Karakterisasi Rizobakteria Pemacu Tumbuh Tanaman dan Toleran Kekeringan
RIANITA HASANAH
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2013
ABSTRAK RIANITA HASANAH. Karakterisasi Rizobakteria Pemacu Tumbuh Tanamandan Toleran Kekeringan. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK. Bakteri rizosfer pemacu pertumbuhan tanaman atau Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) adalah kelompok bakteri yang memiliki sejumlah kemampuan dalam mendukung pertumbuhan tanaman. Dua genus di antaranya berasal dari genus Bacillus dan Pseudomonas. Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi rizobakteria Bacillus dan Pseudomonas asal rizosfer kedelai (Glycine max) dari Nusa Tenggara Barat. Karakterisasi meliputi kemampuan memacu pertumbuhan kecambah kedelai, produksi asam indol asetat (IAA), kemampuan menghadapi cekaman kekeringan, kemampuan melarutkan fosfat, dan produksi enzim kitinase. Sebanyak 22 isolat Pseudomonas dan 29 isolat Bacillus berhasil diisolasi dengan media selektif King;s B dan NB. Enam belas isolat yang terdiri dari tujuh isolat Pseudomonas dan sembilan isolat Bacillus mampu memacu pertumbuhan kecambah kedelai secara signifikan. Bakteri yang tumbuh pada media cair dengan penambahan 0.2 mM triptofan mampu menghasilkan IAA dengan kisaran konsentrasi 1.02 - 21.06 ppm untuk genus Pseudomonas dan 4.59 - 5.44 ppm untuk genus Bacillus. Keenambelas isolat ini diuji kemampuannya dalam menghadapi cekaman kekeringan, melarutkan fosfat, dan memproduksi enzim kitinase. Isolat bntb20 dan pntb80 mampu bertahan sampai tekanan osmotik -2.5 Mpa pada media yang ditambahkan pengontrol tekanan osmotik PEG 6000. Indeks pelarutan fosfat tertinggi dihasilkan isolat pntb18 pada media padat Pikovskaya dengan trikalsium fosfat. Indeks kitinolitik tertinggi dihasilkan isolat bntb22 pada media kitin 1%. Kata kunci: Pseudomonas, Bacillus, asam indol asetat, toleran kekeringan, bakteri pelarut fosfat, enzim kitinase.
ABSTRACT RIANITA HASANAH. Plant Growth Promoting Rhizobacteria Characterization and Drought Tolerance. Under direction of ARIS TRI WAHYUDI and NISA RACHMANIA MUBARIK. Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) are a group of bacteria that have some ability to support plant growth. Two of those rhizobacteria are Bacillus and Pseudomonas. This study aimed to isolate and characterize indigenous rhizobacteria Bacillus and Pseudomonas isolated from soybean (Glycine max) rhizosphere from Nusa Tenggara Barat. Characterization included the ability to stimulate soybean sprouts growth, indole acetic acid (IAA) production, the ability to face drought stress, phosphate solubilizing ability, and chitinase enzyme production. There were 22 isolates of Pseudomonas and 29 of Bacillus were isolated using selective media King's B and NB. Sixteen isolates consisting seven Pseudomonas and nine Bacillus isolates could significantly stimulate soybean sprouts growth. With the addition of 0.2 mM tryptophan in liquid media, bacteria are able to produce IAA in the concentration range of 1.02 to 21.06 ppm for genus Pseudomonas and 4.59 to 5.44 ppm for genus Bacillus. The sixteen isolates were tested for their ability in facing drought stress, phosphate solubilizing, and chitinase enzymes production. Isolates pntb80 and bntb20 can survive up to -2.5 MPa osmotic pressure on the media with PEG 6000 added as osmotic pressure controller. The highest phosphate solubilizing index were shown by pntb18 on Pikovskaya agar with tricalcium phosphate. The highest chitinolytic index were shown by bntb22 on 1% chitin media. Keywords: Pseudomonas, Bacillus, indole acetic acid, drought tolerance, phosphate solibilizing bacteria, chitinase enzyme.
Karakterisasi Rizobakteria Pemacu Tumbuh Tanaman dan Toleran Kekeringan
RIANITA HASANAH
Skripsi Sebagai salah satu syarat Untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Pada program Studi Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2013
Judul Skripsi : Karakterisasi Rizobakteria Pemacu Tumbuh Tanaman dan Toleran Kekeringan Nama : Rianita Hasanah NRP : G34080051
Disetujui: Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. NIP. 19630705 199103 1 005
Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. NIP. 19671127 199302 2 001
Diketahui, Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian ini berhasil diselesaikan. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si. yang telah memberikan bimbingan dan selama penulisan skripsi ini, serta bantuan bahan dan alat yang diperlukan selama penelitian berlangsung.Terima kasih kepada Dr. Ir. Utut Widyastuti, M.Si. selaku penguji dan Wakil Komisi Pendidikan atas saran dan diskusi yang diberikan. Penghargaan penulis sampaikan pada semua staf laboratorium Mikrobiologi yang banyak membantu selama pelaksanaan penelitian dan penyusunan skripsi ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga atas segala doa dan dukungan yang tak henti diberikan. Terima kasih pada Ai, Dita, Issanto, Inggit, dan teman-teman Biologi angkatan 45. Terima kasih pada Kak Siti Meliah yang selalu memberi arahan dan penjelasan terbaiknya. Terima kasih juga penulis sampaikan pada rekan-rekan Senior Resident Asrama TPB IPB yang telah membantu dalam sebagian tahap pengumpulan data. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Februari 2013 Rianita Hasanah
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bengkulu pada 10 Juli 1990 dari pasangan Azwar Muhajir dan Rini Sukapti. Penulis merupakan anak sulung dari tiga bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Serang dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Mahasiswa IPB (USMI). Penulis menempuh studi di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama masa perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar untuk mahasiswa Tingkat Persiapan Bersama, Biologi Alga dan Lumut untuk mahasiswa Biologi semester 4, dan asisten responsi Pengantar Agama Islam pada tahun ajaran 2011/2012. Sejak Mei 2011 sampai Desember 2012 penulis aktif sebagai Senior Resident di Asrama Putri Tingkat Persiapan Bersama Institut Pertanian Bogor. Penulis juga sempat aktif dalam Lembaga Dakwah Fakultas, Serambi Ruhiyah Mahasiswa FMIPA tahun 2010 - 2011, serta menjadi panitia pada beberapa kegiatan biologi antara lain Anggota Tim Khusus pada Lomba Cepat Tepat Biologi 2009 dan 2010. Praktik Lapang dilaksanakan penulis di Unit Transfusi Darah Palang Merah Indonesia Cabang Serang dan Rumah Sakit Umum Daerah Serang pada bulan Juli-Agustus 2011 dengan judul Pengelolaan Darah Donor di Unit Transfusi Darah Palang Merah Indonesia Cabang Serang dan Rumah Sakit Umum Daerah Serang. Beberapa prestasi yang pernah dicapai antara lain finalis Provinsi Olimpiade Sains Perguruan Tinggi oleh Pertamina dalam bidang Biologi tahun 2010 dan 2011, juara 3 pemilihan mahasiswa berprestasi tingkat Departemen Biologi tahun 2011, lolos pendanaan PKM-P dari Dikti pada tahun 2010 dan 2011, serta lolos seleksi karya ilmiah kelompok pada Konferensi Ilmuwan Muda Indonesia di Universitas Indonesia tahun 2011.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI ......................................................................................................................................
v
DAFTAR TABEL ..............................................................................................................................
vi
DAFTAR GAMBAR .........................................................................................................................
vi
DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................................................
vi
PENDAHULUAN Latar Belakang ............................................................................................................................... Tujuan ............................................................................................................................................
