Karlova Univerzita v Praze Přírodovědecká fakulta. Studijní program: Biologie Studijní obor: Imunologie

Karlova Univerzita v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Biologie Studijní obor: Imunologie

Bc. David Šubjak

Imunologický profil u pacientů s roztroušenou sklerózou Immunological profile of multiple sclerosis patients     Diplomová práce

Vedoucí závěrečné práce/Školitel: Anna Fišerová, MD. PhD.

Praha, 2012

Immunological profile of multiple sclerosis patients Abstrakt Multiple sclerosis is an autoimmune neurodegenerative disease affecting predominantly the white matter of the CNS and the spinal cord. The mechanism of disease progression is not yet fully understood. In this study we focused on a comparison of selected immunological markers between patients with multiple sclerosis who were naïve newly diagnosed, subsequently treated with Avonex (IFNβ1a) and healthy donors. The T cells (particulary cytotoxic CD8+ T cells) are the major population involved in pathogenesis of MS causing the demyelization of axons. Subpopulation of CD161+ Th cells has a potential to be very important in this process. We focused on the role of NK cells phenotype and function in autoimmune response of patients and their changes during the therapeutic intervention. Using flow cytometry we analyzed the distribution of NK, NKT, T cells and monocytes with special regard to the expression of CD161 and NKG2D molecules on their surface. We observed increase counts of CD161+ cells in subpopulations NK CD56bright, NK CD56dim, Th, Tc CD8bright, Tc CD8dim and decrease counts of NKG2D+ cells in subpopulations NK CD56bright, NK CD56dim, NKT, Th, Tc CD8bright, Tc CD8dim and monocytes. The decreased cytotoxic activity of NK cells in naïve MS patients correlated with up regulation of CD161 inhibitory and down modulation of NKG2D activation receptors. After treatment with Avonex drug, the functional activity of NK cells returned to values of healthy donors. The measurement of plasma levels of cytokines between patients and healthy donors revealed a significant increase of IL6 and IL17 concentration. This study extends the knowledge about the pathogenesis of MS and gives an input for further investigation of the involvement of NK cells in this disease.

2

Imunologický profil u pacientů s roztroušenou sklerózou Abstrakt Roztroušená skleróza je autoimunitní neurodegenerativní onemocnění, které postihuje převážně bílou hmotu mozkovou a míchu. Mechanizmus progrese onemocnění není dosud zcela objasněn. V této studii jsme se zaměřili na srovnání zastoupení imunitních subpopulací a vybraných imunologických znaků mezi pacienty s roztroušenou sklerózou, kteří byli nově diagnostikováni a následně léčeni přípravkem Avonex (IFNβ1a), a zdravými dárci. T buňky se podílejí na patogenezi roztroušené sklerózy a to zejména cytotoxické CD8+ T buňky, které způsobují demyelinizaci axonů. Subpopulace CD161+ Th buněk má potenciál hrát velmi významnou roli v tomto procesu. V naší studii jsme se zaměřili na roli NK buněk jejich fenotyp a funkci v autoimunitní reakci u nově diagnostikovaných pacientů a po následné terapii. Pomocí průtokové cytometrie jsme analyzovali zastoupení NK, NKT, T lymfocytů a monocytů, kde jsme se zaměřili na expresi molekul CD161 a NKG2D na jejich povrchu. Pozorovali jsme zvýšené počty CD161+ buněk v subpopulacích NK CD56bright, NK CD56dim, Th, Tc CD8bright, Tc CD8dim a snížené počty buněk nesoucí znak NKG2D u subpopulací NK CD56bright, NK CD56dim, Th, NKT, Tc CD8bright, Tc CD8dim a monocytů. Snížená cytotoxická aktivita NK buněk u neléčených pacientů odpovídala zvýšené expresi inhibičního CD161 a snížené expresi aktivačního NKG2D receptoru. Po léčbě Avonexem se funkční aktivita NK buněk vrátila na hodnoty zdravých dárců. Plazmatické hladiny cytokinů mezi pacienty a zdravými dárci vykazovaly významné zvýšení u IL6 a IL17. Tato studie rozšiřuje znalosti o patogenezi RS a dává podnět pro další zkoumání zapojení NK buněk v této nemoci.

3

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracoval samostatně a že jsem uvedl všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu.

V Praze

Podpis

4

Poděkování: Rád bych tímto poděkoval své školitelce Anně Fišerové, MD. PhD. za odborné vedení a poskytnutí cenných informací při psaní mé diplomové práce. Dále děkuji Mgr. Janu Richterovi, RNDr. Katarině Čapkové PhD. a laborantkám Kateřině Fišerové a Věře Mihálové za pomoc. Nemalé poděkování patří paní MUDr. Veronice Tiché, za výběr, poskytnutí vzorků a anamnéz pacientů. Výsledky byly získány ve spolupráci s MS Centrem při neurologické klinice 1. LF UK a VFN, Praha 2 - Nové město. 5

Zkratky: APC – allophycocyanin CCR5 - C-C chemokinový receptor typu 5 CNS - centrální nervová soustava CTLA-4 - Cytotoxický T-lymfocytární antigen 4 CXCR3 - chemokinový receptor typu CXCR3 Cy3 – cyanin 3 EDTA - kyselina ethylendiamintetraoctová EBV - virus Epstein-Barrové ELISA - Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay FACS – Fluorescence activated cell sorter FITC - fluoresceinisothiocyanát FPBS - phosphatebuffered salin for FACS FSC - forward scatter Hsp70 – heat shock protein 70 IL - interleukin IFNγ - interferon gama KIR – rodina receptorů – killer cell Immunoglobulin-like receptor MBP - myelin bazický protein MHC – Major Histocompatibility Complex (hlavní histokompatibilní systém) MICA – MHC I. třídy polypeptid příbuzná sekvence A MICB – MHC I. třídy polypeptid příbuzná sekvence B NK buňky – Natural Killer (přirozené zabíječské buňky) 6

NKT buňky - Natural Killer T cell (přirozené zabíječské T buňky) PBMC - Peripheral Blood Mononuclear Cell (mononukleární buňky periferní krve) PE – phycoerythrin PerCP-Cy5.5 – Peridinin Chlorophyll Protein - Cy5.5 PI - propidium jodid RDB - Reagent Dilution Buffer RS – roztroušená skleróza SSC – sidescatter Tc - cytotoxické T lymfocyty TCR - T cell receptor (T buněčný receptor) TGFβ – Transforming Growth Factor (transformující růstový faktor) β TNFα – Tumor Necrosis Factor (nádory nekrotizují faktor) α



7

Obsah 1 

Literární přehled ...................................................................................................... 11  1.1 

1.1.1 

Rizikové faktory ....................................................................................... 13 

1.1.2 

Diagnostika ............................................................................................... 13 

1.1.3 

Genetické predispozice ............................................................................. 14 

1.2 

Imunologické mechanizmy zapojené v patogenezi RS .................................... 15 

1.2.1 

Monocyty .................................................................................................. 17 

1.2.2 

Dendritické buňky..................................................................................... 17 

1.2.3 

NK buňky .................................................................................................. 18 

1.2.4 

NKT buňky ............................................................................................... 21 

1.2.5 

T buňky ..................................................................................................... 21 

1.2.6 

B lymfocyty .............................................................................................. 23 

1.3 

Úloha receptorů C-lektinového typu v autoimunitě ......................................... 24 

1.3.1 

Aktivační receptor NKG2D ...................................................................... 24 

1.3.2 

Inhibiční receptor CD161 ......................................................................... 25 

1.4  2 

Roztroušená skleróza ....................................................................................... 11 

Léčba roztroušené sklerózy .............................................................................. 26 

Experimentální část ................................................................................................. 28  2.1 

Chemikálie ....................................................................................................... 28 

2.2 

Materiál ............................................................................................................ 28 

2.3 

Přístroje ............................................................................................................ 29 

2.4 

Diagnostické soupravy ..................................................................................... 29 

2.5 

Roztoky a média ............................................................................................... 30 

2.6 

Linie cílových buněk pro test cytotoxicity ....................................................... 30 

2.7 

Ředění monoklonálních protilátek pro FACS .................................................. 31 

2.8 

Statistické vyhodnocení dat.............................................................................. 32 

2.9 

Soubor pacientů a zdravých dárců ................................................................... 32  8

3 

4 

Metody ..................................................................................................................... 33  3.1 

Průtoková cytometrie (FACS).......................................................................... 33 

3.2 

Příprava a značení buněk pro FACS ................................................................ 36 

3.3 

Vyhodnocovací strom vzorků .......................................................................... 37 

3.4 

Test NK buněčné cytotoxicity .......................................................................... 39 

3.5 

Měření koncentrace cytokinů ........................................................................... 40 

3.5.1 

Fluorescenční kuličková cytokinová imunoassay..................................... 40 

3.5.2 

Quantibody array ...................................................................................... 41 

Výsledky .................................................................................................................. 43  4.1 

Procentuální zastoupení jednotlivých subpopulací v periferní krvi ................. 43 

4.2 

Výsledky průtokové cytometrie ....................................................................... 45 

4.2.1 

Výsledky statisticky významných rozdílů párových t-testů hodnocených u

individuálních pacientů v průběhu léčby ................................................................. 53  4.3 

Výsledky testů NK buněčné cytotoxicity ......................................................... 55 

4.4 

Výsledky měření plazmatické hladiny cytokinů .............................................. 60 

5 

Diskuze .................................................................................................................... 61 

6 

Závěr ........................................................................................................................ 64 

7 

Literatura ................................................................................................................. 65 

8 

Klíčová slova ........................................................................................................... 76 

9

Úvod Roztroušená skleróza je závažné neurodegenerativní omenocnění, které ovlivňuje centrální nervový systém a postihuje mladé lidi ve věku od 20 – 40 let. Tato imunitní porucha způsobuje demyelizaci myelinových pochev na povrchu axonů. Jako výsledek můžeme najít jizvy na různých místech mozku a míchy. Umístění těchto jizev představuje různé klinické příznaky. Dodnes neexistuje žádný spolehlivý laboratorní test, který by spolehlivě potvrdil diagnózu již v raném stádiu. Ani při relativní znalosti průběhu této nemoci neznáme léčbu, která by plně odvrátila její postup. V této práci jsme se zaměřili na porovnání vybraných imunologických znaků mezi pacienty s roztroušenou sklerózou a zdravými dárci. Pacienti byli sledováni a jejich vzorky odebrány v určitém časovém období. První odběr byl proveden po potvrzení diagnózy lékařem před nasazením léčby a následně v průběhu již zahájené léčby lékem Avonex. Naším hlavním cílem je sledovat změny v expresi specifických buněčných znaků NKG2D a CD161 na NK, NKT, T buňkách a monocytech u těchto pacientů a jejich dopad na změny v cytotoxické aktivitě NK buněk a produkci cytokinů před a v průběhu léčby. Nově získaná data by mohla být nápomocna při porozumění dalších mechanizmů takto imunologicky složitého onemocnění, jakým roztroušená skleróza bezesporu je. Výsledky této studie by mohly obohatit současné znalosti nynější problematiky chápání mechanizmů vzniku a průběhu roztroušené sklerózy.

10

1

Literární přehled

1.1 Roztroušená skleróza Roztroušená skleróza (RS) je charakterizovaná jako neurodegenerativní autoimunitní onemocnění, které postihuje centrální nervový systém, především bílou hmotu mozkovou a míchu (Alizadeh M. et al., 2003; Michael P., 1999). V těchto oblastech, kde se vyskytují hlavně nervová vlákna, dochází k iniciaci zánětlivého procesu, při kterém vznikají léze a plaky (Grigoriadis N. et al., 2004; Karussis D. et al., 2010). Toto je zapříčiněno autoimunitní poruchou, která způsobuje degradaci myelinových pochev, které zajišťují izolaci a rychlý přenos nervového signálu mezi buňkami. Pokud je myelinová pochva porušena vede to ke zpomalení či úplné blokaci přenosu nervového signálu (Zuvich R. L. et al., 2009). Tímto procesem jsou zasaženy i oligodendrocyty, odpovědné za přísun živin a následnou regeneraci (Grigoriadis N. et al., 2004; Zuvich R. L. et al., 2009). Výsledkem je zjizvená tkáň, která se vyskytuje na více oblastech mozku a míchy a je viditelná na magnetické rezonanci (De Stefano N. et al., 2005). Díky tomuto obrazu dostala tato autoimunitní nemoc svůj název: ,,sclerosis‘‘ – jizva, ,,multiplex‘‘- na více místech (Birgit R., 2004). Jedná se o komplexní onemocnění, kde se zapojují genetické faktory, vliv prostředí, demografická poloha či životní styl (Zuvich R. L. et al., 2009). Pravý původ je stále nejasný a opírá se o různé teorie. První teorie předpokládá výskyt viru v dané oblasti, který po nakažení v pozdním dětství či dospělosti výrazně zvyšuje riziko vzniku roztroušené sklerózy. Naproti tomu při prodělání infekce v raném dětství, se riziko výskytu snižuje (Julio S., 2007; Kakalacheva K. et al., 2011). Jedna z teorií předpokládá poruchu metabolismu lipidů (Corthals A.P., 2011). Další popsaná teorie se pouze domnívá, že dosud neidentifikovatelný patogen, který v oblastech s vyšší prevalencí může díky molekulárním

mimikrům

navodit

imunitní

reakci

proti

vlastním

strukturám

(Kakalacheva K. et al., 2011; Sotgiu S. et al., 2004). Alexander a spol. popisují porušení hematoencefalitické bariéry v průběhu nemoci, a to díky expresi adhezivních molekul, které umožňují prostup imunitních buněk do CNS (Alexander J. S. et al., 2011). Klinický průběh a celkový stav jednotlivého pacienta je ovlivněn mnoha proměnnými. Jedná se o lokalizaci, intenzitu a dobu trvaní zánětu. Tyto faktory vedou k velkému spektru příznaků, které se mohou lišit od záchvatů či relapsů až po progresi určité 11

poruchy, způsobené rozšiřující se zjizvenou tkání (Crayton H. J. et al., 2006; Tjalf Z., 2011). U poruch motorického systému bylo popsáno částečné nebo úplné ochrnutí či ztráta schopnosti ovládání svěračů. U senzorických poruch je to ztráta citlivosti na teplo a tlak nebo ztráta koordinace. Byly popsány i psychické poruchy, nejčastěji deprese a únava. Procentuálně nejčastějšími příznaky jsou poruchy zraku, motility střev a močového měchýře, necitlivost či brnění, únava, deprese a sexuální impotence (Allen J. A. et al., 2008; Birgit R., 2004; Demaille-Wlodyka S. et al., 2011; Nakipoglu G. F. et al., 2009; Randolph J. J. et al., 2000). Tyto různorodé příznaky se mohou objevit v každém ze čtyř klinicky definovaných typů roztroušené sklerózy. Nejčastější typ roztroušené sklerózy je relaps remitující, který postihuje 55-90% pacientů (Tjalf Z., 2011). Je charakterizován střídáním atak a remisí, které mohou trvat i několik let. Trvání atak se pohybuje mezi několika týdny až po několik měsíců (Birgit R., 2004). U většiny pacientů dochází k částečné či úplné remisi. Byly popsány i případy, kdy remise po jediné atace může trvat i desetiletí. Druhý nejčastější typ je sekundárně progresivní forma, která postihuje přibližně 30% pacientů. Tento typ následuje po prvním typu a vyznačuje se ztrátou regenerační schopnosti, tedy dochází k nezvratným změnám a nárůstu invalidity v důsledku degenerace axonů. Průměrná doba přechodu mezi prvním a druhým typem je zhruba 19 let (Rovaris M. et al., 2006; Zuvich R. L. et al., 2009). Třetím typem je primárně progresivní forma roztroušené sklerózy, která postihuje v průměru 10% pacientů. Tato forma je charakterizovaná vznikem postupných poškození bez známek remise. Pacienti trpí stále se zhoršující invaliditou bez známek zlepšení, kdy ataky a progrese nemoci nejsou téměř odděleny. Čtvrtým typem je progresivně relabující forma roztroušené sklerózy, která se vyskytuje u necelých 5% pacientů. Je to nejtěžší forma, která se vyznačuje trvalým poškozením u každé ataky bez žádné remise a vede během několika let k trvalé invaliditě. Dosud nebylo popsáno, co ovlivňuje jednotlivé formy, ani důvod jejich vzniku. (Pender M. P., 2004; Zuvich R. L. et al., 2009).

