KAJIAN PENGHAMBATAN EFEK TOKSIK KARMOISIN DAN RHODAMIN TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT TIKUS OLEH EKSTRAK DAUN JELATANG (Urtica dioica L

KAJIAN PENGHAMBATAN EFEK TOKSIK KARMOISIN DAN RHODAMIN TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT TIKUS OLEH EKSTRAK DAUN JELATANG (Urtica dioica L.)

SKRIPSI

RIJALI ARONI F24063451

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

INHIBITION OF CARMOISINE AND RHODAMINE TOXIC EFFECTS ON RAT’S SPLEEN LYMPHOCYTES PROLIFERATION ACTIVITY BY Urtica dioica L. LEAF EXTRACT Rijali Aroni1, Fransisca R. Zakaria1 1

Department of Food Science and Technology, Faculty of Agricultural Technology, Bogor Agricultural University, IPB Darmaga Campus, PO BOX 220, Bogor, West Java, Indonesia

ABSTRACT Urtica dioica L. has long been known as a herbal remedy and nutritious addition to the diet. It has been consumed for a long time as medicinal plants in many parts of the world. This study aimed to observe the effect of U. dioica L. leaf extracts in enhancing proliferation of rat’s spleen lymphocytes. Furthermore, this study also aimed to observe the capability of U. dioica L. leaf extracts in defending lymphocyte against toxic effects of carmoisine and rhodamine B . 30 Sprague Dawley rats were split into three groups, which are control, 0.1 g/kg BW/day dose, 1 g/kg BW/day dose group. The control group was given drinking water while the others were given U. dioica L. leaf crude extracts at their dose respectively. After 90 days of treatment, lymphocyte cells from the rat’s spleen then isolated and tested using MTT proliferation assay with addition of mitogen, and various concentration of carmoisine and rhodamine B. Stimulation index of spontaneous proliferation in 0.1 g/kg BW/day dose group was higher than the other groups. Mitogen-induced proliferation shows an increased proliferation activity in control and 1 g/kg BW/day dose group, while in 0.1 g/kg BW/day dose group a decreased proliferation activity was observed. U. dioica L. leaf crude extracts given at 1 g/kg BW/day shows that the rat’s lymphocyte proliferation activity at the presence of carmoisine was higher than control and 0.1 g/kg BW/day dose group. Likewise, at the presence of rhodamine B, the rat’s lymphocyte proliferation activity of 1 g/kg BW/day dose group was higher than control and 0.1 g/kg BW/day dose group. It is concluded that U. dioica L. leaf crude extract given at 1 g/kg BW/day could inhibit carmoisine and rhodamine B toxic effect on rat’s spleen lymphocytes proliferation activity. Key words: Urtica dioica L., carmoisine, rhodamine B, lymphocyte proliferation

RIJALI ARONI. F24063451. Kajian penghambatan efek toksik karmoisin dan rhodamin terhadap proliferasi sel limfosit tikus oleh ekstrak daun jelatang (Urtica dioica L.). Di bawah bimbingan Prof. Dr. Ir. Fransisca R. Zakaria, MSc. 2011

RINGKASAN Urtica dioica L. memiliki sejarah panjang sebagai obat herbal dan bahan pangan yang bergizi di berbagai belahan dunia. Penelitian-penelitian terdahulu menyebutkan bahwa tanaman jelatang mengandung beberapa komponen bioaktif yang berfungsi positif terhadap kesehatan, diantaranya adalah komponen-komponen yang memiliki sifat imunomodulator. Namun demikian, pengaruh konsumsi daun tanaman jelatang terhadap sistem imun tubuh belum diketahui secara pasti. Oleh karena itu, perlu dilakukan suatu kajian tentang pengaruh konsumsi tanaman jelatang terhadap respon imun tubuh. Dan lebih jauh lagi, perlu dilakukan pula kajian tentang pengaruh konsumsi tanaman jelatang dalam menangkal efek-efek negatif dari paparan senyawa-senyawa kimia berbahaya. Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari pengaruh pemberian ekstrak daun jelatang (Urtica dioica L.) sebanyak 0.1 g/kg BB/hari dan 1 g/kg BB/hari dalam menstimulasi proliferasi limfosit dan menghambat efek toksik yang ditimbulkan oleh senyawa karmoisin dan rhodamin B terhadap aktivitas proliferasi sel limfosit limfa tikus. Penelitian diawali dengan pembuatan ekstrak jelatang dari bubuk daun jelatang kering dengan dosis 0.1 g/kg BB/hari dan 1 g/kg BB/hari. Pengujian dilakukan dengan menggunakan tikus percobaan jenis Sprague Dawley yang berumur ±2 bulan selama 90 hari dengan 3 hari masa adaptasi. Tikus percobaan dibagi menjadi tiga kelompok. Kelompok pertama merupakan kontrol negatif, kelompok kedua diberikan ekstrak daun jelatang sebanyak 0.1 g/kg BB/hari, dan kelompok ketiga diberikan ekstrak daun jelatang sebanyak 1 g/kg BB/hari. Ekstrak daun jelatang diberikan melalui proses pencekokan. Tikus kelompok kontrol negatif juga dicekok, namun dengan air minum dalam kemasan (AMDK), sehingga mengalami stress yang sama. Penimbangan berat badan untuk memantau pertumbuhan tikus percobaan dilakukan dua hari sekali. Kenaikan berat badan tertinggi terjadi pada kelompok kontrol sebesar 136.60±40.20 g. Hal ini sesuai dengan konsumsi pakan/hari kelompok kontrol yang lebih tinggi dibanding kelompok lain. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa konsumsi pakan/hari kelompok tikus kontrol berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95% dengan dua kelompok lain. Namun kenaikan berat badan tidak berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95% pada masing-masing kelompok tikus. Grafik pertumbuhan masing-masing kelompok tikus juga cenderung meningkat. Hal ini mengindikasikan bahwa selama masa perlakuan, semua kelompok tikus berada dalam keadaan pertumbuhan yang baik. Selama periode pemeliharaan tikus percobaan ditemukan dua kasus kematian (mortalitas). Kedua kasus ini terjadi pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari dan dosis 1 g/kg BB/hari. Kedua kasus kematian ini diperkirakan terjadi karena penyimpangan irama jantung (arrythmia) Mengingat hasil pemeriksaan fisik menunjukkan lebih banyak tikus yang tidak menunjukkan gejala toksisitas, maka diperkirakan tikus yang mati selama pengujian lebih sensitif dibandingkan tikus-tikus lainnya. Pengambilan organ limfa dilakukan pada hari ke 90 dalam keadaan steril. Pengujian proliferasi sel limfosit dilakukan dengan mengisolasi sel limfosit limfa terlebih dahulu dan kemudian sel limfosit dihitung dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop perbesaran 400 kali. Pengujian proliferasi limfosit dan penghambatan efek toksik karmoisin dan rhodamin oleh ekstrak jelatang dilakukan dengan teknik kultur sel. Suspensi sel limfosit ditepatkan 2x106 sel/ml melalui pengenceran dengan RPMI-1640. Selanjutnya suspensi sel dikultur dalam microplate 96 sumur dengan volume total masing-masing sumur adalah 100 µl. Bahan-bahan yang ditambahkan pada setiap sumur

disesuaikan dengan perlakuan yang akan diberikan. Kemudian absorbansi masing-masing sumur diukur dengan menggunakan microplate reader (ELISA Reader) pada panjang gelombang 570 nm. Hasil pengujian proliferasi limfosit spontan menunjukkan bahwa indeks stimulasi limfosit kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari memiliki nilai yang paling tinggi yaitu 1.243. Adapun kelompok tikus dengan pemberian daun jelatang dosis 1 g/kg BB/hari memiliki nilai IS yang lebih rendah dari kontrol yaitu sebesar 0.948. Konsentrasi karmoisin yang diujikan adalah 48 µg/ml, 96 µg/ml dan 144 µg/ml kultur. Secara umum terlihat bahwa adanya paparan karmoisin menyebabkan penurunan aktivitas proliferasi secara signifikan pada kelompok tikus kontrol. Sementara itu, pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari, secara umum terjadi penurunan aktivitas proliferasi limfosit yang signifikan akibat adanya paparan karmoisin. Dengan demikian, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 0.1 g/kg BB/hari tidak dapat menghambat efek toksik yang ditimbulkan karmoisin terhadap proliferasi limfosit tikus. Adapun pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari, aktivitas proliferasi meningkat secara signifikan pada ketiga konsentrasi paparan karmoisin yang diujikan. Pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis ini tidak hanya mampu menghambat efek toksik dari paparan karmoisin namun juga masih mampu menstimulasi proliferasi limfosit. Senyawa rhodamin B ditambahkan ke dalam kultur sel pada konsentrasi 12 µg/ml, 24 µg/ml dan 36 µg/ml kultur. Berdasarkan hasil penelitian, paparan rhodamin B menyebabkan penurunan aktivitas proliferasi limfosit secara sigifikan pada kelompok tikus kontrol. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari secara umum juga mengalami penurunan aktivitas proliferasi secara signifikan. Namun lain halnya dengan kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari, adanya paparan rhodamin B tidak mempengaruhi aktivitas proliferasi secara signifikan. Dengan kata lain, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 1 g/kg BB/hari mampu menghambat efek toksik rhodamin B terhadap aktivitas proliferasi sel limfosit tikus.

KAJIAN PENGHAMBATAN EFEK TOKSIK KARMOISIN DAN RHODAMIN TERHADAP PROLIFERASI SEL LIMFOSIT TIKUS OLEH EKSTRAK DAUN JELATANG (Urtica dioica L.)

SKRIPSI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA TEKNOLOGI PERTANIAN pada Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor

Oleh RIJALI ARONI F24063451

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

ii

Judul Skripsi

:

Kajian penghambatan efek toksik karmoisin dan rhodamin terhadap proliferasi sel limfosit tikus oleh ekstrak daun jelatang (Urtica dioica L.)

Nama

:

Rijali Aroni

NIM

:

F24063451

Menyetujui,

Pembimbing

(Prof. Dr. Ir. Fransisca R. Zakaria, MSc) NIP 19490614.198503.2.001

Mengetahui, Plt. Ketua Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

(Dr. Ir. Nurheni Sri Palupi, MSi) NIP 19610802.198703.2.002

Tanggal Ujian Akhir Sarjana : 22 Juli 2011

iii

PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI

Saya menyatakan dengan sebenar – benarnya bahwa skripsi dengan judul Kajian penghambatan efek toksik karmoisin dan rhodamin terhadap proliferasi sel limfosit tikus oleh ekstrak daun jelatang (Urtica dioica L.) adalah hasil karya saya sendiri dengan arahan Dosen Pembimbing Akademik, dan belum diajukan dalam bentuk apapun pada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun yang tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.

Bogor, Juli 2011 Yang membuat pernyataan

Rijali Aroni F24063451

iv

© Hak cipta milik Rijali Aroni, tahun 2011 Hak cipta dilindungi

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya

v

BIODATA PENULIS Rijali Aroni. Lahir di Masbagik pada tanggal 23 Maret 1988 sebagai anak ketiga dari pasangan Suhin dan Sa’adah. Penulis menempuh pendidikan dasarnya di SD Negeri 12 Masbagik, Lombok Timur hingga lulus pada tahun 2000. Penulis melanjutkan pendidikannya di Mts. Negeri Selong, Lombok Timur hingga lulus pada tahun 2003. Pendidikan menengah atas penulis ditempuh di SMA Negeri 1 Masbagik, Lombok Timur hingga lulus pada tahun 2006. Penulis memasuki perguruan tinggi di Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor melalui Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2006. Selama menempuh pendidikan di IPB, penulis terlibat dalam organisasi himpunan mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan (HIMITEPA) periode 2008-2009 sebagai staf Departemen IT. Penulis pernah mendapatkan juara ketiga pada Engineering Science Competition yang diadakan oleh Himpunan Mahasiswa Teknik Pertanian pada tahun 2006. Penulis pernah mengikuti kompetisi Danone Trust tahun 2009. Selain itu, penulis bersama tim mengikuti Program Pengembangan Kewirausahaan Mahasiswa yang diselenggarakan oleh DPKHA IPB. Sebagai tugas akhir, penulis melakukan penelitian “Kajian penghambatan efek toksik karmoisin dan rhodamin terhadap proliferasi sel limfosit tikus oleh ekstrak daun jelatang (Urtica dioica L.)” di bawah bimbingan Prof.Dr.Ir. Fransisca R. Zakaria, MSc.

vi

KATA PENGANTAR Penulis mengucapkan syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian yang berjudul “Kajian Penghambatan Efek Toksik Karmoisin dan Rhodamin terhadap Proliferasi Sel Limfosit Tikus Oleh Ekstrak Daun Jelatang (Urtica dioica L.)”. Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada: 1.

Prof. Dr. Ir. Fransisca R. Zakaria, MSc selaku dosen pembimbing atas segala bimbingan, kesabaran dan nasihat yang diberikan kepada penulis selama menjadi mahasiswa Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan

2.

Fytagoras BV Plant Science, Belanda yang membiayai sebagian dana penelitian

3.

Seluruh dosen Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan atas segala ilmu yang sangat bermanfaat

4.

Keluarga tercinta, Ibu, Bapak, Kak Insa, Kak Yoesron, Oyik, dan Rizqy atas kesabaran dan kasih sayangnya

5.

Teman-teman satu bimbingan, Anto, Husna, dan Erin atas bantuan dan semangatnya.

6.

Teman-teman dan kakak-kakak yang tergabung dalam tim toksisitas, Mas Anas, Mas Gito, Anissa, Keni, Dinda, dan Zatil, atas arahan dan kerjasamanya

7.

Teman-teman seperjuangan di Friends 24 café, Tito, Kak Fahmi, Kak Riza, Zul, Rina, Widi, Widya, Risma, Kak Dila, dan Kak Tiwi atas pengalaman yang sangat berharga.

8.

Wahyu Anggarini atas waktu, kesabaran, semangat dan keceriaan yang dibagi bersama penulis.

9.

Seluruh teman-teman seperjuangan di ITP 43, terutama Roni, Lingga, Deni, Ade, Dewi, Hasti, Abe, dan Bintang atas keceriaan mengisi hari-hari penulis.

10. Teman-teman satu kontrakan, Rendi, Ahmad, Izhul, Akbar, Andi, Adun, Awet, Budi, dan Arif atas kerjasama dan bantuannya. 11. Para laboran dan staf, terutama Pak Adi, Pak Wahid, Mas Aldi, dan Bu Sri 12. Seluruh staf UPT Akhirnya penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan memberikan kontribusi yang nyata terhadap perkembangan ilmu pengetahuan di bidang teknologi pangan.

Bogor, Juli 2011

Rijali Aroni

vii

DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR …………………………………………………..……………....

vii

DAFTAR TABEL ……………………………………………………….……………...

ix

DAFTAR GAMBAR ……………………………………………………………………

x

DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………………………………

xi

I. 1.1. 1.2.

PENDAHULUAN …………………………………………………………… Latar Belakang …………………………………………...…………………. Tujuan ………………………………………………………………………

1 1 2

II. 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.5.1. 2.5.2.

TINJAUAN PUSTAKA ………………………………………...……………. Toksisitas Pewarna Sintetis………...…………….………….……..................... Karmoisin ………….………….………….………….………….……………... Rhodamin B …………........…………….………….………….………….…… Jelatang (Urtica dioica L.)……………………………………………………... Limfosit …………………………………………..……………………………. Proliferasi Sel Limfosit ………………………………....................................... Uji Proliferasi Sel Limfosit ……..................……………................................... Kultur Sel …………………...................................................…………………. Uji MTT ……………………..................................................…………………

3 3 3 4 6 7 8 9 9 10

III. 3.1. 3.2.

BAHAN DAN METODE ……………………………………….……………. Bahan dan Alat …………………..……………………….…………………. Metode Penelitian ………………………………………...………………….

12 12 13

IV. 4.1. 4.2. 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3.

HASIL DAN PEMBAHASAN ………………………………....……………. Pemeliharaan dan Pertumbuhan Tikus ............................................................... Proliferasi Sel Limfosit Limfa Tikus ………………………………………… Proliferasi Limfosit Spontan …………………………………………………... Proliferasi Limfosit dengan Penambahan LPS .........………………………… Proliferasi Limfosit dengan Penambahan Senyawa Toksik……………………

17 17 19 21 22 24

V. 5.1. 5.2.

SIMPULAN DAN SARAN ………………………………..........……………. Simpulan ………………………………………………….......……………. Saran …………………………………………………………..…………….

31 31 31

DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………...……………... LAMPIRAN ……………………………………………………………..……………...

viii

DAFTAR TABEL Halaman Tabel 1. Bahan pewarna sintetis yang dilarang penggunaannya pada makanan di Indonesia………....................……………....……………....……………....………

5

Tabel 2. Komposisi ransum standar AIN 1976...............…………… ……………………

12

Tabel 3. Komposisi campuran vitamin................. …………………………………………..

12

Tabel 4. Komposisi campuran mineral.......................……………………………………….

13

Tabel 5. Bahan- bahan yang ditanam ke dalam kultur sel...........……………………………

15

Tabel 6. Rata-rata dan standar deviasi berat badan, kenaikan berat badan, dan konsumsi pakan padasetiap kelompok tikus……………………………………………...……

18

Tabel 7. Rata-rata indeks stimulasi pada setiap perlakuan…………………………………..

20

Tabel 8. Rata-rata indeks stimulasi dan aktivitas proliferasi limfosit dengan penambahan LPS…………………………………………………………………………………..

23

Tabel 9. Nilai aktivitas proliferasi limfosit dengan perlakuan karmoisin (%)………….……

25

Tabel 10. Nilai aktivitas proliferasi limfosit dengan perlakuan rhodamin B (%)………..……

28

ix

DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Struktur kimia karmoisin.........................…………............................................

3

Gambar 2.

Struktur kimia rhodamin B.................................................................................

4

Gambar 3.

Jelatang (Urtica dioica L.)...................................................................................

6

Gambar 4. Gambar 5.

Pertumbuhan tikus kontrol dan tikus yang diberi ekstrak daun jelatang dosis 0,1 g/kg BB/hari dan dosis 1 g/kg BB/hari ...................................................... Rata-rata indeks stimulasi proliferasi spontan pada setiap kelompok tikus

Gambar 6.

Pengaruh penambahan LPS terhadap rata-rata indeks stimulasi .....................

Pengaruh penambahan karmoisin 48 μg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit.................................................................................................................. Gambar 8. Pengaruh penambahan karmoisin 96 μg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit ................................................................................................................. Gambar 9. Pengaruh penambahan karmoisin 144 μg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit................................................................................................................. Gambar 10. Pengaruh penambahan rhodamin B 12 μg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit.................................................................................................................. Gambar 11. Pengaruh penambahan rhodamin B 24 μg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit.................................................................................................................. Gambar 12. Pengaruh penambahan rhodamin 36 μg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit.................................................................................................................. Gambar 7.

18 21 23 25 26 26 28 29 29

x

DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Perhitungan konversi dosis manusia ke tikus...........................................

38

Lampiran 2.

Contoh perhitungan volume cekok per tikus............................................

38

Lampiran 3.

Hasil penimbangan berat badan pada setiap kelompok tikus...................

39

Lampiran 4.

Konsumsi pakan per hari..........................................................................

44

Lampiran 5.

Hasil uji homogenitas keragaman beserta uji sidik ragam terhadap berat badan tikus pada awal perlakuan.............................................................. Hasil uji homogenitas keragaman beserta uji sidik ragam terhadap berat badan tikus pada akhir perlakuan.............................................................

Lampiran 6. Lampiran 7.

52 52 53

Lampiran 8.

Hasil uji homogenitas keragaman beserta uji sidik ragam terhadap kenaikan/selisih berat badan tikus………………….............................. Rata-rata absorbansi kultur sel pada tiap perlakuan.................................

Lampiran 9.

Hasil uji sidik ragam terhadap nilai indeks stimulasi spontan……..…..

53

Lampiran 10.

Hasil uji T berpasangan terhadap nilai IS spontan dan IS dengan penambahan LPS......................................................................................

54

Hasil uji T berpasangan terhadap nilai IS spontan dan IS dengan penambahan karmoisin 48 μg/ml.............................................................

54

Hasil uji T berpasangan terhadap nilai IS spontan dan IS dengan penambahan karmoisin 96 μg/ml............................................................

55

Hasil uji T berpasangan terhadap nilai IS spontan dan IS dengan penambahan karmoisin 144 μg/ml.........................................................

