Justien MAES. Promotor: Prof. Dr. Robrecht Raedt Begeleider: Bregt Van Nieuwenhuyse Vakgroep: Inwendige ziekten

Optimalisatie van diepe hersenstimulatie als behandeling voor epilepsie: evaluatie van het aanvalsonderdrukkend effect van unilaterale versus bilaterale stimulatie

Justien MAES

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Robrecht Raedt Begeleider: Bregt Van Nieuwenhuyse Vakgroep: Inwendige ziekten

Academiejaar 2012-2013

Optimalisatie van diepe hersenstimulatie als behandeling voor epilepsie: evaluatie van het aanvalsonderdrukkend effect van unilaterale versus bilaterale stimulatie

Justien MAES

Verhandeling ingediend tot het verkrijgen van de graad van Master in de Biomedische Wetenschappen

Promotor: Prof. Dr. Robrecht Raedt Begeleider: Bregt Van Nieuwenhuyse Vakgroep: Inwendige ziekten

Academiejaar 2012-2013

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”

Datum

Justien Maes

Prof. Dr. Robrecht Raedt

Voorwoord Via deze weg zou ik graag iedereen bedanken die de voorbije twee jaar heeft bijgedragen tot het realiseren van deze masterproef. Eerst en vooral zou ik graag Prof. Paul Boon, Prof. Robrecht Raedt en Prof. Kristl Vonck bedanken. Jullie maakten het mogelijk dat ik mijn masterproef in het LKEN3 kon uitvoeren. Nog een extra woord van dank voor Prof. Raedt en Prof. Vonck om mij 2 jaar lang op te volgen en te ondersteunen. Een welgemeend dankjewel gaat uit naar mijn begeleider Bregt. Zonder zijn begeleiding en raadgeving was deze masterproef nooit gelukt. Bedankt om mij kennis te laten maken met de boeiende wereld van EEG lezen, elektroden maken en omgaan met proefdieren. Ook Lore wil ik bedanken, om er altijd samen de sfeer in te houden met de vele babbeltjes en mij op te peppen als het mijn dag niet was. Met twee was het zoveel leuker dan alleen! De bende van in Gent wil ik natuurlijk ook bedanken. Laura, Tessa, Lisa, Tessa, Yana, Sherly, Jelle en Giel, we hebben de thesis-stress samen doorstaan! Daarnaast beleefden we al vijf fantastische jaren. Bedankt voor de vele leuke momenten en toffe herinneringen, er zullen er ongetwijfeld nog veel volgen eenmaal deze masterproef binnen is! Een zeer speciaal dankjewel gaat uit naar degenen die me bijstonden met raad en daad tijdens ‘de koffiepauze’. Tante Regine en Feline, echt bedankt om mij af en toe gewoon te laten uitrazen en steeds opnieuw al mijn verhalen te willen aanhoren. Idem voor nonkel Johan en Lien, bedankt voor de interesse, het nauwkeurige leeswerk en de handige excel of wordtips! Hetzelfde kan gezegd worden voor de vriendinnen van in Aalter! Telkens wanneer de frustraties zich opstapelden en de emmer (nog maar eens) overliep stonden jullie steeds klaar met een slimme opmerking, grappige tussendoortjes of gewoon deugddoende woorden van begrip en steun. Ik heb mij enorm opgetrokken aan jullie! Charlot, Nele, Fien en Ilse, ik kan mij echt geen betere best friends inbeelden! Mijn allerlaatste en belangrijkste woorden van dank gaan uit naar mijn ouders en broer. Mama, papa en Fiel, bedankt om mij gedurende deze periode te blijven steunen, ondanks mijn wisselvallig humeur. Jullie hebben mij de kans gegeven om dit te realiseren en ik ben jullie daar meer dan dankbaar voor. Ik besef dat ik nooit zou staan waar ik nu sta, zonder jullie. Dikke merci!

Inhoudstafel Inhoudstafel Samenvatting

1

1.

2

Inleiding 1.1.

Epilepsie 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4.

1.2.

Behandeling 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4.

1.3.

2. 2.1.

Algemeen Het kindling model De status epilepticus (SE) modellen

Rationale masterproef

2 2 3 6 6 6 6 7 8 9 9 9 11 12 12 12 12 13 15

Materialen en methoden

16

Test experiment NPI-stimulator

16

2.1.1. 2.1.2.

2.1.3. 2.1.4. 2.1.5. 2.1.6. 2.2.

Algemeen Klinische studies Dierexperimentele studies Werkingsmechanisme

Proefdiermodel 1.4.1. 1.4.2. 1.4.3.

1.5.

Anti-epileptische drugs (AED’s) Resectieve chirurgie Elektrische neurostimulatie Andere

Diepe hersenstimulatie (DBS) 1.3.1. 1.3.2. 1.3.3. 1.3.4.

1.4.

Algemeen Classificatie Mediale temporale kwab epilepsie (TLE) Diagnose

2

Algemeen Operatie

16 17

Nieuwe operatiemethode

17

Klassieke operatiemethode

18

Elektroden

18

EEG opname, stimulatie opstelling en EEG analyse Tresholdbepaling Experimenteel protocol Histologie

19 20 21 23

Test experiment Diego-stimulator 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4.

Algemeen Operatie Diego-stimulator Experimenteel protocol

23 23 23 23 24

2.3.

Unilaterale vs. bilaterale stimulatie 2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.3.4. 2.3.5. 2.3.6. 2.3.7.

2.4.

Dorsale vs. ventrale stimulatie 2.4.1. 2.4.2. 2.4.3. 2.4.4.

3. 3.1.

27 27 27 28

Test experimenten

29

Gebruikte operatiemethode & NPI-stimulator Diego-stimulator

Correlatie observaties met selectie & baseline in het KA-model Observaties KA-model Dorsale vs. ventrale stimulatie

Unilaterale vs. bilaterale stimulatie 3.3.1. 3.3.2.

4.

27

29

3.2.1. 3.2.2. 3.3.

Algemeen Operatie Tresholdbepaling Experimenteel protocol

24 24 24 25 25 26 26

Resultaten 3.1.1. 3.1.2. 3.2.

Algemeen Kainaat injecties Selectie d.m.v. observatie Operatie Tresholdbepaling Experimenteel protocol Statistische methode

24

Aanvalsfrequentie Aanvalsduur

29 32 32 32 35 37 37 40

Bespreking

43

4.1.

Test experimenten

43

4.2.

Observaties

44

4.3.

Unilaterale vs. bilaterale stimulatie

46

5.

Algemeen besluit

48

6.

Referentielijst

49

Samenvatting Mediale temporale kwab epilepsie (TLE) is de meest refractaire vorm van epilepsie. TLE wordt gekarakteriseerd door complexe partiële aanvallen met of zonder secundaire generalisatie vanuit de temporale kwab regio’s. Diepe hersenstimulatie (DBS) kan bij deze patiënten een potentieel voordeel bieden. Hippocampale DBS, zowel uni als bilateraal, werd al succesvol toegepast bij patiënten met refractaire epilepsie. Tot nu toe werd het effect van bilaterale hippocampale DBS nog nooit getest in een diermodel voor epilepsie. In deze studie werd getracht het potentieel voordeel van bilaterale t.o.v. unilaterale DBS aan te tonen. Hiervoor werd eerst het gebruik van bilaterale DBS in het LKEN3 geoptimaliseerd. De werking van twee stimulatoren werd vergeleken, nl. een commercieel beschikbare NPIstimulator en een custom made ‘Diego’-stimulator. Verder werden ook twee verschillende operatiemethoden geëvalueerd. Dit experiment werd gecombineerd met het experiment met de NPI-stimulator. Negen ratten werden volgens twee verschillende methoden geopereerd, 2 stierven na de operatie. Zeven ratten werden bilateraal of unilateraal gestimuleerd. Gedurende de baseline werden geen aanvallen te wijten aan een gebruikte operatiemethode geobserveerd. Tijdens stimulatie met de NPI-stimulator kregen 3/7 ratten aanvallen. Voor de test met de Diego-stimulator werden vier ratten gebruikt en deze werden zowel bilateraal als unilateraal gestimuleerd. De ratten die de stimulatie kregen zoals bedoeld was, kregen geen aanvallen. Voor de uni vs. bilaterale proef werden eerst observaties uitgevoerd over verschillende weken om de correlatie na te gaan tussen de aanvalsfrequentie tijdens observatie en tijdens EEGregistratie. Acht ratten werden geselecteerd, geopereerd en bilateraal of unilateraal gestimuleerd. De selectie werd niet gewijzigd na observatie over verschillende weken. De dieren met de hoogste aanvalsfrequentie tijdens de observatie hadden ook de hoogste aanvalsfrequentie gedurende de baseline. De bilaterale groep had een significantie reductie (pwaarde = 0,004 < 0,025) in aanvalsfrequentie van 0,568 ± 0,063 aanvallen per uur tijdens baseline naar 0,502 ± 0,076 aanvallen per uur tijdens bilaterale DBS. Twee ratten werden aanvalsvrij tijdens bilaterale DBS. Uit deze studie kan besloten worden dat de NPI-stimulator niet compatibel is met de registratie opstelling. De operatiemethoden zijn wel veilig en de Diego-stimulator lijkt veilig. Herhaling bij 6 dieren dient dit te bevestigen. De observatie lijkt een eerste betrouwbare maat voor de aanvalsfrequentie te zijn. Bilaterale stimulatie lijkt te werken, over unilaterale stimulatie kon geen besluit gevormd worden. Bij herhaling van deze proef met meer dieren zou het wel mogelijk moeten zijn om te bevestigen en significantie aan te tonen. 1

1. Inleiding 1.1. Epilepsie 1.1.1. Algemeen Epilepsie is een chronische ziekte van de hersenen die gekarakteriseerd wordt door herhaalde aanvallen. Deze aanvallen zijn het gevolg van een abnormale buitensporige elektrische ontlading in een groep van hersencellen. De ontlading kan in verschillende delen van de hersenen voorkomen (1). Eén enkele aanval duidt niet op epilepsie, tot 10% van de mensen wereldwijd hebben één aanval tijdens hun leven. Epilepsie wordt pas gediagnosticeerd bij herhaalde (twee of meer) spontane aanvallen (1, 2). Wereldwijd lijden ongeveer 50 miljoen mensen aan epilepsie. Bijna 80% van deze mensen met epilepsie komen uit ontwikkelingsgebieden (1, 3). De gemiddelde jaarlijkse incidentie varieert aanzienlijk volgens de leeftijd, zijnde 70 per 100 000 bij kinderen en adolescenten, 30 per 100 000 bij volwassenen en 100 per 100 000 bij ouderen (4). Als aanvallen niet kunnen gecontroleerd worden, kan de patiënt aanzienlijke hinder ondervinden tijdens familiale, sociale, educationele, en beroepsactiviteiten. Dit kan een diepe impact hebben op de levenskwaliteit van de patiënt (3). 1.1.2. Classificatie Epileptische aanvallen worden doorgaans geclassificeerd als focale (partiële) aanvallen en gegeneraliseerde aanvallen (5). Bij een partiële of focale aanval blijft de verandering van elektrische activiteit beperkt tot een bepaalde lokalisatie in één hemisfeer van de hersenen (6, 7). De klinische manifestatie van focale aanvallen varieert afhankelijk van de oorsprong van

Figuur 1 Aanduiding locatie temporale lob. Vanuit deze lob ontstaan de epileptische aanvallen voorkomend bij mediale temporale kwab epilepsie (MTLE) (8).

2

de epileptische ontladingen (de epileptische focus), en omvat motorische, sensorische, autonome en/of psychische symptomen (5). Epileptische aanvallen worden gedefinieerd als enkelvoudig partieel als er geen verlies is van het bewustzijn, en als complex partieel als er wel verlies is van het bewustzijn. Deze complex partiële aanvallen worden vaak psychomotorische of temporaalkwab epileptische aanvallen genoemd omdat ze gepaard gaan met automatische bewegingen en ze meestal hun oorsprong vinden in één van de temporale lobben (5, 9, Fig. 1). Indien de epileptische ontlading zich voldoende snel uitbreidt of generaliseert, en er een sterke participatie is van het motorisch systeem, resulteert dit in een convulsieve reactie die typisch zowel tonische (aanhoudende contractie) als clonische (oscillerende contracties en relaxaties) componenten bevat. Deze primair gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen worden bij sommigen voorafgegaan door prodromen zoals verhoogde prikkelbaarheid, onrust of hoofdpijn. De eigenlijke aanval treedt meestal plotseling op, waarbij de patiënt bewusteloos neervalt. De tonische fase duurt 10 tot 30 seconden en de clonische fase duurt 30 tot 60 seconden (5, 9). Absences zijn primair gegeneraliseerde aanvallen waarbij er geen sterke recrutering van het motorisch systeem voorkomt. Deze aanvallen lijken bijna onmiddellijk gegeneraliseerd te zijn. Ook focale aanvallen kunnen generaliseren, deze worden dan secundair gegeneraliseerde aanvallen genoemd (5). Op basis van de oorzaak of etiologie kan epilepsie nog verder ingedeeld worden in symptomatische, idiopathische en cryptogene epilepsie (5). De focale epilepsieën worden dan verder geclassificeerd als idiopathische focale epilepsie, waarbij geen onderliggende oorzaak wordt gevonden anders dan een mogelijke erfelijke voorbeschiktheid, of als symptomatische focale epilepsie (6, 10). De symptomatische focale epilepsieën worden verder onderverdeeld volgens de locatie van de epileptogene zone (10). In het meest recente International League Against Epilepsy (ILAE) Classification Commission verslag wordt gesuggereerd dat de termen idiopathisch, symptomatisch en cryptogeen beter vervangen worden door respectievelijk genetisch, structureel/metabool en onbekend (6). 1.1.3. Mediale temporale kwab epilepsie (TLE) Mediale temporale kwab epilepsie (TLE) is het meest voorkomende type van symptomatische focale epilepsie en wordt gekarakteriseerd door complexe partiële aanvallen met of zonder secundaire generalisatie vanuit de temporale kwab regio’s (11). De aanvallen worden typisch 3

vergezeld van bewegingsloos staren en orofaciale automatismen, dit zijn repetitieve acties zoals kauwen, met de lippen smakken of slikken (5, 12). In de meeste gevallen bestaat de ontwikkeling van TLE uit drie fasen. Een eerste fase is een initieel precipiterend trauma van de hersenen zoals koortsstuipen, hoofdtrauma, status epilepticus (SE), infectie of een beroerte die primaire structurele veranderingen initiëren. De tweede fase is een periode van 5-10 jaar waarin moleculaire en/of structurele wijzigingen plaatsvinden en de patiënten vrij zijn van symptomen of complicaties. Deze latente periode, geassocieerd met epileptogenese, gaat over in een derde fase eenmaal bij de patiënt spontane aanvallen optreden (11, 13). De latente periode definieert de duur van epileptogenese niet. De epileptogenese is een continue of progressieve functie van de tijd (14, Fig. 2).

Figuur 2 Grafische weergave van het tijdsverloop van epileptogenese. De aanvalsprobabiliteit of frequentie neemt continu toe. Dit wordt voorgesteld als een sigmoïde curve in functie van de tijd. Na het hersentrauma start een graduele toename in aanvalsfrequentie, gevolgd door een periode met een exponentiële toename. Ten slotte volgt een graduele ontwikkeling van een steady state of plateaufase (14).