1 1
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................................................ Bahan ............................................................................................................................................ Metode ...........................................................................................................................................
1 1 1
HASIL Isolasi dan Pemurnian Isolat Bacillus dan Pseudomonas .............................................................. Uji Produksi IAA (Indole Acetic Acid) oleh bakteri ...................................................................... Uji Pemacuan Pertumbuhan Tanaman Kedelai.............................................................................. Uji Pelarutan Fosfat ....................................................................................................................... Uji Produksi Kitinase ..................................................................................................................... Uji Toleransi Bakteri terhadap Cekaman Kekeringan ...................................................................
2 3 4 4 4 5
PEMBAHASAN ................................................................................................................................
5
SIMPULAN .......................................................................................................................................
7
SARAN ..............................................................................................................................................
7
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................................................
7
LAMPIRAN ......................................................................................................................................
10
DAFTAR TABEL Halaman 1 Pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai (Glycine max) oleh Bacillus dan Pseudomonas serta IAA yang dihasilkannya …………………………………………………………………………..
3
2 Produksi enzim kitinase, kemampuan pelarutan fosfat serta toleransi terhadap cekaman kekeringan dari Pseudomonas sp. (pntb) dan Bacillus sp. (bntb) ………………………………................... 5
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Hasil pewarnaan Gram. (A) Genus Pseudomonas bersifat Gram negatif dan berwarna merah (B) Genus Bacillus bersifat Gram positif dan berwarna ungu …..……………………………………. 3 2 Perbandingan kecambah umur 5 hari tanpa isolat bakteri dan dengan inokulasi isolat bakteri . (A) perlakuan isolat Bacillus bntb36, (B) perlakuan isolat Pseudomonas pntb80 …………….....
4
3 Zona bening pada uji pelarutan fosfat oleh (A) pntb20 dan (B) bntb24 umur 4 hari ……..………
4
4 Zona bening pada uji produksi kitinase oleh (A) pntb22 dan pntb20 serta (B) bntb26 dan bntb30 umur 2 hari ………………………………………………………………………………….…...... 4 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi media tumbuh (dalam 1 liter akuades) ……………………………………………...…
11
2 Bahan-bahan untuk karakterisasi fisiologi secara parsial genus Bacillus dan Pseudomonas ……..
12
3 PEG 6000 yang ditambahkan untuk mencapai tekanan osmotik yang diinginkan ……………….
13
4Toleransi bakteri terhadap cekaman kekeringan …………………………………….…………….
13
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Rizosfer tanaman merupakan habitat berbagai jenis bakteri. Bakteri tersebut biasa disebut sebagai rizobakteria. Rizobakteria mampu memberikan dampak positif maupun negatif. Salah satu kelompok rizobakteria yang memberikan dampak positif bagi tanaman ialah Rizobakteria Pemacu Tumbuh Tanaman (RPTT) atau Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) (Kloepper 1992; Jeon et al. 2003). Kelompok bakteri menguntungkan yang mengolonisasi rizosfer (lapisan tanah tipis dengan ketebalan 1-2 mm di sekitar zona perakaran), berperan penting dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman, perlindungan hasil panen, meningkatakan kesuburan lahan (Husen 2003), dan beberapa galur mampu membantu tanaman menghadapi cekaman lingkungan seperti keterbatasan air dan nutrien serta pencemaran senyawa toksik (Shen 1997; Podile & Kishore 2006). Terdapat dua mekanisme pemacuan pertumbuhan oleh rizobakteria, yaitu secara langsung dan tidak langsung. Secara langsung, rizobakteria mampu menghasikan zat pemacu tumbuh serta menyediakan, memfasilitasi, atau memobilisasi penyerapan beberapa unsur hara dari lingkungan. Sedangkan pemacuan tumbuh secara tidak langsung terjadi berkaitan dengan kemampuan bakteri menghambat pertumbuhan patogen tanaman dengan cara menghasilkan sejumlah senyawa kimia seperti siderofor, kitinase, antibiotik (Kloepper 1992) dan enzim aminocyclopropane carboxylate (ACC) deaminase (Glick 1995). Bakteri pemacu tumbuh tanaman telah diteliti sejak lama dan telah banyak aplikasi yang diterapkan pada berbagai tanaman pangan. Bakteri pemacu tumbuh tersebut beberapa diantaranya berasal dari genus Bacillus (Husen 2003) dan Pseudomonas (Astuti 2008). Bacillus diketahui mampu menghasilkan IAA, melarutkan fosfat, dan menghambat pertumbuhan cendawan secara in vitro (Idriss 2002; Widyawati 2008). Beberapa galur dari genus Pseudomonas juga diketahui mampu menghasilkan IAA, melarutkan fosfat, dan menghambat pertumbuhan cendawan secara in vitro (Artati 2008) yang salah satu mekanismenya adalah dengan memproduksi enzim kitinase (Parjono 2008). Selain itu Pseudomonas diketahui mampu mendegradasi dan menggunakan beberapa senyawa organik dan anorganik, berinteraksi dengan tanaman, berasosiasi dalam rizosfer sehingga menguntungkan di bidang pertanian (Palleroni
