KÍSÉRLETES BIOLÓGIAI GYAKORLATOK

Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar

Gazdag Zoltán, Kerepesi Ildikó Kucsera Judit, Manczinger László, Pesti Miklós, Takács Krisztina, Uzsoki Boglárka, Vágvölgyi Csaba

KÍSÉRLETES BIOLÓGIAI GYAKORLATOK

Szerkesztette: Kerepesi Ildikó

Pécs 2005

TARTALOMEGYZÉK

Oldatok

3

Pufferoldatok

4

Kromatográfiás elválasztási módszerek

10

Spektrofotometria

23

Fiziológiás oldatok összeállítása

27

Higitási sorozatok készítése

31

Bioassay vizsgálatok

36

Táptalajok

40

Sterilezés

44

Mikroorganizmusok tenyésztése

49

1

ELŐSZÓ

A biológia egyetemi oktatásába újonnan bevezetett Kísérletes biológiai gyakorlat című tárgy legfontosabb célkitűzése az, hogy a hallgatók megismerkedjenek

a különböző

tudományterületekhez tartozó biológiai laboratóriumok néhány alapvető eszközével és módszerével. Így betekintést kapnak néhány, a

biokémia, állatélettan, mikrotechnika és

mikrobiológiai laboratóriumokban alkalmazott módszerekbe. Tapasztalatokat szereznek a spektrofotometriás, kromatográfiás eljárásokról éppúgy, mint fiziológiás oldatok izomműködésre gyakorolt hatásának vizsgálatáról, vagy mikroorganizmusok tenyésztéséhez tartozó technikákról. Az itt szerzett elméleti ismeretek és gyakorlati technikák elsajátítása remélhetően jó alapot szolgáltat majd a későbbi laboratóriumi munkákhoz.

2

OLDATOK Az oldatok koncentrációja azt fejezi ki, hogy az oldott anyag milyen mennyiségben van jelen az adott mennyiségű oldatban vagy oldószerben. Az oldószer és az oldott anyag mennyiségét tömeg és térfogategységekben, illetve mólokban fejezhetjük ki. A tömegszázalék megadja, hogy az oldott anyag tömege az oldat tömegének hány százaléka: Tömegszázalék =

Oldott anyag tömege (g ) Oldat tömege (g )

x100

A térfogatszázalék megadja, hogy az oldott anyag térfogata hány százaléka az oldat térfogatának. Oldott anyag térfogata (cm 3 ) Térfogatszázalék = x100 Oldat térfogata (cm 3 ) A vegyesszázalék megadja, hogy az oldott anyag tömege hány százaléka az oldat térfogatának. Oldott anyag tömege (g ) x100 Vegyesszázalék = Oldat térfogata (cm 3 ) A molarítás (Mol) az oldott anyag moljainak számát adja meg 1dm3 oldatban. Molarítás (mol/dm3 ) =

Oldott anyag móljainak száma Oldat térfogata (dm 3 )

A molalitás megadja az oldott anyag 1kg oldószerre eső moljainak számát. Molalitás (mol/kg) =

Oldott anyag móljainak száma Oldószer tömege (kg )

A móltört megadja az egyik komponens móljainak számát az oldatban levő összes komponens móljainak számához viszonyítva. XA =

nA n A + n B + nc + ......n I

Koncentráció megadások természetesen más módon is lehetségesek pl.: mg/g; mg/cm3; g/1000cm3 ….

3

PUFFER OLDATOK A puffer oldatok olyan pH kiegyenlítő rendszerek, amelyek pH-ja más oldatokhoz viszonyítva csak kis mértékben változik, ha nagyobb mennyiségű erős savat vagy erős bázist adunk hozzá. Működésük a közös ion hatásán alapul. Puffer oldatnak nevezzük a gyenge savat és sóját (konjugált bázisát) vagy gyenge bázist és sóját (konjugált savát) tartalmazó oldatpárokat. A puffer oldat pH - értékét a gyenge sav (bázis) disszociáció állandója és a proton-akceptor/proton-donor koncentrációaránya határozza meg. A pufferkapacitás valamely erős savnak, ill. bázisnak a mol/dm3-ben kifejezett mennyisége, amely az adott összetételű puffer rendszerben egységnyi pH-változást hoz létre. A pufferkapacitást a proton-akceptor és a proton-donor koncentrációja, valamint aránya határozza meg. Például minél több mol sav vagy só van jelen, annál több erős bázis vagy erős sav hozzáadását egyenlíti ki a puffer a pH lényeges megváltozása nélkül. Vizes oldatban a sav – bázis reakciók jellemzésére Brönsted definíciója alkalmazható: a savak proton-donor, a bázisok proton-akceptor vegyületek. Sok reakció sebességét, vizes oldatban, gyenge savak vagy bázisok is befolyásolják. Ezeket a protondonorokat, illetve proton akceptorokat Brönsted savaknak vagy bázisoknak nevezzük, vagy nevezhetjük általános savaknak vagy általános bázisoknak. Egy BH sav ionizációja a konjugált bázisát, a B- aniont eredményezi. Másfelől a B- anion protonálása a konjugált sav (BH) képződéséhez vezet:

______________________________________________________ sav bázis protondonor protonakceptor ______________________________________________________ BH B+ H+ CH3COOH CH3COO + H+ NH4 NH3 + H+ HOH HO + H+ ______________________________________________________ Az enzimek megfelelő működésének feltétele az állandó hidrogénion-koncentráció. A fehérjéknek nem jelentős a pufferkapacitásuk, így a közeg hidrogénion-koncentrációja (pH) könnyen befolyásolja töltéseinek számát. A szervezetben találhatóak pufferrendszerek pl.: foszfátionok (H2PO4- ↔ HPO42-), cukorfoszfátok, hidrogénkarbonát – karbonát. Kísérleti

4

körülmények között lehetőségünk van a puffer megválasztására és ezen keresztül a közeg hidrogénion-koncentrációjának stabilizálására, illetve a reakció sebességének befolyásolására. A puffer megválasztásánál az egyik szempont a gyenge sav vagy gyenge bázis pKa értéke. Egy puffer ugyanis pKa érékétől ± 1 pH érték tartományában fejt ki kellő pufferkapacitást. Tehát azt a puffert választjuk, amelyeknek pKa értéke a pufferolni kívánt pH értékhez közel esik. A puffer koncentrációja általában 5 és 100 mmol / l tartományban használatos. Egy jó puffer tulajdonságai: Vízben jól oldódjon Membránon ne hatoljon át, a sejtorganellumokba ne jusson be. A puffer pKa értékét, amennyire lehet, ne befolyásolja a puffer koncentrációja, a hőmérséklet, a közeg ionösszetétele. Az enzimek kofaktoraival, mint Ca2+, Mg2+, Mn2+ ne képezzenek komplexeket. Ha a puffer fémionokkal komplexet képez, ezek vízben jól oldhatók legyenek és a kötési állandójuk ismert legyen. A pufferek enzimatikus és nem enzimatikus behatásnak ellenálljanak. Szerkezetükben ne hasonlítsanak az enzim szubsztrátjaira vagy inhibitoraira. Ne reagáljanak a keletkező metabolitokkal vagy a reakcióközeg más komponenseivel. Az alkalmazott koncentrációban oldatuk 230 nm felett ne abszorbeálja a fényt. Lehessen nagy tisztaságban előállítani. Példa a pufferhatás érzékeltetésére egy protont termelő reakcióval: LAKTÁT + NAD+

-

PIRUVÁT + NADH + H+

A reakcióban a piruváttal ekvimoláris mennyiségben hidrogénion keletkezik. Tehát 10µmol piruvát keletkezésekor 10µmol hidrogénion. A reakciót pH 8-nál, 5ml térfogatban

5

végezzük. Így a hidrogénion mol koncentrációja 10-8 + 10 x10-6 / 5 x 1000 =2 x 10-3. Az oldat pH-ja – log [H]+ = 2.699 lesz. A változás 5.301 pH érték. Ha a közeg nincsen pufferolva a pH-t NaOH hozzáadásával állandó pH 8 értéken tarthatjuk, a fogyott lúgból a piruvát mennyisége kiszámítható. Ha a reakcióelegy 50 mmol / l töménységű puffert tartalmaz, a pH 8-ról hozzávetőleg csak 7.96ra csökken.

Foszfátpuffer

A pufferhatást a foszforsav (H3PO4) 2. disszociációs egyensúlyában szereplő H2PO4− és HPO42− - ionok hozzák létre: H2PO4−

↔ H+ + HPO42−

gyenge sav

konjugált bázis

Ks = 6,2 . 10−8

A foszfátpuffer hidrogénion - koncentrációját a dihidrogén-foszfát- és hidrogénfoszfát - anionok aránya szabja meg : +

[H ] =

[ H PO ] Ks [ HPO ] 2

− 4

2− 4

Innen a foszfátpuffer pH- ja :

[ HPO ] pH = pKs + log [ H PO ] 2− 4

2

− 4

azaz pH = 7,21 + log

[ HPO ] [ H PO ] 2− 4

2

− 4

Az élő szervezet sav-bázis egyensúlya különlegesen fontos. A szervezetben a legtöbb reakció vizes közegben játszódik le. A hidrogénion-koncentráció megváltozása sebességüket jelentősen módosítja, mivel az enzimek optimális aktivitása csak igen szűk pH-tartományban érvényesül. A mozgékony hidrogénion befolyásolja a sejtek környezetében az ionok, pl. Na+, K+, Cl− eloszlását is. A foszfátpuffer a szervezet egyik legfontosabb intracelluláris puffer rendszere, H2PO4− - és HPO42− - anionként a cukorfoszfátokban és a nukleotidokban, elsősorban ATP-ben kötött foszfátionok szerepelhetnek.

Hidrogén - karbonát - szén - dioxid puffer

A hidrogén-karbonát-szén-dioxid puffer a szervezet alapvető pufferrendszere, a vér pH-t tartja állandó értéken. Egészséges személynél az artériás pH 7,4 körül, 7,35 és 7,45 között van. Ha növekszik a pH (pH> 7,6), akkor a sejtek már nem tudják a vérnek kellően átadni a biológiai oxidáció során képződött szén-dioxidot, a pH csökkenése (pH< 7,3) pedig a gázcserét segíti elő a

6

tüdőben a szén-dioxid leadásával. A vér pH < 7,0 kómát idéz elő. A pufferrendszer fontos komponensei a szénsav (H2CO3) és ionjai (HCO3−, CO32-). A vér pufferrendszerében a vérben oldott szén-dioxid, CO2 (aq) és a tüdőben lévő gázállapotú szén-dioxid, CO2 (g) is szerepet játszik. A pH-t három egyensúlyi folyamat alakítja ki. 1, A szénsav első disszociációs lépése:

H2CO3(aq) + H2O (l) ↔ H3O+ + HCO3−

[ H ][ HCO ] K1= [ H CO ] +

− 3

2

3

2. Az oldott szén- dioxid és szénsav egyensúlya :

CO2 (aq) + H2O(l) ↔ H2CO3(aq) K2 =

[ H CO ] 2

3

[CO ] 2( aq )

3. A szén - dioxid oldódása:

CO2(g) + H2O (l) ↔ CO2(aq) K3 =

[ CO ] [ CO ] 2 ( aq ) 2( g )

pH = 6,1 + log

[ HCO ] − 3

0,0226 pco2

A vérbe kerülő metabolitok (pl. tejsav) növelhetik átmenetileg a hidrogénion koncentrációt, ami H2CO3 képződéséhez vezet. Ez oldott szén- dioxiddá, CO2(aq) alakul át és a tüdőben gázfázisba lép: CO2(g). A bevitt H+ tehát növeli a pCO2- t , de nem változtatja meg a vér pH-t mindaddig, amíg elegendő koncentrációjú bikarbonát van jelen (alkáli tartalék). A vér pH átmeneti emelkedése növeli a [HCO3−]-t, ami a CO2- gáz oldásából, H2CO3 képződésén át pótlódik. Feladat:

Az alábbi táblázatok felhasználásával

készítse el a gyakorlat vezető által megadott puffer

törzsoldatait majd a megadott pH-jú elegyet. pH mérővel állítsa be a pontos értéket.

