Jurnal Kimia Indonesia Vol. 1 (1), 2006, h. 22-27
Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstrasel dari Isolat Bakteri Termofil SW2 Siswati Setiasih,1 Budiasih Wahyuntari,2 Trismilah,3 dan Dewi Apriliani1 1 Departemen Kimia FMIPA Universitas Indonesia Kampus Baru Depok, Jawa Barat 2,3 Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi, BPPT PUSPITEK, Serpong, Tangerang Banten Email:
[email protected];
[email protected];
[email protected] Abstrak. Dalam penelitian ini digunakan isolat bakteri termofil SW2, dari Pusat Pengolahan Kompos, sebagai sumber enzim -amilase ekstrasel. Isolasi enzim dilakukan setelah bakteri tersebut diaktifkan dan dikultur dalam medium yang mengandung pati kentang pada suhu 60C, pH 7,5 selama 39 jam. Enzim -amilase ekstrasel yang diperoleh memiliki keaktifan optimum pada suhu 70C, dan pH 6,0. Enzim ini merupakan -amilase logam karena keaktifan katalitiknya dapat ditingkatkan oleh ion logam, seperti Na+, K+, Mn+ dan Ca2+ serta diinhibisi sangat kuat oleh Zn2+, Fe2+ dan EDTA. Keaktifan enzim ini juga diturunkan oleh adanya senyawa SDS dan urea. Sedangkan efek penyimpanan selama 4 bulan pada suhu kamar dapat menurunkan keaktifan enzim hingga mencapai + 50%. Massa molekul enzim kasar ditentukan dengan metode elektroforesis SDS-poliakrilamid dan diperoleh sekitar 180 kDa. Kata kunci: -Amilase, termofil, kompos, ekstrasel, inhibisi.
Pendahuluan Berbagai jenis isolat mikroorganisme telah didapatkan dan diketahui memiliki peranan yang besar sebagai penghasil enzim yang berguna dalam industri. Enzim digunakan dalam industri karena bersifat sangat spesifik dibandingkan dengan katalis anorganik. Selain itu, enzim bekerja sangat efisien, beroperasi pada kondisi lunak, aman dan mudah dikontrol, dapat menggantikan bahan kimia yang berbahaya, dan dapat didegradasi secara biologis.1 Enzim mempunyai nilai ekonomi tinggi. Dalam industri pangan, enzim amilase berfungsi menyediakan gula hidrolisis pati sehingga dapat dimanfaatkan untuk produksi sirup glukosa ataupun sirup fruktosa yang mempunyai tingkat kemanisan tinggi, pembuatan roti, dan makanan bayi. Di industri tekstil enzim amilase digunakan untuk membantu dalam proses penghilangan pati, yang digunakan sebagai perekat untuk melindungi benang saat ditenun agar lentur. Proses ini memerlukan suhu sekitar 70-80C. Mikroorganisme termofil dapat menghasilkan enzim yang tahan terhadap suhu tinggi. Kelebihan pada proses industri yang menggunakan suhu tinggi antara lain dapat meningkatkan laju reaksi kimia
termasuk reaksi enzimatis, efisien, dan dapat mengurangi kontaminasi.2-4 Enzim -amilase adalah enzim ekstrasel yang mengkatalisis reaksi pemotongan ikatan glukosidik 1,4 pada bagian dalam molekul substrat (endoenzim). Secara komersial enzim ini dihasilkan baik oleh bakteri seperti dari genus Bacillus, maupun kapang dari genus Aspergillus dan Rhizopus.2,5 Penelitian ini merupakan lanjutan dari penelitian sebelumnya, yang bertujuan memproduksi enzim -amilase ekstrasel. Sebagai sumber enzim digunakan bakteri termofil Bacillus SW2 yang diisolasi dari Pusat Pengolahan Kompos, BSD-Tangerang. Enzim hasil isolasi tersebut selanjutnya akan digunakan dalam industri tekstil. Alasan utama dari pemanfaatan mikroorganisme adalah untuk menghemat biaya impor enzim tersebut. Sel mikroorganisme merupakan sumber penghasil enzim yang sangat potensial karena untuk peningkatan produksi enzim dapat dilakukan dengan lebih mudah, misalnya dengan cara pengaturan kondisi lingkungan pertumbuhannya. Fokus pekerjaan dari penelitian ini adalah pada uji karakterisasi enzim kasar hasil pemekatan melalui ultrafiltrasi. Uji keaktifan enzim dilakukan terhadap berbagai pengaruh lingkungan seperti: suhu, pH, aktivator serta inhibitor enzim. Untuk