Er is aanzienlijk bewijs dat de hippocampale formatie betrokken is in de initiatie van de epileptische aanval bij TLE-patiënten (15). Epileptische activiteit bij TLE omvat een netwerk van de temporale lobben en het limbisch systeem. In dit netwerk zijn volgende structuren opgenomen: de hippocampus, de amygdala, de entorhinale cortex, de laterale temporale neocortex, de mediale thalamus en de inferieure frontale lobben (16). De hippocampus is een structuur gelegen langs de dorsomediale zijde van de twee temporale lobben, posterieur van de amygdala. De hippocampale formatie kan onderverdeeld worden in drie regio’s: de gyrus dentatus, hoorn van Ammon (cornu Ammonis, (CA)) en het subiculum. De hoorn van Ammon wordt verder onderverdeeld in subregio’s: CA1, CA2, CA3 en CA4 (Fig. 3). Deze regio’s worden gedifferentieerd door variaties in de grootte van de pyramidale cellen, dit zijn de primaire neuronen in de hoorn van Ammon. De hippocampus ontvangt 4

neocorticale, subcorticale, limbische en hersenstam afferenten die via de tractus perforans van de entorhinale cortex naar de gyrus dentatus lopen. Van hieruit projecteren de axonen van de gyrus dentatus cellen (mossy fibers) naar de pyramidale neuronen in de CA3 regio (17).

Figuur 3 Afbeelding van de hippocampus van een rat met aanduiding van de CA regio’s (CA1, CA2 en CA3), het subiculum en de gyrus dentatus (18).

De meest voorkomende histopathologische bevinding bij TLE is atrofie van de hippocampus geassocieerd met neuronaal verlies in alle regio’s van de hippocampus (11). De combinatie van neuronaal verlies en verdikking van gliaweefsel (gliose), wordt hippocampale sclerose (HS) genoemd (11, 19). De hippocampus wordt aangeduid als de voornaamste bron van de oorsprong van de epileptische aanval en van het onderhouden van de aanval (20). Bovenop deze

degeneratieve

veranderingen

toont

de

epileptogene

hippocampus

neuronale

reorganisatie. Dit is bewezen door metingen van axonal sprouting en vorming van nieuwe synapsen (synaptogenese) (5, Fig. 4).

Figuur 4 Schematische voorstelling van factoren die leiden tot epileptogenese. Na het primaire trauma volgt een periode waarin structurele en moleculaire veranderingen optreden zoals gliose, neuronale celdood en mossy fiber sprouting. Ook de fysiologische veranderingen met infammatoire cytokines, adenosine homeostase en ionkanaal regulatie spelen een belangrijke rol in het ontstaan van epileptische activiteit (13).

5

1.1.4. Diagnose Een epileptische aanval wordt gedefinieerd als een overmatige losbarsting van abnormale synchrone neuronale activiteit. Dit resulteert in klinische manifestaties die plots opkomen en doorgaans van korte duur zijn. Complex partiële aanvallen, zoals deze die voorkomen bij TLE, hebben een karakteristieke klinische presentatie. Op basis van deze klinische symptomen kan reeds een eerste diagnose gesteld worden. Om verder te bepalen welke zone in de hersenen verantwoordelijk is voor de generatie van de aanvallen wordt een elektroencefalografie (EEG) meting uitgevoerd. Hierbij worden verschillende scalp elektroden op het hoofd geplaatst en wordt de hersenactiviteit gemeten. Dit wordt vaak gevolgd door een magnetic resonance imaging (MRI) opname om structurele defecten te onderzoeken (21).

1.2. Behandeling 1.2.1. Anti-epileptische drugs (AED’s) Na het stellen van een correcte diagnose wordt bij patiënten met epilepsie een chronische therapie met anti-epileptische drugs (AEDs) gestart (9). AEDs zijn structureel en functioneel divers (22). De keuze van het anti-epilepticum is afhankelijk van de aard van de aanvallen en van de eventuele bijwerkingen bij de patiënt (9). Chronische therapie met AEDs is gebaseerd op de modulatie van de corticale inhibitie/excitatie balans om epileptische aanvallen te voorkomen (3). Anti-epileptica werken op basis van membraanstabilisatie, gereduceerde neurotransmittervrijstelling of verhoogde gamma-aminoboterzuur (GABA)-gemedieerde inhibitie. Membraanstabilisatoren reduceren de exciteerbaarheid door Na2+-kanalen te blokkeren (bv. carbamazepine) of door K+-kanalen te activeren (bv. Retigabine) (22, 23). De inhibitoren van neurotransmittervrijstelling werken door Ca2+-kanalen te blokkeren (bv. Gabapentine) en de GABAmimetica werken in op het GABA metabolisme (bv. Valproaat) of werken direct in op de GABA-receptoren (bv. benzodiazepines) (22). Bij een primair gegeneraliseerde epilepsie wordt meestal natriumvalproaat (Depakine) gegeven. Bij focale epilepsie en symptomatische tonisch-clonische aanvallen is carbamazepine (Tegretol) de eerste keus (9). 1.2.2. Resectieve chirurgie Ondanks chronische therapie met AEDs zal tot 30% van de patiënten met epilepsie blijvend last hebben van aanvallen. Deze patiënten hebben refractaire epilepsie (3, 24, 25). TLE is de meest refractaire vorm van epilepsie (15). 6

Een deel van deze patiënten zal kandidaat zijn voor resectieve chirurgie. Dit is mogelijk als de ictale zone waar de aanval begint (ictal onset zone) kan geïdentificeerd worden. Deze zone is verantwoordelijk voor de generatie van de aanvallen (25). Dit gebeurt tijdens de preoperatieve evaluatie.

Deze

evaluatie

maakt

gebruik

van

klinische,

neuropsychologische,

elektrofysiologische, en radiologische gegevens om te bepalen of aanvallen hun oorsprong vinden in een focale zone. Bepaling van de epileptogene zone gebeurt bij ongeveer 85% van de patiënten op een niet-invasieve manier. De overige 15% van de patiënten vereisen intracraniële elektroden voor deze bepaling. Interictale EEG opname toont vaak epileptische activiteit aan bij patiënten met refractaire epilepsie. Specifieke interictale EEG patronen kunnen aanwijzingen geven omtrent de pathologie. Een MRI opname kan structurele defecten aan het licht brengen en eventueel een duidelijke unilaterale focus aantonen. Het uitvoeren van een langdurige ictale video EEG opname speelt een essentiële rol in de preoperatieve evaluatie. Een optimale sessie zou verschillende typische aanvallen van de patiënt moeten vastleggen. Op deze manier laat de video-opname betere karakterisatie toe van de aanvalssemiologie en wordt correlatie met het ictaal EEG vergemakkelijkt (21). Als de aanvallen multifocaal (meerdere foci), bilateraal (foci in beide hersenhelften) of gegeneraliseerd zijn, zijn de patiënten geen geschikte kandidaten voor resectieve chirurgie aangezien de ‘ictal onset zone’ niet kan gedefinieerd worden. Als de aanvallen hun oorsprong hebben in de eloquente cortex, dit is de cortex die instaat voor taalkennis en de verwerking van sensorische stimuli, zijn dit ook geen geschikte kandidaten (3, 25). Bij patiënten met epilepsie die resistent zijn voor behandeling met AEDs en niet geschikt voor resectieve chirurgie kan elektrische neurostimulatie een potentieel voordeel hebben (3). 1.2.3. Elektrische neurostimulatie Neurostimulatie wordt gedefinieerd als directe toediening van elektrische pulsen aan zenuwweefsel om zo een pathologisch substraat te moduleren en een therapeutisch effect te bereiken (24). Enkele belangrijke factoren hebben geleid tot de ontwikkeling van neurostimulatie. Ten eerste is resectieve chirurgie irreversibel en kan het nadelige effecten zoals geheugenverlies en problemen met benaming veroorzaken. Ten tweede is een aanzienlijk deel van patiënten niet vrij van epileptische aanvallen na het ondergaan van resectieve chirurgie (26). Het doel van deze behandeling is de kans op het voorkomen en verspreiden van aanvallen te reduceren (3). Twee grote stimulatie strategieën kunnen nagestreefd worden. De ene aanpak is om zich te richten tot cruciale structuren van het centraal zenuwstelsel waarvan wordt verondersteld dat ze een pacemaker, trigger of gating rol 7

in het epileptogene netwerk hebben. De andere aanpak is om potentiële interferentie met de ‘ictal onset zone’ te evalueren (24). Elektrische stimulatie kan dus op verschillende locaties in het zenuwstelsel toegediend worden. De nervus vagus stimulator stimuleert de Xe craniale zenuw in de hals. De responsieve neurostimulator (RNS) dient stimulatie toe in de regio van de aanvalsfocus, met de bedoeling de verspreiding van de gesynchroniseerde ictale ontlading te proberen te verbreken. Diepe hersenstimulatie (DBS) richt zich op specifieke diepe grijze stof structuren of vezelbanen. Open-loop methoden zoals nervus vagus stimulatie (VNS) en DBS geven chronische stimulatie. RNS is een closed-loop systeem dat enkel stimuleert als er een werkelijke aanval gedetecteerd wordt door het systeem. Op het huidige ogenblik, wordt enkel VNS toegepast voor de behandeling van refractaire partiële epilepsie. Alhoewel DBS goedgekeurd is voor de behandeling van Parkinson, is het nog niet goedgekeurd voor gebruik bij epilepsie. RNS is tot nu toe ook nog niet goedgekeurd. Tenslotte, repetitieve transcraniële magnetische stimulatie (rTMS) wordt ook nog onderzocht voor de behandeling van epilepsie (27). 1.2.4. Andere Een alternatieve behandeling voor refractaire epilepsie is het ketogeen dieet. Dit is een neuroprotectief dieet dat een hoge hoeveelheid vetten, voldoende proteïnen en weinig koolhydraten bevat. Het bootst de metabole effecten van vasten of uithongering na. Als de voorraad aan glucose niet voldoende is, worden ketonlichaampjes geproduceerd vanuit het vetzuurmetabolisme en gebruikt als hoofdenergiebron in de hersenen. Deze ketonlichaampjes hebben een anticonvulsief effect. Traditioneel wordt het dieet gebruikt bij kinderen, alhoewel er ook bewijs is van effectiviteit bij volwassenen. Tot 50% van de kinderen zal ten minste 50% reductie ondervinden in aanvallen. Eén derde kan 90% aanvalsreductie bereiken en 10% zal uiteindelijk aanvalsvrij en zelfs medicatievrij worden. De voorbije jaren zijn er meerdere alternatieve ketogene diëten ontwikkeld. Dit met het oog op het gemakkelijker en smakelijker maken van de behandeling, de bijwerkingen te verminderen en eventueel de behandeling aan een bredere groep van refractaire epilepsie-patiënten te kunnen aanbieden. Inclusief tieners en volwassenen voor wie het klassieke ketogeen dieet moeilijk te volgen is. Voor deze groepen wordt het Modified Atkins Diet (MAD) of het Low Glycaemic Index Treatment (LGIT) dieet aanbevolen, deze kunnen individueel aangepast worden aan de noden van de patiënt (28).

8

1.3. Diepe hersenstimulatie (DBS) 1.3.1. Algemeen ‘Deep brain stimulation’, DBS is directe stimulatie van specifieke hersenregio’s. Het gaat om intracraniële implantatie van één of meer elektroden in een specifieke hersenregio (25). Bij de mens worden via een geïmplanteerde pulsgenerator en een subcutane geleider elektrische pulsen verzonden naar specifieke delen van de hersenen om de neuronale activiteit van de doelwitregio te moduleren (29). Er is aanzienlijk bewijs dat de hippocampale formatie betrokken is in de initiatie van een epileptische aanval bij TLE-patiënten. DBS van het limbisch systeem is dan ook al met succes toegepast om refractaire TLE te behandelen. Meer specifiek werd hippocampale DBS reeds succesvol toegepast in de behandeling van refractaire TLE (15). 1.3.2. Klinische studies Velasco en collega’s waren de eersten om te ontdekken dat unilaterale DBS, geleverd via diepte-elektroden in de temporale regio aan één zijde, interictale en ictale epileptische activiteit verminderde bij refractaire TLE patiënten (30). Vonck en collega’s voerden een studie uit bij 3 patiënten met een normaal MRI, maar met elektroklinische bevindingen die overeenkwamen met TLE. Alle patiënten ondergingen unilaterale stimulatie (in linker of rechterhersenhelft) en hadden een reductie in aanvalsfrequentie van ten minste 50%. Deze studie toont de mogelijkheid aan van continue EEG-meting en DBS in mesiale temporale lob structuren (MTL) gebruik makend van DBS elektroden (25, 26). Dezelfde groep bestudeerde 12 patiënten met refractaire TLE waarbij intracraniële EEGmeting vereist was door normaal MRI of niet overeenstemmende resultaten tijdens de nietinvasieve preoperatieve evaluatie. Patiënten met een bilaterale focus werden bilateraal gestimuleerd (in beide hersenhelften) en patiënten met een unilaterale focus werden unilateraal gestimuleerd. Twee van de 12 patiënten met de minste respons ondergingen vervolgens een resectie van de ictale zone. Na een gemiddelde opvolgtijd van 31 maanden werd één patiënt volledig aanvalsvrij, één patiënt had een aanvalsreductie van meer dan 90%, 5 patiënten een aanvalsreductie van meer dan 50%, twee patiënten een aanvalsreductie van 30-49% en één patiënt reageerde niet op de stimulatie. Deze studie toont de mogelijke efficiëntie van langdurige DBS in MTL structuren, bij zowel patiënten met schade als patiënten zonder schade aan de hippocampus (24, 26). 9