7

Trisz (hidroxi-metil)-amino-metán pufferoldat (pH=7,2…9,10;;23οC)

A pufferoldat komponensei: 0,5057 g trisz(hidroxi-metil)-amino-metán 50cm3-re oldva, 0,1 mol . dm-3HCL (8,0cm3 cc. HCL 1 dm3-re hígítva). 50,0 cm3 trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldathoz a táblázatban megadott mennyiségű sósavoldatot adunk és 100,0 cm3-re egészítjük ki. pH 7,20 7,36 7,54 7,66 7,77 7,87 7,96 8,05 8,14

Oldattérfogat, cm3

pH

45,0 42,5 40,0 37,5 35,0 32,5 30,0 27,5

Oldattérfogat, cm3 22,5 20,0 17,5 15,0 12,5 10,0 7,5 5,0

8,23 8,32 8,40 8,50 8,62 8,74 8,92 9,10

Michaelis-féle foszfátpuffer (pH=5,3…8,3;;18 °C)

A pufferoldat komponensei: 1/15 mol.dm-3 kálium-dihidrogén-foszfát-oldat (9,07g KH2PO4 1 dm3-re oldva), 1/15 mol.dm-3 dinátrium-hidrogén-foszfát-oldat (11,88 Na2HPO4.2H2O 1 dm3-re oldva). A pufferoldat komponenseit a táblázatban megadott arányokban elegyítjük. pH 4,53 5,29 5,59 5,91 6,24 6,47 6,64

KH2PO4 Na2HPO4 oldattérfogat, cm3 10,00 0,0 9,75 0,25 9,5 0,5 9,0 1,0 8,0 2,0 7,0 3,0 6,0 4,0

pH 6,81 6,98 7,17 7,38 7,73 7,9 8,2

KH2PO4 Na2HPO4 oldattérfogat, cm3 5,0 5,0 4,0 6,0 3,0 7,0 2,0 8,0 1,0 9,0 7,9 9,5 8,2 9,75

8

McIlvaine-féle pufferoldat (pH = 2,2…8,0;; 18°°C)

A pufferoldat komponensei: 0,2 mol. dm-3 Na2HPO4-oldat (35,60 g Na2HPO4.2H2O 1 dm3-re oldva), 0,1 mol.dm-3 citromsavoldat [21,01 g C3H4(OH) (COOH)3.H2O 1 dm3-re oldva]. A pufferoldat komponenseit a táblázatban megadott arányokban elegyítjük pH 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 4,0 4,2 4,4 4,6 4,8 5,0

Na2HPO4

Citromsav Oldattérfogat, cm3 0,40 19,60 1,24 18,76 2,18 17,82 3,17 16,83 4,11 15,89 4,94 16,06 5,70 14,30 6,44 13,56 7,10 12,90 7,71 12,29 8,28 11,72 8,82 11,18 9,35 10,65 9,89 10,14 10,30 9,70

pH 5,2 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0

Na2HPO4

Citromsav

Oldattérfogat, cm3 10,72 9,28 11,15 8,85 11,60 8,40 12,09 7,91 12,63 7,37 13,22 6,78 13,85 6,15 14,55 5,45 15,45 4,55 16,47 3,53 17,39 2,61 18,17 1,83 18,73 1,27 19,15 0,85 19,45 0,55

9

KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI MÓDSZEREK

A kromatográfiás módszerek elve

A kromatográfiai eljárások azon az elven alapulnak, hogy az áramló folyadékban vagy gázban (a mozgó fázisban) oldott anyagok egy porózus szilárd hordozón (az álló fázison) áthaladva különböző mértékben vándorolnak. A vándorlási sebességet a mozgó fázis és az álló fázis molekulái között kialakuló fizikai, kémiai kölcsönhatások határozzák meg. A fázisok között dinamikus egyensúly van. Bármely időpontban a mozgófázisban található molekulák relatív mennyisége határozza meg azt, hogy a komponens milyen gyorsan halad át az oszlopon, mert amíg a molekulák az állófázisban tartózkodnak, addig az oszlop hossztengelyén nem mozdulnak el. Ezért azok a molekulák, amelyek időben többet vannak az állófázisban lassabban jutnak át az oszlopon. Az eltérő mozgássebesség a komponensek eltérő egyensúlyi megoszlása révén alakul ki. Ezért a mozgássebességet az egyensúlyi megoszlást meghatározó tényezők szabják meg, így a mozgó és az állófázis összetétele, az elválasztás hőmérséklete. A kromatográfiás módszerek csoportosítása

- Az elválasztás elve, azaz az álló és a mozgó fázis molekulái között kialakuló kölcsönhatások alapján beszélhetünk megoszlási, adszorpciós, ioncserés, gél-, affinitás-, illetve kovalens kromatográfiáról. Az esetek többségében azonban ezek az elvek nem elkülönülten jelentkeznek, hanem két vagy több hatás eredőjével kell számolnunk (pl. adszorpciós és megoszlási kromatográfia). Megoszlási kromatográfia. A folyadék-folyadék vagy megoszlási kromatográfia állófázisa olyan folyadék, amelynek összetétele eltér a mozgófázisétól. A minta molekulái megoszlanak a két folyadék között – ugyanúgy, ahogy a rázótölcsérben végzett extrakció során. A mozgó és álló fázis két, nem elegyedő folyadék. Az állófázist kémiai úton a hordozó szemcséire is köthetik. Az álló és mozgó fázis, a hordozó polaritásától függően, az elúció során jön létre. Például a sok hidroxil csoportot tartalmazó cellulóznál, víz – alkohol keverékével egy cellulóz – víz komplex alakul ki és képezi az álló fázist. Ugyanez az oldószerkeverék a fordított fázisú kromatográfiánál, C18 alkil csoportot rögzítve a szilicium-dioxid mátrixhoz, az alkohol adja az álló fázist és a polárosabb víz

10

a mozgó fázist. Az oldatban levő anyagok a megoszlási hányadosuk arányában tartózkodnak az álló, illetve mozgó fázisban. Adszorpciós vagy folyadék-szilárd kromatográfia esetében az állófázist nagy felületű, szilárd szemcsék alkotják. A minta az álló fázis (pl. aktív szén, alumíniumoxid, szilikagél, zeolitok, keményítő, cellulóz, dextrán) szilárd szemcséinek határfelületein felhalmozódik, melynek mértékét a komponensek adszorpciós együtthatói határozzák meg. A megfelelően megválasztott rendszerben az elválasztandó anyagok adszorpciós együtthatói különböznek, így a komponensek fokozatosan hagyják el a szilárd fázist. Az adszorpciót leginkább befolyásoló tényező a minta polaritása az álló, illetve a mozgó fázishoz viszonyítva. Oldószerek tapasztalati eluotróp sora alumíniumoxid adszorbensre és dielektromos állandóik. ________________________________________________________________

eluáló képesség

dielektromos állandó

________________________________________________________________ hexán

0.01

1.88

ciklohexán

0,04

2.02

CCI

0.18

2.24

diizoprppiléter

0.28

3.88

dietiléter

0.38

4.33

CHCI

0.40

4.80

CHCI

0.42

8.93

aceton

0.56

21.40

etilacetát

0.58

6.11

acetonitril

0.65

37.50

etanol

0.88

25.80

metanol

0.95

33.60

víz

nagy

80.40

formamid

nagy

110.00

ecetsav

nagy

6.10

11

Ioncserés kromatográfia. Az ioncserélők állófázisa olyan anyag, (pl. dextrán, cellulóz, polisztirol), amelyre kovalens kötéssel elektrolitos disszociációra képes pozitív vagy negatív töltésekkel rendelkező funkciós csoportokat (pl. szubsztituált kvaterner ammóniumion, illetve szulfát-, karboxilcsoportokat) köthetünk, melyeknek az ellen-ionjai a mozgó vizes fázis ionjaival reverzibilisen kicserélhetőek. Az elválasztás alapja ebben az esetben a töltések nagyságának különbözősége. Ha a szilárd hordozón pozitív töltéseket rögzítettünk, akkor anion-cserélőről, ellenkező esetben kationcserélőről van szó. A reverzibilisen kötött ionokat az álló fázis felületéről leszoríthatjuk egy másik iont nagy koncentrációban tartalmazó eluens áramoltatásával. Biológiai anyagoknak ioncserés kromatográfiás elválasztására alkalmas

funkciós csoportjai

vannak, melyek köthetők cellulóz, SEPHADEX, agaróz, stb. OH-csoportjaihoz. A fehérjék, mint ionok szétválasztásában nagy jelentőségre tettek szert különböző kémiai módosításokkal ioncserélő sajátosságúvá tett cellulóz származékok. A legáltalánosabban elterjedt ilyen származék a DEAE-cellulóz (Dietil-Amino-Etil-cellulóz), ahol a cellulóz OH-csoportjainak egy részéhez éter kötéssel kapcsolt gyök, mint tercier amin anion cserélő sajátosságokat kölcsönöz a cellulóznak. Így a DEAE-cellulóz az izoelektromos pontjuknál magasabb pH-n a fehérjéket anion formában megköti. Az ionerősség vagy a pH fokozatos változtatásával a fehérje anionok elektromos töltésük erősségétől függően frakcionáltan eluálhatók. Affinitáskromatográfia. Specifikus biokémiai kölcsönhatásokat kihasználó elválasztási módszer. Ha egymáshoz szelektíven kötődő molekula párok (pl. antitest-antigén, enziminhibítor, receptorligand) egyik tagját a funkció károsodása nélkül egy szilárd hordozóhoz (pl. agaróz, poliakrilamid) kovalens kötésekkel rögzítjük, akkor a molekula pár másik tagját igen nagy hígításban, illetve nagy számú komponenst tartalmazó elegyből is kinyerhetjük. A reverzibilisen megkötött anyagot az elúciós körülmények megfelelő megváltoztatásával nyerhetjük vissza. Egy szacharóz táptalajon növesztett gomba (Leuconostoc mesenteroides) terméke az 1,6 kötésekkel összekapcsolt, glükóz egységekből álló, láncot képező poliszacharid, a dextrán. A polimer molekulatömege egy millió Daltonnál nagyobb, nyálkás anyag. A glükóz hidroxilcsoportjain keresztül epiklórhidrinnel keresztkötések alakíthatók ki. Ha a reakciót emulzióban végzik, a megszilárduló cseppek gyöngypolimert képeznek, ez a SEPHADEX. A reakciót úgy vezetik, hogy a gömböcskék átmérője 40-100µm körül alakuljon. Az epiklórhidrin mennyiségével a keresztkötések száma változtatható. Sok keresztkötés szilárdabb terméket ad,

12

vízmegkötő képessége csökken. A keresztkötésekre és a molekulaszűrésnél mutatott elválasztási tartományra a vízmegkötő képességből következtethetünk. A SEPHADEX G100 azt jelenti, hogy 10g száraz termék, szabványkörülmények mellett, 100 g vizet képes megkötni. G a gélszűrésre utal. A térhálósítás után még megmaradó OH-csoportokra töltést viselő, funkciós csoportok kapcsolhatók. Ezzel kémiailag módosított, ioncserés kromatográfiára alkalmas SEPHADEX termékekhez jutunk. Gélszűrés. A molekulaszűrők különféle, vízben oldhatatlan polimerek (pl.dextrán, poliakrilamid) megfelelően térhálósított származékai, Sephadex, Biogel, Molselect, Acrylex stb. néven kerülnek kereskedelmi forgalomba. A térhálósítás mértékétől függően a gyöngyszerű polimer részecskék belsejében kisebb-nagyobb hézagok vannak. A szétválasztandó anyagok, méretűktől függően vagy behatolnak a hézagokba vagy nem. A nagyméretű részek az üregekbe nem hatolnak be, és akadály nélkül áthaladnak a molekulaszűrőkből készített oszlopon. A kisebb méretűek behatolnak a hézagokba, és csak késleltetve haladnak át az oszlopon. Ha az oszlopról lecsurgó anyagokat frakciónként gyűjtjük, akkor először a nagy molekulasúlyú komponensek jelennek meg, majd rendre a kisebb méretű anyagok is. Kovalens kromatográfia. Olyan elválasztási módszer, amelyben egy specifikus hordozó és az oldat egy komponense között kémiai kötés alakul ki, míg az oldat többi komponense változtatás nélkül eluálható. A megkötött anyag egy újabb kémiai reakcióval szabaddá tehető. A mozgó fázis halmazállapota

szerint megkülönböztetünk folyadék-, illetve

gázkromatográfiát. Az elválasztandó anyagok az álló fázisról történő kinyerése, eluálása alapján folyamatos, lépcsőzetes és gradiens elúciót különböztethetünk meg. A folyamatos elúcióban az oldószert tisztán, folyamatosan adagoljuk. Akkor alkalmazzák, ha a komponensek állófázishoz való affinitása nem különbözik nagy mértékben, ezért az egyes komponensek nem nagy intervallumokkal, viszonylag kevés oldószerrel eluálhatók. Lépcsőzetes elúciónál a komponensek kinyerése növekvő eluáló képességű oldószerekkel, szakaszosan

13

történik. A folyamatosan változó összetételű oldószer eleggyel történő eluálást gradiens elúciónak nevezzük. Előnye, hogy csökkenti a sávszélességet és megszünteti az elhúzódást. A

módszer

kivitelezése

alapján

beszélhetünk

oszlop-,

vékonyréteg-és

körkromatográfiáról. Az oszlopkromatográfiánál a szilárd álló fázist egy inert (pl. üveg, műanyag, fém) oszlopba töltik, míg a vékonyréteg kromatográfiánál a hordozót egy sík felületre viszik fel. Az előbbi esetben a mozgó fázis áramoltatását a természetes gravitáció, illetve különböző kialakítású pumpák, míg az utóbbi esetben a száraz álló fázis és a nedves mozgó fázis határán kialakuló kapilláris hatás biztosítja. Körkromatográfia esetében a mintát kör alakban viszik fel a korongot formáló álló fázisra, az eluáló szert pedig a kör középpontjába vezetik. A mozgó fázis folyása centrifugálással gyorsítható. Az elválasztás méretei alapján megkülönböztethetünk analitikai, preparatív, kísérleti üzemi, ipari kromatográfiát. Analítikai célokra inkább vékonyréteg-, preparatív, illetve üzemi célokra pedig inkább oszlopkromatográfiát használnak. A detektálás szempontjából megkülönböztetünk belső és külső kromatogrammot. A belső kromatogram a kromatográfiás töltetlen láthatóvá tett eredmény (pl. vékonyréteg kromatográfiánál a lemez valamilyen festékkel való lefújása, vagy oszlopkromatográfiánál színes vagy fluoreszkáló anyagok elválasztása), elsősorban analitikai alkalmazásoknál. A külső kromatogram az elválasztó rendszeren kívül regisztrált eredmény (pl. az oszloptól szedett frakciók fehérjetartalmának mérése, vagy az oszlop után kötött UV-detektor által folyamatosan mért abszorbancia változás), elsősorban preparatív célokra. A hagyományos kromatográfiás eljárások mellett napjainkra széleskörűen elterjedt az úgynevezett nagy nyomású (High Pressure) vagy nagy felbontású (High Performance) folyadékkromatográfia (Liqid Chromatograhy), azaz a HPLC technika is. Jellemzője, hogy kis szemcseméretű tölteten, 30-400 bar nyomással, gyorsan, kevés oldószer felhasználásával, nagy precizitású pumpák és detektorok automatizált rendszerbe foglalásával a hagyományos módszereknél hatékonyabb és jobban reprodukálható elválasztás érhető el.