12

1.1.1 Rizikové faktory Prevalence roztroušené sklerózy, pokud je přiřazena k demografickému rozdělení, je nejvyšší v mírném pásmu, kde dosahuje hodnot 0,1–0,2%. Mezi země s nejvyšším výskytem patří USA, Kanada, Rusko, velká část evropských států, Izrael, Austrálie a Nový Zéland. Naopak mezi místa s nejnižším výskytem patří Asie, Afrika a Jižní Amerika, kde prevalence je v řádech 0,005% (Kakalacheva K. et al., 2011). Z tohoto důvodu některé práce popisují značný vliv místního zastoupení genetické predispozice v dané oblasti nebo uplatnění hygienické hypotézy (Sotgiu S. et al., 2008). Dalším faktorem je přesná poloha oblasti, kdy prevalence ve vnitrozemí je až 5x vyšší. Předpokládaný vliv může korelovat se spotřebou olejovitých ryb, které snižují riziko vzniku onemocnění (Koch-Henriksen N. et al., 2010). Další vyslovená teorie, která by mohla patřit mezi rizikové faktory, je vliv viru Epstein-Barrové (EBV) či Herpes zoster. Přítomnost protilátek proti EBV byla prokázána téměř u všech pacientů. Lidé, kteří prodělali infekční mononukleózu v dorosteneckém věku, mají o 66,6% vyšší pravděpodobnost, že se u nich rozvine RS než u lidí, kteří infekci prodělali ve velmi mladém věku. Zajímavým parametrem je zvyšující se koncentrace protilátek proti EBV několik let před prvními příznaky RS (Aung L. L. et al., 2012; Comabella M. et al., 2012; Maghzi A. H. et al., 2011). Nezanedbatelným faktorem je pohlaví, ženy mají dvakrát až třikrát vyšší prevalenci než muži. Některé studie zahrnují rizika, jako je například stres, úraz CNS, specifický patogen v dané oblasti, ukončení těhotenství či velká dávka radioaktivního záření (Vollmer T., 2007).

1.1.2 Diagnostika Po lékařské stránce jsou projevy RS již definovány, ale stále nemáme žádné spolehlivé laboratorní vyšetření, které by roztroušenou sklerózu specificky diagnostikovalo již v raném stádiu. Dnešní postup pro diagnostikování RS je založen na použití magnetické rezonance se specifickým obrazem, kde musí být splněno těchto šest specifických znaků. (1) Abnormality nalezené při magnetické rezonanci musí způsobovat dysfunkci centrální nervové soustavy (CNS). (2) Tyto abnormality musí zasahovat do bílé hmoty mozkové. (3) Nález musí být na dvou či více místech CNS. (4) Pacient musí v rozmezí více jak 30 dní prodělat dvě na sobě nezávislé ataky, které trvaly nejméně 24 hodin, nebo mít pozvolné zhoršování postižení po dobu více 13

jak 6 měsíců společně s nálezem oligoklonálních řetězců a přítomností imunoglobulinů IgG v mozkomíšním moku. (5) Počátek rozvoje nemoci by měl být mezi 10 až 60 lety věku pacienta. (6) Symptomy nelze přičíst žádné jiné neurologické poruše. U pacientů se provádí i neurologické zkoušky jako jsou vyšetření koordinace, rychlost reflexů, reakce nervové soustavy na podněty, měření síly ale i pocitová stránka. (Brettschneider J. et al., 2009; Reipert B., 2004; Rovira A. et al., 2008; Smith K. et al., 2006).

1.1.3 Genetické predispozice Podle geografického výskytu některé studie uvažují o značné genetické zátěži spojené s tímto onemocněním. Rodinné studie provedené na jednovaječných dvojčatech prokázaly významný vliv genetické vybavenosti v základní etiologii RS. Riziko výskytu roztroušené sklerózy stoupá u příbuzných 20–40 krát oproti incidenci v běžné populaci. Jednovaječná dvojčata, kde u jednoho dvojčete byla diagnostikovaná RS, se prevalence u druhého dvojčete pohybuje mezi 25-34%. Záměrem mnoha vědeckých skupin je nalezení genů zodpovědných za propuknutí RS. V roce 1970 byla poprvé prokázána vazba na hlavní histokompatibilní komplex (MHC). Konkrétně se jedná o asociaci alel u HLA-DR2 ve složení (HLA-DRB1 *1501 – DQB * 0602). Tato kombinace se vyskytuje u 25–35% pacientů. Z toho důvodu se předpokládá, že se mohou vyskytovat propojení mezi nezávislými alelami, které by mohli být zodpovědné za počáteční rozvoj. Bylo prozkoumáno a popsáno více jak 100 oblastí genomu, které by mohly být zapojeny, ale zatím nebyly potvrzeny (Aung L. L. et al., 2012; Goris A., 2012; Greer J. M. et al., 2011; Rovaris M. et al., 2006).

14

1.2 Imunologické mechanizmy zapojené v patogenezi RS Průběh tohoto autoimunitního onemocnění je podle různých publikovaných výsledků komplexní. Podle většiny testů a pozorování je zřejmé, že nejčastěji jsou zodpovědné za formování lézí v bílé hmotě mozkové cytotoxické T lymfocyty. Ty ale samy o sobě nemohou vysvětlit tak rozsáhlou a selektivní destrukci myelinu. Dalším činitelem mohou být protilátky zaměřené proti povrchovým strukturám myelinových pochev, které se podílí na demyelizačním procesu. Ty byly prokázány v oblastech, kde dochází k demyelizaci, ale není zde zánětlivé ložisko (Markovic-Plese S. et al., 2004; Silber E. et al., 1999). Protilátky mohou být zaměřeny na různé části myelinové struktury. Rozdíly byly pozorovány mezi centrálním a periferním myelinem. Z toho plyne předpoklad, že v bílé hmotě mozkové mohou být regiony se specifickým typem myelinu, proti kterému může být zaměřena specifita protilátek. Toto tvrzení je podloženo faktem, že určité regiony jako například optický nerv, mozeček či prodloužená mícha jsou zasaženy s o mnoho větší frekvencí než ostatní oblasti. Dalším faktor je i zánětlivá odpověď při tvorbě lézí, ve kterých dochází k imunitní reakci proti různým autoantigenům a možné zapojení komplementu (Charles M., 2000; Weber M. S. et al., 2011). Vznik reaktivních T lymfocytů u pacientů s RS v periferii je vysvětlován ve vědeckých publikacích několika teoriemi. Molekulární mimikry, kdy jsou T lymfocyty aktivovány proti cizím antigenním epitopům, které se ale velmi podobají strukturám myelinu, je jedna z nejvíce publikovaných teorií. Objevily se i teorie, které se opírají o tvrzení, že aktivaci T buněk vyvolává přítomnost vlastního myelinu, který je konstitutivně vystavován v lymfatických uzlinách v oblasti krku. Přítomnost myelinu v periferním oběhu může být podle jiné teorie způsobena, například virovou infekcí, způsobující poškození hematoencefalitické bariéry, nebo traumatem (Charles M., 2000; Comabella M. et al., 2012). Samotné změny v hematoencefalitické bariéře, ať již působením různých cytokinů či expresí adhezivních molekul mohou být podle některých prací vůbec prvotní spouštěč zánětlivé reakce (Alexander J. S. et al., 2011). Další předpokládaná příčina může být i nedostatečná imunoregulační kontrola v důsledku selhání centrálních mechanizmů tolerance. Zapojení jednotlivých populací imunitních buněk v mechanizmu patogeneze je popsáno v následujících kapitolách.

15

Obr. 1 Předpokládaný mechanizmus pathogeneze u RS (Brinkmann V. et al., 2010)

16

1.2.1 Monocyty Monocyty můžeme charakterizovat jako CD14+ buňky. Na svém povrchu mohou exprimovat i molekuly CD80, CD86, CD40, CD64, CD16, HLA-DR. Tyto buňky jsou spolu s T lymfocyty nejvíce zastoupené subpopulace v zánětlivé lézi. Jejich úlohou je poskytovat cytokinové prostředí pro ostatní přítomné buňky. Tím mohou ovlivňovat rovnováhu mezi Th1 a Th2 imunologickou odpovědí. U pacientů s RS byla zjištěna zvýšená produkce prozánětlivých cytokinů monocyty a to především IL12 a IL6 a dále zvýšená exprese znaku CD80 na jejich povrchu (Bergh F. T. et al., 2004; Kouwenhoven M. et al., 2001; Nakajima H. et al., 2004). Monocyty se podílí v průběhu patogeneze i na odstranění demyelizačních produktů a nesou na svém povrchu diferenciační znak MRP8/14 (Floris S. et al., 2004).

1.2.2 Dendritické buňky Dendritické buňky na svém povrchu exprimují molekuly CD1a, CD11c, CD86, CD83, CD123 a MHC II. (HLA DR) (Gianotti L. et al., 2008; Ninomiya T. et al., 1999). Hlavní funkce těchto buněk je prezentace antigenu na MHC molekulách I. a II. třídy. Ovlivňují diferenciaci různých subpopulací T buněk a tím určují, jaký podtyp bude převažovat a jaká odpověď imunitního systému bude preferována. Přítomnost plazmocytoidní (CD123+) i myeloidní (CD1a, CD11c) populace dendritických buněk byla u pacientů prokázaná v cerebrospinální tekutině (Pashenkov M. et al., 2001). Antigen prezentující buňka po interakci s naivní CD4+ T buňkou produkuje specifické cytokiny a ty diferencují T buňku do různých linií, které se podílejí na patogenezi RS. Th1 a Th17 buňky mají prozánětlivou, zatím co Th2 a Treg mají protizánětlivou funkci (Obr. 5). Byla zjištěna jistá plasticita u Th17 a T regulačních buněk, kdy v závislosti na specifických cytokinech mohou změnit svoji charakteristiku a výkonné funkce. Tato plasticita má potenciál stát se cílem terapeutických látek a tím usměrnit imunitní odpověď (Stoeckle C. et al., 2010).

17

Obr. 5 Diferenciace a její ovlivnění u naivních T buněk po kontaktu s antigen prezentující buňkou se zaměřením na plasticitu jednotlivých subpopulací zapojených v patogeneze RS (Stoeckle C. et al., 2010).

1.2.3 NK buňky NK buňky můžeme rozlišit podle základního fenotypu CD3- CD56+. Podle míry exprese molekuly CD56 můžeme buňky rozdělit na CD56bright, které jsou cytokin produkční a CD56dim CD16+, které mají cytotoxickou efektorovou funkci. Dále na svém povrchu mohou NK buňky exprimovat molekuly CD2, CD11b/CD18, CD161, CD244 (Perussia B. et al., 2005). NK buňky jsou jednou z hlavních složek přirozené imunity a poskytují počáteční obranu proti virům, intracelulárním bakteriím a nádorovým buňkám. Hlavní funkce NK buněk jsou cytotoxická aktivita a schopnost regulovat imunitní odpověď. Regulační funkce je zprostředkovaná sekrecí cytokinů, chemokinů, nebo přímím kontaktem pomocí exprese aktivačních či inhibičních receptorů. Díky těmto funkcím se předpokládá vliv NK buněk na autoimunitní choroby (Tian Z. et al., 2012). Nepřímým důkazem, že NK buňky mají ochrannou roli u autoimunitních 18

chorob, je považováno to, že některé genové mutace u těchto buněk, které způsobují poruchu jejich funkce, májí za následek zvýšení výskytu těchto onemocnění. Bylo prokázáno, že NK buňky mohou být protektivní, autoreaktivní či podporovat rozvoj zánětu. Například produkce cytokinů NK buňkami může pomoci naivním CD4+ buňkám k diferenciaci na Th1 (IFNγ) nebo Th2 (IL5, IL13) odpověď a tím podpořit v případě Th1 odpovědi autoreaktivní T buňky. Dalším příkladem může být i vzájemná kooperace NK a dendritických buněk, které se mohou navzájem aktivovat a podpořit tak prezentaci vlastních antigenů dendritickými buňkami. Bylo popsáno i přímé zabíjení dendritických buněk nebo autoreaktivních T buněk po aktivaci NK buněk. Dalším protektivním účinkem může být produkce TGFβ či IL10, které napomáhají diferenciaci regulačních buněk (Morandi B. et al., 2008). Obr. 2 Další možností, jak NK buňky mohou navodit regulační účinky, je po kontaktu s T regulačními lymfocyty nebo NKT buňkami. Tento mechanizmus zatím nebyl objasněn (Morandi B. et al., 2008). Některé studie naznačují, že NK buňky, které pronikají do CNS, mají spíše ochranný než autoreaktivní potenciál. Toto zatím bylo prokázáno u myšího modelu (Hammarberg H. et al., 2000).

