JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY ASCO KONGRESSZUS ÖSSZEFOGLALÓ KÖZLEMÉNY SPECIÁLIS KÖZLEMÉNYE

humán 20-51

3.

3/13/07

9:58 AM

ÉVFOLYAM,

JOURNAL

1.

OF

Page 20

SZÁM

–

2007.

FEBRUÁR

CLINICAL ONCOLOGY

ASCO KONGRESSZUS ÖSSZEFOGLALÓ KÖZLEMÉNY SPECIÁLIS KÖZLEMÉNYE

A humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2 vizsgálata emlôrákban: az American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists módszertani ajánlása Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Karen L. Hagerty, D. Craig Allred, Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad M. Hanna, Amy Langer, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes, Catharine Sturgeon, Sheila E. Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler és Daniel F. Hayes American Society of Clinical Oncology, Alexandria, VA; és College of American Pathologists, Northfield, IL. Közlésre benyújtva: 2006. szeptember 20-án; elfogadva: 2006. szeptember 27-én; az internetes változat a nyomtatott verziót megelôzôen, 2006. december 11-én jelent meg a www.jco.org honlapon. Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz és Daniel F. Hayes az American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists Expert Panel társelnökei. Nyilatkozat: az esetleges anyagi támogatással és a munkamegosztással kapcsolatos szerzôi nyilatkozat a közlemény végén található. Levelezési cím: American Society of Clinical Oncology, Cancer Policy and Clinical Affairs, 1900 Duke Street, Suite 200, Alexandria, VA 22314; e-mail: [email protected]. Az ajánlás az American Society of Clinical Oncology és a College of American Pathologists szervezetek közötti együttmûködés keretében született. Az ajánlás Journal of Clinical Oncology és az Archives of Pathology & Laboratory Medicine folyóiratokban felkérésre, mindkét részrôl kölcsönös jóváhagyást követôen került közlésre. Copyright © 2006 American Society of Clinical Oncology és College of American Pathologists. Minden jog fenntartva. A dokumentum bármely része csak az American Society of Clinical Oncology vagy a College of American Pathologists írásbeli engedélyével sokszorosítható vagy továbbítható bármiféle, elektronikus vagy mechanikus módon, így fényképmásolat, hangfelvétel, vagy bármilyen egyéb információtároló és -visszakeresô rendszer segítségével. 0732-183X/07/2501-1/$20.00 DOI: 10.1200/JCO.2006.09.2775

20

Ö S S Z E F O G L A L Á S Célkitûzés Olyan ajánlást kívántunk kidolgozni, amely növeli invazív emlôrákban a humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2 (HER2) meghatározásának pontosságát, és segíti prediktív markerként történô alkalmazását. Módszerek Az American Society of Clinical Oncology és a College of American Pathologists közös szakértôi testületet hozott létre, mely a szakirodalom szisztematikus áttekintése alapján kidolgozta a HER2-vizsgálat optimális végzésére vonatkozó javaslatait. Az ajánlásokat választott szakértôk áttekintették, majd a két szakmai szervezet igazgatótanácsa elfogadta. Eredmények Jelenleg a HER2-vizsgálatok körülbelül 20%-át pontatlanul végzik. A rendelkezésre álló adatok alapján nem dönthetô el, hogy a tesztek gondos validálását követôen immunhisztokémiai vizsgálat (IHC) vagy in situ hibridizáció (ISH) alapján lehet-e jobban elôrejelezni az antiHER2 terápia hatását. Ajánlások A szakértôi testület ajánlása szerint meg kell határozni minden invazív emlôrákos beteg HER2-státusát, melyhez a teszt pontos és reprodukálható elvégzésén alapuló vizsgálati algoritmust javasolnak. Az alkalmazható módszerek közé tartoznak az újabban kapható, világos látóterû ISH vizsgálatok is. Specifikálásra kerülnek azok a pontok (például mintakezelés, a vizsgálat elvégzését kizáró tényezôk, adatközlési kritériumok), melyeknél csökkenthetô a vizsgálati eredmények variabilitása. Az ajánlott vizsgálati algoritmus a HER2-fehérje-expreszszió és génamplifikáció vizsgálat esetében is specifikálja, hogy az eredmény mikor pozitív, nem egyértelmû vagy negatív. A HER2 eredménye akkor pozitív, ha az IHC festés eredménye 3+ (a membrán egyenletesen és intenzíven festôdik az invazív tumorsejtek > 30%ánál), illetve a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) alapján sejtmagonként a HER2 gén kópiaszáma meghaladja a hatot, vagy a HER2 gén szignál és 17. kromoszóma szignál FISH alapján meghatározott aránya nagyobb, mint 2,2. A HER2 eredménye akkor negatív, ha az IHC festés eredménye 0 vagy 1+, vagy a FISH alapján a HER2 gén kópiaszáma sejtmagonként kevesebb, mint 4,0, illetve a FISH arány nem éri el az 1,8-et. Nem egyértelmû eredmény esetén a HER2 státus végleges eldöntése érdekében további lépésekre van szükség. Javasolt, hogy a HER2-vizsgálat végzésekor egy másik, pozitív és negatív értékek szem-

humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 21

A humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2 vizsgálata emlôrákban

pontjából validált teszttel 95%-os egyezést mutassanak a laboratóriumok. A szakértôi testület határozottan javasolja, hogy a laboratóriumi módszert vagy annak módosítását validálják, a munkafolyamat során standardizált eljárásokat alkalmazzanak, illetve az új vizsgálati kritériumok betartását szigorú laboratóriumi akkreditációs standardokkal, minôség-ellenôrzési vizsgálatokkal és a laboratóriumi személyzet hozzáértésének meghatározásával ellenôrizzék. A szakértôi testület azt ajánlja, hogy a HER2-vizsgálatok a CAP által minôsített laboratóriumban, vagy olyan intézményben történjenek, ahol teljesülnek a közleményben kijelölt akkreditációs és minôség-ellenôrzési feltételek. J Clin Oncol 25. Az ajánlás az American Society of Clinical Oncology és a College of American Pathologists szervezetek közötti együttmûködés keretében született. Az ajánlás a Journal of Clinical Oncology és az Archives of Pathology & Laboratory Medicine folyóiratokban felkérésre, mindkét részrôl kölcsönös jóváhagyást követôen került közlésre. Copyright © 2006 American Society of Clinical Oncology és College of American Pathologists. Minden jog fenntartva. A dokumentum bármely része csak az American Society of Clinical Oncology vagy a College of American Pathologists írásbeli engedélyével sokszorosítható vagy továbbítható bármiféle, elektronikus vagy mechanikus módon, így fényképmásolat, hangfelvétel, vagy bármilyen egyéb információtároló és -visszakeresô rendszer segítségével.

BEVEZETÉS

A humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2 gén ERBB2 (melyet általánosan HER2-nek neveznek) az emlôrákos betegek körülbelül 18–20%-ánál amplifikálódik.1 Az ERBB2 a v-erb-b2 eritroblasztos leukémia vírus onkogén homológ-2 gén HUGO Gene Nomenclature Committee által hivatalosan javasolt elnevezése; ez a tirozin-kináz receptorokhoz tartozó epidermális növekedésifaktor-receptor géncsalád egyik tagja. A szakirodalomban számos egyéb megjelölése használatos, például NEU, NGL, HER2, TKR1, HER-2, c-erb B2, HER-2/neu. A szakértôi testület úgy döntött, hogy ebben a közleményben az általánosan alkalmazott HER2 megnevezést fogja használni.2 Fokozott HER2-expresszió esetén döntôen az amplifikáció az a mechanizmus, aminek az eredményeként e daganatokban kórosan magas egy tirozin-kináz aktivitással rendelkezô, 185 kD nagyságú glikoprotein szintje.3 A fokozott HER2-expresszió összefüggésben áll az emlôrák kimenetelével.4–6 A HER2-státus ismerete potenciálisan több dologra alkalmas. Azoknál az újonnan diagnosztizált emlôrákos betegeknél, akik nem részesülnek adjuváns szisztémás kezelésben, HER2-pozitivitás esetén roszszabb a betegség prognózisa (nagyobb a relapszusok aránya és a mortalitás). Ezért a HER2-státus egyéb prognosztikai tényezôk mellett segíthet eldönteni, hogy történjen-e adjuváns szisztémás kezelés. A HER2-státus számos szisztémás terápia szempontjából is prediktív.6 A HER2-pozitivitás általában összefüggni látszik a hormonkezeléssel szembeni relatív, bár nem abszolút mértékû rezisztenciával.7 Vannak ugyan ellentmondások, de a preklinikai és klinikai vizsgálatok felvetik, hogy e hatás a szelektív ösztrogénreceptor-modulátor kezelésre, így például a tamoxifenre lehet specifikus, nem pedig az ösztrogénmegvonásos terápiákra (pl. aromatázgátlók).8 Úgy tûnik, a HER2-státus alapján elôre lehet jelezni a különbözô típusú kemoterápiás szerekkel szembeni rezisztenciát és érzékenységet is. HER2-pozitivitás esetén viszonylag, noha nem abszolút mértékben kisebb az anthracyclint és taxánt nem tartalmazó kemoterápiás protokollok hatásossága.9 A prospektív

www.jco.org

módon végzett, véletlen besorolásos klinikai vizsgálatok eredményeinek retrospektív elemzése viszont határozottan azt mutatta, hogy HER2-pozitivitás mellett a betegek reagálnak az anthracyclin-terápiára; mindazonáltal e hatás talán annak a következménye, hogy a HER2 az e szerek közvetlen támadáspontját jelentô topoizomeráz II-vel együtt amplifikálódik.10–13 Elôzetes adatok azt is felvetik, hogy a HER2 elôre jelezheti az áttétes betegségben alkalmazott vagy adjuvánsként adott paclitaxellel szembeni klinikai választ és annak erôsségét is.14,15 Talán az a legfontosabb, hogy mostanáig több vizsgálat kimutatta: a HER2-re ható szerek kifejezetten eredményesek áttétes kórfolyamatokban, vagy adjuváns terápiaként adva. A trastuzumab (Herceptin; Genentech, South San Francisco, CA), egy monoklonális ellenanyag mellett növekszik a reagáló betegek aránya, meghosszabbodik a progresszióig eltelt idô, sôt még a túlélés is jobb, amikor monoterápiában vagy a kemoterápia kiegészítéseként áttétes emlôrák kezelésére adják a szert.16 A trastuzumab önmagában is hatásos,17,18 és 1998-ban az Egyesült Államok gyógyszerfelügyelete (US Food and Drug Administration) engedélyezte áttétes emlôrák kezelésére. Igen fontos tény, hogy öt nemzetközi, véletlen besorolásos klinikai vizsgálat is igazolta, hogy az adjuvánsként adott trastuzumab felével csökkenti a kiújulás, harmadával pedig a halálozás kockázatát korai stádiumú emlôrákos betegeknél.19–23 Az újabb eredmények szerint a lapatinib (Tykerb, GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA), mely kis molekulájú, kettôs HER1/HER2 tirozinkináz-inhibitorként gátolja a HER2 tirozinkináz-aktivitást, a capecitabin kiegészítéseként adva javítja az elôrehaladott stádiumú betegség kórjóslatát.24 Mindent egybevetve, a fenti eredmények jelzik, hogy a HER2 markerként segíthet az emlôrák eseteiben hozott terápiás döntéseknél, egyszersmind hangsúlyozzák, mennyire fontos, hogy a vizsgálat pontos eredményt adjon. A génamplifikációt kezdetben Southern hibridizációval mutatták ki fagyasztott tumormintákban. Késôbb fedezték fel, hogy ez összefügg a fokozott mRNS-expresszióval és a magasabb fehérjeszintekkel.25 Az elsô vizsgálatok során, amikor a

21

humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 22

Wolff és mtsai

1. táblázat. A HER2-vizsgálat feltételei a trastuzumab adjuváns adását elemzô öt véletlen besorolásos tanulmányban IHC Résztvevôk Klinikai vizsgálat száma

FISH

Módszer

Pozitív

CISH

Módszer

Pozitív

Módszer

Pozitív

NSABP B3121

2119

Bármilyen típusú intézeti módszer

3+ (2+, ha a FISH+); 3+ esetében legalább 10%-os festôdés


Amplifikáció (HER2:CEP17 arány ⭓ 2)

–

NCCTG 983121

3505


3+ (2+, ha a FISH+); 3+ esetében legalább 10%-os festôdés



–

HERA22,23

5081


3+ (2+, ha a FISH+); a definíciókat a cikkben nem adják meg



–

BCIRG 00619

3222

–

–

Vysis PathVysion


–

FinHer20

1010 összesen Bármilyen típusú (a HER2+ ntézeti módszer alcsoportban 232)

Helyi kritériumok

–

Központi laboratóriumban végzett módszer

Központi laboratórium szerepe Elôször intézeti vizsgálat, azonban a tévesen pozitív HER2-eredmények túlságosan nagy kezdeti aránya30 miatt az eredményeket kötelezô volt megerôsíteni központi (Dako IHC HercepTest, teszthez a mellékelt leírás szerinti definíció alapján legalább 10%-os festôdés minôsült pozitívnak), vagy akkreditált laboratóriumban (itt Dako IHC HercepTest vagy egyéb IHC módszert használtak; pozitív lelet esetén a sejtek több mint 30%-a festôdött erôsen); az intézetben kimutatott IHC3+ esetében a központi laboratóriumnak meg kellett erôsítenie az eredményt Dako HercepTest alkalmazásával; a központi FISH vizsgálatot Vysis PathVysion segítségével végezték, habár a klinikai vizsgálat során elfogadták a bármilyen egyéb módszerrel helyben végzett FISH vizsgálat eredményét Elôször intézeti vizsgálat, azonban a tévesen pozitív HER2-eredmények túlságosan nagy kezdeti aránya31 miatt az eredményeket kötelezô volt központilag megerôsíteni Dako HercepTest alkalmazásával; az intézetben kimutatott FISH+-t központilag, Vysis PathVysion segítségével kellett megerôsíteni Az intézetben kimutatott IHC 3+ eredményeket kötelezô volt központilag megerôsíteni Dako HercepTest alkalmazásával; az intézetben kimutatott FISH+-t központilag, Vysis PathVysion segítségével kellett megerôsíteni Kötelezô központi vizsgálat

Amplifikáció Az intézetben kimutatott IHC 2+ vagy 3+ esetén (⭓ 6 jel/sejtmag a központi megerôsítésre volt szükség CISH alkalmazásával sejtek > 50%-ában; nem egyértelmû eredmény esetén CEP17 hibridizáció is történt) 32

Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; IHC, immunhisztokémia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; CISH, kromogén in situ hibridizáció; NSABP B-31, National Adjuvant Breast and Bowel Project B31 jelû vizsgálata; NCCTG 9831, North Central Cancer Treatment Group 9831 jelû vizsgálata; HERA, Herceptin Adjuvant vizsgálat; BCIRG 006, Breast Cancer International Research Group 006 jelû vizsgálata; FinHer, Finland Herceptin vizsgálat.

trastuzumabot áttétes emlôrákban adták, a HER2-státust egy központi laboratóriumban immunhisztokémiai (IHC) módszerrel határozták meg anti-HER2 4D5 és CB11 ellenanyaggal (az anti-HER2 4D5 ellenanyag a trastuzumab alapvegyülete), formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szövetekben. Ez a klinikai vizsgálatokhoz használt módszer a festôdési jellegzetességek alapján a HER2-státust negatívként (0 és 1+) vagy pozitívként (2+ és 3+) sorolta be. E tanulmányokba csak 2+ vagy 3+ festôdést mutató betegeket lehetett bevonni. A retrospektív elemzések felvetették, hogy csak az IHC 3+ és/vagy fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) szerint HER2-génamplifikációval rendelkezô betegeknél volt elônyös a kezelés16 (lásd még C függeléket). A FISH és az IHC egyezését elemezve késôbb kimutatták, hogy az IHC 2+ daganatoknak csupán 24%-a mutat a FISH vizsgálat alapján génamplifikációt.26 A trastuzumabbal 0 vagy 1+, nem amplifikált HER2-státusú betegek körében eddig egyetlen véletlen besorolásos vizsgálat történt; az elôzetes eredményekrôl már jelent meg beszámoló.27 Ebben a vizsgálatban nem járt statisztikailag szignifikáns elônnyel az, ha a trastuzumabot a paclitaxel kiegészítéseként adták HERnegatív emlôrákos nôknek, azonban a vizsgálat stitisztikai ereje csekély volt. További korlátot jelentett, hogy a HER2-t nem központi laboratóriumban vizsgálták.

22

A kezdeti kutatások felvetették, hogy az emlôrákos esetek akár 30%-ánál is fokozott HER2-expresszió áll fenn.1,25 Mindazonáltal valószínû, hogy e tanulmányokban túlbecsülték a HER2-pozitivitás arányát, és – mivel az adatok elsôsorban nagy kockázatú, korai stádiumú emlôrákos kohorszokból és áttétes betegségben szenvedôkbôl származnak – az általános, nem szelektált populációban kisebb a HER2-pozitivitás prevalenciája. Úgy tûnik, a HER2-pozitív emlôrákok gyakorisága kisebb abban az esetben, ha az összes olyan beteget figyelembe veszik, akiknél újonnan diagnosztizálták az invazív emlôrákot. Yaziji és munkatársai28 nemrégiben nagy mintaszámon végzett vizsgálata kapcsán arról számoltak be, hogy a vizsgált minták 18%-a (n = 2913) mutatott FISH alapján génamplifikációt (definíció szerint, náluk a HER2:CEP17 arány ⭓ 2 volt). Owens és munkatársai29 egy hasonló, leíró jellegû vizsgálat során azt állapították meg, hogy az IHC-vel vizsgált 116 736 minta 20%-ában, a FISH-sel elemzett 6556 minta 22,7%-ában fokozott a HER2-expresszió gyakorisága. Öt olyan véletlen besorolásos vizsgálat eredményét közölték 2005 óta, melyeknél az adjuvánsként adott trastuzumab hatását a trastuzumabot nem tartalmazó protokollokéval vetették össze. Ezek kapcsán különbözô eljárásokat alkalmaztak a fokozott HER-expresszió meghatározására vagy

JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY

humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 23


2. táblázat. A szövettani mintákon alkalmazott HER2-vizsgálati módszerek: klinikai vizsgálatok, klinikai gyakorlat és fejlesztés alatt álló módszerek HER2 fehérje Paraméter

HER2 gén

IHC

FISH

Módszer

CTA

HercepTest

Pathway

Gyártó Módszertan

Helyi módszer CB11 és 4D5 monoklonális ellenanyagok

DAKO* A085 poliklonális ellenanyagok

Ventana† CB11 monoklonális ellenanyag

Pontozási kritériumok

0 és 1+ negatív, 2+ gyengén pozitív, 3+ erôsen pozitív

Gyengén pozitív (2+): Pozitív (2+): gyenge–közepes gyengén festôdik mértékben festôdik a membrán egésze a membrán egésze a tumorsejtek > 10%-ában; a tumorsejtek > 10%-ában; pozitív (3+): erôsen pozitív (3+): nagymértékben festôdik nagymértékben festôdik a membrán egésze a membrán egésze a tumorsejtek > 10%-ában† a tumorsejtek > 10%-ában*

Státus

Kutatási célra Az FDA jóváhagyta használt módszer, melyet a trastuzumab áttétes emlôrákban való alkalmazásával kapcsolatos tanulmányokban használnak

Az FDA jóváhagyta

PathVysion HER2 DNS-szonda készlet Abbott‡ Fluoreszcens DNS-szondák hibridizálása HER2-génhez (narancssárga színû) és a 17-es kromoszóma centromer régiójához (zöld színû) HER2 amplifikáció: HER2/CEP 17 arány 60 sejtben átlagosan ⭓ 2; a határértéken vagy annak közelében levô eredményeket (1,8–2,2) óvatosan kell értelmezni34,35

Az FDA jóváhagyta

CISH INFORM HER2/neu szonda Ventana§ Biotinnal jelölt DNS-szondák hibridizálása HER2-génhez és fluoreszencens módon jelölt avidinhez

SPoT-Light

Invitrogen/Zymed¶ Digoxigeninnel jelölt DNS-szonda hibridizálása HER2-génhez; a detektálás egér anti-digoxigenin ellenanyaggal, majd anti-egérellenanyag peroxidázzal történik HER2 amplifikáció: A nagy HER2 átlagosan ⭓ 6 amplifikáció HER2-génkópia/sejtmag; definíció szerint egy közlemény nem azt jelenti, hogy egyértelmûként értékelte, a festôdési pontok ha 60 sejt esetében a száma > 10, vagy nagy génkópiák átlagos száma halmazok (clusterek) sejtmagonként vannak jelen > 4,0 és < 6,0 közötti35,36 (az amplifikáció kicsi, ha a festôdési pontok száma 5–10, vagy csak kis halmazok vannak jelen), vagy ha többszörösen vannak jelen HER2-gén festôdési pontok és nagy halmazok a tumorsejtek > 50%-ának sejtmagjában37 Az FDA jóváhagyta A DNS-szondakészlet az Egyesült Államokban nem áll rendelkezésre

SISH EnzMet GenePro Ventana Dinitrofenollal jelzett DNS-szonda hibridizálása HER2-génhez; a detektálás peroxidázzal jelölt multimerrel, majd enzim-metallográfiával történik Amplifikáció esetén a festôdési pontok száma legalább hat, vagy az invazív tumorsejtek legalább 30%-ában nagy ponthalmaz van jelen38

A DNS-szondakészlet az Egyesült Államokban nem áll rendelkezésre

Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; IHC, immunhisztokémia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; CISH, kromogén in situ hibridizáció; SISH, ezüstözéses in situ hibridizáció; CTA, klinikai vizsgálatokhoz használt módszer; HercepTest, Dako A/S, Glostrup, Dánia; FDA, US Food and Drug Administration. *http://www.dakousa.com/prod_downloadpackageinsert.pdf?objectid=105073003 †http://www.ventanamed.com/products/files/ScoringGuide.pdf ‡http://www.vysis.com/PathVysionHER2DNAProbeKit_35793.asp §http://www.ventanamed.com/catalog/search_detail.html?id=402&categories_id=4 ¶https://catalog.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=viewCatalog.viewProductDetails&productDescription=10,952&CMP=LEC-GCMSSEARCH&HQS=HER2.

megerôsítésére (1. táblázat). A kemoterápia alatt és/vagy után korai stádiumú emlôrákban szenvedô nôknek adjuvánsként adott trastuzumab hatására a betegségmentes túlélés19,20 és az összegzett túlélés21–23 szignifikánsan javult akkor, ha a betegnél a HER2 fokozott expresszióját észlelték. Jelenleg általánosan elfogadott, hogy a fokozott HER2-expresszió predikciós értéke nagy abból a szempontból, hogy áttétes betegségben39 és adjuvánsként adva klinikailag elônyös-e a trastuzumab adása. A fentiek ismeretében az American Society of Clinical Oncology (ASCO) tumormarkerek alkalmazásával foglalkozó szakértô testülete, a Tumor Marker Guidelines Panel 2001 óta javasolja, hogy az újonnan diagnosztizált és áttétet adott emlôrákok esetében rutinszerûen kerüljön sor a HER2 meghatározására.39 Összefoglalva tehát a HER2-státust rutinszerûen meg kell határozni minden újonnan diagnosztizált emlôrák esetén. Továbbra sem egyértelmû azonban, melyik módszer a legjobb a HER2-státus megállapítására, azaz milyen típusú eljá-

www.jco.org

rást alkalmazzanak, és ennek mi legyen az optimális módja. Az adjuváns trastuzumabbal kapcsolatban végzett prospektív, véletlen besorolásos tanulmányok legtöbbjében valamilyen mértékben önkényesen fejlesztették ki a HER2 kimutatásához használt vizsgálati algoritmust. Van olyan, amely FISH módszerrel kiegészített IHC vizsgálaton alapul (ha az IHC eredménye 2+), de van olyan is, melynél kizárólag ISH-t használtak a 2,0 vagy annál nagyobb génamplifikációs arányok kimutatására.19–22,30,31,33,40 E kutatásokban csak olyan betegek vehettek részt, akiknél a FISH eredménye génamplifikációra, vagy az IHC fokozott fehérjeexpresszióra (3+) utalt. A legtöbb esetben ezeket az algoritmusokat a klinikai gyakorlatban is átvették. Az algoritmusok alkalmazásához szükséges adatokat szolgáltató módszereket még nem standardizálták. A szöveti HER2 meghatározására számos módszerrel próbálkoztak (2. táblázat). A US Food and Drug Administration szabályzata azt is lehetôvé teszi a kórszövettani laboratóriumok számára,

23

humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 24

Wolff és mtsai

3. táblázat. A HER2-vizsgálati eredmények változékonyságának okai Preanalitikai Fixálásig eltelt idô Szövetfeldolgozás módszere Fixálás idôpontja Fixálás módja Analitikai Módszer validálása Készülék kalibrációja Standardizált laboratóriumi eljárások alkalmazása A személyzet gyakorlottsága és hozzáértése Antigénfeltárás módja Vizsgálathoz használt reagensek Standardizált kontrollvegyszerek használata Automatizált laboratóriumi módszerek használata Posztanalitikai Az eredmények értelmezési kritériumai Képelemzô rendszer használata Lelet formátuma Minôség-ellenôrzési folyamatok Laboratórium akkreditációja Külsô minôség-ellenôrzés Patológus hozzáértésének megítélése Rövidítés: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2.