55

Hasil uji T berpasangan nilai IS spontan dan IS dengan penambahan rhodamin B 12 μg/ml..............................................................................

56

Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13. Lampiran 14. Lampiran 15.

Lampiran 16.

53

Hasil uji T berpasangan nilai IS spontan dan IS dengan penambahan rhodamin B 24 μg/ml..............................................................................

56

Hasil uji T berpasangan nilai IS spontan dan IS dengan penambahan rhodamin B 36 μg/ml..............................................................................

57

xi

I.

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Dewasa ini, bahan pewarna sintetis telah digunakan secara luas pada pengolahan pangan. Bahan pewarna sintetis ini diketahui memiliki efek negatif bagi tubuh, seperti efek toksik, karsinogenik, ataupun genotoksik. Oleh karena itu, penggunaan bahan-bahan pewarna sintetis ini diatur dengan ketat di seluruh dunia. Namun, penggunaan bahan pewarna yang dilarang juga masih sering ditemukan. Padahal efek negatif dari bahan pewarna yang dilarang sudah jelas dan jauh lebih berbahaya dibandingkan dengan pewarna yang telah diregulasi. Hal ini membuat kita sebagai konsumen pangan akan semakin rentan terhadap paparan senyawa-senyawa kimia berbahaya. Seiring dengan kemajuan teknologi, ajakan-ajakan ataupun regulasi untuk mengurangi penggunaan bahan-bahan tambahan sintetis pada makanan dan obat-obatan semakin meningkat. Penemuan-penemuan terbaru menunjukkan bahwa semakin banyak bahan-bahan asing (sintetis/xenobiotik) yang masuk ke dalam tubuh, maka semakin tinggi pula resiko kesehatan yang akan muncul. Oleh karena itu, banyak orang beralih menggunakan bahan-bahan alami seperti tanaman-tanaman obat (herbal) sebagai obat ataupun bahan makanan untuk menjaga status kesehatannya. Penggunaan berbagai jenis herbal sebagai makanan ataupun obat-obatan untuk meningkatkan status kesehatan sebagian besar merupakan warisan dari tradisi leluhur. Penggunaan tanaman-tanaman ini umumnya hanya didasarkan pada pengalaman tanpa adanya dukungan data-data ilmiah. Sehingga, informasi yang jelas dan akurat mengenai khasiat dan keamanan suatu herbal pun sulit ditemukan. Oleh karena itu, penelitian-penelitian mengenai khasiat dan keamanan herbal semakin berkembang, baik melalui tinjauan terhadap kandungan senyawa di dalamnya ataupun tinjauan penggunaan secara keseluruhan. Urtica dioica L. atau di Indonesia dikenal dengan nama Jelatang merupakan tanaman yang banyak terdapat di sebagian besar daerah Asia dan Eropa Utara, terutama di daerah pedalaman. Di Indonesia, tanaman ini belum banyak digunakan sebagai bahan pangan dan umumnya dikenal sebagai tanaman liar yang tumbuh di daerah persawahan. Walaupun demikian, tanaman ini memiliki sejarah panjang sebagai obat herbal dan bahan pangan yang bergizi di berbagai belahan dunia. Di beberapa negara daun jelatang diolah menjadi semacam sup serta umum diolah menjadi minuman sejenis teh. Daun jelatang juga digunakan secara tradisional sebagai obat herbal untuk perawatan radang sendi (arthritis). Ekstrak tanaman jelatang juga digunakan untuk mengobati penyakit anemia, infeksi saluran urin, hay fever (allergic rhinitis), dan beberapa masalah ginjal. Beberapa peneliti menyebutkan bahwa penggunaan daun dan biji jelatang (Urtica dioica L.) dengan atau tanpa tanaman lain, dapat menyembuhkan eczema, hemorrhoid, inflamasi hati, rematik, dan kanker prostat (Aksu dan Kaya 2004). Selain itu, komponen flavonoid glikosida utama yang diisolasi dari tanaman jelatang memiliki aktivitas immunomodulator dan anti-inflamasi (Akbay et al. 2003). Senyawa yang memiliki aktivitas immunomodulator diketahui dapat meningkatkan sistem imun tubuh. Namun demikian, pengaruh konsumsi daun tanaman jelatang terhadap sistem imun tubuh belum diketahui secara pasti. Oleh karena itu, perlu dilakukan suatu kajian tentang pengaruh konsumsi tanaman jelatang terhadap respon imun tubuh. Dan lebih jauh lagi, perlu dilakukan pula kajian tentang pengaruh konsumsi tanaman jelatang dalam menangkal efek-efek negatif dari paparan senyawasenyawa kimia berbahaya.

Pada penelitian ini, studi difokuskan pada uji proliferasi sel limfosit karena sel limfosit merupakan salah satu komponen yang memiliki peranan penting dalam respon imun tubuh. Sel limfosit bertanggung jawab dalam proses identifikasi dan eliminasi mikroorganisme patogen dan zatzat berbahaya lainnya yang masuk ke dalam tubuh. Adapun proliferasi sel limfosit merupakan proses pembelahan secara mitosis dan diferensiasi sel sebagai respon terhadap antigen atau mitogen. Proliferasi limfosit dapat mengindikasikan aktivitas respon imun spesifik yang berkaitan dengan suatu sistem imun. Parameter yang digunakan dalam pengujian aktivitas proliferasi sel limfosit adalah pengamatan indeks stimulasi (IS) dari sel limfosit yang diisolasi dari limfa tikus dan di kultur dalam media dan lingkungan steril.

1.2. Tujuan Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari pengaruh pemberian ekstrak daun jelatang (Urtica dioica L.) sebanyak 0,1 g/kg BB/hari dan 1 g/kg BB/hari dalam menstimulasi proliferasi limfosit dan menghambat efek toksik yang ditimbulkan oleh senyawa karmoisin dan rhodamin B terhadap aktivitas proliferasi sel limfosit tikus Sprague Dawley.

2

II.

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Toksisitas Pewarna Sintetis Pewarna tambahan alami ataupun sintetis telah digunakan secara luas pada makanan, kosmetik dan obat-obatan (Hallagan et al. 1995). Walaupun demikian, menurut Thorngate III (2002) industri makanan lebih memilih pewarna sintetis dibandingkan pewarna asal hewan, tanaman ataupun mineral karena warnanya yang konsisten, kuat, dan stabil. Frazier (2009) menyebutkan bahwa pewarna sintetis umumnya berupa pewarna azo (seperti karmoisin, amaranth), yang warnanya berasal dari grup azo (R1-N=N-R2). Grup R pada pewarna azo secara normal merupakan sistem aromatik, memberikan sistem ikatan ganda terkonjugasi yang dapat menampilkan berbagai jenis warna (kuning, oranye, merah, coklat). Toksikologi pewarna makanan sintetis kurang mendapat perhatian hingga awal dekade 1930, ketika 4-dimethylaminoazobenzene ditemukan bersifat karsinogen. Setelah itu, pewarna-pewarna lain dibuktikan bersifat toksik dan dilarang untuk ditambahkan pada makanan (Janssen 1997). Walaupun demikian, pewarna sintetis yang dilarang masih sering digunakan dan ditemukan keberadaannya dalam makanan. Menurut EFSA (2005), banyak negara Uni Eropa memberikan notifikasi tentang keberadaan pewarna-pewarna illegal yang diketahui memiliki sifat karsinogenik dan genotoksik seperti Sudan I, Sudan II, Sudan III, Sudan IV, Para Red, Rhodamin B, and Orange II pada beberapa bahan makanan.

2.1.1. Karmoisin Karmoisin atau dikenal juga dengan azorubine merupakan pewarna azo dengan rumus kimia C20H12N2Na2O7S2 (Gambar 1). Senyawa ini memiliki berat molekul 502.44 g/mol dengan nama kimia disodium 4-hydroxy-3- (4-sulphonato-1-naphthylazo) naphthalene-1-sulphonate (EFSA 2009). Karmoisin bersifat larut air dan sedikit larut pada etanol. Senyawa ini biasanya berbentuk bubuk garam disodium dengan warna merah hingga maroon. Karmoisin umum digunakan pada makanan yang mengalami proses pemanasan setelah difermentasi (Amin et al. 2010).

Gambar 1. Struktur kimia Karmoisine (EFSA 2009) Hingga saat ini, Karmoisin merupakan pewarna makanan sintetis yang diizinkan di Uni Eropa dengan level maksimal penggunaan yang diizinkan sebesar 50-500 mg/kg pangan untuk berbagai jenis

bahan pangan dengan nilai Acceptable Daily Intake (ADI) sebesar 0-4 mg/kg BB/hari. Sebagian dari karmoisin yang dicerna mengalami reduksi azo dalam usus. Selain itu, karmoisin yang tidak termodifikasi dan 5 metabolit tidak dikenal juga ditemukan pada feses (EFSA 2009). Menurut Amin et al. (2010), karmoisin dapat tereduksi dalam organisme menjadi sebuah amine aromatik yang sangat sensitif. Beberapa penelitian yang telah dilakukan menunjukkan efek negatif dari karmoisin. Studi yang dilakukan oleh Amin et al. (2010) menyimpulkan bahwa pewarna makanan seperti tartrazin dan karmoisin dapat memberikan pengaruh negatif dan mengubah beberapa penanda biokimia pada organorgan penting seperti hati dan ginjal, baik pada dosis tinggi ataupun rendah. Lebih jauh lagi, tartrazin dan karmoisin juga memberikan efek yang lebih beresiko pada dosis yang lebih tinggi karena dapat menginduksi stress oksidatif melalui pembentukan radikal bebas. Sharma et al. (2006) menemukan bahwa dua dosis Tomato Red (campuran karmoisin dan ponceau 4R) menunjukkan peningkatan yang signifikan pada aktivitas alkaline phospatase (ALP). Pada keadaan normal, ALP yang berada di dalam hati akan diekskresikan ke dalam empedu. Jika terjadi kerusakan atau obstruksi pada hati dan saluran empedu, seperti kolestasis, maka kadar ALP darah akan meningkat. Selain itu, Sharma et al. (2005) juga mengamati adanya peningkatan yang signifikan pada serum transaminase, total protein serum dan globulin tikus yang dietnya ditambahkan pewarna cokelat A dan B (Sunset Yellow, tartrazin, karmoisin dan Brilliant Blue pada berbagai konsentrasi). Peningkatan spesifik pada fraksi globulin akan menuju kepada peningkatan sintesis immunoglobulin, mekanisme pertahanan yang bertujuan untuk melindungi tubuh dari efek toksik pewarna sintesis tersebut.

2.1.2. Rhodamin B Rhodamin B (C28H31ClN2O3) adalah zat warna sintetis berbentuk serbuk kristal, berwarna hijau atau ungu kemerahan, tidak berbau dan berwarna merah terang berfluorensi dalam larutan. Rhodamin B memiliki nama kimia [9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]diethylammoniumchloride dengan berat molekul 479.02 g/mol. Rhodamin B semula digunakan untuk kegiatan histologi dan sekarang berkembang untuk berbagai keperluan seperti sebagai pewarna kertas dan tekstil. Rhodamin B juga digunakan secara luas pada aplikasi bioteknologi seperti fluorescence microscopy, flow cytometry, fluorescence correlation spectroscopy dan ELISA. Menurut Inchem (2006) nilai LD50 rhodamin B adalah 89.5 mg/kg berat badan.

Gambar 2. Struktur kimia Rhodamine B (EFSA 2005)

4

Rhodamin B seringkali disalahgunakan untuk pewarna pangan dan kosmetik. Sebagai contoh, rhodamin B ditemukan pada makanan dan minuman seperti kerupuk, sambal botol dan sirup di Makassar pada saat BPOM Makassar melakukan pemeriksaan sejumlah sampel makanan dan minuman ringan (Anonimus 2006). Menurut Peraturan Menteri Perdagangan RI No.4 tahun 2006, rhodamin B termasuk dalam bahan pewarna sintetis yang dilarang penggunaannya (Tabel 1). Tabel 1. Bahan pewarna sintetis yang dilarang penggunaannya pada makanan di Indonesia No

Nama

Warna

1

Merah

Citrus Red

2

Merah

Ponceau 3R

3

Merah

Ponceau SX

4

Merah

Sudan I

5

Merah

Rhodamin B

6

Merah

Amaran

7

Merah

Ponceau 6R

8

Oranye

Auramine

9

Oranye

Chrycidine

10

Oranye

Oil Orange SS

11

Oranye

Oil Orange XO

12

Oranye

Orange G

13

Oranye

Orange GGN

14

Kuning

Oil Yellow AB

15

Kuning

Oil Yellow OB

16

Kuning

Methanil Yellow

17

Kuning

Butter Yellow

18

Kuning

Aniline Yellow

19

Hijau

Guinea Green

20

Biru

Indantren Blue R

21

Violet

Magenta I

22

Violet

Magenta II

23

Violet

Magenta III

24

Violet

Violet 6B

25

Coklat

Coklat FB

Berdasarkan data dari berbagai studi yang telah dilakukan, EFSA (2005) menyimpulkan bahwa rhodamin B berpotensi memiliki sifat karsinogenik dan genotoksik. Kaji et al. (1991) melakukan pengujian terhadap efek pewarna kosmetik rhodamin B terhadap proliferasi fibroblast (sel KD) bibir manusia pada sistem kultur dan menemukan bahwa rhodamin B, pada konsentrasi 25 µg/ml dan konsentrasi yang lebih tinggi, secara signifikan menurunkan jumlah sel setelah dikultur selama 72 jam. Menurut Pipih dan Juli (2000) pemberian dosis rhodamin B 150 ppm, 300 ppm, dan 600 ppm

5

pada mencit menunjukkan terjadinya perubahan bentuk dan organisasi sel dalam jaringan hati dari normal ke patologis, yaitu perubahan sel hati menjadi nekrosis dan jaringan di sekitarnya mengalami desintegrasi atau disorganisasi. Kerusakan pada jaringan hati ditandai dengan terjadinya piknotik dan hiperkromatik dari nukleus, degenerasi lemak dan sitolisis dari sitoplasma.

2.2. Jelatang (Urtica dioica L.) Jelatang (Urtica dioica L.) merupakan spesies yang paling banyak dikenal dari 30-45 tanaman dalam genus Urtica. Tanaman yang umum disebut common nettle atau stinging nettle ini merupakan tanaman asli Eropa, Asia, bagian utara Afrika, dan Amerika Utara. Tanaman ini sering dihindari karena adanya bulu atau duri-duri halus pada daun dan batangnya. Jika menyentuh kulit, duri-duri halus ini akan mengeluarkan beberapa komponen kimia seperti acetylcholine, histamin, serotonin dan asam format yang kemungkinan menimbulkan rasa gatal. Berikut adalah klasifikasi Urtica dioica L. Kingdom : Plantae Subkingdom : Tracheobionta Superdivisi : Spermatophyta Divisi : Magnoliophyta Kelas : Magnoliopsida Subkelas : Hamamelididae Ordo : Urticales Famili : Urticaceae Genus : Urtica L. Spesies : Urtica dioica L. (European Medicines Agency 2007) Jelatang berkembang biak dengan menyebarkan rhizome dan stolon hingga membentuk rumpun. Tanaman perennial (tahunan) ini mampu tumbuh hingga mencapai tinggi 1-2 meter. Daun, batang dan kelopak tanaman jelatang dipenuhi duri atau bulu-bulu halus yang dapat menimbulkan rasa gatal dan menyengat jika menyentuh kulit. Daun tanaman jelatang berbentuk lancip dan bergerigi. Tanaman ini memiliki bunga yang berwarna putih kekuningan. Tanaman jelatang mampu menghasilkan 10.000 hingga 20.000 biji pada cuaca cerah. Penampakan tanaman jelatang dapat dilihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Jelatang (Urtica dioica L.) (American Herbal Pharmacopoeia 2009)

6

Secara tradisional, tanaman jelatang banyak digunakan sebagai obat dan bahan makanan. Daun jelatang memiliki rasa seperti bayam dan umum dimasak menjadi sup walaupun pengolahan menjadi minuman sejenis teh juga kerap ditemui. Perendaman dalam air atau pemasakan, secara tradisional diyakini dapat menghilangkan efek gatal atau menyengat dari tanaman ini sehingga aman dikonsumsi. Menurut Allardice (1993), jelatang merupakan pangan yang sangat bergizi yang mudah dicerna dan kaya akan mineral (terutama zat besi), vitamin C dan provitamin A. Daun jelatang mengandung sekitar 14.4 mg/100 g α-tocopherol, 0.23 mg/100 g riboflavin, 13 mg/100 g Fe, 0.95 mg/100 g Zn, 873 mg/100 g Ca, dan 532 mg/100 g K (Aksu dan Kaya 2004). Guil-Guerrero et al. (2003) juga mengidentifikasi adanya kandungan karotenoid pada daun jelatang, diantaranya lutein dan isomernya serta β-karoten dan isomernya dengan kandungan vitamin A untuk setiap 100 g daun jelatang muda dan tua masing-masing 16.2 dan 36,2 µg RE. Tanaman jelatang juga dikembangbiakkan secara komersial untuk ekstraksi klorofil yang digunakan sebagai pewarna makanan dan obat-obatan. Beberapa komponen aktif telah berhasil diisolasi dari beberapa bagian tanaman jelatang; steroid, phenylpropanoid, coumarin (Chaurasia dan Wichtl 1987), terpenoid (Ganser dan Spiteller 1995), polisakarida (Wagner et al. 1989) dan lektin (Galelli and Truffa-Bachi 1993) dari akar. Karakaya dan EL (1999) mendeteksi kandungan flavonoid pada jelatang dengan apigenin sebagai komponen flavonoid utama. Daun jelatang digunakan secara tradisional sebagai obat herbal untuk perawatan radang sendi (arthritis). Ekstrak dari tanaman ini juga sering digunakan sebagai obat alami untuk hipertensi dan diabetes (Ziyyat et al. 1997). Fragoso et al. (2008) menyebutkan penggunaan jelatang sebagai obat tradisional pada beberapa penyakit seperti penyakit kelamin dan saluran kencing yang ringan (nocturia, dysuria, penghambatan saluran ginjal, iritasi kantung kemih, dan infeksi), gangguan ginjal, alergi, diabetes, pendarahan internal (mencakup pendarahan uterine, epistaxis, dan melena), anemia, penyakit saluran pencernaan yang ringan (diare, disentri, dan keasaman lambung yang meningkat), sakit muskoluskeletal, osteoarthritis, dan alopecia. Beberapa temuan menunjukkan bahwa tanaman jelatang memberikan efek positif terhadap sistem imun tubuh. Komponen flavonoid glikosida utama yang diisolasi dari tanaman jelatang diketahui memiliki aktivitas immunomodulator dan anti-inflamasi (Akbay et al. 2003). Ekstrak biji tanaman jelatang memiliki efek hepatoprotective pada tikus yang menderita aflatoxicosis, yang kemungkinan bekerja dengan meningkatkan sistem pertahanan antioksidatif (Yener et al. 2009). Polisakarida yang diisolasi dari ekstrak air akar tanaman jelatang mampu menstimulasi baik sel T limfosit ataupun sistem pelengkapnya secara in vitro (Wagner et al. 1989). Gulcin et al. (2004) menunjukkan bahwa tanaman jelatang memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat.