14

Sok komponenst tartalmazó elegyek elválasztásánál fontos, hogy az egyes anyagok nagyon kis térfogatban eluálódjanak, a csúcsok keskenyek legyenek, a feloldóképesség nagy legyen. Az egyik tényező, mely a feloldóképességet befolyásolja az oszloptöltet anyagának szemcsemérete. Minél kisebb részecskékből áll a töltet, annál nagyobb a feloldóképesség. Analitikai célokra ma már 3-5 µm átméretű golyó alakú sziliciumdioxid mátrixokat használnak. Ezek a golyócskák porózusak, az oldószerek a gömb belsejéhez is hozzáférhetnek. Oszlopba töltve a kis átmérők miatt igen szűk járatok alakulnak ki a gömbök között. Az átfolyatott eluálószer viszkozitása függvényében alakul ki a szükséges, 30-400 bar nyomás, mellyel a megkívánt áramlási sebesség elérhető. Ilyen nagy nyomások elviselésére a sziliciumdioxid mátrix kiválóan alkalmas. A sziliciumdioxid mátrix számos OH-csoportot hordoz, melyhez kovalens kötéssel különböző csoportok kapcsolhatók. Ilyen csoportok: fordított fázisú kromatográfiához a C2, C8 és C18 szénatomot tartalmazó alifás láncok (etil, oktil, oktadecil). Aminopropil, cianopropil csoport más típusú

elválasztásokra.

Ezekkel

a

módosított

sziliciumdioxid

mátrixot

tartalmazó

oszloptöltetekkel a nagynyomású folyadékkromatográfia rendkívül széles alkalmazási területre tett szert. Gyakorlatok: 1,Pirospaprika őrlemény színanyagainak vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálata

A paprika színanyagainak szétválasztását Kieselgel G vékonyrétegen adszorpciós folyadék-kromatográfiával végezzük. Ebben az esetben a szilárd fázis a vékonyréteg, amelyre a szétválasztandó elegyet felcseppentjük, a mozgó fázis a folyadékelegy, amelyet kapilláris erők mozgatnak. A színanyagok szétválasztása szemmel is jól követhető. A paprika színanyagainak abszorpciós maximuma különbözik egymástól, benzolban:

λmax

színanyag

λmax

színanyag

465

mutatoxantin

493

β-kryptoxantin

483

violaxantin

493

zeaxantin

486

kapszantin

494

β-karotin

486

kryptokapsin

508

kapszantin epoxid

488

anteraxantin

522

kapszorubin

15

Ha a szétválasztott színanyagok egyikét a vékonyrétegről levakarjuk, és megnézzük az abszorbancia változását a hullámhossz függvényében, az abszorpciós maximum alapján a színanyagot azonosíthatjuk. Karotinok

H3C

CH3

H3C

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

β-karotin

A poliénmolekula két gyűrűjét egy 22 szénatomos lánc köti össze, amelyben a kettős kötések konjugált rendszerben helyezkednek el. A gyűrűket β -jonongyűrűnek nevezzük. A gyűrűben a telítetlen kötés az oldallánc mellett helyezkedik el. Ezzel szemben α-jonongyűrűről beszélünk akkor, ha a telítetlen kötés az oldallánchoz viszonyítva egy atommal távolabb található. Maguk a gyűrűk is képzeletben 2 izoprénegységre bonthatók. A gyűrűket összekötő lánc építőeleme is izoprénváz. A β-karotin táplálkozástani szempontból rendkívül fontos, mert az A-vitamin provitaminja. A szervezetben oxidatív behatásra középen kettészakad, miközben két molekula Avitamin képződik:

CH3 H3C

CH3 H C

CH3 H C

C C H

C H

C C H

C H

CH2OH

CH3

A-vitamin A β-karotin szerkezetére jellemző, hogy molekulájában 11 olefinkötést tartalmaz konjugált rendszerben. Ez a szerkezet okozza mély színét. Kristályai sárgásvörös színűek,

16

kékesen fénylő felülettel. A zöld levelek fő karotinoid alapanyaga. A spenót kloroplasztiszlamelláiban pl. a klorofill:karotinoid arány: 1:0.25. A növényekben előfordul még α- és γ-karotin is. Felépítésük a β-karotinéhoz hasonló. Különbség csak a molekulák kis részletében van: az α-karotin második gyűrűje α-jonon szerkezetű, a γ-karotinban az egyik gyűrű már felszakadt:

H3C

CH3

CH3

H3C

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

α-karotin

H3C

CH3

CH3

H3C

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

γ-karotin

Az oxigént nem tartalmazó karotinoidok további fontos tagja a likopin. Nevét onnan kapta, hogy először a paradicsomból (Lycopersicon esculentum) állították elő:

H3C

CH3

CH3

H3C

CH3 15 15'

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

likopin Xantofillok

A karotinoidok második fő csoportját az oxigént tartalmazó karotinoidok alkotják. Bennük az oxigén különböző funkcionális csoportot képez. A xantofillokat a megfelelő

17

karotinokból vezethetjük le. Eszerint az α-karotin dihidroxi-származéka a lutein vagy más néven xantofill, a β-karotin dihidroxiszármazéka a zeaxantin. Az oxigént tartalmazó karotinoidokhoz tartozik a piros paprikában előforduló kapszantin és kapszorubin: H3C

CH3

CH3

HO

CH3

CH3

H

OH H

H3C

CH3

CH3

H3C

CH3

lutein

H3C

CH3

CH3

HO

CH3

CH3

H

OH H

H3C

CH3

CH3

H3C

CH3

zeaxantin H3C

CH3

CH3

OH H

H3C

CH3

C HO

CH3

CH3

H

CH3

H3 C

O CH3

kapszantin

H3C

CH3

CH3

OH H

H3C

CH3

C O HO H

O

C CH3

CH3

CH3

H3 C

CH3

kapszorubin

18

Anyagok és eszközök:

Kieselgel G vékonyréteg futtatóelegy (a méréshez előre elkészítve), melynek összetétele: petroléter

(40.0 ml)

benzol (10.0 ml) ecetsav ( 2.5 ml) aceton ( 2.5 ml) fűszerpaprika

benzolos

kivonata

(15

g/ml),

pipetták,

kapillárisok,

futtatókád,

kés,

spektrofotométer, küvetták, hajszárító A gyakorlat menete:

A Kieselgel G rétegre az aljától kb. 1.5 cm-re ceruzával vékony startvonalat húzunk úgy, hogy a vonal vége a lap két oldalától 1-1 cm-re legyen. 0.1 ml paprika kivonatot több részletben kapilláris segítségével erre a vonalra visszük fel, a vékonyréteget megszárítjuk és a futtatóelegyet tartalmazó kádba helyezzük. A futtatókádat lefedjük és kb. 45 percig kromatografálunk (az oldószer útja kb. 18 cm). A lapot kivesszük, megszárítjuk, majd a szétválasztás hatásfokának növelésére a futtatást megismételjük. A 2. futtatás után a vékonyréteget ismét megszárítjuk. Az egyik, közösen kiválasztott sávot késsel fehér papírra vakarjuk, a port kémcsőbe töltjük, 2 ml benzollal összerázzuk és redős papírszűrőn történő szűrés után különböző hullámhosszoknál fotometrálunk (a fotométert minden hullámhossznál benzolra nullázzuk). Feladat:

A megfuttatott és megszárított lemezt rajzoljuk le. A fotometrálás után ábrázoljuk az abszorbanciát a hullámhossz függvényében; a görbe lefutásából következtessünk arra, melyik színanyagot izoláltuk!

2. Szérumfehérjék elválasztása ioncserével DEAE-cellulóz oszlopon

A fehérjék, mint ionok szétválasztásában igen nagy jelentőségre tettek szert különböző kémiai módosításokkal ioncserélő sajátságúvá tett cellulóz származékok. A legáltalánosabban elterjedt ilyen származék a dietil-amino-etil (DEAE) cellulóz. A cellulóz OH-csoportjainak egy részéhez éter kötésben kapcsolt gyök, mint tercier amin, anioncserélő sajátságokat kölcsönöz a

19

cellulóznak. A DEAE-cellulóz gyenge ioncserélő, így az izoelektromos pontjuknál magasabb pH-n a fehérjéket anion formájában megköti. Az ionerősség vagy a pH folyamatosan (gradiensben) történő változtatásával a fehérje anionok elektromos töltésük erősségétől függően frakcionáltan eluálhatók.

Anyagok és eszközök:

Aktivált DEAE cellulóz Szérum 0,05 M Tris/HCl puffer-rel (pH=7,7) szemben dializálva 0,05 M Tris/HCl puffer (pH=7,7) 1,0 M KCL 0.05 M Tris/HCl pufferben (pH=7,7) kromatografáló oszlop, mágneses keverő, 2 db 250ml-es főzőpohár, hébércső, mérőhenger, ultraibolya fotométer, vezetőképesség mérő DEAE cellulóz előkészítése: 1, Tisztítás Az oszlopba töltés előtt el kell távolítani a túl finom és a túl durva részeket az ioncserélőkből. A durva részecskék (150µm) eltávolítása megkönnyíti az oszlopkészítést és megakadályozza a csatornaképződést az oszlopban. A finom részek eltávolítása javítja az oszlop átfolyási sebességét. a, A finom részek eltávolítása: 10g ioncserélőt 200 ml ionmentes vízben szuszpendáljuk, gyengén megkeverjük, egyenletesen elosztva a részecskéket 30 percig állni hagyjuk, majd leöntjük a folyadékot a leülepedett ioncserélőről. A leöntött folyadékkal a le nem ülepedett túl finom részecskéket távolítjuk el az anyagból. b, A durva részek eltávolítása: Az ioncserélőt 200 ml ionmentes vízben szuszpendáljuk, gyenge keveréssel elosztva egyenletesen a részecskéket a folyadékban, 1-2 perc állás után a durva részek leülepednek. Ekkor dekantáljuk a még lebegő, közepes szemcsenagyságú részeket a leülepedett durva szemcsék visszahagyásával. A maradékot használjuk oszlop készítésére.

20

2, Aktiválás Minél nagyobb kromatográfiás hatásosság elérésére az ioncserélőt ajánlatos egyszer H+ és OH- cikluson átvinni. Nem célszerű a kezelést oszlopban végezni, hanem az oszlopba töltés előtt lombikban. 10 g ioncserélőt szuszpendálunk 150 ml 0.5 N sósavban és 1 órán át állni hagyjuk. Büchnertölcséren leszűrjük, és ionmentes vízzel pH=5.0-ig mossuk. Az ioncserélőt 150 ml 0.5 M NaOHban szuszpendáljuk, egy órán át állni hagyjuk, szűrjük, és ionmentes vízzel pH=7.0-ig mossuk. Végül a használandó pufferoldatban szuszpendáljuk az ioncserélőt az oszlopba töltés előtt. A kationcserélők ciklizálása ugyancsak a fent leírtak szerint történik, csak a savas és a lúgos kezelést fordított sorrendben kell végezni. 3, Oszlopkészítés Az ismert kromatográfiás oszlopok jól felhasználhatók a cellulóz ioncserélő oszlopok készítésére is. A normál oszlopmagasság 10-20 cm, a magasság és a belső átmérő aránya 5-10 között változik. A töltést úgy kell elvégezni, hogy a töltet buborékmentes, egyenletesen töltött és vízszintes ágyfelszínű legyen! Első lépésként az előkezelt cellulóz ioncserélőt szuszpendáljuk a megfelelő pufferben (szilárd – folyadék arány kb. 1:20). Az oszlop aljára üveggyapotot teszünk, az oszlop tetejére pedig tölcsért rögzítünk. Az oszlop kifolyócsapját elzárjuk, és a cellulóz ioncserélő szuszpenzióját lassan a tölcsérbe öntjük. Mikor a leülepedett ioncserélő réteg néhány cm magasságot elért, kinyitjuk az oszlop csapját, és az ülepítést áramló rendszerben folytatjuk. A kívánt töltetmagasság elérése után a tölcsért leszereljük. Közvetlen használat előtt az oszlop felületéről leengedjük a puffer oldatot a töltet felszínéig, és a minta oldatát óvatosan a felület felkavarása nélkül visszük fel az oszlopra, a töltet felszínére. A töltet felkeveredését meggátolhatjuk, ha a tetejére szűrőpapírkorongot helyezünk. A maximális kromatográfiás hatásosság eléréséhez a teljes elméleti kapacitás alapján számolt minta mennyiségnek csak kis részét célszerű felvinni az oszlopra. Jó szeparálás eléréséhez 1.0 g száraz cellulóz ioncserélőre számítva maximálisan 0,1 g fehérje vihető fel. 4, Regenerálás Használat után az oszlopot 0,5 N nátriumhidroxiddal ill. sósavval lehet regenerálni az előciklizálásnál leírtak szerint.

