IV. HEMOSTÁZA – přednášky 19. HEMOSTATICKÉ A GENETICKÉ MARKERY U ZÁNĚTLIVÝCH STŘEVNÍCH ONEMOCNĚNÍ Krčová V., Krč. I*, Slavík L., Divoká.M., Ježáková J., Hluší. A., Novák P. Hemato-onkologická klinika, *II. interní klinika FN Olomouc Patogeza zánětlivých střevních onemocnění (IBD) zůstává stále neobjasněna. Kromě možných infekčních, genetických (MOD - 2 gen), imunologických a psychosomatických faktorů je v poslední době živě diskutována i možnost krevní hyperkaogulability v rámci trombofilního stavu. Jsou považovány za získaný rizikový faktor zvyšující výskyt tromboembolické nemoci (TEN). U starších pacientů (nad 60 let) byl popsán vyšší výskyt těchto komplikací ve srovnání s mladšími jedinci (do 40 roků). Zánětlivá střevní onemocnění dle některých prací mají třikrát vyšší riziko vývoje žilní trombózy nebo plicní embolie. Absolutní riziko TEN v populaci není přesně známo. Lze uvažovat, zda mimo sekundární riziko hyperkoagulace u těchto pacientů mají u mladších jedinců vliv i dědičné faktory (vrozené trombofilie). Vedle činitelů vrozených jako je Leidenská mutace nebo polymorfismus MTHFR, které již byly literárně publikovány, by zde mohly hrát roli i jiné genetické faktory. Získané formy jako je přítomnost antifosfolipidových protilátek nebo vyšší hladina homocysteinu, podmíněna zejména nedostatkem folátu nebo vitaminu B12 resp. B6, se vyskytují zejména u pacientů léčených pro tato onemocnění. Dosavadní výsledky prací jsou však nejednoznačné, mnohdy i kontroverzní. Předmětem vlastní studie byl soubor 30 pacientů s IBD (19x idiopatická proktokolitis a 11x Crohnova choroba), přijatých na II. Interní kliniku vesměs v aktivním stádiu onemocnění. Z hematologických ukazatelů byly sledovány následující parametry: Quickův test, aPTT, fibrinogen, trombocyty. Z dalších vyšetření byly sledovány tyto hemokoagulační parametry: AT III, PC, PS, F II, F VIII, F XII, F XIII, v WF, PLG, PAI1, tPA, APC-R a lupus antikoagulans. Následně byly vyšetřovány genetické markery: mutace F V Leiden, protrombinová mutace, mutace alely MTHFR a polymorfismus PAI-1. Výsledky většiny vyšetřovaných ukazatelů potvrdily zvýšenou aktivaci koagulační kaskády s možností zvýšené trombogeneze u nemocných v aktivních stádiích zánětlivých střevních onemocnění. Jednotlivé abnormality budou podrobně prezentovány v našem sdělení. Nakolik se však uvedené změny přímo uplatňují v etiopatogeneze Crohnovy choroby a idiopatické proktokolitidy a jejich tromboembolických komplikací, včetně vlivu genetických markerů, bude muset být v budoucnu doloženo dalšími studiemi. 20. VYŠETŘOVÁNÍ TROMBOFILNÍCH MARKERŮ V REGIONU STŘEDNÍ MORAVY – NAŠE ZKUŠENOSTI Hluší A., Novák P., Slavík L., Krčová V. Hemato-onkologická klinika FN Olomouc Žilní trombembolismus je multifaktoriální onemocnění podmíněné interakcí genetických a získaných faktorů. Trombofilie představuje vrozenou nebo získanou poruchu hemostatických mechanismů spojenou s vyšší tendencí k trombóze.
Existence trombofilních stavů je dnes již známa široké odborné veřejnosti a jejich laboratorní vyšetření patří mezi rutinní metody. Naše koagulační laboratoř ke screeningu trombofilních stavů užívá panel vyšetření (AT III, PC, FPS, APC-R, FII a Plasminogen), na jehož základě je často indikováno molekulárně-genetické vyšetření (Faktor V R/Q 506, Faktor II 20210 G/A, MTHFR 677 C/T). U souboru pacientů s projevy či rizikem TEN jsme za rok 2002 hodnotili výsledky screeningových a mol-genet. vyšetření. Screeningovým testem bylo hodnoceno 993 pacientů. Deficit AT III byl prokázán u 4,7% (významný u 1%), deficit PC u 9,6% (0,7%), deficit FPS u 17,8 (0,7%), plasminogenu u 5,9% (0,4%), zvýšení FII u 25,5 % (9,1%) a pozitivita APC-R u 31%. Z tohoto souboru pacientů bylo mol.-geneticky vyšetřeno 321 pacientů (32%). Pozitivita jednoho ze tří výše uvedených PCR vyšetření byla prokázána u 183 vzorků (57%). Pacienti s mutací FVL–heterozyg. tvořili 18,7%, FVL-homozyg. 0,6 %, mutace FII-hetero 1,2%, mutace FII-homo 0,3%, MTHFR-hetero 47%, MTHFR-homo 0,3%. Kombinovaný defekt byl potvrzen u 10% vyšetřených. Analýzou vztahu screeningového a mol.