Obr.2 Mechanizmy působení NK buněk a jejich dvojsečnost u autoimunitních chorob (Morandi B. et al., 2008) NK buňky odebrané od pacientů s RS mají v určitém stádiu nemoci vysokou expresi molekuly Fas (CD95). Podle některých autorů by měly být tyto buňky klasifikovány jako NK2 produkující cytokiny IL-5 a IL-13, které napomáhají Th2 typu imunitní odpovědi. Buňky CD95+CD56bright snižují (v systému in vitro) zatím nejasným způsobem produkci IFNγ u myelin specifických T buněk. Pacienti s fenotypem CD95+ 19

CD56bright mají vyšší frekvenci výskytu paměťových autoreaktivních T buněk a mají zároveň vážnější klinické příznaky roztroušené sklerózy než pacienti s fenotypem CD95+ CD56dim. Zajímavým faktem ale je, že právě u fenotypu CD95+ CD56bright byla prokázaná aktivní schopnost potlačovat vznik paměťových T autoreaktivních buněk. Lze tedy předpokládat, že u NK buněk s fenotypem CD95+ CD56dim hrají roli další faktory, které nebyly zatím objasněny. Bylo popsáno, že před následujícím relapsem ztrácejí NK buňky molekulu CD95 a tím i regulační schopnost, jak jí popisuje daná studie (Morandi B. et al., 2008; Takahashi K. et al., 2004). Obr. 3 Zda tyto rozdílné dopady jsou zprostředkovány různými podskupinami NK buněk (např. cytokin produkčními CD56bright proti cytoxickým CD56dim) zůstává zatím nejasné. Dalším faktorem, který ovlivňuje diferenciaci, je lokalizace NK buněk a orgánově specifické faktory (cytokinové prostředí, receptory na povrchu tkání či struktura) (Bernardini G. et al., 2012; Tian Z. et al., 2012). Zajímavý poznatek přinesla skupina vědců z USA, která tvrdí, že NK buňky mohou přímo regulovat aktivaci T buněk pomocí prokázané exprese MHC II. a kostimulačních molekul CD80 a CD86 podobně jako antigen prezentující buňky (Hanna J. et al., 2004).

Obr. 3 Předpokládané zapojení NK buněk CD95+ CD56bright v regulaci zánětlivé reakce (Takahashi K. et al., 2004).

20

1.2.4 NKT buňky NKT buňky se vyznačují fenotypovou i funkční heterogenitou. Základním fenotypem těchto buněk je exprese molekul CD3 a CD56. Dále mohou mít na svém povrchu koreceptor CD4 nebo CD8, některé populace nemají ani jeden a jsou tak double negativní (MacDonald H. R., 2002; Peralbo E. et al., 2007). Mnoho prací poukazuje, že NKT buňky mají regulační funkci u autoimunitních onemocnění včetně roztroušené sklerózy. Naproti tomu další studie ukázaly, že přítomnost NKT buněk může urychlovat některé zánětlivé stavy. Role těchto buněk v patogenezi RS nebyla objasněna. (Godfrey D. I. et al., 2000; Yamamura T. et al., 2007). Některé výsledky poukazují na snížení počtu double negativních NKT buněk (CD4- a CD8-) u pacientů s RS ve fázi remise (Molano A. et al., 2006).

1.2.5 T buňky T buňky můžeme rozdělit podle specifické exprese koreceptorů na CD4+ takzvané pomocné Th lymfocyty a CD8+ cytotoxické T lymfocyty (Tc). Oba tyto podtypy buněk mají na svém povrchu molekulu CD3 a TCRαβ, které jsou zásadní pro jejich identifikaci. Dalšími důležitými antigeny jsou, CD25, CD28, CTLA4, CD45, (Biro A. et al., 2002). Role CD8+ T buněk je u tohoto onemocnění klíčová. (Baughman E. J. et al., 2011). Histopatologické analýzy a zvířecí experimentální modely naznačují, že autoreaktivní klony cytotoxických CD8+ T buněk se zaměřují na složky centrální a periferní nervové soustavy a vyvolávají zánětlivé léze. Výsledky pokusů sledujících buněčnou diferenciaci prokázaly přítomnost několika podskupin efektorových CD8+ T buněk, které jsou zapojeny do procesu poškození tkáně. Zvláštní význam mají regulační T buňky CD8+ CD25+ a CD8+ CD25+ CD28-, které se významně podílejí na obnově homeostáze imunitního systému a udržení imunitně privilegovaných míst. Mechanizmus není zcela objasněn, ale předpokládá se podobná funkce jako u CD4+ CD25+ regulačních T buněk. Může se jednat o buněčné kontakty, či produkci protizánětlivých cytokinů TGFβ nebo IL10. Další možností je přímé zabíjení patogenních CD4+ T buněk způsobem závislým na HLA-E. Bylo prokázáno, že tato subpopulace je u pacientů s RS snížená, ale po léčbě interferonem β1a (Avonex) se signifikantně zvyšuje. (Aristimuno C. et al., 2010; Graber J. J. et al., 2011;

21

Malmestrom C. et al., 2008; Morandi B. et al., 2008; Saxena A. et al., 2011). Předpokládané zapojení CD4+ a CD8+ T buněk je popsáno na obrázku 4.

Obr. 4 Teoretické schéma působení CD8 T buněk v patogenezi RS (Saxena A. et al., 2011). Dendritické

buňky

prezentují

vlastní

antigeny

autoreaktivním

T

buňkám.

Tyto autoreaktivní T buňky se diferencují do různých efektorových podskupin. CD8 T buňky se diferencují do regulační a efektorové podskupiny, které mohou přestupovat do CNS přes hematoencefalitickou bariéru. Mikroglie a makrofágy prezentují na svém povrchu vlastní peptidové komplexy MHC-I a podporují klonální expanzi autoreaktivních Tc buněk. Takto aktivované Tc se mohou přímo zaměřit na MHC-I molekuly exprimované na oligodendrocytech a axonech neuronů, což vede k nevratnému poškození tkáně (Malmestrom C. et al., 2008; Saxena A. et al., 2011). Některé studie popisují, že CD4+ subpopulace lymfocytů zahajuje tuto autoimunitní reakci. Zvýšený počet myelin specifických autoreaktivních T buněk představuje ústřední mechanizmus v patogenezi RS, i když nejsou hlavní subpopulací vyskytující se v zánětlivé lézi. Důkazem může být jejich produkce prozánětlivých cytokinů TNFα 22

a IFNγ, jež mají vliv na rozvoj zánětu. (Jensen J. et al., 2004; Lassmann H. et al., 2004). V aktivní fázi RS buňky Th1 nesou na svém povrchu chemokínové receptory CCR5, CXCR3 a ve vysokém množství VLA-4 (very late antigen-4), které jsou zodpovědné za migraci do CNS (Krakauer M. et al., 2006). Významnou subpopulací, o které se uvažuje, že je zodpovědná za zánětlivé léze a podporuje účinky autoreaktivních T buněk v patogenezi RS, jsou Th17 buňky produkující IL17A a F, IL6, IL22 a TNFα (Venken K. et al., 2010). Bylo zjištěno, že subpopulace CD4+ CD28- může být funkčně nezávislá na profesionálních antigen prezentujících buňkách. Je tedy možné, že mají schopnost zahájit autoimunitní reakci i bez jejich přítomnosti. Paměťové buňky fenotypu CD4+ CD28- CD45RA–, CD45RO+ produkují velké množství IFNγ a dlouhodobě přežívají. To může být pravděpodobně způsobeno ztrátou receptoru CTLA-4. T buňky CD4+ CD28- jsou výrazně zvýšené u pacientů s RS. (MarkovicPlese S. et al., 2001).

1.2.6 B lymfocyty B lymfocyty jsou charakterizovány expresí znaků CD19 a CD20 na svém povrchu. Tyto buňky mohou také exprimovat molekuly CD1d, CD29, CD54 a CD95 (Stevens C. H. et al., 2012). Vliv B lymfocytů byl náhodně nalezen při terapii RS pomocí léku Rituximab. Rituximab je lidsko-myší chimérická monoklonální protilátka (IgG1), která reaguje specificky s antigenem CD20, který je exprimován na více než 95% normálních a maligních B buněk. B lymfocyty jsou pouze malou součástí zánětlivého infiltrátu v lézi. Proto bylo nepravděpodobné, že by blokáda těchto buněk mohla přímo potlačit místní zánětlivou reakci. Pacienti ale vykazovali snížení projevů zánětu. (Cohen J. A., 2009; Kelesidis T. et al., 2011; Lassmann H., 2011). Další zajímavý jev byl popsán po použití léku Atacicept. Atacicept je lidský rekombinantní fúzní protein, který se váže na receptory pro cytokiny BLyS (B lymfocyt stimulátor) a APRIL (proliferaci vyvolávající ligand), které jsou důležitými regulátory zrání B buněk. Tento lék je zaměřen na pozdní stádia vývoje B lymfocytů, bohužel se jeho použití u pacientů projevilo prozánětlivými účinky, proto musela být léčba Ataciceptem ukončena. Zapojení B lymfocytů v rozvoji RS je tedy mnohem komplexnější (Graber J. J. et al., 2011; Hans-Peter Hartung et al., 2010). Významnou roli hraje i produkce autoreaktivních protilátek, které byly prokázány v cerebrospinální tekutině i v zánětlivé 23

lézi. Tyto autoprotilátky jsou především třídy IgG, a nejvyšší specifita byla prokázána na myelinový oligodendrocytární glykoprotein u více jak 50% pacientů (Garg N. et al., 2007; Karussis D. et al., 2010; Link H. et al., 1990; Seidi O. A. et al., 2002; Weber M. S. et al., 2011). U pacientů s RS byla zjištěna korelace zvýšeného počtu CD5+ B lymfocytů tvořících nízko afinitní autoprotilátky (Seidi O. A. et al., 2002) a snížená produkce IL10 B buňkami ve srovnání se zdravými dárci (Karussis D. et al., 2010).

1.3 Úloha receptorů C-lektinového typu v autoimunitě Aktivační NKG2D a inhibiční CD161 receptory, patřící do rodiny C-lektinového typu receptorů, byly původně identifikovány na NK buňkách a jsou evolučně konzervovány. Tyto receptory jsou spolu s dalšími kódovány v regionu zvaném NK gene complex na 12. chromozomu u lidí a na 6. chromozomu u myší.

1.3.1 Aktivační receptor NKG2D Poprvé byl objeven na NK buňkách, následně také na T αβ CD8+, na γδ T buňkách, a na makrofázích. Zapojení NKG2D receptoru na NK nebo γ/δ T buňkách stimuluje sekreci cytokinů (IFNγ, TNFα a GM-CSF) a uvolnění cytolytických granulí (Raulet D. H., 2003; Saikali P. et al., 2007). NKG2D se vyskytuje ve dvou formách NKG2Ds (short) a NKG2Dl (long). U člověka je v současnosti detekováno sedm ligandů (MICA, MICB, ULBP1-5), které se váží na receptor NKG2D, tyto ligandy rozdělujeme do dvou skupin. První skupinu tvoří polypeptid MHC I třídy z rodiny související sekvence MICA a MICB. Druhou skupinu tvoří cytomegalovirus vázající protein UL-16, do které patří celá rodina proteinů. Exprese NKG2D ligandů je stimulována především buněčným stresem. Signál mezi ligandy zprostředkovává protein DAP10, který tvoří hexamerní strukturu podobnou receptoru CD3 na T lymfocytech a signál přenáší pomocí fosfatidyl 3-kinázy. (Lopez-Larrea C. et al., 2008; Van Belle T. L. et al., 2009). V NK buňkách jsou obecně inhibiční a aktivační signály v rovnováze. I přes některé inhibiční signály je po navázání ligandu na receptor NKG2D buňka převedena do aktivní formy. NKG2D tedy může působit jako hlavní přepínač mezi aktivovaným a inhibovaným stavem buňky. NKG2D receptor je důležitý nejen pro T a NK buňky, především jako aktivátor buněčné imunity proti virům a nádorům, ale také 24

u autoimunitních onemocnění a alogenních transplantací (Flodstrom-Tullberg M. et al., 2009; Lopez-Larrea C. et al., 2010; Obeidy P. et al., 2009). Bylo prokázáno, že u myších modelů roztroušené sklerózy indukované peptidy myelinových proteinů v komplexu s HSP70, dochází k navození tolerance po přenosu NK buněk u myší před podáním

peptidového

komplexu.

Navození

tolerance

závisí

na přítomnosti

glykoproteinu H60, což je další ligand pro receptor NKG2D, který ovlivňuje funkci CD11c+ dendritických buněk, která vyvolává apoptózu autoreaktivních buněk. Zatím není potvrzeno, zda receptor NKG2D může mít podobnou regulační funkci i v lidské patogenezi MS (Galazka G. et al., 2007; Van Belle T. L. et al., 2009).

1.3.2 Inhibiční receptor CD161 CD161 patří do rodiny receptorů KLR (killer cell lectin-like receptor), který obsahuje na tyrosinu založený inhibiční motiv (ITIM), ten se nachází v intracytoplazmatické části receptoru. Navázání ligandu vede ke shlukování inhibičních receptorů a fosforylaci tyrosinu pomocí src-kináz a dále k navázání tyrosin fosfatázy SHP-1 a SHP-2, nebo inositol-fosfatázy (SHIP) Tyto fosfatázy poté blokují kaskádu, spouštějící aktivační signály (Ahern D. J. et al., 2011). Mezi ligandy receptoru patří lidský lectin-like transkript-1 (LLT1), který je exprimován na antigen prezentujících buňkách a lymfocytech (Annunziato F. et al., 2012). Receptor CD161 (NKR-P1A) je rovněž exprimován především na NK buňkách, v menší míře také na CD4+ a CD8+ T lymfocytech a Th17 lymfocytech. CD161 slouží také jako kostimulační molekula, která reguluje činnost CD1d závislých T lymfocytů (Annunziato F. et al., 2012; Carlyle J. R. et al., 2008; O'Keeffe J. et al., 2008; Richter J. et al., 2010; Vidal S. M. et al., 2011). Buňky Th17 exprimují ve vysokém množství molekuly CD161, které se používají také jako jejich diferenciační znak (Ko K. K. et al., 2012). CD161 může mít podle některých publikací současně aktivační i inhibiční účinky v závislosti na typu buněk. Interakce mezi CD161 a LLT1 vede k inhibici cytotoxicity NK buněk. Naproti tomu tato interakce v kombinaci s T buněčným receptorem (TCR) aktivuje T buňky, které produkují IFNγ. CD161 u Th17 buněk působí jako koaktivační receptor a podporuje jejich expanzi (Kamishikiryo J. et al., 2011). Vliv exprese CD161 na dalších subpopulacích zatím není znám (Kesselring R. et al., 2011; Wilke C. M. et al., 2011). O významu tohoto receptoru v závislosti na autoimunitních chorobách zatím 25

víme velmi málo (Richter J. et al., 2010). I když detailní mechanizmus regulace pomocí receptoru CD161 není dobře znám, mohl by se stát novým cílem k potlačení interakce CD161 a LLT1, což by mohlo vést k regulaci autoimunitních a chronicky zánětlivých poruch (Kamishikiryo J. et al., 2011).

1.4 Léčba roztroušené sklerózy Standardní

léčebné

postupy

u

autoimunitních

nemocí

začínají

podáním

imunosupresivních preparátů pro potlačení zánětlivé reakce. Poté je obvykle zahájena terapie specifickými léčivy, z nichž u RS je prozatím lékem volby interferon β (IFNß). Přesné účinky Avonexu (IFNß1a) na průběh roztroušené sklerózy zatím nebyly plně objasněny. Byl však prokázán vliv na snížení aktivace transkripčních faktorů NF-κB a STAT6 a tím i snížení genové exprese regulované těmito transkripčními faktory, které se projeví

jako

snížení

produkce

cytokinů

(IFNγ,

IL-4/IL13

a TNFα).