21

A gyakorlat menete:

1. Az anyag felvitele az oszlopra A gyakorlathoz 2 cm átmérőjű és 16 cm magas DEAE cellulóz oszlopot készítünk 0,05 M Tris/HCl puffer segítségével (pH=7,7). Az oszlopra 30 mg fehérjét viszünk fel (amit előzőleg ugyanezzel a pufferrel szemben dializáltunk) 0,5-1,0 ml pufferben. Az anyagot 2 x 1,0 ml fenti pufferrel bemosunk az oszlopba. Körülbelül 1 ml/perc átfolyási sebességgel dolgozunk. 2. Eluálás A nem kötődött fehérjéket pufferrel kimossuk az oszlopból addig, amíg E280-on követve a frakciók fényelnyelését, az eluens fehérjét már nem tartalmaz. 3.5 ml-es frakciókat szedjünk (kb. 12 darabot). A megkötődött fehérje eluálását lineáris KCl gradiens elucióval végezzük. A gradiens előállítására két, hébercsővel összekötött egyenlő nagyságú főzőpohár szolgál, melyek közül az egyik 200 ml 1,0 M KCl-ot (Tris/HCl pufferben pH =7,7), a másik 200 ml KCl-mentes Tris/HCl pH = 7,7 puffert tartalmaz. Az utóbbi főzőpohárból – melyben az egyenletes keveredést mágneses keverő segítségével biztosítjuk – tápláljuk az oszlopot egy kapilláris csövön keresztül. Az első pohárból a másodikba való folyadékáramlás sebességét az oszlopból kifolyó folyadék sebessége szabja meg. Az eluálás során 30-35 db 3,5 ml-es frakciót gyűjtünk. Feladatok:

1.

Mérjük meg a 3,5 ml-es frakciók extinkcióját 280 nm-nél, és a vezetőképességüket!

2.

Ábrázoljuk az abszorpciót és a KCl koncentrációt a frakciók számának függvényében,

ugyanazon a grafikonon! A frakciók KCl koncentrációját kalibrációs egyenes alapján határozzuk meg 1M KCl oldatból, öt lépcsős hígítási sort készítve 0,05 M Tris/HCl puffer (pH=7,7) segítségével!

22

SPEKTROFOTOMETRIA Igen elterjedt vizsgálati módszer a színkép megfelelő tartományában fényelnyelő tulajdonságú vegyületek (anyagok) azonosítására és meghatározására. A módszer kis mennyiségű anyagok gyors és pontos mérésére alkalmas. A spektrofotometriát az alkalmazott hullámhossz tartománya szerint több csoportba oszthatjuk fel, a gyakorlatok során közülük kettőt használunk: - a látható fény tartományában végzett mérések, ahol az abszorpciós maximum 350-850 nm közé esik (színes anyagok), - az UV spektroszkópia, ahol az abszorpciós maximum 200 és 350 nm közé esik. - ebben a tartományban csak kvarcüveg küvetta használható. A spektrofotometria alkalmazása szerint is több csoportba osztható, ezek közül az alábbiakkal foglalkozunk: -

Anyagok minőségi azonosítása: különböző vegyületek fényelnyelése a külső elektronhéj

állapotától függ, a különböző lehetséges gerjesztett elektronállapotok közötti elektronátmenetek más és más hullámhossznál okoznak abszorpciós maximumot. Az abszorpciós maximum (ok) helye jellemző a megfelelő gerjesztett és alapállapotú elektronpályák közötti elektronátmenetre, így jellemző a megfelelő molekularészletre, sőt az egész molekulára is. Ha az abszorpciót a hullámhossz

függvényében

ábrázoljuk,

jellegzetes,

egy

vagy

több

maximumot

(és

értelemszerűen minimumot) tartalmazó, a vegyületre jellemző görbét kapunk, amelyet az illető anyag azonosítására is felhasználhatunk. -

A spektrofotometria legelterjedtebb alkalmazása fényelnyelő tulajdonságú vegyületek

mennyiségi meghatározása az anyag abszorpciós maximumához tartozó hullámhosszon. Ha a vizsgálandó anyagnak a kérdéses hullámhossz tartományban nincs fényelnyelése, valamilyen kémiai reakcióval gyakran fényelnyelő tulajdonságú vegyületté alakítható. A spektrofotometriás mennyiségi analízisek az oldatok fényelnyelésére vonatkozó Lambert-Beer törvényen alapulnak. A fényáteresztő képesség, vagy transzmisszió (T) egyenlő: valamely oldatból kilépő fény intenzitásának (I) aránya a beeső fény (I0) intenzitásához.

23

T=

I I0

Gyakorlatilag a fotometrálásnál nincs szükségünk a beeső I0 intenzitásának mérésére, hanem ehelyett mérjük a vizsgált oldatból kilépő fény viszonyát a tiszta oldószerből kilépő fényhez (Ib). Eszerint módosítva a

T=

I Ib

A transzmisszió tehát relatív érték, mely 1-nél mindig kisebb. Mérésnél a tiszta oldószerből kilépő fény intenzitását önkényesen 100-nak véve meghatározzuk, hogy ennek hány %-át bocsátja keresztül az oldat. Eszerint a

T%=

I ⋅ 100 Ib

Egy oldat transzmissziója függ: a)

az oldott anyag természetétől

b)

az alkalmazott fény hullámhosszától

c)

a fényt abszorbeáló anyag koncentrációjától.

A Lambert-Beer törvény szerint: T= 10-k l c k = az anyagra jellemző koncentráció vagy moláris fényelnyelési együttható (moláris extinciós koefficiens), mely egyenlő 1M oldat 1 cm vastag rétegénél mért fényelnyeléssel. c = koncentráció mólokban, l = rétegvastagság, melyen a fény áthatol, cm-ben. Az egyenlet logaritmálásával - log T = k l c = A (abszorbancia, extinkció)

24

Az (1) egyenletből ugyanezt az értéket kifejezve: - log T = 1og A 1og kifejezést abszorbanciának (A), extinkciónak (E) vagy optikai sűrűségnek (OD) nevezzük. Abszorbeáló anyagok oldatának extinkciós koefficiense olyan hullámhossznál, amelynél az oldószer nem abszorbeál, a Lambert-Beer-törvény szerint arányos az oldat koncentrációjával, ha az oldott anyag a hígítás alkalmával nem megy át molekuláris változáson. 1 cm-es küvetta (planparallel üvegből, vagy kvarcból készült mérőedény) használata esetén

c=

A k

Ha a mérendő anyag nem követi pontosan a Lambert-Beer törvényt, egyéb módon pontosan meghatározott koncentráció sorozat segítségével kalibrációs görbét készítünk. Ennek alapján megfelelő korrekcióval elvégezhetőek a mérések. Gyakorlatok: 1, A metilénkék oldat abszorpciós spektrumának felvétele. Anyagok és eszközök:

spektrofotométer küvettákkal, kémcső, pipetta, 0.01 %-os metilénkék oldat Az abszorpciós maximum megállapítása céljából felvesszük a metilénkék oldat spektrumát. Ezt elvégezhetjük szakaszos fotométerrel, vagy folytonos spektrofotométerrel. Az abszorpciós maximum megállapítása olyan módon történik, hogy egy alkalmas koncentrációjú metilénkék oldatot több hullámhosszon megmérünk. Az így kapott értékeket grafikusan ábrázolva (abszorbanciát a hullámhossz függvényében) megkapjuk az abszorpciós maximum helyét. 0.01 %-os metilénkék oldatból húszszoros hígítást készítünk. A hígított oldat abszorbanciáját megmérjük 500 és 675 nm között, legalább 5 nm-enként. A kapott abszorbancia értékeket grafikusan ábrázoljuk.

25

2, Ismeretlen koncentrációjú metilénkék oldat koncentrációjának meghatározása.

Ha egy adott anyag oldatára érvényes a Beer törvény, akkor ennek különböző koncentrációjú oldatait adott hullámhosszon mérve, a kapott abszorbanciának arányosnak kell lenni a koncentrációkkal. A 0.01 %-os metilénkékből hígítási sorozatot készítünk, a következő módon: hat kémcsövet megszámozunk, az 1-es számú kémcsőbe bemérünk 1 ml 0.01 %-os metilénkéket és feltöltjük 10 ml-re. A következő kémcsövekbe (2-6) bemérünk 5-5 ml desztillált vizet, ezután az 1es sz. kémcsőből 5 ml-t bemérünk a 2-es sz. kémcsőbe. Összekeverés után a 2-es sz. kémcsőből 5 ml-t bemérünk a 3-as számú kémcsőbe, majd a 3-asból összerázás után 5 ml-t a 4-esbe stb. Így minden kémcsőben fele olyan tömény metilénkék oldatot kapunk, mint a vizsgált kémcsövet megelőző kémcsőben. Az oldatokat fotometráljuk 625 nm-nél. A kapott extinkciókat a koncentráció függvényében ábrázoljuk. Feladat:

Határozzuk meg az ismeretlen hígítású metilénkék oldat koncentrációját.

26

FIZIOLÓGIÁS OLDATOK ÖSSZEÁLLÍTÁSA A szervezet normális működéséhez elengedhetetlen a homeosztázis fenntartása, melybe bele tartozik az ozmotikus viszonyok állandósága (isozmozis), a pH állandóság (isohydria) és az állandó ionösszetétel (isoionia) biztosítás is. A homeosztázisban bekövetkező változások a sejtek rendellenes működéséhez vezetnek. A testfolyadékok jellemezhetők ozmolaritásuk alapján, mely 1 dm3 oldatban megadja az ozmotikusan aktív ionok mennyiségét molban. Például 1 mol/l NaCloldat ozmolaritása: 2 osmol. Az emberi vér esetében az osmolalitás 300 mosmol. Feladat: 1, Készítsen fiziológiás só-oldatot emberek számára! Az ozmolaritás alapján számolja ki, mennyi NaCl-ot kell bemérni 100 ml desztillált vízhez, hogy isozmotikus só-oldatot kapjunk! 2, Készítsen 100 ml fiziológiás só-oldatot békáknak, melynek koncentrációja az emberi fiziológiás só- oldat 65%-a. Számolja ki az oldat ozmolaritását! Anyagok és eszközök: főzőpohár/ lombik, mérőhenger, vegyszer adagoló kanál, mérleg, mágneses keverő NaCl, desztillált víz Adatok: Na 23 g/mol; Cl 35,5 g/mol A gyakorlatban fiziológiás só-oldatot vér-térfogat pótlására, kiszáradás elkerülésére alkalmazzák. Ha a vérbe hipoozmotikus folyadék kerülne, az a sejtek duzzadását, a vörösvértestek kipukkadását (hemolízist) okozna. Ha viszont a vér töményebb, hiperozmotikus folyadékkal kerülne kapcsolatba, akkor a vörösvértestek vizet veszítenének, buzogány alakot vennének fel. Egyik esetben sem lennének képesek ellátni szerepüket, vagyis a légzési gázok szállítását a szervekhez. Az ozmotikus viszonyok fenntartása tehát nélkülözhetetlen az életben maradáshoz. A szervek normális működéséhez azonban a fiziológiás só-oldatban lévő Na+ és Cl- -on kívül egyéb ionok is elengedhetetlenek, úgymint Ca2+, K+ vagy HCO3-. A testnedvekéhez hasonló ion-összetételű, izozmotikus folyadék a Ringer-oldat. Komponenseinek koncentrációja fajonként eltérő. Feladat:

Számolja ki a béka-Ringer tömegszázalékos összetételét, ha a moláris összetétele: 0,111 mol NaCl 0,00268 mol KCl 0,0018 mol CaCl2 0,00595 mol NaHCO3 literenként. A pH 7,2.

27

Ezek alapján készítsen el 1 liter béka Ringer-oldatot! Anyagok és eszközök: főzőpohár, mérőkanál, mágneses keverő NaCl, KCl, CaCl2, NaHCO3, desztillált víz Adatok: Na 23 g/mol; Cl 35,5 g/mol; K 39 g/mol; Ca 40g/mol; C 12 g/mol; O 16 g/mol Ringer-oldat összetételének megváltoztatásával következtethetünk egyes ionoknak a sejtek működésében betöltött szerepére. A későbbiekben a kálcium hatását fogjuk vizsgálni béka izmon. Feladat: Készítsen 100 ml kálcium-mentes béka-Ringert. Anyagok és eszközök: főzőpohár, mérőkanál, mágneses keverő NaCl, KCl, NaHCO3, desztillált víz Mérleggel történő mérések alapja, hogy az ismeretlen tömeget ismert nagyságú tömegsorozattal hasonlítjuk össze. A laboratóriumi gyakorlatban a lemérendő test (anyag) tömegétől és a mérés kívánt pontosságától függően az összehasonlításhoz különböző nagyságú és szerkezetű, különböző érzékenységű mérleget használunk. Tulajdonképpen valamennyi kétkarú emelő. A hagyományos mérlegeken kívül elterjedtek újabban az elektronikus működésű félautomata és automata mérlegek is. A mérlegek jellemzői: -

méréshatár - az a maximális tömeg, amivel a mérleg terhelhető

-

érzékenység - az a legkisebb tömeg, amelyre a mutató egy osztással kitér,

-

pontosság - a valós tömeg és a mért tömeg közötti százalékos eltérés.