Velasco en collega’s voerden een tweede studie uit bij 9 patiënten om de veiligheid en efficiëntie van hippocampale stimulatie te evalueren. Patiënten met een bilaterale focus werden net zoals in de studie van Boon en collega’s bilateraal gestimuleerd en patiënten met een unilaterale focus werden unilateraal gestimuleerd. Er werd geobserveerd dat hippocampale stimulatie minder efficiënt was bij patiënten met hippocampale sclerose. De 4 patiënten met zichtbare hippocampale sclerose op MRI hadden slechts een aanvalsreductie van 50% tot 70% t.o.v. een 95% aanvalsreductie bij patiënten met een normaal MRI. Er werd besloten dat hippocampale stimulatie een alternatieve therapie is voor patiënten met TLE met een normaal MRI en die geen kandidaat zijn voor resectieve chirurgie (26, 31). Het effect van continue bilaterale elektrische stimulatie van de hippocampus op aanvallen en geheugen werd nagegaan door McLachlan en collega’s. Er werden bij twee patiënten twee elektroden met vier contacten elk geïmplanteerd in de hippocampus. Simultane stimulatie van alle elektrode contacten stond aan of uit gedurende elk interval van 3 maanden. De aanvalsfrequentie tijdens stimulatie reduceerde bij beide patiënten met 33%. Drie maanden nadat de stimulatie werd afgezet bleef de aanvalsfrequentie lager dan 25% vooraleer terug te keren naar het baseline niveau. Er werden geen veranderingen in de objectieve of subjectieve metingen van het geheugen gedetecteerd. In deze studie is de algemene impact niet zo robuust zoals gerapporteerd werd in vorige studies (32). Een recente klinische studie van Boëx en collega’s evalueerde de efficiëntie en de effecten van wijzigingen in parameters van chronische amygdala-hippocampale DBS (AH-DBS) bij patiënten met TLE. Acht patiënten ontvingen chronische AH-DBS: twee patiënten met HS en 6 patiënten met een normaal MRI. In deze studie werd bij alle patiënten unilaterale stimulatie toegepast. De twee patiënten met HS verkregen een reductie van 65-75% in aanvalsfrequentie. Twee van de zes patiënten met normaal MRI werden aanvalsvrij, één hiervan zonder stimulatie, wat een microlesioneel effect suggereert. Twee patiënten hadden een reductie in aanvalsfrequentie van 65-70% en de overige twee toonden geen significante aanvalsreductie. Het merendeel van de TLE patiënten ondervindt dus op lange termijn een doeltreffende invloed van AH-DBS. Er werd geconcludeerd dat het een waardevolle behandelingsoptie is voor patiënten met refractaire epilepsie die geen kandidaat zijn voor resectieve chirurgie (33). Tenslotte volgden Vonck en collega’s hun 11 patiënten die uni- of bilaterale MTL DBS ondergingen op gedurende een gemiddelde periode van 8,5 jaar. Dit demonstreerde bij de meerderheid van de patiënten het voordelige effect van MTL DBS. Drie patiënten zijn 10

aanvalsvrij voor reeds meer dan drie jaar, drie patiënten hebben een aanvalsreductie van meer dan 90% en drie andere hebben een gemiddelde respons met een aanvalsreductie van 40% 70%. Twee patiënten hadden slechts een aanvalsreductie van 30%. Bij 3 van de 5 patiënten was het overschakelen van unilaterale naar bilaterale MTL DBS succesvol. Dit kan wijzen op een grotere effectiviteit van bilaterale MTL DBS bij de behandeling van unilaterale MTL epilepsie. Er werd ook besloten dat het overschakelen op stimulatie volgens een dag-nacht cyclus geen invloed heeft op de controle van de aanvallen. Dit kan dus gebruikt worden om de levensduur van de batterij te verlengen (34). 1.3.3. Dierexperimentele studies De eerste dierexperimentele studies vonden dat low frequency stimulation (LFS) in de hippocampus resulteerde in aanvalsinhibitie zowel op korte als lange termijn bij volledig gekindlede ratten. De meer recente studies over LFS in de hippocampus en amygdala zijn allemaal beperkt tot het kindling model. De eerste studie die gebruik maakt van een spontaan model is deze van Bragin en collega’s. Het effect van 200 Hz HFS op de snelheid van interictale pieken en spontane aanvallen werd onderzocht bij kainaat (KA)-behandelde dieren. Er werd geen significante onderdrukking gevonden van de interictale ‘events’ en spontane aanvallen (35, 36). Wyckhuys en collega’s onderzochten het effect van HFS (130 Hz) bij het kindling model. Er werd geconcludeerd dat continue HFS in de hippocampus van epileptische ratten de eigenschappen van de uitgelokte afterdischarge (AD) moduleert op een zodanige manier dat dit zich uit in een reductie van de exciteerbaarheid van de doeltwitregio (37). Dezelfde groep onderzocht het mechanisme en stimulatieprotocol van hippocampale DBS verder. Een vergelijking werd gemaakt van HFS DBS en LFS op AD bij gekindlede ratten. Er werd besloten dat HFS meer effectief is dan LFS in het beïnvloeden van de exciteerbaarheid van epileptische ratten. Dit werd gereflecteerd in een hogere AD drempelwaarde en langere AD latentie tijdens toediening van de stimulatie. Hieruit werd de hypothese opgesteld dat DBS waarschijnlijk de intrinsieke exciteerbaarheid van de gestimuleerde regio beïnvloedt door te interfereren met de intrinsieke homeostatische regulatie van de exciteerbaarheid. Een andere mogelijkheid is dat DBS interfereert met de generatie en propagatie van synchrone activiteit. Volgens deze hypothese zou interferentie met Poisson distributed stimulation (PDS) meer effectief zijn dan deze met HFS. HFS heeft een vast tijdsinterval tussen twee pulsen, PDS heeft dit niet (Fig. 5). Bij PDS worden de pulsen gegeven met een tijdsinterval volgens een Poissonverdeling, hierdoor ontstaat een niet-gesynchroniseerde stimulatie. Er werd 11

aangetoond dat bij PDS eenzelfde aantal pulsen met een significant lagere intensiteit tot een lichtjes grotere groep van responders leidt (38).

Figuur 5 High frequency stimulation (HFS) met een vast tijdsinterval tussen twee pulsen en Poisson distributed stimulation (PDS) met een tijdsinterval volgens een Poissonverdeling (15).

1.3.4. Werkingsmechanisme Als mogelijk werkingsmechanisme van DBS wordt gesuggereerd dat er een rol is voor homeostatische schaling van membraanexciteerbaarheid en/of synaptische kracht (15). Dit is een mechanisme van homeostatische plasticiteit waarbij neuronen selectief de grootte van hun functionele intrinsieke stromen (exciteerbaarheid) aanpassen als reactie op veranderingen in synaptische activiteit. Dit gebeurt op een relatieve korte termijn tijdsschaal (39). Neuronen gaan ook hun synaptische sterkte regelen als respons op het algemene niveau van synaptische activiteit. Hoge synaptische activiteit, zoals geïnduceerd bij toepassing van DBS zal dan leiden tot downregulatie van neuronale activiteit (15).

1.4. Proefdiermodel 1.4.1. Algemeen Een optimaal diermodel voor epilepsie heeft als kenmerken dat er een laag sterftecijfer is en een hoog percentage van de dieren terugkerende spontane aanvallen vertoont. Het diermodel moet ook de gedrags-, elektrografische en anatomische karakteristieke eigenschappen van humane TLE vertonen (40). Bij knaagdieren worden de spontane aanvallen uitgelokt door herseninfarct, traumatische hersenschade, koortsstuipen, kindling en status epilepticus (SE) (11). De twee meest gebruikte diermodellen voor TLE zijn het kindling model en het SEmodel (5). 1.4.2. Het kindling model In het kindling model triggert herhaalde stimulatie in de amygdala of hippocampus progressief sterkere epileptische aanvallen. De voordelen van het kindling model zijn 12

duidelijk. Nauwkeurige focale activatie van de doelwit hersenregio is mogelijk, ontwikkeling van chronische epileptogenese wordt betrouwbaar geobserveerd, het patroon van verspreiding en generalisatie van de aanval kan gemakkelijk gemonitord worden, en interictale, ictale en postictale perioden zijn gemakkelijk te manipuleren. Niettemin heeft het kindling model ook nadelen. De spontane aanvallen ontwikkelen niet tenzij een zeer groot aantal van kindling stimulaties wordt toegediend (overkindling) (5) 1.4.3. De status epilepticus (SE) modellen SE is het precipiterende trauma dat histopathologische veranderingen in temporale kwab regio’s en epileptogenese initieert, resulterend in het optreden van spontane epileptische aanvallen. SE kan geïnduceerd worden door elektrische of chemische (kainaat (KA), pilocarpine) stimulatie van de verschillende hersenregio’s. Pilocarpine (PILO) is een muscarine agonist en stimuleert net zoals acetylcholine de muscarine receptoren (41). KA is een structuuranaloog van glutamaat en wordt geïsoleerd van het zeewier Digenea simplex. Het wordt systemisch (i.p. of i.v.) of intracerebraal geïnjecteerd, dit is ook het geval bij pilocarpine (11). Multipele injecties van een lage dosis KA leiden tot de ontwikkeling van een chronische epileptische toestand. Deze wordt gekarakteriseerd door een latente periode voor het optreden van de chronisch motorische aanvallen en een hoge maar variabele aanvalsfrequentie. Deze neemt initieel toe met de tijd na de eerste chronische aanval en bereikt later een plateaufase. De aanvallen komen in het begin geclusterd voor. Eenmaal de aanvalsfrequentie toeneemt en de plateaufase bereikt wordt verdwijnt de clustering omdat de clusters niet meer kunnen onderscheiden worden (14, 40). Tenslotte zullen de ratten spontane, gegeneraliseerde tonischclonische aanvallen vertonen die sterk gelijken op deze geobserveerd bij patiënten met refractaire TLE (38). In tegenstelling tot kindling zijn deze SE-modellen gemakkelijker te produceren, maar meer variabel in hun expressie. Gebruikmakend van deze modellen, is het mogelijk om een echte epileptische rat te creëren. Daarnaast zijn de morfologische veranderingen die voorkomen in de hippocampus volgend op SE vaak zeer vergelijkbaar met deze gezien in humane mesiale TLE, alhoewel de schade in het diermodel ernstiger en meer verspreid kan zijn. De nadelen van SE-modellen zijn dat de status moeilijk kan te controleren zijn (15% van de dieren sterft tijdens de status fase met het protocol van Hellier), de expressie van de spontane aanvallen kan onvoorspelbaar zijn, en de neurale schade kan uitgebreid zijn (5, 40).

13

Figuur 6 De ontwikkeling van epileptogenese en het voorkomen van herhaalde spontane aanvallen in het kindling en status epilepticus (SE) model. Pijlen wijzen op elektrische stimulatie in het kindling model of de toediening van chemische agentia zoals kainaat en pilocarpine in het SE model. In het kindling model triggert herhaalde stimulatie progressief sterkere responsen. Als stimulatie stopt als het dier het standaard stage 5 criteria bereikt zullen spontane aanvallen niet ontwikkelen. Als kindling stimulaties verdergaan zullen spontane aanvallen typisch voorkomen na de inductie van honderden uitgelokte aanvallen (over-kindling). In het SE model is er typisch een SE die eindigt binnen enkele uren. Spontane aanvallen treden op na een latente periode die weken of maanden kan duren (5).

14

1.5. Rationale masterproef Ondanks de veelbelovende resultaten van hippocampale DBS op suppressie van epileptische activiteit in zowel experimentele diermodellen als TLE patiënten, zijn de optimale stimulatieparameters nog niet bepaald. Dit belemmert het therapeutisch potentieel van hippocampale DBS. Ook het potentieel voordeel van bilaterale DBS t.o.v. unilaterale DBS is nog niet duidelijk aangetoond. Om meer duidelijkheid te krijgen rond deze bovenstaande zaken werden verschillende experimenten uitgevoerd. Deze masterproef bestaat uit drie verschillende luiken. Enerzijds wordt een test-proef uitgevoerd. Dit om het gebruik van DBS te optimaliseren binnen het LKEN3. Hierin wordt nagegaan welke invloed een gebruikte operatiemethode heeft op de fysiologische outcome, m.a.w. kunnen DBS elektroden geïmplanteerd worden, zonder fysiologische veranderingen teweeg te brengen in de hersenen van gezonde proefdieren? Gezonde ratten worden hiervoor via twee verschillende methoden geopereerd. Verder wordt nog de veiligheid van bilaterale ongecorreleerde Poisson verdeelde stimulatie met een commercieel beschikbare NPIstimulator en custom made “Diego-stimulator” geëvalueerd. Hier wordt nagegaan of stimulatie met de stimulator in kwestie geen epileptische processen teweegbrengt in de hersenen van gezonde proefdieren. In een tweede luik wordt de correlatie nagegaan van de uitgevoerde observaties met de uiteindelijke selectie van de ratten in het KA-model. Hiervoor worden observaties uitgevoerd verspreid over verschillende weken. Wordt de selectie van de KA-ratten aangepast na het uitvoeren van deze observaties? Of is observatie op verschillende dagen in één week, m.a.w. 2 of 3 opeenvolgende dagen, voldoende voor deze selectie? Na de selectie wordt het EEG opgenomen van deze geselecteerde ratten. Op deze manier is het mogelijk om na te gaan of de aanvalsfrequentie van de ratten in het KA-model effectief nog toeneemt in de tijd. Verder wordt a.d.h.v. deze observaties en de daaropvolgende baseline nog nagegaan of de ratten die tijdens de observatie de hoogste aanvalsfrequentie hadden ook effectief de meeste aanvallen vertonen op het EEG. In het derde luik wordt het aanvalsonderdrukkend effect van unilaterale t.o.v. bilaterale stimulatie geëvalueerd. Dit om de eerder bekomen positieve resultaten van unilaterale stimulatie in het LKEN3 te bevestigen en een eventueel potentieel voordeel van bilaterale stimulatie zoals beschreven door Vonck en collega’s aan te tonen in een diermodel (15, 34, 38). 15

2. Materialen en methoden 2.1. Test experiment NPI-stimulator 2.1.1. Algemeen In dit onderzoek wordt nagegaan welke invloed de gebruikte operatiemethode heeft op de fysiologische outcome; m.a.w. kunnen DBS elektroden geïmplanteerd worden, zonder nefaste fysiologische veranderingen teweeg te brengen in de hersenen van gezonde proefdieren? Twee verschillende operatiemethoden worden uitgevoerd. Vier ratten worden geopereerd via een nieuwe operatiemethode en vier ratten volgens de klassieke operatiemethode, gebruikt in LKEN3. Tijdens de nieuwe operatiemethode worden quadripolaire elektroden gebruikt waarvan de draden gedraaid zijn, dit is niet het geval bij de klassieke operatie. Een tweede verschil tussen beide methoden is dat bij de nieuwe methode UV-hardend tandheelkundig cement gebruikt wordt, dit warmt niet op t.o.v. het tandheelkundig acrylcement gebruikt bij de klassieke operatiemethode. Er wordt gekeken of de ratten aanvallen hebben tijdens de baseline.

Figuur 7 Positie boorgaten en quadripolaire diepte-elektroden. Er worden in totaal 10 kleine ingangsplaatsen geboord; zes hiervan zijn bedoeld voor de positionering van ankerschroeven, één voor de epidurale elektrode, één voor de referentie elektrode, en twee voor diepte-elektroden. De diepteelektroden worden stereotactisch geïmplanteerd in de hippocampus (AP -5.8, DV -7.4, ML 5.1 mm t.o.v. Bregma).

Verder wordt nog de veiligheid van bilaterale ongecorreleerde Poisson verdeelde stimulatie met een commercieel beschikbare NPI-stimulator geëvalueerd. Hier wordt nagegaan of stimulatie met de stimulator in kwestie geen epileptische processen teweegbrengt in de hersenen van gezonde proefdieren. In het onderzoek worden 6 Sprague-Dawley ratten (operatiegewicht 450-550 g) gebruikt en 1 Wistar rat (580 g; Taconic, Denemarken). De dieren worden verzorgd volgens de richtlijnen 16

goedgekeurd door het Europees Ethisch Comité (decreet 86/609/EEC). De dieren worden gehouden in omgevingsgecontroleerde condities (12 u normale licht/donker cycli; 20-23°C en 50% relatieve vochtigheid) met voedsel en water ad libitum. 2.1.2. Operatie Nieuwe operatiemethode De ratten worden verdoofd met een mix van isoflurane (5% voor inductie, 2% tijdens implantatie) en medisch O2. Na blootstelling van de schedel worden 10 kleine ingangsplaatsen geboord; zes hiervan zijn bedoeld voor de positionering van ankerschroeven, één voor de epidurale elektrode, één voor de referentie elektrode, en twee voor diepte-elektroden (Fig. 7, 8A). Een zelfgemaakte epidurale elektrode wordt aan de rechterzijde van de schedel ter hoogte van de frontale cortex geplaatst. Een gelijkaardig gemaakte referentie elektrode wordt geplaatst aan de rechterzijde van de schedel, posterieur van de sutura lambdoidea (Fig. 8B). De diepte-elektroden worden stereotactisch geïmplanteerd in de hippocampus (AP -5.8, DV 7.4, ML 5.1 mm t.o.v. Bregma) (42, Fig. 8C, D). De elektroden worden naar een connector geleid die gefixeerd wordt aan de schroeven en de schedel met een UV-hardend tandheelkundig cement. Op deze manier wordt een hoedje gemaakt (Fig. 8E, F). A

B

C

D

E

F

Figuur 8 Nieuwe operatiemethode. Boorplaatsen en lokalisatie Bregma (A), plaatsing ankerschroeven en scalpelektroden (B), plaatsing rechter diepte elektrode (C), fixatie met UV-hardend tandheelkundig cement (D) en hoedje (E,F).