Dapat dibaca di www.kimiawan.org/journal/jki
Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstraseluler dari Isolat Bakteri Termofil SW2
penentuan massa molekul protein enzim digunakan SDS-PAGE. Percobaan Mikroorganisme. Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat bakteri termofil SW2 bersifat gram positif berbentuk batang, koloni bulat tidak beraturan berwarna krem, tebal dan tidak tembus pandang. Bakteri tersebut diisolasi dari pusat pengolahan kompos BSD, Tangerang, dan biakannya dipelihara serta diperbanyak pada medium agar. Media. Komposisi media agar yang digunakan adalah maizena 2%, agar teknis 1,65%, gum gellan “Gelrite” 0,35%, ekstrak ragi 0,5%, bacto pepton 0,5%, K2HPO4 0,05%, MgSO4.7H2O 0,05%, CaCl2.2H2O 0,1%. Komposisi media fermentasi terdiri atas, pati kentang 1%, ekstrak ragi 0,5%, bacto pepton 0,5%, K2HPO4 0,05%, MgSO4.7H2O 0,05%, CaCl2.2H2O 0,1% Fermentasi. Inokulum yang telah disiapkan dimasukkan secara aseptik ke dalam media fermentasi (90% volume produksi), lalu diinkubasi selama 39 jam pada suhu 60C di dalam shaker incubator yang berkecepatan 150 rpm. Cairan fermentasi (broth) yang mengandung -amilase ekstrasel dipisahkan dari selnya dengan cara disentrifus pada kecepatan 4000 rpm, 4C selama 30 menit. Filtrat enzim yang didapat kemudian dipekatkan 10 kali dengan ultrafiltrasi menggunakan membran pemisah berukuran 30 kilodalton (Kda). Penentuan keaktifan enzim. Penentuan keaktifan ini berdasarkan pada penguraian substrat oleh enzim. Keaktifan -amilase ditentukan dengan metode kolorimetri Fuwa.6,7 Satu unit keaktifan enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menyebabkan penurunan warna sebesar 50% pada kondisi di atas. Penentuan kadar protein. Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford, dan sebagai standar protein digunakan larutan bovine serum albumin.8,9 Pengaruh suhu dan pH. Kondisi optimum bagi keaktifan enzim -amilase ditentukan dengan cara memvariasikan suhu (yaitu: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, dan 100C) dan memvariasikan pH pada suhu optimumnya (yaitu: pH 4,0; 5,0; 6,0 menggunakan dapar sitrat 20 mM; pH 6,0; 7,0; 8,0 menggunakan dapar fosfat 20 mM; dan pH 9,0; 10,0 menggunakan dapar glisin–NaOH). Kestabilan penyimpanan -amilase ditentukan dengan cara menyimpan filtrat enzim pada suhu kamar (30C)
dan suhu dingin (4C). Kemudian secara berkala dilakukan pengujian keaktifan enzimnya, selama 4 bulan penyimpanan yang diukur pada suhu dan pH optimum enzim. Pengaruh berbagai ion logam dan agen-agen pendenaturasi. Filtrat yang mengandung enzim diikubasi dengan berbagai senyawa ion logam (KCl, LiCl, FeCl3.6H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, NiCl2.6H2O, ZnCl2, MnCl2.4H2O) masing-masing pada konsentrasi 1 mM, 5 mM, dan 10 mM selama 30 menit. Sedangkan pengaruh agen-agen pendenaturasi protein dilakukan dengan cara menginkubasi filtrat enzim dengan senyawa SDS (konsentrasi 0,4%, 1,0% dan 1,5%), EDTA dan urea (konsentrasi 1 mM, 5 mM dan 10 mM) selama 30 menit. Keaktifan -amilase diukur pada suhu dan pH optimum yang diperoleh pada percobaan sebelumnya. Penentuan massa molekul enzim kasar. Enzim hasil isolasi ditentukan massa molekulnya secara elektroforesis menggunakan gel poliakrilamid natrium dodesil sulfat 7,5% (SDS/PAGE) Zimogram dibuat dengan standar marker High Molecular Weight (HMW-SDS) (Amershem Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Gel hasil elektroforesis diinkubasi dalam larutan amilum dan pita-pita protein yang terpisah