPS dari tebu sehingga GmNAC20 cocok dipadukan dengan gen SPS. Hasil analisis PCR menunjukkan pita tunggal mengenai keberadaan gen target pKYS-SoSPS1. Bila gen target tidak ditemukan, ada kemungkinan karena gen tersebut bersifat chimera. Dewanti (2011) menyebutkan bahwa gen target yang diinsersikan pada tanaman tidak termultiplikasi secara merata pada sumber DNA yang menjadi template. Hasil analisis blot Southern juga menunjukkan bahwa gen GUS terintergrasi pada seluruh genom tanaman [16].

Gbr 2. Perkembangan akar lateral tanaman kedelai

Faktor transkripsi NAC juga telah terlibat dalam perkembangan akar lateral sebagai respons stres abiotik melalui aktivasi RE1/AtNAC2/ANAC092. Hasil tersebut menunjukkan hubungan pada hasil bahwa bagian tanaman kedelai yang paling banyak mengandung NAC adalah akar [9]. NAC merupakan salah satu faktor transkripsi tanaman spesifik terbesar yang telah ditemukan pada tanaman Arabidopsis, gandum, dan kedelai [15]. Over-ekspresi gen SoSPS dapat dilihat pada tanaman transgenik. SPS meningkatkan aktivitas enzim SPS dan kandungan sukrosa [8]. Tab 1. Kandungan enzim SPS tanaman transgenik dan non-transgenik

Tab 2. Kandungan karbohidrat tanaman transgenik dan non-transgenik

PENUTUP Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kedelai transgenik tahan terhadap stres abiotik dan menginduksi perkembangan akar lateral melalui regulasi transkripsi dari gen GmNAC. Peningkatan laju pertumbuhan serta perkembangan tanaman kedelai transgenik juga terjadi melalui aktivasi gen SPS. Hubungan kedua gen tersebut bersifat sinergis dalam mempengaruhi perkembangan tanaman kedelai sehingga dapat dihasilkan benih unggul yang dapat menyelesaikan masalah swasembada pangan. Saran kami agar gagasan ini dapat direalisasikan dan didukung oleh semua pihak dalam pelaksanaannya. Kami pun merekomendasikan adanya penelitian lanjutan mengenai kedelai transgenik unggul ini. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Annisa, Ph.D (Dosen Biologi Molekuler Prodi Biologi, Unpad) yang telah memberikan arahan, saran dan rekomendasi kepada penulis. Ucapan terimakasih pula untuk pihak birokrasi Universitas Padjdjaran atas dukungan dana kepada penulis. Referensi [1] Kementerian Pertanian. 2015. Rencana Strategis Kementerian Pertanian tahun 2015-


2019. Kementerian Pertanian Republik Indonesia:hal. 4-5. [2] Dewi, Ratna. 2011. Peningkatan Produksi dan Protein Kedelai dengan Aplikasi Bokasi dan Rhizo-Plus di Lahan Podsolik Merah Kuning. Jurnal Penelitian Pertanian Terapan Vol. 11 (1):52-57. [3] Rukmana, Rahmat., Yuyun Yuniarsih. 1996. Kedelai Budidaya dan Pascapanen. Yogyakarta : PT. Kanisius. [4] Riana, Fitria Dina., Ikbal Hardiyanto. 2011. Analisis Peramalan Kedelai (Glycine max L.) di Indonesia Tahun 2010-2019. AGRISE Volume XI No. 1 Bulan Januari 2011. [5] Kementerian Perindustrian. 2015. Ironi Kedelai Impor di Negeri Tempe. Artikel Kementerian Perindustrian Republik Indonesia. [6] Kementerian Pertanian. 2015. Kebijakan Pembangunan Pertanian 2015-2019. Kementerian Pertanian Republik Indonesia:hal. 5. [7] Song Y, Ji D, Li S, Wang P, Li Q, Xiang F. 2012. The Dynamic Changes of DNA Methylation and Histone Modifications of Salt Responsive Transcription Factor Genes in Soybean. PLoS ONE 7(7): e41274. doi:10.1371/journal.pone.0041274. [8] Nguyen-Quoc, B, Hyacinthe N’Tchobo1, Christine H. Foyer and Serge Yelle. 1999. Overexpression Of Sucrose Phosphate Synthase Increases Sucrose Unloading In Transformed Tomato Fruit. Journal of Experimental Botany, Vol. 50 (335) pp. 785– 791. [9] Hao, Y. J.†, Wei Wei†, Qing-Xin Song, HaoWei Chen, Yu-Qin Zhang, Fang Wang, Hong-Feng Zou, Gang Lei, Ai-Guo Tian. 2011. Soybean NAC Transcription Factors Promote Abiotic Stress Tolerance And Lateral Root Formation In Transgenic Plant. The Plant Journal (2011) 68, 302–313. doi: 10.1111/j.1365-313X.2011.04687. [10] Dewanti, P., M. Islahuddin, P. Okviandari, S. Waluyo, B. A. Saputra, T. Wardiyati, and B. Sugiharto, 2011. Efisiensi transformasi tomat (Lycopersicon esculentum) dengan gen sosps1 menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Berk. Penel. Hayati Edisi Khusus 4C:73–78. [11] Ningtyas, Rinda Media. 2013. Transformasi Gen SoSPS1 pada Tanaman Tebu (Saccharum offcinarum L. var. BL) Overekspresi Gen SoSUT1 Event 2

menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Skripsi. Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember. [12] Miswar, B. Sugiharto, J. Soedarsono dan S. Moeljapawiro. 2007. Transformasi Gen Sucrose Phosphate Synthase (SoSPS1) Menggunakan Agrobacterium tumefaciens untuk Meningkatkan Sintesis Sukrosa pada Tanaman Tebu (Saccharum officinarum L.). Berk. Penel. Hayati. Vol. 12: 137 - 143. [13]Aswan, Mohamad Syaifudin. 2015. Transformasi pada Tebu Produk Rekayasa Genetik Event 2 dan 20 dengan Gen untuk Sucrose Phosphate Syntase. Tesis. Program Studi Magister Biologi Fakultas MIPA Universitas Jember. [14]Setyati, S., P. Oktaviandari, M. Hazmi

dan B. Sugiharto. 2007. Studi Perbandingan Metode Transformasi DNA Menggunakan Vector Agrobacterium tumefaciens pada Tanaman Tebu (Saccharum hybrid). Berk. Penel. Hayati. Vol. 13: 39 - 44. [15]Lindemose, S 1, Charlotte O’Shea 1, Michael Krogh Jensen 2 and Karen Skriver. 2013. Int. J. Mol. Sci. 14(3), 5842-5878; doi:10.3390/ijms14035842. Structure, Function and Networks of Transcription Factors Involved in Abiotic Stress Responses. [16] Utomo, S. D. 2004. Pengaruh Strain Agrobacterium Terhadap Efisiensi Transformasi Genetik Jagung Genotipe Hibrida HiII Jurnal Ilmu Pertanian Vol.

11 No. 2, 2004 : 1-10. Larasati Amaranggana* Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran [email protected] Nurani Istiqamah Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran [email protected] Rina Susanti Chen Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran [email protected]

KITA Indonesia (Kedelai Inovasi Terbaru Anak Indonesia) : sebagai Solusi Pemenuhan Swasembada Pangan

Recommend Documents