17

Klassieke operatiemethode De ratten worden verdoofd met een mix van isoflurane (5% voor inductie, 2% tijdens implantatie) en medisch O2. Na blootstelling van de schedel (Fig. 9A) worden 10 kleine ingangsplaatsen geboord; zes hiervan zijn bedoeld voor de positionering van ankerschroeven, één voor de epidurale elektrode, één voor de referentie elektrode, en twee voor diepteelektroden. Een zelfgemaakte epidurale elektrode wordt aan de rechterzijde van de schedel ter hoogte van de frontale cortex geplaatst. Een gelijkaardig gemaakte referentie elektrode wordt geplaatst aan de rechterzijde van de schedel posterieur van de sutura lambdoidea. De diepte-elektroden worden stereotactisch geïmplanteerd in de hippocampus (AP -5.8, DV 7.4, ML 5.1 mm t.o.v. Bregma) (42, Fig. 9B). De elektroden worden naar een connector geleid die gefixeerd wordt aan de schroeven en de schedel met tandheelkundig acrylcement (Fig. 9C). A

B

C

Figuur 9 Klassieke operatie. Lokalisatie Bregma (A), Plaatsing linker diepte elektrode (B), hoedje (C).

Na de operaties krijgen alle ratten ten minste negen dagen rust in het animalarium. Waarna ze verplaatst worden naar de EEG-registratie/stimulatie kooien. Elektroden Tijdens de operaties worden twee soorten elektroden geplaatst, nl. diepte-elektroden en scalpelektroden. De diepte-elektroden worden zelfgemaakt. Bij de nieuwe operatiemethode is dit door vier polyimide-gecoate roestvrije stalen draden te draaien op de vortex (Fig. 10B). De diepteelektroden gebruikt tijdens de klassieke operatiemethode worden zelfgemaakt door vier polyimide-gecoate roestvrije stalen draden samen te lijmen (Fig. 10A). De diepte-elektroden bestaan uit twee elektroden van 125 µm diameter (Bilaney, Düsseldorf, Duitsland) en twee binnenste elektroden van 70 µm diameter (CFW). 18

A

B

C

Figuur 10 Elektroden. Klassieke diepte elektrode, gemaakt door vier polyimide-gecoate roestvrije draden samen te lijmen (A). Getwiste diepte elektrode, gemaakt door vier polyimide-gecoate roestvrije stalen draden te draaien op de vortex (B). Scalpelektrode, gemaakt door het solderen van een schroef en een connectiepinnetje aan een geïsoleerde metalen draad (C).

Elk van de draden wordt bij beide methoden recht afgesneden, wat resulteert in een quadripolaire elektrode: de binnenste twee contactpunten zullen gebruikt worden voor intracraniële EEG (iEEG) meting. De afstand tussen de registratiepunten is 500 µm. De buitenste twee contactpunten zullen gebruikt worden voor DBS, de afstand tussen de stimulatiepunten is 3 mm. De epidurale elektrode en referentie elektrode zijn scalpelektroden die ook zelfgemaakt worden (Fig. 10C). Dit gebeurt door het solderen van een schroef (Bilaney, 1.57 mm, Düsseldorf, Duitsland) en een connectiepinnetje aan een geïsoleerde metalen draad. 2.1.3. EEG opname, stimulatie opstelling en EEG analyse De ratten worden vastgemaakt aan de swivels (Fig. 12A) en krijgen 4 dagen de tijd om te wennen aan de nieuwe omgeving, voor continue EEG-monitoring wordt gestart. Het hoedje wordt verbonden via zelfgemaakte voorversterkers (Fig. 11) en versterkers (versterking van 510x) met een NI-DAQ6259 data acquisitie kaart (National Instruments, Austin, TX, U.S.A.) en de computer.

Figuur 11 Voorversterker, zelfgemaakt door twee stukjes met een capaciteit van 10 µF te solderen aan een PCB plaatje (rechts) en aan de andere kant een IC Op Amp chip TL074 en TL082 (links) te solderen. De connectiestukjes worden boven en onderaan vastgesoldeerd aan het PCB plaatje.

19

De voorversterkers worden zelfgemaakt door op een PCB plaatje (Eurocircuits n.v., België) twee elektrolytische capaciteiten van 10 µF (16V dc, Sigma-Aldrich, België) te solderen. Aan de andere kant van het plaatje wordt een Operational Amplifier chip TL074 en TL082 (RS, U.K.) gesoldeerd. De connectiestukjes worden gemaakt door twee rijen van pinnen samen te lijmen. Deze worden bovenaan en onderaan vast gesoldeerd aan het plaatje. Het EEG wordt opgenomen met een frequentie van 2000 Hz. Deze hoge EEGopnamefrequentie is nodig om de stimulus artefacten te bepalen, die dan verwijderd worden via interpolatie. In theorie zou een sampling rate van 260 Hz (2 x 130 Hz) reeds voldoende moeten zijn. A

B

Figuur 12 Verbinding van de rat met voorversterker en met swivel(A), verbinding swivel met stimulator (B).

De analyse van het opgenomen EEG gebeurt met behulp van software. Aanvallen op het EEG worden onderscheiden van achtergrondruis doordat ze een grotere amplitude (minstens 3x groter), hoogfrequente activiteit van minimum 5 Hz en een duur van minimum 10 seconden hebben. De parameters zijn het aantal aanvallen en de duur van de aanvallen. 2.1.4. Tresholdbepaling Tijdens de laatste drie dagen van deze herstelperiode worden de stimulatie drempelwaarden (treshold) bepaald voor alle dieren. Op de eerste dag wordt de unilaterale drempelwaarde in de rechterhippocampus bepaald. Op de tweede dag wordt de unilaterale drempelwaarde in de linkerhippocampus bepaald. De derde dag wordt de bilaterale hippocampale stimulatie drempelwaarde bepaald. Gebaseerd op deze drempelwaarden wordt de stimulatie intensiteit ingesteld voor elk dier individueel, voor unilaterale (in de rechter hippocampus) en bilaterale hippocampale therapeutische stimulatie. De tresholdbepaling wordt telkens uitgevoerd op hetzelfde tijdstip van de dag bij een enkelvoudig experiment of een groep van experimenten (9u – 11u). De stimulatie intensiteit voor continue therapeutische hippocampale DBS wordt bepaald door het geven van een 10s 20

pulstrein. Deze pulstrein is identiek aan de stimulatie die zal gebruikt worden tijdens de continue therapeutische stimulatie, m.a.w. 130 Hz, PDS en een pulsbreedte van 100 µs. Deze 10s worden gevolgd door een 1 minuut durende OFF periode gedurende dewelke het EEG geëvalueerd kan worden op het voorkomen van stimulatie geïnduceerde after discharge (Fig. 13). De eerste 10s pulstrein bestaat uit stimulatie pulsen met een amplitude van 25 µA, en de stimulatie intensiteit wordt met elke puls stapsgewijs opgedreven met 25µA, totdat een after discharge geobserveerd wordt. Stimulatie intensiteit voor de therapeutische stimulatie wordt dan ingesteld op de AD-uitlokkende intensiteit – 50 µA. De maximaal gebruikte stimulatie intensiteit is 500 µA.

Figuur 13 Grafiek met uitzetting van de pulsen (µA) gegeven tijdens de tresholdbepaling. De eerste 10s pulstrein bestaat uit stimulatie pulsen met een amplitude van 25 µA, en de stimulatie intensiteit wordt met elke puls stapsgewijs opgedreven met 25 µA, totdat een after discharge geobserveerd wordt. De 10s worden gevolgd door een 1 minuut durende OFF periode gedurende dewelke het EEG geëvalueerd kan worden op het voorkomen van stimulatie geïnduceerde after discharge.

Indien geen drempelwaarde kan bepaald worden met stimulatie in de rechterhippocampus, worden de ratten geëxcludeerd uit het volledige experiment. Als er geen drempelwaarde bepaald kan worden met stimulatie in de linkerhippocampus of tijdens bilaterale hippocampale stimulatie, wordt de rat geëxcludeerd voor het bilaterale hippocampale DBS deel van het cross-over design. 2.1.5. Experimenteel protocol Na bepaling van de drempelwaarde start continue video-EEG meting (24u/24u) met 10 dagen van continue baseline EEG meting, gebruikt om te bepalen of implantatie van de elektroden via één van bovenstaande operatiemethoden bij de ratten spontane aanvallen veroorzaakt. Na de baseline worden twee ratten van de nieuwe operatie groep en twee van de klassieke operatie groep onderworpen aan continue bilaterale hippocampale DBS. De andere vier ratten worden onderworpen aan continue unilaterale hippocampale DBS om te bepalen of zowel het 21

unilaterale als het bilaterale DBS protocol veilig is om uitgevoerd te worden met de NPIstimulator (Fig. 14). Deze stimulatieperiode van 10 dagen wordt dan gevolgd door een 10 dagen durende wash-out periode, nodig om mogelijke langdurige effecten te detecteren. Elke dag van continue video-EEG meting wordt het correct functioneren van de opstelling gecontroleerd.

Figuur 14 NPI-stimulator

Om te starten met de therapeutische stimulatie, wordt de stimulatie intensiteit stapsgewijs opgevoerd tot de eerder bepaalde stimulatie intensiteit (gebaseerd op de drempelwaarde bepaling) bij elk dier individueel. Bij het stapsgewijs opvoeren start de stimulatie intensiteit op 50% van de gewenste stimulatie intensiteit. De stimulatie intensiteit wordt dan elke minuut met 10% opgevoerd totdat de gewenste stimulatie intensiteit bereikt wordt. Als stimulatie geïnduceerde aanvalsactiviteit geobserveerd wordt tijdens het stapsgewijs opvoeren, wordt het opvoeren gestopt, en de stimulatie intensiteit wordt dan gehouden op de laatste stimulatie intensiteit tijdens dewelke geen stimulatie geïnduceerde aanvalsactiviteit werd geobserveerd, voor de duur van de volgende stimulatieperiode. Tijdens de stimulatieperioden wordt de elektrode impedantie dagelijks gemeten (9u-9u30) met de IMP-2 metalen elektrode impedantie tester. De impedantie wordt telkens van beide elektroden getest, ook als een rat enkel unilaterale stimulatie ondergaat. Op deze manier weet men dat als de impedantie slechts bij één van beide elektroden verandert, er mogelijks een probleem is met deze elektrode. Om de impedantie te testen geeft de IMP-2 metalen elektrode impedantie tester een sinusgolf stimulus met een frequentie van 1 kHz, en een teststroom van minder dan 40 nA. Deze lage teststroom laat het gebruik van deze impedantie tester in vivo toe.

22

2.1.6. Histologie Na uitvoeren van het experiment worden de ratten diep verdoofd met pentobarbital (100 mg/kg, i.p.) en transcardiaal geperfuseerd met ‘phosphate buffered saline’ (PBS) gevolgd door formol. Vooraleer de perfusie start wordt heparine (0.1 mg) ingespoten rechtstreeks in het hart om stolling van het bloed tegen te gaan. De hersenen worden verwijderd en in een formol oplossing geplaatst gedurende tenminste 24u. De hersenen worden getransfereerd naar een oplossing die 30% sucrose bevat en dan bevroren. Coronale slices (70 µm) die de hippocampus en de elektrode kanalen bevatten worden gesneden en op draagglaasjes gelegd. Er wordt een Nissl kleuring uitgevoerd op de slices en deze worden afgedekt. De locatie van de elektroden wordt geïdentificeerd via lichtmicroscopie.

2.2. Test experiment Diego-stimulator 2.2.1. Algemeen In dit onderzoek wordt de veiligheid van de custom made “Diego-stimulatoren” geëvalueerd. Er worden 4 Wistar ratten gebruikt (operatiegewicht 380-450 g; Taconic, Denemarken). 2.2.2. Operatie Deze ratten worden geopereerd volgens de nieuwe operatiemethode met het verschil dat voor het maken van het hoedje tandheelkundig acrylcement gebruikt wordt, en enkel voor de plaatsing van de elektroden het UV-hardend cement. Operaties, tresholdbepalingen, impedantie-metingen, stimulatie, EEG-analyse, verzorging en histologie worden uitgevoerd zoals hoger beschreven. 2.2.3. Diego-stimulator A

B

C

D

Figuur 15 Diego-stimulator (A, B, C) en overzicht opstelling (D).

23

2.2.4. Experimenteel protocol De 4 Wistar ratten worden 5 dagen gestimuleerd met bilaterale DBS, gevolgd door 5 dagen van unilaterale DBS.

2.3. Unilaterale vs. bilaterale stimulatie 2.3.1. Algemeen In dit onderzoek wordt gebruik gemaakt van het intraperitoneaal KA rat model. Hierbij wordt KA intraperitoneaal geïnjecteerd. Als gevolg hiervan ontwikkelen de proefdieren een status epilepticus die op zijn beurt aanleiding geeft tot spontane epileptische aanvallen. In het onderzoek worden 8 Sprague-Dawley ratten (operatiegewicht 400-565 g; Taconic, Denemarken) gebruikt. 2.3.2. Kainaat injecties In dit experiment wordt het KA-model gebruikt. Dit omdat het labo hier reeds veel ervaring mee heeft en er in vergelijking met het PILO-model meer spontane aanvallen optreden. De ratten worden intraperitoneaal geïnjecteerd met KA (KA; Tocris Bioscience, U.S.A.) met een concentratie van 5 mg/kg om het uur (38). Na behandeling met KA sterft ongeveer 15% van de ratten. Er worden in totaal 35 ratten geïnjecteerd met KA, uit vorige studies in het labo blijkt dat dit aantal voldoende is om uiteindelijk 16 ratten te kunnen selecteren met voldoende spontane aanvallen. Eenmaal een rat extreme inactiviteit of activiteit vertoont worden de volgende injecties uitgesteld of gereduceerd tot 2,5 mg/kg per 30 minuten. De injecties worden aangepast omdat werd geobserveerd dat dit gedrag frequent vooraf gaat aan sterfte als de behandeling voortgaat aan dezelfde snelheid. Extreme inactiviteit wordt gedefinieerd als wanneer de rat amper nog beweegt en op één locatie in de kooi ligt. Het dier ligt niet te slapen, de ogen zijn open. Extreme activiteit wordt gedefinieerd als wanneer de rat continu in rondjes loopt, springt en/of in de hoek van de kooi staat en overmatig snuift (40). De behandeling wordt voortgezet totdat de dieren in SE zijn. Dit wordt gedefinieerd als het krijgen van 5 stage III-V aanvallen volgens de schaal van Racine in het voorbije uur. 2.3.3. Selectie d.m.v. observatie Elf tot twaalf weken na de injectie met KA worden de ratten geselecteerd op basis van het aantal aanvallen die ze doen in een bepaalde periode, de 8 ratten met het hoogste aantal stage III-V aanvallen worden gebruikt voor de studie en dus geopereerd.