Nejprve dochází k aktivaci transkripčního faktoru STAT1, kde následuje exprese tyrosin fosfatázy SHP-1, která se chová jako široký negativní regulátor STAT1, STAT6, a NF-κB (Christophi G. P. et al., 2011). Klinické testy dle výrobce potvrdily až 89% snížení počtu nově vzniklých aktivních lézí a až 91% zmenšení velikosti již existujících lézí (avonex.com). Změny ale byly pozorovány na všech buňkách imunitního systému. Byl prokázán zvýšený počet subpopulací Th2, Treg, NK a dendritických buněk i monocytů. IFNβ zvyšuje také genovou expresi GITRL (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand) u dendritických buněk. To má vliv na snížení proliferace T regulačních buněk (CD4+ CD25+ Foxp3+), ale také na expresi CTLA4 (negativní regulátor T buněčné aktivace), což vyvolává vyšší citlivost těchto buněk a regulační schopnosti (Aung L. L. et al., 2012; Chen M. et al., 2012). Většina pozorování na pacientech naznačuje pokles zánětlivé buněčné aktivity. (Rudick R. A. et al., 2011). Léčba Avonexem má i mnoho vedlejších účinků jako například horečku, bolest svalů a zimnici, které prokazatelně klesají v závislosti na čase. Další z nich (únava, bolesti hlavy, nespavost, deprese, reakce v místě vpichu, malátnost, slabost, nechutenství, nevolnost a pocení) se po dobu podávání většinou nemění (Vosoughi R. et al., 2010; Zivadinov R. et al., 2003). Stejně jako u jiných bílkovinných terapií, IFNβ může u některých pacientů vyvolat tvorbu protilátek a tím narušit účinnost léčby. Intramuskulárně aplikovaný Avonex patří mezi nejméně imunogenní, podle klinických 26

studií méně než 5% pacientů vyvinulo neutralizující protilátky. Naproti tomu podkožní aplikace IFNβ1b (Betaferon) je nejvíce imunogenní, kdy 35% pacientů rozvinulo protilátkovou odpověď. Podobně je na tom i podkožně podaný IFNβ1a (Rebif), kde 20-25% pacientů vykazovalo přítomnost neutralizačních protilátek (Rudick R. A. et al., 2011). Jiným typem z používaných léků je Glatiramer acetát (Copaxone), který se skládá ze čtyř aminokyselin (L-glutamová kyselina, L-lysin, L-alanin a L-tyrosin) imitující peptidovou sekvenci myelinového bazického proteinu (MBP). Mechanizmus účinku spočívá v kompetici peptidu s MBP a jeho vystavení na antigen prezentujících buňkách (Schrempf W. et al., 2007). V nedávné době byl v některých zemích schválen lék Fingolimod. Fingolimod je chemicky odvozen od myriocinu (ISP-1), který má imunosupresivní účinky a získává se z houby Isaria sinclairii. Fingolimod patří mezi modulátory sfingosin-1-fosfátového receptoru. Mechanizmus jeho účinku spočívá především v inhibici migrace lymfocytů z lymfoidních orgánů (Ingwersen J. et al., 2012) do místa zánětu. Mezi léky, které jsou teprve v klinických studiích či se používají u jiných onemocnění, patří: cladribin, mitoxantron,

pixantron,

teri-flunomid,

treosulfan,

natalizumab,

alemtuzumab,

daclizumab a rituximab. Některé z těchto léků mají ale vážné vedlejší účinky.(Stuve O., 2009).

27

2

Experimentální část

2.1 Chemikálie azid sodný (Sigma Chemical Co., USA) 51

Cr, chroman sodný (Perkin Elmer - Lacomed, ČR)

fetální telecí sérum (BioClot Ltd., SRN) gentamycin (IKEM - lékárna, ČR) médium RPMI 1640 (Úédium , ČR) l-glutamin (ÚMG AVČ, ČR) scintilační roztok SuperMix, (MP biomedicals - M.G.P.,ČR) Triton X 100 (Sigma AldrichChemical Co., USA) Türkův roztok (IKEM - lékárna, ČR) želatina (Sigma AldrichChemical Co., USA) chemikálie pro přípravu roztoků (Lachema s.r.o., ČR) HCl; KCl; Na2HPO4·12H2O; NaCl; NaH2PO4·2H2O; NaHCO3; NaOH

2.2 Materiál 96-jamkové destičky s kulatým dnem (Costar Inc., USA) centrifugační zkumavky 15 ml (SchoellerPharma, ČR) mikrozkumavky (SchoellerPharma, ČR) Petriho misky pro tkáňové kultury (FisherScientific, ČR) špičky pro automatické pipety-různé objemy (Analytika, ČR- Schoellerpharma, ČR)

28

2.3 Přístroje analytické váhy (Precisa Instrument AG, Švýcarsko) automatické pipety 10–5000 μl (Gilson Inc., USA) biohazard box (Jouan Inc., Francie) Bürkerova komůrka (Meopta a.s., ČR) CO2 termostat (Jouan Inc., Francie) dávkovací pipeta HandyStep (Brand, Německo) elektronická pipeta Finipette (ThermoLabsystems, USA) laserový scanner GeneTAC UC4 Microarray Scanner (Genomic Solutions Inc., USA) mrazící box (Sanyo-ultra low, Japonsko) průtokový cytometr BD LSR II (BectonDickinson, USA) pH metr (Volcraft, Německo) scintilační počítač MicroBetaTrilux (WallacOy, Finsko) světelný mikroskop (Opton Inc., Německo) univerzální chlazená centrifuga (Hermle AG, Francie) vortex mixer (Helago ČR)

2.4 Diagnostické soupravy Human Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 13plex Kit FlowCytomix BMS817FF (eBioscience, Inc., USA) Quantitative Antibody Arrays Quantibody® Human Th17 Array 1 (RayBiotech,Inc., USA)

29

2.5 Roztoky a média Fosfátový pufr (PBS) Do 1 litru deionizované vody přidáme 9,00g NaCl; 1,20g Na2HPO4·12H2O; 0,23g NaH2PO4·2H2O. Poté pomocí pH metru upravíme pH vzniklého roztoku na hodnotu mezi 7,2 – 7,4 pomocí přidání HCl nebo NaOH.

Roztok používaný pro průtokovou cytometrii (FPBS) Do 1 litru roztoku PBS se přidáme 1g želatiny a 0,2g azidu sodného (NaN3). Vše dobře protřepeme a promícháme, dokud se vše nerozpustí.

Türkův roztok pro počítání buněk Dodaný koncentrát Türkova roztoku naředíme destilovanou vodou v poměru 1: 4.

Médium H-MEMd Na 1 litr média dáme 100ml H-MEMd (10xkonc.); 2ml gentamycinu o koncentraci 50mg/ml a doplníme do 1000ml deionizovanou vodou. Upravíme pH na hodnotu 7,0 přidáním 7,5% NaHCO3.

Kultivační médium RPMI 1640 Na 1 litr média dáme 200ml roztoku RPMI 1640 (5xkonc.); 2ml gentamycinu o koncentraci 50mg/ml; 10ml 3% L-glutaminu a doplníme do 1000ml deionizovanou vodou. K tomuto roztoku ještě přidáme 25ml fetálního telecího séra (10%) a pomocí pH metru upravíme pH na hodnotu 7,4 přidáním 7,5% NaHCO3.

2.6 Linie cílových buněk pro test cytotoxicity Pro cytotoxický test jsme použili NK senzitivní buněčnou linii K562 což je lidská erytroleukémie. Buňky jsme kultivovali v kultivačním médiu RPMI 1640 v CO2 inkubátoru (5 % CO2; 37°C; 100% relativní vlhkost) a pasážovali po 48 hodinách. 30

2.7 Ředění monoklonálních protilátek pro FACS Všechny použité monoklonální protilátky jsme naředili v roztoku FPBS do směsí potřebných pro detekci jednotlivých buněčných subpopulací v následujícím ředění. 1. kombinace CD3 Pacific Blue; 1:20– Daco, Denmark CD56 APC; 1:10 – Exbio, ČR CD16b Alexa 700; 1:5 – Exbio, ČR CD28 PE-Cy7; 1:5 – e-bioscience, USA CD161 FITS; 1:5 – Serotec, USA CD4 APC-Alexa 750; 1:150 – CaltagUK CD8 Pacific Orange; 1:20 – Caltag UK NKG2D biotin; 1:60 – e-bioscience, USA 2. kombinace CD14 Pacific Blue; 1:200 – Caltag, UK CD161 FITS; 1:5 – Serotec, USA CD86 PE; 1:30 – Caltag, UK CD11c PE-Cy7; 1:20 – e-bioscience, USA CD80 APC; 1:5 – Exbio, ČR CD20 APC-Cy7; 1:10 – BD Bioscience, USA CD16b Alexa 700; 1:5 – Exbio, ČR NKG2D biotin; 1:60 – e-bioscience, USA Sekundární značení Streptavidin Qdot605; 1:200 Caltag, UK 31

Značení mrtvých buněk PI- propidium jodid; 1:10 – BD Bioscience, USA PI jsme přidali do každé skupiny a slouží k eliminaci mrtvých buněk ve vzorcích.

2.8 Statistické vyhodnocení dat Získaná data jsme zpracovali a do grafické podoby převedli pomocí Microsoft Excel 2010. Vypočítali jsme průměrné hodnoty všech měřených parametrů a jejich směrodatné odchylky. Statistickou analýzu jsme provedli v aplikaci GraphPadPrism 5, kde jsme pomocí t-testu výsledky vyhodnotili. Použili jsme metodu nulové hypotézy, kdy se oba soubory dat významně neliší. K rozhodnutí o platnosti nulové hypotézy jsme použili 95% interval spolehlivosti (p < 0,05).

2.9 Soubor pacientů a zdravých dárců Jako testovací skupinu jsme použili soubor 34 pacientů s diagnostikovanou roztroušenou sklerózou. Pro naši analýzu jsme použili periferní krev ve zkumavkách s anti-koagulačním činidlem EDTA. Vzorky od pacientů byly odebrány před zahájením a poté v průběhu léčby. Pacienti jsou muži i ženy v rozmezí 15-58 let s mediánem 29 let. Kontrolní skupinu tvoří soubor 118 dárců krve z transfúzního centra Thomayerovy nemocnice. Tuto skupinu tvoří muži i ženy ve věku 18–61 let s mediánem 35 let.

32

3

Metody

3.1 Průtoková cytometrie (FACS) Průtoková cytometrie (FACS) je laboratorní metoda schopná charakterizovat několik parametrů na velkém množství částic v suspenzi najednou, a to především na základě jejich fyzikálních, chemických a morfologických vlastností. Využití našla zejména v biomedicínských

oborech

například:

hematologii,

imunologii,

a

jiných.

Zde se používá k charakterizaci buněčných populací (odtud cytometrie). Charakterizace buněk analyzátorem FACS je založena na principu měření světelných rozptylů a intenzit fluorescence. Příprava buněk pro měření průtokovým cytometrem tedy spočívá především ve fluorescenčním značení pomocí monoklonálních protilátek proti specifickým extracelulárním nebo intracelulárním znakům. Takto označená a naředěná

suspenze

buněk

je

poté

nasáta

do analyzátoru,

kde

dochází

k hydrodynamické fokusaci proudu vzorku uprostřed laminárního proudu nosného média (PBS). V určitém bodě prochází proudem média s buňkami několik laserových paprsků o různých vlnových délkách, které excitují různé fluorescenční značky navázané na specifických strukturách měřených buněk. Díky hydrodynamické fokusaci a dostatečnému naředění buněčné suspenze je vysoká pravděpodobnost, že laserovým paprskem prochází vždy jen jedna buňka. Kromě emitované fluorescence se měří rozptyl světla, a to ve dvou směrech. Senzor forward-scatter (FSC) měří přímý rozptyl a senzor side-scatter (SSC) boční rozptyl (v úhlu 90° k laserovému paprsku a směru toku vzorku). Intenzitu signálu přímého rozptylu můžeme interpretovat jako velikost procházející buňky, zatímco intenzita signálu z bočního rozptylu vyjadřuje fyzikální vlastnosti povrchu buňky, její vnitřní členitost (granularitu) a optické vlastnosti jádra a cytoplasmy. Emitované fluorescenční světlo je měřeno pomocí fluorescenčních detektorů umístěných na výstupech optické dráhy analyzátoru. Jedná se o fotonásobiče, které zachytávají přicházející záblesky v momentě, kdy prochází buňka laserovým paprskem. Tyto impulsy poté mění v elektrické impulsy, které zaznamenává počítač. Vzhledem k tomu, že fotonásobiče jsou schopné registrovat pouze záblesk a jeho intenzitu, ale nejsou schopny rozlišit jeho vlnovou délku, je třeba zajistit přívod pouze jednoho typu záblesku k jednotlivým detektorům. Toho lze dosáhnout systémem filtrů a polopropustných zrcadel, které jsou zařazeny do optické dráhy analyzátoru tak, 33

aby se ke každému fotonásobiči dostaly pouze záblesky o požadované vlnové délce. Tento systém nám pak zaručí, že každý detektor bude počítat pouze záblesky a intenzitu emitované jedním konkrétním fluorescenčním barvivem (fluorochromem), respektive více barvivy emitujícími světlo o stejné nebo blízké vlnové délce. Ke značení povrchových nebo intracelulárních znaků na buňkách se používají monoklonální protilátky, na které je navázaný příslušný fluorochrom. Díky jejich specifické afinitě k danému antigenu (znaku) můžeme zjistit nejen počet buněk, které daný antigen nesou (počet záblesků na detektoru), ale pomocí intenzity záblesku můžeme zjistit v jakém relativním množství je daný znak přítomen. U většiny pokusů se využívá vícebarevného značení, kdy kombinace přítomných znaků přesněji ukazují na buněčný typ než jeden samostatný antigen. V takovémto případě je pochopitelné a nezbytné značit každý antigen jiným fluorochromem tak, aby se jejich emisní spektra nepřekrývala nebo překrývala co nejméně. V našem případě jsme používali cytometr BD LSR II, který využívá čtyři na sobě nezávislé lasery - fialový (405nm), modrý (488nm), žlutý (561nm) a červený (633nm). Specifické fluorochromy a filtry, které byly použity pro detekci, jsou uvedeny v tabulce č.1.

34

Specifický fluorochrom

Excitační vlnová délka Filtr použitý pro detekci (nm) (nm)

Pacific Blue

405

450/50

Pacific Orange

405

576/26

Qdot605

405

605/12

PE-Cy7

561

780/60

FITC

488

525/50

PerCP-Cy5.5

488

685/35

PE

561

585/15

PI

561

630/20

APC

633

660/20

AlexaFluor700

633

730/45

APC-AlexaFluor750

633

780/60

APC-Cy7

633

780/60

Tabulka č.1 Specifické fluorochomy a detektory. Pro detekci apoptózy a mrtvých buněk jsme použili propidium jodid (PI), který se váže specificky na DNA buněk. Živé buňky ale dokáží propidum jodid vyloučit a zůstávají při vyhodnocování PI negativní, mrtvé a apoptotické buňky se jeví jako PI pozitivní.