2004). Penghambatan patogen oleh bakteri dapat terjadi karena adanya produksi enzim kitinase, siderofor, antibiotik atau sianida (Glick 1995). Penelitian ini diharapkan akan dapat menghasilkan informasi awal bagi penelitian berikutnya dalam penanaman kedelai terutama di lahan kering. Tujuan Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi rizobakteria Bacillus sp. dan Pseudomonas sp. asal rizosfer tanaman kedelai (Glycine max) dari Nusa Tenggara Barat. Karakter yang diteliti meliputi kemampuan isolat bakteri dalam produksi IAA, pemacuan pertumbuhan in vitro, kemampuan melarutan fosfat, menghasilkan kitinase, dan toleransinya terhadap cekaman kekeringan. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Januari 2012 sampai dengan Agustus 2012 di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB. Bahan Tanah rizosfer kedelai asal Nusa Tenggara Barat. Metode Isolasi Pseudomonas dan Bacillus. Sebanyak lima sampel tanah asal Nusa Tenggara Barat masing-masing diambil 10 gram. Sampel tanah selanjutnya dilarutkan dalam 90 ml garam fisiologis 0.85% steril. Suspensi tanah selanjutnya diencerkan secara bertingkat hingga konsentrasi 10-6 dari konsentrasi awal. Sebanyak 100 µL suspensi pada tiga tingkat pengenceran terakhir disebar pada media padat King’s B Agar untuk isolasi Pseudomonas. Sisa suspensi pada tiga tingkat pengenceran terakhir dipanaskan pada suhu 80oC selama 10 menit dan diambil kembali sebanyak 100 µL untuk disebar di media padat Nutrient Broth Agar (NA) untuk isolasi Bacillus (Lampiran 1) (Widyawati 2008). Pemurnian Bakteri. Isolat yang memiliki morfologi koloni yang sama serta diduga termasuk genus Bacillus atau Pseudomonas (berdasarkan buku Bergey’s Manual of Determinative Biology) dimurnikan pada media padat yang baru. semua isolat dilakukan pewarnaan Gram. Selain itu pada isolat yang diduga Bacillus dilakukan pewarnaan endospora
2
menggunakan pewarna malakit hijau dan safranin (Bartholomew & Mittwer 1950). Uji katalase pada isolat yang diduga Pseudomonas menggunakan pereaksi hidrogen peroksida 30%, sementara uji oksidase dilakukan menggunakan kertas uji oksidase yang mengandung NNN’N’-tetramethyl-p-phenylene -diaminedihydrochloride (TMPD) yang akan bereaksi dengan kompleks enzim sitokrom oksidase bakteri (Jurtsuk & McQuitty 1976). Uji Produksi IAA (Indole Acetic Acid) oleh Bakteri. Kemampuan bakteri dalam menghasilkan IAA diuji menggunakan metoda Colorimetric (Bricket al.1991). Setiap isolat Bacillus diinokulasikan sebanyak 1 lup ke dalam media NB + Triptofan 0.2 mM, diinkubasi pada suhu ruang dengan agitasi 100 rpm selama 25 jam saat Bacillus mencapai fase stasionernya (Astuti 2008). Sebanyak 1.5 ml biakan diambil, kemudian dimasukkan ke dalam tabung mikro, dilakukan duplo. Selanjutnya tabung mikro disentrifugasi pada kecepatan 10000 rpm selama 15 menit. Sebanyak 1 ml supernatan dari tabung mikro dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 4 ml reagen Salkowski (Lampiran 2) lalu diinkubasi selama 20 menit dalam ruang gelap pada suhu ruang. Kuantitas IAA diukur menggunakan spektrofotometer Spectronic 20 pada panjang gelombang 510 nm (Aryantha et al. 2004). Konsentrasi IAA dihitung dengan menggunakan kurva kalibrasi standar dengan bahan IAA murni. Uji Pemacuan Pertumbuhan Tanaman Kedelai. Uji pemacuan pertumbuhan dilakukan berdasarkan metode Dey et al. (2004) yang dimodifikasi. Benih yang digunakan ialah kedelai varietas Wilis. Permukaan benih kedelai disterilisasi dengan cara direndam dalam etanol 95% selama 10 detik, kemudian direndam dalam H2O2 5% selama 5 menit dan dibilas dengan akuades steril sebanyak 5 kali untuk menghilangkan residu peroksida. Biji yang telah steril diletakkan pada cawan yang dialasi kertas saring dan dibasahi akuades steril, kemudian diletakkan di ruang gelap selama 24 jam. Isolat ditumbuhkan dalam media cair pada suhu ruang selama 24 jam: King’s B untuk Pseudomonas dan NB untuk Bacillus. Sembilan benih yang telah berkecambah dipindahkan ke dalam cawan dengan media Water Agar 1% dan masingmasing diberi 100 μl kultur bakteri (±8x10 8 sel/ml). Perkecambahan tanpa kultur bakteri digunakan sebagai kontrol. Cawan tersebut diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang dalam kondisi gelap. Setelah itu dilakukan pengukuran panjang batang, panjang akar primer, dan jumlah akar lateral. Hasil pengukuran dianalisis
secara statistik menggunakan software SAS 9.0 dan diuji lanjut dengan uji Duncan pada taraf kesalahan 5%. Uji Pelarutan Fosfat. Uji pelarutan fosfat dilakukan dengan menumbuhkan isolat-isolat Pseudomonas dan Bacillus pada media padat Pikovskaya (Subba-Rao 1999, Yang et al. 2012) yang mengandung trikalsium fosfat (Lampiran 1). Isolat digoreskan pada media dan diinkubasi pada suhu ruang selama 4 hari, zona bening yang terdapat di sekeliling koloni diamati dan diukur diameternya (Ø), kemudian indeks pelarutan fosfatnya (IPF) dihitung dengan rumus: (Ø zona bening – Ø koloni) ÷ Ø koloni. Uji Produksi Enzim Kitinase. Uji produksi enzim kitinase dilakukan dengan menggunakan media kitin 1% (Cattelan et al. 1999) (Lampiran 1). Isolat Pseudomonas dan Bacillus terlebih dahulu dikultivasi pada media King’s B selama 24 jam. Suspensi isolat diteteskan sebanyak 1 µl ke atas media kitin 1%. Adanya aktivitas kitinolitik ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar koloni bakteri yang telah berusia 48 jam. Indeks kitinolitik (IK) dihitung dengan rumus: (Ø zona bening – Ø koloni) ÷ Ø koloni. Uji Toleransi Bakteri terhadap Cekaman Kekeringan. Toleransi terhadap kekeringan diuji dengan menumbuhkan bakteri pada media dengan tekanan osmotik yang rendah. Pengaturan tekanan osmotik dilakukan dengan menambahkan polyethylene glycol (PEG) dengan konsentrasi tertentu berdasarkan persamaan: ψs = -(1.18 x 10-2) C – (1.18 x 10-4) C-2 + (2.67 x 10-4) CT + (8.39 x 10-7) C2T keterangan: ψs= potensial osmotik solut (MPa); C = konsentrasi PEG (g/L); T = temperatur (oC) (Michel & Kaufmann 1973). Inokulan diremajakan dalam kultur cair kemudian dipindahkan ke medium dengan tambahan PEG 6000 sesuai potensial osmotik yang diinginkan (Lampiran 3), diinkubasi selama 1 hari pada suhu ruang di dalam shaker dengan kecepatan 100 rpm. Kerapatan sel diukur dengan melihat OD (Optical Density) dari kultur sel. Pengukuran dilakukan pada panjang gelombang 570 nm pada usia kultur 24 jam. HASIL Isolasi dan Pemurnian IsolatBacillus dan Pseudomonas Bakteri yang berhasil diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai asal Nusa Tenggara Barat berjumlah 51 isolat yang terdiri atas 22 isolat Pseudomonasdan 29 isolat Bacillus. Isolat-isolat
3
terseleksi lewat pengamatan morfologi dan uji fisiologi. Pengamatan morfologi Pseudomonas meliputi pengamatan morfologi koloni pada media padat dan pewarnaan Gram, dan uji fisiologi meliputi uji katalase dan oksidase. Koloni Pseudomonas yang tumbuh di atas media King’s B Agar berbentuk bundar dengan tepian licin, elevasi cembung, timbul dan berbukit, berwarna putih, krem, atau merah muda. Hasil pewarnaan Gram menunjukkan hasil Gram negatif dengan warna sel tampak merah muda (Gambar 1A). Pengamatan morfologi Bacillus meliputi pengamatan morfologi koloni pada media padat pewarnaan Gram, dan pewarnaan endospora. Koloni Bacillus yang tumbuh di atas media NA berbentuk bundar dengan tepian bergelombang, elevasi datar sampai bergelombang atau berlipat, dan berwarna putih susu sampai krem. Hasil pewarnaan Gram menunjukkan hasil Gram positif dengan warna sel ungu (Gambar 1B).