24

Om de aanvallen te scoren wordt gebruik gemaakt van de schaal van Racine. Deze verdeelt de aanvallen in 5 klassen. Bij een aanval van klasse I zijn de gedragskenmerken: immobiliteit, gesloten ogen, trekkingen van de neusharen, faciale clonus en wet dog shakes. Bij klasse II zijn dit knikken met hun hoofd, kauwen, ernstige faciale clonus en wet dog shakes (43-45). Bij een aanval van klasse III vertonen de dieren een clonus van één van de voorste ledematen met een lordotische houding. Bij klasse IV staan ze op hun achterpoten en hebben ze een clonus van beide voorste ledematen en bij klasse V hebben ze een aanval volgens klasse IV en vallen ze omver door een verlies aan evenwicht (40, 43-45). Enkel de motorische aanvallen (klasse III-V) worden gescoord, dus klassen I en II worden niet gescoord. Het krijgen van minstens 2 stage III-V aanvallen in een periode van 6 uur wordt gebruikt als selectiecriterium. Er wordt geobserveerd over verschillende weken om na te gaan of dezelfde ratten zouden geselecteerd worden onafhankelijk van het tijdstip van de observatie. Ook willen we nagaan of er bij de ratten over de verschillende weken effectief meer aanvallen worden geobserveerd. Verder wordt ook nagegaan of het aantal geobserveerde klinische aanvallen gecorreleerd kan worden met het aantal geobserveerde elektrografische aanvallen tijdens de baselineperiode waarin continu EEG geregistreerd wordt. Hiervoor zal ook de data uit de baselineperiode van het uni vs. bilaterale experiment gebruikt worden. 2.3.4. Operatie De ratten worden geopereerd volgens de operatiemethode beschreven bij het test experiment met de Diego-stimulator. Na de operatie krijgen de ratten 3 dagen rust om te herstellen van de operatie in het animalarium. Daarna worden ze verplaatst naar de EEG-meting/stimulatie kooien voor nog 5 dagen rust. 2.3.5. Tresholdbepaling De ratten worden vastgemaakt aan de swivels en krijgen 4 dagen de tijd om te wennen aan de nieuwe omgeving voor continue EEG-monitoring wordt gestart. Tijdens deze rustdagen wordt de dagelijkse verzorging uitgevoerd identiek aan de verzorging die gegeven zal worden tijdens het experiment, m.a.w. wekelijks kuisen van de kooien, dagelijkse controle van de vochtigheid en temperatuur, en dagelijkse controle van de fysische conditie.

25

Tijdens de laatste drie dagen van de herstelperiode worden de stimulatie drempelwaarden bepaald voor alle dieren zoals hoger beschreven. Indien geen drempelwaarde kan bepaald worden met stimulatie in de rechter of linkerhippocampus, worden de ratten geëxcludeerd uit het volledige experiment. 2.3.6. Experimenteel protocol Na bepaling van de drempelwaarde start continue video-EEG registratie (24u/24u) met 10 dagen van continue baseline EEG registratie gebruikt om de baseline aanvalsfrequentie te bepalen in alle ratten. Na de baselineperiode worden de ratten ingedeeld in 2 groepen zodat een gelijke verdeling in dagelijkse aanvalsfrequentie bekomen wordt. De ene groep wordt dan onderworpen aan unilaterale hippocampale DBS in de rechterhippocampus, en de andere groep wordt onderworpen aan bilaterale hippocampale DBS (Fig. 16). Elke dag van continue video-EEG opname wordt het correct functioneren van de opstelling gecontroleerd. Het stapsgewijs opvoeren van de stimulatie, het meten van de impedantie en de EEG-analyse worden uitgevoerd zoals hoger beschreven.

KA-injectie Oktober

Selectie na 11-12 w

Operatie Maart

Rust (8 d)

Baseline EEG (10 d)

Stimulatie (10 d)

Figuur 16 Tijdsschema van het onderzoek. De KA-injecties worden uitgevoerd in oktober. Selectie gebeurt d.m.v. observatie 11 tot 12 weken na injectie. Vervolgens worden de ratten in maart geopereerd en krijgen ze 8 dagen rust. Hierna wordt gestart met 10 dagen EEG opname (baseline) gevolgd door 10 dagen stimulatie en 10 dagen wash-out.

2.3.7. Statistische methode De verkregen data uit de gemeten iEEGs zijn het aantal aanvallen en de duur van de aanvallen. De data worden uitgedrukt als gemiddelde (mean) en standard error of the mean (SEM). Statistische evaluatie van de aanvalsfrequentie en aanvalsduur wordt uitgevoerd door gebruik te maken van de Wilcoxon signed ranks test indien de data niet normaal verdeeld is en een t-test indien de data normaal verdeeld is. P-waarde < 0,025 wordt aangenomen om een significant verschil aan te tonen. Er wordt een Bonferroni correctie van 2 toegepast aangezien telkens twee groepen met elkaar vergeleken worden.

26

2.4. Dorsale vs. ventrale stimulatie 2.4.1. Algemeen In dit experiment worden 5 Sprague-Dawley ratten geopereerd, 243 dagen na injectie met KA (operatiegewicht 430-530 g; Taconic, Denemarken). Er wordt geen observatie uitgevoerd omdat de ratten reeds lange tijd (243 dagen) geïnjecteerd werden en er dus van wordt uit gegaan dat ze allemaal spontane aanvallen vertonen. 2.4.2. Operatie In dit experiment wordt de klassieke operatiemethode gebruikt zoals hoger beschreven. Er worden in totaal 12 ingangsplaatsen geboord, 5 ingangsplaatsen voor de elektroden en 7 voor de ankerschroeven (1,57 mm diameter; Bilaney, Düsseldorf, Duitsland). Er wordt gebruik gemaakt van bipolaire diepte-elektroden. Deze worden zelfgemaakt door twee polyimide-gecoate roestvrije stalen draden samen te lijmen. De diepte elektrode bestaat uit twee elektroden van 125 µm diameter (Bilaney, Düsseldorf, Duitsland; afstand tussen de punten: 500 µm). Er worden 2 bipolaire DBS-diepte-elektroden stereotactisch geplaatst, één in de dorsale rechterhippocampus (AP -3,8; ML +2,2; DV -4,0 t.o.v. Bregma ) en één in de ventrale rechterhippocampus (AP -5,1; ML +4,2; DV -8,4 t.o.v. Bregma). Verder worden er 2 bipolaire diepte-elektroden stereotactisch geplaatst voor de intracraniële EEG-opname (iEEG), één in de rechterhippocampus en één in de linkerhippocampus (AP -5,6; ML +/- 5,10; DV -6,4 t.o.v. Bregma) (42). De zelfgemaakte epidurale referentie-elektrode wordt aan de linkerachterzijde van de schedel geïmplanteerd t.h.v. de sutura lambdoidea. 2.4.3. Tresholdbepaling Tijdens de laatste drie dagen van de herstelperiode worden de stimulatie drempelwaarden bepaald voor alle dieren zoals hoger beschreven. Op de eerste dag wordt de drempelwaarde in de dorsale rechterhippocampus bepaald. Op de tweede dag wordt de drempelwaarde in de ventrale rechterhippocampus bepaald. De derde dag wordt de gecombineerde dorsale en ventrale stimulatie drempelwaarde bepaald in de rechterhippocampus. Gebaseerd op deze drempelwaarden wordt de stimulatie intensiteit ingesteld voor elk dier individueel, voor dorsale, ventrale en gecombineerde (allen in de rechter hippocampus) therapeutische stimulatie.

27

Indien geen drempelwaarde kan bepaald worden met stimulatie in de dorsale of ventrale rechterhippocampus, worden de ratten geëxcludeerd uit het volledige experiment. 2.4.4. Experimenteel protocol Na de operatie krijgen de ratten 1 tot 2 weken rust om te herstellen van de operatie voor continue EEG-monitoring wordt gestart. Dezelfde opstelling werd gebruikt zoals hoger beschreven. Het experiment start met 10 dagen van continue EEG-monitoring, gebruikt om de baseline aanvalsfrequentie te bepalen en alle andere parameters van de ratten. Na het baseline EEG worden de ratten gedurende 10 dagen continu (24h/24h) gestimuleerd met dorsale hippocampale DBS. De stimulatie gebeurt zoals hoger beschreven volgens een Poissonverdeling met gemiddelde en variantie 1/130 s, hierdoor is de gemiddelde frequentie 130 Hz. Na 10 dagen van continue stimulatie volgt een 10 dagen durende wash-out periode. Deze periode wordt gebruikt om de langer durende effecten te bepalen. Hierna volgt 10 dagen ventrale stimulatie, opnieuw gevolgd door 10 dagen wash-out. Uiteindelijk wordt dan afgesloten met een 10 dagen durende periode van gecombineerde dorsale en ventrale stimulatie gevolgd door nog een laatste wash-out periode van 10 dagen (Fig. 17). Het stapsgewijs opvoeren van de stimulatie, het meten van de impedantie, de EEG-analyse en de histologie worden uitgevoerd zoals hoger beschreven.

operatie + rust

baseline (20d)

dorsale stimulatie (10d)

wash-out (10d)

ventrale stimulatie (10d)

wash-out (10d)

D&V stimulatie (10d)

wash-out (10d)

Figuur 17 Tijdsschema van het onderzoek. Na de operatie krijgen de ratten rust voordat 20 dagen van continue EEG opname gestart wordt. Dit wordt gevolgd door 10 dagen dorsale stimulatie en 10 dagen wash-out. Vervolgens start 10 dagen van ventrale stimulatie gevolgd door 10 dagen wash-out. Hierna volgt nog 10 dagen van gecombineerde dorsale en ventrale stimulatie gevolgd door een laatste wash-out periode van 10 dagen.

28

3. Resultaten 3.1. Test experimenten 3.1.1. Gebruikte operatiemethode & NPI-stimulator In totaal werden uiteindelijk 9 ratten geopereerd. Zes volgens de klassieke operatiemethode en drie volgens de nieuwe operatiemethode. Twee ratten stierven na de operatie, Wistar BVN 2 en C7 (Tabel 1). Tabel 1 Overzicht operaties test-experiment.

ID

gewicht (g)

ras

operatiemethode

C1

490

SD

"klassiek"

Wistar BVN 1

580

Wistar

"klassiek"

Wistar BVN 2

685

Wistar

"klassiek"

C3

476

SD

"nieuw"

C4

537

SD

"nieuw"

C5

455

SD

"klassiek"

C6

528

SD

"nieuw"

C7

466

SD

"klassiek"

C8

458

SD

"klassiek"

datum overlijden

22/02/2013

23/02/2013

SD: Sprague-Dawley

Na bepaling van de drempelwaarden werden de ratten onderverdeeld in twee groepen, respectievelijk een groep die unilaterale stimulatie onderging en een groep die bilaterale stimulatie onderging met de NPI-stimulator (Tabel 2). Tabel 2 Overzicht onderverdeling in unilaterale of bilaterale stimulatie en gebruikte elektroden.

ID

Stimulatie

Elektroden

C1

unilateraal

gekleefd

Wistar BVN1

unilateraal

gekleefd

C8

unilateraal

gekleefd

C3

unilateraal

twisted

C5

bilateraal

gekleefd

C4

bilateraal

twisted

C6

bilateraal

twisted

29

Tijdens de baselineperiode werd een aardingslus gecreëerd tijdens het proberen oplossen van storing op het EEG. C3 kreeg hierna aanvallen en ging in status (Fig. 18). Geen enkele andere rat kreeg aanvallen. Verder werd ook geobserveerd dat het loskomen van een rat ook te zien was op het EEG van alle andere ratten, en dat deze op dit moment allemaal een stroompuls kregen (Fig. 19).

Baseline Aantal aanvallen/dag

30 C1

25

C3

20

C4 15

C5

10

C6

5

C8 WBVN1

0 day 1 day 2 day 3 day 4 day 5 day 6 day 7 day 8 day 9 day 10

Figuur 18 Grafiek met gemiddelde aanvallen per dag per rat tijdens de baselineperiode. De aanvallen en daaropvolgende status van C3 zijn te verklaren door het creëren van een aardingslus tijdens het proberen oplossen van storing.

Figuur 19 EEG tijdens stimulatie. Als er een rat loskomt (op figuur de bovenste) valt het signaal ook weg op de andere kanalen en krijgen alle dieren een puls toegediend. De breedte van de figuur stelt 40 seconden voor.

Tijdens de stimulatieperiode ontwikkelden 3 ratten aanvallen; C4, C8 en WBVN1 (Fig. 20). Om deze reden werd de stimulatie gestopt na 3 dagen. Er hadden twee ratten (C8 en WBVN1) aanvallen die geopereerd werden volgens de klassieke operatiemethode en één rat (C4) aanvallen die geopereerd werd volgens de nieuwe operatiemethode. C4 en C8 werden bilateraal gestimuleerd, WBNV1 unilateraal. 30

Stimulatie Aantal aanvallen/dag

12 C1

10

C3

8

C4 6

C5

4

C6

2

C8

0

WBNN1 day 1

day 2

day 3

Figuur 20 Grafiek met gemiddelde aanvallen per dag per rat tijdens de stimulatieperiode. C4, C8 en WBVN1 ontwikkelden aanvallen, om deze reden werd de stimulatie gestopt na 3 dagen.

Op dag 4 van de wash-out periode is het hoedje van C4 losgekomen, deze rat werd dezelfde dag nog geperfuseerd. Tijdens deze wash-out kreeg C3 terug aanvallen (Fig. 21).

Wash-out Aantal aanvallen/dag

6 C1

5

C3

4

C4 3

C5

2

C6

1

C8

0

WBVN1 dag 1

dag 2

dag 3

dag 4

dag 5

Figuur 21 Grafiek met gemiddelde aanvallen per dag per rat tijdens wash-out periode. C3 vertoont opnieuw aanvallen.

De locatie van de elektroden werd geïdentificeerd via lichtmicroscopie. De positie van de elektroden was bij alle ratten goed, nl. zowel links als rechts in de hippocampus. Er is geen direct oorzakelijk verband zichtbaar tussen de aanvallen en schade of bloeding rond de elektroden of in de hippocampus, veroorzaakt door de stimulatie. C3 had aanvallen tijdens de baseline en wash-out t.g.v. het creëren van een aardingslus met een DC offset. Deze rat had aan beide elektroden een bloeding en een verbrede elektrodegang. C4 had aanvallen tijdens de stimulatie en aan beide elektroden een minimale hoeveelheid bloed. Bij C8 en WBVN1, die ook aanvallen hadden tijdens de stimulatie, was er geen schade of bloeding zichtbaar rond de elektroden. Verder had C1 schade en bloeding rond de rechterelektrode en links een minieme 31

hoeveelheid bloed rond de elektrode. C5 had een minimale hoeveelheid bloed aan de rechterelektrode en aan de linkerelektrode een bloeding en een verbrede elektrodegang. Bij C6 was er geen schade of bloeding zichtbaar rond de elektroden. 3.1.2. Diego-stimulator Tijdens de bilaterale stimulatieperiode ontwikkelde LJB controle 1 aanvallen op dag 3 en 4. LJB controle 2 had een aanval op de vijfde stimulatiedag (Fig. 22). Beide dieren kwamen los van hun swivel tijdens de stimulatie en werden opnieuw verbonden zonder de stimulatie te stoppen. Hierdoor werd de stimulatie meteen toegediend zonder deze eerst op te bouwen zoals hoger beschreven.