35

3.2 Příprava a značení buněk pro FACS Krev od pacientů a dárců jsme separovali pomocí centrifugy 40 minut na ficolltelebrixovém denzitním gradientu, abychom získali frakci mononukleárních buněk. Získané buňky jsme spočítali pomocí Bürkerovi komůrky a světelného mikroskopu a naředili v médiu H-MEMd na požadovanou koncentraci 5x105na 100µl, a přenesli do 96 jamkové mikrotitrační destičky s kulatým dnem. Destičku jsme zcentrifugovali na 360 G po dobu dvou minut a poté jsme médium odebrali. Peletu z buněk na dně jsme roztřepali na třepačce a promyli 200μl FPBS. Tento postup jsme opakovali třikrát, aby buněčná suspenze obsahovala co nejméně zbytků média. Po poslední centrifugaci jsme z jamek odebrali zbytek promývacího roztoku a peletu jsme roztřepali. Destičku jsme umístili na led a k buňkám jsme přidali všechny primární značené protilátky, které jsme naředili v FPBS do směsi v příslušném ředícím poměru a kombinaci pro danou skupinu (viz výše) v objemu 10μl. Při prvním měření a v pravidelných intervalech jsme přidali ještě do destičky vzorky, ke kterým jsme přidali pouze jednu značenou monoklonální protilátku od každého fluorochromu a jednu jamku čistých neznačených buněk. Tato kombinace nám poté posloužila při off-line kompenzaci přesvitů jednotlivých barev, kterou je nutno provést před vyhodnocením získaných dat. Buňky jsme inkubovali s přidanými monoklonálními protilátkami po dobu 30 minut ve tmě při 4°C. Po 30 minutách jsme do jamek přidali 200μl FPBS a buňky jsme třikrát promyli, aby došlo k dokonalému vymytí všech nenavázaných protilátek. Po promytí jsme pokračovali druhým stupněm značení. Do všech jamek, kde se vyskytuje primární protilátka značená biotinem, jsme přidali 10μl příslušně naředěného značeného streptavidinu, který se specificky váže na biotin. Tento druhý stupeň značení trval opět 30 minut při 4°C a ve tmě. Do jamek, do kterých jsme v daném kroku nepřidali protilátku ani streptavidin, jsme přidali stejné množství FPBS (10μl). Po sekundárním značení jsme buňky opět třikrát promyli. Získaná data z průtokového cytometru jsme zpracovali v softwaru Tree Star Flow Jo 8.9 a statisticky vyhodnotili (viz výše).

36

3.3 Vyhodnocovací strom vzorků A) Diskriminace doubletů

D) NK CD56bright ,NK CD56dim ,NKT

B) Lymphogate a monogate

C) PI negativní buňky

E) T lymfocyty

G) Tc CD8bright ,Tc CD8dim , Th CD4

Obr. 5 37

F) monocyty

Obr. 5 Znázornění postupu při vyhodnocování základních subpopulací. Dot bloty byly získané z programu FlowJo a šipky ukazují směr postupu při vytváření regionů. A) Na tomto dot blotu jsou odděleny samostatné buňky (tzv. singlet) od na sebe nalepených buněk (tzv. boublet). B) Ohraničení lymfocytů lymfocytární gate a větší monocytární gate . C) Na tomto dot blotu jsou z obou regionů (lymfocytární a monocytární) odděleny živé buňky od mrtvých pomocí propidium jodidu. D) Zde jsou pomocí znaků CD3 a CD56 odděleny v populace NK CD56bright ,NK CD56dim, NKT, které pochází původně z lymfocytárního gate. E) Pomocí znaků CD3 a CD28 byl oddělen gate s T lymfocyty, které pochází původně z lymfocytárního gate. Tyto buňky byly dále rozděleny pomocí znaků CD4 a CD8 na populace Tc CD8bright ,Tc CD8dim a Th (G) F) znázorňujeregion monocytů/makrofágů pomocí znaku CD14 , které pochází původně z monocytárního gate.

38

3.4 Test NK buněčné cytotoxicity Cytotoxickou aktivitu periferních mononukleárních buněk jsme určili pomocí standardního in vitro testu cytotoxicity s uvolňování radioaktivním izotopem chromu 51

Cr. Princip tohoto testu spočívá v inkorporaci 51Cr do cílových buněk a jejich inkubaci

s cytotoxickými buňkami, která má pak za následek lyzi cílových buněk a uvolnění 51Cr do supernatantu; ten se následně použije k detekci β záření. Efektorové buňky v kultivačním médiu RPMI-1640 jsme přenesli do jamek 96-jamkové mikrotitrační destičky (3,2 × 105 buněk na jamku). Každý vzorek jsme přenesli do pěti jamek. Poté jsme ke každému vzorku přidali vždy 104 buněk cílových buněk K562, které byly 90 minut značeny Na2 uvolňování

51

51

CrO4. Jako kontrola spontánního a maximálního

Cr do supernatantu jsme použili samotné cílové buňky kultivované

v čistém médiu a cílové buňky kultivované s přídavkem 10% Tritonu X-100. Po 3,5 a 18 hodinové inkubaci při 37°C, 5% CO2 a 100% vlhkosti jsme odebrali vždy 0,025 ml supernatantu, ke kterému jsme přidali 0,075ml scintilačního koktejlu (SuperMix, Wallac). Pomocí scintilačního počítače (Microbeta Trilux, Wallac) jsme změřili radioaktivitu vzorků a kontrol. Měření jsme provedli v paralelním měření, kdy jsme ke druhé sadě vzorků přidali 1000UI/ml léku Avonex. Cytotoxickou aktivitu buněk jsme vyjádřili v procentech cytotoxicity podle následujícího vzorce:

% ctx

cpmexp – množství

51

. 100

Cr uvolněného nádorovými buňkami v přítomnosti efektorových

buněk cpmspont – množství 51Cr uvolněného spontánně samotnými nádorovými buňkami cpmmax – množství

51

Cr uvolněného po úplném rozpadu cílových nádorových buněk

vlivem detergentu Triton X 100

39

3.5 Měření koncentrace cytokinů 3.5.1 Fluorescenční kuličková cytokinová imunoassay Fluorescenční

kuličková

cytokinová

imunoassay

anglicky

Fluorescent

Bead

Immunoassay je metoda, která využívá polyvinylchloridových kuliček s navázanými monoklonálními protilátkami. Tyto protilátky reagují s příslušnými cytokiny ve vzorku za tvorby imunokomplexu analytu a primární protilátky. Na analyt poté nasedá sekundární biotinylovaná protilátka, která má afinitu k jinému vazebnému epitopu na příslušném cytokinu. Po přidání streptavidinu, na kterém je navázaný phycoerythrin (PE), dojde k vazbě na biotinový konjugát a k projevu fluorescenčního signálu. Emitované fluorescenční záření jsme poté detekovali pomocí průtokové cytometrie (FACS). V našem případě jsme použili soupravu od společnosti ebioscence: Lidské Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 13plex Kit FlowCytomix, u kterého lze současně určit koncentraci 13 různých cytokinů – IFNγ, IL1β, IL2, IL4, IL5, IL6, IL9, IL10, IL12 p70, IL13, IL17A, IL22 a TNFα. Princip jednorázového stanovení 13 analytů spočívá v různé intenzitě vlastní fluorescence kuliček a jejich různé velikosti. Fluorescence jednotlivých populací kuliček, které lze pomocí průtokového cytometru od sebe odlišit.

Obr.

5

Schéma

principu

fluorescenční

kuličkové

cytokinové

imunoassaye

(ebioscence.com) Nejprve jsme si připravili roztok Assay buffer, který jsme naředili v určeném poměru. Dále jsme si připravili směs standardů tak, že jsme od každého standardu odebrali 10µl do mikrocentrifugační zkumavky a doplnili do objemu 200µl roztokem Assay buffer. Tuto zkumavku jsme označili jako standard 1. Poté jsme si připravili ředící řadu standardů tak, že do předem popsaných zkumavek S2 až S7 jsme napipetovali 100µl roztoku Assay buffer. Následně jsme přenesli 50µl ze zkumavky standard 1 do zkumavky S2 a důkladně promíchali. Tímto způsobem jsme pokračovali i u ostatních zkumavek. Dalším krokem byla příprava mixu kuliček. Na každou zkumavku bylo zapotřebí 25µl mixu kuliček. Dále jsme přidali 1/20 výsledného objemu 40

Reagent Dilution Buffer (RDB) a protřepali. Následně jsme centrifugovali 5 minut při 300 G. Odebrali jsme supernatant tak, že ve zkumavce zbylo zhruba 50µl sedimentu. Přidali jsme zhruba stejné množství RDB, které jsme odebrali. Dalším krokem bylo naředění biotin-konjugátu a streptavidinu v poměru uvedeném na obalu. Poté jsme postupovali dle návodu uvedeného výrobcem.

3.5.2 Quantibody array Quantibody array je založena na mnohonásobné sendvičové ELISA metodě a umožňuje přesné stanovení koncentrace mnoha cytokinů současně. Tato metoda kombinuje výhody vysoké detekční citlivosti a specifičnosti. Stejně jako u tradiční sendvičové ELISA se používá dvojice protilátek specifických pro detekci cytokinů. Prvním stupněm je zachycení specifických monoklonálních protilátek na povrchu skla v přesném umístění. Po inkubaci se vzorky dojde na specifické navázání cytokinů a protilátky za vzniku imunokomplexu, na který se následně naváže druhá specifická protilátka. Tato protilátka se váže na jiný epitop cytokinu a je značená biotinem. Pro vizualizaci

se

používá

streptavidin

značený

cyaninem

3

(Cy3),

který

je detekovatelný laserovým skenerem. V našem případě jsme použili laboratorní set od firmy RayBiotech, Inc. - Quantibody Human TH17 Array 1, který nabízí stanovení 20 cytokinů v jednom čipovém poli: GM-CSF, IL1β, IL2, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12p70, IL13, IL17, IL17F, IL21, IL22, IL23, IL28, IFNγ, MIP-3α, TGFβ1, TNFα a TNFβ.

Obr.6 Schéma Quantibody array analýzy.(raybiotech.com) 41

Prvním krokem při Quantibody array analýze je přizpůsobení sklíčka s nástavcem vymezující jednotlivé cytokinové čipy na okolní teplotu, kdy jsme sklíčko vyjmuli a nechali v laminárním boxu na hodinu a půl se přizpůsobit. Mezitím jsme si připravili ředící řadu standardů. Do lyofilizovaného standardu jedna jsme přidali 500µl ředícího roztoku (Sample dilution). Do dalších šesti označených zkumavek jsme napipetovali 200µl ředícího roztoku. Postupně z prvního standardu jsme přenesli 100µl do následující zkumavky a vzniklý naředěný standard jsme promíchali. Takto jsme postupovali i u dalších zkumavek ředící řady. Jednu zkumavku jsme si označili jako kontrolu a přidali do ní 100µl ředícího roztoku. Dále jsme postupovali podle protokolu uvedeného výrobcem.

42

4

Výsledky

Vzorky periferní krve pacientů byly odebrány v tomto pořadí. První odběr byl proveden před nasazením léčby, jsou to takzvaní naivní pacienti, kteří byli nově diagnostikováni. Druhý odběr byl proveden v rozmezí 2-4 týdnů po prvním odběru, kdy již započala léčba. Třetí odběr byl proveden v rozmezí 5-9 týdnů a čtvrtý v rozmezí 10-16 týdne, oba od doby prvního odběru. V každém pokusu byly měřeny i vzorky periferní krve od zdravých dárců. Všichni nově diagnostikovaní (naivní) pacienti započali léčbu Avonexem až po prvním odběru. Signifikantní rozdíly mezi skupinou pacientů a zdravými dárci byly hodnoceny pomocí nepárového t-testu. Pro vyhodnocení výsledků získaných u jednotlivých pacientů v průběhu léčby byl použitý párový t-test. Statisticky významné rozdíly jsou v grafech značeny symboly * (p≤0,05), ** (p≤0,01), *** (p≤0,001).

Buněčné

subpopulace

a

další

analýza

jejich fenotypu

byly

vyhodnocovány pomocí softwaru FlowJo 8 a 9 , kde jsme ohraničili specifické oblasti výskytu lymfocyty pro účely analýzy nazvaný jako lymfocytární gate, ve kterém se vyskytovalo průměrně 89500 buněk, a region s vyšší autofluorescencí označený jako monocytární gate, kde se vyskytovalo průměrně 26500 buněk. Zkratky použité v grafech: Z.D.= zdravý dárce, P.O.= pacientský odběr. Procentuální zastoupení jednotlivých subpopulací v periferní krvi

4.1 Procentuální zastoupení jednotlivých subpopulací v periferní krvi Předmětem této studie byly subpopulace cytokin produkčních (CD3- CD56bright)  a zabíječských (CD3- CD56  dim) NK buněk, NKT (CD3+ CD56+) Th (CD3+ CD28+ CD4+), Tc (CD3+ CD28+ CD8+) a monocytů/makrofágů definovaných pro účely této práce jako CD14+ z monocytárního gate. Souhrn výsledků zastoupení těchto subpopulací je uveden v tabulce 2. Mezi jednotlivými skupinami jsme nenašli žádné signifikantní rozdíly, které byly zřejmě dány značným rozptylem hodnot v rámci jednotlivých souborů.

43

% 

ZD 

Naivní 

Léčený 

NK CD56 bright 

0,9 ± 0,63 

0,52 ± 0,46 

0,69 ± 0,49 

NK CD56 dim 

14,19 ± 7,91 

9,1 ± 5,67 

10,16 ± 5,69 

NKT 

1,23 ± 1,17 

0,75 ± 0,67 

1,3 ± 1 

Th 

81,1 ± 8,46 

84,47 ± 11,5 

75,45 ± 15,18 

Tc 

12,67 ± 6,29 

8,9 ± 6 

9,61 ± 6,4 

monocyty 

70 ± 16,78 

61,8 ± 23,8 

49,8 ± 23,14 

Tabulka č.2 - Procentuální zastoupení jednotlivých subpopulací v periferní krvi u zdravých dárců (ZD), při prvním odběru (Naivní) a při druhém odběru (Léčený). Všechny subpopulace kromě monocytů, jsou vztaženy procentuálně na lymfocytární gate. Monocyty jsou určeny z monocytárního gate. Signifikantní rozdíly nebyly pozorovány. Další uvedené výsledky se zabývají expresí znaků CD161 a NKG2D na vybraných subpopulacích buněk, které jsou zapojeny v patogenezi RS. Zajímali nás především možné rozdíly v expresi CD161 receptoru na NK buňkách, kde má jeho vazba na specifický ligand LLT1 inhibiční funkci oproti jeho aktivačnímu charakteru na CD3+ T lymfocytech. Změny v počtu buněk nesoucích receptory CD161 a NKG2D byly patrné téměř na uvedených subpopulacích, které jsme charakterizovali.