2.3. Limfosit Limfosit merupakan bagian dari sel darah putih (leucocytes) yang tidak memiliki granula dalam sitoplasma (Kuby et al. 2007). Limfosit terdapat sebanyak 20-80% dari sel bernukleasi dalam darah dan lebih dari 99% dalam cairan limfatik (limfa). Limfosit juga terdapat dalam organ limfoid misalnya limfa, kelenjar limfa dan timus. Limfosit merupakan bagian dari sel darah putih yang bersifat agranulosit, berukuran kecil, berbentuk bulat dengan diameter 7-12 µm. Limfosit merupakan sel kunci dalam proses imun spesifik (meliputi respon imun seluler dan humoral) untuk mengenali antigen melalui reseptor antigen. Menurut Roitt & Delves (2001) limfosit mempunyai reseptor antigen yang beragam tetapi setiap limfosit hanya dapat mengenal satu antigen. Berdasarkan fungsinya, sel limfosit dibagi menjadi

7

tiga kelompok yaitu limfosit sel B, sel T, dan sel NK (Natural Killer). Sel B dan T memiliki reseptor pada permukaan yang mampu mengenali antigen tertentu dan termasuk dalam sistem pertahanan spesifik sedangkan sel NK tidak mempunyai reseptor untuk mengenal antigen termasuk sistem pertahanan non spesifik (Kuby et al. 2007). Pada manusia normal, sel limfosit B berjumlah 5-15% dan sel limfosit T berjumlah sekitar 65-80% dari jumlah limfosit dalam tubuh. Sel B berperran dalam respon imun humoral dan sel T berperan dalam sistem imun seluler, sedangkan sel Natural Killer berperan dalam respon imun non spesifik (Harris 1991). Sel limfosit B merupakan sel yang berasal dari sel stem dalam sumsum tulang belakang, tumbuh menjadi sel plasma yang menghasilkan antibodi dan sel memori. Reseptor sel B merupakan molekul antibodi terikat membran. Menurut Sheeler dan Bianchi (1982) limfosit B termasuk sistem pertahanan humoral yaitu tidak menggunakan sel dalam melawan antigen melainkan menghasilkan berbagai jenis antibodi. Sel B memori memiliki waktu hidup lebih lama dan terus mengekspresikan antiibodi terikat membrannya. Meskipun sel plasma hanya hidup beberapa hari, namun sel-sel ini dapat mensekreesikan antibodi dalam jumlah besar selama hidup. Diperkirakan bahwa satu sel plasma dapat mensekresikan lebih dari 2000 molekul antibodi per detik. Antibodi yang disekresi merupakan molekul efektor yang penting dalam imunitas humoral. Sel limfosit T merupakan sistem pertahanan seluler yang berasal dari sel stem (sumsum tulang belakang) dan bermigrasi ke organ timus untuk menjadi dewasa. Sel T dewasa meninggalkan kelenjar timus dan masuk ke dalam pembuluh getah bening dan berfungsi sebagai bagian dari sistem pengawasan kekebalan. Dalam proses pendewasaan, sel T membelah diri menjadi tiga bentuk yang memiliki peran masing-masing yaitu sel Thelper (Th), Tsuppresor (Ts) dan Tcytotoxic (Tc). Sel Thelper dapat dibedakan dari sel Tcytotoxic pada adanya glikoprotein yang berbeda pada permukaan membran mereka. Sel Thelper merupakan sel T yang berperan dalam stimulasi sistesis antibodi dan aktivasi makrofag dengan cara mengeluarkan molekul yang disebut sitokinin. Sel ini bekerja bersama dengan aktivitas antibodi sel B. Sel Tsuppresor berperan menekan aktivitas sel T yang lain. Sel ini mempunyai kemampuan menurunkan produksi antibodi. Sel Tcytotoxic memiliki kemampuan untuk menghancurkan sel alogenik dan sel sasaran yang terinfeksi patogen intraseluler (Baratawidjaja 2006). Adapun sel NK menurut Kresno (1996) termasuk sel nul karena tidak memiliki reseptor antigen pada permukaan tetapi memiliki reseptor untuk komplemen (C) dan fragmen molekul antibodi. Sel ini memiliki ukuran yang lebih besar daripada limfosit T dan B. Sel limfosit ini juga dikenal sebagai Large Granular Lymphocyte (LGL) karena merupakan sel dengan sejumlah besar sitoplasma dengan granula azurofilik (Kuby et al. 2007). Sel NK berfungsi sebagai sel efektor sitolitik yang dapat menyerang dan melisis sel target yaitu sel abnormal seperti sel neoplastik, sel terinfeksi virus /patogen seluler, dan sel normal yang tidak dewasa (Roitt dan Delves 2001).

2.4. Proliferasi Sel Limfosit Proliferasi merupakan fungsi fisiologis yaitu proses pembelahan secara mitosis dan diferensiasi sel sebagai respon terhadap antigen atau mitogen (Zakaria et al. 2003). Proliferasi limfosit dapat mengindikasikan aktivitas respon imun spesifik yang berkaitan dengan suatu sistem imun. Sel limfosit yang dapat berproliferasi adalah bagian dari sel limfosit yang memiliki peranan dalam sistem imun spesifik yaitu sel B dan sel T. Sel T akan menghasilkan sitokin yang menginduksi sistem imun yang lain, sedangkan sel B akan menghasilkan antibodi dari sel plasmanya untuk melawan benda asing (antigen) yang dapat merugikan kesehatan (Kuby et al. 2007). Adanya proliferasi akan memperbanyak jumlah sel B dan sel T sehingga kemampuan menghasilkan sitokin dan antibodi yang diperlukan untuk melawan antigen meningkat dan pertahanan tubuh (sistem imun) pun meningkat.

8

Respon proliferasi sel limfosit yang di uji pada sistem in vitro dapat digunakan untuk menggambarkan fungsi limfosit dan status imun individu. Proliferasi merupakan fungsi biologis mendasar pada sel limfosit, yaitu meliputi proses diferensiasi dan pembelahan sel. Aktivitas proliferasi limfosit merupakan salah satu parameter yang dapat digunakan untuk mengukur status imunitas karena proses proliferasi menunjukkan kemampuan dasar dari sistem imun (Roitt dan Delves 2001). Proliferasi sel limfosit dapat diinduksi oleh suatu senyawa yang disebut mitogen. Mitogen pada umumnya berasal dari tumbuhan (lektin) atau merupakan gula terikat seperti concanavalin A (con-A), pokeweed (PWM) dan fitohemaglutinin (PHA) serta senyawa non lektin seperti lipopolisakarida (LPS). Menurut Lao et al. (2001) aktivitas mitogen bersifat spesifik seperti con-A umumnya menginduksi proliferasi sel limfosit T, LPS menginduksi sel B, sedangkan PWM menginduksi sel limfosit T dan B. Kresno (1996) menyatakan bahwa respon terhadap mitogen dianggap menyerupai respon limfosit terhadap antigen, sehingga uji proliferasi limfosit dengan rangsangan mitogen banyak dipakai untuk menguji fungsi limfosit.

2.5. Uji Proliferasi Sel Limfosit Pengujian aktivitas proliferasi sel limfosit dapat dilakukan secara in vivo pada tikus percobaan dengan tujuh minggu masa perlakuan. Pengujian ini meliputi proses isolasi sel limfosit, perhitungan dan pengkulturan suspensi sel limfosit limfa. Sel limfosit yang umum digunakan adalah sel limfosit dari organ limfa. Organ limfa merupakan organ limfoid sekunder yang berfungsi menangkap dan mempresentasikan antigen dengan efektif. Selain itu, sel B dan sel T dalam organ limfa sudah dalam keadaan matang dan siap untuk berproliferasi dan berdiferensiasi. Organ limfa juga merupakan tempat untuk saringan darah atau pembersihan mikroba darah dan tempat respon imun utama terhadap antigen asal darah (Baratawidjaja 2006). Perhitungan jumlah sel hidup dilakukan dengan metode pewarnaan biru trifan. Biru trifan merupakan larutan buffer isotonik. Prinsip metode ini adalah penyerapan zat warna melalui membran sel. Biru trifan hanya dapat mewarnai sel jika sel itu rusak sehingga dapat digunakan untuk membedakan sel mati/rusak dengan sel hidup. Sel hidup memiliki bentuk bulat dan tidak berwarna/terang, sedangkan sel mati/rusak memiliki bentuk mengkerut dan berwarna biru (Shaper 1998).

2.5.1. Kultur Sel Kultur sel merupakan teknik yang biasa digunakan untuk mengembangbiakkan sel di luar tubuh (in vitro). Kultur sel dapat digunakan untuk mengevaluasi dampak yang ditimbulkan dari kondisi abnormal atau keberadaan senyawa berbahaya pada sel. Untuk melakukan kultur sel secara in vitro dibutuhkan kondisi pertumbuhan yang mirip dengan kondisi in vivo seperti pengaturan temperature, konsentrasi O2 dan CO2, pH, tekanan osmosis, dan kandungan nutrisi. Dalam bidang ilmu pangan, kultur sel seringkali digunakan untuk evaluasi fungsi dan keamanan bahan pangan secara in vitro (Freshney 1994). Doyle dan Griffiths (1997) menyatakan kultur sel limfosit secara in vitro merupakan suatu cara untuk mengembangbiakkan atau menumbuhkan sel limfosit di luar tubuh hewan atau manusia. Lingkungan dan nutrisi untuk pertumbuhan sel secara in vitro diusahakan menyerupai keadaan sel secara in vivo. Oleh karena itu diperlukan media pertumbuhan yang mampu mempertahankan PH dan menyediakan lingkungan yang baik serta menyediakan nutrisi untuk pertumbuhan sel seperti asamasam amino, vitamin, garam-garam anorganik, glukosa dan serum. Media pertumbuhan yang

9

digunakan harus disesuaikan dengan jenis sel yang akan dikultur. Media yang sering digunakan untuk kultur sel limfosit adalah Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 yang merupakan media sintetis yang kaya nutrisi. Serum yang biasa digunakan untuk kultur sel limfosit adalah Fetal Bovine Serum (FBS). Serum ini berfungsi sebagai protein pembawa hormon untuk menstimulasi pertumbuhan sel. Komponen serum sebagian besar adalah protein dan komponen lainnya seperti polipeptida, hormonhormon, mineral dan bahan makanan seperti asam amino, glukosa, lemak, asam keto, etoalamin, fosfoetanol amin dan hasil-hasil metabolit lainnya. Media kultur sel juga ditambahkan buffer dan antibiotik. Penambahan buffer bertujuan untuk menjaga keseimbangan nilai pH yaitu pH 7.4. Menurut Freshney (1994) pertumbuhan sel akan terhambat jika pH sedikit lebih rendah dari pH 7. Buffer yang umum digunakan adalah NaHCO3. Penambahan antibiotik bertujuan untuk mencegah kontaminasi media. Antibiotik yang berbeda memiliki spektrum antimikroba yang berbeda. Penisilin merupakan antimikroba untuk bakteri gram positif, streptomisin untuk bakteri gram positif dan negatif, sedangkan gentamisin untuk bakeri gram positif, gram negatif, dan mikroplasma (Freshney 1994). Menurut Cartwright dan Shah (1994) faktor utama dalam memilih jenis antibiotik untuk kultur sel adalah tidak bersifat toksik, memiliki spektrum antimikroba yang luas, ekonomis, dan memiliki kecenderungan minimum untuk menginduksi pembentukan mikroba yang kebal. Antibiotik yang sering digunakan adalah campuran penisilin dan streptomisin. Menurut Freshney (1994) penggunaan kultur sel lebih menguntungkan karena lingkungan tempat hidup sel dapat dikontrol dan diatur sehingga kondisi fisiologis dari kultur relatif konstan. Namun teknik ini juga memiliki beberapa kelemahan seperti rawan kontaminasi karena sel hewan tumbuh lebih lambat daripada kontaminan, membutuhkan lingkungan yang kompleks seperti di dalam tubuh, serta sel yang tumbuh mengalami perubahan sifat dan kehilangan spesifitas sel karena sel tidak lagi terintegrasi dalam jaringan.

2.5.2. Uji MTT Pengujian proliferasi sel dapat dilakukan menggunakan metode pewarnaan MTT (3-[4,5Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). MTT merupakan suatu garam tetrazolium yang direduksi pada sel metabolik hidup. Prinsip metode ini adalah pengukuran absorbansi senyawa formazan yang berwarna ungu yang merupakan hasil konversi MTT oleh aktivitas enzim suksinat dehidrogenase dari mitokondria sel hidup. Kandungan suksinat dehidrogenase relatif konstan diantara berbagai sel dengan tipe spesifik, sehingga jumlah formazan yang terbentuk proporsional terhadap jumlah sel limfosit yang hidup. Bagaimanapun, telah diketahui juga bahwa reliabilitas dan sensitivitas metode ini dipengaruhi oleh berbagai faktor diantaranya volume sel, antioksidan dan senyawa berwarna lainnya (Wang et al. 2006). Enzim suksinat dehidrogenase adalah salah satu enzim yang berperan aktif selama proses respirasi seluler secara aerobik. Enzim suksinat dehidrogenase merupakan flavoprotein yang mengandung protein dengan ikatan Fe (besi) dan S (belerang). Enzim ini terikat pada bagian membrane mitokondria yang berfungsi sebagai reduktor selama tahapan siklus Krebs dan transport electron. Pada siklus Krebs, enzim ini menerima hidrogen dari suksinat dan bertugas menghidrogenasi suksinat menjadi fumarat serta menghasilkan FADH2 (Lehninger 1982). Freimoser et al. (1999) menyatakan bahwa MTT assay merupakan metode uji viabilitas sel kuantitatif yang lebih praktis, cepat dan efisien dengan hasil yang cukup akurat dibandingkan dengan menggunakan metode pewarnaan biru tripan yang dilakukan secara manual pada pengujian sel fungi. Reduksi garam tetrazolium merupakan cara yang dapat dipercaya untuk mendeterminasi proliferasi sel

10

limfosit. Garam tetrazolium MTT yang berwarna kuning berkurang sebagai akibat proses metabolism sel, terutama karena aktivitas kerja enzim suksinat dehidrogenase. Kristal formazan tidak larut air berwarna biru tua yang terbentuk dapat dilarutkan dengan pelarut organik seperti isopropanol, etil asetat, dietil eter atau n-butanol dan kemudian diukur absorbansinya dengan spectrophotometer microplate reader.

11

III. BAHAN DAN METODE 3.1. Bahan dan Alat 3.1.1. Bahan Bahan dasar yang digunakan adalah daun jelatang (Urtica dioica L.) kering yang disuplai oleh Fytagoras BV Plant Science, Belanda. Hewan percobaan yaitu tikus jenis Sprague Dawley diperoleh dari SEAFAST Center, IPB. Bahan untuk pemeliharaan tikus, meliputi air minum dalam kemasan dan ransum yang mengikuti standar American Institute of Nutrition (AIN) 1976. Komposisi ransum standar AIN 1976 tertera pada Tabel 2. Tabel 2. Komposisi ransum standar AIN 1976 Jumlah (%) Bahan Penyusun Proteina Lemakb Selulosac Campuran vitamin Campuran mineral Patid

20 5 5 1 3,5 Untuk membuat 100%

a

Sebagai sumber protein digunakan tepung kasein sebagai sumber lemak digunakan minyak jagung c sebagai sumber selulosa digunakan carboxymethylcellulose d sebagai sumber pati digunakan tepung maizena b

Ransum standar AIN 1976 menggunakan campuran vitamin dan mineral. Komposisi campuran vitamin dapat dilihat pada Tabel 3 sedangkan komposisi campuran mineralnya pada Tabel 4. Tabel 3. Komposisi campuran vitamin Vitamin Vitamin A Vitamin B1 Vitamin B2 Vitamin B6 Vitamin B12 Vitamin C Vitamin D3 Vitamin E Nikotinamida Kalsium pantetonat Sumber: Puspawati (2009)

Jumlah 1000 1,4 1,6 2 3 60 100 5 9 5

Unit IU mg mg mg mg mg IU mg mg mg

Tabel 4. Komposisi campuran mineral Nama senyawa NaCl (39,3% Na, 60,7% Cl) KI (40,7% K, 59,3% I) KH2PO4 (22,8% P, 28,7% K ) MgSO4. 7H2O CaCO3 (40% Ca) FeSO4. 7H2O (20,1% Fe) MnSO4. 7H2O ZnSO4. 7H2O CuSO4. 5H2O CoCl2. 6H2O Sumber: Puspawati (2009)

Jumlah (g/kg campuran) 74,0 0,790 389,000 57,300 381,400 27,000 4,010 0,548 0,477 0,023

Bahan untuk euthanasia tikus, yaitu eter. Bahan-bahan kimia yang digunakan pada pengujian proliferasi sel limfosit meliputi bubuk Rosewell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 sebagai medium pertumbuhan sel limfosit, antibiotik penicilin-streptomisin, mitogen lipopolisakarida (LPS) Salmonella typhii, larutan rhodamin B (0.04 mg/ml, 0.08 mg/ml, dan 0.12 mg/ml), larutan karmoisin (0.16 mg/ml, 0.32 mg/ml, 0.48 mg/ml), NH4Cl, tryphan blue, NaHCO3, aquabides, phosfat buffer saline (PBS), fetal bovine serum (FBS), MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide), HCl, isopropanol.

3.1.2. Alat Peralatan yang digunakan selama perlakuan dan penanganan tikus percobaan antara lain kandang plastik, botol minum, wadah ransum, timbangan, dan peralatan cekok. Peralatan untuk pembuatan larutan cekok meliputi blender, kain kasa, botol, gelas piala dan tabung reaksi. Peralatan untuk anastesi tikus serta pengambilan organ, yaitu syringe, tabung sentrifuse, gunting, dan pinset. Adapun peralatan yang digunakan untuk pengujian proliferasi sel limfosit antara lain sentrifuse, lemari steril, inkubator, mikroskop, mikroskop inversi, hemasitometer, membran steril 0.2 µm, tabung sentrifuse steril, botol steril, cawan petri steril, tabung reaksi steril, multiplate microwell 96, pipet pasteur, mikropipet, mikrotip, ELISA Reader.

3.2. Metode Penelitian 3.2.1. Pembuatan ekstrak daun jelatang (mengacu Afrah 2010) Daun jelatang kering dihaluskan dengan blender kering untuk memperoleh bubuk daun jelatang. Untuk pembuatan ekstrak dengan dosis 0.1 g/kg BB/hari, tiap 1 g bubuk daun ditambahkan 50 ml aquades kemudian diblender. Sementara untuk dosis 1 g/kg BB/hari, tiap 1 g bubuk daun ditambahkan 5 ml aquades dan diblender. Selanjutnya, campuran tersebut disaring dengan kain kasa untuk mendapatkan ekstrak daun jelatang.

3.2.2. Pemeliharaan tikus (mengacu Afrah 2010) Sebanyak 30 tikus Sprague Dawley dibagi menjadi tiga kelompok. Tiap kelompok terdiri dari 10 ekor tikus yang berumur ±2 bulan dengan berat badan berkisar antara 180-195 g. Selisih berat ratarata masing-masing kelompok tidak lebih dari 5 g. Kelompok 1 merupakan kontrol negatif; kelompok

13

2 diberikan ekstrak daun jelatang sebanyak 0,1 g/kg BB/hari; sedangkan kelompok 3 diberikan ekstrak daun jelatang sebanyak 1 g/kg BB/hari. Ekstrak daun jelatang diberikan melalui proses pencekokan. Tikus kelompok kontrol juga dicekok, namun dengan air minum dalam kemasan (AMDK), sehingga mengalami stress yang serupa dengan tikus yang dicekok ekstrak daun jelatang. Ransum yang digunakan sesuai dengan standar AIN 1976 dan diberikan secara ad libitum. Air juga diberikan dengan cara yang sama. Tikus diadaptasi selama 3 hari. Setelah masa adaptasi selesai, tiap harinya tikus dicekok sesuai perlakuan dan dosis masing-masing. Perlakuan tersebut berlangsung hingga 90 hari. Untuk memantau pertumbuhan tikus, selama masa percobaan dilakukan penimbangan berat badan dua hari sekali.

3.2.3. Pengujian Proliferasi Sel Limfosit 3.2.3.1. Persiapan pereaksi dan media kultur (Puspawati 2009) Untuk pembuatan larutan media RPMI sebagai medium kultur sel limfosit, RPMI bubuk dalam sachet (16.2 g) dilarutkan dengan air bebas pirogen (aquabides) sehingga diperoleh 1 L larutan medium RPMI 1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1% penisilin-streptomisin. Untuk pembuatan larutan NH4Cl, sebanyak 0.85 mg bubuk NH4Cl dilarutkan dalam 100 ml aquabides dan diaduk hingga homogen. Pembuatan phosphate buffer saline (PBS) dilakukan dengan melarutkan satu tablet PBS dalam 200 ml aquabidest. Indikator tryphane blue 0.20% dibuat dengan melarutkan bubuk tryphane blue sebanyak 0.02 mg dalam 10 ml PBS dan diaduk hingga homogen. Persiapan fetal bovine serum (FBS) dilakukan dengan memanaskan 15 ml FBS pada suhu 0 56 C selama 45 menit. Setelah dingin, larutan disterilisasi dingin dengan membran filter steril 0.20 µm. Pembuatan larutan LPS, sebanyak 0.417 mg bubuk LPS dimasukkan ke dalam labu takar 10 ml dan ditambahkan PBS sampai tanda tera. Pembuatan MTT 0.5% dilakukan dengan melarutkan 0.25 mg bubuk MTT dalam 50 ml PBS dan diaduk hingga homogen. Untuk pembuatan HCl-isopropanol, HCl 37% (pekat) dipipet sebanyak 33.1 µl dan ditambahkan 9.669 ml isopropanol dan diaduk hingga homogen sehingga didapat larutan HCl-isopropanol 0.04 N. Larutan ini harus dibuat segar tiap akan digunakan. Larutan-larutan (pereaksi dan media) yang telah dibuat kemudian disterilisasi dingin dengan membran filter steril 0.20 µm.