Aantal aanvallen/dag

Bilaterale stimulatie 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

LJB controle 1 LJB controle 2 LJB controle 3 LJB controle 4

day 1

day 2

day 3

day 4

day 5

Figuur 22 Grafiek gemiddelde aanvallen per rat per dag tijdens de bilaterale stimulatieperiode.

Tijdens de unilaterale stimulatieperiode kreeg geen enkele rat een aanval. De locatie van de elektroden werd geïdentificeerd via lichtmicroscopie. De positie van de elektroden was bij alle ratten goed, nl. zowel links als rechts in de hippocampus, en er werd geen schade gedetecteerd.

3.2. Correlatie observaties met selectie & baseline in het KA-model 3.2.1. Observaties KA-model De ratten werden geïnjecteerd met KA op 31 oktober 2013. De eerste observatie vond plaats 83 dagen na de injecties. Volgende observaties volgden op 84, 92, 113 en 120 dagen na injectie (Fig. 23). Op deze manier werden de observaties uitgevoerd over een periode van verschillende weken. De eerste twee observatiedagen werd geobserveerd gedurende 8 uur, nl. van 8u45 tot 16u45. De volgende observatiedagen werd geobserveerd gedurende 6 uur, nl. van 9u tot 15u. 32

Het selectiecriterium is minstens 2 aanvallen gedurende de 8 uur durende observatieperiode, of 6 aanvallen in 24u. Omdat deze selectie niet voldoende ratten opleverde, werd het selectiecriterium aangepast naar minstens 1 aanval gedurende de 8 uur durende observatieperiode, of 3 aanvallen in 24u. Op basis van de aanvallen die geobserveerd werden op deze verschillende tijdstippen werden telkens ongeveer dezelfde ratten geselecteerd. LJB 1, 5, 6, 9, 12, 18, 26 en 30 werden geselecteerd na de eerste 2 observatiedagen. LJB 5 en 6 zijn gestorven gedurende de verdere observatieperiode. LJB 30 is gestorven na de operatie. Met de data van alle observaties werden uiteindelijk nog LJB 14, 15 en 17 toegevoegd aan de selectie (Fig. 23). LJB 20 werd niet geselecteerd omdat deze zich enorm verzwakt vertoonde en gevreesd werd de verdoving en operatie niet te overleven. LJB 28 stierf in de periode tussen de observatie en de operatie en kon om deze reden ook niet geselecteerd worden. Aan de vroegere selectie veranderde niets. Het lijkt dus geen extra voordeel te hebben om verschillende observaties verspreid over verschillende weken uit te voeren. LJB1

Aantal aanvallen/observatiedag

Aanvallen per observatiedag

LJB5

40

LJB6

35

LJB9 LJB12

30

LJB14 25

LJB15

20

LJB17

15

LJB18 LJB20

10

LJB24

5

LJB26 LJB28

0 SE + 83d

SE + 84d

SE + 92 stage 3+4+5

SE + 113

SE + 120

LJB30 LJB33

Figuur 23 Grafiek met aantal aanvallen per observatiedag (24u) per rat (15 ratten). Op basis van het selectiecriterium minimum 1 aanval gedurende de 6 uur durende observatieperiode zouden telkens dezelfde selectie gemaakt worden.

Voor de uni vs. bilaterale proef werden de overige 8 ratten geopereerd. Gedurende de verschillende observatiedagen is een duidelijke toename zichtbaar in aantal aanvallen bij LJB 9 en 12 (Fig. 24). Bij LJB 18 is een lichte toename zichtbaar. Dit is niet het geval bij de andere ratten.

33

Aantal aanvallen/observatiedag

Aanvallen tijdens observatie 40 35 30 25

stage 3+4+5 SE + 83d

20

stage 3+4+5 SE + 84d

15

stage 3+4+5 SE + 92d

10

stage 3+4+5 SE + 113d

5

stage 3+4+5 SE + 120d

0

Figuur 24 Grafiek met aantal aanvallen per rat per observatiedag (8 geselecteerde ratten voor operatie). Een duidelijke toename in aanvalsfrequentie is zichtbaar bij LJB 9 en 12.

Gedurende de 10 dagen durende baselineperiode van de uni vs. bilaterale proef werd het EEG opgenomen (Fig. 25). Deze startte 142 dagen na injectie. Hierin is een duidelijke toename in aanvalsfrequentie zichtbaar over de 10 dagen bij LJB 14, 15, 17 en 18. Bij LJB 1, 9, 12 en 26 is dit niet zichtbaar.

Aantal aanvallen/dag

Aanvallen op het EEG

dag 1

140

dag 2

120

dag 3

100

dag 4

80

dag 5 dag 6

60

dag 7

40

dag 8

20

dag 9 0 LJB 1

LJB 9

LJB 12

LJB 14

LJB 15

LJB 17

LJB 18

LJB 26

dag 10

Figuur 25 Grafiek met gemiddeld aantal aanvallen per rat gedurende de baselineperiode (10d). Er is een duidelijke toename in aanvalsfrequentie zichtbaar bij LJB 14. 15. 17 en 18. Bij LJB 1. 9. 12 en 26 is dit niet het geval.

Vergelijking van de dieren met de hoogste aanvalsfrequenties gedurende de observatie met deze gedurende de baseline, wijst uit dat LJB 1, 9 en 26 in beide perioden deel uitmaken van de groep met de hoogste aanvalsfrequentie (Tabel 3). Er werd een Spearman’s correlatie uitgevoerd, deze was 0,565 en bereikte geen significantie (p-waarde = 0,145 > 0,05).

34

Tabel 3 Vergelijking van de gemiddelde aanvalsfrequentie per dag gedurende de observatie (klinisch geobserveerde aanvallen) en de baseline (elektrografische aanvallen).

ID LJB1 LJB9 LJB12 LJB14 LJB15 LJB17 LJB18 LJB26

Gemiddelde aanvallen per dag Observatie 11 22 5 1 2 1 1 18

Baseline 36 18 11 10 3 24 3 41

In beide perioden maken LJB 1, 9 en 26 deel uit van de dieren met de hoogste aanvalsfrequentie.

3.2.2. Dorsale vs. ventrale stimulatie Dit experiment werd uitgevoerd bij 5 ratten. Tijdens het experiment stierven 4 van de 5 ratten, enkel VHC 1 overleefde het experiment. Tijdens de baseline vertoonden de ratten niet voldoende aanvallen en een onstabiele aanvalsfrequentie, ondanks dat ze reeds lange tijd ervoor (243 dagen) geïnjecteerd werden met KA (Fig. 26). Dit samen met de sterfte van de ratten maakt het onmogelijk om een besluit te vormen over de werking van dorsale vs. ventrale stimulatie.

Aantal aanvallen/dag

Baseline 80 70 60 50 40 30 20 10 0

VHC 1 VHC 31 VHC 9 VHC 28 VHC 20 dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag dag 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Figuur 26 Grafiek met aantal aanvallen tijdens baseline (20d) per rat.

VHC 31 en 20 stierven tijdens de dorsale DBS periode. VHC 28 stierf tijdens de daaropvolgende baselineperiode en VHC 9 stierf tijdens de ventrale DBS periode. De histologie achteraf wees uit dat VHC 9 en 28 waarschijnlijk een infectie hadden aan de elektroden. Het sterven van VHC 20 en 31 kon niet worden verklaard op basis van de histologie. Bij VHC 1 is de clustering van de aanvallen nog steeds zeer goed zichtbaar (Fig. 27). Dit typeert het KA-model. 35

VHC 1

Aantal aanvallen/dag

25 20 15 10 5

baseline 1

dorsale stimulatie

baseline 2

ventrale stimulatie

baseline 3

D&V stimulatie

day 9

day 6

day 3

day 10

day 7

day 4

day 1

day 8

day 5

day 2

day 9

day 6

day 3

day 10

day 7

day 4

day 1

day 8

day 5

day 2

dag 19

dag 16

dag 13

dag 10

dag 7

dag 4

dag 1

0

baseline 4

Figuur 27 Grafiek met aanvallen van LJB 1 tijdens het experiment. De clustering van de aanvallen is duidelijk zichtbaar.

36

3.3. Unilaterale vs. bilaterale stimulatie In totaal werden 9 ratten geopereerd. LJB 30 is gestorven na de operatie. Eén rat, LJB 26, werd geëxcludeerd uit het experiment doordat het niet mogelijk was een treshold te bepalen tijdens stimulatie in de rechterhippocampus. Later werd via histologie bevestigd dat de elektroden zich aan beide zijden naast de hippocampus bevonden. Het experiment werd dus verder gezet met 7 ratten. De ratten werden ingedeeld in twee groepen zodat er twee groepen verkregen werden met een gelijke aanvalsfrequentie (Tabel 4). Tabel 4 Verdeling in unilaterale en bilaterale stimulatie groep.

Rat LJB 1 LJB 9 LJB 12 LJB 14 LJB 15 LJB 17 LJB 18 LJB 26 LJB 30

Operatiegewicht (g) 416 400 430 563 430 474 441 439 440

Stimulatie Bilateraal Unilateraal Bilateraal Unilateraal Bilateraal Unilateraal Bilateraal Geëxcludeerd Gestorven

De verdeling werd zodanig gemaakt dat twee groepen met een gelijke aanvalsfrequentie werden bekomen. In de tabel wordt verder nog het operatiegewicht per rat weergegeven.

LJB 14 is gestorven op de derde stimulatiedag en werd om deze reden niet opgenomen in de statistische analyse van de unilaterale groep. Deze had een open wonde aan de buik en is waarschijnlijk gestorven t.g.v. een infectie. 3.3.1. Aanvalsfrequentie Een eerste parameter die bestudeerd werd, is de aanvalsfrequentie. De gemiddelde aanvallen per rat, gemiddeld voor alle ratten in de unilaterale groep, werden berekend. Deze gingen van 21,3 ± 6,2 aanvallen per dag tijdens baseline naar 23,7 ± 2,9 aanvallen per dag tijdens unilaterale DBS. Dit bereikte geen significantie met de Wilcoxon signed ranks test (p-waarde = 0,047 > 0,025, Fig. 28). De gemiddelde aanvallen per rat, gemiddeld voor alle ratten in de unilaterale groep werden tevens ook per uur berekend. Deze gingen van 0,879 ± 0,055 aanvallen per uur tijdens baseline naar 0,911 ± 0,061 aanvallen per uur tijdens unilaterale DBS. Dit bereikte geen significantie met de t-test (p-waarde = 0,705 > 0,025, Fig 29). De gemiddelde aanvallen per rat, gemiddeld voor alle ratten in de bilaterale groep, ging van 13,4 ± 2,3 aanvallen per dag tijdens baseline naar 11,4 ± 3,0 aanvallen per dag tijdens unilaterale DBS. Dit bereikte geen significantie met de Wilcoxon signed ranks test (p-waarde = 0,088 > 0,025, Fig. 30). De gemiddelde aanvallen per rat, gemiddeld voor alle ratten in de 37

bilaterale groep, werden eveneens per uur berekend. Deze ging van 0,568 ± 0,063 aanvallen per uur tijdens baseline naar 0,502 ± 0,076 aanvallen per uur tijdens bilaterale DBS. Dit bereikte significantie met de Wilcoxon signed ranks test (p-waarde = 0,004 < 0,025, Fig 31). 140

Effect unilaterale DBS

Aantal aanvallen/dag

120 100 80 60 40 20

baseline

dag 10

dag 9

dag 8

dag 7

dag 6

dag 5

dag 4

dag 3

dag 2

dag 1

dag 10

dag 9

dag 8

dag 7

dag 6

dag 5

dag 4

dag 3

dag 2

dag 1

0

unilaterale DBS

Figuur 28 Grafiek met effect unilaterale DBS per dag t.o.v. baseline, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep (blauw). De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer. De gemiddelde aanvalsfrequentie per dag, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep, wordt weergegeven door de horizontale volle lijn (zwart). De gestippelde lijnen (paars) geven de bijhorende SEM weer. 2,00

Effect unilaterale DBS

Aantal aanvallen/uur

1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20

baseline

23:00

21:00

19:00

17:00

15:00

13:00

11:00

9:00

7:00

5:00

3:00

1:00

22:00

20:00

18:00

16:00

14:00

12:00

10:00

8:00

6:00

4:00

2:00

0:00

0,00

unilaterale DBS

Figuur 29 Grafiek met effect unilaterale DBS per uur t.o.v. baseline, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep (blauw). De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer. De gemiddelde aanvalsfrequentie per uur, gemiddeld voor alle ratten van de unilaterale groep, wordt weergegeven door de horizontale volle lijn (zwart). De gestippelde lijnen (paars) geven de bijhorende SEM weer.

38

Effect bilaterale DBS

40 Aantal aanvallen/dag

35 30 25 20 15 10 5

baseline

dag 10

dag 9

dag 8

dag 7

dag 6

dag 5

dag 4

dag 3

dag 2

dag 1

dag 10

dag 9

dag 8

dag 7

dag 6

dag 5

dag 4

dag 3

dag 2

dag 1

0

bilaterale DBS

Figuur 30 Grafiek met effect bilaterale DBS per dag t.o.v. baseline, gemiddeld voor alle ratten van de bilaterale groep (blauw). De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer. De gemiddelde aanvalsfrequentie per dag, gemiddeld voor alle ratten van de bilaterale groep, wordt weergegeven door de horizontale volle lijn (zwart). De gestippelde lijnen (paars) geven de bijhorende SEM weer.

Effect bilaterale DBS

1,60

Aantal aanvallen/uur

1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20

baseline

23:00

21:00

19:00

17:00

15:00

13:00

11:00

9:00

7:00

5:00

3:00

1:00

22:00

20:00

18:00

16:00

14:00

12:00

10:00

8:00

6:00

4:00

2:00

0:00

0,00

bilaterale DBS

Figuur 31 Grafiek met effect bilaterale DBS per uur t.o.v. baseline , gemiddeld voor alle ratten van de bilaterale groep (blauw). De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer. De gemiddelde aanvalsfrequentie per uur, gemiddeld voor alle ratten van de bilaterale groep, wordt weergegeven door de horizontale volle lijn (zwart). De gestippelde lijnen (paars) geven de bijhorende SEM weer.

Bij alle dieren werd nagegaan of ze een ‘responder’ zijn op de behandeling. Een responder wordt gedefinieerd als een rat met een reductie in aanvalsfrequentie van ≥ 50% als de gemiddelde aanvalsfrequentie tijdens baseline vergeleken wordt met deze gedurende de stimulatie (Tabel 5). Twee ratten, LJB 15 en 18, hadden een reductie groter dan 50% en kunnen als ‘responder’ ingedeeld worden. LJB 15 en 18 bleven zelfs aanvalsvrij vanaf het 39

ogenblik van stimulatie. Deze dieren behoren beide tot de groep die bilaterale DBS onderging. In deze groep zijn dus 2 (50%) van de 4 ratten responder. LJB 1 van deze groep had geen reductie ≥ 50%, maar een toename in aanvalsfrequentie van 9,1%. Twee dieren hadden een reductie ≤ 50%. LJB 12 had een reductie van 36,4%. LJB 17 had een reductie van 23,3%, LJB 9 daarentegen had een toename van 36,6%. Tabel 5 Weergave van de gemiddelde aanvalsfrequentie per rat per dag gedurende baseline en stimulatie met bijhorende SEM.