Táramérleget vagy laboratóriumi kézimérleget használunk, ha 0,01 g pontossággal akarunk mérni. Ezek méréshatára 100-500 g lehet. Az analitikai mérlegen 0,0001 g (0,1 mg) pontossággal mérhetünk. Ez a mérleg igen érzékeny, ezért üvegezett szekrényben tartjuk, hogy a portól, huzattól megvédjük. Méréshatára 100-200 g. Az egyszerű analitikai mérleg helyett a gyakorlatban manapság a hagyományos típusú, légfékes analitikai mérleggel találkozunk, amelynek érzékenysége kisebb ugyan (0,2-0,4 mg), de a mérést lényegesen meggyorsítja. Az igen érzékeny, 20 g méréshatárú mikroanalitikai mérlegen a milligramm ezredrészét (l µg = 10-6 g) is megmérhetjük. Mindegyik mérlegfajtához megfelelő pontosságú tömegminták, azaz mérőtest készlet (tömegsorozat) tartozik

28

Kétkarú mérleggel történő mérésnél a bal serpenyőre helyezzük a mérendő tömeget, a jobb serpenyőre pedig a súlysorozat megfelelő tagjait. A mérendő vegyi anyagot soha nem közvetlenül a serpenyőre helyezzük, hanem mérőedényben, óraüvegen, vagy bemérő csónakon mérjük le! A mérőtestek felhelyezésekor a mérleg mindig rögzített (arretált) állapotban legyen! Méréskor a mérőtesteket csak csont, vagy műanyag végű csipesszel szabad megfogni, sohasem ujjal, mert a legcsekélyebb szennyezés is hamis mérési adatokat eredményez! A mérőtesteket ne tegyük le a laboratóriumi asztalra, azok vagy a mérlegen, vagy a dobozban legyenek! A mérés megkezdése előtt meg kell vizsgálni a mérleg használhatóságát! A mérlegen található vízszintjelző buborék ellenőrzésével győződjünk meg a mérleg helyes felállításáról, valamint állapítsuk meg a mérleg egyensúlyi helyzetét, vagyis hogy terheletlen állapotban a mutató a nulla-ponton álljon be. Analitikai mérlegen történő mérésnél a mérés előtt 5-10 percig nyitva hagyjuk a mérlegszekrény ajtóit, hogy a szekrény levegője azonos állapotú legyen a környezet levegőjével. Szobahőmérsékletűnél melegebb tárgyat ne helyezzünk a mérlegre, mert a mérlegkarok egyenlőtlen felmelegedése sok hibát okoz! A mérés befejezése után a mérleg terhelését a lehető legrövidebb idő alatt szüntessük meg! A mérlegszekrényben a kiszóródott vegyszereket puha ecsettel szedjük össze! A kicsöppent folyadékot azonnal itassuk fel és alkoholos papírvattával töröljük át a szennyezett területet! Ha meghatározott mennyiségű anyagot kell lemérnünk, úgy járunk el, hogy először a bemérőedény (lombik, pohár, bemérő csónak) tömegét az előzőekben leírt módon meghatározzuk. Ezután a jobb oldali serpenyőre a kívánt anyagmennyiségnek megfelelő mérőtömegeket helyezzük, a bemérőedénybe pedig az anyagunkat. Az előre kiszámított skála-értékre további kevés lemérendő anyag elvételével, illetőleg hozzáadásával állítjuk be az egyensúlyi helyzetet. Légfékes mérlegeken gyorsabb a mérés, mert nem kell a lengéseket figyelni és megvárni, amíg a mutató lassan beáll az egyensúlyi helyzetbe. A serpenyőre szerelt légfék ugyanis gyorsan csillapítják a lengéseket, így az egyensúlyi helyzet pontosan és hamar áll be. Napjainkban a mérlegek már elektronikai elven működnek, és digitális kijelzésűek. A testre ható súlyerőt elektromos jellé alakítják, és a kijelzőn a tömeg közvetlenül leolvasható. A mérleg arretálása (kioldása) és az egyensúlyi nulla pont beállítása egy-egy gomb megnyomásával történik. A teljes mérési tartományon belül a mérleg a Tara gomb megnyomásával nullázható. A mérleg az egyensúlyi állapot elérést azzal jelzi, hogy a kiírt érték mellett megjelenik a mértékegység. Automata mérlegen történő mérés esetén a bekapcsolás után (ON gomb) a mérőedényt helyezzük rá a mérlegre. A tárázó gomb megnyomásával nullázzuk, majd bemérjük a kívánt mennyiségű vegyszert. A kijelző folyamatosan mutatja a tömegváltozást, a végleges tömeget a mértékegység megjelenésével jelzi. A mérés végeztével a mérőedényt leemeljük, a mérleget kikapcsoljuk.

29

Desztillált víz bemérésére használhatunk mérőhengert. Ez betöltésre hitelesített térfogatmérő eszköz. Mivel vizes oldatok esetén a meniszkusz homorú, így a mérőhenger beosztásának a folyadékfelület legmélyebb pontjával kell egybeesnie. A lombikot körkörösen mozgatva elősegítjük az oldódást. A keveredés biztosításához használhatunk mágneses keverőt is. A berendezés két részből áll: egy keverőből és egy mágneses keverőbotból. A lombikba beletesszük a keverőbotot, majd a keverő közepére helyezzük. A keverőmotor fordulatszámát tekerőgombbal szabályozhatjuk. Az

elkészített

oldatokat

lefedjük,

és

további

felhasználásig

hűtőben

tároljuk.

30

HÍGÍTÁSI SOROZATOK KÉSZÍTÉSE A hígítási sor egy kiindulási, ismert koncentrációjú törzsoldatból adott oldószer adagolásával készített, oldatonként egyre hígabb összetételű, egyre kisebb koncentrációjú oldatsor. Biológiai vizsgálatoknál egy anyag hatásos dózisának meghatározására használják az ilyen oldatsorokat, a kísérletek kezdeti fázisában szokványosan tízszeres lépésközökkel haladva. Készítéskor a kiindulási oldatból adott mennyiséget, például 10 ml-t veszünk ki, és tízszeresére hígítjuk, azaz 100 ml-re egészítjük ki az oldószerrel (1 sz. oldat; 10-szeres hígítás). Majd az elkészült 1. sz. oldatból veszünk 10 ml-t és 100 ml-re, jelig töltjük (2. sz. oldat, 100-szoros hígítás). És így tovább sorra elkészíthetjük a kívánt hígításokat. A hatásos dózist a hígítási sorozat tagjainak biológiai hatásából, hatásának erősségéből adhatjuk meg. Biológiai mintán a dózisok lépésenkénti csökkentése eredményezhet például fordított Ualakú hatásgörbét: a legkisebb és legnagyobb hígítások nem, vagy alig váltanak ki választ, míg a fordított

hatás erőssége

U közepén lévő koncentrációk hatásosnak bizonyulnak.

FORDÍTOTT ALAKÚ hígítás mértéke

U-

DÓZIS-

HATÁS GÖRBE

A következő gyakorlaton harántcsíkolt izmon, mint biológiai mintán fogunk vizsgálódni. A végtagizmok működését a gerincvelőből kilépő és az izmok membránjához (szarkolemma) futó motoros neuronok irányítják. A motoros idegsejt és az izom közti kapcsolatot neuromuszkuláris junkciónak nevezzük. Ez egy kémiai szinapszis, melynek neurotranszmittere az acetilkolin. Az acetilkolin a kolin ecetsavas észtere.

www.farmakologija.com

31

Az emberi szervezetben megtalálható még a vegetatív preganglionáris rostok, a posztganglionáris paraszimpatikus rostok végződésénél, valamint elterjedt mediátor anyag a központi idegrendszerben is. A motoros neuronon végigterjedő akciós potenciál hatására a vezikulák az ingerületátvivő anyagot kijuttatják a szinaptikus résbe, mely a posztszinaptikus oldalon, az izom membránján lévő nikotinos-acetilkolin receptorokon megkötődik, és depolarizálja a harántcsíkolt izmot.

Neuromuszkuláris junkció. Forrás: fourtee.apptechnc.net Az izom kontrakciójának előfeltétele azonban akciós potenciál kialakulása. Tehát akkora nagyságú depolarizációt kell létrehozni, mely eléri az akciós potenciál kiváltásának küszöb-feszültségét. A küszöb-érték elérésekor akciós potenciál mindig kialakul és az izom ennek következtében mindig összehúzódik. Az izomrostok minden vagy semmi törvénye szerint működnek, vagyis ha küszöbértéket meghaladó inger éri a rostot, arra maximális összehúzódással válaszol. Több izomrostból felépülő izmokra viszont ez a törvény már nem vonatkozik, ugyanis az egyes izomrostok ingerküszöbe eltérő. A küszöb eléréséhez megfelelő mennyiségű acetilkolin jelenléte szükséges. Hasonló hatás érhető el acetilkolin receptor agonisták alkalmazásával, például nikotinnal, fenil-trimetil-ammóniummal. A nikotin a Nicotiana tabacum leveleinek alkaloidja, 1928-ban izolálták.

32

A nikotin volt az az anyag, amelynek segítségével a ganglionális átkapcsolódás mechanizmusát Langleg 1889-ben felfedezte. Nagyon toxikus, ezért terápiás jelentősége nincs. A nikotin színtelen, lúgos kémhatású, olaj sűrűségű, jellegzetes szagú folyadék, amely fény hatására megbarnul. Vízben és zsírokban oldódik, savakkal vízoldékony sókat képez. A bőrön keresztül és belélegezve is felszívódik. A halálos adag 20-60 mg.

A nikotin képlete. www.tocris.com Ha az acetilkolin receptorok működését gátoljuk, akkor nem tapasztalható izom kontrakció. Kísérletekben alkalmazható a d-tubokurarin, mely az acetilkolin kompetitív antagonistája. DélAmerikában az Amazonas és Orinoco környékén élő bennszülöttek ősidők óta készítették a kurarénak nevezett, igen hatékony nyílmérget a Strichnos-félék kérgéből.

33

Strychnos guianensis www.tropilab.com A kurare több rokon alkaloida gyűjtőneve. Közülük a legjelentősebb a tubokurarin. A kurare hatás lényege, hogy a motoros véglemezen az acetilkolin receptorokhoz kötődik és meggátolja az ingerületátvivő anyag kapcsolódását. Izomrelaxáns hatása emberre is veszélyes lehet, mert gátolja a rekeszizom működését, így légzésbénító hatású. Tubokurarin-klorid formában hozzák forgalomba.

www.tocris.com

Feladat:

Az említett anyagok hatásos dózisának meghatározása érdekében készítsen belőlük hígítási sort! 1.) Az előző gyakorlaton elkészített normál Ringer-oldat felhasználásával hígítsa az acetilkolint 102-106-ig, 10-szeres lépésekkel haladva. Az öt különböző hígítás mindegyikéből 10-10 ml-re lesz szükség. 2.) Hasonló módon készítsen öt lépésben 10-104-ig Ringerrel higított d-tubokurarin oldat-sort, valamint 3.) 10-104-ig higított nikotin oldatsort.

34

Anyagok és eszközök: kémcsövek, pipetták béka-Ringer, acetilkolin törzsoldat, d-tubokurarin törzsoldat, nikotin törzsoldat. Kisebb mennyiségű folyadék térfogatának pontos mérésére szolgálnak a különböző pipetták. Főbb típusaik: az egy-, illetve két-körjeles hasas-, valamint az osztott- és a mikro-pipetta. Egyre elterjedtebbek az ún. a u t o m a t a - p i p e t t á k is. Ezek cserélhető, kb. 10 cm hosszúságú és 1 cm átmérőjű, végükön beszűkített műanyag szívócsővel (pipetta-hegy) ellátott dugattyús megoldású eszközök, amely vagy adott térfogat kimérésére szolgálnak (fix térfogatú), vagy kisebb intervallumban (pl. 1-5 cm3) beállítható a kívánt folyadéktérfogat is (változtatható térfogatú). Pontosságuk kissé elmarad a hagyományos üveg eszközökétől (kb. ±2%). A gyorsaság és a kiváló ismételhetőség azonban nagyon előnyös sorozatmérések esetén, így jól helyettesítik az osztott-pipettát. Automata pipetta használatakor először tiszta, száraz pipetta-hegyet helyezünk fel, majd a kívánt térfogatértéket állítjuk be (ez legtöbbször egy rögzíthető kis csavar eltekerésével valósítható meg). Ezután a marokra fogott eszközből a dugattyú segítségével kinyomjuk a levegőt, folyadékba merítjük és hüvelykujjunk lassú emelésével teleszívjuk a pipettát. A dugattyú ismételt lassú megnyomásával engedjük ki a folyadékot, egészen ütközésig lenyomva, miközben a pipetta végét az edény falához érintjük. A pipetta-hegyben mindig marad némi folyadék, amit nem távolítunk el. Használat közben figyeljünk, hogy a pipetta hegye ne érintkezzen az oldószeren kívül mással, ellenkező esetben cseréljük le. Egyes automata pipettákon külön gomb lenyomásával a pipettahegy eltávolítható. Használaton kívül lehetőleg állványon tároljuk! Mivel mérgező vegyi anyagokkal dolgozunk, tartsuk be a munkavédelmi előírásokat! Az előírások betartása mindenkinek a legszigorúbban vett egyéni érdeke, de a laborvezető köteles is mindenkivel betartatni. Vegyszergőzök ellen használjunk szellőző berendezést, és minden műveletet fülke alatt végezzünk. A nikotin bőrön keresztül is felszívódhat, ezért puszta kézzel ne fogjuk meg, hanem használjuk a megfelelő laboratóriumi eszközöket! Ha mégis a bőrre jutna, akkor azonnal mossuk le! A tubokurarin emésztőrendszeren keresztül felszívódva mérgez. Gondosan ügyeljünk arra, hogy ne jusson a szánkba. Ezért a laboratóriumban szigorúan tilos enni, inni és dohányozni! Ha mégis a szánkba kerül, akkor öblítsük ki bő vízzel. Ha már a gyomorba jutott, akkor azonnal hívjunk orvost! Munka közben ügyeljünk a rendre és a tisztaságra! Ha a mérgező oldatok kifolynak, akkor célszerű bő hideg vízsugárral felmosni. Tilos a mérgező anyagokat a lefolyóba önteni. Gyűjtsük őket össze az arra kijelölt tárolóedénybe! Mindenféle kárt és balesetet azonnal jelenteni kell a laborvezetőnek! Az

elkészített

oldatokat

lefedjük,

és

további

felhasználásig

hűtőben

tároljuk.