A
5 µm
B
5 µm
Gambar 1 Hasil pewarnaan Gram. (A) Genus Pseudomonas bersifat Gram negatif dan berwarna merah. (B) Genus Bacillus bersifat Gram positif dan berwarna ungu. Hasil pengujian katalase isolat-isolat uji menunjukkan hasil positif yang ditandai dengan adanya gelembung gas dan uji oksidase menunjukkan hasil positif dengan perubahan warna koloni pada kertas uji oksidase yang menjadi berwarna biru sampai ungu. Uji Produksi IAA(Indole Acetic Acid) oleh Bakteri Sebanyak 13 isolat Bacillus dan 10 isolat Pseudomonas menghasilkan IAA ≤10 ppm, 16 isolat Bacillus dan 8 isolat Pseudomonas menghasilkan IAA 11-19 ppm dan 4 isolat Pseudomonas mampu menghasilkan IAA >19 ppm. Konsentrasi IAA tertinggi dari genus
Bacillus dihasilkan oleh isolat bntb4 sebesar 15.44 ppm sementara dari genus Pseudomonas ialah isolat pntb2 sebesar 21.80 ppm (Tabel 1). Tabel 1 Pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai (Glycine max) oleh Bacillus dan Pseudomonas serta IAA yang dihasilkannya Perlakuan Kel. 1 Kontrol bntb 3 bntb4 bntb 5 bntb 6 bntb 7 bntb 14 bntb 15 bntb 16 bntb 17 bntb 18 bntb 19 bntb 20 bntb 21 bntb 22 bntb 23 bntb 24 bntb 25 bntb 26 bntb 27 bntb 28 bntb 29 bntb 30 bntb 31 bntb36 bntb 42 bntb 43 bntb 44 bntb 45 bntb 46 Kel. 2 Kontrol pntb2 pntb14 pntb15 pntb18 pntb19 pntb20 pntb21 pntb22 pntb44 pntb45 pntb47 pntb48 pntb59 pntb60 pntb63 pntb67 pntb80 pntb82 pntb84 pntb86 pntb87 pntb88
Panjang akar (cm)
Panjang batang (cm)
Jumlah akar lateral
5.8cd 5.6cde 7.5b 4.9defg 3.4hi 4.3efghi 3.6ghi 3.4hi 4.1fghi 5.5cdef 4.0fghi 4.2efghi 4.2efghi 2.9ghi 6.6bc 3.0i 5.8cd 3.7ghi 7.3b 6.6bc 5.5cdef 4.5defgh 4.7defgh 3.5hi 9.4a 7.3b 7.4 b 4.2 efghi 6.6 bc 4.6defgh
5.9 e 5.7 ef 10.7 a 5.6 efg 4.4fghijk 4.7 efghi 3.0 klm 3.0 jklm 3.9 hijkl 5.0 efgh 5.2 efgh 2.4 m 8.2 bcd 3.5ijklm 8.8 bc 3.1 jklm 7.8 cd 4.2 ghijk 8.1 bcd 5.1 efgh 4.4 fghij 5.3 efgh 7.4 d 2.4 m 9.3 b 4.2 hijk 4.7 efghi 5.2 efgh 2.7 lm 5.2 efgh
14.8 de 20.4 bcd 20.6 bcd 22.9 b 12.2 ef 11.2 ef 19.2 bcd 5.9 f 11.7 ef 20.5 bcd 20.0 bcd 10.7 ef 11.4 ef 6.2 f 19.8 bcd 8.7 ef 19.7 bcd 11.8 ef 24.3 b 15.4 cde 20.3 bcd 22.2 bc 22.6 bc 14.6 de 35.0 a 22.0 bc 19.3 bcd 20.8 bcd 20.4 bcd 19.7 bcd
0.00 14.73 15.44 11.76 10.28 14.19 10.41 11.33 13.97 10.50 12.57 5.50 13.60 9.38 8.36 7.60 9.02 8.78 10.57 11.01 11.06 5.61 8.92 11.98 4.94 7.47 4.59 10.16 9.71 7.47
10.4 cdef 9.7 def 8.0 f 10.2 cdef 11.1 cde 8.5 ef 8.4 f 8.0 f 11.6 bcd 13.6 ab 14.2 a 9.1 def 9.6 def 9.2 def 9.6 def 10.4 cdef 10.3 cdef 13.7 ab 8.8 ef 10.6 cdef 8.8 ef 12.7 abc 9.8 def
6.2 cdef 5.4 def 6.1 cdef 5.3 def 7.7 ab 5.3 ef 8.2 a 5.2 ef 6.8 abcd 7.8 ab 6.2 cdef 5.2 ef 5.8 edf 6.4bcdef 5.5 def 6.3 cdef 5.1 f 7.8 ab 6.7abcde 7.8 ab 5.1 f 7.4 abc 6.7abcde
26.0 bc 22.7 cd 17.9 cd 22.4 cd 37.0 a 23.0 cd 26.2 bc 19.0 cd 36.0 a 34.0 ab 35.6 a 25.3 bcd 20.7 cd 25.8 bc 25.8 bc 23.5 cd 24.0 cd 35.7 a 25.7 bc 25.2 bcd 16.0 d 23.8 cd 25.9 bc
0 21.80 1.11 10.77 4.03 19.68 7.14 21.06 15.01 9.33 8.68 11.73 2.92 12.64 18.00 5.37 19.20 3.98 19.20 11.19 2.05 13.26 1.02
IAA (ppm)
Keterangan: Angka-angka yang diikuti huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada uji Duncan (α: 5%).
4
Uji Pemacuan Pertumbuhan Tanaman Kedelai Hasil uji pemacu pertumbuhan tanaman, terpilih 16 isolat yang mampu meningkatkan pertumbuhan kecambah secara signifikan, yaitu isolat bntb4, bntb20, bntb22, bntb24, bntb26, bntb30, bntb36, bntb42, bntb43, pntb18, pntb20, pntb22, pntb44, pntb45, pntb80, dan pntb84. Tiga parameter yang diamati adalah panjang akar, panjang batang, dan jumlah akar leteral. Sebagian isolat memacu pertumbuhan pada salah satu parameter. Terdapat dua isolat yang mampu memacu pertumbuhan pada ketiga parameter yang diamati, yaitu isolat bntb36 dan pntb80 pntb80 (Gambar 2; Tabel 1). kontrol
bntb36 kontrol
A
A
0.5 cm
B
0.5 cm
Gambar 3 Zona bening (ditunjuk panah) pada uji pelarutan fosfat oleh (A) pntb20 dan (B) bntb24 umur 4 hari. Uji Produksi Kitinase Aktivitas kitinase ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar isolat pada media kitin 1% (Gambar 4). Semua isolat mampu mendegradasi kitin pada media kecuali isolat pntb45. Indeks kitinolitik tertinggi dihasilkan oleh isolat bntb22 dengan nilai 1.20 (Tabel 2).
B
Gambar 2 Perbandingan kecambah umur 5 hari tanpa isolat bakteri dan dengan inokulasi isolat bakteri. (A) perlakuan isolat Bacillus bntb36, (B) perlakuan isolat Pseudomonas pntb80. Isolat bntb42 dan bntb43 secara signifikan meningkatkan pertumbuhan akar primer saja. Isolat bntb20, bntb22, bntb24, bntb30, dan pntb84 meningkatkan pertumbuhan batang saja. Isolat pntb22 memicu pertumbuhan akar lateral saja. Isolat bntb4, bntb26, dan pntb44 memacu pertumbuhan panjang akar dan batang primer. Isolat pntb45 memacu pertumbuhan akar primer dan akar lateral. Isolat pntb18 memacu pertumbuhan batang primer dan akar lateral (Tabel 1). Uji Pelarutan Fosfat Sebanyak 16 isolat rizobakteri mampu melarutkan fosfat pada media uji Pikovskaya Agar yang ditambah tricalcium phosphate (TCP, Ca3PO4) sebagai sumber fosfat. Kemampuan ini dilihat dari zona bening di tepi koloni, yang selanjutnya dipakai untuk menghitung indeks pelarutan fosfat. Indeks pelarutan fosfat paling tinggi dihasilkan oleh isolat pntb18 dengan nilai 1.78 sementara paling rendah dihasilkan oleh bntb22 dengan nilai 0.19 (Gambar 3; Tabel 2).