hogy helyileg kifejlesztett módszereket használjanak az FDA által jóváhagyott analitspecifikus reagensek felhasználásával.41 Míg egyes módszereket gondosan validáltak, másokat – különösen helyileg kifejlesztett módszereket – nem. Két, az adjuvánsan adott trastuzumabot és trastuzumabot nem tartalmazó protokollt összehasonlító klinikai vizsgálat során prospektív alvizsgálatot végeztek. Ezek eredménye azt mutatta, hogy a területen (azaz a betegeket közvetlenül kezelô intézmény patológiai laboratóriumában) végzett HER2-vizsgálatok körülbelül 20%-ánál nem pontos az eredmény akkor, ha ugyanazt a mintát egy nagy mintaszámot feldolgozó központi laboratóriumban újraértékelik.30,40 Ez a szervezetlenség és pontatlansági arány nem elfogadható, különösen azért, mert e fontos teszt eredménye határozza meg egy bizonyos esetekben hatékony, de potenciálisan életveszélyes, ráadásul költséges kezelés alkalmazását. A trastuzumab-kezelésnek is vannak hátrányai. Bár áttétes emlôrákban a kezelés idôtartama változó, jelenleg azt javasolják, hogy adjuvánsként a trastuzumabot 12 hónapig adják. Az Egyesült Államokban egy 52 hetes trastuzumabkezelés egy területi kórházban, átlagos árak alapján számolva 100 000 dollár körüli összegbe kerül (www.accc-cancer.org). Ehhez járul még, hogy az adjuváns kemoterápia befejezése után 9–12 hónapig tartó intravénás kezelésre is szükség van. Meg kell jegyezni azt is, hogy trastuzumab mellett kismértékben ugyan, de fennáll a súlyos kardiális toxicitás veszélye.42 A véletlen besorolásos adjuváns kezelést prospektív módon elemzô kutatások során a kardiális állapot gondos és rendszeres ellenôrzése arra utalt, hogy a legfeljebb 3 éves középideig tartó utánkövetés során kardiális diszfunkció a betegek körülbelül 5–15%-ánál jelentkezett, míg trastuzumab-kezelés során súlyos fokú kardiális esemény (így pangásos szívelégtelenség) 1–4%-ban alakult ki.43–45

24

Mindent egybevetve, a trastuzumabbal kapcsolatos elônyök, a nagy költségek és a potenciális kadiotoxicitás miatt szükséges a HER2-vizsgálat pontos elvégzése. Ha arany standardként a terápiára adott választ tekintenénk, az ideális HER2-vizsgálat érzékenységének és fajlagosságának meg kellene közelítenie a 100%-ot. (Ebben az esetben a vizsgálattal az összes olyan HER2-pozitív beteget ki lehetne mutatni, akik számára elônyös a specifikus terápia – ôk képezik a valódi pozitív eseteket; illetve az összes olyan HER2-negatív beteget, akik számára a specifikus terápia nem használ – ôk alkotják a valódi negatív eseteket.) Két dolgot azonban nem szabad elfelejteni. Egyrészt a pontosság („accuracy”) pontos definíciója az, hogy a mért értékek mennyire állnak közel egy feltételezett valódi értékhez, ennélfogva magában foglalja a vizsgálati eredmények variabilitását, továbbá az átlagos mért érték és a valódi érték közötti szisztémás különbséget jelzô torzítást. E fogalmakkal magától értetôdôen együtt jár, hogy kell lennie egy megfelelô arany standardnak, amivel a valódi státust minden egyes minta esetében meg lehet állapítani. Másrészt a HER2-státusra sem szabad úgy tekinteni, mint ami kizárólagosan eldönti az anti-HER2-terápia, így a trastuzumab adásának hatásosságát. A fokozott HER2-expressziót mutató emlôrákos betegek trastuzumabra adott klinikai válasza nagymértékben különbözô. A rendelkezésre álló klinikai adatok megközelítôleg jelzik ugyan, hogy vannak olyan betegek, akik valóban fokozottan expresszálják a HER2-t, azonban náluk a HER2-expressziót szabályozó mechanizmusokat, illetve a HER2 hatását érintô eltérések miatt a trastuzumab hatástalanná válik. Ennek ellenére nem lenne helyes e betegeket HER2-negatívnak tekinteni. Ehelyett továbbra is az a feladat, hogy újabb defektusokat definiáljunk annak érdekében, hogy a HER2-pozitivitást ilyen esetekben is a megfelelô terápiás kontextusba lehessen helyezni. A nemzetközi patológustársadalom azon törekvései ellenére, hogy elôsegítsék a HER2-vizsgálatot a rutin klinikai gyakorlatban,46–50 az IHC és a FISH esetében továbbra is fontos probléma a vizsgálatok pontatlansága.30,31,40 A klinikai gyakorlatban és a klinikai tanulmányok során megfigyelt nagy variabilitást számos tényezô magyarázhatja, ezeket a 3. táblázat összegzi. Mivel a terápia kiválasztása egyedül az alkalmazott laboratóriumi módszerektôl függ, ez nagy feladat elé állítja a módszert alkalmazó és leletet kiadó patológust, illetve a klinikai döntés során eredményekre támaszkodó onkológust egaránt. Ezért az ASCO és a College of American Pathologists (CAP) szervezetek létrehoztak egy olyan, a klinikai gyakorlat számára ajánlást kidolgozó szakértôi testületet, melynek a feladata emlôrákban a HER2-vizsgálattal kapcsolatos javaslatok kidolgozása. A probléma jellegével kapcsolatban a C (A HER2-státus és a trastuzumab-adás elônyei közötti kapcsolatra utaló bizonyíték) és a D függelék (Nem egységes HER2-vizsgálati eredmények) nyújt információt.


humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 25


Az ajánlásban tárgyalt kérdések

Ez az ajánlás két alapvetô kérdést tárgyal a HER2-vizsgálattal kapcsolatban. A javaslatokat a 4. táblázat összegzi. 1. Mi a HER2-státus megállapítására használt optimális vizsgálati algoritmus? 2. Milyen stratégiák segíthetik a bevett módszerek esetében az optimális mûködést, értelmezést és adatközlést? a. Mi az a szabályrendszer, ami elôsegíti a fokozott vizsgálati pontosságot? b. Melyek azok az optimális külsô minôségbiztosítási módszerek, melyek folyamatosan biztosítják a HER2-vizsgálat pontosságát? c. Hogyan lehet e törekvéseket a gyakorlatban megvalósítani és a hatást mérni? Gyakorlati ajánlások

A gyakorlati ajánlások olyan szisztematikusan kifejlesztett megállapítások, melyek adott klinikai körülmények esetére segítséget nyújtanak a gyakorló orvosok és betegek számára az egészségügyi ellátásra vonatkozó döntések meghozatalához. A jó ajánlásokat validitás, megbízhatóság, reprodukálhatóság, klinikai alkalmazhatóság, a különbözô klinikai helyzetekben rugalmasság, egyértelmûség, multidisziplináris jelleg, a bizonyítékok áttekintése és dokumentáció jellemzi. Az ajánlások segíthetnek javítani az ellátás színvonalát és csökkenteni a költségeket. A klinikai ajánlások alkalmazásának köszönhetôen: 1. javulhat a kezelés eredménye; 2. emelkedhet az orvosi ellátás színvonala; 3. lehetôség nyílhat arra, hogy a klinikai gyakorlatban minél kisebbek legyenek a szükségtelen különbségek; 4. a kezelôorvosok segítséget kapnak a döntések meghozatalához; 5. referenciaként szolgálhatnak az orvosok számára a tájékozódás és képzés során; 6. önértékelési szempontnak tekinthetôk; 7. a külsô minôség-ellenôrzés kapcsán indikátorként és kritériumként használhatók; 8. segítséget jelenthetnek a térítési költségek meghatározásában, továbbá a biztosítás körének megítélésében; 9. a megbízhatósággal kapcsolatos döntések során kritériumként szolgálhatnak; 10. segítségükkel meghatározhatók azok a területek, ahol további kutatásra van szükség. Az emlôrákos betegek HER2-vizsgálatára vonatkozó útmutatások kidolgozásakor az ASCO és CAP figyelembe vette a fenti alapelveket, és hangsúlyozta annak fontosságát, hogy az áttekintett adatok megfelelôen kivitelezett és elemzett klinikai vizsgálatokból származzanak. Meg kell jegyezni azonban, hogy a betegek közti egyéni különbségekre nem lehet mindig alkalmazni az ajánlásokat. Az ajánlások célja nem az, hogy helyettesítsék az egyes betegeknél vagy speciális klinikai körülmények esetén az orvos döntését. Nem tartalmazzák az összes megfelelô kezelési módszert sem, ezek

www.jco.org

alapján nem lehetne kizárni más kezeléseket sem, melyek kapcsán megalapozott a feltételezés, hogy ugyanazt a terápiás eredményt hoznák. Ezért az ASCO úgy tekinti, hogy ezen ajánlások betartása önkéntes, alkalmazásukra vonatkozóan a végsô döntést az adott beteg egyedi körülményeinek ismeretében az orvosnak kell meghoznia. Ráadásul az ajánlások a klinikai gyakorlatban alkalmazott eljárásokat és terápiákat részletezik. Ennélfogva nem alkalmazhatók klinikai vizsgálatok keretében végzett beavatkozások kapcsán, ugyanis a klinikai vizsgálatok megtervezésekor a cél az, hogy az újabb módszereket értékeljék és validálják azokban a betegségekben, melyekben szükség van a betegbesorolás és a kezelés javítására. Mivel az ajánlások kidolgozása során a legújabb szakirodalmi adatok áttekintésére és összegzésére is sor kerül, egy gyakorlati ajánlás abban is segít, hogy a további kutatás számára fontos kérdéseket és körülményeket állapítson meg. MÓDSZEREK A szakértôi testület összetétele

Az ASCO Health Services Committee (HSC) és a CAP Council on Scientific Affairs (CSA) szervezetek közösen egy olyan szakértôi testületet hoztak létre, melynek tagjai ismerték a HER2-vizsgálattal kapcsolatos klinikai tapasztalatokat és kutatási eredményeket, járatosak voltak az onkológiában, patológiában, epidemiológiában és biostatisztikában. A testületben egyetemi klinikákon és területi kórházakban dolgozó orvosok és betegképviselôk is jelen voltak. Az US Food and Drug Administration, a Centers for Medicare and Medicaid Services, a National Cancer Institute és a National Academy of Clinical Biochemistry szervezetek képviselôi külsô tagként vettek részt a munkában. A testület tagjainak egy része kormányhivatalok alkalmazásában állt. Véleményük egyéni, azaz nem feltétlenül egyezik meg munkahelyük hivatalos véleményével. A szakértôi testület tagjait az A függelék A1 táblázata mutatja be. Az üzleti szolgáltatást nyújtó laboratóriumok, továbbá a diagnosztikumokat vagy gyógyszereket gyártó cégek képviselôit (B függelék, A2 táblázat) vendégként hívták meg az ASCO központjában 2006 márciusában tartott testületi találkozó nyílt részére. A szakirodalmi adatok áttekintése és elemzése

Irodalomkutatási stratégia. Az alábbi elektronikus adatbázisok 1987. január és 2006. február közötti idôszakra vonatkozó tartalma került elemzésre: MEDLINE, PreMEDLINE, Cochrane Collaboration Library. Ezen túlmenôen az ASCO vagy CAP kongreszszusokon 2000 és 2005 között, a San Antonio Breast Cancer Symposium esetében 2003 és 2005 között bemutatott elôadáskivonatokat is elemeztük. Az irodalomkutatás eredményeit kiválasztott áttekintô közlemények és egyedi adatok részletes kutatásával is kiegészítettük. A MEDLINE kutatás során az alábbi kifejezések alapján kerestünk: „immunhisztokémia”, „in situ hibridizáció, fluoreszcens”, „gének, erbB2”, „receptor, erbB2”, „receptor, epidermális növekedési faktor”, „emlôdaganatok” és „epidermális növekedésifaktor-receptor-neu receptor”. A kutatást különbö-

25

humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 26

Wolff és mtsai

4. táblázat. Az ajánlásban adott javaslatok összegzése Ajánlás A HER2-vizsgálat optimális algoritmusa

Optimális FISH vizsgálat feltételei

Optimális IHC vizsgálat feltételei

Optimális szövetkezelés feltételei

A teszt optimális belsô validálása

Optimális belsô QA eljárások

Optimális külsô minôség-ellenôrzés

Optimális laboratóriumi akkreditáció

A HER2-státus pozitív, ha az IHC HER2 3+ (definíció szerint az invazív tumorsejtek több mint 30%-án a membrán intenzíven festôdik), vagy a FISH amplifikációt jelez (a HER2:CEP 17 arány > 2,2, vagy ha a belsô kontrollpróbát nem használó vizsgálati rendszereknél az átlagos HER2-gén kópiaszám több mint 6 jel/sejtmag) Definíció szerint a HER2-státus nem egyértelmû, ha az IHC 2+, vagy a FISH amplifikációs arány 1,8–2,2, vagy ha a belsô kontrollpróbát nem alkalmazó vizsgálati rendszereknél az átlagos HER2-gén kópiaszám 4–6 jel/sejtmag Definíció szerint a HER2-státus negatív, ha az IHC 0–1+, vagy a FISH arány < 1,8, vagy ha a belsô kontrollpróbát nem alkalmazó vizsgálati rendszereknél a HER2-gén kópiaszám < 4 jel/sejtmag Ezek a meghatározások az alábbiak laboratóriumi dokumentálásától függnek: 1. Annak igazolása, hogy a kezdeti tesztvalidálás megtörtént, amelynek kapcsán bizonyítást nyert, hogy a pozitív és negatív HER2-eredmények 95%-ban megegyeznek ugyanazon vagy egy másik validált HER2-vizsgálati módszer eredményeivel 2. Folyamatosan történik a belsô QA 3. Külsô minôség-ellenôrzési programban való részvétel 4. Validált akkreditáló szervezet által kiadott érvényes akkreditáció Hat óránál rövidebb vagy 48 óránál hosszabb ideig tartó szöveti fixálás nem javasolt A vizsgálatot nem szabad elvégezni vagy meg kell ismételni, amennyiben • A kontrollok nem a várt eredményt adják • A vizsgáló nem talál vagy nem tud leszámolni legalább két olyan területet, ahol invazív tumorsejtek vannak • A jelek > 25%-a a gyenge jelintenzitás miatt nem értékelhetô • A jelek > 10%-a a citoplazma területén észlelhetô • A sejtmagok nem megfelelôen láthatók • Az autofluoreszcencia nagyon erôs Az eredményeket legalább 20 sejt leszámolása alapján lehet értelmezni; a patológusnak meg kell arról bizonyosodnia, hogy a leszámolt sejtek invazív daganatból származnak További sejtek leszámolására van szükség és/vagy a vizsgálatot meg kell ismételni, ha az eredmény kétséges; a leletnek tartalmaznia kell az ajánlásban részletezett adatokat (lásd 10. táblázat) Hat óránál rövidebb vagy 48 óránál hosszabb ideig tartó szöveti fixálás nem javasolt A vizsgálatot nem szabad elvégezni vagy meg kell ismételni, amennyiben • A kontrollok nem a várt eredményt adják • A minta legnagyobb részén mûtermék látható • A mintában az egészséges mirigykivezetô csövek membránja erôsen festôdik (belsô kontrollok) Az értékelés az ajánlásban megadott javaslatokat kövesse • Pozitív HER2 eredmény esetében homogén, fekete körkörös (dróthálószerû) festôdést kell mutasson az invazív daganat > 30%-a • Az értékelést végzô szakembernek rendelkeznie kell olyan módszerrel, mellyel biztosítható az állandóság és a szakértelem A mintából FISH vizsgálatot kell végezni, ha az elsô eredmények nem egyértelmûek. A leletnek tartalmaznia kell az ajánlásban részletezett adatokat (lásd 9. táblázat) A mintavételtôl a fixálásig eltelt idô minél rövidebb legyen; a HER2-vizsgálatokra vett mintákat neutrális vegyhatású formalinban kell fixálni 6–48 órán át; a mintákat a megfelelô makroszkópos megtekintés és a szélek meghatározását követôen 5–10 mm vastagságú szeletekre kell vágni, majd megfelelô mennyiségû neutrális formalinba helyezni A szövettani szeletek esetében nem ideális a HER2-vizsgálat elvégzése, ha több mint 6 hét telt el a kimetszés óta; ez az elsôdleges fixálási és tárolási feltételekkel összefüggésben változhat A fixálásig eltelt idô hosszát és a fixálás idôtartamát minden egyes minta esetében dokumentálni kell A teszt validálását el kell végezni, mielôtt a tesztet klinikai alkalmazásra kínálná a laboratórium A vizsgálat kezdeti validálásakor 25–100 mintát kell megvizsgálni ugyanabban a laboratóriumban validált másik módszerrel, vagy egy másik laboratóriumban validált módszerrel Igazolása annak, hogy a teszt kezdeti validálásakor a pozitív és negatív HER2-eredmények 95%-ban megegyeznek egy másik validált módszerrel kapott eredményekkel, vagy ugyanazon HER2-kimutatásra használt, de validált módszer eredményeivel A folyamatos validálást kétévente kell elvégezni Teszt bevezetés elôtti validálása Folyamatos minôség-ellenôrzés és a készülék karbantartása A laboratóriumi személyzet kiképzése, majd folyamatos továbbképzése és hozzáértésének az ellenôrzése Standardizált mûködési protokollok kidolgozása, melyek részeként a kontrollanyagokat rutinszerûen használják Esetleges módosítás kapcsán az eljárás ismételt validálása A patológusok hozzáértésének folyamatos ellenôrzése, a szakemberek továbbképzése Külsô minôség-ellenôrzési programban való részvétel évente legalább két alkalommal (postán küldött minták feldolgozása) Kielégítônek tekinthetô a mûködési színvonal, ha bármely teszt esetében legalább 90%-os a helyesen megadott pontértékek aránya nem negatív minták esetén • Nem kielégítô mûködési színvonal esetén a laboratóriumnak meg kell hoznia az akkreditációs szervezet programjának elôírásai szerinti intézkedéseket Helyi ellenôrzés kétévente, önellenôrzés évente • Laboratóriumi validálási folyamat, módszerek, QA eredmények és QA folyamat, teszteredmények és leletek áttekintése • Nem kielégítô színvonalú mûködés esetén az adott módszerrel végzett HER2-vizsgálatot a laboratóriumban fel kell függeszteni

Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; IHC, immunhisztokémia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; QA, minôség-ellenôrzés.

26


humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 27


zô kombinációkban az alábbi kifejezések hozzáadásával szélesítettük: immunhisztokémia, immuncitokémia, „IHC”, fluoreszcens in situ hibridizáció, „FISH”, kromogén hibridizáció, „CISH”, arany-facilitált hibridizáció, autometallográfiás, világos mezô, „GOLDFISH”, HER2, erbB2, emlôrák, emlôdaganat. Az irodalomkutatást csak az angol nyelven megjelent közleményekre korlátoztuk. Az irodalomelemzés során nemcsak a véletlen besorolásos vizsgálatokat vettük figyelembe, hanem minden más típusú vizsgálatot – így a kohorsz-, gyógyszerhatás-, összehasonlító és prospektív tanulmányokat csakúgy, mint az esetsorozatokat. Az elemzés magában foglalta az egyesült államokbeli és nemzetközi szervezetek HER2-vizsgálatok végzésére vonatkozó ajánlásait és a minôségellenôrzésre használt stratégiákat is. Új információ érdekében a szerkesztôségi leveleket, a kommentárokat és a megjegyzéseket is áttekintettük. Az esettanulmányokat kizártuk. A bizonyítékok szisztematikus áttekintése érdekében azokat a cikkeket választottuk ki, melyek megfeleltek az alábbi feltételeknek: (1) a vizsgálat prospektív vagy retrospektív módon összehasonlította a FISH vagy az IHC negatív prediktív értékét (NPV, negative predictive value) vagy pozitív prediktív értékét (PPV, positive predictive value); megadta a különbözô módszerek közötti összehasonlítás módját; a HER2-státus meghatározására potenciálisan alkalmazott vizsgálati algoritmusokat tesztelt; vagy azt elemezte, hogy ugyanannál a betegnél hogyan függ össze a primer tumorban és az áttétben meghatározott HER2-státus; (2) a betegeknek invazív emlôrákja volt; (3) a kezelés eredményének ismertetésekor módszerekre lebontva és kombinálva megadták a HER2-státus meghatározására használt FISH és IHC pozitív és negatív prediktív értékét; megadták, hogy az egyes vizsgálati platformok között mekkora volt az egyezés, ismert a HER2-státus meghatározásának pontossága és az anti-HER2 terápia eredménye, az adott tesztek érzékenysége és fajlagossága. Figyelembe vettük azokat a tanulmányokat is, melyek a különbözô módszerekkel kapott eredményeket közvetlenül összehasonlították. A szakértôk áttekintették azon véletlen besorolásos kontrollos vizsgálatok eredményeit is, melyeket emlôrákos betegek bevonásával anti-HER2 gyógyszerekkel (pl. trastuzumab, lapatinib) összefüggésben végeztek. A szakértôi testület azokat a nem vakon végzett klinikai vizsgálatokat is figyelembe vette, melyek a szakirodalmi adatok alapján hasonlították össze a különbözô vizsgálóeljárásokat, megadták a tesztek legfontosabb jellemzôit, és a minôségbiztosítás érdekében stratégiákat fogalmaztak meg. A törvényi szabályozást (CMS és US Food and Drug Administration) képviselô szakemberek a törvényi szabályozás keretérôl adtak információt. Az Egyesült Államokban (CAP), Nagy-Britanniában és Kanadában (Ontario tartományban) minôség-ellenôrzéssel foglalkozó szakemberek azokról a programokról adtak információt, melyek a HER2-mérés alkalmazását és annak fejlesztését segítik elô. Annak érdekében, hogy meghatározzuk a HER2-vizsgálat oktatásának és a teszt végzésének jelenlegi állapotát, értékeltük annak a felmérésnek az adatait is, melyet a trastuzumab gyártója (Genentech) végzett, illetve elemeztük a nagy reagensgyártó cégek (Ventana, Dako, Abbott) és nagy klinikai laboratóriumi szolgáltatók (Clarient,

www.jco.org

Mayo Medical Labs, Phenopath, Quest, és US Labs) elôírásait. Ez az információ segítette a szakértôket abban, hogy eldöntsék, mi a legjobb vizsgálati algoritmus, specifikálhassák a HER2-vizsgálat feltételeit és kizárási kritériumait, valamint a szükséges minôségbiztosítást, melynek eredményeképpen javul a vizsgálat stabilitása és pontossága. Az ASCO/CAP szakértôi testület által végzett szakirodalmi áttekintés és adatelemzés. Az ASCO munkacsoport elôször áttekintette a közlemények összefoglalóit. Minden további, az eredeti irodalomkeresés során talált potenciálisan fontos összefoglalót az ASCO/CAP szakértôi elemeztek, hogy kiválasszák a megfelelônek ítélt tanulmányokat. Két szakember egymástól függetlenül minden egyes összefoglalót abból a szempontból tekintett át, hogy az menynyire releváns a klinikai kérdésekkel kapcsolatban. Ha véleményük különbözött, egy harmadik személyt vontak be az elemzésbe. Ezután minden kiválasztott összefoglalónál a közlemény teljes szövegét áttekintették. A beválogatási kritériumoknak megfelelô, kiválasztott vizsgálatok alapján úgynevezett „eredménytáblákat” („evidence tables”) hoztak létre. A bizonyítékokon alapuló konszenzus kifejlesztése

A szakértôi testület tagjai 2006 márciusában találkoztak; az ajánlással kapcsolatos további munkát elektronikus levelezés és videokonferencia révén fejezték be. Az összejövetel célja az volt, hogy még pontosabban megfogalmazzák az ajánlásban megválaszolni kívánt kérdéseket, és megírják az ajánlás adott részeit. A szakértôi testület minden tagja részt vett az ajánlás vázlatos kidolgozásában, melyet késôbb a testület minden tagja megkapott áttekintés céljából. A külsô referenseket is nyomatékosan kértük, hogy jelezzenek viszsza. Az ajánlás tartalmát és a közleményt az ASCO HSC és az igazgatótanács, valamint a CAP CSA és az irányítótestület a kiküldés elôtt áttekintette és jóváhagyta. Ajánlás és érdekütközés

A szakértôi testület minden tagja megfelelt az ASCO érdekütközéssel kapcsolatos politikájának, ami megköveteli minden olyan pénzügyi vagy egyéb érdekeltség kizárását, mely valós, potenciális vagy látszólagos kapcsolatként magyarázható. A szakértôi testület tagjai kitöltötték az ASCO érdekütközés kizárására vonatkozó nyilatkozatát. Arra is felkérték ôket, jelezzék, milyen kapcsolatban állnak azokkal a cégekkel, melyek olyan termékeket fejlesztenek, melyeket érinthet az ajánlás. Információt kellett adni az alkalmazásra, szakmai tanácsadásra, anyagi segítségre, honoráriumokra, kutatási támogatásra, szakértôi véleményre vagy a cég tanácsadói testületében való tagságra vonatkozóan is. A szakértôi testület esetenként bírálta el, hogy érdekütközés miatt kell-e korlátozni adott személy szerepét. Egyetlen esetben sem igazoltak korlátozást szükségessé tevô érdekütközést. Felülvizsgálati idôpontok

A szakértôi testület társelnökei és a társelnökök által kijelölt két szakember évenként fogja azt meghatározni, hogy az aktuális szakirodalmi adatok alapján szükség van-e az ajánlás módosítására. Ha igen, a potenciális változások megbeszélése érdekében a szakértôi

27

humán 20-51

3/13/07

9:58 AM

Page 28

Wolff és mtsai

testületet újra összehívják. Amikor szükséges, a szakértôi testület az ajánlás módosítását javasolja az ASCO HSC, a CAP CSA, az ASCO testülete és a CAP testülete felé, és kérni fogja annak áttekintését és a hozzájárulást. A vizsgált eredmények összefoglalása