35

BIOASSAY VIZSGÁLAT Az előző két gyakorlaton elkészített oldatok hatását biológiai mintán fogjuk megvizsgálni, mely béka izolált sartorius izma (szabóizom) lesz. A tapasztalatok alapján megismerhetünk néhány tényezőt, mely az izom kontrakciót befolyásolja. Izolált m. sartorius preparátum készítése a következő módon történik. A békát dekapitáljuk, gerincvelőjét bonctűvel elroncsoljuk, miután is a végtagok elernyednek, tónustalanokká válnak. A békát hátára fektetjük, a has bőrét és az izmokat haránt irányban átvágjuk, a symphysist szabaddá tesszük. Mindkét combtőnél a bőrt körbevágjuk, majd lenyúzzuk a lábról. A symphysist éles ollóval középen átvágjuk, vigyázva, hogy a sartorius izom rostjait meg ne sértsük. A térdizületnél, a sartorius inas vége alá fonalat húzunk és megkötjük, de úgy, hogy az izomrostok ne essenek a lekötésbe. A hurok alatt az inat elvágjuk, az izmot pedig a fonallal emelve egészen a medencei eredéséig felfejtjük. A rövid eredési ín alá is fonalat vezetünk és átkötjük, majd az izmot levágjuk.

Béka m. sartorius preparálása. Forrás: Fehér Ottó: Összehasonlító élettani gyakorlatok és bemutatások. A sartorius izom egyik végére kötött fonalat erősen meghurkoljuk, majd a sartorius-edény alsó részén lévő horogra akasztjuk. Az izom másik végén lévő fonallal az izmot a sartorius-edény nyitott végén át az állványra rögzített transzducer érzékelő nyelvéhez csatlakoztatjuk. A sartorius-edény végére gumicsövet húzunk, szorítóval elzárjuk, és normál Ringer-oldattal töltjük fel. A szorító segítségével eresztjük majd le a felül betöltött különböző oldatokat. A transzducer erő-feszültség átalakító berendezés: az izom összehúzódásait, mechanikai munkáját elektromos jelekké fordítja. Az erő-feszültség transzducert analóg-digitális konverterhez kötjük, mely a transzducer analóg jelét a számítógép számára értelmezhető digitális jellé alakítja. Az analóg jelek megszakítás nélküli, folytonos jelek, mint például a mutatós óra. A biológiában analóg szignálnak tekinthetjük az idegi akcióspotenciálok időben gyorsan változó feszültségét, vagy a membránpotenciál

36

lassú változását is. A számítógépes felhasználás érdekében ezeket a jeleket digitalizálni kell, ami általában az időben változó mennyiségek diszkrét értékekben, számokban való megjelenítését jelenti. A digitalizálással lehetőség nyílik az adatok tárolására, átalakítására, akár továbbítására is. A számítógépben történik az adatok grafikus megjelenítése is.

Kísérleti összeállítás: TRANSZDUCER

SARTORIUS-EDÉNY

A/D KONVERTER

COMPUTER

INGERLŐ

Feladat:

A vizsgálat során a sartorius edényben adott sorrendben cserélje ki az inkubáló oldatokat: 1.

normál béka-Ringer

2.

béka fiziológiás só-oldat

3.

kálcium mentes Ringer

4-8. acetilkolin hígítási sor (a leghígabbtól kezdve). 9-13. d-tubokurarin hígítási sor (a leghígabbal kezdve) 14-18. nikotin hígítási sor (a leghígabbal kezdve) Figyelje meg az izom spontán kialakuló kontrakciós válaszait! 1., 3., 9-13. inkubáló oldatok leeresztése után az izom felső, edényből kilógó részét az ingerlővel direkt módon, növekvő erősségű egyes ingerekkel ingerelje, és vizsgálja a számítógépen regisztrált kontrakciókat! Jegyezze fel, mely oldatkoncentrációknál tapasztalható izom összehúzódás! Minden oldat használata után normál Ringerrel mossa át a preparátumot, mert így elkerülhető a sartorius irreverzibilis károsodása!

37

Ringer-oldat esetén egyes ingerekre rángásokkal válaszol az izom. Fiziológiás só-oldat hatására az izom fibrilláris rángásokat végez, mert bizonyos nélkülözhetetlenül fontos ionok hiányoznak az oldatból. Kálcium mentes Ringerrel kezelt sartoriuson szintén fibrilláris rángások tapasztalhatók, ingerlékenysége fokozódik. Normál Ringer adásával a hatás megszüntethető. Acetilkolin bizonyos hígítása spontán, lassú, reverzibilis, tartós kontrakciót eredményez. Ugyanez tapasztalható adott koncentrációjú nikotin-oldat esetén is. Ez bizonyítja, hogy a harántcsíkolt izom kontrakcióját az acetilkolin transzmitter kiváltja, és hatása nikotinos acetilkolin receptorokon keresztül történik. A tapasztalatot megerősíti, hogy a tubokurarin egyik hígítása sem okoz önmagában összehúzódást, az izom csak direkt módon ingerelhető. Ha még működőképes a preparátum, akkor vizsgáljuk meg az acetilkolin és tubokurarin egymást antagonizáló hatását. 1%-os tubokurarin oldattal töltsük fel a sartorius edényt, és fél órán át inkubáljuk benne az izmot. Majd cseréljük ki az antagonistát az acetilkolin azon dózisával, mely korábban összehúzódást váltott ki a preparátumon. Figyeljük meg az izom válaszát! A d-tubokurarin az acetilkolin kompetitív antagonistája: a nikotinos acetilkolin receptorokhoz bekötődve, nem engedi a transzmitter kapcsolódását. Ezért nem tapasztalhatunk kontrakciót! A kompetitivitást meghatározza az anyagnak a receptorhoz való kötődési affinitása.

38

TÁPTALAJOK A mikrobák vizsgálata tenyésztés közben vagy tenyésztés után történik. A tenyésztésre táptalajokat használunk. A mikroorganizmusok tápanyagszükségletüket a táptalajból fedezik. A különböző mikróbák tápanyagigénye rendkívül változatos lehet, de vannak olyan táptalaj összetevők amelyek alapvetően szükségesek. A tápközeg komponensei két fő részből állnak: Esszenciális összetevők Járulékos összetevők: -víz→ oldószer -prekurzorok -energiaforrás→ redukált, nagy energiatartalmú vegyüetek -vitamiok -szén-forrás -nitrogén-forrás -ásványi anyagok→ enzimek A táptalajok osztályozása különböző szempontok alapján történhet. Halmazállapot szerint 1. Folyékony táptalajok: a tápoldat komponensek összemérése során a szilárdító anyagot kihagyjuk (táplevesek, tápoldatok). 2. Szilárd táptalajok: a folyékony táptalajt szilárdító anyaggal egészítjük ki.

Szilárdító anyagok az alábbiak lehetnek: A) Agar-agar: poliszacharid, 1-3%-ban használatos (1% lágyagar), dermedéspontja koncentrációtól függően 38°C feletti, tengeri moszatokból készítik, csak igen kevés mikroorganizmus hidrolizálja. B) Zselatin: polipeptid, 10-30%-ban használatos, dermedéspontja a koncentráció függvénye, számos mikroba bontja. C) Szilikagél: előnye, hogy szerves anyagokat nem tartalmaz. A táptalaj készítése időigényes. Ritkán alkalmazzák, általában kemolitotróf mikroorganizmusok tenyésztésekor. Felhasznált anyag szerint 1. Természetes táptalajok: szerves eredetű anyagok, melyeknek pontos összetételét nem ismerjük, pl. húsfőzet, élesztő kivonat, maláta, melasz, gyümölcslevek, tej. 2. Szintetikus táptalajok: összetételüket pontosan ismerjük. 3. Félszintetikus táptalajok: természetes és szintetikus összetevők keverékei.

1.

Az alkalmazott tápanyagkomponensek szerint Alaptáptalajok: a növekedéshez szükséges alapanyagokon kívül

(esszenciális összetevők) speciális adalékanyagokat nem tartalmaznak, pl. T1 – univerzális táptalaj

39

2. Szelektív táptalajok: alaptáptalaj + szelektív gátlóanyag (pl. antibiotikum). Egyes mikroba csoportok visszaszorítását célozzák. 3. Differenciáló vagy indikátor táptalajok: alaptáptalaj + indikátor anyag, amely speciális anyagcsere reakciókat jelez (pl. laktóz bontás, savképzés). 4. Speciális táptalajok: különböző vizsgálatok céljainak megfelelően, vagy különböző speciális igényű mikrobák számára összeállított táptalajok. Táptalaj készítés: először a szilárd alkotókat mérjük be, majd feloldjuk nem teljes térfogatban. Oldódás után állítjuk be a végleges térfogatot. A pH érték beállítása 5%-os HCl ill. 5→%-os NaOH-dal történik finomskálás indikátor papírral vagy műszerrel történő ellenőrzés mellett,

majd autoklávozunk. Autoklávozás után az agar tartalmú táptalajok pH-ja 0,1-0,5 pH értékkel csökken a szilárdító anyag enyhe hidrolízise és változása miatt. Agar tartalmú táptalajok nyomás alatt sterilezhetők, zselatin tartalmúak csak áramló gőzben (nyomás alatt erős hidrolízis következik be). A hőérzékeny táptalaj komponenseket szűréssel való sterilezés után adjuk az autoklávozott és megfelelően lehűtött alaptáptalajhoz. TENYÉSZTÉSHEZ HASZNÁLT EDÉNYEK Minden tenyésztéshez használt laboratóriumi edényt a táptalaj kifejtése előtt vattadugóval kell ellátni (gyapot- vagy papírvatta egyaránt használható). Kémcsövek: folyékony táptalajból 5 ml mérendő be. Szilárd táptalajból magas agar esetén 10

ml, ferde agarhoz 5 ml szükséges. A ferde táptalaj készítésével célunk a nagyobb felület biztosítása. Lombikok: Erlenmeyer-lombikban és talpas gömblombikban létrehozhatunk folyadéktenyészetet, de önthetünk lemezt és ferde táptalajt is.

40

A kémcső mint tenyészedény

Erlenmeyer-lombik mint tenyészedény

41

Roux-plack

Kolle-csésze

Speciális tenyészedények: a Roux-palack és a Kolle-csésze . A fenti edényféleségek (beleértve a nem speciális Erlenmeyer-lombikot is) mind szilárd, mind nyugvófelszínes folyadékkultúra nevelésére alkalmasak (a táptalaj rétegvastagsága kicsi, felülete nagy). A tenyészedényeket a táptalaj betöltése után vattadugóval zárjuk, majd autoklávozással sterilezzük. Célszerű az edényeket papír, celofán vagy alufólia "sapkával" ellátni sterilezés előtt, nehogy az autokláv gőzterében a vattadugók átnedvesedjenek. Petri-csésze: a leggyakrabban használt laboratóriumi tenyészedény. A táptalaj kiöntése előtt szárazon sterilezzük. A táptalaj kiöntésekor a fedőt csak a szükséges mértékig emeljük. A 9–10 cm átmérőjű csészébe 20-25 ml táptalaj szükséges. A tenyészedényeket az alábbiak szerint jelöljük: 1.) a mikroorganizmus neve és laborkódja, 2.) az oltás dátuma, 3.) a táptalaj típusa, 4.) a gyakorlat száma, 5.) a kivitelező neve.

Petri-csésze A fermentor olyan változatos méretű tenyészedény, amely gépi segédletekkel a tenyészetek nevelésére használható, ahol a tenyésztés körülményeit megfelelő ellenőrző rendszerekkel tudjuk biztosítani. A tápoldatban szaporodó mikroorganizmusok homogenitását keveréssel, oxigénnel való egyenletes ellátásukat steril levegőbefúvással érjük el.

42

OLTÓESZKÖZÖK Oltótű és az oltókacs: hőszigetelt végű, leégethető fémnyelű (Kolle-nyél) tűzálló fémtűvel vagy hurokkal (kaccsal) ellátott eszköz. Sterilezése lángban, leégetéssel történik. Mikrotiterkacs: a hurok helyett kalibrált térfogatú fémkosara van, amely ismert térfogatú folyadék (szuszpenzió) átvitelére alkalmas.

Oltótű, oltókacs Pipetták: Folyadéktenyészetek ismert térfogatának átoltására használhatók az üvegpipetták,

amelyeket fémdobozban, vagy alufóliába csomagolva száraz hővel sterilezzük. Biopipetták: (automata pipetták) különböző térfogat adagolására alkalmas (rögzített, vagy szabályozható méretű) eszközök, cserélhető sterilezhető műanyag pipetta heggyel.

43

STERILEZÉS A tiszta tenyészetekkel végzett munkák előtt az eszközökön, tenyészedényekben, tápközegben lévő mikrobákat el kell pusztítani. Sterilezés során minden mikróbát elpusztítunk. A dezinficiálás pedig csak a kórokozó mikroorganizmusok elpusztítását jelenti. A sterilezésnek különböző módjai vannak. I. Fizikai módszerekkel történő sterilezés A) Sterilezés hővel •

Leégetés lánggal: oltótű, oltókacs esetében alkalmazzuk átoltások során.

•

Száraz hővel: üveg, fémeszközöket, pl. pipettákat, Petri-csészéket sterilezünk így. A

hőlégsterilizálók megadott hőmérsékletre állítható önreguláló elektromos berendezések. A sterilezés időtartama 4 óra 140°C-on vagy 2 óra 160°C-on. •

Nedves hővel




Pasteurözés: magas hőmérsékleten (60-96°C) a vegetatív sejtek nagy részének elpusztítása,

időtartama 1-40 perc, pl. 65°C – 30 perc; 85°C – 5 perc. Hátránya, hogy a Clostridium spórák túlélik.


Arnoldozás: sterilizálás áramló gőzben 100°C-on 20-30 percig. Ekkor a vegetatív sejtek

elpusztulnak, a spóráknak azonban csak egy része. Kivitelezése le nem zárt autoklávban vagy szelep nélküli kuktafazékban történik.


Tyndallozás: három egymást követő napon arnoldozunk. A kezelések közötti időben a spórák

kihajtanak és elpusztíthatók (frakcionált csíramentesítés). Hőérzékeny tápkomponensek esetén (pl. zselatin) alkalmazhatjuk.