44

4.2 Exprese znaků CD161 a NKG2D u subpopulací NK, NKT a T buněk a monocytů/makrofágů

Cytokin produkční NK buňky (CD3- CD56+bright) A

B

Graf 1. Exprese A) CD161+ B) NKG2D+ znaků na cytokin produkčních NK buňkách charakterizovaných jako CD3- CD56+bright (odpovídá průměrně 0,71% buněk z lymfocytárního gate) U cytokin produkčních NK buněk CD3-CD56bright (graf.1AB) byly nalezeny významné změny u obou receptorů. Na grafu 1A je znázorněna exprese CD161, která je významně zvýšena (p≥0,001) u naivních pacientů a léčbou není významně ovlivněna v porovnání se zdravými dárci. Naproti tomu počet CD56bright buněk nesoucích aktivační NKG2D receptor u neléčených pacientů klesá (graf 1B). Vlivem léčby dochází k jejich postupnému nárůstu, ale k vyrovnání hodnot se zdravými dárci nedošlo. 45

Cytotoxické NK buňky (CD3- CD56+dim) A

B

Graf 2. Exprese A) CD161+ B) NKG2D+ znaků na cytotoxických NK buňkách charakterizovaných jako CD3- CD56+dim (odpovídá průměrně 10,5% buněk z lymfocytárního gate) Výsledky u subpopulace cytotoxických NK buněk CD3- CD56dim (graf. 2AB) se liší od předešlé subpopulace. Signifikantní zvýšení exprese inhibičního receptoru CD161 je patrné až od 2. PO tzn. až po započetí terapie. Trend zvyšování je ještě u 3. odběru, ale při 4. odběru strmě klesá k hodnotám zdravých dárců. Zrcadlovým obrazem je relativní zastoupení NKG2D+ cytotoxických NK buněk (graf 2B). Hodnoty u neléčených pacientů jsou významně snížené a ani po nasazení Avonexu nedochází k jejich nárůstu na hodnoty zdravých dárců. 46

NKT buňky (CD3+ CD56+) A

B

Graf 3. Exprese A) CD161+ B) NKG2D+ znaků na NKT buňkách charakterizovaných jako CD3+ CD56+ (odpovídá průměrně 1,1% buněk z lymfocytárního gate) Na NKT buňkách (CD3+CD56+) jsme v expresi znaku CD161 nenalezli žádné signifikantní změny (graf 3A). U exprese znaku NKG2D (graf 3B) je patrné signifikantní snížení u naivních pacientů. Na úroveň zdravých jedinců se dostává až mezi 5. – 9. týdnem terapie (3. odběr).

47

Th buňky (CD3+ CD28+ CD4+) A

B

Graf 4. Exprese A) CD161+ B) NKG2D+ znaků na Th buňkách charakterizovaných jako

CD3+

CD28+

CD4+

CD8-

(odpovídá

průměrně

44%

počtu

buněk

z lymfocytárního gate) Relativní

zastoupení

CD161+

Th

buněk

(CD3+CD4+CD28+)

v současnosti

považovaných za Th17 populaci, je signifikantně zvýšeno u naivních pacientů a v průběhu léčby dochází k jejich dalšímu progresivnímu nárůstu (graf 4A). Naproti tomu počet NKG2D+ Th buněk klesá od 1. odběru, ale statisticky významný rozdíl je zaznamenaný až po započetí léčby (2. odběr). Tento trend je rovněž progresivní i v průběhu léčby.

48

Tc buňky (CD3+ CD28+ CD8+bright) A

B

Graf 5. Exprese A) CD161+ B) NKG2D+ znaků na cytotoxických T buňkách charakterizovaných jako CD3+ CD28+ CD4- CD8+bright (odpovídá průměrně 6% počtu buněk z lymfocytárního gate) Změny u buněk Tc CD3+ CD28+ CD8bright, které nesou na svém povrchu CD161, jsme zaznamenali pouze u nově diagnostikovaných pacientů (graf 5A). Po nasazení Avonexu dochází ke skokovému snížení zastoupení těchto buněk a naměřené hodnoty se od kontrolních vzorků. Relativní zastoupení NKG2D+ Tc buněk (graf 5B) se velmi podobá trendu u NKT buněk (graf 3B), kde také dochází ke snížení jejich počtu v prvním odběru, ale 5.-9. týden léčby (třetí odběr) vykazuje zvýšení k hodnotám zdravých dárců. 49

Tc buňky (CD3+ CD28+ CD8+dim) A

B

Graf 6. Exprese A) CD161+ B) NKG2D+ znaků na cytotoxických T buňkách charakterizovaných jako CD3+ CD28+ CD4- CD8+dim (odpovídá průměrně 1,4% buněk z lymfocytárního gate) Hodnoty u subpopulace Tc CD3+ CD28+ CD8dim se liší od výsledků subpopulace Tc CD8bright tím, že počet CD161+ (graf 6A) je signifikantní zvýšení patrné také u druhého odběru. Poté se zastoupení těchto buněk dostává na úroveň zdravých dárců. Graf 6B znázorňuje relativní zastoupení NKG2D+ CD8dim Tc buněk, které je pacientů snížené a vlivem léčby nedochází k jejich nárůstu jako u Tc CD8bright buněk (graf 5B).

50

Monocyty/makrofágy (CD14+) A

B

Graf 7. Exprese A) CD161+ B) NKG2D+ znaků na monocytech charakterizovaných jako CD14+ (odpovídá průměrně 63% buněk z monocytárního gate) Měření exprese CD161 na CD14+ buňkách (monocyty/makrofágy) (graf 7A) ukázalo signifikantní snížení počtu buněk nesoucích tento znak zejména u pacientů léčených Avonexem. Stejný trend byl prokázán také u CD14+NKG2D+ monocytů. (graf 7B). Význam exprese těchto receptorů na monocytech/makrofázích zatím není známý

51

Z výsledků FACS analýzy vyplývá, že se zde vyskytuje několik trendů ve změnách počtu buněk s nesoucích znak CD161. Většina populací vykazuje při prvním odběru (pacienti před léčbou) statisticky významné zvýšení (NK CD56dim, Tc CD8dim, CD8bright a Th) (grafy 1A.,4A, 5A. a 6A). U cytotoxických NK buněk CD56dim je signifikantní zvýšení zaznamenané až po započetí léčby, u druhého odběru (graf.2A). Na NKT subpopulaci nebyly žádné změny pozorovány (graf.3A). Překvapivě opačný trend mají monocyty/makrofágy , kdy exprese CD161 klesá (Graf.7A). Po zahájení léčby se trend rozděluje na postupné zvyšování počtu buněk nesoucích znak CD161 (Th lymfocyty) (graf 4A), nebo jejich postupný návrat k hodnotám zdravých dárců (NK CD56dim, Tc CD8dim a CD8bright) (grafy 2A, 5A, 6A) Překvapivý a ojedinělý trend se objevil u monocytů, kdy již od prvního odběru exprese klesá (graf 7A). Snížení aktivačního receptoru NKG2D u neléčených pacientů jsme zjistili na všech námi sledovaných subpopulacích. Snížení při prvním odběru jsme popsali u buněk CD56dim, NKT, Tc CD8bright, CD8dim (graf.1B-3B, 5B a 6B). U Th buněk a monocytů dochází ke snížení až při druhém odběru (graf 4B a 7B). Léčba neovlivňuje relativní zastoupení NKG2D+ buněk u subpopulací NK CD56bright, CD56dim, Tc CD8dim (grafy 1B, 2B, 6B). Návrat ke kontrolním hodnotám byl zjištěn u NKT a Tc CD8brigh buněk v období 5. Až 9. týdne po započetí léčby Avonexem (grafy 3B a 5B). Naopak snížené počty NKG2D+ Th lymfocytů pod vlivem léčby nadále progresivně klesají.

52

4.2.1 Výsledky statisticky významných rozdílů párových t-testů hodnocených u individuálních pacientů v průběhu léčby Abychom přesněji stanovili vliv léčby Avonexem na zjištěné rozdíly sledovaných subpopulací imunitních buněk, hodnotili získaná data u jednotlivých pacientů v definovaných časových intervalech po započetí terapie 1. P.O. (O. den) 2. P.O. (2-4 týdny), 3. P.O. (5-9 týdnů) a 4. P.O. (10-16 týdnů) párovým t-testem. Zpracované výsledky jsou uvedeny v tabulkách 2 - 7 podle sledovaných subpopulací, u kterých byly zjištěny statisticky významné rozdíly.

1.P.O. 2.P.O. 3.P.O. 4.P.O.

1.P.O.

2.P.O.

3.P.O.

n.s. * (zvýšení)) n.s.

n.s. n.s.

n.s.

4.P.O.

Tabulka 3. Vliv terapie na relativní zastoupení CD161+ cytotoxických T buněk charakterizovaných jako CD3+ CD28+ CD4- CD8+bright (odpovídá průměrně 6% buněk z lymfocytárního gate).

1.P.O. 2.P.O. 3.P.O. 4.P.O.

1.P.O.

2.P.O.

3.P.O.

n.s. n.s. ** (pokles)

n.s. n.s.

n.s.

4.P.O.

Tabulka 4. Vliv terapie na relativní zastoupení CD161+ Th buněk charakterizovaných jako CD3+ CD28+ CD4+ CD8- (odpovídá průměrně 44% buněk z lymfocytárního gate).

1.P.O. 2.P.O. 3.P.O. 4.P.O.

1.P.O.

2.P.O.

3.P.O.

n.s. n.s. ** (pokles)

n.s. n.s.

n.s.

4.P.O.

Tabulka 5. Vliv terapie na relativní zastoupení CD161+ monocytů/makrofágů charakterizované jako CD14+ (odpovídá průměrně 63% buněk z monocytárního gate).

53

1.P.O. 2.P.O. 3.P.O. 4.P.O. Tabulka

6.

1.P.O.

2.P.O.

3.P.O.

n.s. * (zvýšení) n.s.

n.s. n.s.

n.s.

Vliv

charakterizovaných

terapie jako

na CD3+

4.P.O.

relativní

zastoupení

NKG2D+

NKT

buněk

CD56+

(odpovídá

průměrně

1,1%

buněk

z lymfocytárního gate)

1.P.O. 2.P.O. 3.P.O. 4.P.O.

1.P.O.

2.P.O.

3.P.O.

n.s. n.s. n.s.

* (zvýšení) n.s.

n.s.

4.P.O.

Tabulka 7. Vliv terapie na relativní zastoupení NKG2D+ cytotoxických T buněk charakterizovaných jako CD3+ CD28+ CD4- CD8+bright (odpovídá průměrně 6% buněk z lymfocytárního gate).

1.P.O. 2.P.O. 3.P.O. 4.P.O.

1.P.O.

2.P.O.

3.P.O.

n.s. * (pokles) * (pokles)

n.s. n.s.

n.s.

4.P.O.

Tabulka 8. Vliv terapie na relativní zastoupení NKG2D+ Th buněk charakterizovaných jako CD3+ CD28+ CD4+ CD8- (odpovídá průměrně 44% buněk z lymfocytárního gate). S využitím párových t-testů u jednotlivých pacientů v průběhu terapie prokázaly statisticky

významný

pokles

v relativním

zastoupení

CD161+

Th

buněk

a monocytů/makrofágů. Návrat počtu buněk na úroveň zdravých dárců byla zjištěna u CD161+ Tc CD8bright subpopulace. Snížené hodnoty NKG2D+ Th buněk vlivem léčby nadále klesaly. Zvýšení relativního zastoupení na kontrolní hodnoty bylo zjištěno u NKG2D+ NKT a Tc CD8bright buněk. Léčba neovlivňovala CD161 ani NKG2D expresi na NK a Tc CD8dim buňkách.

54

4.3 Výsledky testů NK buněčné cytotoxicity

C

A

B

D

Graf.8. Výsledky cytotoxického testu po 1. odběru po A) 3,5h. B) 18h. a po přidání interferonu β1a (1000UI/ml) k efektorovým buňkám na 30 minut před nasazením cílových buněk C) 3,5h. D) 18h.

55

C

A

B

D

Graf.9. Výsledky cytotoxického testu po 2. odběru po A) 3,5h. B) 18h. a po přidání interferonu β1a (1000UI/ml) k efektorovým buňkám na 30 minut před nasazením cílových buněk C) 3,5h. D) 18h.

56

C

A

B

D

Graf.10. Výsledky cytotoxického testu po 3. odběru po A) 3,5h. B) 18h. a po přidání interferonu β1a (1000UI/ml) k efektorovým buňkám na 30 minut před nasazením cílových buněk C) 3,5h. D) 18h.

57

C

A

B

D

Graf.11. Výsledky cytotoxického testu po 4. odběru po A) 3,5h. B) 18h a po přidání interferonu β1a (1000UI/ml) k efektorovým buňkám na 30 minut před nasazením cílových buněk C) 3,5h. D) 18h.

58

Zjistili jsme statisticky významné rozdíly v hodnotách cytotoxických aktivit NK buněk mezi pacienty a dárci. Aktivita byla měřena při každém odběru po 3,5h a 18h ve dvou skupinách, kdy jsme souběžně testovali také účinky interferonu β1a (Avonex) in vitro na NK buněčnou zabíječskou aktivitu. U neléčených pacientů a na počátku léčby (1. a 2. odběr) byla signifikantně snížená NK buněčná cytotoxicita (Graf. 8A,B., 9A,B). Při třetím odběru byla statisticky snížená aktivita u pacientů pouze po časovém intervalu 18h (Graf. 10B). U posledního odběru, jsme již žádnou signifikantní změnu oproti hodnotám zdravých dárců nezpozorovali (Graf. 11A,B). U vzorků s přídavkem interferonu β1a byly hodnoty NK buněčné funkce na úrovni zdravých dárců ve všech sledovaných časových intervalech (nenalezli jsme žádné signifikantní změny). Na základě našich výsledků můžeme tedy usuzovat, že IFN1a působí na výkonnou funkci buněk NK, a tím se podílí na celkovém pozitivním účinku léčby Avonexem.

59

4.4 Výsledky měření plazmatické hladiny cytokinů

Graf.12. Koncentrace IL6 u zdravých dárců a neléčených pacientů.

Graf.13. Koncentrace IL17 u zdravých dárců a neléčených pacientů.