A legfontosabb kérdés az volt, hogyan függ össze a HER2-státus és az anti-HER2-terápia. Ezenkívül vizsgáltuk, hogy a HER2-státus meghatározásához önmagában vagy kombinálva alkalmazott FISH és IHC esetében mekkora a PPV és NPV; milyen mértékû az egyes vizsgálóeljárások eredménye közti egyezés; mekkora a HER2-státus meghatározásának pontossága, az adott tesztek szenzitivitása és specificitása. Ezenkívül figyelembe vettük az újabb vizsgálóeljárások, így a világos látóterû in situ hibridizáció teljesítôképességét is, bár – mivel a US Food and Drug Administration eddig még nem hagyta jóvá alkalmazásukat – az ezekre vonatkozó adatok csak kiegészítô jellegûek voltak. Ez az ajánlás elsôsorban az IHC és a FISH módszerekre összpontosít. EREDMÉNYEK Irodalomkutatás

A kutatás elsô fázisában 1802 MEDLINE összefoglalót gyûjtöttünk ki. Az összefoglalók áttekintését az ASCO munkacsoportja végezte, és 1010 olyan összefoglalót válogatott ki, amelynél valamelyik kritérium nem teljesült. Az eredeti, szisztematikus áttekintés után fennmaradó 792, potenciálisan releváns összefoglalót az ASCO két külön szakembere egymástól független módon áttekintette. Ebben a lépésben 667 összefoglaló került kizárásra. A fennmaradó 125 közleményt teljes egészében áttekintették, és elemezték az azokban leírt kezeléseket és eredményeket. Az adatok metaanalízisére nem került sor, ugyanis a vizsgálatokat túlságosan heterogénnek ítélték értelmes kvantitatív szintézis elvégzéséhez. Korábbi ajánlások és konszenzusálláspontok

A HER2-vizsgálatra vonatkozóan az ASCO és a CAP szervezeteknek korábban külön ajánlásai és álláspontjai voltak.39,51 Ezeket azonban az elôtt dolgozták ki, hogy a trastuzumab adjuváns adásával kapcsolatos vizsgálatok adatait közölték volna. A legtöbb esetben ezek csak annyit állítottak, hogy a HER2vizsgálatot el kell végezni, nem ajánlottak specifikus módszereket, és nem foglalkoztak a minôség-ellenôrzéssel sem. A meglévô ajánlásokban megadott vizsgálati algoritmusok feltételezik az IHC és a FISH módszerek szoros kapcsolatát. Az Egyesült Királyságban például egy 2004-es ajánlás olyan vizsgálati algoritmust javasol, mely elsôdlegesen az IHC elvégzésén alapul. Ha az IHC értéke 0 vagy 1+, akkor a mintát HER2-negatívnak, ha az érték 3+, a mintát HER2pozitívnak kell tekinteni. A 2+ eredmény nem egyértelmû (vagy bizonytalan) HER2-státust jelez, ekkor a mintát automatikusan el kell küldeni FISH vizsgálatra.48 Az Egyesült Királyság szakértôi testülete számos feltételt szab ahhoz,

28

hogy a laboratóriumban engedélyezzék a HER2-vizsgálatot. Ide tartozik, hogy a laboratóriumban az évi mintaszám érjen el egy minimális értéket (IHC esetén legalább 250, FISH esetén legalább 100 mintát dolgozzanak fel évente) – amennyiben a mintaszám ennél kisebb, a laboratóriumnak mérlegelnie kell egy referencialaboratórium igénybevételét –, alkalmazzanak standardizált és validált vizsgálómódszereket, és folyamatosan vegyenek részt minôségbiztosítási programokban. Más ajánlások elôírják szövet alapú kontrollok használatát; hogy az értékelés csak a daganat invazív részén történjen; illetve a diagnosztikai készletek használata során szigorúan ragaszkodjanak a protokollhoz és az értékeléshez.48 A CAP az Egyesült Államokban egy CAP által támogatott szimpóziumon (Strategic Science Symposium, Rosemont, IL, 2002. május 4–5.) is hasonló ajánlásokat fogalmazott meg.47 A szervezet hangsúlyozta: szükséges, hogy az egyes laboratóriumok dokumentálják, mennyire egyeznek a FISH és az IHC eredmények, mielôtt a FISH vizsgálatot csak az IHC 2+ eredményekre korlátozzák (eszerint az egyezés mértékének az IHC 0 és 3+ eredmények esetén 90%-nak, IHC 1+ esetében 95%-nak kell lennie). Azt is javasolták, hogy a leletek formátuma egységes legyen, illetve definiálták a nevezéktant. Meg kell jegyezni, hogy az egyezôségre vonatkozó feltételeket a palliatív trastuzumabkezelés alapján határozták meg. Több csoport is beszámolt a HER2-vizsgálat pontosságának javítására tett erôfeszítéseirôl.52

AJÁNLÁSOK Mi a HER2-státus megállapításának optimális vizsgálati algoritmusa?

Összefoglalás és ajánlások. A szakirodalom áttekintése és az ennek eredményein alapuló szakértôi testületi megbeszélés a HER2-vizsgálati eredmények esetében három külön kategóriára mutatott rá, melyek alapján az emlôrákos betegeknél eltérô terápiás döntéseket hoznak. Az alkalmazott módszertôl függetlenül a vizsgálat eredménye lehet pozitív, nem egyértelmû vagy negatív. Minden egyes vizsgálati eredményhez meghatározott kezelési algoritmus tartozik, amint azt az 1. ábra (IHC) és a 2. ábra (FISH) mutatja. Minden esetben alapvetô feltétel, hogy az alkalmazott tesztet a jó laboratóriumi gyakorlatnak megfelelôen, a cikk további részében ismertetett módon végezzék, így az eredmény pontos és reprodukálható. A laboratórium csak akkor döntheti el, hogy a HER2-vizsgálat eredménye pozitív vagy negatív, ha korábban egy validált FISH módszerrel ellenôrizte az egyezést, és igazolta, hogy bármely idôszakban a pozitívként vagy negatívként klasszifikált minták legfeljebb 5%-ánál tér el az eredmény a validált módszerrel kapott eredménytôl. Ha a laboratórium nem tudja ezt a kritériumot teljesíteni, nem végezhet HER2-vizsgála-


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 29


Emlôrákból származó minta (invazív rész)

HER2-fehérje-expresszió kimutatása validált IHC módszerrel

HER2-fehérje-expresszió pozitív: IHC 3+ (definíció szerint egységes intenzív membránfestôdés az invazív daganatsejtek > 30%-ában)

HER2-fehérje-expresszió nem egyértelmû: IHC 2+

HER2-fehérje-expresszió negatív: IHC 0 vagy 1+

1. ábra. Az immunhisztokémiai (IHC) vizsgálat algoritmusa. Az adjuváns trastuzumab-vizsgálatokkal kapcsolatos további információk: Slamon és munkatársai,19 Romond és munkatársai,21 Piccart-Gebhart és munkatársai22 és HERA klinikai vizsgálat.23 HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2.

HER2-génamplifikáció kimutatása validált módszerrel

HER2-génamplifikáció pozitív

HER2-génamplifikáció nem egyértelmû (azok a betegek, akiknél a HER2/CEP17 ⭓ 2,0, részt vehettek a trastuzumab adjuváns adásával kapcsolatos klinikai vizsgálatokban)

tot, és a mintákat egy referencialaboratóriumba kell küldenie. A nem egyértelmû eseteknél várhatóan nem lesz 95% az egyezés mértéke, ilyen esetekben egy további, megerôsítô vizsgálat szükséges. Az egyezést évente igazolni kell. A szakértôi testület kisebb hányada kifejezte azt a véleményét, hogy az IHC nem eléggé pontos módszer ahhoz, hogy ennek alapján lehessen meghatározni a HER2-státust; szerintük minden esetben inkább FISH-t kellene használni. Meg kell jegyezni, hogy a módszerek közötti egyezés nem biztosítja a pontosságot (azaz, hogy a mért értékek mennyire állnak közel a feltételezett valódi értékhez; F függelék). Egy vizsgálat pontosságának értékeléséhez az eredményt egy arany standardhoz kell viszonyítani. Jelenleg nem áll rendelkezésre ilyen, vagyis nincs olyan teszt, amivel pontosan azonosítani lehetne azokat, akiknél az anti-HER2-terápia várhatóan hatásos, illetve akiknél biztosan nem az. A HER2-státusra vonatkozóan az alábbi definíciókat fogadták el. Alapvetôen fontos, hogy a vizsgálatokat invazív emlôrákban végezzék, mivel ismeretlen okokból a HER2 in situ emlôrákban gyakran emelkedett (fokozottan expresszálódik és/vagy amplifikálódik); ebben az esetben az eredmény klinikai jelentôsége még nem tisztázott.53 Pozitív HER2-teszt. A klinikai vizsgálatok, a nemzetközi vizsgálatok és protokollok szakirodalmának, a szakértôi kon-

www.jco.org

HER2-génamplifikáció negatív

szenzusoknak, valamint a US Food and Drug Administration Panel eredményeinek áttekintése alapján a HER2-vizsgálat eredménye akkor pozitív, ha IHC-vel vizsgálva a sejtfelszíni HER2-fehérje expressziója 3+ (azaz definíció szerint az invazív daganatsejtek > 30%-a mutat intenzív membránfestést), vagy a FISH során az amplifikált HER2 gén kópiaszáma nagy (azaz belsô kontrollpróba nélkül a vizsgált rendszerben átlagosan több mint hat génkópia/sejtmag), vagy ha a HER2/CEP 17 arány meghaladja a 2,2-et (a CEP 17 egy olyan próba, mely a 17-es kromoszóma HER2 gént is tartalmazó centromér régiójára specifikus). A pozitív IHC 30%-os küszöbértékét részleteiben a G függelék tárgyalja. Eredetileg a FISH vizsgálat eredményeit vagy pozitívként, vagy negatívként definiálták, azonban azóta egy köztes tartományt (melyet „nem egyértelmû” tartományként neveznek) is leírtak. E megfigyelés klinikai jelentôsége egyelôre nem ismert.34–36 E módszer azokat a betegeket tartja HER2-pozitívnak, akiknél bármelyik teszt pozitív eredményt adott. A jelenlegi adatok alapján nem lehet meghatározni, hogy e betegek valódi pozitív vagy tévesen pozitív eseteknek számítanak-e. Bár a trastuzumabbal végzett nagy prospektív véletlen besorolásos vizsgálatokat nem úgy tervezték, hogy a fenti kérdéseket meg lehessen válaszolni, azt gondoljuk, hogy az ilyen jellegû elemzésekre hamarosan korrelációs vizsgálatok formájában kerül sor.

29

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 30

Wolff és mtsai

Emlôrákból származó minta (invazív rész)

HER2-génamplifikáció kimutatása validált FISH módszerrel

HER2-génamplifikáció pozitív (FISH arány > 2,2 vagy HER2 gén kópiaszáma > 6,0)

HER2-génamplifikáció nem egyértelmû (FISH arány 1,8–2,2 vagy HER2 gén kópiaszáma 4,0–6,0*)

HER2-génamplifikáció negatív (FISH arány < 1,8 vagy HER2 gén kópiaszáma < 4,0)

2. ábra. A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) algoritmusa. Az adjuváns trastuzumab-vizsgálatokkal kapcsolatos további információk: Slamon és munkatársai,19 Romond és munkatársai,21 Piccart-Gebhart és munkatársai22 és HERA klinikai vizsgálat.23 (*)34–36 HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2.

További sejtek leszámolása a FISH során, vagy a vizsgálat megismétlése, vagy HER2 IHC vizsgálat végzése

HER2-génamplifikáció nem egyértelmû (azok a betegek, akiknél a HER2/CEP17 ⭓ 2,0, részt vehettek a trastuzumab adjuváns adásával kapcsolatos klinikai vizsgálatokban)

Nem egyértelmû HER2-teszt. A HER2-vizsgálattal kapcsolatban a legtöbb zavar abból ered, hogy a trastuzumab-kezelés iránti igényt (azaz „igen”, vagy „nem”) olyan vizsgálati eredmények alapján kell meghatározni, melyek inkább folytonosak, mintsem kategorikus változók. Ezen túlmenôen az IHC és FISH módszerek esetében számottevôen eltérô, hogy mi tartozik az intermedier (nem egyértelmû) tartományba. A nem egyértelmû IHC-tartományt a 2+ minták alkotják, ahová a minták akár 15%-a is belekerülhet.29 Nem egyértelmû eredmény (2+) esetén a membrán teljes egészében festôdik, a festôdés intenzitása azonban nem egységes vagy gyenge, viszont a festôdés nyilvánvalóan körkörös eloszlású a sejtek legalább 10%-ában. A szakértôi testület tagjainak tapasztalata alapján nagyon ritkán az invazív daganatsejtek kevesebb mint 30%-ában intenzív, komplett membránfestôdés észlelhetô. Az ilyen eseteket is nem egyértelmûnek minôsíti az ajánlás. Néhány – de nem az összes – esetben ezek a minták HER2-génamplifikációt mutathatnak. Ezért ezen esetekben a valódi HER2-státus meghatározása érdekében további vizsgálatokra van szükség (1. és 2. ábra).54,55 FISH-módszer esetében a nem egyértelmû tartományt definíció szerint az képezi, ha a HER2/CEP 17 arány 1,8–2,2 közötti, vagy (belsô kontroll próbát nem használó rendszerekben) az átlagos génkópiaszám 4,0–6,0.34–36 Meg kell azon-

30

ban jegyezni, hogy a 2,0 és 2,2 közötti HER2/CEP17 FISH arányt mutató betegeket korábban HER2-pozitívnak tartották, ôk ezért részt vehettek a trastuzumab adjuváns adását elemzô vizsgálatokban. Ennél fogva a rendelkezésre álló hatékonysági adatok alapján nem indokolt kizárásuk a trastuzumab-kezelésbôl. E csoport kevés esetet ölel fel: nyilvánvalóan a minták kevesebb mint 3%-a tartozik ide.56 A 17-es kromoszóma többszörözôdését (poliszómia) az összes minta közel 8%-ában igazolták, elsôsorban azokban az esetekben, amikor a HER2 gén kópiaszáma négy és hat között változott (nem egyértelmû tartomány).57,58 Nincs elfogadott definíció arra, mit jelent a poliszómia, és a szerzôk különbözô kritériumokat használnak ennek meghatározására. Ha a 17-es poliszómiát úgy definiálják, hogy a CEP17 kópiaszáma legalább három, a legtöbb eset nem jár fokozott fehérje- vagy mRNS-expreszszióval.57 Hasonló a helyzet azokkal a daganatokkal is, melyekben a HER2 gén kópiaszáma 4 és 6 közé esik.35 Beszámoltak olyan esetekrôl is, amikor a kétféle módszerrel kapott eredmények nem egyeztek (IHC 3+/FISH-negatív, vagy IHC < 3+/FISH-pozitív). Ezt egy trastuzumabbal végzett klinikai tanulmányba való beválogatás során 1503 beteg nagyjából 4%-ánál észlelték; a meghatározások egy központi laboratóriumban (LabCorp, Burlington, NC) történtek.59 Mindazonáltal e két csoportnál még nem állnak rendelkezés-


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 31


re a klinikai kimenetelre vonatkozó adatok. Javasoljuk, hogy a jövôben a trastuzumabbal végzett nagy prospektív véletlen besorolásos klinikai vizsgálatok során történjenek ilyen elemzések. A szakértôi testület megbeszélései és a szakirodalom áttekintése alapján az is világos, hogy a nem egyértelmû HER2vizsgálati eredményt mutató betegek egy olyan, nem kellôképpen ismert alcsoportot alkotnak, amelynél nem lehet tudni, milyen mértékben függ össze a vizsgálat eredménye az anti-HER2-terápia eredményességével.60 A szakértôi testület szerint az e betegcsoportban végzett további vizsgálatokat elôsegítené, ha ezeket a teszteredményeket úgy definiálnák, hogy azok nem egyértelmûek vagy határértéket jelentenek. A testület a „nem egyértelmû” kifejezés használatát választotta annak érdekében, hogy el lehessen kerülni a határérték-pozitív és határérték-negatív kifejezésekkel kapcsolatosan felmerülô zavart; utóbbiakat néha a FISH vizsgálat értékelésekor használják. Ha egy adott vizsgálat eredménye nem egyértelmû, további lépésekre van szükség, melyeket a leletben is meg kell jelölni. A nem egyértelmû IHCeredményt a minta FISH elemzésével kell megerôsíteni. A nem egyértelmû eredményt mutató FISH vizsgálat esetén további sejteket kell leszámolni, vagy meg kell ismételni a FISH vizsgálatot. Ha a FISH eredménye a további sejtek figyelembevétele vagy a vizsgálat megismétlése után továbbra sem egyértelmû, az eredmény megerôsítésére IHC javasolt annak érdekében, hogy a HER2-fehérjeexpresszió mértéke a nem egyértelmû génamplifikációs státus ellenére is ismert legyen. Negatív HER2-teszt. Definíció szerint a HER2-teszt eredménye akkor negatív, ha a sejtmembránban az IHC segítségével vizsgált fehérjeexpresszió 0 vagy 1+ (nincs festôdés, vagy a daganatsejtek bármelyik részén gyenge, inkomplett membránfestôdés mutatkozik); ha a HER2/CEP17 arány meghatározására végzett FISH eredménye 1,8; illetve (belsô

5. táblázat. Mikor nem szabad a mintán HER2 IHC módszert végezni és az eredményeket értékelni? Kizárási kritériumok A neutrális formalin helyett egyéb tartósítószerekkel fixált szövetek* Neutrális formalinban kevesebb mint egy órán át fixált tûbiopsziás minták Excízióból származó szövettani minták, amennyiben hat óránál kevesebb vagy 48 óránál hosszabb ideig fixálták azokat formalinban† Hengeres tûbiopsziák A szövethenger egészét érintô széli vagy retrakciós mûtermék Szövetsérülés (vékony tûvel, vákuum-extrakciós tûvel vett minták) Olyan szövetek, melyekben a belsô normális ductusok vagy lobulusok erôs membránfestôdést mutatnak Azok a szövetek, melyeknél a kontrollok nem a várt eredményeket adják Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; IHC, immunhisztokémia. *Amennyiben a laboratórium nem neutrális formalint, hanem egyéb tartósítószert használ, validálnia kell a módszer mûködési jellemzôit, hogy kimutassa: az így nyert eredmények megegyeznek azokkal, melyeket ugyanazokban a minták pufferelt formalinban történô fixálásával kapnának. †Nem abszolút kizárási kritérium, ha azonban ismert, hogy a fixálás kevesebb mint hat órán át vagy 48 óránál hosszabb ideig tartott, a leleten az esetleges negatív eredmény mellett ezt is jelezni kell.

www.jco.org

6. táblázat. Mikor nem szabad a mintán HER2 FISH módszert végezni és az eredményeket értékelni? Kizárási kritériumok Az invazív ráksejteket csak korlátozott mértékben tartalmazó mintákat nehéz ultraibolya fényben vizsgálni A neutrális formalin helyett egyéb tartósítószerekkel fixált szövetek* Formalinban hosszú ideig (több mint 48 órán át) fixált szövetek† Ha a kontrollok nem a várt eredményeket adják A FISH jelek nem egységesek (< 75% azonosítható) Nem értelmezhetô háttérjelek (a jelek > 10%-a a citoplazma felett látható) Nem optimális enzimatikus emésztés (elégtelen magfestôdés, perzisztáló autofluoreszcencia) Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció. *Amennyiben a laboratórium nem neutrális formalint, hanem egyéb tartósítószert használ, validálnia kell a módszer mûködési jellemzôit, hogy kimutassa: az így nyert eredmények megegyeznek azokkal, melyeket ugyanazon minták pufferelt formalinban történô fixálásával kapnának. †Nem abszolút kizárási kritérium, ha azonban ismert, hogy a fixálás kevesebb mint hat órán át vagy 48 óránál hosszabb ideig tartott, a leleten az esetleges negatív eredmény mellett ezt is jelezni kell.

kontrollpróbát nem alkalmazó rendszereknél) a HER2 gén kópiaszáma sejtmagonként legfeljebb négy. Egy átlagos laboratóriumi vizsgálat esetében a tévesen negatív esetek arányának megengedett felsô határa 5%. Annak fényében, hogy az adjuváns trastuzumab-kezelés potenciálisan gyógyító hatású, ez az érték sok: a laboratóriumokban azt kell célul tûzni, hogy a tévesen negatív eredmények arányát a 0%-hoz minél közelebbi szinten tartsák. A HER2-vizsgálat kizárási kritériumai. Minden vizsgálómódszerben rejlenek diagnosztikai buktatók, melyeket el kell kerülni. A szakértôk egyetértettek abban, hogy vannak helyzetek, amikor a magával a módszerrel vagy a mintával kapcsolatos megfontolások miatt elônyben kell részesíteni egyik vagy másik mérômódszert. A HER2-státus kimutatására végzett IHC vagy a FISH módszer elvégzésekor, illetve az eredmények értékelésekor léteznek kizárási kritériumok (5. és 6. táblázat). A kérdéses mintával kapcsolatos szövettani leleteket áttekintô patológus feladata annak eldöntése, melyik típusú módszert tartja optimálisnak az adott esetben. A témával kapcsolatos szakirodalom áttekintése

A szakértôk áttekintették a már megvalósult és befejezett klinikai tanulmányok, közlemények adatait, illetve elemezték azon elôadások anyagát, melyeket olyan szakmai társaságok képviselôi tartottak, melyeknél a belsô és külsô minôségbiztosítás érdekében szigorú intézkedéseket vezettek be. Milyen stratégiák segíthetnek biztosítani a módszerek optimális végzését, az eredmények értékelését és közlését?

Összegzés és ajánlások. Az alábbi ajánlások az Egyesült Államokban tartott konszenzus-konferenciákon,47,61 egy intézetre korlátozódó vizsgálatok adatain,62 a referencialaboratóriumok gyakorlatán,28,29,55 nemzetközi jelentéseken,48–50,63,64 az Egyesült Államokban jelenleg érvényes szabályozásokon (Clinical Laboratory Improvement Amend-

31

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 32

Wolff és mtsai

ment [CLIA] 88 és US Food and Drug Administration szabályozás), valamint a szakértôi testület találkozóján kialakított szakértôi konszenzuson alapulnak. Az ajánlásokat a 4. táblázat összegzi. A szövetek feldolgozására és a kontrollanyagok kezelésére vonatkozó ajánlásokat lásd az E függelékben. A módszer validálásának feltételei. Ez a rész azt írja le, milyen feltételei vannak egy módszer technikai validálásának. Fontos, hogy minden új tesztet egy olyan referenciateszttel hasonlítsanak össze, amelyet klinikailag már validáltak – azaz ami elôre jelzi a betegség kimenetelét. A laboratórium által ajánlott új teszt esetében a validálási folyamat több lépésbôl áll. A kínált teszt esetében a laboratóriumnak ki kell választania és be kell szereznie a megfelelô készüléket, biztosítania kell, hogy azt a személyzet hozzáértô módon tudja használni, és ki kell fejlesztenie egy standard mûködési protokollt, melyet a személyzetnek ezután egy standardizált terv alapján be kell gyakorolnia. Az új eljárást olyan eseteken kell tesztelni, melyek arra a betegcsoportra jellemzôek, amelyik számára a tesztet kínálni fogják. Az új vizsgálatot párhuzamosan egy másik, ugyanezen analitikum (például HER2) kimutatására használt, de már validált klinikai teszttel együtt kell végezni. Amennyiben az új tesztet (például a HER2-expresszió IHC-vel való kimutatását) egy korábban validált kiegészítô teszttel kell összehasonlítani (például FISH-sel végzett HER2-meghatározással), a mintákat mindkét módszerrel szükséges megvizsgálni, és az eredményeket össze kell hasonlítani. Azon laboratóriumok számára, ahol korábban egyik tesztet sem validálták, a validálás másik lehetôsége, hogy a vizsgálatot egy másik, már validált módszert kínáló laboratóriummal párhuzamosan végzik. Nincs pontosan meghatározva, hány tesztre van szükség egy megbízható validáláshoz. A szám 25 és 100 eset között változik, és függ a lehetséges eredmények számától, valamint attól, hogy a teszteredmények hogyan változhatnak. Egy új tesztnek legalább 95%-os egyezést kell mutatnia azzal a validált módszerrel, amellyel összehasonlításra kerül. Az eredményeket értékelô személyek értékelésének egymással is összhangban kell állnia (legalább 95%-os egyezés). Amennyiben a laboratóriumok nem formalin, hanem egyéb fixálószer alkalmazását választják, a laboratóriumnak kötelezô validálnia a fixálószer hatékonyságát is oly módon, hogy ugyanazon minták másik részét formalinban is fixálják, és elvégzik rajtuk ugyanazt a HER2-vizsgálatot. Az egyezésnek ez esetben is el kell érnie a 95%-ot. Az F függelék azt tárgyalja, hogy statisztikai megfontolások alapján kell meghatározni a megfelelô esetszámot a módszer validálásakor használt mintakészleteknél, és hogyan érdemes célokat kitûzni. A kompetencia folyamatos ellenôrzése. A laboratóriumban a belsô minôség-ellenôrzési program részeként folyamatosan ellenôrizni kell a laboratóriumi szakemberek és a vizsgálatok eredményét értelmezô patológusok hozzáértését. A laboratórium vezetôjének felelôssége, hogy biztosítsa a vizsgálatot végzôk kompetenciáját, és olyan rögzített laboratóriumi eljárásokat alkalmazzon, melyek alkalmasak arra,