3.2.3.2. Pengambilan organ Pengambilan organ tikus dilakukan dalam keadaan steril. Tikus dimasukkan dalam wadah kaca bertutup yang sebelumnya telah diisi dengan kapas dan eter. Saat tikus terlihat tidak mampu lagi bergerak dan matanya mulai tertutup, tikus diangkat, disemprot dengan alkohol dan diletakkan di alas bedah. Kulit perut digunting (mengikuti pola seperti huruf V) hingga mendekati rongga dada. Limfa tikus diambil menggunakan gunting dan pinset steril dan segera dicuci dengan larutan PBS steril di dalam botol steril.

3.2.3.3. Isolasi sel limfosit limfa (Prangdimurti 1999) Limfa tikus dalam larutan PBS selanjutnya dipindahkan ke cawan petri steril yang berisi 5 ml RPMI-1640. Limfa tersebut digerus hingga homogen dan selanjutnya dimasukkan dengan pipet pasteur ke dalam tabung sentrifuse 15 ml. Suspensi limfa disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet dijentik-jentikkan dan ditambah 2 ml NH4Cl 0.85 % steril. Larutan didiamkan selama tepat 2 menit kemudian ditambahkan 3 ml RPMI-1640 dan disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Supernatan yang berisi sel darah merah yang

14

telah lisis dibuang. Pelet dijentik-jentikkan dan ditambahkan 5 ml RPMI kemudian disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 5 menit. Endapan disuspensikan dengan 3 ml RPMI.

3.2.3.4.

Penghitungan sel limfosit limfa

Sebanyak 50 µl suspensi sel limfosit ditempatkan dalam sumur microplate dan ditambahkan dengan 50 µl tryphan blue (1:1). Sebanyak 50 µl campuran kemudian ditempatkan pada hemasitometer. Penghitungan dilakukan di bawah mikroskop dengan perbesaran 400 kali. Sel yang hidup tampak terang, jernih dan berbentuk bulat sedangkan sel yang mati akan berwarna biru dan mengkerut. Berdasarkan hasil perhitungan pada area 2 kotak besar hemasitometer (@ 16 kotak kecil) dapat ditentukan jumlah sel yang hidup per mililiter suspensi dengan rumus : V N = x F x 10 sel/ml 2 Keterangan : N = jumlah sel/ml V/2 = rata-rata jumlah sel terhitung dari dua bidang pandang F = faktor pengenceran (2) 4 10 = jumlah sel per luas bidang pandang (1.0 mm x 1.0 mm x 0.1 mm) Suspensi sel limfosit kemudian ditepatkan 2x106 sel/ml melalui pengenceran dengan RPMI1640.

3.2.3.5.

Pengujian proliferasi sel limfosit limfa (Puspaningrum 2003; Keller et al. 2005)

Suspensi sel dikultur dalam microplate 96 sumur dengan volume total masing-masing sumur adalah 100 µl. Bahan-bahan yang ditambahkan pada setiap sumur disesuaikan dengan perlakuan yang akan diberikan seperti ditunjukkan Tabel 5. Tabel 5. Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel Perlakuan

RPMI (µl)

Suspensi sel (µl)

Mitogen (µl)

Senyawa toksik (µl)

FBS (µl)

Kontrol

30

60

-

-

10

-

60

30

-

10

-

60

-

30

10

Perlakuan mitogen (LPS) Perlakuan senyawa toksik*

*senyawa toksik yang digunakan adalah rhodamin B dan karmoisin Konsentrasi LPS yang ditambahkan ke dalam kultur adalah 41,7 µg/ml sehingga konsentrasi LPS dalam kultur adalah 12.5 µg/ml kultur. Konsentrasi senyawa toksik karmoisin yang ditambahkan ke dalam kultur adalah 160 µg/ml, 320 µg/ml dan 480 µg/ml sehingga konsentrasi senyawa toksik karmoisin dalam kultur masing-masing adalah 48 µg/ml, 96 µg/ml dan 144 µg/ml kultur. Konsentrasi senyawa toksik rhodamin B yang ditambahkan ke dalam kultur adalah 40 µg/ml, 80 µg/ml dan 120 µg/ml sehingga konsentrasi senyawa toksik rhodamin B dalam kultur masing-masing adalah 12 µg/ml, 24 µg/ml dan 36 µg/ml kultur.

15

Kultur sel diinkubasi pada suhu 370C dengan atmosfer 5% CO2, 95% udara dan RH 96% selama 72 jam. Empat jam sebelum masa inkubasi berakhir, ditambahkan 10 µl larutan MTT 0.5% ke dalam masing-masing sumur. Dan setelah masa inkubasi berakhir, ke dalam tiap sumur ditambahkan 80 µl HCl-isopropanol 0.04 N. Kemudian absorbansi masing-masing sumur diukur dengan menggunakan microplate reader (ELISA reader) pada panjang gelombang 570 nm. Nilai Optical Density (OD) hasil pembacaan ELISA reader bersifat proporsional terhadap jumlah sel hidup. Indeks stimulasi (IS) sebagai dasar penentuan aktivitas proliferasi dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut.

IS =

OD sel perlakuan (dengan mitogen atau senyawa toksik) OD sel kontrol (tanpa mitogen atau senyawa toksik)

Nilai rata-rata indeks stimulasi dengan perlakuan mitogen atau senyawa toksik kemudian dibandingkan dengan nilai rata-rata indeks stimulasi spontan dan secara statistic dianalisis menggunakan uji T berpasangan (paired-sample T-test) pada taraf kepercayaan 95%. Besar peningkatan atau penurunan aktivitas proliferasi limfosit akibat penambahan mitogen atau senyawa toksik ditentukan dengan perhitungan % aktivitas sebagai berikut.

% Aktivitas=

(IS perlakuan (dengan mitogen atau senyawa toksik)-IS spontan) x100% IS spontan

16

IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Pemeliharaan dan Pertumbuhan Tikus Penelitian ini menggunakan tikus putih (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley berumur sekitar delapan minggu sebagai hewan uji. Menurut Puspawati (2009) tikus galur ini merupakan tikus yang mudah didapat dan sering digunakan dalam pengujian imunitas. Tikus percobaan dipelihara dan diberikan perlakuan pencekokan selama 90 hari ditambah 3 hari masa adaptasi. Larutan cekok yang diberikan adalah ekstrak daun jelatang dengan menggunakan air sebagai pelarut. Berdasarkan dosis larutan cekok yang diberikan, tikus percobaan dibagi menjadi tiga kelompok yaitu kelompok dosis 0,1 g/kg BB/hari, kelompok dosis 1 g/kg BB/ hari, dan kelompok kontrol yang diberikan air minum. Hal ini dilakukan agar tikus kontrol juga menerima stress perlakuan yang sama dengan tikus kelompok lainnya. Penentuan dosis 0.1 g/kg BB/hari didasarkan pada hasil konversi dosis pemberian pada manusia (Lampiran 1). Volume larutan cekok yang diberikan berbeda-beda karena masing-masing tikus memiliki berat yang tidak sama. Contoh perhitungan volume larutan cekok dapat dilihat pada Lampiran 2. Tikus kontrol dicekok dengan air minum sebanyak 1 ml. Ekstrak daun jelatang yang diberikan merupakan ekstrak kasar yang masih berupa suspensi karena adanya partikel-partikel yang tidak terlarut. Penggunaan ekstrak kasar sebagai larutan cekok diharapkan dapat memberikan hasil yang mendekati hasil pengujian jika daun jelatang diberikan secara langsung bersama pakan. Pemberian daun jelatang langsung bersama pakan sulit dilakukan mengingat konsumsi pakan dari masing-masing tikus berbeda-beda dan kemungkinan adanya karakteristik daun jelatang yang tidak disukai oleh tikus. Pemberian substansi uji tertentu dengan cara tertentu pada hewan percobaan dapat mempengaruhi pola makan, tingkah laku dan pertumbuhan hewan tersebut. Selama periode pemeliharaan tikus percobaan ditemukan dua kasus kematian (mortalitas). Kasus pertama ditemukan pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari setelah 42 hari masa perlakuan dan kasus kedua ditemukan pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari setelah 73 hari masa perlakuan. Adanya gejala morbiditas (sakit/menderita) terlihat pada kedua tikus dalam waktu kurang dari 24 jam sebelum kematian. Selain itu, ditemukan juga banyak darah di sekitar hidung dan mata kedua tikus yang telah mati. Kedua kasus kematian ini diperkirakan terjadi karena penyimpangan irama jantung (arrythmia). Menurut Peterson dan Talcott (2006), tanaman Urtica spp dapat memicu gejala-gejala klinis seperti salivasi, muntah, arrythmia, dyspnea, kelemahan, dan collapse. Mekanisme terjadinya arrhytmia diduga terkait dengan sifat diuretik dari daun Urtica dioica L. Beberapa laporan menunjukkan bahwa diuretik, terutama yang tidak memiliki aktivitas menghemat kehilangan kalium dari tubuh (non potassium sparing diuretic), dapat meningkatkan risiko kematian arrhytmic (kematian akibat penyimpangan denyut jantung) pada pasien-pasien hipertensif, yang diduga terjadi karena diuretik mengubah keseimbangan elektrolit (Cooper et al. 1999). Ditemukannya sedikit darah di sekitar mulut dan hidung tikus pada saat pemeriksaan diasumsikan akibat tikus menggosok-gosokkan hidung ke tutup kandang yang terbuat dari logam. Tingkah laku tersebut diperkirakan karena pemberian jelatang dapat memicu gatal, seperti yang disebutkan oleh Fragoso et al. (2008). Mortalitas hanya terjadi pada satu dari 10 ekor tikus pada kelompok dosis 0.1 g/kg BB/hari dan satu dari sepuluh ekor tikus pada kelompok dosis 1 g/kg BB/hari. Mengingat hasil pemeriksaan fisik menunjukkan lebih banyak tikus yang tidak menunjukkan gejala morbiditas, maka diperkirakan tikus yang mati selama pengujian lebih sensitif dibandingkan tikus-tikus lainnya.

Penimbangan berat badan untuk memantau pertumbuhan tikus percobaan dilakukan dua hari sekali. Data berat badan tikus selama masa perlakuan tertera pada Lampiran 3. Tabel 6 menunjukkan data berat badan awal, berat badan akhir, kenaikan berat badan, serta rata-rata konsumsi pakan per hari setiap kelompok tikus. Setelah 90 hari masa percobaan, semua kelompok tikus mengalami kenaikan berat badan. Kenaikan berat badan tertinggi terjadi pada kelompok kontrol sebesar 136.60±40.20 g. Hal ini sesuai dengan rata-rata konsumsi pakan/hari kelompok kontrol yang lebih tinggi dibanding kelompok lain. Pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 0.1 g/kg BB/hari dan 1 g/kg BB/hari mempengaruhi konsumsi pakan/hari kelompok tikus tersebut menjadi lebih rendah. Walaupun demikian, hal tersebut tidak memberikan pengaruh negatif pada pertumbuhan tikus secara keseluruhan. Hasil analisis uji sidik ragam terhadap berat badan awal tikus tertera pada Lampiran 5; berat akhir tikus pada Lampiran 6 dan kenaikan berat badan pada Lampiran 7. Berat badan kelompok tikus yang mendapat ekstrak daun jelatang, baik dosis 0.1 g/kg BB/hari maupun 1 g/kg BB/hari, tidak berbeda nyata dengan kontrol pada taraf kepercayaan 95%. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa kenaikan berat badan tidak berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95% pada masing-masing kelompok tikus. Grafik pertumbuhan masing-masing kelompok tikus juga cenderung meningkat (Gambar 4). Hal ini mengindikasikan bahwa selama masa perlakuan, semua kelompok tikus berada dalam keadaan pertumbuhan yang baik. Menurut National Research Council (1978), pertumbuhan dan perkembangan yang baik dari mahkluk hidup ditandai dengan terjadinya kenaikan berat badan yang mengikuti bentuk kurva pertumbuhan yang sigmoid. Dalam kondisi diet seimbang (protein, energi, serta komponen-komponen lainnya), kenaikan berat badan akan terjadi sesuai dengan pola pertumbuhan yang seharusnya, dan akan menjadi lebih buruk bila hewan mendapatkan ransum yang tidak bergizi seimbang. Tabel 6. Rata-rata dan standar deviasi berat badan, kenaikan berat badan, dan konsumsi pakan pada setiap kelompok tikus Berat badan (g) Perlakuan

Awal

Kontrol Dosis 0.1 g/kg BB/hari Dosis 1 g/kg BB/hari

Akhir a

194.20±22.78 183.60±14.28a 188.90±14.19a

Kenaikan a

330.80±43.79 287.33±47.02a 293.89±70.20a

136.60±40.20a 104.11±39.40a 104.44±61.16a

Konsumsi pakan/hari (g) 18.54±1.77a 16.80±1.84b 17.24±1.94b

Notasi huruf yang sama dalam kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Begitu pula sebaliknya (uji lanjut Tukey)

Berat badan (g)

400,00 300,00 kontrol

200,00

dosis 0,1 g/kg BB/hari

100,00

dosis 1 g/kg BB/hari

0,00 0

Gambar 4.

50 Hari ke-

100

Pertumbuhan tikus kontrol dan tikus yang diberi ekstrak daun jelatang dosis 0.1 g/kg BB/hari dan dosis 1 g/kg BB/hari

18

4.2. Proliferasi Sel Limfosit Limfa Tikus Proliferasi limfosit merupakan suatu proses yang dapat mengindikasikan aktivitas respon imun spesifik yang berkaitan dengan suatu system imun. Menurut Kuby et al. (2007), sel limfosit yang dapat berproliferasi adalah sel B dan sel T yang merupakan bagian dari sistem imun spesifik. Sel B bertambah banyak dan berdiferensiasi menjadi sel plasma (efektor) dan sel memori pada awal proses proliferasi, sedangkan sel T berdiferensiasi menjadi sel Thelper (Th), Tsuppresor (Ts) dan Tcytotoxic (Tc). Sel B akan menghasilkan antibodi dari sel plasmanya unruk melawan benda asing (antigen) yang dapat merugikan bagi kesehatan. Sel T akan menghasilkan sitokinin yang menginduksi sistem imun lain. Pengujian aktivitas proliferasi sel limfosit limfa tikus setelah 90 hari masa perlakuan dilakukan melalui proses isolasi sel limfosit limfa, perhitungan dan pengkulturan suspensi sel limfosit limfa, serta penentuan indeks stimulasi sel limfosit limfa berdasarkan hasil pengujian dengan metode MTT. Sel limfosit yang diuji berasal dari organ limfa. Organ ini merupakan organ limfoid sekunder yang dirancang untuk menginisiasi respon imun terhadap antigen asal darah. Janeway et al. (2001) menyebutkan bahwa limfa merupakan organ yang mengumpulkan antigen dari darah serta mengumpulkan dan membuang sel darah merah (eritrosit) yang telah tua. Organ limfa mengandung kompartemen-kompartemen khusus yang merupakan tempat sel-sel imun berkumpul dan bekerja, dan berfungsi sebagai tempat pertemuan (konfrontasi) sistem imun dengan antigen (National Institute of Health 2003). Sebelum dikultur, jumlah sel dalam suspensi sel limfosit dihitung menggunakan metode biru trifan. Hal ini dilakukan untuk mengetahui konsentrasi sel hidup dalam suspensi sel limfosit. Sel hidup memiliki membran sel yang masih utuh sehingga pewarna biru trifan yang diberikan tidak akan masuk ke dalam sel. Sel hidup tampak berbentuk bulat utuh dan bening pada pengamatan dengan mikroskop perbesaran 400x. Adapun sel yang telah mati tampak mengkerut dan berwarna kebiruan karena membran selnya telah rusak dan pewarna biru trifan dapat masuk ke dalam sel. Jumlah sel hidup dalam suspensi sel yang akan dikultur minimal sebesar 95% (Tejasari 2000). Pengkulturan sel limfosit limfa dilakukan secara in vitro dengan media RPMI 1640 yang mengandung nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan sel. Dalam media kultur juga ditambahkan fetal bovine serum (FBS) sebesar 10%. Penambahan serum ini bertujuan untuk memberikan hormonhormon penting pertumbuhan, protein, lipid, dan mineral-mineral yang penting untuk prtumbuhan, serta sebagai faktor penempel sel pada matrik tempat sel tumbuh (Freshney 1994). Antibiotik juga ditambahkan untuk mengatasi kontaminasi mikroorganisme. Selain itu ditambahkan juga NaHCO3 yang berfungsi sebagai buffer untuk mempertahankan pH yang diperlukan dalam pengkulturan sel limfosit (Freshney 1994). Pada pengkulturan sel limfosit limfa ini juga ditambahkan senyawa mitogen dan senyawa yang bersifat toksik bagi tubuh yaitu rhodamin B dan karmoisin. Hal ini dilakukan untuk mengetahui respon proliferasi sel limfosit limfa terhadap senyawa-senyawa tersebut. Mitogen yang digunakan adalah lipopolisakarida (LPS) dari Salmonella thyphii. Penambahan LPS bertujuan memacu proliferasi karena LPS merupakan semacam antigen yang menginduksi terjadinya proliferasi. LPS umum digunakan untuk menstimulasi sel dan hal tersebut terjadi secara alami pada kasus infeksi. Menurut Watter et al. (2002), LPS adalah komponen membran luar bakteri gram negatif yang dapat meningkatkan aktivitas sel imun. Adapun karmoisin dan rhodamin B merupakan pewarna buatan (sintetis) yang dapat bersifat toksik bagi tubuh. Amin et al. (2010) menyimpulkan bahwa karmoisin dapat memberikan pengaruh negatif dan mengubah beberapa penanda biokimia pada organ-organ penting seperti hati dan ginjal, baik pada dosis tinggi ataupun rendah. Dan menurut EFSA (2005), rhodamin B berpotensi memiliki sifat karsinogenik dan genotoksik.