A Gambar 4
1 cm
B
1 cm
Zona bening (ditunjuk panah) pada uji produksi kitinase oleh (A) pntb22 dan pntb20 serta (B) bntb26 dan bntb30 umur 2 hari.
Uji Toleransi Bakteri terhadap Cekaman Kekeringan Seluruh bakteri mampu bertahan sampai tekanan -1.50 Mpa. Tekanan -2.0 Mpa menghambat pertumbuhan beberapa isolat dan hanya 9 isolat yang berhasil bertahan yaitu bntb4, bntb20, bntb24, bntb26, bntb30, bntb43, pntb20, pntb80, dan pntb84. Isolat yang menunjukkan OD pada panjang gelombang 570 nm minimal 0.4 ialah isolat yang toleran terhadap kekeringan (Alikhani & Mohamadi 2010, Lampiran 4). Terdapat tujuh isolat yang toleran sampai tekanan osmotik -2.0 Mpa dan dua isolat toleran sampai tekanan osmotik 2.5Mpa, yaitu bntb20 dan pntb80 (Tabel 2).
5
Tabel 2 Produksi enzim kitinase, kemampuan pelarutan fosfat serta toleransi terhadap cekaman kekeringan dari Pseudomonas sp. (pntb) dan Bacillus sp. (bntb) Tekanan Osmotik Indeks Indeks pelarutan -0.73 -1.00 -1.50 -2.00 -2.5 kitinolitik 0 Mpa Tekanan Osmotik Indeks fosfat Mpa Mpa Mpa Mpa Mpa Indeks Isolat pelarutan -0.73 -1.00 -1.50 -2.00 -2.5 bntb4 kitinolitik 0.21 0.22 1.112 0.598 0.563 0.541 0.382 0 Mpa fosfat Mpa Mpa Mpa Mpa Mpa bntb20 0.31 0.38 1.319 1.113 0.662 0.640 0.561 0.422 bntb4 0.21 0.22 1.112 0.598 0.563 0.541 0.382 -bntb22 1.20 0.19 1.206 0.930 0.433 0.411 0.332 bntb20 0.31 0.38 1.319 1.113 0.662 0.640 0.561 0.422 bntb24 0.23 0.22 1.198 0.620 0.491 0.408 0.400 0.249 bntb22 1.20 0.19 1.206 0.930 0.433 0.411 0.332 bntb26 0.43 0.44 0.914 0.703 0.551 0.529 0.450 0.308 bntb24 0.23 0.22 1.198 0.620 0.491 0.408 0.400 0.249 bntb30 0.50 0.39 1.084 0.526 0.512 0.490 0.399 bntb26 0.43 0.44 0.914 0.703 0.551 0.529 0.450 0.308 bntb36 0.71 0.32 0.907 0.655 0.500 0.478 0.330 bntb30 0.50 0.39 1.084 0.526 0.512 0.490 0.399 -bntb42 0.54 0.27 1.042 0.942 0.558 0.536 0.299 bntb36 0.71 0.32 0.907 0.655 0.500 0.478 0.330 bntb43 0.32 0.25 1.291 0.660 0.563 0.541 0.426 0.373 bntb42 0.54 0.27 1.042 0.942 0.558 0.536 0.299 -pntb18 0.36 1.78 1.215 0.841 0.422 0.400 0.273 bntb43 0.32 0.25 1.291 0.660 0.563 0.541 0.426 0.373 pntb20 0.45 1.50 1.078 0.632 0.547 0.471 0.402 0.289 pntb18 0.36 1.78 1.215 0.841 0.422 0.400 0.273 -pntb22 0.60 0.80 1.138 0.691 0.478 0.456 0.217 pntb20 0.45 1.50 1.078 0.632 0.547 0.471 0.402 0.289 pntb44 0.10 0.79 1.153 1.165 0.537 0.515 0.187 pntb22 0.60 0.80 1.138 0.691 0.478 0.456 0.217 -pntb45 0.00 1.63 0.920 1.013 0.442 0.420 0.191 pntb44 0.10 0.79 1.153 1.165 0.537 0.515 0.187 pntb80 0.20 0.94 1.476 1.431 0.764 0.742 0.692 0.607 pntb45 0.00 1.63 0.920 1.013 0.442 0.420 0.191 pntb84 0.18 1.17 1.142 0.769 0.582 0.512 0.430 0.327 pntb80 0.20 0.94 1.476 1.431 0.764 0.742 0.692 0.607 pntb84 0.18 1.17 1.142 0.769 0.582 0.512 0.430 0.327 of Determinative Bacteriology, yaitu berbentuk PEMBAHASAN Tabel 2 Produksi enzim kitinase, kemampuan pelarutan fosfat serta toleransi terhadap cekaman bulat dengan tepian bergelombang, elevasi kekeringan dari Pseudomonas sp. (pntb) dan Bacillus sp. (bntb) senderung rata, permukaan bergelombang atau Hasil isolasi rizobakteri dari tanah rizosfer berlipat, berwarna krem atau putih. Pada kedelai asal NTB ialah 29 isolat Bacillus dan pengamatan mikroskopis pewarnaan Gram, 22 isolat Pseudomonas. Isolasi Pseudomonas diketahui sel Bacillus berbentuk batang dengan dilakukan dengan cara menyebar larutan tanah penataan tunggal, dua sel berdampingan atau rizosfer kedelai pada media padat selektif berantai dengan panjang sel sekitar 2.0 – 5.0 King’s B sampai terseleksi koloni berdasarkan μm (Gambar 1B). Selanjutnya isolat Bacillus karakteristik morfologinya dengan panduan diberi nama dengan kode awal ‘bntb’ dan isolat Bergey’s Manual of Determinative Pseudomonas diberi nama dengan kode awal Bacteriology, yaitu bundar tak beraturan dengan ‘pntb’. tepian licin, elevasi cembung, timbul dan Semua isolat mampu menghasilkan IAA. berbukit, berwarna putih, krem, atau merah Kuantifikasi IAA dilakukan dengan cara muda. Pada pengamatan mikroskopis mereaksikan supernatan dari kultur bakteri pewarnaan Gram, diketahui sel Pseudomonas setelah disentrifugasi, dengan reagen Salkowski. tergolong Gram negatif, berbentuk batang, lurus Reagen ini akan bereaksi dengan IAA yang atau sedikit bengkok dengan panjang sekitar 1,5 terakumulasi dalam filtrat yang diuji sehingga – 5,0 μm (Gambar 1A). Sel Pseudomonas terbentuk warna merah. Intensitas warna dapat bersifat motil maupun nonmotil. berbanding lurus dengan konsentrasi IAA yang Pseudomonas memiliki satu atau beberapa dihasilkan. Konsentrasi IAA selanjutnya didapat flagela di salah satu ujung sel, atau juga dapat dari persamaan kurva standar IAA yang telah bersifat nonmotil (Pelczar & Chan 1986). dibuat sebelumnya. Isolat Bacillus yang Beberapa menghasilkan pigmen kuning atau menghasilkan IAA tertinggi adalah bntb4 yaitu merah muda yang tidak larut dalam air. sebesar 15.44 ppm. Pengaruh dari inokulasi Beberapa tidak dapat menghasilkan pigmen. isolat ini terhadap kecambah kedelai ialah Genus ini bersifat Gram negatif, motil, aerob memacu pertumbuhan panjang akar dan panjang atau anaerob. Beberapa galur bahkan dapat batang, sementara jumlah akar lateral lebih menghasilkan pendaran (floresen) (Balows et al. banyak namun tidak signifikan dibandingkan 1992). dengan kontrol. Sementara itu, pemacuan Isolasi Bacillus dilakukan dengan cara terbaik didapatkan pada pertumbuhan kecambah menyebar larutan tanah rizosfer kedelai pada yang diinokulasikan isolat bntb30, di mana media padat Nutrient Broth (NB) sampai semua parameter menunjukkan nilai yang lebih terseleksi koloni berdasarkan karakteristik baik secara signifikan dibandingkan dengan morfologinya dengan panduan Bergey’s Manual Isolat