32

hogy az ellenôrzés idôpontjában ezeket át lehessen tekinteni. A patológusok hozzáértésének ellenôrzése során idôszakosan vagy folyamatosan össze kell hasonlítani a laboratóriumban a HER2-mintákat vizsgáló patológusok munkáját. Ha az értékelésben különbségek vannak, szükséges ennek korrigálása és dokumentálása. A szakértôi testület egyetértett abban, hogy az ilyen vizsgálatok esetében az elfogadható mûködési standardok a következôk: • A módszert csak akkor szabad alkalmazni, ha a minta invazív emlôrákból származik, vagy az emlôrák invazív komponensét vizsgálják. • A szövetek feldolgozásának feltételeit standardizálni és minden minta esetében dokumentálni szükséges. Az összes korábbi, HER2-vizsgálattal foglalkozó konferencia, valamint a trastuzumab forgalomba kerülése elôtti engedélyeztetése során az emlôszövet 10%-os semleges vegyhatású formalinban való fixálását írták elô. A fixálás optimális ideje 6–48 óra, a fixálási idôtartamot a leleten fel kell tüntetni. • Bizonyos körülmények fennállásakor nem végezhetô HER2 immunhisztokémiai vizsgálat és FISH; a kizárási kritériumokat széles körben ismertetni kell (5. és 6. táblázat). • A vizsgálóeljárásokat a laboratóriumnak validálnia kell, mielôtt a tesztet a klinikai felhasználásra kínálná. Az új tesztnek 95%-os egyezést kell mutatnia egy validált referenciamódszerrel. • A vizsgálóeljárásokat standardizálni kell. A standardizált módszertôl való bármiféle eltérést fel kell jegyezni és a módszer újbóli validálásával legalizálni kell. A leleten bármiféle ilyen eltérést dokumentálni kell. A szakértôi testület egyetértett abban, hogy az optimális mûködés automatizált festési rendszerekkel könnyebben biztosítható, mint manuális módszerekkel. A vizsgálatokat végzô személyzet hozzáértését rendszeres idôközönként ellenôrizni kell. • Standardizált kontrollanyagokat kell alkalmazni. Ezek lehetnek kereskedelmi forgalomban lévô termékek, vagy meghatározott gyártási standardoknak felelhetnek meg (például a European Collection of Cell Cultures vagy a National Institute of Standards and Technology [NIST] által elôállított sejtvonalak), vagy a laboratórium vezetôje által elôírt kontrollok. Ezeket folyamatosan, minden laboratóriumban minden egyes vizsgálat alkalmával használni kell. A megfelelô kontrollminták olyan sejtvonalak vagy tumorminták, melyeknél az expresszió és a génamplifikáció eredménye igazoltan negatív, nem egyértelmû vagy pozitív. Különbözô HER2-expressziós szintû szövettani blokkok vagy xenograftok ugyancsak alkalmazhatók, ha a várt eredmények jól karakterizáltak. Amennyiben a kontrollok nem a várt eredményt mutatják, nem szabad az értékelést elvégezni, ehelyett meg kell ismételni a vizsgálatot. • A képelemzés hathatósan elôsegítheti, hogy az értékelés színvonala állandó legyen. Mindamellett egy patológusnak ellenôriznie és igazolnia kell a képelemzés eredményét. A képelemzést végzô készülék – csakúgy, mint a laborató-


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 33


rium többi berendezése – rendszeres kalibrálást és karbantartást igényel, és belsô minôség-ellenôrzést is kell végezni. A képelemzési eljárásokat bevezetésük elôtt validálni kell. A szakértôi testület megbeszélésén felvetôdött, hogy a patológián használt optikai mikroszkópok esetében nincs kalibráció, és ez egészen biztosan szerepet játszik abban, hogy eltérôen értékelik a szövettani képet. Ha a patológusok a vizsgálati eredmények leolvasásához több különbözô mikroszkópot használnak, az értékelés állandó színvonalának biztosítása érdekében be kell vezetni a mikroszkópok kalibrálását. • Mindegyik HER2 tesztmódszer esetében standardizálni és finomítani kell az értékelés kritériumait. Ennek az újabb klinikai vizsgálatok és nemzetközi tapasztalatok során kialakított értelmezési kritériumokon kell alapulnia. (2. táblázat). A kritériumokat a 7. és 8. táblázat vázolja fel, illetve a G függelék részletezi. • A HER2-vizsgálat kapcsán született és kiadott leleteket standardizálni kell. A felsorolandó adatok listáját a 9. és a 10. táblázat mutatja. • Bár vannak arra bizonyítékok, hogy a laboratóriumoknál a HER2-vizsgálat végzésére való jogosultság megadásakor hatékony stratégia az évi minimális mintaszám specifikálása, arra vonatkozóan nincs általános érv, hogy a mintaszám összefüggne a pontossággal. A szakértôk egyetértettek abban, hogy a laboratóriumnak nem érdemes a HER2-vizsgálatot végeznie akkor, ha évente csak néhány vizsgálatra kerül sor. Ekkor inkább központi laboratóriumba kell küldeni a mintát, ahol több a minta és nagyobb a gyakorlat. A több patológust foglalkoztató laboratóriumokban célszerû lehet korlátozni azok számát, akik a HER2-vizsgálatot értékelik, így biztosítva, hogy ôk több mintát értékeljenek. A szakirodalom áttekintése

A korábbi konszenzus-konferenciák megadták azokat a feltételeket, amelyeket a HER2-vizsgálatot végzô laboratóriumoknak teljesíteniük kell.47,61 Ezen ajánlások alapja a CLIA 88 törvény (melyet 1988-ban az Egyesült Államok kongreszszusa jóváhagyott), ami kötelezôvé teszi a belsô minôségellenôrzést. A CLIA 88 nagy vonalakban elôírja a leletkiadással kapcsolatos ajánlásokat, ezeket a CAP konszenzus-konferencia47 és szakértôi vélemények65 specifikálják. A feltételek megállapítása a vizsgálatok kizárási kritériumaival és az értelmezési feltételekkel foglalkozó szakirodalom áttekintése alapján történt.47,66 Mi az a szabályozási keret, ami lehetôvé teszi a fokozott vizsgálat ellenôrzését?

Összegzés és ajánlások. A CLIA 88 az igen összetett vizsgálatok esetében szigorú minôség-ellenôrzési feltételeket ad meg. Ide tartozik a rákbetegség progressziójával foglalkozó összes vizsgálat. A törvény elôírja, hogy kétévente ellenôrizni kell az ide sorolt vizsgálatokat végzô laboratóriumokat, és mûködési hiányosság észlelésekor meg kell tenni a szükséges intézkedéseket. A CAP és a Joint Commission on Accredita-

www.jco.org

7. táblázat. Az IHC értékelési kritériumai Kontrollok ellenôrzése; ha nem a várt eredményt adják, a vizsgálatot meg kell ismételni Pozitív eredmény esetén a daganatnak több mint 30%-ban körkörös (dróthálószerû) membránfestôdést kell mutatnia* A membránfestôdésnek intenzívnek és egységesnek kell lennie A festôdési mintázat homogén, fekete és körkörös (dróthálószerû) legyen A részleges vagy halvány membránfestôdést nem szabad figyelembe venni Az egységes értékelés érdekében kvantitatív képelemzési eljárás javasolt azon esetekben, amikor a membránfestôdés gyenge (1–2+) Ha a citoplazma festôdése zavarja a membrán festôdését, meg kell ismételni a vizsgálatot, vagy FISH vizsgálat szükséges Nem értékelhetô a minta, ha a normális ductusok és lobulusok egyértelmûen festôdnek Nem értékelhetô a minta, ha zavaró mûtermékeket tartalmaz DCIS esetében nem adható pont; csak az infiltráló ductalis carcinoma értékelhetô Rövidítések: IHC, immunhisztokémia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; DCIS, ductalis in situ carcinoma. *E százalékos arány nagyobb, mint a US Food and Drug Administration által jóváhagyott tesztek által megadott érték, azonban a szakértôi testület azon véleményén alapul, hogy ez reálisabb küszöbértéknek felel meg.

tion of Healthcare Organizations szervezetek kapták meg a jogot, hogy ezeket az ellenôrzéseket végrehajtsák. A US Food and Drug Administration az 1976-os Medical Devices Amendments rendelet révén szabályozza az orvosi eszközök alkalmazását. Mivel a HER2-vizsgálat eredménye potenciálisan nagy hatást gyakorol a betegek halálozására és morbiditására, ezért a nagy kockázatú (3. osztályba tartozó) orvosi diagnosztikai eszközök közé sorolják, melyek esetében a forgalomba hozatal elôtt intenzív ellenôrzésre van szükség. Az ezzel kapcsolatos törvényi szabályozás és szabályok áttekintése után (H függelék) a szakértôi testület egyetértett abban, hogy a jelenlegi törvényi keretek megfelelô mértékben támogatják az ajánlásban megadott javaslatokat, ezért módosításra nincs szükség. Célszerûnek látszik, hogy e törvényi keretet a javasolt HER2-vizsgálatra vonatkozó ajánlások kapcsán is alkalmazzák.

8. táblázat. A FISH értékelési kritériumai Az invazív ráksejtek lokalizálása érdekében elôször át kell tekinteni a megfelelô hematoxilin-eozin és/vagy IHC preparátumot is; in situ carcinoma esetén nem szabad pontot adni Kontrollok ellenôrzése; ha nem a várt eredményt adják, a vizsgálatot meg kell ismételni Két külön területen legalább 20 különálló invazív ráksejtet kell megvizsgálni Nem értékelhetô a minta, ha a jelek nem egységesek (> 25%) Nem értékelhetô a minta, ha az autofluoreszcencia nagymértékû, vagy a sejtmagok rosszul ábrázolódnak Nem értékelhetô a minta, ha a háttér zavarja a jelet (> 10% a citoplazma felett látható) Amennyiben a HER2/CEP 17 arány 1,8–2,2 közötti, egy másik vizsgáló is számolja le a sejteket Heterogén expresszió esetén egy másik vizsgáló is számolja le a sejteket A sejteket gyakorlott szakasszisztens is leszámolhatja, azonban a patológusnak meg kell bizonyosodnia arról, hogy az eredmény (a sejtek leszámolása) pontos, és a számolás invazív daganat területén történt FIGYELEM. A daganat heterogenitása, a 17-es kromoszóma monoszómiája vagy poliszómiája, továbbá a géndeléció befolyásolhatja az abszolút arány meghatározását. Rövidítések: FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; IHC, immunhisztokémia; HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2.

33

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 34

Wolff és mtsai

9. táblázat. Az IHC vizsgálati leletek elemei

10. táblázat. A FISH vizsgálati lelet elemei

Betegazonosító információ Kezelôorvos azonosítója Vizsgálat idôpontja A minta azonosítószáma (eset és blokk sorszáma) Mintavétel helye és típusa Minta fixálásának módja Fixálásig eltelt idô (ha ismert) Fixálás idôtartama (ha ismert) Antitest/klón forgalmazó cég Alkalmazott módszer (teszt/forgalmazó, illetve hogy az FDA jóváhagyta-e) Képelemzési eljárás (ha alkalmaznak ilyet) Kontrollok (nagy fehérjeexpressziót mutató, kis fehérjeexpressziót mutató, fehérjét egyáltalán nem expresszáló, belsô kontroll) A minta vizsgálatra való alkalmassága Eredmények Teljes membránfestôdést mutató invazív daganatsejtek százalékos aránya Egységes festôdés: igen/nem Homogén, körkörös sötét festôdési mintázat: igen/nem Értékelés Pozitív (HER2-fehérje-expresszió igazolt); nem egyértelmû (FISH végzése és értékelése szükséges); negatív (HER2-fehérje-expresszió nem igazolt); nem értelmezhetô Megjegyzés Ha FDA által jóváhagyott módszert alkalmaznak, azt jelezni kell; ha az FDA által jóváhagyott módszert módosították, a leleten szerepelnie kell annak, milyen módosítások történtek, és ezeket validálták-e; amennyiben az FDA nem hagyta jóvá a módszert, vagy az FDA által jóváhagyott módszert módosították, a leleten egyértelmûen szerepelnie kell annak, hogy az eredményeket közlô laboratórium felelôsséget visel a vizsgálat eredményeiért.

Betegazonosító információ Kezelôorvos azonosítója Vizsgálat idôpontja A minta azonosítószáma (eset és blokk sorszáma) Mintavétel helye és típusa Minta fixálásának módja Fixálásig eltelt idô (ha ismert) Fixálás idôtartama (ha ismert) Szonda (szondák) azonosítója Alkalmazott módszer (teszt/forgalmazó, illetve hogy az FDA jóváhagyta-e) Képelemzési eljárás Kontrollok (amplifikációt mutató, nem egyértelmû, amplifikációt nem mutató, belsô kontroll) A minta vizsgálatra való alkalmassága (az invazív daganatsejtek elegendô számban vannak-e jelen) Eredmények Leszámolt invazív tumorsejtek száma Vizsgálatot végzô szakemberek száma HER2 jel/sejtmag vagy tile átlagos száma CEP 17 kromoszóma szondák/sejtmagok vagy tile átlagos száma Átlagos HER2-jelek/CEP 17 szonda szignálok aránya Megjegyzés: a „tile” a képelemzô rendszerrel végzett számolás kapcsán használt egység Értékelés Pozitív (amplifikációt mutató); nem egyértelmû; negatív (amplifikációt nem mutató); nem értelmezhetô; amennyiben IHC történik azért, mert problémák vannak a módszerrel vagy az eredményekkel, ezt is jelezni kell a leleten. Megjegyzés Ha FDA által jóváhagyott módszert alkalmaznak, azt jelezni kell; ha az FDA által jóváhagyott módszert módosították, a leleten szerepelnie kell annak, milyen módosítások történtek, és ezeket validálták-e; amennyiben az FDA nem hagyta jóvá a módszert, vagy az FDA által jóváhagyott módszert módosították, a leleten egyértelmûen szerepelnie kell annak, hogy az eredményeket közlô laboratórium felelôsséget visel a vizsgálat eredményeiért.

Rövidítések: IHC, immunhisztokémia; FDA, US Food and Drug Administration, FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; HER2, humán epidermális növekedésifaktorreceptor-2.

Rövidítések: FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; FDA, US Food and Drug Administration; HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2.

Melyek azok az optimális külsô minôség-ellenôrzési módszerek, melyek a HER2-vizsgálat során folyamatosan biztosítják a pontosságot?

Összegzés és ajánlások. A HER2-analitokra, így az IHC-vel meghatározott fehérjeexpresszióra vagy a FISH segítségével vizsgált génexpresszióra jelenleg nem vonatkoznak kötelezô minôség-ellenôrzési elôírások; azonban a minôség-ellenôrzés elsajátítására önkéntes továbbképzési programok kapcsán lehetôség van. Jelen ajánlás a laboratórium akkreditálásának idôpontjában kötelezôvé teszi a minôség-ellenôrzést, és magasabb szintû ellenôrzést ír elô. Az ajánlás a CLIA 88 törvényi feltételein, a közölt vizsgálatokon, a CAP korábbi tapasztalatain,34,67 egyéb csoportok megállapításain,50,68,69 és a szakértôi testület konszenzusán alapul. A szakértôi testület ajánlása szerint a HER2-vizsgálatot egy CAP által akkreditált laboratóriumban kell végezni, vagy olyan intézményben, ahol az e közleményben lefektetett akkreditációs és minôség-ellenôrzési feltételek teljesülnek. Külsô minôség-ellenôrzés (a laboratórium akkreditálása). A CAP Laboratory Accreditation Program 2007-tôl megköveteli, hogy minden olyan, CAP által akkreditált laboratórium, amelyik HER2-vizsgálatokat végez, vegyen részt az adott vizsgálatra vonatkozó, ezen ajánlásnak megfelelô minôség-ellenôrzési programban. A szakértôi testület javasolja, hogy a jövôben minden akkreditáló szervezet követelje meg, hogy teljesüljenek az ajánlásnak megfelelô minôség-

34

ellenôrzési és a HER2-vizsgálat végzéséhez szükséges laboratóriumi akkreditációs feltételek. A Laboratory Accreditation Program a szükséges minôség-ellenôrzés során fogja vizsgálni a laboratórium teljesítményének színvonalát. Ha a teljesítmény színvonala nem éri el a 90%-ot, akkor azt nem fogja kielégítônek tartani. Ekkor belsô és külsô, az akkreditációs program elôírásainak megfelelô lépéseket tesz kötelezôvé. Ennek során a rossz mûködés okának feltárására, a probléma korrigálása érdekében intézkedések megtételére és arra utaló bizonyítékokra van szükség, hogy a problémát megoldották. A laboratóriumokkal szemben támasztott igények listáját a 11. táblázat mutatja. A nemzetközi külsô minôség-ellenôrzési kezdeményezéseket az I függelék ismerteti. A minôség-ellenôrzés feltételei. A HER2-eredményeket közlô laboratóriumok mindegyikének részt kell vennie egy olyan, az ajánlásoknak megfelelô minôség-ellenôrzési (PT, proficiency testing) programban, mely az adott módszerre specifikus (azaz van külön program az IHC, a FISH, a világos látóterû ISH és a képelemzés számára is). Annak az érdekében, hogy megfeleljenek ennek az ajánlásnak, a PT programoknak évente legalább két alkalommal kell tesztmintákat kiküldeni. Ezek között – a laboratórium mûködésének megfelelô ellenôrzése érdekében – kielégítônek kell lennie a pozi-


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 35


tív esetek számának. Azon minôség-ellenôrzési programoknál, melyeknél egy ellenôrzés során legalább 10 pozitív esetet küldenek ki, a laboratórium mûködése akkor kielégítô, ha az egyes ellenôrzések kapcsán pontosan be tudják sorolni a nem negatív esetek 90%-át. Azok a laboratóriumok, melyeknél egy adott PT ellenôrzés szerint a nem negatív esetek esetében a pontos válaszok aránya kevesebb mint 90%, a következô ellenôrzés során kiemelt kockázatúnak számítanak. A nem kielégítô mûködésû laboratóriumoknál szükség lesz arra, hogy az akkreditációs program elôírásai szerint intézkedjenek, és a szóban forgó módszer esetében függesszék fel a HER2-vizsgálatot egészen addig, amíg nem tudnak kielégítô színvonalon dolgozni.

11. táblázat. A CAP laboratóriumi akkreditáció elemei, melyeket az ellenôrzéskor dokumentálni kell Tesztmódszer validálása Standard mûködési protokollok használata A vizsgálatot végzô személyzet képzettsége Minták és reagensek helyes jelölése Minták és reagensek megfelelô tárolása Készülékek kalibrálása és QC Belsô QA terv és betartásának dokumentálása A vizsgálat során az értékelésre használt tesztek minôsége Az asszisztensek és patológusok hozzáértésének folyamatos ellenôrzése Leletek alkalmassága és minôsége Eredmények pontos közlése FIGYELEM. A vizsgálatot végzôk hozzáértését idôszakonként vagy folyamatosan ellenôrzik oly módon, hogy összehasonlítják a teszteket végzôk teljesítményét. Az esetleges hibát korrigálni kell. Rövidítések: CAP, College of American Pathologists; QC, minôség-ellenôrzés; QA, minôségbiztosítás.

Statisztikai szempontok a minôség-ellenôrzés kapcsán

A laboratórium külsô minôség-ellenôrzésére használt tesztmintáknak minél pontosabban tükrözniük kell azokat a mintákat, amelyeket a laboratórium a mindennapi munka során feldolgoz. Tekintettel kell lenni a mintától elválaszthatatlan jellemzôkre, a minta kezelésével és fixálásával kapcsolatos körülményekre. Nyilvánvalóan vannak olyan korlátok, amelyek miatt nem lehet biztosítani azt, hogy a tesztminták a rutin munka során feldolgozott minták összes tulajdonságával rendelkezzenek. Például a tesztminták mérete nagyobb; illetve feltétel, hogy az egyértelmû arany standard érték meghatározása érdekében megfelelô legyen biológiai homogenitásuk, állandó legyen a festés, vagy a hibridizálás eredménye. A tesztmintákat a laboratórium megkaphatja szöveti microarray (TMA) vagy hagyományos teljes metszet formájában. A bináris („igen” vagy „nem”) eredményt adó diagnosztikai teszteknél a laboratóriumi munka színvonala a szenzitivitás, a specificitás és a pontosság alapján jellemezhetô. A pontosság a szenzitivitást és a specificitást ötvözi, megadja azon (pozitív és negatív) esetek százalékos arányát, melyeknél a vizsgálat eredménye megegyezik a valós állapottal (egyezôségi vagy konkordanciaarány). A vizsgálatok kapcsán felmerülô statisztikai szempontokat részletesebben az F függelék tárgyalja. Hogyan lehet ezeket az erôfeszítéseket megvalósítani és hatásukat mérni?

Összegzés és ajánlások. A hatékonyság érdekében ezen ajánlásokat széles körben kell az orvosi szakma és a betegek számára ismertetni. Ebben a továbbképzéseknek, illetve a HER2-vizsgálatokat végzô laboratóriumok feletti ellenôrzés módosításának van szerepe. Javasoljuk, hogy a CAP és az ASCO szervezetek a továbbképzést összehangoltan végezzék, illetve a laboratóriumi akkreditációt végzô összes szervezet között hangolják össze a standardizált ellenôrzési kritériumokat. Ezen túlmenôen a CAP idôszakonként közölni fogja a külsô minôség-ellenôrzési vizsgálatok összesített eredményét annak érdekében, hogy az onkológustársadalomban tudatosuljon, milyen fejlôdéshez vezetett a stratégia. A továbbképzés feltételei és kommunikációs stratégiák. Annak érdekében, hogy ezt az ajánlást a világon bárhol haté-

www.jco.org

konyan át tudják venni a laboratóriumok, szükség lesz a patológusok, onkológusok, betegek és jogászok hatékony és széles körû tájékoztatására. A CAP online és élô továbbképzô elôadásokat fog tartani arról, miért van szükség a HER2vizsgálatra, melyek a vizsgálat feltételei, milyen ajánlások vannak a vizsgálat értékelésére, illetve a laboratórium akkreditálása és a külsô minôség-ellenôrzés során milyen módszerekkel lehet a teszt végzésének színvonalát meghatározni. A világ más részein mûködô egyéb szervezetek hasonló szerepet játszhatnak. Az ASCO továbbképzô anyagokat hoz létre az onkológusok és a betegek számára arról, hogy a laboratóriumi munka minôsége hogyan értékelhetô a kiadott leletek és a laboratóriumi minôség-ellenôrzés terén tett lépések alapján. A patológusoknak aktív felügyeletet kell gyakorolniuk a vizsgálat során alkalmazott eljárások felett, és az onkológusnak betegei érdekében meg kell bizonyosodnia afelôl, hogy a kiadott vizsgálati eredményeket megfelelôen ellenôrizték. Ezek a HER2-vizsgálati eredmények konzisztenciájának javulásához vezetnek. Tény, hogy a javulás számszerûsítése nem egyszerû feladat. A pontos HER2-vizsgálat egyik fontos eredménye, ha biztosítható, hogy a HER2kezelésbôl profitáló minden emlôrákos beteget pontosan és azonnal azonosítanak; míg azoknál, akiknek nem használ a kezelés, el lehetne kerülni egy költséges és potenciálisan káros szer adását. A College of American Pathologists korábbi továbbképzési törekvéseinek áttekintése

A CAP több, a rák prediktív és prognosztikai tényezôivel foglalkozó konszenzus-konferenciát támogatott 1994 óta. Az e témában 1994-ben tartott elsô konferencia eredményeként egy olyan közlemény született, amely emlôrákban részletezte a HER2-vizsgálat potenciális értékét. Ebben azonban a vizsgálómódszerre vonatkozóan nem voltak specifikus ajánlások.70 Az 1999-ben tartott második konferencia a módszer specifikálása nélkül támogatta, hogy az emlôrák kivizsgálásakor kerüljön sor a HER2-antigén vagy -génexpresszió meg-

35

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 36

Wolff és mtsai

12. táblázat. A CAP HER2 Strategic Science 2002 szimpózium ajánlásainak összegzése Csak formalinos fixálást szabad használni a minták HER2-vizsgálatához A laboratóriumi validálás után jóváhagyott standardizált módszereket kell használni A patológusokat és asszisztenseket ki kell képezni, és mérni kell teljesítményüket Minden vizsgálatsorozatnál pozitív és negatív kontrollokat kell használni, melyek viszonyítási alapként szolgálnak Az értékeléshez képelemzési eljárás szükséges Az onkológustól származó információ alapján formanyomtatványon történjen a leletkiadás Külsô minôség-ellenôrzési programokban való rendszeres részvétel, hiányosság esetén a probléma okának feltárása A mûködés színvonalának rendszeresen mérése és elemzése, mennyire függnek össze az egyéb tesztekkel kapott eredmények, szükség esetén intézkedések a probléma megszüntetésére Rövidítések: CAP, College of American Pathologists; HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2.

határozására.51 A CAP 2002-ben egy külön szimpóziumot („Strategic Science”) szervezett, melynek kapcsán a patológusok számára arra vonatkozó ajánlásokat adott, hogyan kell a HER2-vizsgálatot végezni. Ez alapján született meg az a közlemény, mely igen specifikusan részletezi a patológusoknak adott ajánlásokat (12. táblázat).47 A CAP (a National Cancer Institute [Bethesda, MD], a NIST és a US Food and Drug Administration szervezetekkel együtt) 2003-ban egy olyan ülést támogatott, amely egy standardizált HER2 referenciaanyag kidolgozását tárgyalta meg az immunhisztokémiai HER2-vizsgálatok számára. A találkozón általános volt az egyetértés abban, hogy a HER2-vizsgálat standardizálását segítené, ha referenciaminták állnának rendelkezésre. Az ülésen megfogalmazott ajánlásokat a 13. táblázat összegzi.61 Azóta a National Cancer támogatást adott a NIST számára annak érdekében, hogy kifejlesszen egy, a HER2-fehérjét specifikusan különbözô mértékben expresszáló sejtvonalakból álló referenciamintát. A sejtvonalakat kiválasztották, és megkezdôdött a referenciaminta standardizált termelése. A CAP országos kongresszusain 2002 óta

13. táblázat. A NIST Consensus Workshop on Reference Material for HER2 Testing 2003 munkaértekezlet ajánlásainak összegzése A NIST azokat a rendelkezésre álló emlôsejtvonalakat tudja elfogadni standardként (hármat), amelyeknél a receptor- és génexpresszió különbözô mértékû, így alkalmas a receptormennyiség lefedésére A sejtvonalakat optimális formában tartják A NIST a standard esetében jellemzi a HER2 receptortartalmát (ún. „scatchard pontok”) fehérje fizikai adottságait génkópiaszámot RNS-expressziós szinteket Üzleti célra egy másodlagos standardot fognak elôállítani Ezt minden olyan HER2 laboratóriumi vizsgálatnál kell alkalmazni, amelyet gyártók/üzleti célú laboratóriumok/kutatók végeznek A HER2-vizsgálathoz és a referenciastandardhoz fixálószerként 10%-os neutrális formalint kell használni Minden egyes tárgylemez (vagy vizsgálatsor) kapcsán, valamint a laboratóriumok és módszerek közötti összehasonlítások során használni kell Rövidítések: NIST, National Institute of Standards and Technology; HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2.