19

Dalam proses pengkulturan sel sangat dibutuhkan kondisi yang steril untuk menghindari kontaminasi mikroorganisme. Tahapan-tahapan dalam pengkulturan sel limfosit dikerjakan secara aseptis dan sebagian besar dilakukan di dalam lemari steril. Inkubasi kultur sel limfosit dilakukan selama 72 jam dalam inkubator CO2 dengan pengaturan suhu 370C, kadar CO2 5%, udara 95%, dan RH 97%. Kondisi ini diupayakan untuk mendekati kondisi yang sama dengan kondisi tubuh. Menurut Freshney (1994), untuk melakukan kultur sel secara in vitro dibutuhkan kondisi pertumbuhan yang mirip dengan kondisi in vivo seperti pengaturan temperatur, konsentrasi O2 dan CO2, pH, tekanan osmosis, dan kandungan nutrisi. Di akhir masa inkubasi dilakukan pengujian proliferasi sel limfosit dengan metode MTT (3(4.5- dimethilthyazol-2-yl)-2.5 diphenyl-tetrazolium bromide). Empat jam sebelum berakhirnya masa inkubasi, senyawa MTT yang berwarna kuning ditambahkan ke dalam kultur sel. Senyawa MTT akan bereaksi dengan enzim suksinat dehidrogenase yang ada dalam mitokondria sel hidup. Enzim ini dapat mengubah senyawa tetrazolium dari MTT untuk menghasilkan kristal formazan yang berwarna biru. Nilai absorbansi dari warna biru kristal formazan ini kemudian dijadikan indikator jumlah sel limfosit hidup. Penambahan HCl-isopropanol dilakukan pada akhir masa inkubasi atau sebelum dilakukan pengukuran nilai absorbansi. Hal ini dilakukan untuk menghentikan aktivitas proliferasi sel limfosit sehingga stabil selama pengukuran nilai absorbansi dan untuk melarutkan kristal formazan yang terbentuk (Puspawati 2009). Pengukuran nilai absorbansi kultur sel limfosit dilakukan dengan ELISA reader. Kesalahan dapat terjadi pada proses pengukuran ini karena adanya kontaminasi bakteri maupun khamir. Mitokondria sel bakteri dan khamir juga mengandung enzim suksinat dehidrogenase yang dapat bereaksi dengan garam tetrazolium. Oleh karena itu, pelaksanaan analisis yang aseptis sangat diperlukan untuk menghindari adanya kontaminasi. Aktivitas proliferasi sel limfosit limfa tikus ditentukan melalui perhitungan nilai indeks stimulasi (IS). Nilai ini merupakan perbandingan antara rata-rata absorbansi kultur yang diberi perlakuan (konsumsi daun jelatang, penambahan mitogen atau senyawa toksik) dengan rata-rata absorbansi kultur yang tidak diberi perlakuan (kontrol). Semakin tinggi nilai IS menandakan proliferasi limfosit semakin banyak atau aktivitas proliferasi limfosit semakin tinggi (Cambier 2000). Data rata-rata absorbansi kultur sel pada masing-masing perlakuan tertera pada Lampiran 8. Adapun rata-rata indeks stimulasi pada masing-masing perlakuan tertera pada Tabel 7. Tabel 7. Rata-rata indeks stimulasi pada setiap perlakuan Kelompok Tikus

Perlakuan Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari

Dosis 1 g/kg BB/hari

Spontan LPS

1,000 1,140

1,243 0,988

0,948 1,020

Kar 48 µg/ml Kar 96 µg/ml

0,511 0,555

0,893 1,005

1,183 1,067

Kar 144 µg/ml

0,583

1,020

1,124

Rho 12 µg/ml Rho 24 µg/ml Rho 36 µg/ml

0,481 0,504 0,522

0,936 0,953 0,950

0,915 0,950 1,011

20

4.2.1. Proliferasi Limfosit Spontan Gambar 5 menunjukkan rata-rata indeks stimulasi sel limfosit limfa tikus tanpa penambahan mitogen atau senyawa toksik (proliferasi limfosit spontan). Nilai indeks stimulasi ini merupakan hasil bagi antara nilai absorbansi kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari atau dosis 1 g/kg BB/hari dengan nilai absorbansi kelompok tikus kontrol. Dengan demikian, kelompok tikus kontrol memiliki nilai indeks stimulasi 1. Terlihat bahwa kelompok tikus dengan pemberian daun jelatang dosis 0.1 g/kg BB/hari memiliki nilai IS yang paling tinggi yaitu 1.243. Adapun kelompok tikus dengan pemberian daun jelatang dosis 1 g/kg BB/hari memiliki nilai IS yang lebih rendah dari kontrol yaitu sebesar 0.948. Hasil analisis statistik dengan uji sidik ragam (Lampiran 9) menunjukkan bahwa rata-rata nilai indeks stimulasi kelompok tikus kontrol, dosis 0.1 g/kg BB/hari, dan dosis 1 g/kg BB/hari tidak berbeda secara signifikan pada tingkat kepercayaan 95%. 1,400

1,243

1,200 Indeks Stimulasi

1,000

0,948

1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari Dosis 1 g/kg BB/hari Kelompok Tikus

Gambar 5. Rata-rata indeks stimulasi proliferasi spontan pada setiap kelompok tikus Hasil penelitian menunjukkan bahwa indeks stimulasi limfosit kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari memiliki nilai yang paling tinggi. Hal ini dapat terjadi mengingat adanya kandungan komponen-komponen bioaktif pada daun jelatang seperti komponen fenolik yang memiliki sifat antioksidan. Gulcin et al. (2004) menyatakan bahwa komponen fenolik pada ekstrak air dari tanaman jelatang bertanggung jawab terhadap aktivitas antioksidan yang kuat dan mendeteksi kandungan fenol sebesar 25,3 µg pyrocatechol equivalent pada 1 mg ekstrak. Lebih jauh lagi, Gulcin et al. (2004) menunjukkan aktivitas antioksidan dari ekstrak air daun jelatang sebesar 39, 66, dan 98% inhibisi peroksidasi dalam emulsi asam linoleat masing-masing pada konsentrasi 50, 100, dan 250 µg. Adanya sifat antioksidan dari komponen fenolik dapat melindungi sel limfosit dari stress oksidatif yang dapat merusak sel limfosit sehingga proliferasi terhambat. Penelitian tentang sifat antioksidan senyawa fenolik yang menunjukkan peranan sebagai antiradikal atau antioksidan secara in vivo pada manusia juga telah dilakukan oleh Erniwati (2007) yang menyebutkan komponen bioaktif seperti polifenol pada bubuk kakao bebas lemak dapat meningkatkan sifat antiradikal bebas pada sel limfosit manusia. Puspawati (2009) yang melakukan kajian aktivitas proliferasi limfosit dan kapasitas antioksidan sorgum dan jewawut pada tikus Sprague Dawley menyebutkan bahwa terjadinya aktivitas antioksidan senyawa fenolik sorgum dan jewawut diduga karena senyawa fenolik tersebut setelah mengalami metabolisme dalam tubuh dapat diserap oleh jaringan seperti organ limfa. Mekanisme

21

aktivitas antioksidan dari senyawa fenolik ini adalah kemampuan senyawa fenolik mendonorkan elektron atau mekanisme menangkap (scavenger) radikal bebas atau ROS menjadi produk yang non reaktif. Adapun menurut Damiani et al. (2008), penghambatan transfer hidrogen merupakan mekanisme yang umum terjadi pada antioksidan fenolik. Sebagian besar antioksidan sintetis ataupun alami merupakan senyawa fenolik (ArOH) yang paling sedikit memiliki satu grup hidroksil yang terikat pada cincin benzene. Efek antioksidan dari senyawa fenolik ini terjadi karena donasi atom hidrogen fenolik pada rantai yang mengandung radikal peroksil (1) merupakan reaksi yang terjadi lebih cepat dibandingkan penyerangan radikal peroksil terhadap substrat organik (2) yang merupakan tahap propagasi dari proses peroksidatif.

Selain itu, dugaan adanya komponen fenolik dari ekstrak daun jelatang yang berikatan dengan reseptor pada permukaan sel limfosit yang tersusun atas protein juga menjadi alasan tingginya proliferasi limfosit pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari. Menurut Tejasari (2007) komponen fenolik dapat berikatan dengan reseptor sel limfosit karena komponen fenolik dapat berikatan dengan protein melalui ikatan hidrogen. Adanya ikatan ini secara tidak langsung mengaktivasi sel B untuk berproliferasi (Tejasari dan Zakaria 2002). Namun demikian, pada dosis yang lebih tinggi (1 g/kg BB/hari), pemberian ekstrak daun jelatang menunjukkan efek menurunkan proliferasi limfosit. Hal ini diduga akibat banyaknya komponen fenolik yang terakumulasi dalam sel. Fardiaz (1996) menyatakan bahwa salah satu karakteristik fenol adalah kemampuannya sebagai antioksidan namun pada konsentrasi tinggi fenol dapat bersifat prooksidan. Sejalan dengan itu, Damiani et al. (2008) menyebutkan bahwa setiap antioksidan selama beraktivitas dapat menghasilkan spesies yang mampu mendorong oksidasi, oleh karena itu setiap antioksidan baik secara langsung ataupun tidak langsung memiliki sifat prooksidan. Efek prooksidan dari antioksidan telah menjadi objek studi yang menunjukkan bahwa antioksidan menjadi berbahaya ketika diaplikasikan pada dosis tinggi pada diet biasa (Damiani et al. 2008).

4.2.2. Proliferasi limfosit dengan penambahan LPS Proliferasi sel limfosit dapat diinduksi oleh senyawa yang disebut mitogen. Mitogen dapat memicu proliferasi karena dapat mengaktivasi hormon tirosin kinase yang merupakan faktor pertumbuhan. Hormon ini akan mengirimkan sinyal-sinyal yang berpengaruh terhadap faktor transkripsi dan aktivasi gen sehingga terjadi proliferasi sel (Decker 2001). Mitogen yang digunakan pada penelitian ini adalah lipopolisakarida (LPS). LPS merupakan komponen membran luar dari bakteri gram negatif seperti Salmonella typhii ataupun E. coli. LPS diketahui dapat memicu proliferasi sel limfosit B. Menurut Kuby et al. (2007), LPS merupakan contoh dari type 1 thymusindependent antigens (antigen TI-1). Sebagian besar antigen TI-1 merupakan aktivator sel B poliklonal (mitogen) yang dapat mengaktivasi sel B tanpa mempedulikan spesifitas antigenik mereka. Pada konsentrasi tinggi, beberapa antigen TI-1 akan menstimulasi proliferasi dan sekresi antibodi sebanyak sepertiga dari keseluruhan sel B. LPS menstimulasi produksi antibodi spesifik untuk LPS pada konsentrasi rendah, sedangkan pada konsentrasi tinggi LPS merupakan aktivator sel B poliklonal. Rata-rata indeks stimulasi limfosit dengan perlakuan LPS serta % aktivitasnya tertera pada Tabel 8. Pengaruh penambahan LPS terhadap aktivitas proliferasi dapat dilihat pada Gambar 6.

22

Tabel 8. Rata-rata indeks stimulasi dan aktivitas proliferasi limfosit dengan penambahan LPS Kelompok Tikus

Indeks stimulasi

Aktivitas (%)

Kontrol

1,140

14,02

Dosis 0,1 g/kg BB/hari

0,988

-20,50

Dosis 1 g/kg BB/hari

1,020

7,56

1,400

Indeks Stimulasi

1,200 1,000

1,140 1,000

1,243 0,988

0,948

1,020

0,800 0,600

Spontan

0,400

LPS

0,200 0,000 Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari

Dosis 1 g/kg BB/hari

Kelompok Tikus

Gambar 6. Pengaruh penambahan LPS terhadap rata-rata indeks stimulasi Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada kelompok tikus kontrol nilai indeks stimulasi dengan penambahan LPS lebih tinggi daripada nilai indeks stimulasi spontan. Berdasarkan perhitungan % aktivitas, kenaikan aktivitas proliferasi limfosit dengan penambahan LPS pada kelompok tikus kontrol adalah 14.02 %. Pada kelompok tikus dengan perlakuan ekstrak daun jelatang dosis 0.1 g/kg BB/hari, nilai indeks stimulasi dengan penambahan LPS lebih kecil dibanding indeks stimulasi spontan dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 20.50%. Adapun kelompok tikus dengan perlakuan ekstrak daun jelatang dosis 1 g/kg BB/hari menunjukkan nilai indeks stimulasi dengan penambahan LPS lebih tinggi daripada nilai indeks stimulasi spontan dengan kenaikan aktivitas proliferasi sebesar 7.56%. Hasil analisis statistik dengan uji T berpasangan terhadap indeks stimulasi spontan dan perlakuan LPS tertera pada Lampiran 10. Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa kenaikan aktivitas proliferasi karena penambahan LPS pada kelompok tikus kontrol dan kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari merupakan kenaikan yang tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Begitu juga dengan penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari, penurunan ini tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Berdasarkan paparan data di atas, penambahan mitogen LPS mampu meningkatkan proliferasi pada kelompok tikus kontrol dan kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari. Walaupun demikian peningkatan yang terjadi bersifat tidak signifikan. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh metode analisis uji MTT yang menggunakan pengukuran absorbansi. Keller et al. (2005) yang membandingkan dua metode pengujian proliferasi limfosit menemukan bahwa pengujian dengan radioaktif 3H-thymidine secara signifikan menghasilkan nilai indeks stimulasi yang lebih tinggi dibandingkan pengujian dengan MTT. Lebih jauh lagi, Iwata dan Inoue (1993) menyebutkan bahwa

23

rendahnya nilai IS pada uji MTT disebabkan oleh nilai absorbansi sel yang tidak distimulasi (sel kontrol) secara relatif lebih tinggi karena metode pengujian ini tidak hanya mengukur viabilitas sel yang membelah secara aktif, tetapi juga sel yang sedang beristirahat. Pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari penambahan LPS mengakibatkan penurunan aktivitas proliferasi walaupun tidak signifikan. Hal ini menunjukkan bahwa mitogen yang ditambahkan pada kultur sel limfosit tikus bersifat tidak sinergis dengan ekstrak daun jelatang dalam meningkatkan aktivitas proliferasi dan cenderung menghambat proliferasi pada perlakuan ekstrak daun jelatang dosis rendah. Penelitian yang dilakukan oleh Nora (2007) juga menunjukkan bahwa penambahan mitogen LPS pada kultur sel limfosit tikus yang telah diberi paparan ekstrak daun kumis kucing dan bunga kenop cenderung menghambat proliferasi, ditunjukkan dengan nilai indeks stimulasi lebih kecil dari 1. Walaupun demikian, pada pemberian dosis ekstrak daun jelatang yang lebih tinggi (1 g/kg BB/hari) proliferasi limfosit dengan penambahan LPS mengalmi peningkatan. Hal ini kemungkinan terjadi karena efek stimulasi proliferasi oleh ekstrak daun jelatang lebih dominan daripada efek unsinergis LPS dan ekstrak daun jelatang dalam meningkatkan proliferasi. Namun perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk memastikan dan menjelaskan fenomena ini.

4.2.3. Proliferasi sel limfosit limfa dengan penambahan senyawa toksik Senyawa toksik ditambahkan pada kultur sel limfosit untuk mengetahui sejauh mana ekstrak daun jelatang dapat menghambat efek toksik dari senyawa tersebut terhadap proliferasi limfosit. Senyawa toksik yang digunakan dalam penelitian ini adalah karmoisin dan rhodamin B. Karmoisin merupakan pewarna makanan sintetis yang pada kadar tertentu diketahui memiliki efek toksik bagi tubuh sehingga penggunaannya dalam bahan pangan diatur dengan ketat. Hingga saat ini, karmoisin merupakan pewarna makanan sintetis yang diizinkan di Uni Eropa dengan level maksimal penggunaan yang diizinkan sebesar 50-500 mg/kg pangan untuk berbagai jenis bahan pangan dengan nilai Acceptable Daily Intake (ADI) sebesar 0-4 mg/kg BB/hari (EFSA 2009). Nilai ADI ini digunakan sebagai dasar penentuan konsentrasi karmoisin yang ditambahkan pada kultur. Adapun rhodamin B merupakan pewarna sintetis yang dilarang penggunannya pada pangan namun masih sering disalahgunakan oleh produsen pangan. Menurut Inchem (2006) nilai LD50 rhodamin B adalah 89.5 mg/kg berat badan. Nilai LD50 digunakan sebagai dasar penentuan konsentrasi rhodamin B yang ditambahkan pada kultur. Rata-rata indeks stimulasi dengan perlakuan senyawa karmoisin dan rhodamin B dapat dilihat pada Tabel 7. Paparan senyawa karmoisin yang diujikan pada penelitian ini adalah 48 µg/ml, 96 µg/ml dan 144 µg/ml kultur. Tabel 9 menunjukkan % aktivitas proliferasi limfosit dengan perlakuan karmoisin pada setiap konsentrasi, sedangkan Gambar 7 menunjukkan perbandingan antara nilai indeks stimulasi spontan dan indeks stimulasi dengan paparan karmoisin 48 µg/ml. Kelompok tikus kontrol menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 48.86%. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari juga menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 28.17%. Adapun pada kelompok tikus 1 g/kg BB/hari terjadi kenaikan nilai indeks stimulasi dengan kenaikan aktivitas proliferasi sebesar 24.80%. Hasil analisis statistik dengan uji T berpasangan terhadap indeks stimulasi spontan dan perlakuan karmoisin 48 µg/ml tertera pada Lampiran 11. Hasil analisis statistik yang telah dilakukan menunjukkan bahwa penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus kontrol dan kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Sementara itu, kenaikan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari juga merupakan kenaikan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%.

24

Tabel 9. Nilai aktivitas proliferasi limfosit dengan perlakuan karmoisin (%) Kelompok Tikus

Perlakuan Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari

Dosis 1 g/kg BB/hari

Kar 48 µg/ml Kar 96 µg/ml

-48,86 -44,47

-28,17 -19,14

24,80 12,53

Kar 144 µg/ml

-41,70

-17,97

18,51

1,400

1,243

1,183

1,200 Indeks Stimulasi

1,000 1,000

0,893

0,948

0,800 0,600

0,511

Spontan Kar 48 µg/ml

0,400 0,200 0,000 Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari

Dosis 1 g/kg BB/hari

Kelompok Tikus Gambar 7.

Pengaruh penambahan karmoisin 48 µg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit

Gambar 8 menunjukkan perbandingan antara nilai indeks stimulasi spontan dan indeks stimulasi pada paparan karmoisin 96 µg/ml. Kelompok tikus kontrol menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 44.47%. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari juga menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 19.14%. Adapun pada kelompok tikus 1 g/kg BB/hari terjadi kenaikan nilai indeks stimulasi dengan kenaikan aktivitas proliferasi sebesar 12.53%. Hasil analisis statistik dengan uji T berpasangan terhadap indeks stimulasi spontan dan perlakuan karmoisin 96 µg/ml tertera pada Lampiran 12. Hasil analisis statistik yang telah dilakukan menunjukkan penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus kontrol dan dosis 0.1 g/kg BB/hari merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Sementara itu, kenaikan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari merupakan kenaikan yang tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%.

25

1,400

1,243

Indeks Stimulasi

1,200 1,000

1,005

1,000

1,067 0,948

0,800 0,555

0,600

Spontan Kar 96 µg/ml

0,400 0,200 0,000 Kontrol

Gambar 8.

Dosis 0,1 g/kg BB/hari Kelompok Tikus

Dosis 1 g/kg BB/hari

Pengaruh penambahan karmoisin 96 µg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit

Gambar 9 menunjukkan perbandingan antara nilai indeks stimulasi spontan dan indeks stimulasi pada paparan karmoisin 144 µg/ml. Kelompok tikus kontrol menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 41.70%. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari juga menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 17.97%. Adapun pada kelompok tikus 1 g/kg BB/hari terjadi kenaikan nilai indeks stimulasi dengan kenaikan aktivitas proliferasi sebesar 18.51%. Hasil analisis statistik dengan uji T berpasangan terhadap indeks stimulasi spontan dan perlakuan karmoisin 144 µg/ml tertera pada Lampiran 13. Hasil analisis statistik yang telah dilakukan menunjukkan penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus kontrol merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Adapun penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari merupakan penurunan yang tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Sementara itu, kenaikan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari merupakan kenaikan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. 1,400

Indeks Stimulasi

1,200

1,243 1,124 1,020

1,000

1,000

0,948

0,800 0,600

0,583

Spontan Kar 144 µg/ml

0,400 0,200 0,000 Kontrol

Gambar 9.

Dosis 0,1 g/kg Dosis 1 g/kg BB/hari BB/hari Kelompok Tikus

Pengaruh penambahan karmoisin 144 µg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit

26

Pada ketiga nilai konsentrasi karmoisin yang diujikan, secara umum terlihat bahwa adanya paparan karmoisin menyebabkan penurunan aktivitas proliferasi secara signifikan pada kelompok tikus kontrol. Amin et al (2010) menyebutkan bahwa pada konsentrasi tinggi karmoisine dapat menginduksi stress oksidatif melalui pembentukan radikal bebas. Adanya stress oksidatif ini dapat merusak sel limfosit dan menghambat proliferasi. Tidak adanya mekanisme ataupun senyawa yang melindungi sel dari stress oksidatif ini menyebabkan aktivitas proliferasi limfosit pada kelompok tikus kontrol menurun cukup drastis hingga hampir 50%. Sementara itu, pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari, secara umum terjadi penurunan aktivitas proliferasi limfosit yang signifikan akibat adanya paparan karmoisin. Dengan demikian, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 0.1 g/kg BB/hari tidak dapat menghambat efek toksik yang ditimbulkan karmoisin terhadap proliferasi limfosit tikus. Ekstrak daun jelatang yang diberikan pada dosis rendah diduga menyebabkan senyawa fenolik yang terserap oleh limfa tikus tidak cukup banyak sehingga efek antioksidan dari senyawa fenolik tersebut tidak maksimal. Adapun pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari, aktivitas proliferasi meningkat secara signifikan pada ketiga konsentrasi paparan karmoisin yang diujikan. Pemberian ekstrak daun jelatang pada konsentrasi ini tidak hanya mampu menghambat efek toksik dari paparan karmoisin namun juga masih mampu menstimulasi proliferasi limfosit. Daun jelatang sendiri diketahui memiliki kandungan komponen-komponen bioaktif yang memiliki aktivitas antioksidan. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, Gulcin et al. (2004) menyimpulkan bahwa ekstrak air tanaman jelatang memiliki aktivitas antioksidan yang kuat terhadap berbagai system oksidatif secara in vitro. Beberapa mekanisme dari ekstrak air tanaman jelatang ini dapat disebabkan oleh kemampuan yang kuat untuk mendonasikan hidrogen, kemampuan mengkelat logam, dan kemampuannya secara efektif sebagai penangkap (scavenger) hidrogen peroksida, superoksida, dan radikal bebas. Aktivitas antioksidan ini dapat menanggulangi stress oksidatif yang diinduksi oleh adanya paparan senyawa karmoisin sehingga proliferasi limfosit tidak terhambat. Pada penelitian ini juga digunakan senyawa rhodamin B yang ditambahkan ke dalam kultur sel pada konsentrasi 12 µg/ml, 24 µg/ml dan 36 µg/ml kultur. Tabel 10 menunjukkan % aktivitas proliferasi limfosit dengan perlakuan karmoisin pada setiap konsentrasi sedangkan Gambar 10 menunjukkan pengaruh paparan senyawa rhodamin B 12 µg/ml terhadap proliferasi limfosit pada masing-masing kelompok tikus. Kelompok tikus kontrol menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 51.86%. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari juga menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 24.67%. Pada kelompok tikus 1 g/kg BB/hari juga terjadi penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 3.47%. Hasil analisis statistik dengan uji T berpasangan terhadap indeks stimulasi spontan dan perlakuan rhodamin B 12 µg/ml tertera pada Lampiran 14. Hasil analisis statistik yang telah dilakukan menunjukkan penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus kontrol merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Adapun penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Sementara itu, penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari merupakan penurunan yang tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%.