Autoklávozás: sterilezés nyomás alatt (autokláv). A leggyakrabban alkalmazott körülmények:

120°C, 1,0 atmoszféra túlnyomás, 15-30 perc. Egy adott nyomáson elérhető hőmérséklet az autoklávtérben a levegő és gőz arányától függ. túlnyomás (atm)

gőz teljes levegő (°C)

gőz 1/2 levegő (°C)

gőz levegő nélkül (°C)

A

0,66

90

105

115

1,00

100

112

121

1,66

115

124

130

2,00

121

128

135

sterilezésre

használt

berendezésének

megfelelő

működését

ismert

hőtűréssel

rendelkező

mikroorganizmusokkal ellenőrizetjük, pl. autokláv esetén→ B. stearothermophilus; hőlég estetén→ Bacillus speciesek.

44

Szimplafalú autokláv kezelése: 1. Ellenőrizzük, hogy van-e megfelelő mennyiségű víz az autoklávban. 2. Behelyezzük a sterilizálandó anyagokat (edény, eszköz, tenyészet). 3. Lezárjuk az autokláv fedelét, szorítócsavarokkal egyenletesen leszorítjuk. 4. Ellenőrizzük, hogy a gőz-szelep nyitva van-e.

5. Bekapcsoljuk az autokláv fűtését. 6. Megvárjuk, amíg az autokláv felmelegszik. A gőzszelepet csak az intenzív gőzkiáramlás megindulása után 2-3 perc múlva zárjuk el. 7. Bekapcsolt autoklávot magára hagyni tilos! A nyomás emelkedésekor ellenőrizzük, hogy a biztonsági szelep működik-e. 8. A kívánt nyomásérték elérésekor az autoklávot 20 percen keresztül megfelelő hőmérsékleten tartjuk, majd a fűtést kikapcsoljuk. 9. Megvárjuk amíg a túlnyomás nullára csökken. Nyitjuk a gőz-szelepet, majd az autokláv fedelét. Vigyázzunk! A felszálló gőz éget! A duplafalú és automata autoklávok kezelése a készülékekhez mellékelt használati utasítás szerint történik.

l. gőz-szelep, 2. nyomásmérő, 3. biztonsági szelep, 4. hőmérő, 5. fedél, 6. vízszintjelző, 7. rakfelület, 8. fűtőtest, 9. vízszint

Gyakorlatainkban gyakran alkalmazunk autokláv helyett kuktafazekat sterilezésre. Így is teljes csírátlanítás érhető el. A kuktafazékba desztillált vízet kell tölteni kb. kétujjnyi magasságban, behelyezni az eszközöket, majd lezárjuk és gázlánggal melegítjük a kuktát. A forrástól számítva 20 percig sterilezünk. 45

B) Sterilezés UV-sugárzással: különböző sugárzások (Röntgen-, radioaktív-, UV-sugárzás)

csíraölő hatásúak. A gyakorlaton 260-265 nm sugárzási maximumú UV (germicid)-lámpákkal sterilezünk. C) Sterilezés szűrőkkel: folyadék sterilezésére vagy folyadék és szilárd táptalajok hőérzékeny

komponenseinek csíramentesítésére szűrőket alkalmazunk. • Abszorpciós szűrők: Chamberland (zománc nélküli porcelán), Berkefeld (kovaföld), Seitz (azbeszt); ezek egy idő után telítődnek. • Pórus szűrők: leggyakrabban a szinterüveg (zsugorított porózus üveglemez) szűrők és a membránszűrők használatosak. A bakteriológiai szinterüveg szűrők között legismertebb a G-5 jelzésű szűrő, 0,1µm pórusátmérővel. A membránszűrők anyaga különböző szerves polimer lehet: leggyakrabban a 0,22 vagy a 0,45 µm pórusátmérőjű készítményekkel dolgozunk

(Millipore- vagy Sartorius szűrők). A baktériumok eredményes szűréséhez max. 0,3 µm pórusátmérőjű szűrőt használjunk. A szűrés elősegítésére vízlégszivattyút, olajlégszivattyút, vagy fecskendőhöz hasonló nyomópumpát alkalmazunk.

l. szűrőtölcsér, 2. szűrőlap 3. gumidugó, 4. szívópalack 5. vattazár

l. dugattyú, 2. fecskendőház 3. szűrőtartó, 4. szűrőlap, (membrán)

46

D) Sterilezés ultrahanggal: Ritkán alkalmazott eljárás. II. Sterilezés kémiai úton

A kemikáliák fehérjékkel és egyéb sejtkomponensekkel való reakciók révén fejtik ki sterilező hatásukat. A hatás a koncentráció és az idő függvénye. Alkalmazhatók nehézfémsók (HgCl2, AgNO3), oxidálószerek (KMnO4, H2O2), halogének (klór, jód), szerves oldószerek (pl. 70%os etanol, dimetilszulfoxid), a fenol 3%-os vizes oldata (karbol), a formalin 3%-os vizes oldata; gáz (etilénoxid). Felületaktív, zsíremulgeáló kation szappan, membránkárosító, spórákat nem öl. A neomagnol (benzol-szulfonkloramid-nátrium) 0,1%-os vizes oldatában a keletkező NaOCl a fehérjék aminocsoportjait klórozza. Megfelelő koncentrációban sporocid. Hatástalanítja a toxinokat is. Steril oltófülke

Használata a táptalajoknak steril edényekbe való kifejtésekor, Petri-csészékbe történő lemez készítésekor, ezek leszárításakor, valamint oltási műveletek végzése esetén ajánlatos. Különösen Petri-csészék, illetve folyadéktenyészetek, hosszú tenyészidőre beállított kultúrák inokulálását célszerű a steril fülkében elvégezni. Az ún. "biohazard" típusú oltófülke lényege, hogy a levegő a beépített szívó és nyomóhatást kifejtő elektromotorok hatására a fülke hasznos belső terének tetején elhelyezett szűrőn keresztül csíramentesen kerül a munkatérbe, ott lefelé áramlik, majd a lyuggatott munkalapon keresztül elhagyja a munkateret. Az ismételt steril szűrőn való átjutás előtt egy előszűrőn halad át a levegőáram. Ez a mozgásirány, valamint a munkatér és a külvilág határfelületén egyéb segédberendezések (kiküszöbölendő az örvénymozgást) megakadályozzák, hogy a fülkébe a külső térből bárminemű szennyezés, fertőzésforrás bekerülhessen, egyben megakadályozza a munka során a belső térben használt mikroorganizmusok kikerülését is. A steril fülkék ezen típusa alkalmas a patogén mikroorganizmusokkal való munkára is.

47

A MIKROORGANIZMUSOK TENYÉSZTÉSE A mikrobákat kontrollált körülmények között kell tenyészteni. Fontos az optimális hőmérsékleten való tartás a gyors növekedés biztosítása érdekében. Erre a célra termosztátokat használunk (duplafalú, vízköpennyel, önreguláló elektromos fűtéssel ellátott szekrények). A mikróbák különböző levegőztetést igényelnek. Az aerob szervezetek nevelésekor – ha azok nem szilárd táptalaj felületén nőnek – a megfelelő levegőztetésről körkörös rázatással vagy fermentorban való tenyésztéssel gondoskodhatunk. A rázógépek termosztálását vízfürdő segítségével vagy száraz levegő befúvással biztosítjuk. Anaerobok esetén oxigén elvonást, illetve reduktív körülményeket kell a tápközegben biztosítani. Az egyes mikroorganizmusok tápnygszükséglete eltérő, ezért tenyésztéskor a megfelélő táptalajt kell alkalmazni. Végül pedig a tenyésztési időt is figyelembe kell venni, mivel ez is más-más az egyes mikróbáknál (baktériumoknál 1-2 nap, élesztőgombáknál 2-3 nap, penész- ill. fonalasgombáknál 1 hét). MIKROSZKÓP-ISMERET Ebben a fejezetben röviden áttekintjük a mikroszkóp használatával kapcsolatos tudnivalókat. Mikroszkópunk binokuláris tubussal, keresztasztallal, négy revolverváltóval, cserélhető achromát objektívvel, két pár okulárral rendelkező készülék. A fényforrás beépített alacsonyfeszültségű lámpa (10. ábra). Az objektíveken néhány jellemző érték van feltüntetve, pl.:

nagyítás

HI 100/1,25 olajimmerzió (WI - vízimmerzió Glyc - glicerin immerzió)

160/0,17

numeriks apertura fedőlemez vastagsága

tubushossz

Az első szám az objektív nagyítóképességét jelzi, ha a tubus hossza mm-ben az alatta lévő számmal (160) egyenlő. Az első sorban a törtvonal utáni szám az objektív numerikus aperturája. A második sorban a törtvonal utáni szám azt a fedőlemez vastagságot jelzi mm-ben, melynél a felette lévő numerikus apertura érték érvényes. A legnagyobb nagyítású objektíven a nagyítást jelző szám előtt álló HI a "homogén immerzió" szavak rövidítése. Azt jelzi, hogy ennél az objektívnél a jelzett numerikus apertura és

48

nagyítás értékek akkor érvényesek, ha az objektív frontlencséje és a preparátum között nem levegő van (mint a többi, úgynevezett száraz-objektívnél), hanem immerziós olaj (cédrus olaj vagy anizol), melynek fénytörése az üveg fénytörésével azonos. Az okulárokon jelzik a nagyítóképességet és (kis körbe írva) az ún. mező számot (lásd később). Műszerünk teljesítőképességét a fenti adatok alapján egyszerűen kiszámíthatjuk. A feloldóképesség annak a legkisebb tárgynak az átmérője, amelyet a műszerrel még éppen felismerhetünk. A feloldóképesség (F) a megvilágításra használt fény hullámhosszától (λ) és az objektív numerikus aperturájától (NA) legkedvezőbb megvilágítási viszonyok esetén az alábbi képlet szerint függ: λ F = ––––––– 2 x NA A numerikus apertura a tárgy és az objektív frontlencséje között lévő közeg törésmutatója (n) valamint a frontlencse félnyílásszöge (α) sinusának a szorzata: NA = n x sinα α

A nyílásszöget a tárgy egy pontjából a frontlencse széleihez húzott két egyenes adja (élesre állított kép esetén!). A sinα maximális értéke 1; gyakorlatban 0,95 az elérhető érték, ekkor a teljes nyílásszög kb. 140°. Száraz objektíveknél n = 1 (levegő) homogén immerziós objektíveknél n = 1,51. (cédrusolaj) Számításainknál a fény hullámhosszát 500 nm-nek vegyük; ez az emberi szem által legjobban érzékelhető, világoszöld színű fény hullámhossza. A mikroszkóp nagyítása az objektív nagyításának és az okulár nagyításának szorzata. Az objektíven jelölt nagyítás 160 mm tubushosszra vonatkozik. Egyes mikroszkópoknál a binokuláris tubus 160 mm-nél hosszabb; ebben az esetben a nagyítás kiszámításánál a binokuláris tubuson látható faktorral (1,6x) is szorozni kell. Azt, hogy a mikroszkóp látómezejében megfigyelt terület mekkora a valóságban, kiszámíthatjuk, ha az okuláron jelzett mezőszámot elosztjuk az objektív nagyításával, így mmben kapjuk a kérdéses kör átmérőjét. Természetesen a tubushosszat itt is figyelembe kell vennünk. A binokuláris tubust mindenki beállítja a saját pupillatávolságára, a tubuson lévő 55től 75-ig számozott skála a pupillatávolságot jelzi mm-ben. A binokuláris tubuson korrigálható a két szem közötti esetleges dioptriakülönbség. A bal szemet behunyva a képet a mikrométer-gombbal élesre állítjuk, majd a jobb szemet behunyva a képet a tubuson lévő gyűrűvel állítjuk élesre. Akiknél a két szem egyforma, a 0-jel vonása egybeesik a tubus oldalán lévő vonással. Az élesre állítást úgy végezzük, hogy oldalról ellenőrizve először a tárgyasztalt a durvabeállító gombbal az objektív felé közelítjük, míg az objektív a preparátumot csaknem érinti, majd a

49

mikroszkópba nézve a tárgyasztal süllyesztésével (előbb a durvabeállítóval, majd amikor a kép már látszik, a mikrométer gombjával) állítunk élesre. A mikroszkópos kép jó minőségét és egyenletes kivilágítottságát a lámpa égőjének és blendéjének, a kondenzor magasságának és blendéjének megfelelő beállításával, továbbá a kondenzorba homályos üveg illetve színszűrő behelyezésével igyekszünk elérni. A kondenzor alsó részén található, kihajlítható lencsét csak a 6,3x-os nagyítású objektívvel kapcsolatban iktassuk be. A mikroszkóphoz csatlakoztatható fáziskontraszt berendezés, sötétlátóteres kondenzor és UV-fényforrás is (lásd a megfelelő gyakorlatokat). Mikroszkópos fotózás Amikor a mikroszkópozás során látott képet rögzíteni akarjuk, akkor szükségessé válik a mikroszkóp és a fényképezőgép (kamera) összekapcsolása. Ez történhet egyszerű mechanikai úton, de az összekapcsoláskor közbeiktathatunk különböző típusú automatikus rendszereket elsősorban a vizsgált tárgyon áthaladó fény mérésére, és az ehhez szükséges expozíciós idő

automatikus mérésére. Gyakorlatunkban a BA2 típusú fénymérő és exponáló automatát használjuk. Ezen keresztül csatlakoztatjuk a kamerát a fáziskontraszt mikroszkóphoz. (Többféle típusú kamera használható mikroszkópos fotózáshoz, ha a normál fényképezőgép optikáját eltávolítva illeszteni tudjuk a mikroszkóphoz.) Az exponáló automata segítségével különböző fedettségű, sötét illetve világos, jól megvilágított és gyenge világítottságú preparátumról készíthető jól exponált film. Az automata fénymérő üvegszál optikán beméri az adott preparátum megvilágítási viszonyait és ennek megfelelően vezérli a felvétel expozíciós idejét (ez a másodperc tört részeitől 5-6 perc hosszúságú lehet). A fényképezésre szánt mikroszkópos preparátummal szemben magas minőségi követelményeket támasztunk: l.) A tárgylemezek, fedőlemezek teljesen tiszták, karcmentesek és optikailag is megfelelőek legyenek. 2.) A vizsgálandó anyag, élő sejt, vagy rögzített preparátum mindig egyrétegben (egy síkban) helyezkedjen el. Ez lényeges, mert az átvilágítás során egyik réteg zavarja a másikat. Az egy síkban elhelyezkedő mikrobák mélységélessége jelentősen javul, így morfológiájuk jól tanulmányozható és a képi látvány is tökéletesebb. 3.) Beszáradt, vagy zsugorodott preparátum nem fényképezhető. 4.) A tárgylemezre felvitt anyag (intakt sejtek, fonalak, konidiumok) mindig folyadékba legyen ágyazva. Ez a fénytörésből eredő zavaró problémákat csökkenti, a fényképezéshez elengedhetetlen kontúrélességet fokozza. A tárgylemezre vitt anyagra cseppentsünk az alkalmazandó folyadékból, vagy eleve ebbe a folyadékcseppbe készítsük el a fényképezendő preparátumot, tiszta fedőlemezzel fedjük le, a felesleges folyadékot itassuk fel. (Ne ússzon a fedőlemez!)