36

számos továbbképzô ülést is tartott a HER2-vizsgálattal kapcsolatban. A különbözô országos patológuskongresszusokon egyéb, a gyártók által támogatott ülésekre is sor került, azonban ezeken nem született egybehangzó megállapítás. A szabályozási környezet módosítása. Lehetôség lesz arra, hogy az Egyesült Államokban a laboratóriumi akkreditációban és a külsô minôség-ellenôrzési szolgáltatásban részt vevô szervezetek áttekinthessék ezt az ajánlást. Az ASCO és a CAP közösen dolgozik azon, hogy segítsék az ajánlások elterjedését. Törekedni fognak arra, hogy a laboratóriumokban segítsék a továbbképzést. Ezért kérni fogják, hogy az ajánlásban szereplô információt közzétegyék a Centers of Disease Control and Prevention szervezet kiadványában, a Morbidity and Mortality Weekly Report hetilapban. A CAP számottevô aktivitást fog kifejteni a továbbképzés terén is; annak érdekében, hogy segítsék a patológusokat abban, hogy az akkreditációs gyakorlatban bekövetkezô változások jelentôségét megértsék, elôadásokat és online továbbképzéseket tart – elsô alkalommal a CAP 2006. szeptemberi éves közgyûlésén került erre sor. Az ASCO és a CAP továbbképzési lehetôségeket (nyomtatott vagy online formában, illetve kongresszusokon) biztosít az egészségügyben dolgozók, a betegek, a biztosítótársaságok és a szabályozó szervezetek részére. A CAP fel fogja kérni tagjait, az akkreditációs és a külsô minôség-ellenôrzési programokban részt vevôket arra, hogy a továbbképzésrôl is nyújtsanak információt a laboratóriumi akkreditációban játszó szerepükrôl összeállított jelentésükben. Az ASCO és a CAP dolgozni fog azon, hogy az ajánlásokat más szervezetekével, így a National Comprehensive Cancer Network,71 a National Cancer Advisory Board és a betegjogi szervezetekkel is összhangba hozzák. Biztosak vagyunk abban, hogy a felsorolt intézkedések javítani fogják azon laboratóriumok mûködését, ahol predikciós célból végzik e vizsgálatokat. A CAP aktívan át fogja tekinteni a külsô minôség-ellenôrzés eredményeit és a laboratóriumi akkreditáció terén végzett tevékenységet, és rendszeres idôközönként nyilvánosságra hozza, milyen színvonalon végzik a vizsgálatot. A szervezet dolgozni fog azon is, hogy a HER2-vizsgálatok minôségét ellenôrzô tevékenység része legyen azoknak a programoknak, melyek célja a folyamatos minôség-ellenôrzés, hasonlóképpen a CAP Q-tracks és Q-probes programjaihoz.72 A szakirodalmi adatok korlátai

Függetlenül attól, hogy a trastuzumabbal kapcsolatos klinikai vizsgálatról vagy a HER2-státust vizsgáló rendszerekrôl van szó, a HER2-vizsgálatokkal foglalkozó szakirodalom értékelését nehezíti, hogy az egyes klinikai vizsgálatok között nem standardizálták többek között azt, hogy milyen vizsgálómódszereket alkalmaznak, az eredményeket hogyan értékelik, mikor kerül vagy nem kerül sor megerôsítô vizsgálatra, illetve a vizsgálatok helyben vagy központi laboratóriumban történnek-e. A HER2-státus meghatározására használt vizsgálati algoritmusokat valamelyest önkényesen fejlesztették


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 37


ki, az algoritmusok kapcsán alkalmazott módszereket sem mindig standardizálták. Míg egyes vizsgálómódszereket gondosan validáltak, másokat – különösen a helyileg kifejlesztett módszereket – nem, ami megnehezíti az egyes klinikai vizsgálatok és vizsgálati rendszerek közvetlen összehasonlítását. Amennyiben nem változik a helyzet, akkor az emlôrákos betegek jelentôs hányada a szükségesnél kisebb vagy nagyobb mértékû kezelésben fog részesülni. A közölt vizsgálatokon túl a szakértôi testület figyelembe vette a hazai és nemzetközi szakmai szervezetek korábbi ajánlásait és álláspontjait. A legtöbb esetben ezek a korábbi ajánlások egyszerûen csak annyit állítottak, hogy a HER2vizsgálatot el kell végezni, és nem tértek ki a specifikus módszertan és a minôség-ellenôrzés kérdésére, vagy arra, milyen kapcsolatban áll a vizsgálati eredmény a klinikai eredménnyel. Az ajánlások azt is hangsúlyozták: szükséges, hogy mielôtt a másodlagos FISH vizsgálatokat csak az IHC 2+ eredményekre korlátoznák, az egyes laboratóriumok dokumentálják, saját tapasztalataik szerint mennyire egyezik meg a FISH és az IHC eredménye (ez legalább 90% kell legyen IHC 0 és 3+, és 95% IHC 1+ esetében). A figyelembe vett ajánlásokat a trastuzumab adjuváns adásával kapcsolatos adatok közlése elôtt dolgozták ki. Ennél fogva az egyezési arányokat a palliatív célú trastuzumab esetében állapították meg, nem pedig az adjuváns trastuzumab-adással kapcsolatos túlélési elôny alapján. Végül más szervezetek olyan algoritmusokat javasoltak, melyek a legújabb, de valójában igen szórványosan rendelkezésre álló adatokon alapulnak. Meg kell jegyezni, hogy a már létezô ajánlások által megadott vizsgálati algoritmusok feltételezik, hogy az IHC és FISH vizsgálatok eredménye nagymértékben egyezik, ez azonban a fellelhetô szakirodalmi adatok alapján nem feltétlenül megalapozott. A szakértôi testület felismerte, hogy a köztes vagy nem egyértelmû eredményekkel rendelkezô betegekre vonatkozó szakirodalmi adatok hiányosak. A döntés, hogy kell-e specifikus terápiát végezni (például trastuzumabot adni), csak „igen” vagy „nem” válaszként fogalmazódhat meg. Mindazonáltal a HER2-vizsgálat eredménye folyamatos változó, ami várhatóan ahhoz vezet, hogy az eredmények egy része a szürke zónába esik. Tovább növeli a zavart, hogy az IHC és a FISH módszerek esetében nagymértékben eltérnek az intermedier tartományok. Az intermedier eredményekkel rendelkezô betegek alcsoportjában hiányosak a szakirodalmi adatok. A hatékonysági adatok a betegek azon alcsoportjában is korlátozottak, ahol a jó minôségû IHC és FISH vizsgálatok eredménye nem egyezett. Ez egy olyan kevéssé vizsgált alcsoport, ahol a HER2-értékek kevéssé megbízhatóak, így a trastuzumab-kezelés valódi haszna sem ismert. Mivel ezen alcsoportok mérete (és így az események száma) az adjuváns trastuzumab-terápiával foglalkozó egyes vizsgálatokban viszonylag kicsi, javasoljuk, hogy a kutatásokat irányító szakemberek közös értékelés céljára összegezzék adataikat. Így kísérletet lehetne tenni néhány kérdés megválaszolására.

www.jco.org

ÉRDEKÜTKÖZÉS LEHETÔSÉGE MIATT KIZÁRT SZERZÔK Noha minden szerzô kitöltötte az érdekütközésre vonatkozó nyilatkozatot, az alábbi szerzôk vagy családtagjaik esetében felmerült az anyagi motiváció lehetôsége. Nem tekintjük érdekütközésnek, ha a motiváció tárgyát képezô egyes gyógyszerek vagy eszközök nem szerepelnek az értékelésben. A fenti kategóriák részletes leírása és az ASCO érdekütközéssel kapcsolatos állásfoglalásának további részleteiért, kérjük, olvassa el a kizáró nyilatkozatot (Author Disclosure Declaration) és a szerzôknek szóló útmutatót (Information for Contributors), amely az eredeti folyóirat minden számának elején megtalálható. Alkalmazotti viszony: N/A Vezetô pozíció: N/A Szaktanácsadó: Richard J. Cote, Clarient, Roche, Abbott; Mitchell Dowsett, Roche, Abbott Diagnostics; Soonmyung Paik, Genentech, GlaxoSmithKline; Mark D. Pegram, Genentech; Michael F. Press, Genentech; Anthony Rhodes, European Collection of Cell Cultures; Marc van de Vijver, Roche; Daniel F. Hayes, Immunicon, Pfizer, Novartis Részvényes: Richard J. Cote, Clarient Díjazás: M. Elizabeth H. Hammond, M2 Communications, Serinomics; Mitch Dowsett, Roche; Soonmyung Paik, Genentech, GlaxoSmithKline; Mark D. Pegram, Genentech; Michael F. Press, Genentech; Raymond Tubbs, Ventana, Abbott/Vysis; Marc van de Vijver, Roche Kutatási támogatás: Antonio C. Wolff, Roche; Richard J. Cote, Roche, Abbott; Raymond Tubbs, Ventana, Abbott/Vysis; Daniel F. Hayes, Pfizer, Novartis Szakvélemény: Michael F. Press, Genentech Egyéb: Raymond Tubbs, Nanoprobes A SZERZÔK HOZZÁJÁRULÁSA A KÉZIRAT ELKÉSZÍTÉSÉHEZ A vizsgálat ötlete és megtervezése: Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Daniel F. Hayes Adminisztratív segítség: Karen L. Hagerty Adatgyûjtés és -rendszerezés: Antonio C. Wolff, Karen L. Hagerty Adatelemzés és az eredmények értékelése: Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Karen L. Hagerty, D. Craig Allred, Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad Hanna, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes, Catharine Sturgeon, Sheila Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler, Daniel F. Hayes A kéziratot elkészítette: Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, Karen L. Hagerty, D. Craig Allred, Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad Hanna, Amy Langer, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes, Catharine Sturgeon, Sheila Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler, Daniel F. Hayes A kézirat végsô jóváhagyása: Antonio C. Wolff, M. Elizabeth H. Hammond, Jared N. Schwartz, D. Craig Allred, Richard J. Cote, Mitchell Dowsett, Patrick L. Fitzgibbons, Wedad Hanna, Amy Langer, Lisa M. McShane, Soonmyung Paik, Mark D. Pegram, Edith A. Perez, Michael F. Press, Anthony Rhodes, Catharine Sturgeon, Sheila Taube, Raymond Tubbs, Gail H. Vance, Marc van de Vijver, Thomas M. Wheeler, Daniel F. Hayes

37

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 38

Wolff és mtsai

HIVATKOZÁSOK 1. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, et al: Human breast cancer: Correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science 235:177-182, 1987 2. NCBI: PubMed.http://www.ncbi.nlm.nih. gov/ entrez/query.fcgi?db_gene&cmd_Retrieve&dopt_full_r eport& list_uids_ 2064 3. Akiyama T, Sudo C, Ogawara H, et al: The product of the human c-erbB-2 gene: A 185-kilodalton glycoprotein with tyrosine kinase activity. Science 232:1644-1646, 1986 4. Press M, Pike M, Chazin V, et al: Her-2/neu expression in node-negative breast cancer: Direct tissue quantitation by computerized image analysis and association of overexpression with increased risk of recurrent disease. Cancer Res 53:4960-4970, 1993 5. Press MF, Bernstein L, Thomas PA, et al: HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: Poor prognosis in node-negative breast carcinomas. J Clin Oncol 15: 2894-2904, 1997 6. Yamauchi H, Stearns V, Hayes DF: When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer. J Clin Oncol 19:2334-2356, 2001 7. Konecny G, Pauletti G, Pegram M, et al: Quantitative association between HER-2/neu and steroid hormone receptors in hormone receptorpositive primary breast cancer. J Natl Cancer Inst 95:142153, 2003 8. Ellis MJ, Coop A, Singh B, et al: Letrozole is more effective neoadjuvant endocrine therapy than tamoxifen for ErbB-1- and/or ErbB-2-positive, estrogen receptor-positive primary breast cancer: Evidence from a phase III randomized trial. J Clin Oncol 19:38083816, 2001 9. Menard S, Valagussa P, Pilotti S, et al: Response to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil in lymph node-positive breast cancer according to HER2 overexpression and other tumor biologic variables. J Clin Oncol 19:329-335, 2001 10. Thor AD, Berry DA, Budman DR, et al: ErbB2, p53, and efficacy of adjuvant therapy in lymph nodepositive breast cancer. J Natl Cancer Inst 90: 13461360, 1998 11. Pritchard KI, Shepherd LE, O’Malley FP, et al: HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 354:2103-2111, 2006 12. Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, et al: Correlation between complete response to anthracyclinebased chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and protein overexpression in locally advanced/ metastatic breast cancer. Int J Oncol 24:201-209, 2004 13. Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, et al: TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 45:590-596, 2006 14. Konecny GE, Thomssen C, Luck HJ, et al: Her-2/neu gene amplification and response to paclitaxel in patients with metastatic breast cancer. J Natl Cancer Inst 96:1141-1151, 2004 15. Hayes DF, Thor A, Dressler L, et al: HER2 predicts benefit from adjuvant paclitaxel after AC in node-positive breast cancer: CALGB 9344. J Clin Oncol 24:5S, 2006 (abstr 510) 16. Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, et al: Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 344:783-792, 2001 17. Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D, et al: Multinational study of the efficacy and safety of

38

humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. J Clin Oncol 17:2639-2648, 1999 18. Vogel CL, Cobleigh MA, Tripathy D, et al: Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 20:719-726, 2002 19. Slamon D, Eiermann W, Robert N, et al: Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (ACT) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (ACTH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 94:S5, 2005 (supp 1; abstr 1) 20. Joensuu H, Kellokumpu-Lehtinen P-L, Bono P, et al: Adjuvant docetaxel or vinorelbine with or without trastuzumab for breast cancer. N Engl J Med 354:809-820, 2006 21. Romond EH, Perez EA, Bryant J, et al: Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 353: 16731684, 2005 22. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, LeylandJones B, et al: Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 353:1659-1672, 2005 23. The Herceptin Adjuvant (HERA) Trial Study Team: Trastuzumab following adjuvant chemotherapy in HER2-positive early stage breast cancer (HERA trial): Disease-free and overall survival after 2 year follow-up. J Clin Oncol 24, 2006 presented as a late breaking abstract at the 42nd Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Atlanta, GA, June 2-6, 2006 24. Geyer CE, Cameron D, Lindquist D, et al: A phase III randomized, open-label, international study comparing lapatinib and capecitabine vs. capecitabine in women with refractory advanced or metastatic breast cancer (EGF100151). J Clin Oncol; 2006 presented as a late breaking abstract at the 42nd Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, Atlanta, GA, June 2-6, 2006 25. Slamon DJ, Godolphin W, Jones LA, et al: Studies of the HER-2/neu proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. Science 244:707-712, 1989 26. Mass RD, Sanders C, Charlene K, et al: The concordance between the clinical trials assay (CTA) and fluorescence in situ hybridization (FISH) in the Herceptin pivotal trials. Proc Am Soc Clin Oncol 19:75a, 2000 (abstr 291) 27. Seidman AD, Berry D, Cirrincione C, et al: CALGB 9840: Phase III study of weekly (W) paclitaxel (P) via 1-hour(h) infusion versus standard (S) 3h infusion every third week in the treatment of metastatic breast cancer (MBC), with trastuzumab (T) for HER2 positive MBC and randomized for T in HER2 normal MBC. J Clin Oncol 22: 6s, 2004 (abstr 512) 28. Yaziji H, Goldstein LC, Barry TS, et al: HER-2 testing in breast cancer using parallel tissue-based methods. JAMA 291:1972-1977, 2004 29. Owens MA, Horten BC, Da Silva MM: HER2 amplification ratios by fluorescence in situ hybridization and correlation with immunohistochemistry in a cohort of 6556 breast cancer tissues. Clin Breast Cancer 5:6369, 2004 30. Paik S, Bryant J, Tan-Chiu E, et al: Real-world performance of HER2 testing-National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project experience. J Natl Cancer Inst 94:852-854, 2002 31. Perez EA, Suman VJ, Davidson NE, et al: HER2 testing by local, central, and reference laboratories in specimens from the North Central Cancer Treatment Group N9831 Intergroup adjuvant trial. J Clin Oncol 24:3032-3038, 2006

32. Isola J, Tanner M, Forsyth A, et al: Interlaboratory comparison of HER-2 oncogene amplification as detected by chromogenic and fluorescence in situ hybridization. Clin Cancer Res 10:4793-4798, 2004 33. Press M, Bernstein L, Sauter G, et al: Topoisomerase II-alpha gene amplification as a predictor of responsiveness to anthracycline-containing chemotherapy in the Cancer International Research Group 006 clinical trial of trastuzumab (Herceptin) in the adjuvant setting. Breast Cancer Res Treat 94:S54, 2005 (supp 1; abstr 1045) 34. Persons DL, Tubbs RR, Cooley LD, et al: HER-2 fluorescence in situ hybridization: Results from the survey program of the College of American Pathologists. Arch Pathol Lab Med 130:325-331, 2006 35. Dal Lago L, Durbecq V, Desmedt C, et al: Correction for chromosome 17 is critical for determination of true Her-2/neu gene amplification status in breast cancer (BC). Mol Cancer Ther 5:2572-2579, 2006 36. Vera-Roman JM, Rubio-Martinez LA: Comparative assays for the HER-2/neu oncogene status in breast cancer. Arch Pathol Lab Med 128:627633, 2004 37. Hanna WM, Kwok K: Chromogenic in-situ hybridization: A viable alternative to fluorescence insitu hybridization in the HER2 testing algorithm. Mod Pathol 19:481-487, 2006 38. Downs-Kelly E, Pettay J, Hicks D, et al: Analytical validation and interobserver reproducibility of EnzMet GenePro: A second-generation bright-field metallography assay for concomitant detection of HER2 gene status and protein expression in invasive carcinoma of the breast. Am J Surg Pathol 29:15051511, 2005 39. Bast RC Jr, Ravdin P, Hayes DF, et al: 2000 update of recommendations for the use of tumor markers in breast and colorectal cancer: Clinical practice guidelines of the American Society of Clinical Oncology. J Clin Oncol 19:1865-1878, 2001 40. Roche PC, Suman VJ, Jenkins RB, et al: Concordance between local and central laboratory HER2 testing in the breast intergroup trial N9831. J Natl Cancer Inst 94:855-857, 2002 41. Gutman S: Regulatory issues in tumor marker development. Semin Oncol 29:294-300, 2002 42. Hayes DF, Picard MH: Heart of darkness: The downside of trastuzumab. J Clin Oncol 24:40564058, 2006 43. Tan-Chiu E, Yothers G, Romond E, et al: Assessment of cardiac dysfunction in a randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by paclitaxel, with or without trastuzumab as adjuvant therapy in node-positive, human epidermal growth factor receptor 2-overexpressing breast cancer: NSABP B-31. J Clin Oncol 23:7811-7819, 2005 44. Perez E, Suman V, Davidson N, et al: Exploratory analysis from NCCTG N9831: Do clinical and laboratory characteristics predict cardiac toxicity of trastuzumab when administered as a component of adjuvant therapy? Breast Cancer Res Treat 94: 2005 (supp 1; abstr 2038) 45. Geyer CE, Bryant JL, Romond EH, et al: Four year update of cardiac dysfunction on NSABP B-31: A randomized trial of AC-_paclitaxel vs. AC-_ paclitaxel with trastuzumab in HER2 positive, node positive operable breast cancer. J Clin Oncol 24: 23S, 2006 (abstr 581) 46. Cell Markers and Cytogenetics Committees College Of American Pathologists: Clinical laboratory assays for HER-2/neu amplification and overexpression: Quality assurance, standardization, and proficiency testing. Arch Pathol Lab Med 126:803- 808, 2002 47. Zarbo RJ, Hammond ME: Her-2/neu testing of breast cancer patients in clinical practice. Arch Pathol Lab Med 127:549-553, 2003


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 39

A humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2 vizsgálata emlôrákban 48. Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, et al: Best practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 57:233-237, 2004 49. Hanna W, O’Malley F: Updated recommendations from the HER2/neu consensus meeting. Current Oncology 9:S18-S19, 2002 (suppl 1) 50. Bilous M, Dowsett M, Hanna W, et al: Current perspectives on HER2 testing: A review of national testing guidelines. Mod Pathol 16:173-182, 2003 51. Fitzgibbons PL, Page DL, Weaver D, et al: Prognostic factors in breast cancer: College of American Pathologists Consensus Statement 1999. Arch Pathol Lab Med 124:966-978, 2000 52. Vincent-Salomon A, MacGrogan G, Couturier J, et al: Calibration of immunohistochemistry for assessment of HER2 in breast cancer: Results of the French multicentre GEFPICS study. Histopathology 42:337-347, 2003 53. Allred DC, Clark GM, Tandon AK, et al: HER2/neu in node-negative breast cancer: Prognostic significance of overexpression influenced by the presence of in situ carcinoma. J Clin Oncol 10:599-605, 1992 54. Tubbs RR, Pettay JD, Roche PC, et al: Discrepancies in clinical laboratory testing of eligibility for trastuzumab therapy: Apparent immunohistochemical false-positives do not get the message. J Clin Oncol 19:2714-2721, 2001 55. Perez EA, Roche PC, Jenkins RB, et al: HER2 testing in patients with breast cancer: Poor correlation between weak positivity by immunohistochemistry and gene amplification by fluorescence in situ hybridization. Mayo Clin Proc 77:148-154, 2002 56. Press MF, Sauter G, Bernstein L, et al: Diagnostic evaluation of HER-2 as a molecular target: An assessment of accuracy and reproducibility of laboratory testing in large, prospective, randomized clinical trials. Clin Cancer Res 11:6598-6607, 2005 57. Downs-Kelly E, Yoder BJ, Stoler M, et al: The influence of polysomy 17 on HER2 gene and protein expression in adenocarcinoma of the breast: A fluorescent in situ hybridization, immunohistochemical, and isotopic mRNA in situ hybridization study. Am J Surg Pathol 29:1221-1227, 2005 58. Ma Y, Lespagnard L, Durbecq V, et al: Polysomy 17 in HER-2/neu status elaboration in breast cancer: Effect on daily practice. Clin Cancer Res 11:4393-4399, 2005 59. Reddy JC, Reimann JD, Anderson SM, et al: Concordance between central and local laboratory HER2 testing from a community-based clinical study. Clin Breast Cancer 7:153-157, 2006 60. FDA/CBER: Clinical Review Briefing Document sBLA STN: 103792\5008\0 [Original BLA 980369] Trastuzumab. http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/ 01/briefing/3815b1_08_HER2%20FISH.pdf 61. Hammond ME, Barker P, Taube S, et al: Standard reference material for Her2 testing: Report of a National Institute of Standards and Technologysponsored consensus workshop. Appl Immunohistochem Mol Morphol 11:103-106, 2003