-biol. vyšetření byla potvrzena korelace mezi FVL-hetero a APC-R<1,8, FVL-homo a APC-R<1,3. Vztah mezi hladinou FII a Faktor II 20210 G/A prokázán nebyl. Výsledky screeningového vyšetření jsou v řadě případů zkresleny chybným načasováním odběru (akutní stádium TEN, antikoagulační terapie), proto by měla být věnována větší pozornost správné edukaci indikujících lékařů. 21. VÝSKYT VENÓZNÍHO TROMBOEMBOLIZMU U JEDINCŮ S F V LEIDEN V SOUVISLOSTI S IMOBILIZACÍ DOLNÍ KONČETINY Dulíček P.1, Malý J.1, Pecka M.1, BeránekM.2 1 Oddělení klinické hematologie, 2Oddělení klinické biochemie, FN, Hradec Králové Cíl práce: Zhodnocení rizikovosti imobilizace dolní končetiny u jedinců s F V Leiden v heterozygotní formě. Metoda: K tomuto účelu jsme zhodnotili výskyt VTE ve 2. souborech jedinců. 1.soubor tvoří 304 jedinců s F V Leiden po prodělané VTE..Zde byla hodnocena frekvence výskytu VTE v souvislosti s přiložením sádry či dlahy. 2.soubor tvoří 366 asymptomatických jedinců s F V Leiden. V tomto souboru byl hodnocen počet expozic ( k přiložení sádry či dlahy ) a jejich průběh . Výsledky: V 1.souboru se vyskytnula VTE u 20 jedinců (13 mužů,7 žen ). V l7 případech se jednalo o distální trombózu, v 3 případech o proximální DVT (1x + PE ). V tomto souboru symptomatických jedinců s F V Leiden ještě dalších 5 mužů a 5 žen bylo vystaveno této expozici, ale k VTE nedošlo. VTE byla vždy objektivně potvrzena zobrazovací metodou. V 2. souboru jedinců bylo této expozici vystaveno 32 mužů ( 34 expozic ) a 18 žen(19 expozic), tedy dohromady 50 jedincům s F V Leiden byla 53 x přiložena sádra či dlaha. Výsledky jsou shrnuty v tabulce Počet jedinců a expozic Počet VTE ( v% na Asymptomatičtí jedinci expozici ) 80 jedinců – 83 expozic 20 ( 24,1 ) 60 jedinců – 63 expozic Muži: 50 - 52 expozic 13 ( 25,0 ) 37 mužů – 39 expozic Ženy: 30 – 31 expozic 7 ( 22,6 ) 23 žen – 24 expozic
Závěr: Přiložení sádry či dlahy je v našem souboru jedinců s F V Leiden signifikantním rizikovým faktorem pro VTE, zejména distální trombózu.Farmakologická prevence LMWH je tudíž u těchto jedinců v této situaci plně indikovaná po celou dobu imobilizace. 22. VÝSKYT ANTIFOSFOLIPIDOVÝCH PROTILÁTEK U NEMOCNÝCH SE SYSTÉMOVÝM LUPUS ERYTHEMATODES Fojtík Z.1, Beránek M.2, Kořístek Z.1, Klabusay M.1, Buliková A.3 1 Interní hematoonkologická klinika, 3Oddělení klinické hematologie, Fakultní nemocnice Brno Bohunice, 2Centrum biostatistiky a analýz lékařské a přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity Antifosfolipidové protilátky mohou ovlivňovat pochody na odlišných úrovních koagulační kaskády. Přítomnost APLA protilátek může vést k různým klinickým projevům, kterým dominují trombotické příhody, opakované ztráty plodu a trombocytopenie. Cíl studie: zjistit výskyt a klinický význam lupus antikoagulant (LA) a antifosfolipidových protilátek (APA) u nemocných se systémovým lupus erythematodes (SLE). Materiál a metodika: Analyzovaný soubor tvoří 46 nemocných se SLE. Byly sledovány nespecifické parametry zánětlivé aktivity, autoprotilátky typické pro SLE a lupus antikoagulant a antifosfolipidové protilátky. Byly anamnesticky hodnoceny trombofilní příhody. Výsledky: V souboru bylo 13 LA+ a 33 LA-, resp. 18 APA+ a 28 APA- nemocných. Ve skupině LA+ byla zaznamenána u 62 % nemocných přítomnost žilních trombóz, ve skupině LA- 18 % (p<0,05). Arteriální trombózy se vyskytly ve skupině LA+ u 31 % nemocných, ve skupině LA- u 6 % (p<0,05). V rámci hodnocení samovolných potratů nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly ve skupinách LA+ a LA-. Obdobná statistická významnost byla nalezena i pro skupiny APA+ a APA-. Statisticky významným parametrem v rámci jednotlivých skupin byl nález 5 trombocytopenie pod 100x10/ /l (p<0,05). Statistická významnost byla zaznamenána v případě hodnocení ANF při titru vyšším než 1:320 a v případě pozitivity ENA (p<0,01). Závěry: ze studie vyplývá, že existuje statisticky významná korelace mezi pozitivitou LA a APA a anamnesticky zjišťovanými trombotickými příhodami. Tato korelace byla pozorována ve vztahu k žilním a arteriálním trombózám a trombocytopenii. 