diwarnai dengan Coomassie Brilliant Blue R-250.2,10 Hasil dan Pembahasan Produksi Enzim. Berdasarkan hasil penelitian sebelumnya, kondisi optimum proses fermentasi dilakukan pada suhu 60C, pH awal 7,5 selama 39 jam di dalam shaker incubator yang berkecepatan 150 rpm.11 Cairan fermentasi yang diperoleh dipisahkan dari selnya dengan cara disentrifuga pada kecepatan 4000 rpm, 4C selama 30 menit, kemudian dipekatkan 10 kali dengan ultrafiltrasi. Pemekatan dengan ultrafiltrasi berdasarkan pada kemampuan membran dengan tekanan hidrostatik tinggi untuk menahan komponen yang mempunyai ukuran partikel yang relatif besar serta melewatkan pelarut dan zat terlarut dengan ukuran partikel yang lebih kecil, sehingga didapatkan filtrat enzim yang lebih murni.12 Pemekatan juga bertujuan agar enzim lebih stabil selama masa penyimpanan. Hasil penentuan keaktifan enzim -amilase ekstrasel yang terdapat dalam supernatan dapat dilihat pada Tabel 1. Pemekatan enzim dengan ultrafiltrasi menyebabkan tingkat kemurnian naik sebesar 50 kali dibandingkan broth, kenaikan ini disebabkan karena molekul air dan juga protein lain yang
23
Siswati Setiasih, Budiasih Wahyuntari, Trismilah, dan Dewi Apriliani
ukurannya lebih kecil dari 30 kDa dapat terlewatkan sehingga memberikan kenaikan keaktifan spesifik . Karakterisasi. Suhu optimum bagi keaktifan -amilase yang diperoleh dari hasil percobaan yaitu 70C. Di bawah suhu optimum (60C) dan di
atas suhu optimum (90C), enzim masih memiliki keaktifan sebesar ±66%. Pada 80C enzim masih memiliki keaktifan sebesar ±77% dibandingkan keaktifan pada suhu optimumnya (Gambar 1). Hasil penelitian lain menyatakan bahwa -amilase termofil memiliki keaktifan antara 60-80C dan
Tabel 1. Tahap Pemekatan -Amilase Ekstraseluler SW2 Volume Keaktifan Total (mL) Rata2 (unit) (unit)
Protein Total Rata2 (mg/mL) (mg)
2000
1,300
2600
1,293
Supernatan 1900 (sentrifus)
1,116
Supernatan 200 (ultrafiltrasi) Filtrat 1700 (ultrafiltrasi)
Broth
Keaktifan Spesifik Tingkat (unit/mg protein) Kemurnian
2585,9 1,005
2120,4 0,027
51,775 40,954
41
4,636
927,2
0,093
18,69
50
0
0
0,0078
13,175 0
49,609
0
120 Aktivitas relatif (%)
100 80 60 40 20 0 20
30
40
50
60
70
80
90
100
Suhu ( OC)
Gambar 1. Pengaruh suhu terhadap keaktifan -amilase ekstraseluler SW2
Aktivitas relatif (%)
120 100 80 60 40 20 0 4
5
6
7
8
9
10
pH
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap keaktifan -amilase ekstraseluler SW2
24
Jurnal Kimia Indonesia Vol. 1(1), 2006
Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstraseluler dari Isolat Bakteri Termofil SW2
kehilangan keaktifannya pada suhu di bawah 40C.3 Sedangkan enzim -amilase ekstrasel dari isolat bakteri termofil SW2 menjadi tidak aktif pada 100C. Penentuan pH optimum enzim -amilase ekstrasel dari isolat bakteri termofil SW2 ini dilakukan pada suhu 60C. Gambar 2 menunjukkan bahwa keaktifan enzim tertinggi diperoleh pada pH 6. Keaktifan enzim relatif masih tinggi baik pada pH 5 maupun pada pH antara 7 – 9 akan tetapi pada pH di bawah 5 dan di atas pH 9 keaktifan enzim menurun drastis. Pengaruh berbagai ion logam dan senyawa pendenaturasi. Untuk mengetahui pengaruh beberapa ion logam terhadap keaktifan enzim, maka dalam percobaan ini digunakan beberapa senyawa garam klorida, yaitu: KCl, FeCl3.6H2O, NaCl, CaCl2.2H2O, MgCl2.6H2O, NiCl2.6H2O, ZnCl2, MnCl2.4H2O. Senyawa garam klorida digunakan karena pengaktifan amilase menurun sesuai urutan Cl- > Br- > I-.13 Penambahan ion K+ pada konsentarasi 1 mM menurunkan keaktifan enzim sebesar ±4%, sedangkan pada konsentrasi 5 mM dan 10 mM ion K+ meningkatkan keaktifan enzim masing-masing sebesar ±2% dan ±4%. Ion Na+ menaikkan keaktifan enzim pada konsentrasi 1 mM dan 5 mM masing-masing sebesar ±6% dan ±2%, sedangkan pada konsentrasi 10 mM ion Na+ menurunkan keaktifan enzim sebesar ±2%. Pada konsentrasi 1 mM dan 5 mM ion Ca2+ menaikkan