27

Tabel 10. Nilai aktivitas proliferasi limfosit dengan perlakuan rhodamin B (%) Kelompok Tikus

Perlakuan Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari

Dosis 1 g/kg BB/hari

Rho 12 µg/ml Rho 24 µg/ml

-51,86 -49,60

-24,67 -23,34

-3,47 0,23

Rho 36 µg/ml

-47,80

-23,55

6,61

1,400 Indeks Stimulasi

1,200

1,243 1,000

0,936

1,000

0,948 0,915

0,800 0,600

0,481

Spontan

0,400

Rho 12 µg/ml

0,200 0,000 Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari Kelompok Tikus

Dosis 1 g/kg BB/hari

Gambar 10. Pengaruh penambahan rhodamin B 12 µg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit Gambar 11 menunjukkan pengaruh paparan senyawa rhodamin B 24 µg/ml terhadap proliferasi limfosit pada masing-masing kelompok tikus. Kelompok tikus kontrol menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 49.60%. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari juga menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 23.34%. Pada kelompok tikus 1 g/kg BB/hari terjadi sedikit kenaikan nilai indeks stimulasi dengan peningkatan aktivitas proliferasi sebesar 0.23%. Hasil analisis statistik dengan uji T berpasangan terhadap indeks stimulasi spontan dan perlakuan rhodamin B 24 µg/ml tertera pada Lampiran 15. Hasil analisis statistik yang telah dilakukan menunjukkan penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus kontrol merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Sementara itu, peningkatan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari merupakan peningkatan yang tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%.

28

1,400

Indeks Stimulasi

1,200

1,243 1,000

0,953

1,000

0,9480,950

0,800 Spontan

0,504

0,600

Rho 24 µg/ml

0,400 0,200 0,000 Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari Kelompok Tikus

Dosis 1 g/kg BB/hari

Gambar 11. Pengaruh penambahan rhodamin B 24 µg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit Gambar 12 menunjukkan pengaruh paparan senyawa rhodamin B 36 µg/ml terhadap proliferasi limfosit pada masing-masing kelompok tikus. Kelompok tikus kontrol menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 47.80%. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari juga menunjukkan penurunan nilai indeks stimulasi dengan penurunan aktivitas proliferasi sebesar 23.55%. Pada kelompok tikus 1 g/kg BB/hari terjadi kenaikan nilai indeks stimulasi dengan peningkatan aktivitas proliferasi sebesar 6.61%. Hasil analisis statistik dengan uji T berpasangan terhadap indeks stimulasi spontan dan perlakuan rhodamin B 36 µg/ml tertera pada Lampiran 16. Hasil analisis statistik yang telah dilakukan menunjukkan penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus kontrol merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Penurunan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari merupakan penurunan yang signifikan pada taraf kepercayaan 95%. Sementara itu, peningkatan aktivitas proliferasi pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari merupakan peningkatan yang tidak signifikan pada taraf kepercayaan 95%. 1,400 Indeks Stimulasi

1,200

1,243 1,000

0,950

1,000

0,948

1,011

0,800 0,600

Spontan 0,522

Rho 36 µg/ml

0,400 0,200 0,000 Kontrol

Dosis 0,1 g/kg BB/hari Kelompok Tikus

Dosis 1 g/kg BB/hari

Gambar 12. Pengaruh penambahan rhodamin 36 µg/ml terhadap aktivitas proliferasi limfosit

29

Berdasarkan hasil penelitian, paparan rhodamin B baik pada konsentrasi 12 µg/ml, 24 µg/ml ataupun 36 µg/ml menyebabkan penurunan aktivitas proliferasi limfosit secara sigifikan pada kelompok tikus kontrol. Kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari secara umum juga mengalami penurunan aktivitas proliferasi secara signifikan. Namun lain halnya dengan kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari, adanya paparan rhodamin B tidak mempengaruhi aktivitas proliferasi secara signifikan. Dengan kata lain, pada kelompok ini peningkatan atau penurunan aktivitas proliferasi yang terjadi bersifat tidak signifikan. Penurunan aktivitas proliferasi pada limfosit yang terpapar rhodamin B diduga terjadi karena banyaknya sel yang mati. Berdasarkan studi yang dilakukan oleh Kaji et al. (1991), rhodamin B pada konsentrasi 25 µg/ml dan konsentrasi yang lebih tinggi, secara signifikan menurunkan jumlah sel KD (fibroblast) bibir manusia setelah dikultur selama 72 jam. Dan pada konsentrasi 50 µg/ml, rhodamin B mengakibatkan perubahan degeneratif pada nukleus dan bentuk sel menjadi tidak biasa. Selain itu, Pipih dan Juli (2000) menyebutkan bahwa rhodamin B dapat menyebabkan terjadinya peubahan bentuk dan organisasi sel dalam jaringan hati mencit dari normal menjadi patologis, yaitu perubahan sel hati menjadi nekrosis dan jaringan di sekitarnya mengalami desintegrasi atau disorganisasi. Lockshin dan Zakeri (2004) menyebutkan bahwa nekrosis merupakan proses kematian sel yang tidak terkontrol dan terjadi ketika sel tidak mampu mengikuti jalur apoptosis (kematian sel yang terprogram). Nekrosis dapat terjadi ketika sel secara tiba-tiba mengalami stress yang ekstrim, seperti perubahan drastis pada konsentrasi ion atau pH dari medium ekstraseluler, hilangnya sumber energi secara tiba-tiba, ataupun penurunan atau peningkatan suhu yang menyebabkan keadaan homeostasis tidak mungkin dijaga. Keberadaan rhodamin B dalam kultur sel diduga mendorong sel limfosit untuk mengalami nekrosis. Bagi organisme, selalu lebih baik untuk mengontrol kematian sel untuk menghindari lolosnya molekul-molekul destrukif seperti protease, sitokinin yang memicu inflamasi serta organisme invasif seperti virus (Lockshin dan Zakeri 2004). Dengan demikian, ketika sel mengikuti jalur kematian sel yang tidak terkontrol (nekrosis), molekul-molekul destruktif ini akan terlepas dan menyerang sel-sel lain di sekitar sel yang mengalami nekrosis. Hal ini menyebabkan efek kerusakan atau kematian sel semakin meluas. Ketika terjadi pada sistem kultur sel limfosit, hal ini akan menyebabkan penghambatan aktivitas proliferasi yang cukup besar. Seperti yang terjadi pada kelompok tikus kontrol yang mengalami penurunan aktivitas proliferasi hingga lebih dari 50%. Pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari, efek penurunan aktivitas proliferasi karena paparan rhodamin B tidak sebesar kelompok tikus kontrol, yaitu hanya sekitar 20-25%. Hal ini berarti bahwa pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 0.1 g/kg BB/hari memiliki kemampuan dalam menghambat efek toksik yang ditimbulkan oleh rhodamin B terhadap aktivitas proliferasi. Namun, pada dosis ini efek penghambatan yang ditimbulkan tidak cukup besar karena diduga komponenkomponen bioaktif yang terserap tidak cukup banyak untuk memberikan efek yang maksimal. Terbukti pada pemberian ekstrak daun jelatang dengan dosis yang lebih tinggi, yaitu 1 g /kg BB/hari, adanya paparan rhodamin B secara umum tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap aktivitas proliferasi sel limfosit tikus.

30

V.

SIMPULAN DAN SARAN

5.1. Simpulan Hasil pengamatan pada pemeliharaan tikus menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun jelatang (dosis 0,1 g/kg BB/hari dan dosis 1 g/kg BB/hari) memicu reaksi gatal, serta arrhythmia pada beberapa tikus. Arrhytmia diduga menjadi penyebab terjadinya dua kasus mortalitas yang terjadi pada satu dari sepuluh tikus pada masing-masing kelompok yang diberi perlakuan ekstrak daun jelatang. Namun hingga akhir masa pemeliharaan tidak ditemukan adanya manifestasi toksisitas ekstrak daun jelatang terhadap berat badan tikus. Pengujian proliferasi limfosit spontan menunjukkan bahwa kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari memiliki nilai indeks stimulasi yang lebih tinggi dari kontrol yaitu 1.243, sedangkan kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari memiliki nilai indeks stimulasi yang lebih rendah dari kontrol yaitu 0.948. Tingginya nilai indeks stimulasi pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari diduga terjadi karena aktivitas antioksidan komponen fenolik pada daun jelatang yang mampu melindungi sel limfosit dari stress oksidatif yang dapat merusak sel. Namun demikian, secara statistik perbedaan nilai indeks stimulasi ini bersifat tidak signifikan. Sementara itu, penambahan mitogen LPS mampu meningkatkan aktivitas proliferasi limfosit pada kelompok tikus kontrol sebesar 14.02% dan pada kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari sebesar 7.56%. Sedangkan pada kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari terjadi penurunan aktivitas proliferasi limfosit sebesar 20.50%. Secara statistik peningkatan atau penurunan yang terjadi bersifat tidak signifikan. Pengujian aktivitas proliferasi limfosit pada paparan karmoisin pada tiga konsentrasi berbeda menunjukkan bahwa kelompok tikus kontrol mengalami penurunan aktivitas proliferasi limfosit sekitar 41-48%, kelompok tikus dosis 0.1g/kg BB/hari mengalami penurunan aktivitas proliferasi sekitar 17-28%, sedangkan kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari mengalami kenaikan aktivitas proliferasi sekitar 12-24%. Dengan demikian, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis rendah mampu mengurangi efek toksik karmoisin terhadap aktivitas proliferasi limfosit tikus. Adapun, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 1 g/kg BB/hari selain dapat menghambat efek toksik karmoisin juga mampu menstimulasi proliferasi limfosit tikus pada paparan senyawa toksik karmoisin. Aktivitas proliferasi limfosit kelompok tikus kontrol mengalami penurunan sekitar 47-51% pada pengujian dengan paparan rhodamin B pada tiga konsentrasi berbeda, sedangkan kelompok tikus dosis 0.1 g/kg BB/hari mengalami penurunan sekitar 23-24%. Adapun aktivitas proliferasi limfosit kelompok tikus dosis 1 g/kg BB/hari mengalami penurunan sebesar 3% dan peningkatan hingga 6%. Dengan demikian, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 0.1 g/kg BB/hari mampu mengurangi efek toksik rhodamin B terhadap aktivitas proliferasi limfosit tikus. Adapun, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 1 g/kg BB/hari selain dapat menghambat efek toksik karmoisin juga mampu menstimulasi proliferasi limfosit tikus pada paparan senyawa toksik rhodamin B.

5.2. Saran Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, pemberian ekstrak daun jelatang pada dosis 1 g/kg BB/hari memberikan efek paling baik dalam menghambat efek toksik yang ditimbulkan oleh karmoisin dan rhodamin B terhadap aktivitas proliferasi limfosit. Namun demikian perlu dilakukan pengujian terhadap dosis optimal untuk penggunaan ekstrak daun jelatang secara praktis. Selain itu, perlu dilakukan kajian yang lebih dalam mengenai komponen aktif yang bertanggung jawab terhadap aktivitas daun jelatang dalam menstimulasi proliferasi limfosit serta menghambat efek toksik karmoisin ataupun rhodamin B. Mengingat potensi yang dimiliki daun jelatang, tidak menutup

kemungkinan untuk dilakukan pengujian terhadap kemampuan daun jelatang dalam menghambat efek toksik dari bahan-bahan tambahan pangan lainnya, baik pewarna, pengawet, pemanis dan yang lainnya .

32

DAFTAR PUSTAKA [AIN] American Institute of Nutrition. 1976. Report AIN ad hoc committee on standard for nutrition study. J Nutr 107: 1340-1348 [EFSA] European Food Safety Authority. 2005. Opinion of the scientific panel on food additives, flavourings, processing aids and materials in contact with food on a request from the commission to review the toxicology of a number of dyes illegally present in food in the EU. EFSA J 263: 1-71 [EFSA] European Food Safety Authority. 2009. Scientific opinion on the re-evaluation of azorubine/carmoisine (E 122) as a food additive. EFSA J 7 (11): 1-36 Afrah Z. 2010. Pengujian Hepatotoksisitas Subkronis Ekstrak Daun Jelatang (Urtica dioica L.) pada Tikus Sprague Dawley. [skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Bogor Akbay P, Basaran AA, Undeger U, Basaran N. 2003. In vitro immunomodulatory activity of flavonoid glycosides from Urtica dioica L. Phyto Res 17: 34–37 Aksu MI, Kaya M. 2004. Effect of usage Urtica dioica L. on microbial properties of sucuk a Turkish dry-fermented sausage. Food Cont 15: 591–595 Allardice P. 1993. A–Z of Companion Planting. Cassell Publishers Ltd, London American Herbal Pharmacopoeia. 2009. Stinging Nettle Herb. Scotts Valley, USA Amin KA, Hameid II HA, Elsttar AHA. 2010. Effect of food azo dyes tartrazine and carmoisine on biochemical parameters related to renal, hepatic function and oxidative stress biomarkers in young male rats. Food Chem Toxicol 48: 2994-2999 Anonimus. 2006. Rhodamine B ditemukan pada makanan dan minuman di Makassar. Republika Kamis 5 Januari 2006. http://www.republika.co.id/online_detail.asp ?=229881&kat_id=23. [30 Desember 2010] Baratawidjaja KG. 2006. Immunologi Dasar. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta Boyer R. 2002. Concepts in Biochemistry Ed 2. Brooks/Cole. Canada Cambier JC. 2000. B-Lymphocyte Differentiation. CRC Press, Florida Cartwright T, Shah GP. 1994. Culture media. Di dalam: Davis JM (ed). Basic Cell Culture, A Practical Approach. Oxford Univ Pr, New York Chaurasia N, Wichtl M. 1987. Flavonol glycosides aus Urtica dioica. Plant Med 53: 432–434 Cooper HA, Dries DL, Davis CE, Shen YL, Domanski MJ. 1999. Diuretics and risk of arrhythmic death in patients with left ventricular dysfunction. Circulation 100: 1311-1315

Damiani E, Astolfi P, Carloni P, Stipa P, Greci L. 2008. Antioxidants: how they work. Di Dalam: Valacchi G, Davis P (eds). Oxidants in Biology: A Question of Balance. Springer Science, California National Institute of Health. 2003. Understanding the Immune System : How It Works. NIH Publication, USA Decker JM. 2001. Introduction to Immunology. Blackwell Science Inc, Massachusetts Doyle A, Griffiths JB. 1997. Mammalian Cell Culture. Oxford, London Erniati. 2007. Efek Konsumsi Minuman Bubuk Kakao Bebas Lemak terhadap Sifat Antioksidan dan Proliferativ Limfosit Manusia. [tesis]. Program Pascasarjana IPB, Bogor European Medicines Agency. 2007. Evaluation of medicines for human use: community herbal monograph on Urtica dioica L. and Urtica urens L. herba. Draft. London Fragoso LR, Esparza JR, Burchiel SW, Ruiz DH, Torres E. 2008. Risk and benefits of commonly used herbal medicines in Mexico. Toxicol Appl Pharmacol 227: 128-135 Frazier RA. 2009. Food chemistry. Di dalam: Campbell-Platt G. (ed). Food Science and Technology. Blackwell Publishing Ltd, United Kingdom Freimoser FM, Jakob CA, Aebi M, Tuor U. 1999. The MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyltetrazolium bromide) assay is a fast and reliable method for colorimetric determination of fungal cell densities. Appl Environ Microbiol 65(8): 3727-3729 Freshney RI. 1994. Animal Cell Culture: A Practical Approach. IRL Press, Washington DC Galelli A, Truffa-Bachi P. 1993. Urtica dioica agglutinin. A superantigenic lectin from stinging nettle rhizome. J of Immun 151: 1821–1831 Ganser D, Spiteller G. 1995. Aromatase inhibitors from Urtica dioica roots. Plant Med 61: 138–140 Guil-Guerrero JL, Rebolloso-Fuentes M, Isasa M. 2003. Fatty acids and carotenoids from stinging netle (Urtica dioica L). J Food Comp and Anal 16: 111–119 Hallagan JB, Allen DC, Borzelleca JF. 1995. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food Chem Toxicol 33 (6): 515–528 Harris JR. 1991. Blood Cell Biochemistry vol.3: Lymphocytes and Granulocytes. Plenum Press, New York Inchem. 2006. JECFA Evaluation of http://www.inchem.org/jecfa/jeceval/jec_2089.htm. [5 Januari 2010]

Rhodamine

B.