ID

DBS

LJB 9 LJB 17 LJB 1 LJB 12 LJB 15 LJB 18

unilateraal unilateraal bilateraal bilateraal bilateraal bilateraal

Aanvalsfrequentie baseline 18,4 24,1 36,4 11,4 2,6 3,1

SEM 2,2 12,4 1,2 1,9 1,6 1,2

Aanvalsfrequentie stimulatie 29,0 18,5 39,7 7,3 0,0 0,0

SEM 2,3 4,9 3,6 5,3 0 0

Verschil (%) 57,6 -23,3 9,1 -36,4 -100,0 -100,0

Het verschil (%) wordt weergegeven in de rechterkolom. Negatieve cijfers wijzen op een aanvalsreductie.

3.3.2. Aanvalsduur De tweede parameter die bestudeerd werd is de aanvalsduur. De gemiddelde duur van de aanvallen, gemiddeld voor alle ratten in de unilaterale groep, ging van 44,4 ± 1,84 seconden tijdens baseline naar 42,4 ± 1,25 seconden tijdens unilaterale DBS (Fig. 32). Deze daling bereikte geen significantie met een t-test (p-waarde = 0,379 > 0,025). Bij de bilaterale groep werd eveneens de gemiddelde duur van de aanvallen, gemiddeld voor alle ratten met uitzondering van LJB 15 en 18, berekend. LJB 15 en 18 werden niet meegenomen in deze analyse aangezien beide dieren aanvalsvrij bleven gedurende de stimulatie. De gemiddelde duur ging van 34,70 ± 0,47 seconden tijdens baseline naar 37,67 ± 0,56 seconden tijdens bilaterale DBS (Fig. 32). Deze stijging bereikte wel significantie (p-waarde < 0,025).

Aanvalsduur

50

Gemiddelde aanvalsduur per groep

45 40

Baseline

35

Stimulatie

30 25 unilateraal

bilateraal

Figuur 32 Gemiddelde aanvalsduur per groep tijdens baseline en stimulatie. De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer.

40

Bij alle dieren werd nagegaan of hun individuele aanvalsduur verschilde tussen baseline en stimulatie (Tabel 6, Fig. 33). Bij LJB 15 en 18 kon deze vergelijking niet gemaakt worden aangezien beide dieren aanvalsvrij bleven gedurende de stimulatie. Bij LJB 1 had de stimulatie geen invloed op de aanvalsduur, deze bleef constant en bereikte bijgevolg geen significantie (p-waarde = 0,304 > 0,025). Zowel bij LJB 9 als 12 is er een stijging van de aanvalsduur tijdens de stimulatie. Deze stijging bereikte bij beiden significantie (p-waarden < 0,025). Enkel bij LJB 17 werd tijdens de stimulatie een daling in aanvalsduur vastgesteld. Deze bereikte geen significantie (p-waarde = 0,055 > 0,025). Tabel 6 Vergelijking van de gemiddelde aanvalsduur per rat gedurende baseline en stimulatie met bijhorende SEM.

ID LJB 9 LJB 17 LJB 1 LJB 12

Aanvalsduur

DBS unilateraal unilateraal bilateraal bilateraal

baseline (s) 26,68 57,80 37,01 27,42

SEM 0,59 2,95 0,47 0,95

Aanvalsduur stimulatie (s) 38,64 49,50 37,79 36,87

SEM

Verschil (%)

0,867 3,15 0,57 1,94

44,8 -14,4 2,1 34,5

De rechterkolom geeft het verschil (%) weer. Negatieve cijfers wijzen op een daling in aanvalsduur. 65

Gemiddelde aanvalsduur per rat

60 Aanvalsduur

55 50 45

Baseline

40

Stimulatie

35 30 25 20 LJB 1

LJB 9

LJB 12

LJB 17

Figuur 33 Gemiddelde aanvalsduur per rat tijdens baseline en stimulatie. De verticale lijnen en eindstrepen (grijs) geven de SEM weer.

Om de totale aanvalsduur, gemiddeld per dag, te berekenen werd de gemiddelde aanvalsduur per rat (Tabel 6) vermenigvuldigd met de gemiddelde aanvalsfrequentie per dag van deze rat (Tabel 5). Deze totale aanvalsduur wordt weergegeven in Tabel 7. Hieruit kan afgeleid worden dat de totale aanvalsduur bij LJB 12 niet stijgt, maar licht daalt met 17% en de totale aanvalsduur van LJB 9 aanzienlijk stijgt met 56,2%.

41

Tabel 7 Weergave van de totale aanvalsduur, gemiddeld per dag (s).

LJB 1

LJB 9

LJB 12

LJB 17

DBS

bilateraal

unilateraal

bilateraal

unilateraal

Baseline

1348,2

490,3

312,7

1394,5

Stimulatie

1502,0

1119,4

267,3

916,1

Verschil (%)

10,2

56,2

-17,0

-52,2

De gemiddelde aanvalsfrequentie per dag tijdens de baselineperiode werd voor elk dier individueel vermenigvuldigd met de gemiddelde aanvalsduur van dit dier gedurende de baselineperiode. Dezelfde berekening werd gemaakt voor de stimulatieperiode. De onderste rij geeft het verschil (%) weer. Negatieve cijfers wijzen op een daling in totale aanvalsduur.

42

4. Bespreking 4.1. Test experimenten Beide operatiemethoden blijken geen nefaste fysiologische veranderingen, leidend tot epileptische aanvallen, te induceren in de hersenen van gezonde proefdieren. Tijdens de baselineperiode kreeg enkel C3 aanvallen en deze gingen over in een status. C3 had aan beide elektroden een bloeding en een verbrede elektrodegang. Dit in combinatie met de status die C3 doormaakte is te verklaren door het creëren van een aardingslus tijdens het proberen oplossen van storing op het EEG. Aangezien beide methoden veilig zijn werd geopteerd voor een combinatie van de methoden. In de verdere experimenten (Diego test en uni vs. bilaterale proef) werden de getwiste elektroden gebruikt. Er werd gekozen om het UV-hardend cement te gebruiken voor de plaatsing van de elektroden omdat dit sneller droogt dan het tandheelkundig acrylcement. Het laatste werd gebruikt om het hoedje te maken, dit omdat het veel goedkoper is en zeker even efficiënt. De resultaten van het test experiment met de NPI-stimulator wijzen uit dat deze stimulator niet veilig is voor de ratten aangezien er 3 ratten aanvallen ontwikkelden tijdens de stimulatie. Als er één dier loskwam van zijn swivel was dit ook te zien op het EEG van de andere dieren en kregen deze op dat moment allemaal een stroompuls. Een verklaring hiervoor is waarschijnlijk te vinden in de opbouw van de NPI-stimulator zelf. In de toekomst zal verder gezocht worden naar een oplossing voor dit probleem. De operatiemethode als oorzaak kan ook hier uitgesloten worden. Er hebben namelijk twee ratten (C8 en WBVN1) aanvallen die geopereerd werden volgens de klassieke operatiemethode en één rat (C4) aanvallen die geopereerd werd volgens de nieuwe operatiemethode. C4 en C8 werden bilateraal gestimuleerd, WBNV1 unilateraal. Deze resultaten wijzen erop dat de aanvallen, zowel bij uni- als bilaterale stimulatie, uitsluitend veroorzaakt worden door de stimulator. Samen met de observatie dat alle ratten een stroompuls kregen, kan besloten worden dat de registratie opstelling niet compatibel is met de stimulatie opstelling. Bijgevolg is het gebruik van deze stimulator niet veilig. Verder kan er niet direct een oorzakelijk verband gelegd worden tussen de aanvallen en het voorkomen van schade en bloedingen rond de elektroden en in de hippocampus, veroorzaakt door de stimulatie. C1 werd unilateraal (rechts) gestimuleerd en had schade en bloeding rond de rechterelektrode. Meest waarschijnlijk is dit veroorzaakt door de unilaterale stimulatie. C4 werd bilateraal gestimuleerd, dus het bloed aan beide elektroden en de aanvallen tijdens de 43

stimulatie kunnen veroorzaakt zijn door de stimulatie. Echter, het hoedje van C4 kwam los tijdens de wash-out dus ook dit kan een verklaring zijn voor het bloed aan beide elektroden. C5 werd ook bilateraal gestimuleerd en had geen aanvallen maar wel een bloeding aan de linkerelektrode. De histologie bevestigt dat beide operatiemethoden veilig zijn en geen fysiologische veranderingen induceren. De stimulatie daarentegen veroorzaakt wel epileptische processen en schade rond de elektroden. In het test experiment met de Diego-stimulatoren kwamen LJB controle 1 en 2 los van hun swivel. Bij het terug vasthangen werd de stimulatie niet stopgezet waardoor de dieren onmiddellijk terug gestimuleerd werden met de vooraf bepaalde waarde zonder deze eerst op te bouwen zoals hoger beschreven. De aanvallen en daaropvolgende status van LJB controle 1 kunnen vermoedelijk hierdoor veroorzaakt zijn en dus op de manier verklaard worden. Voor de ene aanval van LJB controle 2 werd tot op heden nog geen verklaring gevonden. In de literatuur werd een gelijkaardige situatie nog niet vermeld. De dieren vertoonden verder geen aanvallen en na uitvoeren van de histologie werd geen schade gedetecteerd. De dieren die niet loskwamen en dus de stimulatie toegediend kregen zoals bedoeld was, vertoonden geen aanvallen. Deze proef zal herhaald worden bij 6 dieren. Meer sluitend bewijs hierrond dient de veiligheid van de Diego-stimulatoren te bevestigen.

4.2. Observaties De selectie van de KA-ratten wordt niet aangepast na het uitvoeren van observaties verspreid over verschillende weken. Observaties op verschillende dagen in één week blijken voldoende te zijn voor de selectie. De observaties gebeuren best gedurende opeenvolgende dagen aangezien zo vermeden wordt dat men aanvallen mist. Dieren kunnen nl. de ene dag geen aanvallen vertonen en de daaropvolgende dag wel (14). Indien na de eerste observatiedagen niet voldoende ratten kunnen geselecteerd worden spreekt het voor zich dat nog meerdere observaties vereist zijn. In de toekomst kan met deze resultaten rekening gehouden worden bij het uitvoeren van observaties in het LKEN3. Dit zal de extra werklast, die het uitvoeren van meerdere observaties met zich meebrengt, een stuk verminderen. Er is een duidelijke toename zichtbaar in aanvalsfrequentie gedurende de verschillende observatiedagen bij LJB 9 en 12. Dit is niet het geval bij de andere dieren. Op het EEG van de baselineperiode van de uni vs. bilaterale proef is een duidelijke toename in aanvalsfrequentie zichtbaar bij LJB 14, 15, 17 en 18. Bij LJB 1, 9, 12 en 26 is dit niet zichtbaar. Volgens de studie van Hellier wordt de plateaufase 4 tot 7 maanden (120 tot 210 dagen) na injectie 44

bereikt (40). Williams en collega’s verdeelden de progressie van de aanvallen op het EEG in 4 fasen op. Fase 1 was de latente periode gedurende dewelke geen aanvallen werden gedetecteerd. De tweede fase begon met een trage groeifase die gekarakteriseerd werd door een lage maar gradueel toenemende aanvalsfrequentie. In deze fase waren de langste intervallen tussen twee aanvallen 4 tot 8 dagen. Het einde van deze trage groeifase werd gedefinieerd als de eerste dag waarop de rat ≥ 5 aanvallen per dag kreeg. Fase 3 bestond uit een exponentiële groeifase. De gemiddelde tijd tot het einde van deze groeifase was 79 ± 10 dagen. Ten laatste volgde de 4e fase, nl. de plateaufase. Hierin bleef de aanvalsfrequentie relatief stabiel. De ratten in ons experiment werden laatst geobserveerd op 120 dagen na injectie en de eerste dag van de baseline begon 142 dagen na injectie. Dit suggereert dat LJB 9 en 12 de plateaufase bereikten tussen de laatste observatiedag en de eerste dag van de baseline. LJB 1 en 26 bereikten deze plateaufase reeds voor de eerste observatiedag. LJB 14, 15, 17 en 18 bereikten de plateaufase nog niet en bevinden zich waarschijnlijk in de derde, exponentiële fase aangezien ze op het einde van de baseline meer dan 5 aanvallen per dag vertonen. De progressieve toename in aanvalsfrequentie overgaand in een plateaufase sluit aan bij de continue functie hypothese, gebruikt om verworven epileptogenese te beschrijven. Dit werd reeds in de studie van Williams en collega’s onderzocht (14). Zowel tijdens de observaties als tijdens de baseline zijn het steeds dezelfde dieren die behoren tot de groep met een hogere aanvalsfrequentie. Dit resultaat leidt tot de hypothese dat observatie reeds een eerste betrouwbare maat is voor de aanvalsfrequentie. Bij de dieren die reeds veel aanvallen vertonen tijdens de observatie zal dit ook achteraf af te leiden zijn uit het EEG. Hetzelfde kan gesteld worden voor de dieren met een lage aanvalsfrequentie. Niettemin kan er uit deze studie niet besloten worden dat er een correlatie is tussen observatie en baseline, op vlak van aanvalsfrequentie. Er kon namelijk geen significantie aangetoond worden. Lange tijd (243 dagen in ons experiment) tussen de injectie van KA en de start van de proef blijkt geen garantie te zijn voor een voldoende hoge aanvalsfrequentie in het KA-model. Dit kan besloten worden uit de baseline resultaten van de dorsale vs. ventrale proef. Er is duidelijk bewijs (VHC 1, Fig. 27) dat de aanvallen, ook bij zo’n lange tijd na injectie, nog steeds geclusterd kunnen voorkomen met een interval van dagen. De stabiele aanvalsfrequentie, vereist voor de proef, is nog niet bereikt. Hellier en collega’s rapporteerden dat de aanvalsfrequentie één jaar na injectie nog blijft toenemen (40). Er kan dan gesteld worden dat VHC 1 zijn aanvalsfrequentie nog steeds toeneemt en theoretisch ooit de 45

plateaufase bereikt. Dit resultaat bewijst ook duidelijk de grote variabiliteit die heerst in het KA-model. Om te besluiten, observatie blijft onmisbaar om ratten uit het KA-model te selecteren voor een proef.