Pro potvrzení aktivace Th17 buněk u pacientů před započetím léčby jsme provedli měření hladiny panelu pro- i proti-zánětlivých cytokinů (viz. Metody - kapitola 3.5). Statisticky významné rozdíly v plazmatických koncentracích cytokinů mezi pacienty s roztroušenou sklerózou a zdravými dárci jsme zaznamenali pouze při použití Quantibody array u IL6 a IL17. Ostatní sledované cytokiny u obou metod byly v porovnání s kontrolami nesignifikantní. 60

5

Diskuze

V této studii jsme se zabývali zapojením NK buněk v autoimunitním procesu roztroušené sklerózy a expresí C-lektinových receptorů (NKG2D a CD161) na subpopulacích lymfocytů (NK, NKT a T) a monocytů/makrofágů u nově diagnostikovaných pacientů a v průběhu léčby Avonexem (IFNβ1a). Receptor CD161 byl poprvé popsán na NK buňkách, nověji také na CD4+ a CD8+ T lymfocytech a jako jeden z charakteristických znaků Th17 buněk (Annunziato F. et al., 2012; Vidal S. M. et al., 2011). Literatura je nejednotná nejen, co se týká inhibiční/aktivační funkce tohoto receptoru na různých subpopulacích lymfocytů, ale také u NK buněk. V časných vývojových stadiích NK buněk funguje jako aktivační receptor spouštějící produkci IL8 a CXCL8 chemokinu (Montaldo E. et al., 2012). Po prokázání přítomnosti na tyrosinu založeného inhibičního motivu (ITIM) se novější publikace přiklání k inhibiční funkci (Ahern D. J. et al., 2011). Vysoká exprese CD161 na CD8+ T lymfocytech syntetizujících IL17 u pacientů s RS nebo RA je považována za kostimulační signál vedoucí

k produkci

IFNMolekuly

CD161

na

CD8+

buňkách

současně

s chemokinovým receptorem CCR6 (směruje transport do CNS) předurčují jejich prozánětlivou funkci a mohou se tedy podílet na imunopatologii RS. (Annibali V. et al., 2011). Podle této studie se předpokládá možná asociace genetické predispozice v oblasti kódující právě receptor CD161. Lze předpokládat, že genetická zátěž tohoto onemocnění bude úzce spjata s tímto receptorem. Výsledky průtokové cytometrie prokazují procentuální změny u subpopulací buněk mezi pacienty s roztroušenou sklerózou a zdravými dárci. V naší studii jsme prokázali signifikantní zvýšení počtu buněk nesoucích receptor CD161 na populacích cytokin produkčních NK CD56bright buněk (graf 1A), Th (graf 4A), Tc CD8bright (graf 5A) a Tc CD8dim (graf 6A) lymfocytů u pacientů, kteří ještě nebyli léčeni. Subpopulace CD161+ zabíječských NK CD56dim buněk se zvýšila až v časných stadiích léčby Avonexem. Cytotoxická výkonná funkce NK buněk měřená ve stejných časových intervalech byla u pacientů (1. a 2. odběr) podle našich výsledků signifikantně snížená (Grafy 8A, 8B, 9A, 9B a 10B). Vysvětlujeme si to tím, že aktivační receptor NKG2D u těchto buněk, byl významně snížený (graf 2B). Vzhledem k tomu, že záleží na poměru aktivačních a inhibičních receptorů, který v tomto případě jasně poukazuje na snížení NKG2D, exprese CD161 nemusí být tak vysoká, aby potlačila cytotoxickou aktivitu NK buněk. Naproti tomu 61

IFN1a přidaný k PBMC in vitro stimuloval NK buněčnou aktivitu ve všech časových intervalech na hodnoty zdravých dárců. Na základě těchto výsledků usuzujeme, že v organizmu mohou být zapojeny další faktory, které účinky IFNoslabují a tím i prodlužují nástup jeho působení na NK buněčnou funkci. Podobně, zvýšená exprese CD161 na NK buňkách u pacientů s revmatoidní artritidou vykazovala snížení jejich funkční aktivity (Richter J. et al., 2010). Naše výsledky u pacientů s RS podporují tuto hypotézu. Účinek léku je postupný, kdy již prokázané snížení cytotoxické aktivity u těchto pacientů se v intervalech námi odebraných vzorků zvyšuje k hodnotám zdravých dárců (graf 9-12). Ke snížení cytotoxické aktivity přispívá i fakt, že aktivační receptor NKG2D byl u NK buněk CD56dim signifikantně snížený (graf 2B). NKG2D je aktivační

nebo

koaktivační

receptor

na lidských

NK

buňkách,

γ/δ T buňkách, a α/β CD8+ T buňkách a jeho zapojení stimuluje sekreci cytokinů (IFNγ, TNFα a GM-CSF) a uvolnění cytolytických granulí nezbytných pro výkon cytotoxické funkce (Raulet D. H., 2003; Saikali P. et al., 2007). Literatury o expresi inhibičního receptoru CD161 u pacientů s RS je velmi málo. Autoři (O'Keeffe J. et al., 2008) zde uvádí snížení exprese CD161 znaku pouze na buňkách CD3+ CD94+ u pacientů s RS, ale jeho expresí na dalších subpopulací se nezabýval. Zvýšená exprese CD161 na CD8+ T lymfocytech byla potvrzena u pacientů s RS na základě genové exprese ve studii (Annibali V. et al., 2011), kde prokázali jejich prozánětlivou úlohu zvýšenou produkcí IFNγ, který aktivuje Th1 lymfocyty a následně i klinický průběh onemocnění. V naší studii jsme zjistili, že počáteční zvýšení relativního zastoupení populace CD8+ CD161+ T lymfocytů (graf 5A, 6A), kde CD161 slouží jako aktivační receptor (Annibali V. et al., 2011) v průběhu léčby klesá na úroveň zdravých dárců. Což je pravděpodobně jeden z možných mechanizmů pozitivních účinků léčby IFNβ1a. Zvýšené zastoupení CD161+ CD3+CD4+ Th populace může poukazovat na aktivaci Th17 buněk. Bylo prokázáno, že u pacientů s Crohnovou chorobou CD4+ T buňky mající

vysokou

expresi

znaků

CD161

i

NKG2D

se

diferencují

právě

na Th17 subpopulaci (Pariente B. et al., 2011). Tyto nálezy byly potvrzeny i zvýšenou hladinou IL17 v plazmě naivních pacientů (graf 13). Dalším důležitým průkazem našich výsledků by bylo stanovení transkripčního faktoru RORγt. V průběhu léčby populace CD4+ NKG2D+ dle našich měření klesá (graf 4B). Můžeme tedy předpokládat pozitivní efekt léčby na snížení počtu buněk diferencujících se na prozánětlivé Th17 buňky a tím i potlačení zánětu. Pokles NKG2D jsme popsali i u populací NKT 62

(graf 3B), Th (graf 4B), Tc CD8bright (graf 5B), Tc CD8dim buněk (graf 6B) a monocytech/makrofázích (graf 7B). Pokles exprese NKG2D na NK buňkách byl popisován i u jiných autoimunitních onemocnění například diabetes I. typu (FlodstromTullberg M. et al., 2009). U pacientů s RS tento pokles zatím nebyl publikován. Pro srovnání Copaxone nemá na expresi NKG2D u pacientů s RS vliv (Sand K. L., 2009). Můžeme se tedy domnívat, že se jedna o specifický účinek Avonexu. Pokles exprese tohoto receptoru může znamenat narušenou funkční aktivitu NK buněk i u dalších autoimunitních chorob. Zjištěné fenotypové změny na CD4+ Th buňkách jsme chtěli ověřit pomocí měření hladiny cytokinů v plazmě pacientů použitím dvou screeningových metod fluorescenční kuličkovou cytokinovou immunoassay (CBA) a Quantibody array. Statisticky významné rozdíly jsme nalezli pouze při použití Quantibody array u cytokinů IL6 a IL17 (graf 12,13). Zvýšené koncentrace těchto cytokinů byly již dříve potvrzeny, ale ne všechny práce se shodují v signifikantnosti. Může to být zapříčiněno jinými analytickými testy jako je ELISA test či uchováváním vzorků (Chen Y. C. et al., 2012; Huang Y. M. et al., 1999; Kouwenhoven M. et al., 2001; Kurtuncu- M. et al., 2012; Mikulkova Z. et al., 2011) Další studie ukazují i další rozdíly v koncentracích cytokinů u pacientů: například zvýšení IL4, IL5, IL8, IL12, IL15,TGFβ, IFNγ, TNFα či snížení IL10 (Heesen C. et al., 2002; Imitola J. et al., 2005; Kouwenhoven M. et al., 2001; Rentzos M. et al., 2006; Soldan S. S. et al., 2004). Literatura k těmto výsledkům je ale nejednotná. Některé studie poukazují pouze na jeden signifikantní rozdíl a někdy si přímo protiřečí jako například u snížení/zvýšení IL10 (Imitola J. et al., 2005) a (Mikulkova Z. et al., 2011). Výsledky CBA analýzy, kde jsme nedetekovali žádné změny, může mít více příčin. Vzhledem k technickým parametrům diagnostických sad nebylo možné stanovit každý vzorek ihned po přijetí, museli tedy být uchovány pro hromadné měření při -80°C. Vzhledem k tomu, že vzorky krve od pacientů byly získávány v delších časových intervalech (cca 1-2 roky) a většinu cytokinů jsme nedetekovali, lze předpokládat, že byly pod detekčním limitem nebo byly vzorky poškozeny uchováním při -80°C , což je ale v rozporu s článkem, na jehož základě jsme tento způsob uchování použili (de Jager W. et al., 2009).

63

6

Závěr

Ve své diplomové práci jsem se zabýval studiem exprese vybraných buněčných znaků na myeloidních a lymfoidních buňkách u pacientů s diagnostikovanou roztroušenou sklerózou. Dále jsem sledoval změny cytotoxické aktivity efektorových buněk u těchto pacientů a produkci cytokinů v krevní plazmě. Jako kontrolu jsem použil periferní krev zdravých dárců z transfúzního centra. Získané výsledky ukázaly, že u neléčených pacientů dochází ke: 

zvýšení počtu buněk exprimujících lektinový receptor CD161 u subpopulací NK CD56bright, NK CD56dim, Th, Tc CD8bright a Tc CD8dim



snížení počtu buněk exprimující aktivační znak NKG2D u subpopulací NK CD56bright,

NK

CD56dim,

NKT,

Th,

Tc

CD8bright,

Tc

CD8dim

a monocytů/makrofágů 

snížení počtu CD14+ monocytů/ makrofágů exprimujících receptor CD161



snížení NK buněčné cytotoxicity u naivních pacientů,



zvýšení koncentrace cytokinů IL6 a IL17

Léčba Avonexem o normalizuje zastoupení CD161+ Tc CD8bright buněk, NKG2D+ NKT a NKG2D+Tc CD8bright lymfocytů o potencuje změny v expresi CD161 a NKG2D vyvolané RS na Th buňkách o neovlivňuje CD161 ani NKG2D expresi na NK a Tc CD8dim buňkách o NK buněčná cytotoxicita se po podání IFNβ1a normalizuje

64

7

Literatura

Ahern D. J., Brennan F. M. 2011: The role of Natural Killer cells in the pathogenesis of rheumatoid arthritis: Major contributors or essential homeostatic modulators? Immunology Letters 136, 115–121. Alexander J. S. et al. 2011: Multiple sclerosis and cerebral endothelial dysfunction: Mechanisms. Pathophysiology 18, 3–12. Alizadeh M. et al. 2003: Genetic analysis of multiple sclerosis in Europeans: French data. Journal of Neuroimmunology 143, 74–78. Allen J. A., Stein R., Baker R. A. and Royden Jones H. 2008: Muscle atrophy associated with multiple sclerosis: A benign condition or the onset of amyotrophic lateral sclerosis? Journal of Clinical Neuroscience 15, 706–708. Annibali V. et al. 2011: CD161(high)CD8 cells bear pathogenetic potential in multiple sclerosis. Brain 134, 542–554. Annunziato F., Cosmi L., Liotta F., Maggi E. and Romagnani S. 2012: Defining the human T helper 17 cell phenotype. Trends in Immunology Aristimuno C. et al. 2010: IFN+--1a therapy for multiple sclerosis expands regulatory CD8+ T cells and decreases memory CD8+ subset: A longitudinal 1-year study. Clinical Immunology 134, 148–157. Aung L. L. et al. 2012: Multiple sclerosis-linked and interferon-beta-regulated gene expression in plasmacytoid dendritic cells. Journal of Neuroimmunology Baughman E. J. et al. 2011: Neuroantigen-specific CD8+ regulatory T-cell function is deficient during acute exacerbation of multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity 36, 115–124. Bergh F. T., Dayyani F. and Ziegler-Heitbrock L. 2004: Impact of type-I-interferon on monocyte subsets and their differentiation to dendritic cells: An in vivo and ex vivo study in multiple sclerosis patients treated with interferon-beta. Journal of Neuroimmunology 146, 176–188. 65

Bernardini G., Gismondi A. and Santoni A. 2012: Chemokines and NK cells: Regulators of development, trafficking and functions. Immunology Letters 145, 39–46. Birgit R. 2004: Multiple sclerosis: a short review of the disease and its differences between men and women. The Journal of Men's Health & Gender 1, 334–340. Biro A. et al. 2002: Lymphocyte phenotype analysis and chromosome aberration frequency of workers occupationally exposed to styrene, benzene, polycyclic aromatic hydrocarbons or mixed solvents. Immunology Letters 81, 133–140. Brettschneider J. et al. 2009: Serum anti-GAGA4 IgM antibodies differentiate relapsing remitting and secondary progressive multiple sclerosis from primary progressive multiple sclerosis and other neurological diseases. Journal of Neuroimmunology 217, 95–101. Brinkmann V. et al. 2010: Fingolimod (FTY720): discovery and development of an oral drug to treat multiple sclerosis. Nat Rev Drug Discov 9, 883–897. Carlyle J. R. et al. 2008: Evolution of the Ly49 and Nkrp1 recognition systems. Seminars in Immunology 20, 321–330. Charles M. 2000: The pathogenesis of multiple sclerosis: a commentary. Clinical Neurology and Neurosurgery 102, 191–194. Chen M. et al. 2012: IFN-+- induces the proliferation of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells through upregulation of GITRL on dendritic cells in the treatment of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 242, 39–46. Chen Y. C. et al. 2012: Serum level of interleukin-6 in Chinese patients with multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 249, 109–111. Christophi G. P. et al. 2011: Quantitative differences in the immunomodulatory effects of Rebif and Avonex in IFN-+- 1a treated multiple sclerosis patients. Journal of the Neurological Sciences 307, 41–45. Cohen J. A. 2009: The future of multiple sclerosis treatment. Journal of the Neurological Sciences 277, Supplement 1, S55–S61.