62. Press MF, Slamon DJ, Flom KJ, et al: Evaluation of HER-2/neu gene amplification and overexpression: Comparison of frequently used assay methods in a molecularly characterized cohort of breast cancer specimens. J Clin Oncol 20:3095-3105, 2002 63. Hanna W, O’Malley FO: Updated recommendations from the HER2/neu consensus meeting: Toronto, Ontario, 7 September 2001. Curr Oncol 9:S18S20, 2002 (supp 1) 64. Dowsett M, Bartlett J, Ellis IO, et al: Correlation between immunohistochemistry (HercepTest) and fluorescence in situ hybridization (FISH) for HER-2 in 426 breast carcinomas from 37 centres. J Pathol 199:418-423, 2003 65. Taylor CR: The total test approach to standardization of immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med 124:945-951, 2000 66. Hicks DG, Tubbs RR: Assessment of the HER2 status in breast cancer by fluorescence in situ hybridization: A technical review with interpretive guidelines. Hum Pathol 36:250-261, 2005 67. Fitzgibbons P, Murphy D, Dorfman D, et al: Interlaboratory comparison of immunohistochemical testing for HER2: Results of the 2004 and 2005 College of American Pathologists HER2 immunohistochemistry tissue microarray survey. Arch Pathol Lab Med 130:1440-1445, 2006 68. Rhodes A, Jasani B, Anderson E, et al: Evaluation of HER-2/neu immunohistochemical assay sensitivity and scoring on formalin-fixed and paraffinprocessed cell lines and breast tumors: A comparative study involving results from laboratories in 21 countries. Am J Clin Pathol 118:408-417, 2002 69. O’Malley F, Thomson T, Julian J, et al: HER2 status: A Canadian experience of concordance between central and local testing laboratories. Breast Cancer Res Treat 82:305, 2003 70. Henson DE, Fielding LP, Grignon DJ, et al: College of American Pathologists Conference XXVI on clinical relevance of prognostic markers in solid tumors. Arch Pathol Lab Med 119:1109-1112, 1995 71. Carlson RW, Moench SJ, Hammond ME, et al: HER2 testing in breast cancer: NCCN Task Force report and recommendations. J Natl Compr Canc Netw 4:S1-S22, 2006 (suppl 3); quiz S23-S24, 2006 72. Zarbo RJ, Jones BA, Friedberg RC, et al: Qtracks: A College of American Pathologists program of continuous laboratory monitoring and longitudinal tracking. Arch Pathol Lab Med 126:1036-1044, 2002 73. Dako A/S G, Denmark: HercepTest package insert. http://www.dakousa.com/prod_downloadpackageinsert. pdf?objectid_105073003 74. Carlson RW, Anderson BO, Burstein HJ, et al: Breast Cancer. J Natl Compr Canc Netw 3:238-289, 2005 75. Perez EA, Suman VJ, Davidson NE, et al: HER2 testing by local, central, and reference laboratories in the NCCTG N9831 Intergroup adjuvant trial. J Clin Oncol 22:567, 2004

76. Mass RD, Press MF, Anderson S, et al: Evaluation of clinical outcomes according to HER2 detection by fluorescence in situ hybridization in women with metastatic breast cancer treated with trastuzumab. Clin Breast Cancer 6:240-246, 2005 77. Bartlett JM, Going JJ, Mallon EA, et al: Evaluating HER2 amplification and overexpression in breast cancer. J Pathol 195:422-428, 2001 78. Dybdal N, Leiberman G, Anderson S, et al: Determination of HER2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization and concordance with the clinical trials immunohistochemical assay in women with metastatic breast cancer evaluated for treatment with trastuzumab. Breast Cancer Res Treat 93:3-11, 2005 79. Masood S, Bui MM: Assessment of Her-2/ neu overexpression in primary breast cancers and their metastatic lesions: An immunohistochemical study. Ann Clin Lab Sci 30:259-265, 2000 80. Simon R, Nocito A, Hubscher T, et al: Patterns of HER-2/neu amplification and overexpression in primary and metastatic breast cancer. J Natl Cancer Inst 93:1141-1146, 2001 81. Hammond M, Taube S: Issues and barriers to development of clinically useful tumor markers: A development pathway proposal. Semin Oncol 29: 213-221, 2002 82. Rhodes A, Borthwick D, Sykes R, et al: The use of cell line standards to reduce HER-2/neu assay variation in multiple European cancer centers and the potential of automated image analysis to provide for more accurate cut points for predicting clinical response to trastuzumab. Am J Clin Pathol 122:51-60, 2004 83. Gulmann C, Loring P, O’Grady A, et al: Miniature tissue microarrays for HercepTest standardisation and analysis. J Clin Pathol 57:1229-1231, 2004 84. Wick MR, Swanson PE: Targeted controls in clinical immunohistochemistry: A useful approach to quality assurance. Am J Clin Pathol 117:7-8, 2002 85. Moskaluk CA: Standardization of clinical immunohistochemistry: Why, how, and by whom? Am J Clin Pathol 118:669-671, 2002 86. Bloom K, Harrington D: Enhanced accuracy and reliability of HER-2/neu immunohistochemical scoring using digital microscopy. Am J Clin Pathol 121:620630, 2004 87. Wang S, Saboorian MH, Frenkel EP, et al: Assessment of HER-2/neu status in breast cancer: Automated cellular imaging system (ACIS)-assisted quantitation of immunohistochemical assay achieves high accuracy in comparison with fluorescence in situ hybridization assay as the standard. Am J Clin Pathol 116:495-503, 2001 88. US Food and Drug Administration: Clinical Laboratory Improvement Amendments. www.fda .gov/cdrh/clia 89. Dowsett M, Hanby, AM, Laing M, et al: HER2 testing in the UK: Consensus from a national consultation. J Clin Path, in press

■ ■ ■

Köszönetnyilvánítás

A szakértôi testület a kézirat korábbi verzióinak áttekintéséért köszönetét fejezi ki az alábbiaknak: Deborah Collyar, Nancy Davidson, MD, Christopher Desch, MD, Cindy Geoghegan, David Hicks, MD, Michael Neuss, MD, Lisa Newman, MD, Frances O’Malley, Martine Piccart-Gebhart, MD, PhD, George Sledge, MD, továbbá American Society of Clinical Oncology Health Services Committee és College of American Pathologists Council on Scientific Affairs.

www.jco.org

39

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 40

Wolff és mtsai

A függelék A1 táblázat. A munkacsoport tagjai Tag neve

Intézmény

M. Elizabeth H. Hammond, MD, társelnök Daniel F. Hayes, MD, társelnök Jared N. Schwartz, MD, PhD, FACP, társelnök Antonio C. Wolff, MD, FACP, társelnök D. Craig Allred, MD Richard J. Cote, MD, FRCPath Mitchell Dowsett, PhD Patrick L. Fitzgibbons, MD, FCAP Wedad M. Hanna, MD, FRCP(C) Amy Langer Lisa M. McShane, PhD Soonmyung Paik, MD Mark D. Pegram, MD Edith A. Perez, MD Michael F. Press, MD, PhD Anthony Rhodes, PhD Catharine Sturgeon, Ph.D., MRCPath, FACB Sheila E. Taube, PhD Raymond Tubbs, DO Gail H. Vance, MD Marc van de Vijver, MD Thomas M. Wheeler, MD Steven Gutman, MD, MBA, Ex-Officio Patricia Keegan, MD, Ex-Officio Judy Yost, MA, MT (ASCP), Ex-Officio

Intermountain Healthcare, University of Utah School of Medicine University of Michigan Comprehensive Cancer Center, University of Michigan Health and Hospital System Presbyterian Hospital The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center at Johns Hopkins Washington University School of Medicine in St Louis University of Southern California Keck School of Medicine/Norris Comprehensive Cancer Center, Los Angeles Royal Marsden Hospital St Jude Medical Center Sunnybrook Health Sciences Centre/Women’s College Hospital betegtanácsadó és oktató National Cancer Institute National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project University of California in Los Angeles, Geffen School of Medicine Mayo Clinic Jacksonville University of Southern California University of the West of England, Bristol The Royal Infirmary of Edinburgh National Cancer Institute Cleveland Clinic Foundation Indiana University Netherlands Cancer Institute Baylor College of Medicine Food and Drug Administration Food and Drug Administration Centers for Medicare & Medicaid Services

B függelék A2 táblázat. A szakértôi testület 2006 márciusában megtartott nyílt ülésére meghívott vendégek Vendég neve Kenneth J. Bloom, MD Jon Askaa, DVM, PhD Patrick C. Roche, PhD Mary Hickman Allen M. Gown, MD Jess Savala Jr, MD Arturo Anguiano, MD Robert D. Mass, MD Robert B. Jenkins, MD, PhD

Cég Clarient Inc (Aliso Viejo, CA) Dako A/S (Glostrup, Dánia) Ventana Medical Systems Inc (Tucson, AZ) Abbott (Vysis) Molecular Inc (Des Plaines, IL) PhenoPath Laboratories (Seattle, WA) US LABS (LabCorp; Irvine, CA) Quest Diagnostics (Lyndhurst, NJ) Genentech Inc (South San Francisco, CA) Mayo Medical Labs (Rochester, MN)

C függelék A HER2-státus és a trastuzumab-adás elônyei közötti kapcsolatra utaló bizonyíték

Az elsô klinikai vizsgálatok során végzett HER2-meghatározások. A trastuzumab áttétes emlôrákban való adását elemzô három klinikai vizsgálat során a LabCorp központi laboratóriumban körülbelül 6000 tumormintánál végezték el a HER2-szûrést annak érdekében, hogy megállapítsák, alkalmas-e a beteg a vizsgálatban való részvételre.16–18 A jelöltek kétharmadánál nem volt kimutatható fokozott HER2-expresszió (definíció szerint IHC 0 vagy 1+ pontértéknek felel meg). Valószínûtlennek tartották, hogy e betegeknél a trastuzumabbal végzett HER2-ellenes kezelés hatékony lenne. A betegek fennmaradó egyharmadát HER2pozitívként sorolták be (definíció szerint IHC 2+ vagy 3+).60 A US Food and Drug Administration Center for Biologics Evaluation and Research hivatal elôírta, hogy minden olyan esetben, amikor egy terápiás célú termék alkalmazása egy adott vizsgálati eredménytôl függ, biztosítani kell e célra diagnosztikai módszer elérhetôségét. Ezért a trastuzumabbal egy idôben, 1998-ban egy IHC módszer (HercepTest; DakoA/S, Glostrup, Dánia) alkalmazását is engedélyezték. A HercepTest ugyanolyan pontozási kritériumokat használ, mint a CTA, az ellenanyag azonban eltérô (poliklonális).73 A végpontként a klinikai kimenetelt (a trastuzumab hatásosságát) alkalmazó validációs vizsgálatokat nem lehetett volna elvégezni, mivel a trastuzumab hatékonyságát elemzô vizsgálatokból származó, elôre elkészített preparátumokat technikailag alkalmatlannak tartották e specifikus célra.60

40


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 41


Egy áttétes emlôrákban végzett véletlen besorolásos tanulmány adatainak elemzése felvetette, hogy a trastuzumab jobb eredménnyel alkalmazható azoknál a betegeknél, akiknél az IHC pontértéke 3+.16 Bár a US Food and Drug Administration úgy vélte, hogy ez még nem elegendô adat ahhoz, hogy a trastuzumab adását a betegek csupán ezen alcsoportjára korlátozzák, a gyártó Genentechet (South San Francisco, CA) felkérték arra, hogy a HercepTest és más HER2-meghatározási módszerek alkalmazásával értékelje, milyen klinikai eredményt hoz a trastuzumab-kezelésre kiválasztott betegeknél.60 Klinikai algoritmus és az egyezôség vizsgálata. A betegek kiválasztására CTA-t alkalmazó IHC vizsgálattal kapcsolatos kezdeti tapasztalatok hatással voltak arra, hogy a leggyakrabban használt algoritmust átültessék a klinikai gyakorlatba. Ennek kapcsán a HER2-státust IHC vagy FISH módszerrel határozzák meg; ha az IHC pontértéke 2+, akkor FISH vizsgálatra kell sort keríteni (A3, A4 és A5 táblázat).74 A HER2-státus meghatározásánál komoly hiányosságok derültek ki: azoknál a – helyi laboratóriumok meghatározása szerint – HER2-pozitív kórfolyamatban szenvedô betegeknél, akiknél javasolták a két észak-amerikai adjuváns trastuzumab-kezeléssel kapcsolatos vizsgálatban való részvételt, az elsô néhány száz beteg esetében kiugróan nagy volt a tévesen pozitív eredmények aránya.30,40 Ezért a vizsgálati protokoll kiegészítése kötelezôvé tette, hogy a pozitív eredményt még a véletlen besorolás elôtt egy központi vagy referencialaboratóriumban megerôsítsék. A cél az volt, hogy így csökkentsék annak a valószínûségét, hogy olyan betegeket vonjanak be, akiknél a HER2-vizsgálat eredménye tévesen pozitív. Ennek hatására azonban csak mérsékelten javult a helyi és a központi laboratóriumok eredményei közötti egyezés (81,6% [IHC], illetve 88,1% [FISH]; A3 táblázat).31 A tévesen negatív eredményekkel kapcsolatban is felmerültek problémák. Perez és munkatársai tanulmányában55 az IHC pontértéke a résztvevôk 12%-ánál (n = 216) 2+ volt, és a FISH génamplifikációt igazolt. Hasonló problémák vezettek azokhoz a korábbi CAP ajánlásokhoz, melyek szerint a laboratóriumnak automatikusan el kell végeznie a FISH vizsgálatot akkor, ha az IHC pontértéke 1+ vagy 2+. Ez addig volt érvényben, amíg ki nem mutatták, hogy az IHC 1+ pontérték esetén a betegeknek kevesebb mint 5%-a mutat FISH-pozitivitást.47 Az N9831 klinikai tanulmányból származó további adatok azt mutatják, hogy az IHC és a FISH vizsgálatok eredményei közötti egyezés továbbra sem optimális.31 Press és munkatársai62 számos HER2-módszer eredményét hasonlították össze 117 olyan mintán, melynél ismerték a génamplifikáció és a fehérjeexpresszió mértékét. Két FISH módszer esetében 95,7–97,4%-nak, négy IHC-módszer (két helyi, két kereskedelemben kapható) esetében pedig 88,9–95,7%-nak adódott az egyezési arány. Bartlett és munkatársai77 a FISH szerint amplifikációt mutató és az IHC 2+/3+ minták esetében a HercepTesttel 67%-os, a CB11 antitest esetében 83%-os egyezôséget mutattak ki. Ezek az adatok jelzik, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható, a US Food and Drug Administration által jóváhagyott IHC módszerekkel jóval kevésbé pontosan jellemezhetôk az ismert HER2-státusú daganatok, mint FISH vizsgálattal, egyben alátámasztják a szakértôi testület egyes tagjainak véleményét, miszerint az IHC nem kielégítô, helyette FISH módszert kellene használni. Mindazonáltal az N9831 klinikai tanulmány adatai azt tükrözik, hogy – függetlenül attól, hogy IHC-rôl vagy FISH-rôl van-e szó – a helyi laboratóriumban és a központi intézetben végzett HER2-vizsgálatok közötti egyezés mértéke nem optimális (A3 táblázat).31 A szakértôi testület tagjainak többsége viszont kifejezte azt az aggodalmát, hogy jelenleg nem tudjuk, melyik módszer jelzi jobban elôre az anti-HER2-terápia hatékonyságát. Ráadásul az IHC/FISH eredmény a betegek akár 3%-ánál is eltérô lehet (azaz IHC 3+ esetén a FISH-sel amplifikáció mutatható ki, illetve IHC < 3+ esetén FISH-sel nem igazolható amplifikáció). A rendelkezésre álló klinikai adatok alapján adható meg, hogy e betegek egyedi biológiai alcsoportot képviselnek-e (és így ezeknek az eredményeknek van terápiás jelentôsége), vagy pedig az eredmények az IHC vizsgálat pontatlanságát jelzik. A CTA IHC módszer és a FISH (PathVysion, Abbott-Vysis, Chicago, IL) módszerek közti egyezést ugyanabban a laboratóriumban (LabCorp) vizsgálták. Korai áttétet adó emlôrákból származó mintákon kimutatták,16–18 hogy az IHC alapján 0, 1+, 2+ vagy 3+ festôdést mutató mintáknál a HER2-amplifikáció gyakorisága rendre 4,2%, 6,7%, 23,9% és 89,3%; az összes esetet tekintve az egyezés aránya 82% volt. A minták közül 488-at egy másik központi laboratóriumban, a University

A3 táblázat. A HER2-vizsgálatok egyezôségének idôbeli változása az NCCTG 9831 felmérés szerint: a központi és a helyi laboratórium eredményei közötti egyezés Vizsgálat Vizsgálat IHC 3+ (HercepTest) FISH+ (PathVysion)

Roche40 (n = 119)

Perez75 (n = 976)

Perez31 (n = 2535)

74% 67%

79,5% 85%

81,6% 88,1%

Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; NCCTG, North Central Cancer Treatment Group; IHC, immunhisztokémia; HercepTest, Dako A/S, Glostrup, Dánia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; PathVysion, Abbott/Vysis Molecular Inc, Des Plaines, IL.

www.jco.org

41

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 42

Wolff és mtsai

A4 táblázat. A terápiára reagáló betegek aránya a HER2-státus (FISH) alapján a H648g jelû, véletlen besorolásos klinikai vizsgálatban Kezelés (n = 451) Kemoterápia + trastuzumab

Csak kemoterápia

HER2-státus

Esetszám

%

Esetszám

%

p-érték

FISH+ FISH-

95/176 19/50

54 38

51/168 22/57

30 39

< 0,0001 NS1

FIGYELEM. Mass és munkatársai76 munkája alapján Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; NS, nem szignifikáns.

of Southern California Los Angeles, CA egyetemen is megvizsgáltak FISH segítségével. Az összegzett egyezési arány 92%nak bizonyult (HER2-pozitivitást a minták 71%-ában, illetve 78%-ában mutattak ki).78 Ezek az értékek valamelyest hasonlóak azokhoz az arányokhoz, melyeket a North American Intergroup adjuváns trastuzumab adását elemzô véletlen besorolásos klinikai vizsgálat során gyûjtött mintákkal kapcsolatban két referencialaboratóriumban találtak.31 Press és munkatársai56 a helyi és központi laboratóriumban végzett FISH vizsgálatok esetében 92%-os egyezést figyeltek azon minták esetében, melyeket a Breast Cancer International Research Group 006 jelzésû klinikai tanulmánya során központi ellenôrzésre beküldtek. Az IHC és FISH predikciós értéke a trastuzumab hatékonyságának elôrejelzésekor. Nem szabad elfelejteni, hogy mivel a trastuzumabbal kapcsolatos korai vizsgálatoknál besorolási kritériumként szerepelt, hogy a központi laboratóriumban CTA alkalmazásával az egyidejûleg meghatározott IHC 2+ vagy 3+ legyen, a klinikai adatok nem álltak rendelkezésre azoknál a betegeknél, akiknél az IHC értéke 0 vagy 1+ volt, ezért ôket kizárták a vizsgálatból. Ezek az algoritmusok annak ellenére a HER2-amplifikációt használták viszonyítási alapként, hogy valójában az anti-HER2-terápia klinikai hatékonysága lett volna az optimális mérôeszköz. Mass és munkatársai76 újraelemezték a kemoterápia ± trastuzumab adását elemzô véletlen besorolásos tanulmány (H648g) klinikai eredményeit az IHC-val meghatározott HER2-státus (CTA-t alkalmazó prospektív, központi laboratóriumban végzett vizsgálat) és a FISH-eredmények (PathVysiont használó retrospektív, központi laboratóriumban végzett vizsgálat) alapján. Felvetették, hogy a kezelés csak azoknál a betegeknél jár elônnyel, akiknél a daganat génamplifikációt mutat (HER2:CEP 17 arány ⭓ 2; A4 táblázat). Sajnos ez az elemzés nem adott információt a betegek azon alcsoportjára vonatkozóan, akiknél a minta IHC 2+/FISH-pozitív vagy IHC 3+/FISH-negatív volt, mivel a szerzôk úgy ítélték meg, hogy az elemzés statisztikai ereje nem elegendô ahhoz, hogy e kérdést retrospektív módon vizsgálhassák. A H0649g tanulmány 209 betegénél, akik trastuzumabot kaptak azt követôen, hogy áttétes betegségük kemoterápia mellett progressziót mutatott, egy elôre nem megtervezett, nem kellô statisztikai erejû alcsoportelemzésre került sor.17 Az eredmények azt mutatták, hogy a fokozott HER2-expressziót és génamplifikációt mutató betegek eltérô módon reagálnak a kezelésre (az IHC 3+/FISH-pozitív esetekben erôteljesebb válasz mutatkozik, mint az IHC 2+/FISH-pozitív betegeknél), ugyanakkor – függetlenül az IHC eredményétôl – egyáltalán nem reagáltak azok a betegek, akiknél a daganatban nem igazolódott génamplifikáció (A5 táblázat). A H648g tanulmány kapcsán végzett másik hasonló, elôre nem megtervezett, nem kellô statisztikai erejû alcsoport-

A5 táblázat. A trastuzumab-monoterápiára reagáló betegek összegzett aránya a HER2-státus (FISH és IHC) alapján a H649g jelû klinikai vizsgálatban IHC (CTA) CTA 3+

CTA 2+

Összesen

HER2-státus

Esetszám

%

Esetszám

%

Esetszám

%

FISH (PathVysion) Pozitív Negatív Összesen

30/136 0/21 30/157

22 0 19

3/27 0/25 3/52

11 0 6

33/163 0/46 33/209

20 0 14

FIGYELEM. Olyan betegek, akiknél korábbi kemoterápia mellett az áttétes emlôrák progrediált. Az elemzést az FDA végezte,60 Cobleigh és munkatársai17 elôre nem tervezett alcsoportelemzése alapján. Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; PathVysion, Abbott/Vysis Molecular Inc, Des Plaines, IL; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; IHC, immunhisztokémia; CTA, klinikai vizsgálatokhoz használt módszer.

42


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 43


A6 táblázat. Az elsô vonalbeli kemoterápia trastuzumabbal való kiegészítésekor megfigyelt kimenetel a HER2-státus (FISH és IHC) alapján a H648g jelû klinikai vizsgálatban IHC (CTA) 2+ és 3+ Kemoterápia + trastuzumab FISH (PathVysion) Reagáló betegek aránya Bármilyen* (n = 469) Pozitív (n = 325) Negatív (n = 126) Túlélési idô mediánértéke Pozitív, hónap (n = 325) Negatív, hónap (n = 126) Tumor progressziójáig eltelt idô mediánértéke Pozitív, hónap (n = 325) Negatív, hónap (n = 126)

3+ Kemoterápia

Kemoterápia + trastuzumab

2+ Kemoterápia + trastuzumab

Kemoterápia

Kemoterápia

Esetszám

%

Esetszám

%

Esetszám

%

Esetszám

%

Esetszám

%

Esetszám

%

106/235 89/164 25/62

45 54 40

67/234 49/161 24/64

29 30 38

87/176 81/148 13/21 n = 169 26,3 29,1

49 55 62

46/173 40/145 12/22 n = 167 18,8 29,7

27 28 55

19/59 8/16 12/41 n = 57 21,4 19,3

32 50 29

21/61 9/16 12/42 n = 58 24,5 18,4

34 56 29

7,3 11,3

4,6 6,3

9,4 5,3

5,6 4,5

FIGYELEM. Az elemzést az FDA végezte,60 Slamon és munkatársai16 elôre nem tervezett alcsoportelemzése alapján. Az eredmények jelzik, hogy a kemoterápia trastuzumabbal való kiegészítése csak azon betegeknél elônyös, akiknél a HER2-fehérje fokozottan expresszálódik, és génamplifikáció igazolható (IHC 3+/FISH+); azon betegeknél nem elônyös, akiknél génamplifikáció nélkül van jelen fokozott fehérjeexpresszió (IHC 3+/FISH–), vagy akiknél a génamplifikáció mellett a fokozott fehérjeexpresszió nem egyértelmû (IHC 2+/FISH+). A kedvezô hatás a válaszarány és az összegzett túlélés mediánértéke esetében jelentkezett, a daganat progressziójáig eltelt idô mediánértéke esetében viszont nem. Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; IHC, immunhisztokémia; CTA, klinikai vizsgálatokhoz használt módszer. *Az adatok a trastuzumab alkalmazási elôiratából származnak.

elemzés (A6 táblázat) eredményei az IHC 2+/FISH-pozitív betegeknél ellentmondásosak voltak. Néhány paraméter esetében (így a daganat progressziójáig eltelt idô vonatkozásában) e betegeknél elônyösnek tûnt a kemoterápia trastuzumabbal való kiegészítése, azonban más paraméter esetében (a terápiás válasz aránya és az összegzett túlélés tekintetében) nem mondható el ugyanez.60 Az A7 táblázatban összegzett ellentmondásos adatok ismereteink hiányosságát jelzik. A US Food and Drug Administration által végzett retrospektív vizsgálat sajnos nem rendelkezett elegendô statisztikai erôvel ahhoz, hogy eredményei alapján egyértelmû állításokat lehessen megfogalmazni.60 A véletlen besorolásos tanulmányok kevés információval szolgálnak arról, hogy a fokozott HER2-expressziót nem mutató betegek esetében melyek a trastuzumab-kezelés elônyei. Tovább nehezíti a helyzetet az a tény, hogy sok betegnél a HER2vizsgálatot csak az adott kórházban, IHC-vel végezték (azaz ilyen esetekben az IHC eredménye 0, 1+ vagy 2+ volt, amennyiben a FISH negatív eredményt adott). A Cancer and Leukemia Group B C9840 tanulmánya az egyetlen olyan klinikai kutatás, mely véletlenszerûen sorolta be e betegeket paclitaxel- vagy paclitaxel + trastuzumab-kezelésre.27 Megfigyelték, hogy a trastuzumabbal is kezelt csoportba sorolt betegeknél (n = 113) hosszabb idô telt el a progresszióig, mint azoknál, akik trastuzumabot nem kaptak (n = 115). A lehetséges magyarázatok közé tartozik a véletlen hatása, esetleg a helyi laboratóriumban végzett HER2-vizsgálat tévesen negatív eredménnyel zárult, illetve az elsôdleges daganat és az áttét HER2-státusa eltért egymástól.79,80 A jelenleg is folyó elemzés a központi laboratóriumban végzett vizsgálatok eredményeivel (így FISH-méréssel) veti össze ezeket az adatokat. Nincsenek ismereteink arra vonatkozóan, hogy a trastuzumab hatékonysága összefügg-e a génamplifikáció mértékével. Egyértelmû, hogy ennek elemzéséhez összegezni kell a különbözô véletlen besorolásos, adjuváns klinikai vizsgálatok adatait. D függelék A nem egységes HER2-vizsgálati eredményekre vonatkozó adatok