23. PROFYLAXE ŽILNÍ TROMBOEMBOLIE: DRUHÁ VERZE POČÍTAČOVÉHO PROGRAMU Gumulec J., Radina M., Penka M.*, Majerek P. Hematologie P&R LAB s.r.o. Nový Jičín, *Oddělení klinické hematologie FN Brno Bohunice Žilní tromboembolická nemoc (TEN) je díky své incidenci, morbiditě a mortalitě významným socioekonomickým problémem. Její výskyt však lze snížit využitím účinných profylaktických režimů. K dispozici dnes máme, kromě pravidla časné mobilizace pacientů po operacích, kompresivní punčochy, intermitentní pneumatickou kompresi a různá antitrombotika, z nichž se nejvíce využívají hepariny
a warfarin. Indikace různých profylaktických režimů nebo jejich kombinací se řídí rizikem žilní trombózy, které vyplývá z charakteru operačního zákroku nebo preexistujícího interního onemocnění, věku pacienta a z přídatných rizikových faktorů. Různý trombogenní potenciál operačních výkonů a nesčetné množství různě významných přídatných rizikových faktorů tromboembolické nemoci představuje nepřehlednou spleť informací, jejichž nesprávná interpretace může mít pro pacienta fatální následky. Jednoduchý počítačový program, nazvaný „Profylaxe hluboké žilní trombózy a plicní embolizace“, si klade za cíl usnadnit orientaci ve zmiňované džungli informací. Kromě usnadnění stratifikace rizika TEN nabízí doporučení péče o tyto pacienty v různých oblastech medicíny. Doporučení je pochopitelně možné v praxi využívat jen po dokonalé medicínské interpretaci všech dostupných klinických a laboratorních údajů a použitá profylaktická opatření je nutné důsledně individualizovat. Žádný, ani sebelepší software nedokáže nahradit zodpovědného lékaře. Součástí programu je i adresář kooperujících lékařů (elektronická pošta) sloužící jako diskusní forum a pochopitelně pro potřeby konsultací sporných nebo komplikovaných případů. V této souvislosti se autoři obracejí na další případné zájemce o spolupráci s cílem vytvořit síť odborníků, kteří se mohou přihlásit na adrese
[email protected]. 24. DIFERENCIÁLNÍ DIAGNOSTIKA SPECIFICKÝCH A NESPECIFICKÝCH INHIBITORŮ KOAGULACE Novotný J. Transfúzní oddělení a krevní banka FN Brno, Bohunice Patologické inhibitory krevního srážení jsou nejčastěji imunoglobuliny, jejichž specifita je zaměřena buď proti jednotlivým koagulačním faktorům, nebo proti komplexům fosfolipidů (PL) s nejrůznějšími bílkovinami. V prvém případě hovoříme o specifických inhibitorech, tyto jsou nejčastěji zaměřeny proti koagulačnímu faktoru VIII nebo IX a jsou detekovány zejména u těžkých hemofiliků,méně často u pacientů s lymfomy, systémovými onemocněními pojiva, solidními tumory apod. Prodloužený koagulační čas in vitro zde obráží i kliniku ve smyslu krvácivých komplikací, spojených s přítomností specifických inhibitorů. Ve druhém případě jsou protilátky zaměřeny proti komplexům fosfolipidů s kofaktory – nejčastěji jde o beta2glykoprotein I, protrombin, protein C, protein S, systém vnitřní i zevní tenázy. Přes mnohdy výrazné prodloužení koagulačních časů in vitro zde jen zřídka vidíme krvácivé projevy, pacienti s nespecifickými inhibitory jsou naopak ohroženi hyperkoagulací. Diferenciální diagnostika lupus antikoagulans versus specifický inhibitor není mnohdy jednoduchou záležitostí v důsledku výrazné variability reakcí in vitro, navíc mohou být vzácně detekovány u jednoho pacienta oba typy inhibitoru. Specifické inhibitory vykazují většinou výrazný progresivní charakter in vitro a vesměs zde není patrný zřetelný diluční efekt ( paradoxní vzestup aktivity koagulačních faktorů při ředění plasmy pacienta), pacienti trpí většinou výraznými krvácivými projevy. Silné LA nespecificky výrazně sníží aktivity faktorů vnitřní cesty při koagulačním vyšetření, při měření aktivit faktorů chromogenními substráty však LA vykazuje jen zanedbatelnou interferenci, navíc jsou zde pozitivní konfirmační testy ( hexagonální PL, destičkový neutralizační test).