Iwata H, Inoue T. 1993. The colorimetric assay for swine lymphocyteblastogenesis. J Vet Med Sci 55: 697–698

34

Janeway CA, Travers P, Walport M, Shlomchik M. 2001. Immunobiology : the immune system in health and disease. Garland Publishing, New York Janssen MMT. 1997. Food additives. Di dalam: Vries JD (ed). Food Safety and Toxicity. CRC Press, Boca Raton Kaji T, Kawashima T, Sakamoto M, Kurashige Y, Koizumi F. 1991. Inhibitory effect of rhodamine B on the proliferation of human lip fibroblasts in culture. Toxicol 68(1):11-20 Keller JM, Mc.Clellan-Green PD, Lee AM, Arendt MD, Maier PP, Segars AL, Whitaker JD, Keil DE, Peden-Adams MM. 2005. Mitogen-induced lymphocyte proliferation in loggerhead sea turtles: comparison of methods and effects of gender, plasma testosterone concentration, and body condition on immunity. J Vet Immuno & Immunopathology 103: 269-281 Kresno SB. 1996. Imunologi: Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta Kuby J, Kindt TJ, Richard AG, Barbara AO. 2007. Immunology. 6th Edition. W.H Freeman and Company, New York Lao CC, Lin TL, Wu CC. 2001. Factors affecting mitogenic response of turkey lymphocytes. Acta Vet BRNO 70: 433-442 Lehninger A. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Terjemahan : Maggy Thenawijaya. Penerbit Erlangga, Jakarta Lockshin RA, Zakeri Z. 2004. Cell death origin and progression: introduction. Di Dalam: Lockshin RA, Zakeri Z. (eds). When Cells Die II: A Comprehensive Evaluation of Apoptosis And Programmed Cell Death. John Wiley & Sons Inc., New Jersey National Research Council. 1978. Nutrient Requirement of Laboratory Animal no. 10 3rd Rev. National Academy of Sciences, Washington D.C. Nora Z. 2007. Pengaruh Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Kenop (Gomphrena globosa L.) terhadap Proliferasi Sel Limfosit Tikus. [tesis]. Program Pascasarjana IPB, Bogor Peterson ME, Talcott PA. 2006. Small Animal Toxicology. Ed 2. Elsevier Saunders, Amerika Serikat Pipih S, Juli SS. 2000. Uji toksisitas zat warna makanan rhodamin terhadap jaringan hati mencit (Mus musculus) galur Australia. J Toksikol Ind 1(3): 18-27 Prangdimurti E. 1999. Efek Perlindungan Ekstrak Jahe terhadap Respon Imun Mencit yang Diberi Perlakuan Stress Oksidatif oleh Pestisida Paraquat. [tesis]. Program Pascasarjana IPB, Bogor Puspaningrum. 2003. Pengaruh Ekstrak Kayu Secang terhadap Proliferasi Sel Limfosit Limfa Tikus dan Sel Kanker k-562 (Chronic Myelogenous Leukimia) Secara In Vitro. [skripsi]. Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Bogor

35

Puspawati KD. 2009. Kajian aktivitas proliferasi limfosit dan kapasitas antioksidan sorgum (Sorghum bicolor L. Moench) dan Jewawut (Pennisetum sp) pada Tikus Sprague Dawley. [tesis]. Program Pascasarjana IPB, Bogor Roitt IM, Delves PJ. 2001. Essential Immunology. Backwell Scientific Publications, London Shaper PT. 1988. Methods of Cell Separation. Elsevier, Amsterdam Sharma S, Goyal RP, Chakravarty G, Sharma A. 2005. Haemotoxic effects of chocolate brown, a commonly used blend of permitted food colour on Swiss Albino mice. Asian J Exp Sci 19(2): 93–103 Sharma S, Goyal RP, Chakravarty G, Sharma A. 2006. Tomato red toxicity: haematological and serological changes in the blood of swiss albino mice Mus musculus. Ind J Environ Sci 10(2): 145–148 Sheeler P, Bianchi DE. 1982. Cell Biology Structure: Biochemistry and Function. 2nd ed. John Wiley & Sons Inc, New York Tejasari. 2007. Evaluation of ginger (Zingiber officinale Roscoe) bioactive compounds in increasing the ratio of T-cell surface molecules of CD3+CD4+:CD3+CD8+ in-vitro. Mal J Nutr 13(2): 161-170 Tejasari & Zakaria FR (2002). Aktivitas stimulasi komponen bioaktif rimpang jahe (Zingiber officinale Roscoe) pada sel limfosit B manusia in vitro. J Teknol Ind Pangan 8(1):47-53. Thorngate III JH. 2002. Synthetic Food Coloransts. Di dalam: Brannen AL, Davidson PM, Salminen S, Thorngate III JH (eds). Food Additives. Marcel Dekker Inc, New York Wagner H, Willer F, Kreher B. 1989. Biologically active compounds from the aqueous extract of Urtica dioica. Plant Med 55: 452–454 Wang X, Ge J, Wang K, Qian J, Zou Y. 2006. Evaluation of MTT assay for measurement of Emodininduced cytotoxicity. Assay Drug Dev Technol 4(2): 203-207 Waters JJ, Sommer JA, Pfeiffer ZA, Prabhu U, Guerra AN, Bertics PJ. 2002. A Differential Role for the Mitogen-Activated Protein Kinases in LPS Signaling: The MEK/ERK Pathway Is Not Essential for Nitric Oxide and Interleukin 1β Production. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc. 1-39 Yener Z, Celik I, Ilhan F, Bal R. 2009. Effects of Urtica dioica L. seed on lipid peroxidation, antioxidants and liver pathology in aflatoxin-induced tissue injury in rats. Food Chem Toxicol 47: 418-424 Zakaria FR, Nurahman, Prangdimurti E, Tejasari. 2003. Antioxidant and immunoenhancement activities of ginger (Zingiber officinale Roscoe) extracts and compounds in in vitro and in vivo mouse and human system. Nutrac Foods 8: 96-104

36

Ziyyat A, Legssyer A, Mekhfi H, Dassouli A, Serhrouchni M, Benjelloun W. 1997. Phytotherapy of hypertension and diabetes in oriental Morocco. J Ethnopharmacol 58: 45–54

37

LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan konversi dosis manusia ke tikus Acuan : Jumlah konsumsi daun jelatang = 2 g/hari/70 kg BB/hari Faktor konversi dari manusia (70 kg) ke tikus (20 g) = 0,018 Dosis pada tikus

= 2 g x 0,018 = 0,036 g/hari/200 g BB/hari = 0,18 g/hari/kg BB/hari ≈ 0,1 g/hari/kg BB/hari

Lampiran 2. Contoh perhitungan volume cekok per tikus Untuk : berat badan tikus (BB) = 200 g = 0,2 kg dosis yang diinginkan