keaktifan enzim masing-masing sebesar ±2% dan ±3%, sedangkan pada konsentrasi 10 mM ion Ca2+ menurunkan keaktifan enzim sebesar ±7%. Ion Mn2+ menaikkan keaktifan enzim sebesar ±5% pada konsentrasi 1 mM, selanjutnya kenaikan konsentrasi ion Mn2+ menyebabkan keaktifan enzim menurun yaitu sebesar ±1% pada 5 mM dan ±12% pada 10 mM. Ion Mg2+ menurunkan keaktifan enzim, dan penurunannya sejalan dengan bertambahnya konsentrasi ion Mg2+, pada konsentrasi 1 mM, 5 mM dan 10 mM, keaktifan enzim menurun masing-masing sebesar ±8%, ±10% dan ±20%. Ion Zn2+ dan Fe3+ menyebabkan enzim sama sekali tidak aktif baik pada konsentrasi 1 mM, 5 mM maupun 10 mM. Begitu pula dengan ion Ni2+ pada konsentrasi 5 mM dan 10 mM, pada konsentrasi ion Ni2+ 1 mM keaktifan enzim turun sampai dengan ±24%. Berdasarkan data tersebut (Gambar 3) maka terdapat empat macam ion logam yang dapat meningkatkan keaktifan amilase hasil isolasi yaitu K+, Na+, Ca2+ dan Mn2+ serta tiga macam ion logam yang dapat menghilangkan keaktifan -amilase hasil isolasi yaitu Ni2+, Zn2+ dan Fe3+. Pada Gambar 3, adanya penambahan EDTA (sebagai pengkelat logam) pada berbagai konsentrasi menunjukkan bahwa keaktifan enzim -amilase ini hampir seluruhnya hilang. Dari data tersebut, -amilase hasil isolasi dapat digolongkan sebagai -amilase logam.
120
aktivitas relatif (%)
100 80 60 40 20 0 None
Na+
Mn2+
Ni2+
Fe3+
Urea
senyawa 1 mM
5 mM
10 mM
Gambar 3. Pengaruh ion logam, senyawa pengkelat dan pendenaturasi protein terhadap keaktifan -amilase ekstrasel SW2.
25
Siswati Setiasih, Budiasih Wahyuntari, Trismilah, dan Dewi Apriliani
aktivitas relatif (%)
105 100 95 90 85 80
SDS 0%
0,40%
1,0%
1,5%
Gambar 4. Pengaruh berbagai konsentrasi deterjen anionik (sulfonil dedosil sulfat) terhadap keaktifan -amilase ekstrasel SW2
Untuk mengetahui adanya pengaruh detergen anion, maka dalam percobaan digunakan SDS dengan konsentrasi sebesar 0,4%, 1,0% dan 1,5%. Dari data hasil percobaan (Gambar 4) terlihat keaktifan enzim menurun sejalan dengan bertambahnya konsentrasi SDS. Urea sebagai agen pendenaturasi protein juga mempengaruhi keaktifan enzim. Pada Gambar 3 konsentrasi urea 1 mM keaktifan enzim naik sampai ±6%. Selanjutnya keaktifan enzim menurun sejalan dengan bertambahnya konsentrasi urea. Pada konsentrasi urea 5 mM dan 10 mM keaktifan enzim menurun masing-masing sebesar ±1% dan ±20%. Gel Elektroforesis. Dari hasil elektroforesis (Gambar 5) diperoleh satu pita protein yang menunjukkan keaktifan katalitik enzim terhadap substrat pati. Terdapat beberapa hasil penelitian yang melaporkan bahwa isolasi -amilase dari sumber mikroorganisme termofil akan menghasilkan dua bentuk enzim -amilase. Menurut Long-Liu Lin et al1 apabila sumber karbon yang digunakan pada fermentasi berasal dari pati terlarut akan teridentifikasi dua pita amilase dengan massa molekul sekitar 150 dan 42 kDa. Akan tetapi apabila sumber karbon berasal dari pati mentah hanya satu pita amilase dengan massa molekul sekitar 150 kDa yang dapat teridentifikasi, karena protein dengan massa molekul 42 kDa kemungkinan diabsorbsi oleh sumber karbon yang tidak larut dalam air. Percobaan ini menggunakan pati mentah yang berasal dari kentang sehingga hanya amilase dengan massa molekul yang besar dapat teridentifikasi. Dengan menggunakan standar massa molekul diperkirakan pita protein yang
26
memiliki keaktifan mengkatalisis pati tersebut memiliki massa molekul sekitar 180 kDa.