P – II. HEMOSTÁZA – postery P4. VYŠETŘENÍ ANTITROMBOCYTÁRNÍCH PROTILÁTEK U PACIENTŮ S TROMBOCYTOPENIÍ METODOU MAIPA Ambrůzová Z., Uhýrková B., Dosoudilová M., Petřek M. HLA laboratoř Ústavu imunologie FN Olomouc Úvod: Vyšetření protilátek proti trombocytárním glykoproteinům (GP) je součást základní palety laboratorních testů k diferenciální diagnostice trombocytopenie. MAIPA (Monoclonal Antibody-specific Immobilisation of Platelet Antigens) slouží ke stanovení vázaných i volných IgG protilátek proti jednotlivým destičkovým glykoproteinům. S vysokou specificitou této metody kontrastuje její nižší senzitivita; jednotliví autoři uvádějí průkaz trombocytárních protilátek metodou MAIPA u 28-85% pacientů. Cíl: zavést metodu MAIPA a ověřit možnost jejího využití k vyšetření antitrombocytárních protilátek v krevních vzorcích dospělých pacientů s diagnózou trombocytopenie (bez určení typu nebo rozlišení akutní a chronické formy). Metoda: V séru a trombocytární suspenzi 128 dospělých pacientů byly metodou MAIPA vyšetřeny cirkulující a vázané protilátky třídy IgG proti destičkovým glykoproteinům Ib/IX, IIb/IIIa, Ia/IIa a V. Byla stanovena frekvence protilátek a zpracován přehled jejich typů. Výsledky: Antitrombocytární protilátky byly prokázány celkem u 41(32%) pacientů. Z toho u 12(29%) pacientů byly zjištěny pouze protilátky vázané na trombocytech, u 23 (56%) pacientů jen protilátky cirkulující v séru a u 6 (15%) pacientů byly detekovány oba typy protilátek. Z celkového počtu 128 vyšetřených u 32 (25%) pacientů nebylo možno pro těžkou trombocytopenii izolovat dostatečný počet trombocytů k analýze vázaných protilátek, popř. laboratoř obdržela k vyšetření pouze sérum. Závěr: Vyšetření antitrombocytárních protilátek v našem souboru pacientů s trombocytopenií potvrdilo nižší senzitivitu metody MAIPA. Jedním z limitujících faktorů metody byl aktuální počet trombocytů, který u 25% pacientů neumožnil vyšetření vázaných protilátek. Bez ohledu na tato omezení, nově zavedená metoda patří k základním vyšetřením diagnostiky trombocytopenie, neboť její výsledek může potvrdit popř. vyvrátit imunní podklad onemocnění. P5. STANOVENÍ FUNKCE DESTIČEK OVLIVNĚNÉ LÉČBOU TYPU ASA VE SROVNÁNÍ S HPA-1 POLYMORFISMEM Malíková I., Tichavská D., Šauerová R., Vondráčková B., Vaňková L., Mrázková J. Centrální hematologická laboratoř I. interní kliniky VFN, Praha 2, ČR Úvod: HPA-1 (Human Platelet Antigen-1) je nový název systému alloantigenů specifických pro trombocyty (dříve označovaných ZW nebo PlA). Molekulárním základem HPA-1 (PlA) polymorfismu je záměna aminokyseliny na pozici 33 (leucin – prolin) destičkového glykoproteinu IIIa. Můžeme rozlišit tři typy Gp IIIa fenotypů: HPA-1a/ HPA-1a (Pl A1/ Pl A1), HPA-1a/ HPA-1b (Pl A1/ Pl A2) a HPA-1b/ HPA-1b (Pl A2 / Pl A2). Klinické studie prokazují zvýšenou prevalenci destičkového fenotypu HPA1b u jedinců s onemocněním koronárních tepen v mladším věku.
Cíl studie: Ověřit, zda HPA-1 polymorfismus ovlivňuje funkce destiček při protidestičkové léčbě kyselinou acetylsalicylovou (ASA) a dále sledovat případné rozdíly v účincích preparátů obsahujících ASA (Anopyrin a Aspirin Bayer). Vliv léčby jsme sledovali pomocí analyzátoru PFA 100® (Platelet Function Analyzer), fa Dade Behring, SRN. Používali jsme testovací cartridge Dade® PFA Collagen/Epinephrin a Dade® PFA Collagen/ADP, fa Dade Behring, SRN. HPA-1 polymorfismus jsme zjišťovali metodou imunofenotypizace periferní krve s použítím kitu Platelet HPA-1 od firmy Biocytex. Vzorky byly analyzovány průtokovým cytometrem FACSCalibur, fa Becton Dickinson, a hodnoceny pomocí software CellQuest TM. Do studie bylo zařazeno 20 pacientů, kteří užívali v rámci sekundární prevence nejprve Anopyrin (100 mg/den) a poté Aspirin Bayer (100 mg/den). Výsledky studie: U 12-ti pacientů byl zjištěn fenotyp HPA-1a/ HPA-1a, u 5-ti fenotyp HPA-1a/ HPA-1b a u 3 HPA-1b/ HPA-1b. Ze všech stanovení (Anopyrin + Aspirin Bayer) se u 25% homozygotů HPA-1a/HPA-1a neprojevil vliv léčby na funkci destiček, u heterozygotů HPA-1a/HPA-1b se projevil 100% vliv a u homozygotů HPA1b/ HPA-1b se neprojevil u 67%. Pokud porovnáme vliv samotného Anopyrinu, u 42% HPA-1a/ HPA-1a se jeho vliv neprojevil, u HPA-1a/ HPA-1b se projevil 100% a u HPA-1b/ HPA-1b se neprojevil u 67%. Vliv léčby Aspirinem Bayer se neprojevil u 8% HPA-1a/ HPA-1a , u HPA-1a/ HPA- a se projevil 100% a u 67% HPA-1b/ HPA-1b se vliv Aspirinu Bayer neprojevil. Závěr: Reakce destiček na terapii ASA souvisí s HPA-1 polymorfismem. Homozygoti s destičkovým fenotypem HPA-1b/ HPA-1b nereagují nebo špatně reagují na léčbu Aspirinem Bayer i Anopyrinem. Studie bude dále pokračovat s větším souborem pacientů. Studie proběhla v rámci výzkumu VZ 64 165. P6. KARBONYLACE BÍLKOVIN KREVNÍCH DESTIČEK PŘI JEJICH AKTIVACI Suttnar J., Veselá P., Čermák J., Havelková A., Gašová Z., Dyr J. E. Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, ČR Aktivaci destiček kolagenem provází produkce NO a hydroxylového radikálu. Oxid dusnatý způsobuje zejména nitraci destičkové bílkoviny VASP (vasodilator-sensitive phosphoprotein, relativní molekulová hmotnost ~50000). Účinek hydroxylového radikálu na destičkové bílkoviny nebyl dosud pozorován. V této práci prezentujeme úvodní výsledky svědčící o tvorbě karbonylových derivátů destičkových bílkovin při aktivaci destiček kolagenem. Vznik hydroxylových radikálů při aktivaci promytých destiček různými agonisty jsme prokazovali chromatografickým stanovením dihydroxy derivátů kyseliny benzoové. Byly použity krevní destičky zdravých dárců, destičky z expirovaných destičkových koncentrátů a destičky pacientů s přetížením železa. Jako agonisté agregace sloužily kolagen, ADP, trombin a TRAP (thrombin receptor activating peptide, SFLLRNP). Dinitrofenylhydrazínové produkty karbonylových derivátů bílkovin byly detegovány imunoblottingem. Zjistili jsme, že produkce hydroxylových radikálů v destičkách je významně vyšší při jejich aktivaci kolagenem ve srovnání s ostatními agonisty. Pomocí imunoblottingu byla v sedimentu destiček aktivovaných kolagenem nalezena výrazná zóna neredukované bílkoviny o relativní molekulové hmotnosti 105500 a několik zón s nižší elektroforetickou pohyblivostí. V supernatantu těchto destiček nebyly nalezeny karbonylované bílkoviny. V sedimentech a supernatantech destiček aktivovaných
ADP, trombinem nebo TRAPem a v klidových destičkách rovněž nebyly nalezeny karbonylované bílkoviny. Zkoumání takových procesů může přispět k rozšíření znalostí o šíření signálu vyvolaného jednotlivými destičkovými agonisty. Poděkování: tato práce vznikla díky podpoře grantu NK-6841 MZd ČR a GAČR 303/03/0249. P7. AKTIVACE DESTIČEK ZA PŘÍTOMNOSTI LDL Suttnar J., Otáhalová E., Čermák J., Havelková A., Dyr J. E. Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, ČR Za jednu z hlavních příčin atherosklerosy je považována peroxidace lipidů, zejména oxidativní modifikace LDL. Dosud není zcela jasné, jak vzájemně souvisí peroxidace lipidů a aktivace destiček. V této práci zkoumáme vliv nativních a modifikovaných LDL na adhesi a agregaci krevních destiček. V několika případech byly použity LDL izolované ze séra pacientů s přetížením železa. Promyté krevní destičky byly získány z krve zdravých dárců. LDL byly izolovány chromatograficky na hydroxyapatitové koloně. Získané LDL byly modifikovány do různého stupně chlornanem sodným nebo malondialdehydem. Adheze destiček na různě modifikované LDL byly zjišťovány metodou podle Bellavite a spol. (Anal. Biochem. 216, 444-450 (1994)), agregace destiček byly prováděny podle Borna. Nativní LDL, izolované z patnácti sér zdravých dárců, ve všech případech způsobovaly agregaci destiček s odezvou srovnatelnou pro ADP i TRAP (thrombin receptor activating peptide, SFLLRNP). LDL oxidované chlornanem poskytovaly nižší agregační odpověď ve srovnání s nativními LDL. LDL modifikované malondialdehydem způsobovaly pouze nepatrnou agregační odezvu. Při prahové koncentraci obou modifikovaných LDL i nativních LDL vedl následný přídavek ADP i TRAPu ke zvýšené agregační odpovědi ve srovnání s účinkem agonistů za nepřítomnosti LDL. Adheze promytých destiček na LDL modifikované oběma způsoby byla významně vyšší ve srovnání s adhezí na nativní LDL. Adheze destiček na LDL pacientů s přetížením železa byla nižší než na LDL modifikované oběma způsoby a vyšší než na nativní LDL. Interakce destiček s LDL i s LDL pacientů s přetížením železa svědčí