= 0,1 g/kg BB/hari = 100 mg/kg BB/hari

konsentrasi ekstrak

= 20 mg bahan/ml air

Volume cekok =

BB×dosis yang diinginkan konsentrasi ekstrak

Volume cekok =

0,2kg×100mg/kg 20mg/ml

Volume cekok =1 ml

38

Lampiran 3. Hasil penimbangan berat badan pada setiap kelompok tikus Kode tikus

02Feb

04Feb

06Feb

08Feb

10Feb

12Feb

14Feb

16Feb

20Feb

22Feb

K1

168

166

175

172

178

185

189

190

214

221

K2

200

209

219

222

227

236

235

243

260

263

K3

206

210

218

228

233

237

246

252

265

266

K4

205

220

219

222

230

237

237

241

242

245

K5

222

224

230

233

237

237

243

255

280

282

K6

220

220

225

230

238

238

259

258

262

263

K7

228

232

239

240

248

254

256

262

270

273

K8

205

208

215

220

231

236

238

245

257

258

K9

172

176

192

184

188

195

202

203

212

215

K10 Ratarata

146

157

156

165

166

174

179

170

182

185

206,8

211,1

217,5

220,9

227,8

232,5

237,9

243,3

256,3

258,9

R1

201

202

209

212

220

226

229

236

247

248

R2

185

190

198

200

203

207

208

213

219

220

R3

194

191

195

200

209

214

217

225

233

235

R4

201

202

210

204

214

215

222

230

233

236

R5

190

190

209

211

218

224

229

235

244

247

R6

188

190

195

196

198

203

206

210

220

222

R7

179

180

185

189

190

196

197

202

207

209

R8

172

176

182

180

190

193

195

197

204

208

R9

205

188

197

200

200

208

207

210

205

207

R10 Ratarata

162

167

179

180

182

198

202

205

209

211

193,2

194,2

202,7

203,8

210,3

214,8

218,5

224,8

232,7

234,7

T1

195

200

203

212

219

224

227

234

237

239

T2

205

216

217

227

235

244

245

252

261

262

T3

200

208

212

220

225

235

237

245

255

255

T4

224

228

238

243

255

265

269

283

294

296

T5

180

188

190

190

198

202

207

212

215

217

T6

189

187

192

198

201

200

203

202

205

210

T7

195

200

203

208

214

223

226

235

240

210

T8

204

209

222

217

230

237

240

247

250

255

T9

190

191

196

198

210

225

230

253

245

247

T10 Ratarata

164

165

168

169

172

174

177

177

180

185

198,3

203,9

207,9

214,0

221,0

227,6

230,6

237,6

243,9

241,3

39

Kode tikus

25Feb

27Feb

02Mar

04Mar

06Mar

08Mar

10Mar

12Mar

14Mar

16Mar

K1

222

225

229

233

235

237

240

241

239

241

K2

261

270

281

290

293

295

298

306

306

315

K3

292

291

295

296

302

305

291

298

302

282

K4

252

251

257

258

258

260

262

266

269

255

K5

290

302

305

298

304

310

310

318

323

318

K6

270

277

281

284

281

286

290

293

307

298

K7

275

275

279

226

230

245

248

254

264

246

K8

270

270

275

274

280

280

275

283

288

290

K9

215

219

226

228

227

228

233

231

225

231

K10 Ratarata

191

193

222

247

245

247

240

248

253

252

266,5

270,1

275,3

269,9

272,9

277,3

276,8

282,4

287,3

280,6

R1

258

265

269

273

278

280

275

265

268

275

R2

226

231

235

236

242

245

246

240

240

245

R3

242

246

254

257

259

260

258

260

264

255

R4

255

256

259

265

264

267

268

253

241

248

R5

255

257

263

268

269

270

277

273

276

280

R6

228

228

235

234

231

234

236

223

214

223

R7

213

215

215

218

219

202

205

200

200

185

R8

210

212

212

213

215

217

207

196

195

199

R9

225

228

230

225

226

228

229

233

237

238

R10 Ratarata

205

210

210

210

207

210

205

192

191

196

244,0

247,2

252,5

255,5

257,2

259,3

260,0

252,3

250,5

254,3

T1

252

270

278

281

284

286

293

293

275

292

T2

278

283

287

291

290

293

296

291

282

282

T3

271

277

286

290

298

300

291

293

265

264

T4

312

316

325

328

327

329

336

343

344

355

T5

225

225

232

233

237

239

238

230

239

241

T6

209

245

257

255

259

260

267

266

245

T7

257

259

265

265

267

269

273

252

243 Mati

T8

272

206

212

210

215

217

215

214

215

215

T9

250

257

255

258

260

263

252

242

240

223

T10 Ratarata

181

181

180

183

184

186

181

180

180

180

257,7

267,9

275,7

277,6

280,3

282,3

284,9

281,1

274,7

279,8

40

Kode tikus

18Mar

20Mar

22Mar

24Mar

26Mar

28Mar

30Mar

01Apr

03Apr

05Apr

K1

246

244

246

257

285

285

286

299

300

308

K2

315

315

318

324

330

333

336

342

345

341

K3

304

305

308

305

319

321

323

312

315

316

K4

271

272

275

275

279

281

282

288

289

288

K5

324

315

317

334

343

348

349

348

349

358

K6

300

290

305

303

306

312

315

315

317

316

K7

267

265

271

253

256

266

267

268

269

268

K8

292

295

298

298

299

300

302

301

305

304

K9

234

233

235

240

235

240

243

239

240

242

K10 Ratarata

251

247

249

254

256

260

262

259

260

266

289,9

287,6

292,3

293,6

302,1

305,8

307,5

309,1

311,1

312,4

R1

280

278

280

295

297

305

306

319

326

323

R2

250

247

248

260

267

255

257

280

287

278

R3

273

266

269

276

281

284

284

292

295

293

R4

251

252

257

270

271

275

277

283

280

280

R5

277

278

280

280

280

285

286

289

293

302

R6

228

206

209

212

225

232

235

240

246

237

R7

195

201

205

206

210

210

211

211

210

210

R8

200

205

207

211

215

219

220

220

223

228

R9

241

233

236

241

241

247

248

245

250

250

R10 Ratarata

191

206

209

222

222

226

228

223

236

238

259,8

254,5

257,2

265,5

270,2

272,7

274,2

283,8

287,8

285,5

T1

301

300

302

310

315

318

320

321

329

310

T2

274

280

283

297

302

304

306

316

322

322

T3

262

267

268

277

286

300

304

315

319

319

T4

351

356

357

359

364

370

372

370

376

365

T5

242

245

246

252

258

255

257

268

266

248

T6

242

248

250

267

273

276

277

279

283

281

Mati

T7 T8

218

215

217

220

225

228

229

229

240

238

T9

225

233

235

243

250

250

252

254

257

258

T10 Ratarata

181

181

185

182

189

188

189

190

200

199

278,7

282,7

284,3

293,7

299,7

303,8

306,0

311,5

315,8

307,5

41

Kode tikus

07Apr

09Apr

11Apr

13Apr

15Apr

17Apr

19Apr

21Apr

23Apr

25Apr

K1

310

312

315

315

319

321

322

330

335

335

K2

348

352

356

359

364

367

368

374

380

386

K3

327

325

327

332

334

342

345

345

353

357

K4

290

292

295

296

299

301

303

305

306

311

K5

359

360

361

366

370

372

375

377

388

388

K6

323

315

317

327

330

330

333

335

335

336

K7

280

278

280

280

278

279

280

285

296

295

K8

303

318

320

320

319

324

325

310

320

326

K9

242

247

249

268

266

272

273

304

318

264

K10 Ratarata

268

269

270

268

270

268

269

270

275

275

317,5

319,0

321,4

324,4

326,6

329,5

331,4

332,6

339,1

341,8

R1

323

322

325

333

333

332

335

335

340

340

R2

295

288

289

272

290

293

295

296

302

306

R3

305

305

307

310

304

308

309

310

300

311

R4

295

301

305

305

307

310

311

312

320

323

R5

297

305

307

309

311

310

325

324

R6

240

250

252

233

311 315 Mati

R7

207

211

215

211

217

218

220

220

220

222

R8

233

227

228

230

233

234

236

235

240

240

R9

251

250

252

247

245

243

245

245

250

245

R10 Ratarata

245

244

246

237

230

235

237

242

243

243

292,5

295,2

297,5

293,7

309,0

310,6

312,2

313,6

317,4

320,8

T1

323

326

326

326

330

321

325

332

330

329

T2

324

327

329

330

327

330

333

339

322

342

T3

328

335

336

344

345

349

350

359

337

356

T4

382

379

380

358

363

368

369

380

385

386

T5

270

270

271

276

276

278

280

282

286

283

T6

285

289

290

293

293

293

295

296

299

297

Mati

T7 T8

238

240

245

255

258

273

273

295

181

190

T9

265

266

267

265

268

266

268

270

268

270

T10 Ratarata

191

190

190

200

200

194

195

195

198

194

318,7

321,0

322,0

321,2

322,3

323,2

325,3

331,3

326,5

332,2

42

Kode tikus

27Apr

29Apr

01Mei

K1

340

342

351

K2

385

387

386

K3

355

355

360

K4

315

313

314

K5

387

392

394

K6

337

340

337

K7

296

293

295

K8

330

325

330

K9

266

263

264

K10 Ratarata

274

274

277

343,1

343,4

345,9

R1

340

333

340

R2

305

310

307

R3

316

316

317

R4

324

332

336

R5

325

325 Mati

328

R7

205

223

222

R8

238

240

240

R9

248

255

251

R10 Ratarata

245

235

245

322,0

323,2

325,6

T1

338

322

340

T2

325

334

340

T3

322

355

350

T4

369

368

383

T5

280

282

287

T6

296

300 Mati

302

T8

180

185

185

T9

267

269

272

T10 Ratarata

193

192

186

321,7

326,8

333,7

R6

T7

43

Lampiran 4. Konsumsi pakan per hari Kode tikus

01Feb

02Feb

03Feb

04Feb

05Feb

06Feb

07Feb

08Feb

09Feb

10Feb

11Feb

K1

11,7

11,4

12,0

13,5

11,2

10,9

13,5

15,4

16,9

18,7

19,4

K2

12,5

14,2

13,1

15,8

11,8

12,4

13,0

13,7

20,0

19,7

19,1

K3

16,2

17,2

17,3

17,5

16,9

17,5

16,5

15,0

15,5

16,7

16,2

K4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K5

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

15,1

20,0

20,0

20,0

16,0

18,0

K6

11,0

4,5

9,0

12,7

10,2

10,3

20,0

12,7

20,0

10,5

20,0

K7

20,0

19,2

20,0

20,0

20,0

20,0

16,6

20,0

20,0

20,0

20,0

K8

20,0

20,0

20,0

11,1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,1

20,0

20,0

19,2

11,4

K10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

19,1

20,0

20,0

15,1

15,7

15,6

16,7

15,0

15,2

15,8

16,0

18,1

18,8

18,7

R1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

9,4

17,5

17,2

R2

11,0

18,1

15,9

10,8

12,9

20,0

15,4

13,7

14,2

13,9

13,6

R3

19,1

14,1

16,4

17,2

15,0

15,0

15,7

17,0

15,1

16,7

17,0

R4

13,7

18,5

16,2

16,3

13,3

15,0

13,5

13,8

16,0

17,8

18,3

R5

16,3

14,4

15,4

16,5

15,5

14,6

15,4

12,3

12,0

12,3

13,6

R6

17,4

20,0

17,5

20,0

20,0

16,0

16,8

17,9

16,9

18,6

20,0

R7

17,4

19,7

15,9

16,9

20,0

20,0

20,0

20,0

19,0

20,0

20,0

R8

16,5

18,4

11,2

20,0

20,0

20,0

20,0

19,7

20,0

20,0

20,0

R9

13,2

13,5

13,2

20,0

10,7

15,1

15,3

14,6

17,3

18,2

20,0

R10 Ratarata

18,0

18,0

19,5

20,0

18,0

18,2

20,0

20,0

19,4

19,3

20,0

16,3

17,5

16,1

17,8

16,5

17,4

17,2

16,9

15,9

17,4

18,0

T1

11,7

11,6

12,9

11,2

13,4

13,5

14,4

20,0

18,7

19,7

20,0

T2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

13,7

20,0

20,0

20,0

T3

20,0

15,9

20,0

20,0

13,3

18,4

19,0

17,2

20,0

19,8

20,0

T4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T5

19,1

17,9

15,9

16,4

16,6

20,0

20,0

20,0

20,0

17,9

18,5

T6

16,9

20,0

20,0

16,3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T7

15,0

15,8

16,4

12,2

15,7

12,9

15,4

17,4

15,1

16,5

17,2

T8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T9

13,3

17,8

14,6

20,0

11,0

14,2

13,3

13,8

13,4

16,6

19,1

T10 Ratarata

17,9

18,8

10,2

12,6

13,5

12,4

12,6

11,8

18,2

16,7

13,8

17,4

17,8

17,0

16,9

16,3

17,1

17,5

17,4

18,5

18,7

18,9

44

Kode tikus

12Feb

13Feb

14Feb

15Feb

19Feb

21Feb

23Feb

24Feb

25Feb

26Feb

12Feb

K1

19,2

19,6

19,5

20,0

9,6

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

19,2

K2

16,2

16,7

20,0

20,0

15,0

20,0

13,2

20,0

17,1

20,0

16,2

K3

14,3

14,4

20,0

20,0

16,6

20,0

15,5

19,7

14,0

20,0

14,3

K4

20,0

20,0

20,0

19,3

20,0

20,0

18,0

16,6

20,0

17,9

20,0

K5

20,0

20,0

20,0

18,7

20,0

20,0

20,0

20,0

18,9

20,0

20,0

K6

20,0

20,0

20,0

14,6

20,0

13,9

20,0

12,6

13,9

12,8

20,0

K7

14,1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

14,1

K8

20,0

20,0

19,7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K10

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

Ratarata

17,4

17,7

19,9

19,8

15,3

20,0

16,7

19,1

17,8

19,5

17,4

R1

16,2

17,4

17,4

20,0

18,1

19,1

16,0

20,0

16,4

17,2

16,2

R2

17,2

18,9

19,1

20,0

10,4

18,6

12,6

20,0

18,5

19,5

17,2

R3

16,9

16,8

17,4

20,0

17,5

16,7

15,8

20,0

20,0

20,0

16,9

R4

15,9

18,2

17,7

20,0

14,7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

15,9

R5

11,7

14,4

15,8

14,4

12,1

14,8

17,3

20,0

18,0

20,0

11,7

R6

20,0

20,0

20,0

20,0

19,4

20,0

20,0

20,0

20,0

19,8

20,0

R7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

16,9

20,0

20,0

20,0

18,4

20,0

R8

17,9

18,7

19,3

20,0

18,5

18,8

18,2

20,0

20,0

16,7

17,9

R9

16,9

17,4

17,1

20,0

20,0

20,0

19,5

20,0

20,0

19,2

16,9

R10 Ratarata

18,0

19,5

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

18,0

17,1

18,1

18,4

19,4

17,1

18,5

17,9

20,0

19,3

19,1

17,1

T1

20,0

20,0

20,0

19,9

20,0

20,0

18,1

16,9

20,0

20,0

20,0

T2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T3

20,0

20,0

20,0

20,0

18,1

20,0

19,3

18,6

20,0

13,8

20,0

T4

20,0

20,0

18,0

17,1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T5

17,5

18,6

18,7

18,6

20,0

20,0

19,0

14,8

17,6

12,7

17,5

T6

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,7

13,4

20,0

16,5

20,0

T7

13,7

16,9

17,3

16,9

14,7

20,0

16,7

17,3

18,2

17,8

13,7

T8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T9

16,3

19,4

20,0

20,0

14,9

20,0

19,1

20,0

19,8

20,0

16,3

T10 Ratarata

15,2

16,8

16,7

16,0

14,0

20,0

16,1

9,3

16,1

13,2

15,2

18,3

19,2

19,1

18,9

18,2

20,0

18,6

17,0

19,2

17,4

18,3

45

Kode tikus

27Feb

28Feb

01Mar

02Mar

03Mar

04Mar

05Mar

06Mar

07Mar

08Mar

09Mar

K1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K2

17,6

20,0

18,5

20,0

20,0

20,0

16,3

15,9

16,1

15,4

12,0

K3

20,0

15,6

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

19,4

17,5

17,4

18,2

K4

20,0

20,0

20,0

18,0

15,7

16,2

13,7

14,0

13,8

18,3

19,1

K5

20,0

20,0

20,0

19,4

18,5

18,9

20,0

20,0

20,0

20,0

13,0

K6

12,9

9,9

16,0

20,0

20,0

18,0

20,0

19,2

16,8

13,5

15,2

K7

20,0

20,0

20,0

20,0

5,7

17,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

16,2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K10 Ratarata

20,0

14,9

16,3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

18,5

18,7

18,3

19,4

18,9

19,6

19,5

18,9

19,1

17,5

17,3

16,9

17,8

17,3

R1

14,2

14,7

18,4

12,7

16,2

17,8

13,9

12,8

10,6

20,0

2,3

R2

15,2

12,6

17,6

12,2

12,4

14,3

11,1

15,0

11,9

6,4

10,4

R3

18,2

19,1

20,0

20,0

19,1

14,2

15,7

13,7

15,0

16,3

15,3

R4

20,0

20,0

20,0

19,2

20,0

20,0

18,4

17,5

16,1

7,2

7,0

R5

16,7

14,5

14,6

14,8

12,3

12,9

14,2

13,3

13,3

13,7

10,2

R6

19,0

20,0

20,0

17,7

19,2

19,0

17,5

14,3

9,5

12,7

16,3

R7

19,0

17,5

19,1

16,7

20,0

20,0

16,8

19,3

16,0

17,2

10,5

R8

16,9

15,2

16,3

20,0

13,2

12,0

20,0

13,6

10,7

14,1

12,5

R9

15,4

16,7

17,7

16,7

16,2

16,8

14,2

14,0

12,5

13,2

9,5

R10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,4

17,0

18,4

17,0

16,9

16,7

16,2

15,4

13,6

14,1

11,4

T1

20,0

20,0

16,4

16,9

19,8

19,1

11,9

11,3

13,9

9,8

13,7

T2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

16,2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T3

20,0

15,7

17,9

14,0

20,0

11,8

16,0

15,1

15,6

17,0

14,2

T4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T5

20,0

20,0

13,4

10,5

11,6

13,7

17,0

16,7

13,2

14,8

12,1

T6

20,0

13,2

19,6

18,9

16,9

17,9

20,0

20,0

20,0

18,6

19,3

T7

20,0

15,0

17,5

17,9

15,9

18,8

16,3

15,1

17,0

19,1

18,1

T8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T9

20,0

19,5

20,0

18,2

19,7

20,0

18,7

19,1

15,7

20,0

18,0

T10 Ratarata

20,0

19,2

17,0

17,1

20,0

15,7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

18,3

18,2

17,3

18,4

17,3

18,0

17,7

17,5

17,9

17,5

46

Kode tikus

10Mar

11Mar

12Mar

13Mar

14Mar

15Mar

16Mar

17Mar

18Mar

19Mar

20Mar

K1

20,0

19,0

18,7

12,4

14,7

20,0

20,0

19,7

20,0

20,0

12,6

K2

20,0

16,3

12,4

12,0

17,2

17,4

20,0

17,1

20,0

20,0

20,0

K3

13,8

20,0

16,4

14,8

19,0

17,3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K4

12,8

12,7

16,5

5,0

15,1

17,9

18,8

20,0

20,0

20,0

20,0

K5

9,0

11,0

13,7

14,7

12,7

10,8

10,4

10,0

15,0

14,7

17,0

K6

14,9

18,3

15,9

16,0

14,9

15,4

16,4

15,2

12,7

20,0

15,5

K7

20,0

20,0

16,7

13,0

16,3

19,6

15,7

19,0

18,5

16,0

16,7

K8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

15,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

20,0

20,0

20,0

17,2

19,4

16,2

13,1

17,9

18,0

16,4

20,0

K10 Ratarata

20,0

14,8

14,8

17,8

20,0

20,0

17,0

17,6

14,4

16,2

20,0

16,7

17,0

16,0

11,0

16,5

18,2

19,7

19,2

20,0

20,0

18,2

R1

6,0

10,5

17,9

20,0

11,9

11,4

15,2

9,9

10,6

15,1

16,2

R2

1,9

3,3

6,2

9,9

16,1

14,8

13,4

15,0

15,5

17,5

14,0

R3

16,1

1,4

9,0

12,6

17,1

13,6

16,5

17,8

15,3

20,0

20,0

R4

6,2

9,2

13,3

14,6

15,4

16,8

15,8

20,0

16,2

20,0

19,0

R5

11,0

5,6

14,4

13,8

20,0

14,0

15,8

11,3

16,0

18,0

19,2

R6

13,9

13,4

13,1

14,8

20,0

20,0

18,7

20,0

18,9

20,0

20,0

R7

7,8

4,4

3,6

11,9

12,0

14,6

13,3

18,0

20,0

16,6

20,0

R8

13,8

13,4

14,7

11,7

14,9

17,2

13,8

20,0

19,4

15,8

20,0

R9

7,5

20,0

13,7

13,8

13,3

16,9

13,2

15,9

13,8

13,4

16,7

20,0

16,3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

10,4

9,7

12,6

14,3

16,1

15,9

15,6

16,8

16,6

17,6

18,5

T1

5,9

11,8

8,9

9,7

14,1

14,9

8,8

17,7

11,3

15,8

11,1

T2

6,9

12,5

12,2

4,9

1,9

5,1

10,2

10,5

9,4

20,0

12,8

T3

10,6

14,3

9,5

15,1

15,6

20,0

20,0

14,6

20,0

20,0

7,5

T4

20,0

20,0

16,5

10,6

10,0

20,0

20,0

5,9

20,0

20,0

20,0

T5

8,3

4,8

4,9

4,7

8,4

1,5

2,0

20,0

6,7

14,0

10,8

T6

16,0

14,8

10,7

20,0

6,3

10,0

13,5

14,3

11,5

20,0

18,8

T7

20,0

20,0

6,2

T8

20,0

20,0

20,0

8,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,6

T9

15,5

16,1

20,0

17,0

15,3

18,4

11,6

19,6

17,4

20,0

15,4

T10 Ratarata

20,0

20,0

14,7

3,4

1,9

10,1

11,1

10,9

13,1

20,0

20,0

14,3

15,4

12,4

10,4

10,4

13,3

13,0

14,8

14,4

18,9

14,9

R10 Ratarata

47

Kode tikus

21Mar

22Mar

23Mar

24Mar

25Mar

26Mar

27Mar

28Mar

29Mar

30Mar

31Mar

K1

20,0

20,0

20,0

20,0

15,3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K2

20,0

20,0

20,0

16,9

17,5

12,1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K4

20,0

20,0

20,0

16,9

17,7

12,4

18,7

14,0

20,0

20,0

20,0

K5

17,1

20,0

17,4

20,0

15,2

15,2

20,0

20,0

20,0

12,2

12,1

K6

16,2

20,0

13,1

15,4

17,0

15,2

16,6

13,4

20,0

17,5

18,2

K7

20,0

20,0

20,0

20,0

19,2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

16,0

20,0

16,8

20,0

20,0

16,8

20,0

20,0

20,0

20,0

18,4

17,6

16,1

19,7

18,5

20,0

20,0

20,0

R1

13,3

18,8

15,5

16,0

17,5

20,0

16,8

10,6

20,0

14,5

20,0

R2

14,8

12,8

14,5

12,4

15,3

14,0

17,4

16,2

20,0

19,9

16,8

R3

17,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,6

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

R4

20,0

20,0

18,2

18,0

20,0

20,0

20,0

15,5

20,0

20,0

17,9

R5

16,0

17,9

15,5

15,3

17,8

11,9

16,2

16,0

20,0

18,0

16,1

R6

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

18,3

18,9

20,0

19,1

15,9

R7

19,6

20,0

15,8

17,0

16,7

14,2

13,5

20,0

20,0

20,0

15,9

R8

16,0

16,3

15,9

12,6

18,2

12,5

19,0

19,4

20,0

14,9

20,0

R9

20,0

20,0

20,0

20,0

18,0

13,9

17,6

13,8

20,0

11,3

15,3

R10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,7

18,6

17,5

17,1

18,4

16,4

17,9

17,0

20,0

17,8

17,8

T1

19,2

18,9

12,6

15,1

16,4

20,0

20,0

20,0

18,4

11,1

20,0

T2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,5

12,8

20,0

T3

20,0

20,0

16,9

16,4

18,2

20,0

19,7

20,0

19,3

7,5

20,0

T4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T5

11,3

11,3

20,0

12,8

14,9

12,8

12,2

20,0

20,0

10,8

20,0

T6

20,0

20,0

20,0

20,0

19,1

18,6

20,0

20,0

18,9

18,8

20,0

T8

12,7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,6

20,0

T9

14,9

17,3

14,7

15,7

14,3

16,8

18,8

20,0

15,7

15,4

20,0

T10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,6

18,6

18,2

17,8

18,1

18,7

19,0

20,0

18,9

14,9

20,0

T7

48

Kode tikus

01Apr

02Apr

03Apr

04Apr

05Apr

06Apr

07Apr

08Apr

09Apr

10Apr

11Apr

K1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,6

20,0

14,0

20,0

20,0

20,0

K2

20,0

20,0

20,0

20,0

13,3

19,0

20,0

9,7

20,0

20,0

20,0

K3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K4

15,8

17,3

18,3

20,0

17,4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K5

18,4

19,3

16,5

20,0

19,5

16,4

16,9

17,5

14,6

20,0

20,0

K6

15,5

14,2

20,0

20,0

15,7

16,2

17,3

13,9

16,8

11,7

13,8

K7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

16,8

K8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K10 Ratarata

17,6

14,5

20,0

20,0

19,1

14,9

20,0

20,0

16,2

15,9

20,0

18,9

19,3

19,6

20,0

17,7

19,2

20,0

15,9

20,0

20,0

20,0

R1

19,3

11,4

19,1

20,0

20,0

20,0

14,2

15,9

11,4

13,6

13,9

R2

18,4

13,5

18,7

20,0

16,8

16,0

11,8

15,2

14,4

15,8

14,8

R3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

17,4

20,0

20,0

16,4

20,0

R4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

R5

16,0

12,9

13,5

16,0

17,3

18,6

11,8

14,2

9,0

9,4

20,0

R6

20,0

19,2

19,5

20,0

20,0

19,1

16,8

18,6

18,3

18,5

17,4

R7

20,0

14,8

11,0

12,9

20,0

20,0

20,0

18,5

17,0

10,9

8,3

R8

20,0

13,1

14,3

16,9

16,4

17,4

15,0

13,0

13,6

12,4

11,5

R9

17,7

12,4

17,7

20,0

20,0

20,0

12,9

10,8

12,5

11,6

11,6

R10 Ratarata

20,0

18,3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

19,1

15,5

17,4

18,6

19,0

19,1

16,0

16,6

15,6

14,9

15,7

T1

16,1

20,0

19,5

20,0

14,9

19,0

16,7

16,4

20,0

20,0

20,0

T2

20,0

14,6

12,3

20,0

14,7

20,0

20,0

20,0

16,7

16,6

20,0

T3

20,0

20,0

20,0

20,0

18,1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T4

20,0

20,0

20,0

20,0

18,7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T5

11,7

15,5

13,4

20,0

17,7

15,4

16,0

11,5

10,2

10,2

12,9

T6

20,0

18,0

16,7

20,0

17,1

20,0

20,0

20,0

15,5

13,4

20,0

T8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

18,5

T9

17,3

14,8

15,5

20,0

11,2

14,4

14,3

15,4

14,6

16,7

13,8

T10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

18,3

18,1

17,5

20,0

16,9

18,8

18,6

18,1

17,4

17,4

18,4

T7

49

Kode tikus

13Apr

14Apr

15Apr

16Apr

17Apr

18Apr

19Apr

20Apr

21Apr

22Apr

23Apr

K1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K3

18,6

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K5

20,0

17,0

20,0

15,5

20,0

20,0

20,0

20,0

17,9

20,0

20,0

K6

13,5

20,0

12,9

14,6

16,5

20,0

15,0

13,6

15,3

15,0

16,0

K7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K10 Ratarata

17,8

14,0

20,0

18,0

16,4

20,0

16,8

15,6

13,3

7,4

20,0

19,7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

R1

14,7

14,6

17,3

12,3

14,5

13,5

11,8

11,1

10,9

12,9

13,9

R2

15,3

16,8

16,7

17,0

17,1

13,5

15,1

15,0

16,1

13,2

18,1

R3

20,0

20,0

19,7

14,4

16,4

17,0

15,7

16,3

20,0

19,2

16,6

R4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

R5

15,7

14,0

18,0

17,5

16,4

11,4

16,0

14,7

15,9

14,8

16,2

R6

10,4

3,6

R7

12,6

14,5

19,0

16,1

13,8

13,4

15,3

14,2

12,4

14,2

15,5

R8

17,9

14,6

12,6

18,0

18,5

13,7

15,3

12,8

18,0

16,9

18,0

R9

10,7

12,2

9,2

12,9

20,0

13,6

20,0

10,7

13,7

17,2

20,0

R10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

18,3

20,0

20,0

20,0

20,0

15,7

15,0

16,9

16,5

17,4

15,1

16,4

15,0

16,3

16,5

17,6

T1

13,5

16,0

20,0

18,5

16,2

14,1

15,8

17,5

20,0

16,8

20,0

T2

20,0

13,5

15,9

14,2

20,0

16,5

20,0

15,3

19,4

16,2

11,1

T3

20,0

20,0

20,0

17,8

20,0

19,7

20,0

15,7

20,0

12,7

12,0

T4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

T5

11,3

10,9

11,8

11,0

11,8

13,0

10,2

12,3

13,2

11,5

13,9

T6

14,0

10,8

14,2

16,3

18,2

19,4

20,0

20,0

18,0

17,1

8,8

T8

8,8

20,0

16,5

15,9

20,0

18,5

20,0

17,8

20,0

20,0

20,0

T9

14,9

15,4

12,7

16,2

17,4

14,0

16,2

13,2

14,5

16,9

13,5

T10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

15,8

16,3

16,8

16,6

18,2

17,2

18,0

16,9

18,3

16,8

15,5

T7

50

Kode tikus

24Apr

25Apr

26Apr

27Apr

28Apr

29Apr

30Apr

01Mei

K1

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K2

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K3

20,0

20,0

20,0

17,1

20,0

20,0

20,0

20,0

K4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K5

20,0

20,0

20,0

20,0

18,2

19,2

20,0

20,0

K6

11,4

14,9

15,6

13,8

15,8

20,0

10,8

15,7

K7

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K8

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K9

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

K10 Ratarata

18,9

20,0

20,0

20,0

16,0

16,3

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

19,3

20,0

20,0

20,0

20,0

R1

20,0

20,0

13,5

13,2

13,2

9,4

13,1

13,3

R2

20,0

20,0

18,5

12,7

14,9

20,0

20,0

20,0

R3

16,9

20,0

16,8

20,0

20,0

19,1

19,1

17,8

R4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

R5

20,0

20,0

17,2

15,9

16,5

15,4

17,5

16,3

R7

12,3

20,0

14,2

16,3

16,7

20,0

13,2

15,1

R8

14,3

20,0

20,0

15,7

15,5

20,0

19,0

15,9

R9

11,3

14,6

18,5

12,2

15,0

16,2

13,5

17,2

R10 Ratarata

20,0

18,4

20,0

20,0

20,0

20,0

18,3

18,2

17,2

19,2

17,6

16,2

16,9

17,8

17,1

17,1

T1

7,5

16,1

20,0

20,0

15,8

13,4

20,0

20,0

T2

15,4

20,0

20,0

6,9

15,3

16,2

19,4

15,1

T3

10,9

10,6

20,0

8,0

8,4

9,1

9,6

20,0

T4

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

6,9

T5

12,6

16,6

20,0

20,0

11,2

9,5

12,6

14,9

T6

15,6

20,0

20,0

11,0

13,3

17,3

20,0

T8

15,3

20,0

20,0

15,8

20,0

19,2

20,0

20,0

T9

11,8

14,1

14,4

12,8

13,0

13,9

15,4

13,8

T10 Ratarata

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

20,0

14,3

17,5

19,4

14,9

15,2

15,4

17,4

16,7

R6

19,3

T7

51

Lampiran 5. Hasil uji homogenitas keragaman beserta uji sidik ragam terhadap berat badan tikus pada awal perlakuan Test of Homogeneity of Variances berat badan tikus (g) Levene Statistic 1,649

df1

df2 2

Sig. ,211

27

ANOVA berat badan tikus (g)

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 561,800 8318,900 8880,700

df 2 27 29

Mean Square 280,900 308,107

F ,912

Sig. ,414

Lampiran 6. Hasil uji homogenitas keragaman beserta uji sidik ragam terhadap berat badan tikus pada akhir perlakuan Test of Homogeneity of Variances berat badan tikus (g) Levene Statistic 1,216

df1

df2 2

Sig. ,313

25

ANOVA berat badan tikus (g) Sum of Squares Between Groups 10576,475 Within Groups 74376,489 Total 84952,964

df 2 25 27

Mean Square 5288,238 2975,060

F 1,778

Sig. ,190

52

Lampiran 7. Hasil uji homogenitas keragaman beserta uji sidik ragam terhadap kenaikan/selisih berat badan tikus Test of Homogeneity of Variances selisih berat badan (g) Levene Statistic ,927

df1

df2 2

Sig. ,409

25

ANOVA selisih berat badan (g)

Between Groups Within Groups Total

Sum of Squares 6716,596 56883,511 63600,107

df 2 25 27

Mean Square 3358,298 2275,340

F 1,476

Sig. ,248

Lampiran 8. Rata-rata absorbansi kultur sel pada tiap perlakuan Perlakuan Kontrol LPS Kar 48 µg/ml Kar 96 µg/ml Kar 144 µg/ml Rho 12 µg/ml Rho 24 µg/ml Rho 36 µg/ml

G6 1,364 1,244 0,593 0,737 0,710 0,526 0,555 0,710

Tikus Kontrol G7 G8 G9 1,216 0,792 1,136 1,197 1,310 1,209 0,587 0,544 0,625 0,589 0,504 0,786 0,630 0,710 0,634 0,521 0,485 0,576 0,497 0,520 0,693 0,524 0,552 0,580

G10 1,226 1,333 0,493 0,519 0,517 0,581 0,538 0,553

L2 1,467 1,323 1,169 1,475 1,549 1,268 1,466 1,226

Dosis 0,1 g/kg BB/hari L4 L5 L6 1,431 1,405 1,415 1,297 1,371 1,612 1,105 1,281 1,478 1,242 1,397 1,551 1,418 1,437 1,423 1,202 1,298 1,428 1,322 1,370 1,244 1,391 1,472 1,318

L7 1,498 1,525 1,406 1,589 1,531 1,564 1,477 1,445

S1 1,150 1,104 1,340 1,020 1,077 0,987 0,869 1,063

Dosis 1 g/kg BB/hari S3 S4 S5 1,076 1,129 0,901 0,996 1,254 1,031 1,049 1,967 0,983 1,191 1,545 1,009 1,068 1,657 0,893 0,944 1,125 0,900 0,969 1,300 0,886 1,089 1,200 0,978

Lampiran 9. Hasil uji sidik ragam terhadap nilai indeks stimulasi spontan

53

S6 0,976 0,934 0,920 0,831 1,200 0,824 0,938 0,944

Lampiran 10. Hasil uji T berpasangan terhadap nilai IS spontan dan IS dengan penambahan LPS

Lampiran 11. Hasil uji T berpasangan terhadap nilai IS spontan dan IS dengan penambahan karmoisin 48 µg/ml

54

Lampiran 12. Hasil uji T berpasangan terhadap nilai IS spontan dan IS dengan penambahan karmoisin 96 µg/ml

Lampiran 13. Hasil uji T berpasangan nilai IS spontan dan IS dengan penambahan karmoisin 144 µg/ml

55

Lampiran 14. Hasil uji T berpasangan nilai IS spontan dan IS dengan penambahan rhodamin B 12 µg/ml

Lampiran 15. Hasil uji T berpasangan nilai IS spontan dan IS dengan penambahan rhodamin B 24 µg/ml

56

Lampiran 16. Hasil uji T berpasangan nilai IS spontan dan IS dengan penambahan rhodamin B 36 µg/ml

57