4.3. Unilaterale vs. bilaterale stimulatie Tot nu toe werd het effect van bilaterale DBS in de hippocampus nog nooit getest in een diermodel voor epilepsie. Niettemin werd bilaterale hippocampale DBS wel reeds toegepast in verschillende klinische studies (31, 32, 34). Om deze reden werd deze studie uitgevoerd als een pilootproef, met de bedoeling om deze later te herhalen bij een groter aantal dieren. Doordat de unilaterale groep slechts uit twee ratten bestond, LJB 14 stierf tijdens de stimulatie, kan een besluit i.v.m. de werking van unilaterale DBS niet gevormd worden. Een vergelijking van de unilaterale groep met de bilaterale groep is eveneens niet betrouwbaar door de te kleine unilaterale groep. Bilaterale DBS daarentegen bereikte wel een significant anticonvulsief effect als de aanvalsfrequentie per uur vergeleken werd. Er werd geen significantie bereikt bij vergelijking van de aanvalsfrequentie per dag. Hieruit kan besloten worden dat de bilaterale DBS schijnbaar lijkt te werken. Twee ratten bleven aanvalsvrij gedurende de volledige stimulatieperiode. De groep was te klein om zowel per uur als per dag significantie te bereiken. Met deze resultaten is het niet mogelijk om het eerder bekomen positieve effect van unilaterale DBS te bevestigen (38). Bij herhaling van deze proef met meer dieren zou het wel mogelijk moeten zijn om te bevestigen en significantie aan te tonen. In deze proef werden twee (50%) ratten van de bilaterale groep ingedeeld als ‘responder’. Deze bleven tijdens de stimulatie aanvalsvrij. Soortgelijke observaties werden reeds beschreven in zowel klinische als dierexperimentele studies (34, 38). In de studie van Wyckhuys en collega’s rond unilaterale DBS, werd 54% van de KA-ratten ingedeeld als responder. In de studie van Vonck en collega’s werd bij 6/11 patiënten een aanvalsreductie ≥ 90% bekomen en slechts 2 patiënten werden ingedeeld als non-responder (aanvalsreductie ≤ 30%). Alhoewel de respons in die studies steeds hoger was, is dit resultaat opnieuw een bevestiging van de sterke correlatie tussen de respons op DBS bij patiënten met TLE en in het KA-model. De herhaling van deze proef met meer dieren zal ook een meer betrouwbaar beeld geven van het aantal responders. De tweede parameter die bestudeerd werd in deze proef is de aanvalsduur. De unilaterale DBS, gemiddeld voor alle dieren in deze groep, blijkt geen invloed te hebben op de aanvalsduur. Individueel had LJB 17 een reductie van 14,4% en LJB 9 een stijging van 46

44,8%. De stijging in aanvalsduur bij LJB 9 is significant. De bilaterale DBS, gemiddeld voor alle dieren in deze groep, blijkt wel een effect te hebben op de aanvalsduur. Bij LJB 1 had de bilaterale DBS geen invloed op de aanvalsduur, er was slechts een lichte stijging van 2,1%. Bij LJB 12 was er een significante stijging van 34,5%. Om een beter beeld te krijgen van de aanvalsduur rekening houdend met de aanvalsfrequentie werd de totale aanvalsduur, gemiddeld per dag, berekend. LJB 12 had een aanvalsreductie van 36,4% en een stijging in aanvalsduur van 34,5%. Als naar de totale aanvalsduur gekeken wordt valt op dat deze bij LJB 12 niet stijgt, maar daalt met 17,0%. Bij het vormen van een besluit rond de stijging in aanvalsduur van 34,5% dient met dit resultaat ook rekening te worden gehouden. LJB 12 kreeg na behandeling met bilaterale DBS minder aanvallen, maar de aanvallen duurden langer. De bilaterale DBS had bij LJB 1 geen significant effect op de aanvalsduur, de totale aanvalsduur steeg met slechts 10,2%. De totale aanvalsduur, gemiddeld per dag, van LJB 9 steeg echter met 56,2%. De unilaterale DBS blijkt dus een langere aanvalsduur te induceren bij LJB 9. Dit kan verklaard worden doordat LJB 9 een stijging in aanvalsfrequentie had van 57,6% en een stijging van de aanvalsduur met 44,8%. Bij LJB 17 daalde de totale aanvalsduur met 52,2%. LJB 17 had een aanvalsreductie van 23,3% en een daling in aanvalsduur van 14,4%. Bij de unilaterale (LJB 9 en 17) en bilaterale DBS (LJB 1 en 12) is er zowel bewijs dat de stimulatie geen effect heeft als dat de stimulatie wel effect heeft op de aanvalsduur. De significante stijging in aanvalsduur bij de bilaterale groep kan verklaard worden door de stijging in aanvalsduur van LJB 12. Rekening houdend met de daling in aanvalsfrequentie van LJB 12 kan een duidelijk verband tussen bilaterale DBS en stijging in aanvalsduur niet gelegd worden. In de vorige studie rond unilaterale DBS werd geen effect gedetecteerd van de stimulatie op de aanvalsduur (38).

47

5. Algemeen besluit De operatiemethode heeft geen invloed op het induceren van fysiologische veranderingen in de hersenen van gezonde proefdieren. Zowel de gekleefde als getwiste elektroden en zowel het UV-hardend tandheelkundig cement als het tandheelkundig acrylcement cement zijn veilig voor gebruik. De NPI-stimulator is niet compatibel met de registratie opstelling en induceert epileptische processen. Om deze reden kan de NPI-stimulator niet gebruikt worden voor de toediening van Poisson verdeelde stimulatie. De custome made ‘Diego-stimulator’ daarentegen blijkt veilig te zijn en kan wel gebruikt worden. Indien er dieren loskomen wordt de stimulatie best stopgezet alvorens de dieren terug te verbinden met swivel. Dit om ervoor te zorgen dat de dieren telkens de stimulatie toegediend krijgen zoals bedoeld. Door herhaling van deze proef bij 6 dieren zal meer sluitend bewijs verkregen worden. Het uitvoeren van twee of drie opeenvolgende observaties in één week blijkt voldoende te zijn om een goede selectie te bekomen in het KA-model. Observaties over meerdere weken veranderen de uiteindelijke selectie niet. Dit resultaat draagt bij tot een betere en meer efficiënte uitvoering van de observaties en de daaropvolgende selectie in het LKEN3. Alhoewel er geen correlatie kon worden aangetoond tussen observatie en baseline, lijkt de observatie wel een eerste betrouwbare maat voor de aanvalsfrequentie te zijn. De grote variabiliteit die heerst in het KA-model werd aangetoond. Het uitvoeren van observaties blijft onmisbaar om ratten uit het KA-model te selecteren voor een proef. Met de resultaten van de uni vs. bilaterale DBS-proef is het niet mogelijk om het eerder bekomen positieve effect unilaterale DBS te bevestigen. Bij herhaling van deze proef met meer dieren zou het wel mogelijk moeten zijn om te bevestigen en significantie aan te tonen. De bilaterale DBS blijkt wel te werken aangezien 2 dieren aanvalsvrij werden. De herhaling van deze proef met meer dieren zal ook een meer betrouwbaar beeld geven van het aantal responders. De stimulatie heeft geen duidelijk effect op de aanvalsduur. In beide groepen is er zowel bewijs dat de stimulatie geen effect heeft als dat de stimulatie wel effect heeft op de aanvalsduur.

48

6. Referentielijst 1. 2. 3. 4. 5. 6.

7. 8. 9. 10.

11.

12. 13.

14.

15.

16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28.

WHO. Epilepsy (2012). Fact sheet no. 999. Banerjee PN, Filippi D, Allen Hauser W (2009). The descriptive epidemiology of epilepsy-a review. Epilepsy Research 85(1) :31-45. Zhong XL, Yu JT, Zhang Q, Wang ND, Tan L (2011). Deep brain stimulation for epilepsy in clinical practice and in animal models. Brain Research Bulletin 30;85(3-4): 81-88. Strzelczyk A, Reese JP, Dodel R, Hamer HM (2008). Cost of epilepsy: a systematic review. Pharmacoeconomics 26(6): 463-476. Morimoto K, Fahnestock M, Racine RJ (2004). Kindling and status epilepticus models of epilepsy: rewiring the brain. Progressive Neurobiology73(1): 1-60. Berg AT, Berkovic SF, Brodie MJ, Buchhalter J, Cross JH, van Emde Boas W, et al. (2010). Revised terminology and concepts for organization of seizures and epilepsies: report of the ILAE Commission on Classification and Terminology, 2005-2009. Epilepsia 51(4): 676-685. Epilepsie. Coëlho zakwoordenboek der geneeskunde. 28e druk (2008). Doetinchem Elsevier Gezondheidszorg; 271-272. Epilepsy Foundation Temporal lobe epilepsy. Aangepast van: www.epilepsyfoundation.org/aboutepilepsy/syndromes/temporallobeepilepsy.cfm. Vonck K. Klinische Neurologie. 2011-2012: 123. Menzler K, Thiel P, Hermsen A, Chen X, Benes L, Miller D, et al (2011). The role of underlying structural cause for epilepsy classification: clinical features and prognosis in mesial temporal lobe epilepsy caused by hippocampal sclerosis versus cavernoma. Epilepsia 52(4): 707-711. Raedt R, Van Dycke A, Van Melkebeke D, De Smedt T, Claeys P, Wyckhuys T, et al. (2009). Seizures in the intrahippocampal kainic acid epilepsy model: characterization using long-term video-EEG monitoring in the rat. Acta Neurologica Scandinavica 119(5): 293-303. Salloway S, Malloy P, Cummings JL (1997). The neuropsychiatry of limbic and subcortical disorders. American Psychiatric Press. O'Dell CM, Das A, Wallace Gt, Ray SK, Banik NL (2012). Understanding the basic mechanisms underlying seizures in mesial temporal lobe epilepsy and possible therapeutic targets: a review. Journal of Neuroscience Research 90(5): 913-924. Williams PA, White AM, Clark S, Ferraro DJ, Swiercz W, Staley KJ, et al. (2009). Development of spontaneous recurrent seizures after kainate-induced status epilepticus. Journal of Neuroscience 29(7): 2103-2112. Wyckhuys T, Staelens S, Van Nieuwenhuyse B, Deleye S, Hallez H, Vonck K, et al. (2010). Hippocampal deep brain stimulation induces decreased rCBF in the hippocampal formation of the rat. Neuroimage 52(1): 55-61. de Lanerolle NC, Lee TS (2005). New facets of the neuropathology and molecular profile of human temporal lobe epilepsy. Epilepsy & Behavior 7(2): 190-203. Fisher PD, Sperber EF, Moshe SL (1998). Hippocampal sclerosis revisited. Brain and development 20(8): 563-573. Zhang S-x. An atlas of Histology (1999). Springer. Gliosis. Coëlho zakwoordenboek der geneeskunde. 28e druk (2006). Doetinchem Elsevier Gezondheidszorg; 344. de Lanerolle NC, Lee TS, Spencer DD (2010). Histopathology of human epilepsy. Epilepsia 51: 37. Tamber MS, Mountz JM (2012). Advances in the Diagnosis and Treatment of Epilepsy. Seminars in Nuclear Medicine 42(6): 371-386. Howard P, Twycross R, Shuster J, Mihalyo M, Remi J, Wilcock A (2011). Anti-epileptic drugs. Journal of Pain and Symptom Management 42(5): 788-804. FAGG. Bijsluiter Retigabine. Boon P, Vonck K, De Herdt V, Van Dycke A, Goethals M, Goossens L, et al. (2007). Deep brain stimulation in patients with refractory temporal lobe epilepsy. Epilepsia 48(8): 1551-1560. Vonck K, Boon P, Achten E, De Reuck J, Caemaert J (2002). Long-term amygdalohippocampal stimulation for refractory temporal lobe epilepsy. Annals of Neurology 52(5): 556-565. Tellez-Zenteno JF, Wiebe S (2011). Hippocampal stimulation in the treatment of epilepsy. Neurosurgery Clinics of North America 22(4): 465-475. Kotagal P (2011). Neurostimulation: vagus nerve stimulation and beyond. Seminars of Pediatric Neurology 18(3): 186-194. Miranda MJ, Turner Z, Magrath G (2012). Alternative diets to the classical ketogenic diet-Can we be more liberal? Epilepsy Research 100(3): 278-285.

49

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35. 36.

37.

38.

39.

40.

41. 42. 43. 44. 45.

Wyckhuys T, Geerts PJ, Raedt R, Vonck K, Wadman W, Boon P (2009). Deep brain stimulation for epilepsy: knowledge gained from experimental animal models. Acta Neurologica Belgica 109(2): 6380. Velasco AL, Velasco M, Velasco F, Menes D, Gordon F, Rocha L, et al (2000). Subacute and chronic electrical stimulation of the hippocampus on intractable temporal lobe seizures: preliminary report. Archives of Medical Research 31(3): 316-328. Velasco AL, Velasco F, Velasco M, Trejo D, Castro G, Carrillo-Ruiz JD (2007). Electrical stimulation of the hippocampal epileptic foci for seizure control: a double-blind, long-term follow-up study. Epilepsia 48(10): 1895-1903. McLachlan RS, Pigott S, Tellez-Zenteno JF, Wiebe S, Parrent A (2010). Bilateral hippocampal stimulation for intractable temporal lobe epilepsy: impact on seizures and memory. Epilepsia. 51(2): 304-307. Boex C, Seeck M, Vulliemoz S, Rossetti AO, Staedler C, Spinelli L, et al.(2011). Chronic deep brain stimulation in mesial temporal lobe epilepsy. Seizure: the journal of the British Epilepsy Association 20(6) :485-490. Vonck K, Sprengers M, Carrette E, Dauwe I, Miatton M, Meurs A, et al. (2013). A decade of experience with deep brain stimulation for patients with refractory medial temporal lobe epilepsy. International Journal of Neural Systems 23(1):1250034. Bragin A, Wilson CL, Engel J (2002). Rate of interictal events and spontaneous seizures in epileptic rats after electrical stimulation of hippocampus and its afferents. Epilepsia 43: 81-85. Bragin A, Wilson CL, Staba RJ, Reddick M, Fried I, Engel J (2002). Interictal high-frequency oscillations (80-500Hz) in the human epileptic brain: Entorhinal cortex. Annals of Neurology 52(4): 407-415. Wyckhuys T, De Smedt T, Claeys P, Raedt R, Waterschoot L, Vonck K, et al. (2007). High frequency deep brain stimulation in the hippocampus modifies seizure characteristics in kindled rats. Epilepsia 48(8): 1543-1550. Wyckhuys T, Boon P, Raedt R, Van Nieuwenhuyse B, Vonck K, Wadman W (2010). Suppression of hippocampal epileptic seizures in the kainate rat by Poisson distributed stimulation. Epilepsia 51(11): 2297-2304. Van Welie I, van Hooft JA, Wadman W (2004). Homeostatic scaling of neuronal excitability by synaptic modulation of somatic hyperpolarization-activated I-h channels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101(14): 5123-5128. Hellier JL, Patrylo PR, Buckmaster PS, Dudek FE (1998). Recurrent spontaneous motor seizures after repeated low-dose systemic treatment with kainate: assessment of a rat model of temporal lobe epilepsy. Epilepsy Research 31(1): 73-84. Navarro Mora G, Bramanti P, Osculati F, Chakir A, Nicolato E, Marzola P, et al. (2009). Does pilocarpine-induced epilepsy in adult rats require status epilepticus? PloS one 4(6):e5759. Watson G, Paxinos C . The rat brain in stereotactic coordinates. 4e druk (1998): Academia Press. McIntyre DC, Poulter MO, Gilby K (2002). Kindling: some old and some new. Epilepsy Research 50(12): 79-92. Racine RJ (1972). Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure. Electroencephalography and Clinical Neurophysiology 32(3): 281-294. Wyckhuys T, Raedt R, Vonck K, Wadman W, Boon P (2010). Comparison of hippocampal Deep Brain Stimulation with high (130 Hz) and low frequency (5 Hz) on afterdischarges in kindled rats. Epilepsy Research 88(2-3): 239-246.

50