o proatherogenním potenciálu modifikovaných LDL. Poděkování: tato práce vznikla díky podpoře grantu NK-6841 MZd ČR a GAČR 303/03/0249. P8. PROC® GLOBAL: ZKUŠENOSTI SE STANOVENÍM A INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Gumulec J., Brejcha M., Mikešová M., Richterová R., Radina M. Onkologické centrum J.G.Mendela Nový Jičín Systém proteinu C je spolu s antitrombinem a TFPI pravděpodobně nejvýznamějším systémem zaměřeným proti trombóze. Defekty v tomto systému, především rezistence na aktivovaný protein C (APC-R) navozená Leidenskou mutací faktoru V (FVL), jsou nejčastější kongenitální odchylky manifestované trombofilií. Do systému je řazen vlastní protein C (PC), protein S (PS), trombomodulin, C4b binding protein, specifické inhibitory a fenomen APC-R. ProC® Global je funkční globální screeningový test pro stanovení antikoagulační kapacity systému proteinu C. Je
založen na schopnosti endogenního aktivovaného proteinu C prodlužovat aktivovaný parciální tromboplastinový čas (APTT). Během roku 2002 jsme vyšetřili celkem 224 osob (153 žen a 71 mužů) s projevy trombofilie ve věku 14 až 90 let (medián 45). Patologický výsledek testu (index pod 0,80) jsme diagnostikovali u 136 (60,7%) osob. Defekt PC, PS nebo FVL jsme našli u 42% pacientů s patologickým výsledkem testu (index 0,62±0,11), v 58% případů s patologickou hodnotou testu (index 0,67±0,09) však byl výsledek vyšetření PC, PS i FVL negativní. U heterozygotů FVL byla hodnota indexu 0,62±0,11, u homozygotů FVL 0,52±0,15, u osob s defektem PC 0,62±0,09 a u osob s deficitem volného PS 0,63±0,09. U pacientů bez defektu PC, PS a bez FVL jsme s klesající četností diagnostikovali zvýšení aktivity FVIII, zvýšený titr antikardiolipinových protilátek (ACLA), protrombin 20210A a změny APTT. Senzitivita/specificita testu v našem souboru je pro defekt PC 71/95%, pro defekt PS 58/91%, pro FVL 93/97%, pro průkaz ACLA 70/81%, pro zvýšení aktivity FVIII 71/65% a pro průkaz mutace FII 22010A 73/88%. V souboru bylo 18 (13%) pacientů s nevysvětleným výsledkem testu s hodnotami indexu 0,69±0,08. ProC® Global je cenný globální test, který upozorňuje na změny v systému proteinu C, nejcitlivěji reaguje na přítomnost FVL a odhaluje pacienty se získanou APC-R. P9. PRVNÍ ZKUŠENOSTI S PODÁNÍM ANTI-D GLOBULINU U DĚTÍ S CHRONICKOU FORMOU ITP Pospíšilová D.1, Bajslová A.2, Blažek B.3, Vepřeková L.4, Smíšek P.5 1 Dětská klinika LF a FN v Olomouci, 2Transfúzní oddělení FN v Olomouci, 3Dětská klinika ILF Ostrava, 4Klinika dětského a dorostového lékařství Praha, 5II. dětská klinika FN v Praze-Motole Chronická ITP u dětí je závažné onemocnění, které může výrazně ovlivnit kvalitu života ditěte. U části pacientů jsou možné spontánní remise i po mnoha letech trvání nemoci. Léčebný pristup je individuální, k základním lékům patří kortikoidy a HD IVIG. Splenektomie je indikovana pouze u pacientů s trváním nemoci déle než 1 rok, s projevy krvácení do sliznic a trombocyty trvale pod 10,0x109/l. Zkušenosti s ostatnimi léky (cytostatika, Cyklosporin A, Danazol) jsou malé. Podání anti-D globulinu je v posledních letech doporučováno jako vhodná alternativa léčby a při delším podávani je možno dosáhnout oddálení splenektomie. Tento lék zatím u dětí v České republice nebyl podáván. Uvádíme první zkušenosti s podáním anti-D globulinu u 6 pacientů s chronickou ITP. Soubor pacientů: Jednalo se o pět divek a jednoho chlapce s chronickou formou ITP ve věku 7-12 let (medián 9,5 let). Trombocyty při zahájení léčby se pohybovaly v rozmezí 3-17x109/l (medián 10x109/l). Výsledky: U 3 z 6 pacientů jsme pozorovali přechodnou normalizaci počtu trombocytů, u dvou pacientu došlo k přechodnemu vzestupu počtu trombocytů na hodnotu nad 50,0x109/l, jedna pacientka byla na léčbu rezistentní. Nepozorovali jsme závažnějši vedlejší účinky. Hladina Hb klesla o 3 –27 g/l (medián 15 g/l). U jedné pacientky přetrvává lehká pozitivita PAT po dobu 3 měsíců po podání poslední dávky. Všichni pacienti s dobrou odpovědí na anti-D globulin měli v minulosti dobrou odpověď i na HD IVIG. Závěr: Podání anti-D globulinu vedlo k přechodné normalizaci trombocytů pouze u 50% pacientů, k přechodnému lehkému zvýšení počtu trombocytů u 2 pacientů.