6
kontrol, namun IAA yang dihasilkan tergolong rendah yaitu 4.94 ppm. Beberapa isolat hanya memacu tumbuh secara signifikan pada dua atau satu parameter dengan konsentrasi IAA yang bervariasi. Isolat Pseudomonas yang menghasilkan IAA tertinggi adalah isolat pntb2 dengan konsentrasi IAA 21.80 ppm, namun tidak ada parameter yang pertumbuhannya lebih baik dibandingkan dengan kontrol. Pemacuan pertumbuhan pada ketiga parameter justru dihasilkan oleh isolat pntb80 dengan konsentrasi IAA 3.98 ppm. Selain itu, terdapat beberapa isolat yang hanya memacu di dua atau satu parameter dengan konsentrasi IAA yang bervariasi. Menurut Ahmad et al. (2004) produksi IAA oleh bakteri dapat meningkat dengan pemberian triptofan 1-100 µg/ml. Penelitian ini menggunakan L-Trp dengan konsentrasi 0,2 mM atau sekitar 41 µg/ml. Konsentrasi ini ditentukan berdasarkan penelitian serupa yang telah dilakukan oleh Wahyudi et al. (2011) dan Artati (2008) menggunakan bakteri dari genus yang sama. Seluruh isolat Pseudomonas mampu memproduksi IAA meskipun dengan variasi konsentrasi yang sangat besar. Menurut Salisbury dan Ross (1992) auksin dapat memacu pemanjangan akar hanya pada konsentrasi yang sangat rendah (10-13 M hingga 10-7 M, tergantung spesies dan usia tumbuhan). Beberapa isolat mampu menghasilkan IAA dalam jumlah yang lebih tinggi dibandingkan isolat yang lain namun isolat tersebut tidak memacu pertumbuhan lebih baik daripada kecambah kontrol. Hal ini diduga karena IAA yang dihasilkan oleh kecambah ditambah IAA yang dihasilkan oleh bakteri melebihi konsentrasi untuk memacu pertumbuhan. IAA yang dikeluarkan dalam jumlah tinggi akan meningkatkan transkripsi dan aktivitas aminosiklopropan-1-karboksilat (ACC) sintase sehingga memicu sintesis ACC yang berperan sebagai prekursor hormon etilen. Etilen bekerja sebagai modulator fitohormon lain dan mencegah pertumbuhan yang berlebih (Salisbury & Ross 1992). Isolat-isolat Bacillus dan Pseudomonas pada penelitian ini sebagian besar menghasilkan IAA dengan kisaran konsentrasi rendah. IAA pada kisaran konsentrasi optimal akan mampu menstimulasi pembentukan akar lateral dan akar adventif (Astuti 2008). Pada sel bakteri sendiri IAA yang diproduksi tidak secara langsung berfungsi sebagai hormon, namun diduga dihasilkan karena hormon tersebut berperan penting dalam interaksi antara bakteri dan tanaman. Pada penelitian Patten dan Glick
(2002) diketahui bahwa IAA yang dihasilkan oleh bakteri di perakaran tanaman mampu menstimulasi perakaran tanaman. Isolat yang menghasilkan IAA dalam konsentrasi tinggi atau berlebih bagi tanaman masih tetap dapat dimanfaatkan sebagai pemacu tumbuh. Penelitian yang dilakukan Widyawati (2008) menunjukkan bahwa Bacillus mampu menghasilkan IAA sampai konsentrasi 52,5 mg/ml media dan hal tersebut menghambat pertumbuhan kecambah kacang hijau. Hal yang dilakukan kemudian ialah melakukan pengenceran kultur sampai 20 kali untuk kemudian diinokulasikan kepada kecambah. Hasilnya ialah kecambah dapat tumbuh lebih baik daripada dengan kultur yang sebelumnya lebih pekat. Uji pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai varietas Wilis menunjukkan bahwa terdapat 9 dari 22 isolat Bacillus (40,9%) serta 7 dari 29 isolat Pseudomonas (24,1%) yang mampu memacu pertumbuhan kecambah secara signifikan. Dibandingkan penelitian sebelumnya, persentasi isolat yang mampu memacu tumbuh kecambah pada penelitian ini serupa dan relatif lebih tinggi. Pada penelitian serupa yang dilakukan Parjono (2008), persentase isolat Pseudomonas yang memacu tumbuh kecambah kedelai secara signifikan ialah 20% dari semua isolat yang diuji. Sementara itu, persentase Bacillus asal rizosfer yang memacu tumbuh pada penelitian Widyawati (2008) ialah sebesar 13.2%. Hasil uji pelarutan fosfat menunjukkan bahwa keenambelas isolat mampu melarutkan fosfat pada media padat yang ditandai dengan adanya zona bening di tepian koloni. Indeks pelarutan fosfat, yang menjadi nilai kemampuan pelarutan fosfat, bervariasi dari setiap isolat. Perbedaan kemampuan melarutkan fosfat ini terkait dengan kondisi spesifik fisiologis sel bakteri dan asam organik pelarut fosfat yang dihasilkannya. Asam organik akan membentuk kompleks yang stabil dengan kation pengikat P dan menurunkan pH. Pada proses pelarutan fosfat, asam juga akan menghidrolisis fosfat menjadi fitat. Bacillus mampu mengubah bentuk fitat melalui sekresi enzim fitase. Fitat inilah yang akan diserap oleh tanaman (Idriss et al. 2002). Asam organik dapat melarutkan fosfat melalui tiga mekanisme yaitu asidifikasi, pengkelatan, dan reaksi pertukaran ligan (Archand & Schneider 2006). Pada mekanisme asidifikasi, asam organik berperan dalam menurunkan pH, karena asam organik akan terdisosiasi menjadi anion dan kationnya. Ion H+ akan melarutkan batuan fosfat dengan
7