Alapvetôen fontos, hogy a HER2-vizsgálat pontos eredményt adjon. Csak így biztosítható, hogy azok a betegek, akiknek a legnagyobb valószínûséggel használ, valóban kapjanak trastuzumabot, míg azok, akiknél valószínûleg nem használ a trastuzumab, megtakaríthassuk a terápia költségeit, és elkerülhessük a kezeléssel járó veszélyeket. Sajnos számos oka lehet annak, ha a HER2 eredményei nem pontosak. Az optimális módszer kérdése nem mentes az ellentmondásoktól. Mivel a trastuzumab kizárólag a HER2-fehérjéhez kötôdik, elméletileg az e molekulát detektáló módszerek alapján lehetne leginkább eldönteni, hogy a betegnek kapnia kell-e a szert vagy sem. E szempontból a HER2-fehérje expressziójának meghatározására számos módszer kínálkozik: a Western blot, az ELISA (enzyme-linked immunoassay) és az in situ immunfestési technikák (pl. immunfluoreszcencia, IHC). Ezek közül az IHC a legszélesebb körben elfogadott a kórszövettani laboratóriumokban, mivel e módszert számos más fehérje kimutatására is használják, illetve formalinnal fixált, paraffinba ágyazott szöveten is el lehet végezni. Mindazonáltal számos különbözô, ebben a rész-

www.jco.org

43

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 44

Wolff és mtsai

A7 táblázat. A HER2 mint a trastuzumab hatásosságának prediktív tényezôje áttétes emlôrákban 0 IHC/FISH Prevalencia, %* Kedvezô klinikai hatás†

1+

2+

3+

Negatív

Pozitív

Negatív

Pozitív

Negatív

Pozitív

Negatív

Pozitív

97 Feltehetôen nincs

3 Nem ismert


7 Nem ismert


24 Bizonytalan

11 Bizonytalan

89 Van

Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; IHC, immunhisztokémia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció. *A becsült prevalencia Dybdal és munkatársai78 adatain alapul. †A becsült kedvezô klinikai hatás az áttétes emlôrákkal kapcsolatos vizsgálatok16–18 és elôre nem tervezett alcsoportelemzések60 eredményein alapul.

ben tárgyalt tényezô befolyásolhatja az IHC eredményét és okozhat lényeges eltéréseket (3. táblázat). Emiatt sokan HER2génamplifikációs módszereket javasolnak, mivel ezek kivitelezése pontosabb. Az amplifikáció világos látóterû vagy fluoreszcens ISH módszerekkel igazolható, melyek közül a legszélesebb körben, a legtöbb patológiai intézetben a FISH-t alkalmazzák. Kimutatták, illetve a vizsgálat jelenlegi körülményei alapján nagy valószínûséggel feltételezhetô, hogy számottevô különbségek mutatkozhatnak abban, hogyan végzik a HER2-vizsgálatokat. E különbségek gyakorlatilag a vizsgálat minden stádiumát érinthetik (azaz preanalitikai, analitikai és posztanalitikai szinteken lehetnek jelen; 3. táblázat). Az emlôrákos szövetekben sem a HER2-antigének immunhisztokémiai kimutatására, sem a HER2 gén detektálására nincs standardizált módszer. Például, bár a detektálásra használt módszerek elôírják, hogy a vizsgálandó szövetet csak 10%-os neutrális formalinban lehet fixálni, sok laboratóriumban egyéb tartósítószereket használnak, és ez lényegesen befolyásolhatja a vizsgálat eredményeit.61 A különbözô HER2-epitópokkal szemben számos különbözô ellenanyag kapható a kereskedelmi forgalomban.56 Kimutatták, hogy a HER2 immunhisztokémiai vizsgálatára használatos különbözô antitestek esetében lényegesen különbözik a festôdés. Mivel a HER2 immunhisztokémiai módszerek számára egészen mostanáig nem állt rendelkezésre standardizált kontrollanyag, nem volt mód arra, hogy a különbségeket egy standard értéken normalizálják.61 Ezen túlmenôen számos ellenanyag alkalmazása során szükség van olyan lépésekre, melyekkel az antigént hozzáférhetôvé teszik az antitest számára; ezáltal válik lehetôvé, hogy a paraffinba ágyazott szövetben megfelelôen detektálhassuk az epitópokat. Az antigénfeltárást többféle módon lehet végezni, ami ahhoz vezet, hogy az alkalmazott módszer miatt kifejezett eltérések mutatkoznak a festôdésben.62 Ez szignifikáns eltéréseket okoz a szövetek festôdésekor, így igencsak különbözhetnek azok az értékek, melyek alapján eldöntik, hogy egy minta pozitív vagy negatív. Sok laboratóriumban azonban nincsenek tudatában ennek a ténynek. Becslések szerint a HER2-vizsgálatokat végzô laboratóriumok csupán igen kis hányada (30%) vesz részt külsô minôség-ellenôrzési programokban, és még e laboratóriumok közül is kevesen validálják a vizsgálati eljárást azelôtt, hogy a tesztet klinikai alkalmazásra kínálná (Genentech telefonos felmérés adatai, 2001; M.E.H. Hammond PowerPoint for-

A8 táblázat. A határérték elérésének vagy túllépésének valószínûsége (%) A külsô minôség-ellenôrzés során 80%, 85%, 90% vagy 95%-os egyezési arány, a laboratórium valódi egyezési arányának és a mintakészletben lévô tesztminták számának függvényében Határérték-egyezési arány (%) 80

85

90

95

44

Valódi egyezési arány (%) 80 85 90 95 98 80 85 90 95 98 80 85 90 95 98 80 85 90 95 98

Mintakészletben lévô tesztminták száma 20

40

80

41 65 87 98 > 99 21 40 68 92 99 7 18 39 74 94 1 4 12 36 67

44 76 96 > 99 > 99 16 43 79 99 > 99 3 13 42 86 99 <1 1 8 40 81

46 86 99 > 99 > 99 10 45 90 > 99 > 99 1 7 45 95 > 99 <1 <1 4 43 92


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 45


mátumú elôadásdiája alapján, 2003). Bár a HER2 kimutatására mind az immunhisztokémiai, mind a FISH vizsgálatok esetében rendelkezésre állnak a US Food and Drug Administration által jóváhagyott módszerek, az ilyeneket alkalmazó laboratóriumoknak csupán 48%-a jelezte, hogy teljes mértékben betartja a US Food and Drug Administration által jóváhagyott módszer elôírásait (CAP felmérés eredményei, 2004; személyesen ellenôrizte M.E.H. Hammond, 2005). A különbözô módszerek esetében eltérô eredményeket figyeltek meg,62 és nincs egyértelmû ajánlás arra vonatkozóan sem, hogy ilyen esetekben mi a legjobb laboratóriumi eljárás.81 Slamon és munkatársai25 tapasztalatai szerint még a HER2-génamplifikációt nem mutató emlôrákos minták is mutatnak kisfokú HER2-expressziót, ami IHC alapján detektálható. Ennek ellenére a legtöbb olyan vizsgálat, melynek során paraffinba ágyazott emlôrákos mintákat elemeztek, azt mutatta ki, hogy az IHC 0 kategória igen gyakori.62 Bár ezeknél a csekély expressziót mutató eseteknél a membrán csak minimális mértékben festôdik, a fagyasztott szövetminták esetében gyakorlatilag nem létezik az IHC 0 kategória, ezt pedig a szövetfixálás és -feldolgozás mûtermékeként lehet felfogni. Olyan emlôrákos eseteknél, melyeknél génamplifikáció és fokozott expresszió egyaránt jelen volt (és amelyeket Northern hibridizációval, Western immunoblottal és fagyasztott metszeten végzett IHC-val is igazoltak), arról számoltak be, hogy ezek egy részénél a paraffinba való ágyazást követôen megszûnhet a membránfestôdés.25 Ez felveti annak lehetôségét, hogy a legtöbb – ha nem minden – esetben az emlôrákos mintákban a fixálás és a paraffinos beágyazást követôen csökken az IHC festôdés. Arra azonban nincs adat, hogy az a HER2-amplifikációt mutató emlôrák, ami a mintafeldolgozás során elveszíti az immunfestôdést, biológiailag különbözne azoktól az emlôrákos mintáktól, melyekben a mintafeldolgozás után is megmarad az IHC festôdés. Slamon és munkatársai ugyanis megfigyelték, hogy a fagyasztott metszet IHC festôdése független volt attól, hogy a paraffinba való ágyazást követôen elvesztette-e a szövet az IHC festôdést. Ezért a potenciálisan tévesen negatív IHC kialakulásához vezetô antigénvesztést (illetve az antigénfeltárás során a potenciálisan álpozitív IHC-leletet eredményezô nem egyenletes antigenitásfokozódást) befolyásolhatja, ha a fixálásra használt módszereket nem megfelelôen standardizálják. Meg kell jegyezni, hogy a gyakorlott laboratóriumok részérôl csak nagyon kis arányban jeleztek FISH-amplifikációt abban az alcsoportban, melyben az IHC eredménye 0 vagy 1+. E függelék A szövettani minta feldolgozásának feltételei és kontrollanyagok

A szövettani minta feldolgozásának feltételei. A HER2-vizsgálattal kapcsolatos korábbi konszenzuskonferenciák ajánlásai47,61 és a US Food and Drug Administration jóváhagyásakor adott ajánlások alapján minden HER2-vizsgálat esetében a mûtéti eltávolítással nyert szövettani mintákat 10%-os neutrális pH-értékû formalinban legalább 6, de legfeljebb 48 órán át kell fixálni. A fixációs idô a fehérjeantigének expresszióját és az ISH génamplifikációs protokoll során végzett enzimatikus emésztés feltételeit egyaránt befolyásolja. Az elhúzódó (48 óránál hosszabb) fixálás tévesen negatív eredményekhez vezethet. A tûbiopsziás mintákra vonatkozó fixálási idôtartamot célzottan nem vizsgálták. A fixálás idejét (amennyiben ismert) rutinszerûen rögzíteni kell az esetleges probléma elhárítása érdekében. A megfelelô makroszkópos megtekintés és a széli részek meghatározása után az emlômintákból azonnal 5–10 mm vastagságú szeleteket kell készíteni és formalinban fixálni (a fel nem szeletelt mintákat nem szabad a tartósítószerbe tenni). A mintavétel és a fixálás közti idôtartam minél rövidebb legyen. A formalinban fixált mintákat rutinszerûen paraffinba kell ágyazni, majd 48 órán belül üveg tárgylemezre kell ôket helyezni. Kerülni kell a tárgylemezen a metszetek hosszabb ideig való tárolását. Az antigének konzerválását még nem veszélyeztetô tárolási idôtartam a fixálás körülményeitôl függôen változó.82 Az IHC vizsgálathoz használtak olyan szöveti microarray tárgylemez-preparátumokat, melyeket akár 270 napig is tároltak 4 °C-on.83 Bár az eltarthatóság függ az elsôdleges fixálástól és a tárolás körülményeitôl, a korábban elkészített metszeteket ideálisan hat héten belül fel kell használni a HER2 IHC vizsgálatára. Amennyiben a metszeteket a vizsgálat elôtt hosszabb ideig tárolták, és az eredmény negatív, ezt a körülményt fel kell jegyezni. A gyors szövetfeldolgozásra kifejlesztett új protokollok HER2-vizsgálatra gyakorolt hatása nem ismert. A standard körülményekben beálló bármiféle változtatást – így az egyéb fixálószerek, mikrohullámú fixálás, vagy egyéb, a minta feldolgozására használt módszerek alkalmazását – standard vizsgálati módszerekkel validálni kell, mielôtt a megváltoztatott körülmények mellett dolgozó tesztet a laboratórium felajánlaná a klinikusoknak. Az eredmények egyezôségét validálással kell igazolni, melynek során ugyanazt a HER2-vizsgálatot ugyanazon mintákon az új fixálószerrel, illetve neutrális formalinnal való tartósítás mellett is elvégzik. Kontrollanyagok. A nagyon jó minôségû kontrollok, így a standard sejtvonalak akkor fogják javítani a HER2 minôségét, amikor széles körben rendelkezésre fognak állni a belsô minôség-ellenôrzés számára.84,85 E sejtvonalakat a European Collection of Cell Cultures szervezetnél fejlesztették szigorú minôségbiztosítási feltételek mellett. A cél az volt, hogy a minôség-ellenôrzés számára ismert expressziós szintû sejteket tartalmazó preparátumokat hozzanak létre. A standardok a klinikai laboratóriumok számára 2006 vége felé lesznek elérhetôek. A NIST-nél jelenleg is tartó munka eredményeként hasonló sejtvonalakat hoznak létre az Egyesült Államokban,61 melyeket aztán a kereskedelmi cégek másodlagos, szélesebb körben alkalmazható kontrollanyagok elôállítására használhatnak fel.

www.jco.org

45

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 46

Wolff és mtsai

F függelék A módszervalidálás statisztikai feltételei

A laboratóriumi külsô minôség-ellenôrzési programok célja egyrészt annak kimutatása, hogy mely laboratóriumok esetében térnek el szignifikáns mértékben a leleteken megadott eredmények a megállapított vonatkoztatási szintektôl, másrészt segít felismerni, mely tényezôk felelôsek az eltérô eredményekért. Egy vizsgálat eredményét több tényezô befolyásolhatja. Ide tartoznak a vizsgált markerek és a minta adottságai, például az, hogy a marker mennyire stabil, a minta sejtjei mennyire heterogének, vagy milyen mértékû a daganat nekrózisa. A mintakezeléssel kapcsolatos tényezôk (például az, hogy a mûtéti eltávolítást követôen milyen gyorsan dolgozzák fel a mintát, milyen típusú fixálást mennyi ideig alkalmaznak) szintén hatással lehetnek az eredményekre. A HER2-vizsgálat esetében külön problémát jelent, hogy az alkalmazott módszerek a laboratóriumok között különbözôek, illetve a minôség az egyes laboratóriumokon belül sem állandó. A laboratóriumok különbözô reagenseket, eltérô technikai protokollokat, vagy az értékeléshez különbözô pontrendszereket használhatnak. A minôség véletlenszerû ingadozása olyan tényezôkkel is összefügghet, mint az, hogy mi a reagens gyártási száma, melyik mintasorozatról van szó, milyenek voltak a környezeti körülmények, illetve melyik asszisztens végezte a vizsgálatot. Az összes ilyen változó hatással lehet a laboratórium által leletként kiadott végsô vizsgálati eredményre. Egy laboratóriumi külsô minôség-ellenôrzési program megtervezésekor az alábbi szempontokat mindenképpen figyelembe kell venni: a program során használt mintakészlet összeállítása, a tesztminta típusa, a vizsgálat idôzítése, a módszer minôségének jellemzésére használt módszerek és határértékek meghatározása, valamint az értékeléshez használt statisztikai eljárások. A tervezés az elsô elemek megbeszélésével kezdôdik, ezt követi a laboratóriumi munka minôségét jellemzô módszerek és a statisztikai eljárások megvitatása. Ideális esetben a teszthez használt mintakészlet olyan típusú mintákat tartalmaz, amilyeneket a laboratórium a rutin gyakorlat során feldolgoz. Tekintettel kell lenni a minták fizikai adottságaira és a mintakezelés körülményeire is. Amennyiben van általánosan elfogadott gyakorlat a minta kinyerésére, kezelésére és fixálására, ezeket a tesztminták esetében is alkalmazni kell. Nyilvánvalóan nem mentes a korlátoktól, hogy a klinikai minta adottságait hogyan lehet a tesztmintákon megjeleníteni. Például a tesztminták méretének és biológiai homogenitásának többnyire nagyobbnak kell lennie, illetve konstans módon kell festôdnie vagy hibridizálódnia annak érdekében, hogy egyértelmû viszonyítási értéket adjon. A laboratórium a tesztmintákat TMA formájában vagy hagyományos teljes metszetként kaphatja meg. Bár a hagyományos teljes metszetek jellemzôek azokra a mintákra, melyeket a laboratóriumok a rutin gyakorlat során feldolgoznak, a TMA-formátummal könynyebben és kevésbé költségigényesen több mintát lehet megvizsgálni, így a laboratóriumi módszerek minôség-ellenôrzése során figyelembe vett szempontok többségét le lehet vele fedni. A külsô minôség-ellenôrzési programban való részvételt évente kettô–négy alkalommal javasolják; a gyakoriság attól függ, hogy a laboratóriumon belül a vizsgálatok minôsége mennyire állandó. Egy gondosan képzett, gyakorlott személyzettel rendelkezô dolgozó, melyben a munkatársak alig cserélôdnek, és ahol szigorú belsô minôségbiztosítási (QA)/minôség-ellenôrzési (QC) gyakorlatot követnek, valószínûleg idôben állandóbb szinten fog teljesíteni, mint az a laboratórium, amelyiknél nem ez a helyzet. Ezért a minôség értékelésekor minden laboratóriumban figyelembe kell venni a belsô QA/QC eljárásokat és a munkatársak képzettségét, tapasztalatát, továbbá a személyzet állandóságát. Hagyományosan a szenzitivitással, specificitással és pontossággal írják le, hogy a bináris („igen/nem”) eredményeket adó diagnosztikai teszteket milyen színvonalon végzik. E függelék egy vizsgálat analitikai minôségére összpontosít (milyen pontosan határozza meg a teszt az analit valódi értékét, esetünkben az arany standarddal meghatározott bináris HER2-státust). A teszt klinikai minôségét – hogy a vizsgálat milyen jól jelzi elôre, melyik beteg fog az anti-HER2-terápiára reagálni – csak megfelelôen megtervezett klinikai vizsgálattal lehet értékelni; ez túlmutat a módszervalidálás statisztikai hátterével foglalkozó rész keretein. A pontosság definíciója az, hogy a mért értékek mennyire állnak közel egy feltételezett valódi értékhez. Ez magába foglalja a variabilitást (más néven a precíziót) és a torzításokat (azaz az átlagos mért érték és a valódi érték közötti szisztémás különbséget). E megbeszélés kapcsán adottnak vesszük, hogy már rendelkezésre áll egy alkalmas vonatkoztatási érték minden egyes minta valódi státusának meghatározásához. A megfelelô arany standard kiválasztásával járó nehézségeket az ajánlás bevezetô részében már tárgyaltuk. Mivel a függeléknek ez a része speciálisan a bináris eredményt adó módszerekkel foglalkozik, a pontosság definícióját arra korlátozzuk, hogy az értékelt módszerrel kapott eredmények mekkora hányada egyezik az arany standardként használt módszerrel kapott eredményekkel, ezért az egyezés (konkordancia) kifejezést e célra alkalmazzuk. A további megfontolásoknak akkor van helye, ha a teszteredményeket különbözô pontértékek vagy folyamatos értékek formájában adják meg, azonban a jelen megbeszélésben csak arra a legegyszerûbb esetre összpontosítunk, melynél a módszer eredménye bináris értékként szerepel. A szenzitivitás – definíció szerint – a pozitív teszteredmények azon hányada, amikor a minták valóban pozitívak. A specificitás a negatív teszteredményeknek azt a százalékos arányát jelzi, amikor a minták valóban negatívak. A pontosság (vagy egyezés) a szenzitivitást és a specificitást ötvözi: azon (pozitív és negatív) esetek százalékos arányát adja meg, melyeknél a módszer eredménye megfelel a valós helyzetnek. Nem szabad elfelejteni, hogy a pontosságot (egyezési arányt) – amennyiben az érzékenységi és fajlagossági arányok eltérôk – nagymértékben befolyásolhatja, hogy a tesztminták esetében hogyan oszlanak meg a pozitív és negatív esetek. Általában fontos odafigyelni arra, hogy a tesztminták között a pozitív és negatív esetek megfelelô arányban legyenek jelen, annak érdekében, hogy hitelesen meg lehessen határozni a specificitást és a szenzitivitást.

46


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 47


Miután a módszer minôségét jellemzô paramétereket elfogadták, fel kell állítani azt a határértéket, melyet a vizsgálatot magas színvonalon végzô laboratórium számára elfogadható minôségnek tekintenek. A megbeszélés megkönnyítése érdekében tételezzük fel, hogy a külsô minôség-ellenôrzés számára használt mintaállományból véletlenszerûen kiválasztott esetet úgy tekinthetjük, mint ahol meghatározott annak a valószínûsége, hogy a külsô minôség-ellenôrzési programban részt vevô laboratórium helyesen fogja véleményezni a HER2-státust. A valószínûség mértékét befolyásolják a minta adottságai, illetve az, hogy a laboratórium adott módszere hogyan mûködik a minta adottságai és egyéb véletlenszerû hatások mellett. Ezen túlmenôen feltételezni fogjuk, hogy a pontos leleteket lényegében mintáról mintára függetlennek lehet tekinteni. Bár elôfordulhat, hogy e függetlenségi feltétel nem teljesül pontosan (például akkor, ha egy több tesztmintát tartalmazó mintasorozatnál katasztrofális hibát követnek el), általában e feltételezés megalapozott és szükséges ahhoz, hogy a problémát statisztikailag kezelhetôvé tegyük. A fenti feltételezések alapján a pontos eredmények a sikeres vizsgálatok binomiális arányának tekinthetôk, és a statisztikai értékelés a binomiális arányok statisztikai tulajdonságain alapulhat. Egy adott számú tesztminta esetében a feltételezett egyezôségi arány és a vizsgálati minôséget jellemzô határérték esetén egy binomiális valószínûségi eloszlásból kiszámítható annak értéke, hogy az adott számú tesztmintát tartalmazó mintakészlettel kapcsolatban mekkora valószínûséggel fogja a laboratórium elérni a minôségi vizsgálatot jellemzô határértéket. Ilyen valószínûségiérték-számítással kapcsolatos példákat az A8 táblázat mutat be. A táblázat azokat a szituációkat jelzi, amikor az egyezôségi arányok határértéke 80%, 85%, 90% és 95%. A táblázatban a sorok lehetséges valódi (hosszú távú átlagnak megfelelô) laboratóriumi egyezôségi arányokat adnak meg (80%, 85%, 90%, 95% vagy 98%), míg az oszlopok a mintakészletekben használt különbözô tesztmintaszámoknak felelnek meg (20, 40 vagy 80). Az elsô megfigyelés, hogy ha a határértéket a laboratórium igazi egyezési arányának szintjére állítjuk, csak 50% körül van annak valószínûsége, hogy a laboratórium megfelel az ellenôrzésen. Ennek oka, hogy egy meghatározott számú tesztminta esetében a laboratórium aktuálisan megfigyelt egyezési aránya mindig a valódi, hosszú távú átlagérték körül fog változni. Ezért az esetek mintegy felében a megfigyelt egyezési arány a valódi érték alá, míg az esetek másik részében a fölé esik. (A valószínûség nem pontosan 50%, mivel a helyesen kiadott eredmények száma mindig egész szám.) Minél jobban meghaladja a laboratóriumban az igazi egyezôségi arány a határértéket, annál nagyobb annak a valószínûsége, hogy a laboratórium a mintakészlet esetében is eléri vagy meghaladja az egyezési arány határértékét. Ha például a határértéket 90%-ra állították be, és a laboratórium valódi egyezési aránya 95%, akkor 86% annak a valószínûsége, hogy negyven tesztmintából álló készlet esetében a laboratórium eléri vagy meghaladja a 90%-os egyezési arányt. Ha a laboratórium valódi egyezési aránya 98%, akkor ennek esélye 99%. Ugyanezen minôségellenôrzési feltételek mellett (40 eset, 90%-os határérték), egy olyan laboratórium, amely 85%-os egyezési arány mellett dolgozik, csak 13%-os valószínûséggel fogja elérni vagy meghaladni a 90%-os egyezési határértéket a tesztminták esetében. A laboratóriumok még szigorúbb megkülönböztetése érdekében növelni kell a tesztminták számát. Ha például a mintakészlet nyolcvan tesztmintából áll, és a határértéket 90%-ra jelölik ki, akkor csupán 7% annak az esélye, hogy a 85%-os átlagos egyezôségi arányon mûködô laboratórium ezt eléri vagy meghaladja, egy átlagosan 95%-os egyezôségi arány mellett dolgozó laboratórium esetében ugyanakkor ennek valószínûsége 95%. Az egyezôségi arány fogalmát a Függelék eddigi részében általános értelemben használtuk. Ez vonatkozhat az általános egyezésre (azaz a pozitív és negatív esetek kimutatásakor mutatott teljesítményre), a szenzitivitásra (azaz arra, hogy a pozitív eseteknél milyen szinten teljesít a laboratórium) vagy a specificitásra (azaz a negatív eseteknél elért teljesítményre). Az A8 táblázatnak megfelelô mintaszámokat abban az összefüggésben kell értelmezni, hogy aktuálisan milyen egyezôségi arányt vizsgálnak. Amennyiben a vizsgált egyezôségi arány az általános egyezôség, akkor a mintaszám a mintakészlet összes esetére (a pozitív és negatív esetek együttesére) érvényes. Ha a szenzitivitást vizsgálják, akkor a mintaszám a valódi pozitív esetekre, míg ha a specificitást, akkor valódi negatív esetekre vonatkozik. Összefoglalva, a hatékony és egyértelmû laboratóriumi külsô minôség-ellenôrzési program érdekében gondosan mérlegelni kell a mintakészlet összetételét, a használt esetek számát, illetve a minôség érdekében szükséges határértéket. A minôség-ellenôrzés eredményét a laboratóriumban végzett szokásos QA/QC eljárásokkal együtt kell értékelni. E tényezôk figyelembe vételével ki lehet fejleszteni olyan laboratóriumi külsô minôség-ellenôrzési programot, mely alkalmas a nagy egyezôségi aránnyal és az elfogadhatatlanul kis egyezôségi aránnyal dolgozó laboratóriumok elkülönítésére. Ennek célja a kutatásban és az általános klinikai gyakorlatban végzett HER2-vizsgálat pontosságának jelentôs javítása. G függelék A HER2-vizsgálat értékelési feltételei és leletkiadás