V našem souboru korelovala dobrá odpověď na anti-D s odpovědí na HD IVIG. Stupeň hemolýzy byl mírný, nebyly pozorovány žádné závažné vedlejší účinky. P10. NÁDOROVÝ PROCES V ETIOLÓGII ZÍSKANEJ TROMBOFÍLIE? Beňová B., Švorcová E., Guman T., Hulíková M. Klinika hematológie a onkohematológie FNsP, tr.SNP 1, Regionálne centrum hemostázy a trombózy, Košice Hyperkoagulačné zmeny s rekurentnými trombózami sú priamym dôsledkom pôsobenia nádorových buniek, ich produktov, či chemoterapie do koagulačnej kaskády. Autori počas 3 ročného sledovanie vyšetrili 113 pacientov so selektívne vybratými lymfoproliferatívnymi ochoreniami /CLL, plazmocytóm, HL a NHL, ALL./ Vstupne boli vyšetrované: trombocyty, heparín tolerančný index, vonkajšia a vnútorná protrombináza, trombínový čas, fibrinogen, následne boli indikované : F VIII, VII, X, AT III, APC-R, Proteín S a C, fibrinolýza, TFPI, FDP, D.-diméry. U všetkých pacientov /100%!!/ bol in vitro zachytený hyperkoagulačný stav, klinicky manifestná trombóza venózna bola u 67 pacientov, arteriálna u 11, u 35 sa trombóza nemanifestovala. Časté boli atypické trombózy v. jugularis /7/, axilaris /4/, sinus rectus /2/P, a. mesenetrica /1/, v.subclavia /12/, najfrekventnejšie však rozhodne boli trombózy hĺbkových a povrchových žíl DK/32/ a pľucne embólie /14/, u 3 sme diagnostikovali sy DIC, v 1 jako hemolyticko-uremický syndrom. Laboratórne neexistoval jednoznačne špecifický parameter na predikciu klinickej manifestácie trombozy, nepravidelen sme objektivizovali zvýšenie hladiny FVIII, VII, X, trombocytózu, hyperfibrinogénémiu, pozitivitu D.-di, pokles AT III, fenotyp získanej APC-rezistencie, zvyšenú TFPI, dokonca u 4 pacientov aj pozitivitu ACLA. V liečbe sme pacientov stratifikovali podľa rizika, použili sme LMWH, /všetci ambulantní/, alebo UFH /hospit/. Oba prípravky boli neskor sledované orfarinom, dlžka liečby bola variabilná /3 mes-rok/. Komplexnosť koagulačných zmien pri nádoroch, s lokálnymi a systémovými zmenami v nás vytvorila povedomie nádoru ako získanej trombofílie. P11. HYPERFIBRINOGENÉMIE A DYSFIBRINOGENÉMIE Dyr J. E., Scheiner T., Salaj P., Maryšková Z., Suttnar J. Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, ČR Hyperfibrinogenémie je prognostický rizikový faktor u řady onemocnění včetně kardiovaskulárních onemocnění. Stále není přesně známo, jak dalece příspívá vysoká hladina fibrinogenu k etiologii onemocnění a jak dalece je pouze následkem patogenního procesu. Hyperfibrinogenémie způsobuje hyperkoagulační stav a je většinou asociována se zvýšenou agregací destiček a hyperviskozitou. Důsledkem je redukce krevního toku a ischémie. U hematoonkologických pacientů je hyperfibrinogenémie častým průvodním nálezem v rámci základního onemocnění, hlavně v souvislosti se septickými komplikacemi. Fibrinogen je mnohem citlivější k oxidativní modifikaci ve srovnání s ostatními plasmatickými bílkovinami. Stejně jako hyperfibrinogenémie může i dysfibrinogenémie vést k aterotrombotickým příhodám.
V této práci byl sledován vliv různých volných radikálů provázejících oxidační stres na modifikaci fibrinogenu a na jeho schopnost tvořit fibrinovou síť a zprostředkovat agregaci a adhezi krevních destiček. Zjistili jsme, že i velmi malý stupeň modifikace, méně než 0,3 mol karbonylových skupin na molekulu fibrinogenu výrazně ovlivní kvalitu fibrinové sítě. Ta je mnohem více porézní, méně pružná a skládá se z klastrů velmi tenkých vláken. Výsledky ukazují, že i modifikace méně než každé třetí molekuly fibrinogenu výrazně ovlivní tvorbu fibrinu. Protože rychlost modifikační reakce je funkcí koncentrace fibrinogenu, tato data naznačují, že zvýšená hladina fibrinogenu může být provázena vyšší náchylností k oxidační modifikací fibrinogenu. To může ovlivnit schopnost fibrinogenu tvořit fibrinový gel, stejně tak jak ovlivňovat kvalitu vytvářeného fibrinu. Naše výsledky ukazují na možnou souvislost mezi hyperfibrinogenémií a získanou dysfibrinogenémií. Poděkování: Tato práce byla vznikla na základě grantůl IGA MZ ČR NA/7616-3 a NK-6841. P12. POST-TRANSLAČNÍ NITRAČNÍ MODIFIKACE FIBRINOGENU Scheiner T., Weisel J., H. Ischiropoulos, Hertkorn C., Dyr J. E. Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha, ČR, University of Pennsylvania a Children Hospital of Philadelphia, USA Zvýšená hladina aktivních forem dusíku a kyslíku (volné radikály) při oxidačním stresu vede k oxidacím a nitracím bílkovin, lipidů a nuk-leových kyselin a může ovlivnit závažná onemocnění (infarkt myokardu). Zjistili jsme zvýšenou hladinu fibrinogenu modifikovaného nitrací některých tyrosinových aminokyselinových zbytků u pacientů s koronárními arteriálními onemocněními. Pro studium takto modifikovaného fibrinogenu jsme připravili fibrinogen nitrovaný peroxinitritem, který vzniká v roztoku spontánním rozkladem 3– morpholinosydnoniminu. Nitrace tyrosinových zbytků fibrinogenu vedla na rodíl od fibrinogenu kontrolního ke zrychlení polymerizace fibrinu, ke zvýšení výsledné turbidity a ke zvýšení prokřížení fibrinových molekul působením faktoru XIIIa. Rychlost fibrinolysy modifikovaného fibrinu nebyla ovlivněna. Skenovací elektronová mikroskopie ukázala, že nitrovaný fibrinogen tvoří neobvyklou síť z abnormálně tenkých zkroucených vláken (∼ 45 nm průměr vláken), často s volnými konci, shlukujících se do tlustých (až 700 nm) svazků. Tato fibrinová síť měla zvýšenou permeabilitu díky přítomnosti velkých pórů mezi snopci vláken. Pomocí torsního kyvadla užívaného k měření viskoelastických vlastností jsme zjistili, že takto modifikovaný fibrinogen tvoří výrazně měkčí sítě, které mohou být snadněji deformovány při mechanickém namáhání. Nebo může též dojít k fragmentaci a tím k zvýšení možného nebezpečí vzniku mikroembolií. K výše uvedeným změnám vlastností fibrinové sítě dochází i při nanitrování pouhých 4% molekul fibrinogenu, což odpovídá množství nitrovaného fibrinogenu naměřeného u pacientů s koronárním arteriálním onemocněním. Poděkování: Tato práce vznikla za podpory grantů NK-6841 a NA/7616-3 MZd ČR a grantu 30954 NIH USA. P13. POUŽITÍ REKOMBINANTNÍHO FAKTORU VIIa (NOVOSEVEN)
U PACIENTŮ LÉČENÝCH PRO MALIGNITU NA KLINICE DĚTSKÉ ONKOLOGIE FN BRNO Zapletal O., Blatný J., Lokaj P.*, Kohlerová S., Štěrba J.* Oddělení klinické hematologie FN Brno, * Klinika dětské onkologie FN Brno Rekombinantní faktor VIIa (NovoSeven) představuje účinný prostředek pro zástavu akutního život ohrožujícího krvácení, které špatně reaguje na jinou terapii. Autoři prezentují čtyři kazuistiky pacientů léčených pro maligní onemocnění, u nichž byl přípravek použit při akutních krvácivých komplikacích onkologické léčby nebo jako sekundární prevence při operačních výkonech. Tři pacienti byli primárně léčeni pro diagnosu akutní lymfoblastické leukemie a jeden pro hepatoblastom. Ve všech případech se podařilo krvácení, ke kterému došlo z různých důvodů (krvácení do GIT a dýchacích cest při těžké febrilní neutropenii, krvácení do abscesu v CNS, krvácení do perikardu), zastavit nebo mu předejít (radikální resekce rozsáhlého tumoru jater). Výsledky naznačují další možnosti rozšíření indikací přípravku mimo čistě hematologické diagnózy. P14. 25 LET NÁRODNÍHO REGISTRU VROZENÝCH PORUCH KOAGULACE V ČR – OD KRYOPROTEINU K MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTICE Vorlová Z., Habart D. Ústav hematologie a krevní transfuse, Praha Cílem sdělení je zhodnotit význam registru v průběhu 25 let jeho existence. Registr byl založen na ÚHKT v roce 1977 a od té doby byl průběžně doplňován a využíván k potřebám, které byly aktuální v různých obdobích. Registr vznikl z potřeby vyslovit požadavky na zajištění cílené péče o hemofilickou populaci, která je relativně malá a při tom vyžaduje intensivní péči. Racionální plánování výroby kryoproteinu transfusní službou vyžadovalo kvalifikovaný odhad předpokládané spotřeby. Registr umožnil centrální ověřování diagnosy, zejména hemofilie A, v oblastech, kde vázla laboratorní diagnostika. Po zavedení testů k průkazu HIV infekce registr umožnil pohotově provést centrální epidemiologický průzkum populace hemofiliků registrovaných v ČR. Při přechodu z léčby kryoproteinem na koncentráty faktorů podložená znalost spotřeby v celonárodním měřítku dovolila formulovat požadavky na výrobu koncentrátů z domácí plasmy u zahraničních zpracovatelů. Registr posloužil jako věcné východisko při diskusích s pojišťvnami o vyjmutí nákladné terapie koncentráty (domácí léčba) z paušální platby. V posledních letech registr slouží systematickému vyšetřování přenašečství v hemofilických rodinách. Po roce 2000 bylo zahájeno systematické upřesňování diagnosy von Willebrandovy choroby a bylo započato s vytvářením registru nemocných s touto chorobou. V současné době je v registru evidováno 115 nemocných s hemofilií B a 671 nemocných s hemofilií A. Registr obsahuje informaci o průkazu kausální mutace ve 193 hemofilických rodinách a posloužil k provedení 76 prenatálních vyšetření. Do registru bylo zařazeno 49 rodin s upřesněnou diagnosou von Willebrandovy choroby, ale celkový přehled o počtech nemocných s von Willebrandovou chorobou však zatím není znám. Registr byl budován spoluprací hemofilických center v Brně, Českých Budějovicích, Hradci Králové, Olomouci, Ostravě, Plzni, Praze a Ústí nad Labem. Svým dílem přispěla některá genetická pracoviště. Elektronické zpracování bylo provedeno firmou MSoft díky finanční podpoře MZ ČR.