mengubah kesetimbangan. Mekanisme kedua, anion asam organik melarutkan fosfat melalui reaksi pengkelatan. Anion asam organik dengan hidroksil yang mengandung oksigen mempunyai kemampuan untuk membentuk kompleks yang stabil dengan kation-kation yang sering berikatan dengan fosfat di dalam tanah, salah satunya adalah kalsium yang diuji pada penelitian ini. Mekanisme ketiga terjadi dengan cara anion asam organik memobilisasi fosfor melalui reaksi pertukaran liganmelalui kompetisi dengan anion-anion fosfat yang terserap ke permukaan kristal Fe(OH)3 dan Al(OH)3 (Dey et al. 2004). Kemampuan pendukung yang ingin diketahui dari Pseudomonas dan Bacillus sebagai rizobakteria adalah perannya sebagai penghambat pertumbuhan cendawan patogen melalui produksi enzim kitinase. Enzim ini dapat merusak struktur kitin yang merupakan komponen utama dinding sel cendawan. Kitin sendiri merupakan polisakarida tak bercabang yang panjang dari sebuah gula amino N-asetilβ-D-glukosamin yang terhubung oleh ikatan β1,4-glikosidik (Chuan 2006). Kemampuan isolat menghasilkan enzim kitinase tidak selalu berarti bahwa isolat tersebut mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen. Isolat yang tidak menghasilkan enzim kitinase pun tidak berarti bahwa isolat tersebut tidak mampu menghambat cendawan patogen. Hal ini karena penghambatan fungi patogen juga dapat dilihat dari potensi lain seperti produksi siderofor (Sindhu & Dadarwal 2001) atau hidrogen sianida (Susilowati 2011). Selain itu, tingkat penghambatan juga ditentukan oleh aktivitas enzim. Hal ini ditunjukkan oleh penelitian Wang dan Chang (1997) yang mendapatkan tujuh kitinase memiliki aktivitas yang berbeda untuk media dengan sumber kitin yang sama. Enzim kitinase pun dihasilkan bakteri dengan berat molekul yang bervariasi, seperti yang ditunjukkan oleh penelitian Thamthiankul et al. (2001) bahwa Bacillus thuringiensis diketahui dapat menghasilkan kitinase dalam berbagai macam berat molekul yaitu 66, 60, 47, dan 32 kDa. Faktor-faktor inilah yang menjadikan penghambatan cendawan oleh enzim kitinase dapat berbeda antar isolat bakteri meskipun berasal dari genus yang sama. Hasil uji cekaman kekeringan, menunjukkan Pseudomonas spp. dan Bacillus spp. mampu bertahan pada kondisi stress air. Pemilihan level tekanan osmotik ditentukan berdasarkan Michel dan Kauffman (1972). Kondisi yang dibuat dimaksudkan untuk mengurangi tekanan osmotik air di dalam media sehingga air yang
ada di media lebih sulitdigunakan oleh bakteri. Toleransi bakteri dilihat melalui nilai optical density (OD) pada kultur bakteri di media cair berumur 24 jam. Menurut Sandhya (2010) rizobakteri yang menghuni area di mana air terbatas dengan periode kekeringan yang berulang lebih adaptif dan memacu pertumbuhan tanaman lebih baik dibandingkan bakteri yang diisolasi dari area di mana sumber air sangat melimpah. Beberapa rizobakteria terutama genus Pseudomonas, mampu menyekresikan eksopolisakarida yang dapat menahan air di sekitar sel sehingga bakteri lebih tahan terhadap kondisi kekurangan air (Sandhya et al. 2009). Jika bakteri mengkolonisasi permukaan akar, maka akar tanaman pun akan mampu menghadapi cekaman kekeringan dengan lebih baik. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melihat pengaruh isolat pada pertumbuhan tanaman kedelai dewasa dan potensinya untuk dijadikan pupuk hayati. Keunggulan bakteri PGPR dengan demikian dapat dimanfaatkan pada aplikasi praktis di lapangan. SIMPULAN Isolat yang berhasil diisolasi dari rizosfer kedelai (Glycine max) asal Nusa Tenggara Barat sebanyak 51yang terdiri atas 29 isolat Bacillus dan 22 isolat Pseudomonas. Dari 51 isolat tersebut, sebanyak 16 isolat mampu memacu pertumbuhan kecambah dengan kisaran IAA 4.59–5.44 ppm untuk isolat Bacillus dan 1.02 – 21.80 ppm untuk isolat Pseudomonas. Ketujuh belas isolat tersebut telah diuji kemampuannya menghadapi cekaman kekeringan dan terdapat dua isolat yang bertahan sampai tekanan osmotik -2.5 Mpa, yaitu isolat bntb20 dan pntb80. Karakterisasi kemampuan melarutkan kitin dan fosfat pun telah dilakukan dengan indeks kitinolitik paling besar ditunjukkan oleh isolat bntb22 sementara indeks pelarutan fosfat paling besar ditunjukkan oleh pntb18. SARAN Identifikasi bakteri secara biokimia atau fisiologi sebaiknya dilakukan supaya jenis isolat yang dapat diujikan lebih meyakinkan. Setelah dilakukan uji produksi enzim kitinase, sebaiknya isolat diujikan langsung terhadap fungi patogen perakaran tanaman.
8
DAFTAR PUSTAKA Ahmad F, Ahmad I, Khan MS. 2005.Indole acetic acid production by the indigenous isolat of Azotobacter and fluorescent Pseudomonas in the presence and absence of tryptophan. Turk J Biol 29:29-34. Alikhani HA, Mohamadi L. 2010. Assesing tolerance of rhizobial lentil symbiosis isolates to salinity and drought in dry land farming condition. Di dalam: 19th World Congress of Soil Science, Soil Solutions for a Changing World; Brisbane, 1-6 Agustus 2010. Archand MM, Schneider KD. 2006. Palant and microbial based mechanisms to improve the agronomic effectiveness of phosphate rock: A review. Acad Bras Cienc 78:791-807. Artati R. 2008. Penapisan Pseudomonas spp. dari rizosfer tanaman kedelai yang berpotensi sebagai rizobakteria pemacu pertumbuhan tanaman dan biokontrol fungi patogen [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Aryantha IP, Lestari DP, Pangesti NPD. 2004. Potensi isolat bakteri penghasil IAA dalam meningkatkan pertumbuhan kecambah kacang hijau pada kondisi hidroponik. J Mikrobiol Indones 9:43-46. Astuti RI. 2008. Analisis karakter Pseudomonas sp. Sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman dan biokontrol fungi patogen [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Balows A, Truper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer HH. 1992. The Procaryotes.Ed. ke-2. New York: Springer Verlag Inc. Bartholomew JW, Mittwer T. 1950. A simplified bacterial spore stain. Biotec Histochemist 25:153-156. Brick JM, Bostock RM, Silvertone SE. 1991. Rapid in situ assay for indoleacetic acid production by bacteria immobilized on a nitrocellulose membrane. Appl Environ Microbiol 57: 535-538. Cattelan AJ, Hartel PG, Fuhrmann JJ. 1999. Screening for plant growth-promoting rhizobacteria to promote early soybean growth. Soil Sci Soc Am J 63: 1670-1680. Chuan DL. 2006. Review of fungal chitinases. Mycopathologia 161:345-360.