220 170 116 76 53
(a) 1 2
(b)
3 4
Gambar 5. a.) Hasil uji elektroforesis (SDS-PAGE) enzim kasar -amilase ekstrasel SW2 (1 dan 2 = native enzim; 3 dan 4 = enzim yang terdenaturasi); b) penanda massa molekul protein
Kesimpulan Karekterisasi terhadap enzim kasar -amilase hasil isolasi dari bakteri termofil SW2 telah berhasil dilakukan. Diketahui bahwa enzim ini merupakan enzim ekstrasel dengan suhu dan tingkat keasaman optimum berturut-turut pada 70C dan pH 6,0. Sebagai tambahan, penelitian ini berhasil mengidentifikasi pengaruh ion-ion logam dan senyawa-senyawa pendenaturasi terhadap keaktifan katalitiknya. Karakter penting lainnya seperti kestabilan keaktifan menunjukkan bahwa
Jurnal Kimia Indonesia Vol. 1(1), 2006
Karakterisasi Enzim -Amilase Ekstraseluler dari Isolat Bakteri Termofil SW2
keaktifan enzim dapat dipertahankan pada suhu yang relatif rendah selama proses penyimpanannya (hasil tidak dicantumkan dalam makalah ini). Penghargaan. Penelitian ini dibiayai atas dana hibah Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Kementerian Ristek Republik Indonesia. Peneliti sangat berterima kasih atas fasilitas yang diberikan untuk melaksanakan sebagian dari penelitian ini kepada Pusat Pengkajian dan Penerapan Teknologi (PPPT), Serpong. Pustaka 1. Long-Liu Lin; Charng-Cherng Chyau; Wen-Hwei Hsu Biotechnol. Appl. Biochem, 1998, 28, 61-68. 2. Jei-Fu Shaw, Fu-Pang Lin, Su-Chiu Chen & HsingChen Chen. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 1995, 36, 195-200. 3. Vielle, C., G.J. Zeikus. Microbiology and Molecular biology Reviews, 2001, 65(1), 1-43. 4. Trismilah, Sumaryanto, Esti, W. Enzim -amilase dari B. Stearothermophilus DSM22 Menggunakan Kulit Buah Pisang Nangka sebagai Substrat dalam Prosiding Seminar Nasional Kimia Surabaya, 2000. 5. Dyah, P.M. Studi tentang Enzim Amilase Penghidrolisis Pati Mentah Ubi Kayu dari
Streptomyces sp. dalam Prosiding Seminar Bioteknologi Biomassa BPPT I. Jakarta, 1995. 6. Taji, N. (ed.). Handbook of amylase and related enzymes: Their sources, isolation methods, properties and applications. 1st edition. Pergamon Press: New Jersey, 1988. 7. Wiseman, A., (ed.). Topics in Enzymes and Fermentation Biotechnology. Ellis Horwood Limited: New York, 1979. 8. Kruger, N.J. J.M. Walker, (ed.). Methods in molecular biology (32) Basic protein and peptide protocols. Humana Press: New Jersey, 1994. 9. Bradford, M.N. Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254 10. Boyer, R.F. Modern experimental biochemistry. 2nd edition. Benjamin/Cumming Publishing: London, 1993. 11. Widyasti, E. Isolasi dan optimasi suhu dan pH pertumbuhan bakteri termofilik penghasil -amilase termostabil dalam Seminar Masalah Khusus Jurusan Biologi FMIPA IPB, Bogor, 2002. 12. Copeland, R.A. Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Laboratory Protocols. Chapman and Hall: New York, 1994. 13. Bush, D.S., L. Sticher, Huystee, R. van, D. Wagner, & R.L. Jones. J. Biol. Chem, 1989, 246(32), 1939219398.
27