66

Comabella M., Khoury S. J. 2012: Immunopathogenesis of multiple sclerosis. Clinical Immunology 142, 2–8. Corthals A.P. 2011: Multiple sclerosis is not a disease of the immune system. The quarterly review of biology 4, 287–321. Crayton H. J., Rossman H. S. 2006: Managing the symptoms of multiple sclerosis: A multimodal approach. Clinical Therapeutics 28, 445–460. de Jager W., Bourcier K., Rijkers G., Prakken B. and Seyfert-Margolis V. 2009: Prerequisites for cytokine measurements in clinical trials with multiplex immunoassays. BMC Immunology 10, 52– De Stefano N., Bartolozzi M. L., Guidi L., Stromillo M. L. and Federico A. 2005: Magnetic resonance spectroscopy as a measure of brain damage in multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 233, 203–208. Demaille-Wlodyka S., Donze C., Givron P. and Gallien P. 2011: Self care programs and multiple sclerosis: Physical therapeutics treatmentTá-Táliterature review. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine 54, 109–128. Flodstrom-Tullberg M., Bryceson Y. T., Shi F. D., H+Âglund P. and Ljunggren H. G. 2009: Natural killer cells in human autoimmunity. Current Opinion in Immunology 21, 634–640. Floris S. et al. 2004: Monocyte activation and disease activity in multiple sclerosis. A longitudinal analysis of serum MRP8/14 levels. Journal of Neuroimmunology 148, 172–177. Galazka G. et al. 2007: EAE Tolerance Induction with Hsp70-Peptide Complexes Depends on H60 and NKG2D Activity. The Journal of Immunology 179, 4503–4512. Garg N. et al. 2007: Clinical and MRI correlates of autoreactive antibodies in multiple sclerosis patients. Journal of Neuroimmunology 187, 159–165. Gianotti L. et al. 2008: Phenotype and function of dendritic cells and T-lymphocyte polarization in the human colonic mucosa and adenocarcinoma. European Journal of Surgical Oncology (EJSO) 34, 883–889. 67

Godfrey D. I., Hammond K. J. L., Poulton L. D., Smyth M. J. and Baxter A. G. 2000: NKT cells: facts, functions and fallacies. Immunology Today 21, 573–583. Goris A. 2012: Omics and the immunopathogenesis of multiple sclerosis. Neuroscience Letters 508, 1–3. Graber J. J., Dhib-Jalbut S. 2011: Biomarkers of disease activity in multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 305, 1–10. Greer J. M., McCombe P. A. 2011: Role of gender in multiple sclerosis: Clinical effects and potential molecular mechanisms. Journal of Neuroimmunology 234, 7–18. Grigoriadis N., Ben-Hur T., Karussis D. and Milonas I. 2004: Axonal damage in multiple sclerosis: a complex issue in a complex disease. Clinical Neurology and Neurosurgery 106, 211–217. Hammarberg H. et al. 2000: Neuroprotection by Encephalomyelitis: Rescue of Mechanically Injured Neurons and Neurotrophin Production by CNS-Infiltrating T and Natural Killer Cells. The Journal of Neuroscience 20, 5283–5291. Hanna J. et al. 2004: Novel APC-like properties of human NK cells directly regulate T cell activation. The Journal of Clinical Investigation 114, 1612–1623. Hans-Peter Hartung, Bernd C.Kieseier 2010: Atacicept: targeting B cells in multiple sclerosis. Therapeutic Advances in Neurological Disorders 4, 205–216. Heesen C., Gold S. M., Sondermann J., Tessmer W. and Schulz K. H. 2002: Oral terbutaline differentially affects cytokine (IL-10, IL-12, TNF, IFNg) release in multiple sclerosis patients and controls. Journal of Neuroimmunology 132, 189–195. Huang Y. M. et al. 1999: Multiple sclerosis is associated with high levels of circulating dendritic cells secreting pro-inflammatory cytokines. Journal of Neuroimmunology 99, 82–90. Imitola J., Chitnis T. and Khoury S. J. 2005: Cytokines in multiple sclerosis: from bench to bedside. Pharmacology & Therapeutics 106, 163–177. Ingwersen J. et al. 2012: Fingolimod in multiple sclerosis: Mechanisms of action and clinical efficacy. Clinical Immunology 142, 15–24. 68

Jensen J. et al. 2004: CD4 T cell activation and disease activity at onset of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 149, 202–209. Julio S. 2007: On the viral hypothesis of multiple sclerosis: Participation of varicellazoster virus. Journal of the Neurological Sciences 262, 113–116. Kakalacheva K., M+-nz C. and L+-nemann J. D. 2011: Viral triggers of multiple sclerosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease 1812, 132–140. Kamishikiryo J., Fukuhara H., Okabe Y., Kuroki K. and Maenaka K. 2011: Molecular Basis for LLT1 Protein Recognition by Human CD161 Protein (NKRP1A/KLRB1). The Journal of Biological Chemistry 286, 23823–23830. Karussis D., Teitelbaum D., Sicsic C. and Brenner T. 2010: Long-term treatment of multiple sclerosis with glatiramer acetate: Natural history of the subtypes of antiglatiramer acetate antibodies and their correlation with clinical efficacy. Journal of Neuroimmunology 220, 125–130. Kelesidis T., Daikos G., Boumpas D. and Tsiodras S. 2011: Does rituximab increase the incidence of infectious complications? A narrative review. International Journal of Infectious Diseases 15, e2–e16. Kesselring R., Thiel A., Pries R. and Wollenberg B. 2011: The number of CD161 positive Th17 cells are decreased in head and neck cancer patients. Cellular Immunology 269, 74–77. Ko K. K. et al. 2012: Isolation, expansion and characterisation of alloreactive human Th17 and Th1 cells. Immunology Letters 143, 116–121. Koch-Henriksen N., Sarensen P. S. 2010: The changing demographic pattern of multiple sclerosis epidemiology. The Lancet Neurology 9, 520–532. Kouwenhoven M., Teleshova N., Ozenci V., Press R. and Link H. 2001: Monocytes in multiple sclerosis: phenotype and cytokine profile. Journal of Neuroimmunology 112, 197–205.

69

Krakauer M., Sorensen P. S. and Sellebjerg F. 2006: CD4+ memory T cells with high CD26 surface expression are enriched for Th1 markers and correlate with clinical severity of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 181, 157–164. Kurtuncu- M. et al. 2012: Effect of short-term interferon-B treatment on cytokines in multiple sclerosis: Significant modulation of IL-17 and IL-23. Cytokine 59, 400–402. Lassmann H. 2011: Pathophysiology of inflammation and tissue injury in multiple sclerosis: What are the targets for therapy. Journal of the Neurological Sciences 306, 167–169. Lassmann H., Ransohoff R. M. 2004: The CD4-Th1 model for multiple sclerosis: a crucial re-appraisal. Trends in Immunology 25, 132–137. Link H. et al. 1990: Persistent anti-myelin basic protein IgG antibody response in multiple sclerosis cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology 28, 237–248. Lopez-Larrea C., Lopez-Soto A. and Gonzalez S. 2010: Chapter Five - NK cell immune recognition: NKG2D ligands and stressed cells. 65–77. Lopez-Larrea C., Suarez-Alvarez B., Lopez-Soto A., Lopez-Vazquez A. and Gonzalez S. 2008: The NKG2D receptor: sensing stressed cells. Trends in Molecular Medicine 14, 179–189. MacDonald H. R. 2002: Development and selection of NKT cells. Current Opinion in Immunology 14, 250–254. Maghzi A. H. et al. 2011: Viral pathophysiology of multiple sclerosis: A role for Epstein-Barr virus infection? Pathophysiology 18, 13–20. Malmestrom C. et al. 2008: Relapses in multiple sclerosis are associated with increased CD8+ T-cell mediated cytotoxicity in CSF. Journal of Neuroimmunology 196, 159– 165. Markovic-Plese S., Cortese I., Wandinger K. P., McFarland H. F. and Martin R. 2001: CD4+CD28- costimulation-independent T cells in multiple sclerosis. The Journal of Clinical Investigation 108, 1185–1194.

70

Markovic-Plese S., Pinilla C. and Martin R. 2004: The initiation of the autoimmune response in multiple sclerosis. Clinical Neurology and Neurosurgery 106, 218–222. Michael P. 1999: Recent progress in the diagnosis and treatment of multiple sclerosis. Journal of Clinical Neuroscience 6, 367–372. Mikulkova Z., Praksova P., Stourac P., Bednarik J. and Michalek J. 2011: Imbalance in T-cell and cytokine profiles in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 300, 135–141. Molano A., Porcelli S. A. 2006: Invariant NKT cell regulation of autoimmunity. Drug Discovery Today: Disease Mechanisms 3, 193–198. Montaldo E. et al. 2012: Human NK cells at early stages of differentiation produce CXCL8 and express CD161 molecule that functions as an activating receptor. Blood 119, 3987–3996. Morandi B. et al. 2008: Role of natural killer cells in the pathogenesis and progression of multiple sclerosis. Pharmacological Research 57, 1–5. Nakajima H. et al. 2004: Decreased CD14+CCR2+ monocytes in active multiple sclerosis. Neuroscience Letters 363, 187–189. Nakipoglu G. F. et al. 2009: Urinary dysfunction in multiple sclerosis. Journal of Clinical Neuroscience 16, 1321–1324. Ninomiya T., Akbar S., Masumoto T., Horiike N. and Onji M. 1999: Dendritic cells with immature phenotype and defective function in the peripheral blood from patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology 31, 323–331. O'Keeffe J. et al. 2008: T-cells expressing natural killer (NK) receptors are altered in multiple sclerosis and responses to +--galactosylceramide are impaired. Journal of the Neurological Sciences 275, 22–28. Obeidy P., Sharland A. F. 2009: NKG2D and its ligands. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 41, 2364–2367.

71

Pariente B. et al. 2011: Activation of the Receptor NKG2D Leads to Production of Th17 Cytokines in CD4+ T Cells of Patients With Crohn's Disease. Gastroenterology 141, 217–226. Pashenkov M. et al. 2001: Two subsets of dendritic cells are present in human cerebrospinal fluid. Brain 124, 480–492. Pender M. P. 2004: The pathogenesis of primary progressive multiple sclerosis: antibody-mediated attack and no repair? Journal of Clinical Neuroscience 11, 689–692. Peralbo E., Alonso C. and Solana R. 2007: Invariant NKT and NKT-like lymphocytes: Two different T cell subsets that are differentially affected by ageing. Experimental Gerontology 42, 703–708. Perussia B., Chen Y. and Loza M. J. 2005: Peripheral NK cell phenotypes: multiple changing of faces of an adapting, developing cell. Molecular Immunology 42, 385–395. Randolph J. J., Arnett P. A., Higginson C. I. and Voss W. D. 2000: Neurovegetative Symptoms in Multiple Sclerosis: Relationship to Depressed Mood, Fatigue, and Physical Disability. Archives of Clinical Neuropsychology 15, 387–398. Raulet D. H. 2003: Roles of the NKG2D immunoreceptor and its ligands. Nat Rev Immunol 3, 781–790. Reipert B. 2004: Multiple sclerosis: a short review of the disease and its differences between men and women. The Journal of Men's Health & Gender 1, 334–340. Rentzos M. et al. 2006: IL-15 is elevated in serum and cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 241, 25–29. Richter J. et al. 2010: CD161 receptor participates in both impairing NK cell cytotoxicity and the response to glycans and vimentin in patients with rheumatoid arthritis. Clinical Immunology 136, 139–147. Rovaris M. et al. 2006: Secondary progressive multiple sclerosis: current knowledge and future challenges. The Lancet Neurology 5, 343–354. Rovira A., Leon A. 2008: MR in the diagnosis and monitoring of multiple sclerosis: An overview. European Journal of Radiology 67, 409–414. 72

Rudick R. A., Goelz S. E. 2011: Beta-interferon for multiple sclerosis. Experimental Cell Research 317, 1301–1311. Saikali P. et al. 2007: NKG2D-mediated cytotoxicity toward oligodendrocytes suggests a mechanism for tissue injury in multiple sclerosis. The Journal of Neuroscience 27, 1220–1228. Sand K. L. 2009: Modulation of natural killer cell cytotoxicity and cytokine release by the drug glatiramer acetate. Cellular and molecular life sciences 66, 1446–1456. Saxena A., Martin-Blondel G., Mars L. T. and Liblau R. S. 2011: Role of CD8 T cell subsets in the pathogenesis of multiple sclerosis. FEBS Letters 585, 3758–3763. Schrempf W., Ziemssen T. 2007: Glatiramer acetate: Mechanisms of action in multiple sclerosis. Autoimmunity Reviews 6, 469–475. Seidi O. A., Semra Y. K. and Sharief M. K. 2002: Expression of CD5 on B lymphocytes correlates with disease activity in patients with multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 133, 205–210. Silber E., Sharief M. K. 1999: Axonal degeneration in the pathogenesis of multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 170, 11–18. Smith K., McDonald I., Miller D. and Lassmann H. 2006: Chapter 13 - The pathophysiology of multiple sclerosis. 601–659. Soldan S. S., Alvarez Retuerto A. I., Sicotte N. L. and Voskuhl R. R. 2004: Dysregulation of IL-10 and IL-12p40 in secondary progressive multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 146, 209–215. Sotgiu S., Angius A., Embry A., Rosati G. and Musumeci S. 2008: Hygiene hypothesis: Innate immunity, malaria and multiple sclerosis. Medical Hypotheses 70, 819–825. Sotgiu S. et al. 2004: Genes, environment, and susceptibility to multiple sclerosis. Neurobiology of Disease 17, 131–143. Stevens C. H. et al. 2012: Reduced T helper and B lymphocytes in Parkinson's disease. Journal of Neuroimmunology

73

Stoeckle C., Tolosa E. 2010: Antigen processing and presentation in multiple sclerosis. Results and problems in cell differentiation 51, 149–172. Stuve O. 2009: Knowns and unknowns in the future of multiple sclerosis treatment. Journal of the Neurological Sciences 287, Supplement 1, S30–S36. Takahashi K., Aranami T., Endoh M., Miyake S. and Yamamura T. 2004: The regulatory role of natural killer cells in multiple sclerosis. Brain 127, 1917–1927. Tian Z., Gershwin M. E. and Zhang C. 2012: Regulatory NK cells in autoimmune disease. Journal of Autoimmunity Tjalf Z. 2011: Symptom management in patients with multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 311, Supplement 1, S48–S52. Van Belle T. L., von Herrath M. G. 2009: The role of the activating receptor NKG2D in autoimmunity. Molecular Immunology 47, 8–11. Venken K., Hellings N., Hensen K., Rummens J. L. and Stinissen P. 2010: Memory CD4+CD127high T cells from patients with multiple sclerosis produce IL-17 in response to myelin antigens. Journal of Neuroimmunology 226, 185–191. Vidal S. M., Khakoo S. I. and Biron C. A. 2011: Natural killer cell responses during viral infections: flexibility and conditioning of innate immunity by experience. Current Opinion in Virology 1, 497–512. Vollmer T. 2007: The natural history of relapses in multiple sclerosis. Journal of the Neurological Sciences 256, Supplement 1, S5–S13. Vosoughi R., Freedman M. S. 2010: Therapy of MS. Clinical Neurology and Neurosurgery 112, 365–385. Weber M. S., Hemmer B. and Cepok S. 2011: The role of antibodies in multiple sclerosis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease 1812, 239–245. Wilke C. M., Bishop K., Fox D. and Zou W. 2011: Deciphering the role of Th17 cells in human disease. Trends in Immunology 32, 603–611.

74

Yamamura T., Sakuishi K., Illes Z. and Miyake S. 2007: Understanding the behavior of invariant NKT cells in autoimmune diseases. Journal of Neuroimmunology 191, 8–15. Zivadinov R. et al. 2003: A longitudinal study of quality of life and side effects in patients with multiple sclerosis treated with interferon beta-1a. Journal of the Neurological Sciences 216, 113–118. Zuvich R. L., McCauley J. L., Pericak-Vance M. A. and Haines J. L. 2009: Genetics and pathogenesis of multiple sclerosis. Seminars in Immunology 21, 328–333.

75

8

Klíčová slova

Roztroušená skleróza CD161 NKG2D NK buněčná cytotoxicita IL6 IL17

Key words Multiple sclerosis CD161 NKG2D NK cell cytotoxicity IL6 IL17

76