Compant S, Duffy B, Nowak J, Clement C, Barka EA. 2005. Use of plant growthpromoting bacteria for biocontrol of plant diseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Appl Environ Microbiol 71: 4951–4959. Dey R, Pal KK, Bhatt DM, Chauhan SM. 2004. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachis hipogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol Res 159:371-394. Glick BR. 1995. The enhancement of plant growth promotion by free living bacteria. Can J Microbiol 41: 109-117. Husen E. 2003. Screening of soil bacteria for plant growth promotion activities in vitro. Indones J Agric Sci 4:27-31. Idriss EE, Makarewicz O, Farouk A, Rosner K,Greiner R, Bochow H, Richter T, Borriss R. 2002. Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant growth promoting effect. Microbiology148: 2097-2109. Jeon JS, Lee SS, Kim HY, Ahn TS, Song HG. 2003. Plant growth promotion in soil by some inoculated microorganisms. J Microbiol 41:271-276. Jurtshuk P Jr., McQuitty DN. 1976. Use of a quantitative oxidase test for characterizing oxidative metabolism in bacteria. Appl Environ Microbiol 31:688–679. Kloepper JW. 1992. Plant growth promoting rhizobacteria as biological control agents. Di dalam: Meeting Jr, editor. Soil Microbial Ecology, Aplications in Agricultural and Environmental Management. New York: Marcel dekker Inc. hlm 255-274. Michel BE, Kaufmann MR. 1972. The osmotic of polyethylene glycol 6000. J Plant Physiol 51:914-916. Palleroni NJ. 2004. The Road to the Taxonomy of Pseudomonas. Di dalam: Pierre C, editor. Pseudomonas: Genomics and Molecular Biology. Vol 1. Norfolk: Caister Academic Press. hlm 1-18. Parjono. 2008. Pseudomonas sp. sebagai pemacu pertumbuhan dan pengendali hayati fungi patogen akar tanaman kedelai [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
9
Patten CL, Glick BR 2002. Role of Pseudomonas putida indole acetic acid in development of the plant root system. Appl Environ Microbiol 68:3795-3801. Pelczar MJ, Chan ESC. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. Hadioetomo HS, Imas T, Angka SL penerjemah. Element of Microbiology. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Podile AR, Kishore GK. 2006. Plant growthpromoting rhizobacteria.Di dalam: Samuel S. Gnanamanickam, editor. Plant-Associated Bacteria. Dordrecht: Springer Netherlands. hlm 195-203.
Subba-Rao NS. 1999. Soil Microbiology - Soil Microorganisms and Plant Growth. Ed. ke4. New Hampshire: Science Publishers Inc. Susilowati A. 2011. Karakterisasi fisiologi dan genetik Pseudomonas sp. Sebagai biokontrol penyakit cendawan tular tanah pada tanaman kedelai[disertasi]. Bogor: Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Thamthiankul S, Suan-Ngay S, Tamtimavanic S, Panbagred W. 2001. Chitinase from Bacillus thuringiensis subs. Pakistani. Appl Microbiol Biotechnol 56:395-401.
Salisbury FB, Ross CW. 1992. Plant Physiology. Ed ke-4. California: Wadsworth Publishing, Inc.
Wahyudi AT, Astuti RI, Giyanto. 2011a. Screening of Pseudomonas sp. isolated from rhizosphere of soybean plant as plant growth promoter and biocontrol agent.Am J AgricBiol Sci 6:134-141.
Sandhya V, Ali SKZ, Grover M, Reddy G, Venkateswarlu B. 2009. Alleviation of drought stress effects in sunflower seedlingsby the exopolysaccharides producing Pseudomonas putida strain GAPP45. Biol Fertil Soils46:17-26.
Wahyudi AT, Astuti RP, Widyawati A, Meryandini A. 2011b. Characterization of Bacillus sp.strains isolated from rhizosphere of soybean plants for their use as potential plant growth for promoting rhizobacteria. J Microbiol Antimicrob 3:34-40.
Sandhya V, Ali SKZ, Grover M, Reddy G, Venkateswarlu B. 2010. Effect of plant growth promoting Pseudomonas spp. on compatible solutes, antioxidant status and plant growth of maize under drought stress. Plant Growth Regul 62:21-30.
Wang SL, Chang WT. 1997. Purification and characterization of two bifunctional chitinases/lysozymes extracellularly produced by Pseudomonas aeruginosa K187 in a shrimp and crab shell powder medium. Appl Environ Microbiol 63:380386.
Shen D. 1997. Microbial diversity and application of microbial products for agricultural purposes in China. Agric Ecosyst Environ 62: 237-245. Sindhu SS, Dadarwal KR. 2001. Chitinolytic and cellulolytic Pseudomonas sp. antagonistic to fungal pathogens enhances nodulation by Mesorhizobium sp. Cicer in chickpea. Microbiol Res 156:353-358.
Widyawati A. 2008. Bacillus sp. Asal rizosfer kedelai yang berpotensi sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan biokontrol fungi patogen akar [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Yang PX et al.2012. Phosphate solubilizing ability and phylogenetic diversity of bacteriafrom P-rich soils around Dianchi Lake drainage area of China. Pedosphere 22:707-71.
10
LAMPIRAN
11
Lampiran 1 Komposisi media tumbuh (dalam 1 liter akuades) 1. Nutrient Broth (NB) (atau NA) Beef extract 3g Peptone 5g Agar-agar 20 g 2. King’s B (atau King’s B Agar) Peptone 20 g K2HPO4 1,5 g MgSO4 1,5 g Gliserol 1,5 ml Agar-agar 20 g 3. Water Agar 1% Agar -agar
10 g
4. Pikovskaya (Subba-Rao 1999, Yang et al. 2012) Glukosa 10 g Ca3(PO4)2 5g NaCl 0,2 g KCl 0,2 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.2H2O 2,5 g FeSO4.7H2O 2,5 g Ekstrak khamir 0,5 g (NH4)2SO4 1g Agar-agar 15 g 5. Media Agar Kitin 1% (Cattelan et al. 1999) Glukosa 5g Pepton 2g Kitin 10 g 0,5 g K2HPO4 MgSO4 0,5 g NaCl 0,5 g Agar 15 g
12
Lampiran 2 Bahan-bahan untuk karakterisasi fisiologi secara parsial genus Bacillus dan Pseudomonas. 1. Kit pewarnaan Gram Pewarna kristal ungu (modifikasi Hucker) Larutan A: Kristal violet (85%) 2g Etanol (95%) 20 ml Larutan B: Amonium oksalat 0,8 g Akuades 80 ml Pewarna Safranin Safranin 0,25 g Etanol (95%) 10 ml Akuades 100 ml 2. Kit pewarnaan endospora Hijau malakit Malachite green oxalate Akuades Safranin Safranin Akuades
0,5 g 100 ml
3. Pereaksi Salkowsky (Patten H2SO4 pekat Akuades FeCl3.6H2O 0,5M
& Glick 2002) 150 ml 250 ml 7,5 ml
5g 100 ml
13
Lampiran 3 PEG 6000 yang ditambahkan untuk mencapai tekanan osmotik yang diinginkan (Michel & Kaufmann 1973). Potensial osmotik yang diinginkan (MPa) -0.73 -1.00 -1.50 -2.00 -2.50 -3.00
PEG (g/L) 249.17 295.75 367.67 428.38 481.89 530.30
Lampiran 4 Toleransi bakteri terhadap cekaman kekeringan (Alikhani & Mohamadi 2010). Tingkat toleransi Sangat sensitif Sensitif Toleran Sangat toleran
Optical density (OD) < 0.3 0.3-0.4 0.4-0.5 > 0.5