50

5.) Az expozíciós idő alatt állítsuk le, vagy fékezzük le a preparátum mozgását. A pillanatnyi mozdulatlanság előfeltétele az éles felvételnek. A mozgás leállítása, vagy lassítása történhet zselatinba, glicerinbe történő ágyazással, tárgylemezhez történő fixálással, ragasztással, vagy pl. konidiumok cellux szalagra történő ragasztásával. 6.) Válasszunk ki jellemző, nem zsúfolt látómezőt a fényképezésre. 7.) A felvételeket viszonylag gyorsan készítsük el, mert a fényforrás melegít, a preparátum száradása megindul, és beindul a Brown-féle mozgás is. 8.) A kép "megszerkesztésekor" síkban gondolkodjunk (a binokuláris mikroszkópok térben adják a képet). A fénykép "kevesebbet" ad vissza a binokuláris feltétben látottaknál. 9.) A mikroszkópos felvétel készítése előtt ügyeljünk a preparátum élesre állítására. Itt a képkeresőben látható szálkereszt élesre állításához igazodjunk. A mikroszkópos fekete-fehér felvételek készítéséhez leggyakrabban a közepes érzékenységű (15/10, vagy 17/10 din) filmek alkalmazhatók. Ezek szemcsézettsége finom, jól nagyíthatók, kontrasztosak, a részleteket jól visszaadják. Színes felvételek készítésekor műfény diafilm, fluorescens-mikroszkóp esetében napfény diafilm használható 18/10 din alsó érzékenység határral. Mikroszkópunk vázlata. l: talp; 2: durva beállítógomb; 3: mikrométer beállítógomb; 4: kondenzor emelő-süllyesztő gomb; 5: kondenzor, kihajlítható alsó lencse, kihajlítható tartógyűrű színszűrő vagy opálüveg számára, blende; 6: tárgyasztal keresztasztallal; 7: keresztasztal mozgató gombjai; 8: objektívek a revolverváltóban; 9: binokuláris tubus okulárokkal; 10: mikroszkóp megvilágító rendszere (talpba épített transzformátor, izzó). Gyakorlatok: 1,Táptalajok készítése

A mikroorganizmusokat különböző összetételű tápközegben tenyésztjük további vizsgálatok céljából. Az anyag- és eszközismeretnél leírtak alapján különböző táptalajokat állítunk össze, a pH-t 7-re állítjuk, vattadugózunk, sapkázunk majd sterilezünk. A táptalajok felhasználása későbbi gyakorlato(ko)n történik. Anyagok és eszközök: T-1 recept szerinti táptalajkomponensek összemérve lombikban, 100 ml-re

300 ml-es Erlenmeyer-lombik (1 db) 100 ml-es főzőpohár (1 db) A gyakorlat menete: 100 ml kiegészített hústáptalajt (T-1) készítünk 3 % agarral, 1 db 300 ml-es Erlenmeyerlombikban. A táptalajkoponenseket bemérjük, majd hozzáadjuk a desztillált vizet.

51

Kuktafazékban sterilezünk. A steril táptalajt laminár boxban Petri-csészébe illetve kémcsőbe (ferde agar) töltjük. Figyelem! A nyomás alatti sterilezés után meg kell várni, amíg az autoklávban, kuktafazékban a túlnyomás megszűnik. A táptalajokat csak akkor szabad kiemelni, ha forrásuk már megszünt! Feladat: Számítsuk ki a recept alapján 100 ml táptalajra vonatkoztatva a bemért komponensek mennyiségét!

2, Mikroorganizmusok izolálása a környezetből A gyakorlat célja annak bemutatása, hogy a környezetünkben sok mikroorganizmus

fordul elő, nagy gyakoriságuk veszélyezteti a mikrobiológiai munkák tisztaságát. Ha a táptalajt antibiotikumokkal szelektívvé tesszük, baktériumellenes antibiotikumokkal a gombák kitenyésztését, gombaellenes antibiotikummal a baktériumok izolálását tesszük könnyebbé. Anyagok és eszközök: T-1+40 µg/ml nystatin-t tartalmazó Petri-csésze (4 db) T-1+ 60 µg/ml tobramycin-t tartalmazó Petri-csésze (4 db)

Elkészítése:


Kimérjük a megfelelő mennyiségű gátló anyagot.




A nystatint oldjuk DMSO-ban, a tobramycint steril desztvízben.




Hozzáadjuk a törzsoldatot a lesterilezett táptalajhoz. Kiöntjük Petri-csészébe. 100 ml

táptalajhoz 1 ml „gátlóanyagos” törzsoldatot pipettázunk. Törzsoldat cc.-ja: nystatin 4mg/ml ; tobramycin 6 mg/ml. •

steril vatta

•

talajminta

A gyakorlat menete: A 40 µg/ml nystatin tartalmú csészéken baktériumokat, a 60 µg/ml tobramycint tartalmazó csészéken gombákat izolálunk. Mindkét sorozattal az alábbi műveleteket végezzük el: 1) A csészéket fedetlenül hagyjuk 15 percig a laboratóriumban. 2) A csészéket fedetlenül a nyitott ablakba, huzatos helyre helyezzük 15 percig. 3) Steril vattával bútorfelületről levonatot veszünk és azt rávisszük a steril táptalajra. 4) Ajkunkról steril vattával mintát veszünk és azt a táptalaj felületére visszük.

52

5) Beosztjuk három részre a csészét, az alján filctollal jelölve, majd részenként (A) érintsük mosatlan ujjunkkal a táptalajt; (B) érintsük ujjunkkal a táptalajt szappanos kézmosás és levegőn

való szárítás után; (C) érintsük ujjunkkal a táptalajt néhány perces sterogenolos kézmosás és levegőn való szárítás után. 6) Helyezzünk hajszálat a táptalajra. 7) Porított talajmorzsákat hintsünk a táptalajra. 8) Érintetlenül hagyjuk a csészét kontrollnak. 30°C-on inkubálunk, megfigyelés 48 óra, illetve 5 nap után. Feladat: 1. Írjuk le a látottakat, hasonlítsuk össze az azonos módon kezelt, de különböző antibiotikumokat tartalmazó táptalajokon a tenyészeteket. 2. Hasonlítsuk össze a 48 órás, illetve az 5 napos inkubáció után látottakat. 4. Rajzoljuk le a különböző teleptípusokat sztereomikroszkópos megfigyelések alapján

felülnézetben. Írjuk le a telepek morfológiai jellemzőit (alak, szín, konzisztencia, perem, stb.).

3, Átoltások gyakorlása

Az elkészített táptalajokat (T-1—T-5a) különböző steril tenyészedényekbe szétosztjuk, majd a táptalajokat hagyjuk lehűlni, illetve megdermedni. A kémcsöveket megdöntve helyezzük el a ferdeagar, és függőlegesen a magas agar készítéséhez. A lehűlt tápoldatba, illetve a megdermedt táptalajra oltunk. a) Oltás ferde agarra Mikroorganizmusok: Escherichia coli, Serratia marcescens, Bacillus cereus var. mycoides, B. megaterium, Micrococcus luteus, (T-1); Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Rhodotorula rubra, Syncephalastrum racemosum, Aspergillus niger 48 órás tenyészetei T-5 ferde agaron (a baktériumok T-1, a gombák T-5 táptalajon növekednek jól). Anyagok és eszközök: T-1 ferde agar (4 db) T-5 ferde agar (4 db) A leoltás menete: 1) Bal kézbe fogjuk a leoltandó tenyészetet tartalmazó és az "üres " kémcsövet (11. ábra). A csövek helyzete közel vízszintes legyen. Hüvelykujjunkkal a tenyerünkhöz szorítjuk a csöveket.

53

(Rögzíthetjük a csöveket az ujjak közé szorítással is.) Az agar oltandó felülete mindig felénk legyen fordítva. 2) Az üres cső vattadugóját megforgatjuk, hogy könnyen kiemelhető legyen, ha a belefejtett táptalajtól beragadt volna. 3) Az oltóeszközt úgy fogjuk jobb kézzel, mintha íróeszközt fognánk. Közel függőleges helyzetben a gázlángba tartva, felizzítjuk az oltókacsot, majd a nyél fém részét lángoljuk le. 4) Jobb kezünk gyűrűs- és kisujjával kiemeljük a tenyészetes cső dugóját úgy, hogy a kiemelés után a dugó szabad része ne érintkezzen semmivel. Lángoljuk le a kémcső száját. 5) A kaccsal benyúlunk a kémcsőbe, lehűtjük üres agarfelületen. A tenyészetből inokulumot veszünk ki. (Inokulum = az a mikrobamennyiség, amellyel be/le/oltjuk az új táptalajt.) A kacs nem érhet a cső oldalához. Lelángoljuk a kémcső száját, a dugót visszahelyezzük a tenyészetes csőbe. 6) A beoltandó kémcső dugóját kivesszük, lelángoljuk a kémcső száját (vigyázzunk, az inokulum ne érjen a lángba!). Beoltjuk a táptalaj felületét zegzugos vonal mentén. 7) Lelángoljuk a frissen leoltott cső száját, visszahelyezzük a vattadugót. Leégetjük az oltókacsot (először szárítva, majd izzítva), állványba állítjuk, majd állványba helyezzük a kémcsöveket is.

Ferde agarra történő oltás egy lehetséges módja

54

Figyelem! Az egész műveletet a gázláng közvetlen közelében végezzük, ügyelve arra, hogy a beoltás folyamata kellő ütemű legyen, ugyanakkor nagy levegőmozgást széles mozdulatokkal,

kapkodással ne keltsünk. A tenyészedényeket oltás előtt lássuk el jelöléssel. Átoltunk 4 baktérium, 2 élesztőgomba és 2 fonalasgomba törzset. b) Oltás magas agarba (szúrt tenyészet) Mikroorganizmusok: Serratia marcescens, Bacillus cereus var. mycoides, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Rhodotorula rubra 48 órás tenyészetei T-1 illetve T-5 ferde agaron. Anyagok és eszközök: T-1 magas agar (2 db) T-5 magas agar (2 db) A gyakorlat menete: Oltás menete ugyanaz mint előbb, csak tűvel és zegzugos vonalhúzás helyett egyetlen szúró

mozdulattal oltunk be 2 baktérium és 2 élesztőgomba törzset.

A B Ferde- illetve magas agar leoltása

55

c) Oltás kémcsőből folyékony táptalajba Mikroorganizmusok: Serratia marcescens, Escherichia coli, Bacillus megaterium, Micrococcus luteus, Saccharomyces cerevisiae, Syncephalastrum racemosum, Aspergillus niger 48 órás tenyészetei T-1 illetve T-5 ferde agaron Anyagok és eszközök: 15 ml T-1a tápoldat kémcsőben (4 db) A beoltás menete: az a) gyakorlatnál leírtak szerint történik. A kémcsöveket egyenként beoltjuk 2 baktérium, 1 élesztőgomgba és 1 fonalasgomba törzzsel A mikroorganizmusokat szuszpendáljuk a folyadékban. Feladat: l. Ellenőrizzük az átoltás eredményességét. 2. Figyeljük meg az átoltott mikroorganizmusok színét, telepmorfológiai (fénye-matt felszín)

tulajdonságait. Ábrázoljuk megjelenési formájukat. 3. Rajzoljuk és írjuk le, hogyan szaporodnak a különböző mikrobák a szúrt tenyészetekben (gázterelés, milyen mélyen nő). 4. Rögzítsük hogy folyadéktenyészetben milyen a különböző mikrobák tenyészete (egyformán zavarosít, felületen úszik, kiülepszik, milyen a színük)?

56

Felhasznált irodalom:

Ajtai Katalin – Szilágyi László: Biokémiai gyakorlatok. Tk kiadó, Budapest, 1983. Kevei Ferenc, Kucsera Judit, Manczinger László, Pfeifer I., Varga J., Vágvölgyi Csaba: Mikrobiológiai Gyakorlatok I. JATE-Press, 2004 Lénárd László: Összehasonlító élettani gyakorlatok. JPTE jegyzet 1998 Dr. Teichman Farkas: Biokémiai gyakorlatok. DOTE jegyzet. Debrecen 1999.

57