Értékelési feltételek. E témával kapcsolatban a szakértôi testület tagjainak elôször azt kellett elfogadniuk, hogy a vizsgálat körülményeit érintô eltérések minimálisra csökkenthetôek, ha a laboratóriumok számára kötelezôen elôírják, hogy a vizsgálatok technikai validálását még azelôtt végezzék el, hogy azokat felajánlanák a klinikai gyakorlat számára; csak standardizált módszereket használjanak; és vegyenek részt a folyamatos belsô és külsô minôségbiztosítási és laboratóriumi akkreditációs programokban. Ez biztosítaná azt, hogy a HER2-vizsgálatokra használt módszerek idôben és a különbözô laboratóriumok között kon-

www.jco.org

47

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 48

Wolff és mtsai

zisztensek és pontosak legyenek. A szakértôi testület egyetértett abban, hogy az eredmények javítása érdekében mindkét módszer (IHC és FISH) esetében specifikusan meg kell határozni és be kell tartani az értékelési feltételeket. Az Egyesült Államokban még nem hagyták jóvá a HER2 kimutatására szolgáló egyéb módszerek klinikai célra való alkalmazását. A HER2-fehérje expresszióját kimutató IHC módszerek esetében az eredeti, US Food and Drug Administration által jóváhagyott értékelési ajánlások nem biztosítják a megfelelô fajlagosságot. A klinikai vizsgálatok eredményeinek központi elemzésében részt vevô szakértôk némelyike szerint az IHC eredménye akkor pozitív, ha a kifejezett körkörös membránfestôdés a daganat több mint 30%-át érinti (nem pedig az eredetileg meghatározott 10%-át). Ez azt jelenti, hogy ekkor azoknál a daganatoknál, melyeknél az erôs körkörös festôdés a sejtek legfeljebb 30%-ánál van jelen, az eredményt nem egyértelmûnek kell tekinteni, és másodlagos FISH vizsgálat szükséges. A 30% feletti határérték megfelel a szakértôi testület tagjai tapasztalatának, miszerint általában a sejtek nagy hányada lesz pozitív valódi IHC3+ esetén; illetve azon közlemények adatainak, melyeknél a határértéket 10% felett adták meg.52 Egyben tükrözi azt a célt, hogy a tévesen 3+ eredmények elôfordulási aránya minél kisebb legyen. Az ennél kisebb százalékos arányt mutató eredmények nem egyértelmûek, ezeket FISH-sel kell megerôsíteni. A fehérjeexpresszió-pozitivitás további kritériuma, hogy a sejtmembrán egyenletesen, körkörösen, sötéten festôdjön, és a mintázat dróthálószerû képet adjon.47 Ha egyenletes és homogén, sötét körkörös festôdés látható, a minták valószínûleg a pozitív HER2-fehérjeexpresszió mellett FISH során amplifikációt is mutatnak. Nem szabad figyelembe venni azokat az eseteket, amikor csak a szövetek széle vagy a mintafeldolgozás során sérült területek festôdnek erôsen. Az eredményeket csak akkor szabad értékelni, ha minden méréskor pozitív, nem egyértelmû és negatív kontrollokat is vizsgálnak. A képelemzô eljárások javítják az értékelés állandóságát (7. táblázat).86,87 Ha képelemzô eljárást alkalmaznak, a módszert validálni kell, és ismert FISH-amplifikációt mutató minták segítségével meg kell határozni a pozitív, nem egyértelmû és negatív határértékeket. A negatív kategóriába nem tartozhat olyan minta, mely FISH amplifikációt mutat, míg a pozitív kategóriák esetében a minták 100%-ának kell amplifikálódnia. Mivel a készülék analitikai toleranciája csekély, a FISH esetében nagyobb egyezôségi arányokat lehet megkívánni. Szükséges a minták (szám szerint 11–26) évenkénti újraellenôrzése FISH-sel annak érdekében, hogy meg lehessen bizonyosodni a küszöbértékek további érvényességérôl. A HER2-génamplifikáció érdekében végzett FISH módszernél – mind a hematoxilin-eozinnal festett, mind az IHC-vel jelölt szekvenciális metszetek esetében – a legfontosabb kritérium annak dokumentálása, hogy a jelek leszámolásának helye az invazív tumor területére esett. Az in situ carcinoma területén nem végezhetô számolás. Legalább két vizsgálónak 20 sejtet kell leszámolnia. Egy patológusnak ellenôriznie kell, hogy a számolás az invazív carcinoma területén történt, illetve az egész mintát át kell tekintenie abból a szempontból, hogy jelen van-e benne genomiális heterogenitás (8. táblázat). A mintákat minden tesztsor lefuttatásakor pozitív, nem egyértelmû és negatív kontrollok tükrében kell értékelni. Meg kell ismételni a vizsgálatot, ha a jelintenzitás a sejtek több mint 25%-ában gyenge, a sejtmagok nem különíthetôk el, a sejtek több mint 10%-ában a citoplazma felett látható jel, vagy a háttér festôdése miatt a jel halvány. A HER2 jel/sejtmag arányt, illetve a 17-es kromoszóma jel/sejtmag arányt is dokumentálni kell annak érdekében, hogy az egy allélt érintô deléciót, illetve a 17-es kromoszóma monoszómiáját vagy poliszómiáját le lehessen írni (8. táblázat). Ha a HER2-génamplifikáció esetében genomiális heterogenitást mutatnak ki, ezt külön jelezni kell.66 A genomiális heterogenitás kezelésével kapcsolatban jelenleg nincs egyetértésen alapuló ajánlás. Leletkiadás. A standardizált leletformátum segít biztosítani, hogy a leleteken minden szükséges adat egyértelmû és tömör formában szerepeljen. A lelet legegyszerûbb formája az adatlista. Meg kell adni a betegre, a kezelôorvosra, az intézetre, a mintára, a szolgáltatás idôpontjára, a módszerre és eredményekre, valamint az értékelésre vonatkozó adatokat. A szakértôi testület által javasolt specifikus adatok listáját a 9. és 10. táblázat összegzi. A két módszer esetében megadásra kerülô adatok az eredmények specifikációját, a pontozási rendszert és a végsô értékelést leszámítva megegyeznek. H függelék A laboratóriumok mûködésének szabályozása

A rutinszerûen HER2-vizsgálatot végzô laboratóriumok mindegyikének követnie kell az úgynevezett „jó laboratóriumi gyakorlatot”. Ezt a CLIA 88 szabályozás határozza meg, és a laboratóriumokat akkreditáló szervezetek közvetítik a laboratórium felé. A módszerek során használt készüléket kalibrálást követôen, rendszeres szervizszolgálat és belsô minôség-ellenôrzés mellett kell mûködésbe állítani. A vizsgálati eljárásokat a rutinszerû alkalmazás elôtt standardizálni és validálni kell. A szakértôi testület egyetértett abban, hogy a HER2-fehérjeexpresszió IHC-vel, valamint a génamplifikáció FISH módszerrel való kimutatásához a US Food and Drug Administration által jóváhagyott módszereket kell használni. Költségvonzata miatt egyes külföldi laboratóriumok nem tudják megengedni maguknak ilyen módszerek alkalmazását, helyette olyan alternatív eszközökhöz fordulnak, melyeket az alkalmazás elôtt gondosan validáltak. Ilyen alternatív módszer választásakor a laboratórium vezetôjének felelôssége biztosítani azt, hogy a laboratóriumban végzett módszer validált és stabil, a US Food and Drug Administration által jóváhagyott módszerekkel megegyezô eredményeket ad. Ha a US Food and Drug Administration által nem jóváhagyott módszert alkalmaznak, azt a leleten jelezni kell. Hasonlóképpen meg kell jelölni azt is, ha a laboratóriumban validált módon változtattak a módszeren.

48


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 49


CLIA 88

A CLIA törvényt a Kongresszus 1988-ban fogadta el abból a célból, hogy biztosítsa, hogy a teszteredmények a laboratóriumtól függetlenül pontosak és megbízhatóak legyenek. A CLIA 8888 az egészségügyi célból emberen végzett összes vizsgálatot minimális minôségi szintek elôírásával szabályozza. A standard szabályozás a vizsgálat összetettségétôl függ. A rák predikciójára használt összes marker kimutatását az igen összetett kategóriába sorolja, amely a legszigorúbb minôségi elôírások betartása mellett azt követeli meg, hogy az erre jogosult szervezetek kétévente ellenôrizzék az elôírások betartását. A minôségi színvonal megítélése az ellenôrzô szervezetek feladata. A minôség színvonalát meghatározza, milyen a személyzet képzettsége, ki miért felelôs; milyen a minôség-ellenôrzés (az a mechanizmus, mellyel biztosítható, hogy a teszt naponta megbízhatóan mûködik); milyen a minták integritása és az adatkezelés; mibôl áll a külsô minôség-ellenôrzés (az egyezôségi arány külsô ellenôrzése); és folyamatos-e a minôségbiztosítás. A minôségbiztosítás olyan rendszert jelent, amelyben átfogó terv szolgál a minôség terén elért eredmények ellenôrzésére és biztosítására. Feltétel, hogy a laboratórium validáljon minden tesztet, mielôtt klinikai alkalmazásra kínálná azt. Az ellenôrzés során megfigyelik, hogyan végzik a laboratóriumi vizsgálatokat, kikérdezik a személyzetet, áttekintik a dokumentációt (ezen belül a leleteket) és az eredményeket, értékelik a külsô minôség-ellenôrzési program eredményeit. Amennyiben a laboratórium mûködésének színvonalát nem találják kielégítônek, az akkreditáló szervezet áttekinti, milyen korrekciót terveznek. Ha szükséges, eltiltja a laboratóriumot a további vizsgálatok végzésétôl. A CAP felfogása szerinti laboratóriumi akkreditáció

A CAP és a Joint Commission on Accreditation of Healthcare Organizations két olyan szervezet, amelyet a US Department of Health and Human Services feljogosított arra, hogy ellenôrizze a laboratóriumokat, és a CLIA 88 szellemében akkreditálja azokat. A HER2-vizsgálat nagymértékben összetett, ezért a laboratóriumi ellenôrzés során a legnagyobb szigorúsággal ellenôrzik azt. Az akkreditáló szervezet az analittal kapcsolatban kötelezôen elôírhatja, hogy rendszeresen külsô minôség-ellenôrzést végezzenek. Ezen túlmenôen a laboratóriumi akkreditációs inspekciós feltételeket tovább lehet szigorítani a CLIA 88 szabályozás keretein belül. A US Food and Drug Administration szabályozási elôírásai

A US Food and Drug Administration hivatal a HER2-vizsgálat során alkalmazott orvosi eszközök szabályozásakor a 1976-os Medical Device Amendments rendelet óta érvényes szabályokat tartja szem elôtt. Az általános kontroll része a HER2 diagnosztikai reagensek regisztrációja és felsorolása, a megfelelô gyártási folyamat elôírása, továbbá a forgalomba hozatalt követô észlelt nemkívánatos hatások jelentése. Az 1976-os törvény a forgalomba hozatalt megelôzô ellenôrzésre vonatkozóan is tartalmaz elôírásokat. Mivel a HER2 eredménye befolyásolja a gyógyszeres kezelés megválasztását, ezért közvetlen hatást gyakorolhat a morbiditásra és a mortalitásra, a vizsgálatot nagy kockázatú vagy 3. osztályba sorolt szolgáltatásnak tartják, ezért a módszer jóváhagyása a US Food and Drug Administration hivatal forgalomba hozatalt megelôzô engedélyezéssel foglalkozó részlegének hatáskörébe tartozik. A HER2-vizsgálat forgalomba hozatalt megelôzô adminisztrációs ellenôrzése során szükség van annak kimutatására, hogy a vizsgálat biztonságos és hatásos. Az ellenôrzés azon az információn alapul, mely jellemzi, hogy a vizsgálat milyen színvonalon végezhetô analitikai és klinikai szinten. A HER2-vizsgálat forgalomba hozatalát megelôzô FDA-ellenôrzés része a teszt során használt jelölések elemzése, illetve a teszt elôállításakor alkalmazni kívánt rendszer minôségének forgalomba hozatalt megelôzô vizsgálata. A US Food and Drug Administration nem szabályozza a helyileg kifejlesztett HER2-vizsgálatokat, melyeket egy adott vagy csak néhány laboratórium esetében alkalmaznak. E tesztek validálása a laboratórium CLIA elôírásai szerint történik. Amennyiben ezek során kereskedelmi forgalomban kapható reagenseket használnak (melyeket ASR-ként jelölnek), a vizsgálat e fontos összetevôit a fent említett általános kontrollokkal kell ellenôrizni. Ezentúl, amikor a HER2-vizsgálat eredményérôl kiadják a leletet, egyértelmûen jelezni kell, hogy a vizsgálatot a US Food and Drug Administration nem hagyta jóvá, és hogy a leletet kiadó laboratórium felelôsséget vállal a teszt minôségéért. I függelék A külsô minôségbiztosításra tett nemzetközi kezdeményezések

Minôségbiztosítás az Egyesült Királyságban. Az Egyesült Királyságban nyilvánosságra hozták a HER2-vizsgálatot végzô klinikai laboratóriumokra vonatkozó fôbb kritériumokat bemutató ajánlásokat. Jelenleg egy olyan kétfázisú vizsgálati algoritmust javasolnak, mely az IHC módszert jelöli meg elsôdleges szûrésként, a FISH-t pedig a nem egyértelmû esetek számára tartja fenn.48 Ennek alapja, hogy 37 laboratórium esetében nagyon nagy fokú volt az egyezés az emlôrákmintákon végzett IHC és FISH eredmények között, amikor nagy gyakorlattal rendelkezô referenciaközpontokban ellenôrizték az eredményeket.64 A hangsúly továbbra is azon van, hogy standardizálják a módszertant, az értékelést és a jó minôségû munka érdekében szükséges stratégiákat.48 Bizonyított tény ugyanis, hogy abban az idôszakban, amikor a laboratóriumok külsô HER2 minôség-ellenôr-

www.jco.org

49

humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 50

Wolff és mtsai

A9 táblázat. CAP laboratóriumi minôség-ellenôrzési programok a HER2 klinikai vizsgálatát végzô laboratóriumok számára Minôségellenôrzési program

Módszer

Résztvevôk száma 2005-ben

MK

IHC

826

HER2 CYH ISH IMG

IHC FISH BRISH IHC és képelemzési eljárás

155 191 95 52

Jelenlegi felépítés

Tervezett változások

Évente nyolc, teljes metszetbôl álló képzési program (négy eset évente kétszer); egy emlôrákos eset évente 80 eset (40 eset 10-hengeres, ún. core TMA évente kétszer) Két eset teljes metszet formájában évente egyszer Egy eset teljes metszet formájában évente egyszer Egy eset teljes metszet formájában évente egyszer

Nincs Nincs 20 eset (10 eset 5-hengeres TMA formájában évente kétszer) 80 eset (40 eset 10-hengeres, ún. core TMA formájában évente kétszer) 80 eset (40 eset 10-hengeres, ún. core TMA formájában évente kétszer)

Rövidítések: HER2, humán epidermális növekedésifaktor-receptor-2; IHC, immunhisztokémia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; BRISH, világos látóterû in situ hibridizáció; TMA, szöveti microarray.

zési programban vesznek részt, javul az eredmények reprodukálhatósága.68,82 Hamarosan teljes terjedelemben ismertetik annak a nemzeti konzultációnak az eredményeit, melyben 200 onkológus és patológus vett részt az Egyesült Királyságban.89 E megbeszélés számos területen hozott megállapodást. Ezek közé tartozik, hogy az összes invazív emlôrákot szûrni kell HER2-re; a szakértelem biztosítása érdekében az immunhisztokémiai HER2-vizsgálatot csak azokban a laboratóriumokban szabad elvégezni, ahol évente legalább 250 esetet dolgoznak fel; a FISH központok évente legkevesebb 100, de lehetôleg 150 mintát dolgozzanak fel; illetve bizonyos kivételes körülményeket leszámítva minden HER2-vizsgálati szolgáltatást a Clinical Pathology Accreditation szervezetnek (CPA UK Ltd, Sheffield, Anglia) kell akkreditálnia. Minôség-ellenôrzési kezdeményezések a kontinentális Európában és Ausztráliában. A szakértôi testület tagjai nem szisztematikus módon áttekintették a kontinentális Európában és Ausztráliában tett ez irányú erôfeszítéseket. Kiderült, hogy a legtöbb országban a vizsgálati algoritmus alapja az IHC és az in situ hibridizáció.50 Általánosan elfogadott irányelvként a 3+ IHC értéket HER2-pozitívnak, míg a 0 vagy 1+ IHC értéket HER2-negatívnak kell tartani. Ha az IHC értéke 2+, akkor azt úgy kell tekinteni, hogy a HER2-státus nem egyértelmû; ilyen esetekben a vizsgálatot meg kell ismételni FISH vagy CISH módszerrel. Néhány országban (például Belgiumban és Finnországban) az összes IHC 2+ és 3+ esetet újra megvizsgálják FISH vagy CISH módszerrel, és csak azokat az eseteket tekintik HER-pozitívnak, melyeknél az IHC 2+ vagy 3+, és génamplifikáció igazolható. A legtöbb országban konszenzus-dokumentum rögzíti a HER2-vizsgálat irányelveit, mely tartalmazza a vizsgálat elôtt a szövetek kezelésére, az alkalmazandó IHC módszerekre és az ISH protokollokra vonatkozó irányelveket. Általában azzal kapcsolatban is született ajánlás, hogy az egyes laboratóriumokban legkevesebb hány esetet kell megvizsgálni, azonban a legtöbb országban nem határozzák meg, hogy a laboratóriumon belül egy-egy patológusnak évente hány mintát kell elemeznie. A legtöbb országban mûködik külsô minôség-ellenôrzési program. Ez az IHC vagy ISH esetében olyan külsô minôség-ellenôrzési feladatokból (körkontrollokból) áll, amikor a festetlen metszeteket az összes részt vevô laboratóriumnak kiküldik. A részt vevô laboratórium elvégzi az IHC festést vagy az ISH-t, és visszajelzi a festés eredményét. Tizenkét francia laboratórium egy helyi, két külön HER2 antitestet használó IHC módszerrel kapcsolatban egy multicentrikus kalibrációs teszt eredményeirôl számolt be. Arany standardként FISH-t használva az IHC pontossági aránya 95%-nak adódott (119-bôl 116 minta vizsgálata alapján). A vizsgálat során az IHC eredményeket folyamatos változónak tekintették, a fokozott HER2-expresszió esetében pedig azt választották határértéknek, amikor az invazív sejtek 60%-a festôdött.52 Minôség-ellenôrzési erôfeszítések Kanadában. Kanadai patológusok is kialakítottak konszenzust a vizsgálati algoritmusra vonatkozóan. Az algoritmus elsôként IHC vizsgálatot ajánl, egy vagy két ellenanyag alkalmazásával. A nem egyértelmû eseteknél FISH végzése javasolt. A 2002-ben közölt vizsgálati algoritmus49 ajánlásokat tartalmaz a megfelelô fixálásra, a vizsgálat értelmezési kritériumokra vonatkozóan, illetve azokkal a markerekkel kapcsolatosan is, melyek alapján az ellenôrzô ISH vizsgálatot el kell végezni. Annak érdekében, hogy javítsák az IHC vizsgálat pontosságát, a csoport ellenôrzô FISH vizsgálatot ajánl az IHC2+ kategóriába tartozó minták esetében és minden olyan esetben, amikor a klinikai körülmények alapján a HER2-pozitivitás valószínûnek tûnik. Az Egészségügyi Minisztérium, az ontariói laboratóriumok szövetsége és a Quality Management Program for Laboratory Services 2001-ben egy QA programot támogatott, és 14 laboratóriumban – köztük két referencialaboratóriumban (Mount Sinai Hospital és Sunnybrook Hospital, Toronto, Ontario) bevezette a HER2-vizsgálatot. Minden vizsgálati helyet felkértek, hogy hathavonta a negatív és pozitív esetek 5%-át, vagy öt pozitív és öt negatív esetet küldjenek a számukra kijelölt referencialaboratóriumba, ahol a mintákat a szokványos protokoll szerint IHC-vel újra megvizsgálták. Az eltérô eseteknél ISH (FISH vagy CISH) végzésére került sor.37 A két referencialaboratóriumból eddig összegyûjtött adatok azt mutatták, hogy a tévesen pozitív esetek aránya 5–7% volt, míg a tévesen negatív leleteké a QA program során vizsgált 300 esetbôl nem érte el az 1%-ot. O’Malley és munkatársai69 Ontarióban és Brit-Kolumbiában az áttétes emlôrákos mintákban végzett HER2-vizsgálattal kapcsolatban végeztek felmérést. Kimutatták, hogy a negatív esetek 97,6%-ában, a pozitív esetek 87,4%-ában egyezik az eredmény a központi labo-

50


humán 20-51

3/13/07

9:59 AM

Page 51


ratóriumban végzett vizsgálat eredményével. Ezt a QA programot gyakori oktatással, munkaértekezletekkel és továbbképzési anyagokkal egészítették ki, melyet a referencialaboratóriumban dolgozó patológus biztosított. A CAP minôség-ellenôrzési erôfeszítései. A CAP több laboratóriumi minôség-ellenôrzési programot fejlesztett ki és ültetett a gyakorlatba azzal a céllal, hogy a HER2-t klinikai célra vizsgáló laboratóriumok vegyenek részt azokban.46,47 Ezek közé tartozik az általános immunhisztokémiai program (MK Survey), a szöveti microarray alapú HER2 program (HER2 Survey), az interfázis in situ hibridizációs program (CYH Survey), a világos látóterû in situ hibridizációs program (ISH Survey), vaalamint az IHC és képelemzés program (IMG Survey). Az A9 táblázat mindegyik program esetében összegzi a vizsgált minta jellegét, a résztvevôk számát és a mintaszámot. Az A10 táblázat a legnagyobb számú résztvevôvel zajló programok esetében adja meg az egyezôségi adatokat. Ezek során ugyanazon esetekbôl származó szekvenciális metszeteket osztottak szét a laboratóriumok között. Az A11 táblázat összegzi, hogy a CYH felmérés HER2-amplifikációt mutató eseteinél milyen eltérések mutatkoztak a HER2-szignál mennyiségi meghatározásában a résztvevôk között. A programok eredményei alapján a laboratóriumok mûködésében vannak különbségek, különösen a nem egyértelmû pozitív immunhisztokémiai eredmények vagy a határértéket adó FISH vizsgálati eredmények esetében. Az immunhisztokémiai vizsgálatokkal kapcsolatban nagyobb eltérések észlelhetôk, mint a FISH vizsgálat vonatkozásában. Az eredményeket kellô óvatossággal kell értékelni; mindazonáltal kevesebb laboratóriumban végeznek FISH, mint IHC vizsgálatot, illetve a FISH vizsgálatokra nagyobb mintaszámot feldolgozó laboratóriumokban kerül sor. Ennek az önkéntes részvétellel zajló továbbképzési programnak a szellemében azonban csak igen kevés laboratórium végzi a vizsgálatot. Bár a HER2-vizsgálatot végzô laboratóriumok pontos száma nem ismert, úgy gondolják, hogy az Egyesült Államokban a HER2-státust körülbelül 2000 laboratórium vizsgálja IHC, 500 laboratórium pedig FISH módszerrel.

A10 táblázat. Az MK (IHC) és CYH (FISH) CAP felmérések esetében közösen használt minták Esetek

Egyezôség (%)

MK

IHC

CYH

FISH

MK

CYH

2000-04 2002-02 2004-08 2003-05 2003-05 2001-01 2002-05

3+ 3+ 0* 1+ 1+ 0 2+

2000-2 2002-2 2004-1 2003-2 2002-1 2000-1 2003-1

AMP AMP AMP LLAMP LLAMP NONAMP NONAMP

96 98 87* 73 73 72 86

100 100 96 56 88 100 97

Rövidítések: CAP, College of American Pathologists; IHC, immunhisztokémia; FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; AMP, HER2-génamplifikáció jelen van; NONAMP, HER2-génamplifikáció nincs jelen; LLAMP, alacsony szintû HER2génamplifikáció. *Eltérô génamplifikációt/fehérjeexpressziót mutató invazív ductalis carcinoma; az MK résztvevôk 87%-a 0 vagy 1+, a negatív IHC eredményt a College of American Pathologists Cell Markers Committee Experts laboratóriumában megerôsítették.

www.jco.org

A11 táblázat. CYH felmérés (FISH) CYH

Genotípus*

2000-1 2000-2 2001-1 2001-2 2002-1 2002-2 2003-1 2003-2 2004-1 2004-2 2005-1 2005-2

NONAMP AMP NONAMP AMP LLAMP AMP NONAMP LLAMP AMP NONAMP NONAMP AMP

Résztvevôk száma 35 35 48 59 89 90 127 124 139 136 151 152

Egyezôség (%)

Arány (átlagérték ± SD)

100 100 100 100 56 100 97 88 96 97 99 99

0,42 ± 0,19 4,53 ± 3,38 1,05 ± 0,14 9,51 ± 4,20 2,0 ± 0,66 10,42 ± 6,07 1,11 ± 0,17 2,56 ± 0,72 3,63 ± 1,34 1,15 ± 0,20 1,12 ± 0,36 8,53 ± 3,54

Rövidítések: FISH, fluoreszcens in situ hibridizáció; SD (standard deviáció), szórás; AMP, HER2-génamplifikáció jelen van; NONAMP, HER2-génamplifikáció nincs jelen; LLAMP, alacsony szintû HER2-génamplifikáció. *Teljes metszetek.

51

JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY ASCO KONGRESSZUS ÖSSZEFOGLALÓ KÖZLEMÉNY SPECIÁLIS KÖZLEMÉNYE

Recommend Documents